ANÁLOGOS DE VITAMINA D - (20R)-23, -DIFLÜORO-2 -METILEN- 19 -NOR-BISHOMOPREGNACALCIFEROL
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con compuestos de vitamina D y de manera más particular con análogos | de vitamina D, (20R) -23 , 23-difluoro-2-metilen-19-nor-bishomopregnacalciferol, y sus usos farmacéuticos. Es sabido que la hormona natural, la, 25-dihidroxivitamina D3 y su análogo en la serie del ergosterol, es decir, la la, 25-dihidroxivitamina D2, son reguladores muy potentes de la homeostasia del calcio en animales y humanos y su actividad en la diferenciación celular se ha establecido también, Ostrem et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987). Se han preparado y analizado muchos análogos estructurales de estos metabolitos que incluyen ?a-hidroxivitamina D3 , la-hidroxivitamina D2, varias vitaminas homologadas en la cadena lateral y análogos fluorados . Algunos de estos compuestos muestran una interesante separación de actividades en la diferenciación celular y en la regulación del calcio. Esta diferencia en actividad puede ser útil en el tratamiento de una variedad de enfermedades como osteodistrofia renal, raquitismo resistente a la vitamina , osteoporosis , soriasis y algunos tumores malignos. ;
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Otra clase de análogos de vitamina D, es decir, los compuestos denominados 19 -ñor vitamina D, se caracterizan por la sustitución del grupo metiljeno exocíclico del anillo A (carbono 19) , típico del sistema de la vitamina D, con dos átomos de hidrógeno. La evaluación biológica de estos análogos 19-nor (por ejemplo, la, 25-dihidroxivitamina D3), manifestaron un perfil de actividad selectiva de alta potencia para inducir diferenciación celular y muy baja para la actividad de movilización del calcio. Así que, estos compuestos son potencialmente útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de tumores malignos o en el tratamiento de varios trastornos de la piel. Se han descrito dos diferentes métodos de síntesis de estos análogos 19 -ñor-vitamina D (Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 3£, 7663 (1991), y DeLuca et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5,086,191). 1 En la . Patente de los Estados Unidos Núm .4 , 666 , 634 , se describen los análogos 2p-hidroxi y alcoxi (por ejemplo, ED-71) de la la, 25 -dihidroxivitamina
D3 y son evaluados por el grupo de Chagall como medicamentos potenciales para osteoporosis y como antineoplásicos. Véase también, Hokano et al., Biochem. r ¦ Biophys. Res. Commun. 163 , 1444 (1989). También se han preparado y analizado otros análogos de la la, 25-
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dihidroxivitamina D3 , sustituidos en la posición 2 ,del anillo A (con hidroxialquilo, por ejemplo, ED-120, y grupos fluoroalquilo) (Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl . 1, 190 (1993); Posner et al . , J. Org. Chem. 59, 7855 (1994) y¡ J. Org. Chem. 6J), 4617 (1995)). También se han sintetizado análogos de la, 25-dihidroxi- 19 -ñor-vitamina D3 sustituidos en la posición 2, es decir, compuestos sustituidos en la posición 2 con grupos hidroxilo o alcoxi (De Luca et. al. Patente de líos i
Estados Unidos Núm. 5,536,713), con grupos 2-alquilo (De Luca et. al. Patente de los Estados Unidos Núm. 5,945,410) y con grupos 2-alquilideno (De Luca et. al. Patente de los Estados Unidos Núm. 5,843,928), los cuales muestran interesantes perfiles de actividad selectiva. Todos estos estudios indican que los sitios de unión en los receptores de vitamina D pueden acomodar diferentes sustituyentes en C-2 en los análogos de vitamina D sintetizados. En un esfuerzo continuo por investigar la ciase 19 -ñor de compuestos de vitamina D farmacológicamente importantes, también se han sintetizado y evaluado análogos que se caracterizan por la presencia de un sustituyente metileno en el carbono 2 (C-2) , un grupo hidroxilo en, el carbono 1 (C-l) y una cadena lateral reducida unida, al carbono 20 (C-20) . El loc-hidroxi-2-metilen-19-nor-
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pregnacalciferol se describe en la Patente de los Estádos Unidos Núm. 6,566,352 mientras que el loc-hidroxi-2-metilleri- 19-nor-homopregnacalciferol se describe en la Patente! de los Estados Unidos Núm. 6,579,861 y el la-hidroxi-2-metilen-19-nor-bishomopregnacalciferol se describe en' la Patente de los Estados Unidos Núm. 6,627,622. Estos tres compuestos tienen relativamente alta actividad de unión a los receptores de vitamina D y una actividad I de i diferenciación celular también relativamente alta pero jioca o ninguna actividad calcémica en comparación con la la, 25-dihidroxivitamina D3. Sus actividades biológicas hacen a estos compuestos excelentes candidatos para una variedad de i usos farmacéuticos, como se expone en las patentes '352,
861 y '622.
RESUMEN DE LA INVENCION La presente invención está dirigida hacia los análogos (20R) -23 , 23 -difluoro-2-metilen-19-nor- I i ! bishomopregnacalciferol de la vitamina D, a su actividad biológica y a varios usos farmacéuticos para estos compuestos. Estos nuevos compuestos de vitamina D hasta ahora desconocidos, son análogos 19-nor-vitamina D que tienen un grupo metileno en la posición 2 (C-2) , un grupo metilo en la posición 20 (C-20) en su configuración R y un i grupo etilo como cadena lateral unida en la posición 17 j (C-
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17) y la sustitución de los dos átomos de hidrógeno normalmente ubicados en la posición 23 (C-23) en la cadena lateral con dos átomos de flúor. El compuesto preferido es el (20R) -23 , 23-difluoro-la-hidroxi-2-metilen-19-rior-bishomopregnacalciferol . Estructuralmente estos análogos (20R) -23 ,j23 -difluoro-2 -metilen- 19 -nor-bishomopregnacalciferol de ¡ la vitamina D se caracterizan por la formula general I qué se presenta a continuación:
en donde Xj. y X2, que pueden ser iguales o i diferentes, se seleccionan cada uno a partir de hidrógeno o de un grupo protector de hidroxilo. El análogo preferido es el (20R) -23 , 23-difluoro-la-hidroxi-2-metilen-19-ñor-bishomopregnacalciferol , el cual tiene la fórmula la siguiente:
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H
Los compuestos I anteriores, en particular el jla, presenta un patrón de actividad biológica deseado y |con muchas ventajas. Estos compuestos se caracterizan por una relativamente alta actividad de unión a los receptoresj de i vitamina D, pero muy baja actividad de transporte de calcio intestinal, en comparación con la de la la,j25-dihidroxivitamina D3 y tiene muy poca capacidad ' de 1 ; movilizar el calcio del hueso, en comparación con la la,¡25- I ; dihidroxivitamina D3. Por lo tanto, estos compuestosj se pueden caracterizar como compuestos que tienen poca o nula I actividad calcémica. Es indeseable elevar el calcio sérico a niveles superiores a los fisiológicos cuando 'hay supresión del gen de la hormona preproparatiroidea (Darvlzish & DeLuca, Arch. Biochem. Biophys. 365, 123-130, 1999j) y proliferación de glándula paratiroidea . Es de esperárse que estos análogos que tienen poca o ninguna actividad
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calcémica mientras que son muy activos en la diferenciación, sean útiles como terapia para la supresión de hiperparatiroidismo secundario asi como osteodistrofia renal . También se ha descubierto que los compuestos1 I, en particular el la, de la invención son muy adecuados para tratamiento y profilaxis de trastornos humanos que se caractericen por un desequilibrio en el sistema inmune, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes, que incluyen esclerosis múltiple, lupus, diabetes mellitus, rechazo del receptor al injerto y rechazo a trasplantes de órganos; y adicionalmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, como artritis reumatoide, asma y enfermedades inflamatorias del intestino como la enfermedad celiaca, la colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn. El acné, la alopecia y la hipertensión son otros trastornos que se pueden tratar con los compuestos de la invención. Los compuestos I anteriores y sobre todo el la, también se caracterizan por una actividad de diferenciación celular relativamente elevada. Así, estos compuestos i también aportan un principio activo terapéutico para el tratamiento de la soriasis o un antineoplásico, en especial contra la leucemia, el cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de piel y cáncer de próstata. Por otra parte, debido a su relativamente elevada actividad \ de
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diferenciación celular, estos compuestos aportan un principio activo terapéutico para el tratamiento de varios trastornos de la piel que incluyen arrugas, falta ¡ de hidratación dérmica adecuada, es decir, piel seca, falta de firmeza dérmica adecuada, es decir, piel flácida, e insuficiente secreción sebácea. El uso de estos compuestos I no solo da como resultado la humectación de la piel sino que también mejora la función de barrera de la piel. Los compuestos de la invención de fórmula I y en particular los de fórmula la, también son útiles para prevenir o tratar la obesidad, inhibir la diferenciación de adipocitos, inhibir la transcripción del gen SCD-1 y/o reducir la grasa corporal en animales. Por lo tanto, j en algunas modalidades, un método para prevenir o tratar la obesidad, inhibir la diferenciación de adipocitos, inhibir la transcripción del gen SCD-1 y/o reducir la grasa corporal en individuos animales, incluye administrar; al animal, una cantidad eficaz de uno o más de los compuestos o una composición farmacéutica que incluya uno o más de los compuestos de fórmula I. La administración de uno o más de los compuestos o de las composiciones farmacéuticas a los individuos, inhibe la diferenciación de adipocitos inhibe la transcripción génica y/o reduce la grasa corporal en¡ el animal . Uno o más compuestos pueden estar presentes en
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una composición destinada a tratar las enfermedades y trastornos arriba señalados, en una cantidad alrededor de 0.01 pg/gm a 1000 pg/gm de la composición, de preferencia, alrededor de 0.1 µg/gm a 500 µg/gm de la composición ,y puede administrarse por vía tópica, transdérmica, rectal, nasal, sublingual o parenteral en dosis alrededor de 0.01 pg/día a 1000 pg/día, de preferencia, alrededor de 0.1 µg/día a 500µg/día. | Por otra parte, se considera que los siguientes compuestos con fórmulas V y VI que se forman como intermediarios durante la síntesis de los productos finales de fórmulas I y la, son nuevos y desconocidos hasta ahora:!
en donde R se selecciona a partir de hidrogenó o un grupo protector de hidroxilo, y
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BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS j I En las figuras : Las Figuras 1 a 5 ilustran varias actividades biológicas del (20R) -23 , 23-difluoro-l -hidroxi-2-metiljeri- \ ! ¡
19-nor-bishomopregnacalciferol, en lo sucesivo denominado
"FF-44", en comparación con la hormona natural 1a,¾25-dihidroxivitamina D3, en lo sucesivo " 1 , 25 (OH) 2D3 " . La Figura 1 es un gráfica que ilustra ! la actividad relativa de FF-44 y l,25(OH)2D3 en competencia jcó'n [3H] -1,25- (OH)2-D3 por la unión al receptor de vitamina D recombinante de longitud completa, de rata. La Figura 2, es una gráfica que ilustra el jpp.r ciento de diferenciación célular HL-60 como una función! de i la concentración de FF-44 y 1, 25 (OH) 2D3. La Figura 3 es una gráfica que ilustra la actividad de transcripción in vitro de la l,25(OH)2D3j en 1 I comparación con FF-44; | La Figura 4 es una gráfica que ilustra j la actividad de movilización del calcio óseo de la l,25(OH)2D3 en comparación con FF-44, y '< í !
La Figura 5 es una gráfica que ilustra ! la ; ' j actividad de transporte de calcio intestinal de ; la l,25(OH)2D3 en comparación con FF-44.
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DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se sintetizó y se evaluó el (20R) -23 , 23 , difluoro-la-hidroxi-2-metilen-19-nor-bishomopregnacalciferol (denominado en la presente "FF-44") un análogo 19-|nor vitamina D que se caracteriza por la presencia de ; un sustituyente metileno en el carbono 2 (C-2) , un grupo metilo en la posición 20 (C-20) en su configuración R, un grupo etilo como cadena lateral unida en la posición 17 (G- 17) y la sustitución de dos átomos de hidrógeno normalmente ubicados en la posición 23 (C-23) en la cadena lateral con dos átomos de flúor. Estos análogos de vitamina D parecen ser un objetivo interesante debido a que el grupo metileno, que es relativamente pequeño, en la posición' C-2 no interfiere con la unión al receptor de vitamina D. Desde el punto de vista estructural, este análogo 19-ñor se caracteriza por la fórmula general la ilustrada en , lo anterior y su precursor o profármaco (en la forma protegida con hidroxilo) se caracteriza" por la fórmula general I también ilustrada en lo anterior. La preparación de los análogos (20R) -23,23-difluoro-2-metilen-19-nor-bishomopregnacalciferol de : la vitamina D que tienen la estructura I, se puede llevar a cabo por medio de un método general común, por ejemplo, la condensación de una cetona II tipo indaus-Grundmánn bicíclica con el óxido de fosfina alílico III que da lugar
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al correspondiente análogo IV de vitamina D, éste ultimo compuesto se somete a la desprotección en C-1 y C-3: H
En las estructuras II, III y IV, los grupos Xx y X2 son grupos protectores de hidroxilo, de preferencia, t-butildimetilsililo, también se debe considerar que cualquier grupo funcional que pudiera ser sensible o interfiriera con la reacción de condensación, se protegerá de manera adecuada según los métodos tan conocidos eri la técnica. El proceso mencionado en lo anterior representa una aplicación del concepto de síntesis convergente, el cual se ha aplicado con eficacia en la preparación de compuestos de vitamina D [por ejemplo, Lythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans . I, 590 (1978) ; Lythgoe, Chem. Soc. Rev. 9, 449 (1983) ; Toh et al., J. Org . Chem. 48, Í414 (1983) ; Baggiolini et al., J. Org. Chem. 51, 3098 (1986) ; Sardina et al., J. Org. Chem. 51, 1264 (1986); J. Órg.
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Chem. 51, 1269 (1986) ; DeLuca et al., Patente de ¡los Estados Unidos Núm. 5,086,191; DeLuca et al., Patentej de los Estados Unidos Núm. 5,536,713] . 1 '¦' . I La hidrindanona de la estructura general II nc| se conoce. Se puede preparar . por el método que se muestraj en ' i ; el Esquema I (véase la preparación del compuesto FF-44) .j Para la preparación de los óxidos de fosfina i requeridos, de estructura general III, se ha desarrollado una ruta de síntesis que parte de un derivado metil quinicato que se obtiene fácilmente a partir del ácido
(IR, 3R, 4S, 5R) - ( - ) -quínico comercial, según lo descrito ¡por
Perlman et al., Tetrahedron Lett. 3_2, 7663 (1991), Deliuca et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5,086,191 y Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998) . ! El proceso general de la síntesis de los compuestos I y la se ilustra y se describe de manera 'más completa en la Patente de los Estados Unidos Núm. titulada "Compuestos 2-alquiliden-19-nor-vitamina D" (2-Alkylidene-19-Nor-Vitamin D Compounds) , cuya especificación se considera parte de la presente, como referencia. En el sentido que se utiliza en la presente yj en las reivindicaciones, el término "grupo protector de hidroxilo" se refiere a cualquier grupo de los comúnmente utilizado en la protección temporal de funciones hidroxilp, por ejemplo, grupos alcoxicarbonilo, acilo, alquilsililo ;o i r
alquilarilsililo (en lo sucesivo denominados simplemente grupos "sililo") y grupos alcoxialquilo . Los grupos protectores alcoxicarbonilo son grupos alquil-0-CO- como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, ter-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo o aliloxicarbonilo . El término "acilo" se refiere a un grupo alcanoilo de 1 a 6 átomos de carbono, en todas sus forma isoméricas o un grupo carboxialcanoilo de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, un grupo oxalilo, malonilo, succinilo, glutarilo o un grupo acilo aromático como benzoilo o un grupo benzóilo sustituido con halo, nitro o alquilo. En el sentido que se utiliza en la presente descripción o en las reivindicaciones, el término "alquilo" representa un radical alquilo de cadena recta o ramificada de 1 a. 10 átomos de carbono, en todas sus formas isoméricas. i Los i grupos protectores alcoxialquilo son grupos como metoximetilo, etoximetilo, metoxietoximetilo o tetrahidrofuranilo y tetrahidropiranilo . Los grupos protectores sililo preferidos son trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, dibutilmetilsililo, difenilmetilsililo, fenildimetilsililo, difenií-t-butilsililo y radicales silil alquilados análogos. : El término "arilo" especifica un grupo fenilo o un grupo fenilo sustituido con grupos alquilo, nitro o halo.
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Un grupo "hidroxilo protegido" es un grupo hidroxilo derivatizado o protegido con cualquiera de jlos grupos mencionados en lo anterior de uso común para la protección temporal o permanente de funciones hidroxilo, por ejemplo, los grupos sililo, alcoxialquilo, acilo o alcoxicarbonilo, según se definieron previamente. |LÓS términos "hidroxialquilo" , "deuteroalquilo" y
" fluoroalquilo" se refieren a un radical alquilo sustituido con uno o más grupos hidroxilo, deuterio o flúor, respectivamente . De manera más específica, se debe hácer i referencia al siguiente ejemplo ilustrativo y a ¡ la descripción así como al Esquema 1 de la presente, para conocer más detalles acerca de la preparación del compue'sto FF-44. ! En este ejemplo, los productos específicos identificados por los números arábigos (1, 2, 3) j se refieren a las estructuras específicas así identificadasj en el Esquema 1. !
EJEMPLO Preparación de (20R) -23 , 23 -difluoro-lcc-hidrox¿-2 -metilen-19-nor-bishomopregnacalciferol - j Des-A, B-23, 24 -dinorcolan- 8ß, 22-diol (1). ¡Una I solución de vitamina D2 (10 g; 25.4 mmoles) en MeOH (¡700 i
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mL) y piridina (7 mL) se enfrió a -78 °C mientras se purgaba con argón. El flujo de argón se detuvo y se hizo pasar una corriente de ozono hasta que apareció un color azul. La solución se purgó con oxígeno hasta que desapareció el color azul y se trató con NaBH4 (2.4 g; 64 mmoles) . Después de 20 minutos se adicionó la segunda fracción de NaBH4 (2.4 g; 64 mmoles) y la reacción se dejó a temperatura ambiente. Se adicionó la tercera fracción de (2.4 g; 64 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó a.^ temperatura ambiente. La reacción se interrumpió con agua (100 mL) y se concentró a vacío. El residuo se extrajo con
CH2C12 (3 x 200 mL) . La fase orgánica se lavó con solución i acuosa 1M de HC1 (100 mL) , solución acuosa saturada; de NaHC03 (100 mL) , se secó en MgS04 anhidro y se concentró a vacío. El residuo se purificó por cromatografía en columna (15-40% acetato de etilo/hexano) y se obtuvieron 4.10 g (19.3 mmoles; 76% de rendimiento) de 1 como cristales blancos. [a]D = +56.0 (c 0.95, CHC13) ; m.p. 110 - 111 °C; XH MR (400 MHz, CDC13) d 0.96 (3H, s) , 1.03 (3H, d, J = 6.6 Hz), 3.38 (1H, dd, J = 10.5 Hz, J = 6.8 Hz) , 3.64 (1H, dd, J = 10.5 Hz, J = 3.2 Hz) , 4.09 (1H, d, J = 2.3 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 13.6, 16.6, 17.4, 22.6, 26.6, 33.5, 38.2, 40.2, 41.3, 52.3, 52.9, 67.8, 69.2; MS (El) m/z 212 (M+, 2), 194 (17), 179 (18), 163 (10), 135 (19), 125 (34), 111 (100); masa exacta calculada para Ci3H220 ( [M - H2Ó] +)
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194.1671, obtenida 194.1665. Des-A,B-22- (ácetoxi) -23, 24 -dinorcolan- 8ß-?1 (2) . A una solución en agitación, de 1 (3.50 g, 16.5 mmoles) y DMAP (100 mg) en Et3N (3.00 mL, 1.67 g, 21.6 mmoles) y cloruro de metileno (300 mL) se le adicionó gota a gota anhídrido acético (1.54 mL, 2.18 g, 16.5 mmoles) a 0 °C.< La mezcla de reacción se mantuvo a 4°C durante la noche. Los disolventes se eliminaron a presión reducida y el residuo se volvió a disolver en CH2C12 (200 mL) , se lavó con una solución acuosa al 10% de HC1 (50 mL) , solución acuosa saturada de NaHC03 (50 mL) y agua (50 mL) . La fase orgánica se secó en Na2S04 anhidro y se concentró a presión reducida para obtener 4.06 g (16.0 mmoles; 97% de rendimiento) de 2 como cristales blancos, [a] D = +33.7 (c 0.90, CHC13) ; m.p. 78 - 80 °C; ¾ MR (500 MHz , CDC13) d 0.96 (3H, s) , 1.00 (3H, d, J = 6.6 Hz) , 2.05 (3H, s) , 3.77 (1H, dd, J" = 10.6 Hz, J = 7.7 Hz) , 4.06 (1H, dd, J" = 10.6 Hz, J = 3.3 Hz) , 4.11 (1H, br s) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) 613.5, 17.0, 17.4, 21.0, 22.5, 26.6, 33.5, 35.3, 40.2, 41.9, 52.3, 53.2, 69.1, 69.4, 171.4; MS (El) m/z 254 (M+, 2), 236 (5), 205 (2), 194 (12), 176 (22), 161 (14), 135 (16), 125 (34), 111 (100); masa exacta (ESI) calculada para Ci5H2303 a ( [M + Na] +) 277.1780, obtenida 277.1791. Des-A,B-22- (acetoxi) -8ß- [ (trietilsilil) oxi] -23, 24-dinorcolano (3). A una solución en agitación de 2
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i
(4.00 g, 16.6 mmoles) en CH2C12 (40 mL) y 2 , 6-lutidina (¿.67 mL, 2.46 g, 23.0 mmoles) se le adicionó gota a gota trietilsilil trifluorometansulfonato (4.52 mL, 5.28 g, 20.0 mmoles) en atmósfera de argón a -50 °C. Después de 30 minutos, se adicionaron CH2C12 (5 mL) y agua (80 mL) . ; La mezcla de- reacción se extrajo con CH2C12 (3 x 120 mL) y la fase orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de CuS04 (50 mL) , se secó en Na2S0 anhidro y se concentró a presión reducida para obtener el producto 3 crudo, como un aceite, [a] D = +42.2 (c 1.25, CHC13) ; H NMR (500 Hz, CDC13) d .0.55 (6H, q, J = 7.9 Hz)., 0.93 (3H, s) , 0.95 (9H, t, J = 8.0 Hz) , 0.98 (3H, d, J = 6.6 Hz) , 2.05 (3H, s) , 3.77 (1H, dd, J = 10.6 Hz, J = 7.5 Hz) , 4.04 - 4.07 (2H, m) ; 13C NMR (125 MHz, CDC13) d 4.9, 6.9, 13.5, 17.1, 17.6, 21.0, 23.0, 26.8, 34.6, 35.4, 40.6, 42.2, 52.8, 53.4, 69.2, 69.6, 171.4; MS (El) m/z 368 (M+, 4), 339 (30), 325 (15), 177 (89) , 145 (100) ; masa exacta calculada para C2iH0O3Si 368.2747, obtenida 368.2748. Des-A,?-8ß- [ (trietilsilil) oxi] -23, 24 -dinorcolah-22 -ol (4) . A una solución, en agitación, del producto 3 crudo en metanol (100 mL) se le adicionó gota a gota una solución al 10% de MeONa en MeOH (20 mL) . Después de 2 h se adicionó una solución acuosa saturada de NH4C1 (20 mL) y j agua (60 mL) y la mezcla se extrajo con CH2C12 (5 x 100 mL) . La fase orgánica se secó en Na2S0 anhidro, se concentró a
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presión reducida y el residuo se purificó en una columna de gel de sílice (10 - 20% acetato de etilo/hexano) para obtener 5.25 g (16.1 mmoles; 97 % de rendimiento de 2) de 4. [O D = +40.3 (c 1.00, CHC13) ; H NMR (400 MHz , CDCl3) d 0.55 (6H, q, J = 7.9 Hz) , 0.93 - 0.97 (12H, m) , 1.02 (3H, d, J = 6.6 Hz) , 3.37 (1H, dd, J = 10.4 Hz, J = 6.8 Hz) , 3.63 (1H, dd, J = 10 Hz, J = 3.0 Hz), 4.04 (1H, d, J = ¡1,8 Hz) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 4.9, 6.9, 13.6, 16.6, 17.6, 23.0, 26.8, 34.6, 38.3, 40.6, 42.1, 52.8, 53.1, 68.0, 69.3; MS (El) m/z 326 (M+, 10), 311 (2) , 297 (93) , 283 (36), 225 (16) , 193 (21) , 177 (100) ; masa exacta calculada para Ci9H3802Si 326.2641, obtenida 326.2639. Des-A, ?-8ß- [ (trietilsilil) oxi] -23, 24 -dinorcolan-22 -al (5) . Se adicionó el complejo de trióxido de azufre piridina (758 mg, 4.74 mmoles) a la solución de 4 en agitación (514 mg, 1.58 mmoles) en Et3N (659 L, 479 mg, 4.74 mmoles) , DMSO anhidro (336 pL; 370 mg; 4.74 mmoleó) y CH2C12 anhidro (10 mL) a 0 °C en atmósfera de argón. Después de 2 h se adicionó CH2C12 (50 mL) y la mezcla de reacción se lavó con solución acuosa saturada de CuS04 (10 mL) y agua (10 mL) . La fase orgánica se secó en Na2S04 anhidro, se concentró a presión reducida y el residuo se purificó en gel de sílice (0.5 - 2% acetato de etilo/hexano) para obtener 400 mg (1.23 mmoles; 78% de rendimiento) del producto 5. [a] D = +42.6 (c 1.15, CHC13) ; XH NMR (400 MHz,
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CDC13) d 0.57 (6H, q, J" = 7.9 Hz) , 0.94 - 0.98 (12H, !ra) , i
1.10 (3H, d, J = 6.8 Hz), ;.2.35 (1H, m) , 4.07 (1H, d, jJ ;= 2.5 Hz) , 9.58 (1H, d, ; J = 3.2 Hz) ; 13C NMR (100 MHz , CDCI3) d 5.0, 6.9, 13.4, 13.9, 17.6, 23.3, 26.2, 34.6, 40.6, 42.7, 49.1, 51.8, 52.5, 53.2, 69.1, 205.3; MS (EI) m/z 324 (M+,
4), 311 (12), 295 (100); masa exacta calculada para C17H31O2SÍ ( [M - C2H5]+) 295.2093, obtenida 295.2086. ¡ Des-A,?-8ß- [ (trietilsilil) oxi] -24-norcol-22-enb | (6) . A una suspensión en agitación de bromuro de metiltrifenilfosfonio (881 mg; 2.47 mmoles) en THF (6 ¡mL) se le adicionó gota a gota una solución 1.6 de n-butil litio en hexanos (1.38 mL; 2.20 mmoles) a 0 °C. Después de i
1 h. la mezcla se enfrió a -50 °C y se adicionó juna solución del producto 5 (400 mg; 1.23 mmoles) en THF (5 ¡mL) a través de una cánula. La mezcla se llevó a ¡una temperatura de 0°C y se agitó durante 1 h. Se adicionaron unas cuantas gotas de acetaldehído y Et20 (8 mL) y la i mezcla se filtró a través de un cartucho de gel de sílice ·' . : ' ! ,
Sep-Pack. El filtrado se concentró a presión reducida y se purificó en un cartucho de gel de sílice Sep-Pack (hexánp) para obtener 274 mg (0.85 mmoles; 69% de rendimiento) jdel producto 6. [a] D = +40.5 (c 0.90, CHC13) ; XH NMR (400 MHz,
CDCI3) d 0.55 (6H, q, J" = 7.9 Hz) , 0.93 (3H, s) , 0.95 (9H, t, J = 7.9 Hz) , 1.00 (3H, d, J= 6.6 Hz) , 1.94 (1H, br d, J
= 12.4 Hz) , ,2.06 (1H, m), 4.03 (1H, d, J" = 2.1 Hz) , 4.81 I 1 I ;¦
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(1H, dd, J = 10.2 Hz, J = 1.8 Hz), 4.89 (1H, dd, J = 17.0 Hz, J" = 1.1 Hz) , 5.66 (1H, ddd, J = 17.3 Hz , J = 10.0 Hz, J = 8.5 Hz) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 4.9, 7.0, 13.7, 17i.7, 20.0, 23.0, 27.6, 34.7, 40.7, 40.8, 42.1, 53.1, 56.1, 69!.4, 111.4, 145.4; S (EI) m/z 293 ( [M - C2H5]+, 98), 279 (43), 225 (18), 189 (39),- 135 (49), 103 (100); masa exacta calculada para C18H33OSi ( [M - C2H5]+) 293.2301, obtenida 293.2295. Des-A,?-8ß- [ (trietilsilil) oxi] -24-norcolan-23-ól (7) . A una solución en agitación del producto 6 (140 'mg; 0.43 mmoles) en THF (5 mL) se le adicionó gota a gota luna solución 0.5 M de 9-borabiciclo [3.3.1] nonano en THF (8.8 mL; 4.4 mmoles) . Después de 4 h, la reacción se interrumpió con MeOH (2 mL) , se enfrió a 0°C después de 15 minutos y se trató sucesivamente con una solución acuosa 6 M de NaOH (1 mL) y una solución acuosa al 30% de H202 (2 mL) . Entonces, la mezcla se calentó a 55°C durante 1 h, se enfrió yj se trató con salmuera (10 mL) . La mezcla se extrajo con éter dietílico (3 x 40 mL) . La fase orgánica se secó en MgS04 anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en un cartucho de gel de sílice Sep-Pack (5 - 20% acetato dé etilo/hexano) para obtener 130 mg (0.38 mmoles; 89% de rendimiento) del producto 7. [a] D = +43.9 (c 1.00, CHC13) ; H NMR (400 MHz, CDC13) d 0.55 (6H, q, J = 7.9 Hz) , 0.92 (3H, d, J = 6.6 Hz) , 0.95 (9H, t, J = 7.9 Hz) , 3.60 -
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3.66 (1H, m) , 3.68 - 3.74 (1H, m) , 4.03 (1H, d, J = 2.0 Hz) ; 13C MR (100 Hz , CDC13) d 4.9, 6.9, 13.5, 17.7, 18.8, 23.0, 27.4, 32.5, 34.6, 38.9, 40.8, 42.2, 53.1, 57.0, 61.0, 69.4; MS (EI) m/z 340 (M+, 36), 325 (11), 311 (79), 297 (67) , 191 (100) ; masa exacta calculada para C20H40P2SÍ I 340.2798, obtenida 340.2791. Des-A,?-8ß- [ (trietilsilil) oxi] -24 -norcolan-23 -al
(8) . A una solución en agitación del producto 7 (130 mg;
0.38 mmoles) , trietilamina (106 µ???; 77 mg; 0.76 mmoles) y D SO (54 µ?,; 59 mg; 0.76 mmoles) en CH2C12 (2 mL) se: le adicionó en complejo de trióxido de azufre piridina (122 mg; 0.76 mmoles) a 0 °C. Después de 2 h, se adicionó CH2C12 (50 mL) y la mezcla se lavó con agua (10 mL) . La fase orgánica se secó en MgS04 anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en un cartucho de gel de sílice Sep-Pack (0 - 5% acetato de etilo/hexano) para obtener 105 mg (0.31 mmoles; 82% de rendimiento) del producto 8. [a] D = +24.6 (c 0.90, CHC13) ; XH NMR (400 MHz, I
CDCI3) d 0.55 (6H, q, J" = .7.9 Hz) , 0.93 - 0.97 (12H, ¡m) , 0.99 (3H, d, J = 6.5 Hz) , 1.95 (1H, br d, J" = 12.5 Hz) , 2.00 - 2.07 (1H, m) , 2.45 (1H, dd, J = 15.8 Hz, J = 2.2 Hz) , 4.04 (1H, d, J = 1.9 Hz) , 9.75 (1H, dd, J = 3.5 Hz, J = 1.4 Hz) ;13C NMR (100 MHz, CDC13) d 4.9, 6.9, 13.5, 17.6, 19.9, 20.9, 27.6, 31.3, 34.5, 40.6, 42.3, 50.8, 53.0, 5¿.5, 69.2, 203.7; MS (El) m/z 338 (M+, 23), 323 (6), 309 (100),
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? 23
295 (43); masa exacta calculada para C20H38O2Si 338.26¡41, obtenida 338.2631. Des-A,B-23,23-difluoro-8P- [ (trietilsilil) oxji] -24-norcolano (9) . A una solución en agitación del producto 8 (103 mg; 0.30 mmolés) en CH2C12 (1 mL) se le adicijonó trifluoruro de (dietilamino) azufre (47 56 mg; Q.36 mmoles) a 0 °C. El baño de enfriamiento se retiró yj la mezcla se agitó durante 5 h. Luego, se le adicionó ¡una i solución acuosa de NaHC03 (0.5 mL) y agua (4 mL) y la mezcla se extrajo con hexano (3 x 20 mL) . La fase orgánica se secó en MgS04 anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en un cartucho de gel de sílice Sep- Pack (hexano) para obtener 40 mg (0.11 mmoles; 37% de rendimiento) del producto 9. [a] D = +24.6 (c 0.90, CHCÍ3); ; 'H MR (400 MHz, CDC13) d 0.55 (6H, q, J = 7.9 Hz) , 0.9j3 -0.97 (12H, m) , 1.00 (3H, d, J = 6.5 Hz) , 4.03 (1H, d, í ;
J" = 2.3 Hz) , 5.86 (1H, tdd, JH.F = 57.1 Hz, J = 6.3 Hz , ¡J" ' = 4.5 Hz) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 4.9, 6.9, 13.4, 17^6, 19.1, 22.9, 27.4, 31.0, 34.5, 40.2 (t, JC.F = 19.9 Hz)', 40.7, 42.2, 53.1, 56.6, 69:3, 117.4 (t, JC.F = 238 Hz);: 19F
NMR (376 MHz, CDC13) d (vs . TFE indirectamente) MS (ESÍ)
361 ( [M + H] +) , 360 (M+) . ' ' Des-A,B-23 , 23-difluoro-24-norcolan-8P-ol (. 0) .
Una solución del producto 9 (40 mg; 0.11 mmoles) en ÉtOH (2.5 mL) se trató con ácido (15) - (+) 10-canforsulfónico (30
ee4i.i6 ;
mg; 0.13 mmoles) durante la noche. Luego, una solución acuosa saturada de NaHC03 (0.5 mL) y agua (5 mL) y la mezcla, se extrajeron con CH2C12 (5 x 15 mL) . La fase orgánica se secó en MgSO„ anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en un cartucho de gel de sílice Sep-Pack (5 - 15% acetato de etilo/hexano) para obtener 25 mg (0.10 mmoles ; 92% de rendimiento) del producto 10. [a]D = +37.0 (c 1.25, CHCl3) ; XH NMR (400 MHz, CDC13) d 0.96 (3H, s) , 1.01 (3H, d, J = 6.6 Hz) , 4.08 (1H, br s) , 5.87 (1H, tdd, J„_F = 57.0 Hz, J = 6.2 Hz, J = 3.5 Hz) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 13.4, 17.4, 19.0, 22.4, 27.2, 31.0 (t, JC.F = 4.7 Hz) , 33.5, 39.9 - 40.3 (2C, m) , 41.9, 52.5, 56.4, 69.2, 117.24 (t, JC.F = 238 Hz) ; MS (El) m/z 246 (M+, 8), 231 (20), 211 (8), 125 (18), 111 (100); I masa exacta calculada para C14H24F20 246.1795, obtenida 246.1800. Des-A,B-23,23-difluoro-24-norcolan-8-ona (11) . A una solución en agitación del producto 10 (17 mg; 69 µp???e?) y PPTS (3 mg) en CH2C12 (3 mL) se le adicionó 'PDC (75 mg; 200 µp????e) a 0 °C. El baño de enfriamiento se retiró y la mezcla se agitó durante 2 h y después se purificó en un cartucho de gel de sílice Sep-Pack (5 - ;15% acetato de etilo/hexano) para obtener 14 mg (57 µp????ß, 83% de rendimiento) del producto 11. ?? NMR (400 MHz, CDC13) d 0.67 (3H, s) , 1.07 (3H, d, J = 6.4 Hz), 2.47 (1H, dd, J =
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11.7 ??, J = 7.5 ??) , 5.88 ; (1?, tdd, JH_F = 53.9 ??, «J = ¡6.1 ??, J = 3.6 ??) ; 13C MR (100 ??? , CDC13) d 12.4, lSj.O;, 19.2, 23.9, 27.5, 31.1, (t,' JC.F = 4.6 ??) , 38.7, 40.0 (t, JC_F = 19.9 ??) , 40.9, 49.7, 56.4, 61.8, 117 (t, = ¡23'8 ??) , 211.6; MS (El) tp/? 244 (?\ 92) , 229 (51) , 201 (48) , 151 (97) , 125 (100) ;, masa exacta calculada para C14H22F20 244.1639, obtenida 244.1627. 23, 23-Difl oro-la-hidroxi-2-metilen-19-nor- ! bishomopregnacalciferol (14) . A una solución en agitación de óxido de fosfina 12 (43 mg; 74 µp???ß?) en THF (500 µ?) se le adicionó una gota de una solución 1.8 de fenil litio en éter di-n-butílicó a -20 °C hasta que la solución desarrolló un color naranja. Luego, se adicionó la siguiente fracción de fenil litio (39 µL,· 70 µ????e?) . Después de 20 minutos, la mezcla se enfrió a -78 °C yj se adicionó, por medio de una cánula, una solución jdél producto 11 (14 mg; 57 µ????eß) en THF (300 µL) y la mezcla ? se agitó durante 3 h. Luego, se le adicionó una solución acuosa saturada de NH4C1 (0.5 mL) y agua (5 mL) y la mezcla i se extrajo con hexano (3 x 20 mL) . La fase orgánica se secó en MgS04 anhidro y se concentró a presión reducida. j El I residuo se purificó en un cartucho de gel de sílice Sjep- Pack (0 - 3% acetato de étilo/hexano) para obtener 27 mg del producto 13 crudo. ! El producto 13 se disolvió en EtOH (2 mL) y se
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trató con ácido (1S) - (+) -10-canforsulfónico (20 mg; : 86 µp???ß?) durante la noche. El disolvente se burbujeó parcialmente con argón y el residuo se purificó en un cartucho de gel de sílice Sep-Pack (10 - 40% acetato1 de etilo/hexano) y posteriormente por HPLC (10% isopropanol/hexano; Zorbax Rx-Sil 9.4 mm x 25 cm, 5 ?µp?; 4 mL/min. ; Rt = 6.82 min.) para obtener 12.5 mg (33 µp??? ; 58% de rendimiento a partir de 10) de 14. UV (EtOH) Xmax = 244, 251, 260 nm; XH NMR (500 MHz, CDC13) d 0.58 (3H, s) , 1.04 (3H, d, J = 6.5 Hz) , 2.27 (1H, dd, J = 12.8 Hz ,
= 8.7 Hz), 2.34 (1H, dd, J = 13.5 Hz, J" = 6.0 Hz) , 2.56 (1H, dd, J = 13.4 Hz, J" = 3.5 Hz) , 2.82 (1H, dd, J" = 12.8 Hz , J = 3.6 Hz) , 2.87 (1H, dd, J = 13.1 Hz , J = 4.5 Hz), 4.46 -4.50 (2H, m) , 5.09 (1H, s) , 5.11 (1H, s) , 5.76 - 6.01 (2H, m) , 6.35 (1H, d, J = 11.3 Hz) ; 13C NMR (125 MHz, CDC1]) d 12.0, 19.2, 22.2, 23.3, 27.6, 28.8, 31.7, 38.0, 40.0 - 40.3 (2C, m) , 45.6, 45.7, 56.2, 70.5, 71.8, 115.5, 117.2 (t, JC.F = 238 Hz), 124.0, 130.7, 142.8, 151.8; MS (El) m/z 380 (M\ 43), 362 (4), 333 (3), 295 (37), 220 (30), 205 (100); masa exacta calculada para C23H34F202Na 403.2425, obtenida 403.2424.
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(i) 03, MeOH, py; NaBH4, 76%. (¡i) A¾0, Et3N, DMAP, CH2CI2, 97%. (¡ii) TESOTf, 2,6-lutidina, CH2GI2. (iv) MeONa/MeOH, 97% de 2. (v) S03/py, DMSO, Et3N, CH2CI2, 78%. (vi) Ph3PMeBr, n-Buü, THF, 69% (vii) 9-BBN, THF; MeOH, 6M NaOH, 30% H202, 89%. (viii) S03/py, DMSO, Et3N, CH2CI2, 82%. (ix) DAST, CH2CI2, 37%. (x) CSA, EtOH, 92%. (xi) PDC, PPTS, CH2CI2, 83%. (xii) 12, Phü, THF. (xiii) CSA, EtOH, 58% de 11.
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ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE (2 OR) -23 , 23 -DIFLUORO-l -HIDROXI -2 -METILE - 19 - OR-BISHOMOPREGNACALCIFEROL La introducción de un grupo metileno en i la posición 2, un grupo metilo en la posición 20 (C-20) en su configuración R, un grupo etilo como cadena lateral unida en la posición 17 (C-17) y la sustitución de los dos átomos de hidrógeno que se ubican normalmente en la posición 23 (C-23) de la cadena lateral con dos átomos de flúor, tuvieron poco efecto en la unión de FF-44 al receptor de vitamina D recombinante de longitud -completa proveniente de rata, en comparación con la la, 25-dihidroxivitamina D3. El compuesto FF-44 se unió casi de la misma forma al receptor comparado con el estándar l,25-(OH)2D3 (Figura 1) . | A partir de estos resultados cabria esperar que el compuesto FF-44 tuviera actividad biológica equivalente. Sin embargo, de manera sorprendente, el compuesto FF-44 es un análogo bastante selectivo con una actividad biológica excepcional'. La Figura 5 muestra que el FF-44 tiene poca actividad en comparación con la de la la, 25- i dihidroxivitamina D3 (1, 25 (OH) 2D3) , la hormona natural,; en cuanto a la estimulación del transporte de calcio intestinal . La Figura 4 demuestra que el FF-44 tiene poca actividad de movilización de calcio óseo, comparado con la l,25(OH)2D3.
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piel seca, falta de firmeza dérmica adecuada, es dec|ir, piel flácida, e insuficiente secreción sebácea. El uso| de este compuesto no solo da como resultado la humectación^ de la piel sino que también mejora la función de barrera de¡ la piel. ¡ i '
La Figura 3 ilustra que el compuesto FF-44 ti¡ene alrededor de la misma actividad transcripcional en célujlas óseas que la la, 25-dihidroxivitamina D-o> . Este resultaI do I junto con la actividad de diferenciación celular de | la Figura 2, sugiere que el FF-44 será muy eficaz en ! la soriasis porque tiene actividad celular directa en ' la i generación de la diferenciación celular, la transcripción
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génica y la supresión de proliferación celular. Esjtos datos también indican que el FF- 4 puede tener una i ¡ actividad significativa como antineoplásico, en especial, contra leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer; de j piel y cáncer prostático. j La potente actividad del FF-44 en i la diferenciación de HL-60 sugiere que será activo en j la supresión del crecimiento de las glándulas paratiroidea's y en la supresión del gen preproparatiroideo . i
MÉTODOS EXPERIMENTALES Unión al receptor de la vitamina D j Material de prueba Fuente de proteína ¡ ( ; > · ' ! '
El receptor recombinante de longitud completa proveniente de rata se expresó en células de E. coli BL21
(DE3) Codon Plus RIL y se purificó hasta homogeneidad mediante el uso de dos diferentes sistemas de cromatografía en columna. El primer sistema fue una resina de afinidad de níquel que utiliza en esta proteína la etiquetaj de i histidina en la terminal C. La proteína que se eluyój de esta resina se purificó posteriormente por medio de cromatografía de intercambio iónico (S-Sepharose Fast I j
Flow) . Alícuotas de la proteína purificada se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C
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hasta el momento de su utilización. Para su uso en ensayos de unión, la proteína se diluyó en TEDK50 (50 mM Tris, 1.5 m EDTA, pH 7.4, 5 mM DTT, 150 mM KCl) con detergente CHaps i al 0.1%. Las concentraciones de proteína receptora y ligando se optimizaron de tal manera que no más de 20% de ligando radiomarcado adicionado se unió al receptor. ; Medicamentos de estudio Los ligandos sin etiquetar, se disolvieron en etanol y las concentraciones se determinaron por medio de i espectrofotometría UV (1,25 (OH) 2D3 : coeficiente de extinción molar = 18,200 y max = 265 nm; An logos: coeficiente de extinción molar = 42,000 y Xmax = 252 nm) . Se adicionó ligando radiomarcado (3H-1, 25 (OH) 2D3, -159 Ci/mmoles) | en etanol a una concentración final de 1 nM. Condiciones del ensayo Se adicionaron ligandos radiomarcados y sin marcar a 100 mcl , de la proteína diluida, a una concentración final de etanol <10%, se mezclaron y se incubaron sobre hielo durante la noche para lograr el equilibrio de unión. Al día siguiente, se adicionaron '¦.100 mcl de la suspensión de hidroxiapatita (50%) a cada tubo y se mezclaron a intervalos de 10 minutos durante 30 minutos. La hidroxilapatita se recolectó por centrifugación y luego se lavó tres veces con amortiguador Tris-EDTA (50 mM Tris, 1.5 mM EDTA, pH 7.4) que contenía Tritón X-100 al 0.5%.
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Después del lavado final, los glóbulos se transfirieron a viales para centelleo que contenían 4 mi de mezcla para centelleo Biosafe II, se mezclaron y se colocaron en un contador de centelleo. La unión total se determinó a partir de los tubos que contenían sólo ligando radiomarcado . Diferenciación de HL-60 Material de prueba Medicamentos de estudio Los medicamentos de estudio se disolvieron1 en i etanol y las concentraciones se determinaron por medio de espectrofotometría por UV. Se prepararon diluciones en serie de tal manera que fuera posible analizar un intervalo de concentraciones de medicamento sin cambiar j la concentración final de etanol (< 0.2%) presente en los cultivos celulares .' Células Células humanas de leucemia promielocítica (HL60) se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía suero fetal de bovino al 10%. Las células se incubaron a 37°C en presencia de C02 al 5%. Condiciones del ensayo Las células HL60 se depositaron en una placa a 1.2 x 105 células/ml. Dieciocho horas después de depositar las células, por duplicado se trataron con el medicamento.
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Cuatro días después, las células se cosecharon y se realizó un ensayo de reducción con nitro tetrazolio (Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974). El porcentaje de células diferenciadas se determinó por el conteo de , un total de 200 células y se registró el número que contenía depósitos de formazán azul-negro intracelular . La verificación de la diferenciación a células monocíticas se determinó por medición de la actividad fagocítica (no se muestran datos) . Ensayo de transcripción in vitro La actividad de transcripción se midió en células (óseas) que se transfectaron establemente con un promotor génico de 2 -hidroxilasa (240hasa) en la dirección 5' de un gen indicador (Arbour, et al., 1998). Se les suministro a las células un intervalo de dosis. Dieciséis horas después de suministrar la dosis a las células, éstas se cosecharon y se midieron las actividades por medio de un luminómetro. RLU = unidades relativas de luciferasa. Transporte de calcio intestinal y movilización de calcio óseo Ratas macho, Sprague-Dawley recién destetadas, se sometieron a la Dieta 11 (0.47% Ca) aceite +AEK durante una semana y después a la Dieta 11 (0.02% Ca) aceite +AEK durante 3 semanas. Después, la dieta de la ratas se cambió a una que contenía 0.47% de Ca durante una semana y
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enseguida dos semanas con una dieta que contenía 0.02% de
Ca. La administración de la dosis comenzó durante la última semana de la dieta de 0.02% de Ca. Cuatro dosis consecutivas \ por vía intraperitoneal (i.p.) se administraron con alrededor de 24 horas de intervalo. Veinticuatro horas después de la última dosis, se extrajo sangre del cuello seccionado y se determinó la concentración de calcio sérico como una medida de la movilización del calcio óseo. También se recolectaron 'los primeros 10 cm de intestino para el análisis del transporte I de calcio mediante el método del saco intestinal evertidp.
INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS Unión VDR, diferenciación de células HL60 y actividad de transcripción. El FF-44 (Ki=2xl0"10M) es itan activo como la hormona natural la, 25 -dihidroxivitamina D3
(Ki=5xl0 M) en cuanto a su capacidad para competir con la [3H] -1, 25 (OH) 2D3 por la unión al receptor de vitamina D recombinante de longitud completa derivada de rata (Figura 1) . También hay una pequeña diferencia en el FF-44 (EC50=lxlO"7M) en cuanto a su capacidad (eficacia o potencia) para promover la diferenciación de células HL-60 en comparación con la la, 25 -dihidroxivitamina D3 (EC50=2xlO~ 9M) (Véase la Figura 2) . También, el compuesto FF-44 (iEC50 = lxl08 ) ) tiene actividad transcripcional en células ósea
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similar a la de la la, 25-dihidroxivitamina D3 (EC50=3xlO"j0M) i
(Véase la Figura' 3) Estos resultados sugieren que el FF-44 será muy eficaz en la soriasis porque tiene actividad celular directa en la generación de la diferenciación celular, la transcripción , génica y la supresión i de
\ . . . proliferación celular. - Estos datos también indican que el
FF-44 tendrá una significativa actividad como antineoplásico, en especial, contra leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama/ cáncer de piel y cáncer prostático, así como contra padecimientos de la piel, por ejemplo, p^el j ? seca (falta de hidratación dérmica) , relajamiento de¡ la piel (insuficiente firmeza de la piel) , insuficiente secreción de grasa y arrugas. También es de esperarse que sea muy activo en suprimir en hiperparatiroidismo secundario, en especial, en individuos que tengan enfermedad renal crónica e individuos con diálisis. Movilización de calcio del hueso y absorción de calcio intestinal en animales deficientes en vitamina D. ! Se evaluaron las actividades de FF-44 y l,25(OH)2D3 en intestino y huesos, utilizando ratas deficientes en vitamina D sometidas a una dieta baja en calcio (0.02%) . Tal como se esperaba, la hormona nativa (1, 25 (OH) 2D3) aumentó ¡los niveles de calcio sérico (Figura 4) . La Figura 4 muestra que el FF-44 tiene poca o nula actividad para movilizar calcio a partir de huesos. La administración de FF-4'4 ,a
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2340 pmoles/día durante 4 días consecutivos no dio lugar a movilización de calcio óseo y al aumentar la cantidad de iFF-44 a 35100 pmoles/día tampoco tuvo ningún efecto. j El transporte de calcio intestinal se evaluó j en los mismos grupos de animales por el método del s'aco intestinal evertido (Figura 5) . Estos resultados muestran que el compuesto FF-44 no estimula el transporte de calcio intestinal cuando se administra a 2340 pmol/día, mientras i que la l,25(OH)2D3 promueve un aumento significativo a juna dosis de 87 pmol/día. Incluso cuando se administraron 35100 pmoles/día de FF-44, no se registró una actividad importante de transporte de calcio intestinal, un aumento equivalente a 15 veces la dosis con respecto a la de 2|340 pmoles/día. De este modo, se concluye que el FE¡-44 i básicamente carece de actividad de transporte de caljcio intestinal a las dosis recomendadas. Estos resultados indican que el FF-44 es ! un excelente candidato para varias terapias en humanos, s gún se describe en la presente, y que puede ser muy útilj en varias circunstancias como la supresión ¡ de hiperparatiroidismo secundario de la osteodistrofia renal, enfermedades autoinmunes, cáncer y soriasis. El FF-44! es un excelente candidato, para tratar la soriasis porque: ¡(1) tiene significativa unión a VDR, actividad de transcripción y actividad de diferenciación celular; (2) carece , de
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responsabilidad hipercalcéraica a dosis relativamente bajjas, a diferencia de la l,25(OH)2D3; y (3) se sintetiza con facilidad. Puesto que el FF-44 tiene una significatjiva actividad de unión al receptor de vitamina D, pero poca o nula capacidad para elevar el calcio sérico sanguíneo, puede ser especialmente útil para el tratamiento : de hiperparatiroidismo secundario sobre todo en individuos a los que se les ha diagnosticado enfermedad renal crónica e individuos con diálisis, así como para el tratamiento osteodistrofia renal. Estos datos también indican que el compuesto FF-44 de la invención puede ser muy adecuado para tratamiento y profilaxis de trastornos humanos que se caractericen ¡por un desequilibrio en el sistema inmune, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes, que incluyen esclerosis múltiple, lupus, diabetes mellitus, rechazo del receptor al injerto y rechazo a trasplantes de órganos; y adicionalmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, como artritis reumatoide, asma y enfermedades inflamatorias del intestino como la enfermedad celiaca, la colitis ulcerativa y¡ la enfermedad de Crohn. El acné, la alopecia y la hipertensión son otros trastornos que se pueden tratar ¡con el compuesto FF-44 de la invención. Los compuestos de la invención de fórmula I y en particular los de fórmula la, también son útiles para
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prevenir o tratar la obesidad, inhibir la diferenciación de I adipocitos, inhibir la transcripción del gen SCD-1 ¡y/o reducir la grasa corporal en animales. Por lo tanto,; en algunas modalidades, un método para prevenir o tratar ¡ la obesidad, inhibir la diferenciación de adipocitos, inhibirla transcripción del ge SCD-1 y/o reducir la grjasa corporal en individuos animales, incluye administrar j al animal/ una cantidad eficaz de uno o más de los compuestos o una composición farmacéutica que incluya uno o más de ¡los compuestos de fórmula I. La administración del compuestjo ,'o de las composiciones farmacéuticas al individuo, inhibe! la diferenciación de adipocitos, inhibe la transcripción i génica y/o reduce la grasa corporal en el animal. ¡ El animal puede ser una persona, un animal doméstico corno! un i perro o un gato, o un animal de campo, en especial los ¡que proporcionan carne para consumo humano, por ejemplo, pollos, pavos, faisanes o codornices, así como, ganado bovino, ovino, caprino o porcino. Para los fines de prevención y/o tratamiento, los compuestos de la invención, definidos por la fórmula l,j se pueden formular para aplicaciones farmacéuticas como ¡una
con vehículos' sólidos, según los métodos convencionales
conocidos en la técnica. Cualquiera de estas formulaciones también puede contener excipientes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos, como estabilizantes, antioxidaríte, aglutinantes, colorantes o emulsifícantes o aditivos modificadores de sabor. Los compuestos de fórmula I y en particular el FF-44, se pueden administrar por vía oral, tópica, parenteral, rectal, nasal, sublingual o transdérmica. El compuesto se administra favorablemente por inyección o por infusión intravenosa o soluciones estériles adecuadas, o bien en forma de dosis líquidas o sólidas por el conducto alimentario, o también en forma de cremas, ungüentos, parches o vehículos similares adecuados para las aplicaciones transdérmicas . Una dosis de O.Olpg a 100Q pg día de los compuestos I, en particular del FF-44, ; de preferencia alrededor de 0. ^g a 500 µg por día, es adecuada para fines de prevención y/o tratamiento, esta dosis se ajusta según la enfermedad a tratar, su gravedad y la respuesta del individuo, como es sabido en la técnica. Puesto que los compuestos presentan especificidad de acción, cada uno puede administrarse solo o junto con dosis escalonadas de otro compuesto de vitamina D activo, por i ejemplo, loc-hidroxivitamina D2 o D3 o la, 25-dihidroxivitamina D3 , en situaciones en las que se considere favorable la presencia de diferentes grados; de
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movilización de mineral óseo y estimulación de transporte i de calcio. · ¡ Las composiciones destinadas a utilizarse en jlos tratamientos antes mencionados contienen una cantijdad eficaz de los compuestos I, en particular del FF-44, se|gún lo definido para las fórmulas I y la, como ingrediente i activo y un vehículo adecuado. Una cantidad eficaz de e'ste Í compuesto para utilizarse según esta invención, es i de alrededor de,0.0Í pg a 1000 g por g de la composición,; de preferencia alrededor de 0.1 µg a 500 µg por gramo de la composición, y se puede administrar por vía tópica, tfansdérmica, oral, rectal, nasal, sublingual o parenteral, en dosis alrededor de 0.01 g/día a 1000· g/día y de preferencia, alrededor de 0.1 µg/día de 500 µg/día. Los compuestos I, en particular el FF-44, se pueden formular ^como cremas, lociones, ungüentos, parches tópicos, comprimidos, cápsulas o tabletas, supositorios, aerosoles o en forma líquida como soluciones, emulsiones, dispersiones o suspensiones en disolventes o aceites farmacéuticamente aceptables e inocuos ; estas preparaciones pueden contener además otros componentes farmacéuticamente inocuos o benéficos, por ejemplo, estabilizantes , antioxidantes, colorantes, aglutinantes o aditijvos modificadores de sabor. Los compuestos I, en 'particular el FF-44, , se
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pueden administrar favorablemente en cantidades suficientes para efectuar la diferenciación de promielocitos a macrofagos normales. Las dosis según se describe en lo anterior ison adecuadas, se debe entender que las cantidades mencionadas se ajustarán según la gravedad de la enfermedad y el estado y respuesta del individuo, como es sabido en la técnica. Las formulaciones de la presente invención contienen un ingrediente activo asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable y como característica opcional contiene otros ingredientes terapéuticos. El vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de las formulaciones y no ser nocivo para el receptor de las mismas. Las formulaciones de la presente invención propias para la administración oral pueden estar en forma de unidades individuales como cápsulas, bolsitas, tabletas o comprimidos oblongos, cada uno conteniendo una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en la forma de polvo o gránulos; en la forma de una solución o una suspensión en un líquido acuoso o en un líquido no acuoso,- o en la forma de una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite. Las formulaciones para administración rectal pueden estar en la forma de un supositorio que incorpora el ingrediente activo y un vehículo como manteca de cacao o
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bien, en la forma de enema. Las formulaciones propias para la administración parenteral contienen una preparación acuosa u oleosa estéril del ingrediente activo, la cual, de preferencia,' es isotónica con la sangre del receptor. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas, como linimentos, lociones, aplicadores, emulsiones aceite en agua o agua en aceite, como cremas, ungüentos o pastas; o soluciones o suspensiones, como gotas; o atomizaciones. Para la administración nasal, se pueden emplear: la inhalación de polvos, formulaciones de autopropulsió'n o rocío, nebulizadores o atomizadores. Al suministrarse, las formulaciones tienen, de preferencia, un tamaño ¡ de partícula en el intervalo de 100 a 100µ. Convenientemente, las formulaciones puéden Í presentare en forma de unidades de dosificación y pueden prepararse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica de farmacia. El término "unidad de dosificaci 1ón" I se refiere a dosis unitaria, es decir, una sola dosis 'que puede administrarse al paciente como dosis unitaria física y químicamente estable, que contiene el ingrediente activo como tal o una mezcla de éste con diluyentes o vehículos farmacéuticos líquidos o sólidos.
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