MX2011000360A - Analogos de 2-metilen-20(21)-deshidro-19-nor-vitamina d. - Google Patents

Abstract

Esta invención describe análogos de la 2-metilen 20 (21)-deshidro-19-nor-vitamina D, y específicamente la 2metilen-20(21)-deshidro-19-nor-la, 25-dehidroxivitamina D3, y usos farmacéuticos de los mismos. Este compuesto exhibe una actividad de trascripción relativamente alta, así como una actividad pronunciada para detener la proliferación de las células no diferenciadas e inducir su diferenciación al monocito, evidenciado así el uso como un agente anticancerígeno y para el tratamiento de enfermedades de la piel tales como soriasis, así como condiciones de la piel tales como arruga, piel flácida, piel seca y secreción de cebo suficiente. Este compuesto también muestra una actividad menor in vivo en la movilización del calcio óseo y una actividad de transporte del calcio intestinal in vivo, similar, en comparación a la hormona nativa 1ª,25-dihidroxivitamin a D3, y por lo tanto, puede utilizarse para tratar trastornos autoinmunes o enfermedades inflamatoria en humanos, así como esteodistrofia renal. Este compuesto también puede utilizarse para el tratamiento o prevención de la obesidad.

Description

ANÁLOGOS DE 2 -METILEN-20 (21) -DESHIDRO- 19 -NOR- VITA INA D ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con compuestos de vitamina D, y más particularmente con análogos de 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-vitamina D, y sus usos farmacéuticos.

La hormona natural, la la, 25-dihidroxivitamina D3 y su análogo en la serie del ergosterol, es decir, la, 25-dihidroxivitamina D2, son conocidos por ser reguladores altamente potentes de la homeostasis del calcio en animales y humanos, y su actividad en la diferenciación celular" también se ha establecido, Ostrem et al., Proc . Nati. Acád. Sci. USA, 84, 2610 (1987). Muchos análogos estructurales de estos metabolitos se han preparado y probado, incluyendo la ?a-hidroxivitamina D3, ?a-hidroxivitamina D2, varias vitaminas homologadas de cadena lateral y análogos fluorados. Algunos de estos compuestos exhiben una separación de actividades interesante, en la diferenciación celular y en la regulación del calcio. Esta diferencia en la actividad puede ser útil en el tratamiento de una variedad de enfermedades, tales como la osteodistrofia renal, raquitismos resistentes a la vitamina D, osteoporosis , soriasis y ciertas malignidades.

Otra clase de análogos de vitamina D, es decir, los llamados compuestos de 19-nor-vitamina D, está caracterizada por el reemplazo del grupo metileno exocíclico del anillo A (carbono 19) , típico del sistema de la vitamina D, por dos átomos de hidrógeno. Las pruebas biológicas de tales análogos 19-ñor (por ejemplo, la, 25-dihidroxi-19-nor-vitamina D3) , reveló un perfil de actividad selectiva con alta potencia para inducir la diferenciación celular, y una actividad para movilizar el calcio muy baja. Así, estos compuestos son potencialmente útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de malignidades, o para el tratamiento de varios trastornos de la piel. Se han descrito dos métodos diferentes de síntesis de tales análogos de la 19-ñor vitamina D (Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 3_2, 7663 (1991), y DeLuca et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,086,191).

En la Patente de los Estados Unidos No. 4,666,634, los análogos 2p-hidroxi y alcoxi (por ejemplo, ED-71) de la la, 25-dihidroxivitamina D3 se han descrito y examinado por el grupo de Chugai como fármacos potenciales para la osteoporosis y como agentes antitumorales . Véase también Okano et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. 163 , 1444 (1989) . Otros análogos del anillo A sustituidos en la posición 2 (con hidroxialquilo, por ejemplo, ED-120, y grupos fluoroalquilo) de la la, 25-dihidroxivitamina D3, también se han preparado y probado (Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, lili (1993); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993); Posner et al., J. Org . Chem. 59, 7855 (1994), y J. Org. Chem. 60, 4617 (1995)).

Los análogos sustituidos en la posición 2 de la la, 25-dihidroxi-19-nor-vitamina D3 también se han sintetizado, es decir, compuestos sustituidos en la posición 2 con grupos hidroxi o alcoxi (DeLuca et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,536,713), con grupos 2 -alquilo (DeLuca et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,945,410), y con grupos 2 -alquilideno (DeLuca et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,843,928), que exhiben perfiles de actividad interesantes y selectivos. Todos estos estudios indican que los sitios de unión en los receptores de la vitamina D pueden acomodar diferentes sustituyentes en C-2 en los análogos de vitamina D sintetizados .

En un esfuerzo continuo por explorar la clase 19-ñor de los compuestos de vitamina D farmacológicamente importantes, los análogos que están caracterizados por la presencia de un sustituyente de metileno en el carbono 2 (C-2) , un grupo hidroxilo en el carbono 1 (C-l) , y una cadena lateral acortada anexa al carbono 20 (C-20) también se han sintetizado y probado. El la-hidroxi-2-metilen-19-nor-pregnacalciferol se describe en la Patente de los Estados Unidos 6,566,352, mientras que el la-hidroxi-2 -metilen-19-nor-homopregnacalciferol se describe en la Patente de los Estados Unidos 6,579,861 y el lot-hidroxi-2-metilen-19-nor-bishomopregnacalciferol se describe en la Patente de los Estados Unidos 6,627,622. Todos estos tres compuestos tienen una actividad de unión relativamente alta a los receptores de la vitamina D, y una actividad de la diferenciación celular relativamente alta, pero poca, si la hay, actividad calcémica, en comparación con la la, 25-dihidroxivitamina D3. Sus actividades biológicas hacen a estos compuestos candidatos excelentes para una variedad de usos farmacéuticos, como se expone en las patentes '352, v861 y '622.

Los compuestos de la 17-en vitamina D, así como los compuestos de vitamina D que tienen un enlace doble en la cadena lateral de los mismos, también son conocidos, y se han propuesto para varios usos f rmacológicos. Las enfermedades óseas tales como osteoporosis , trastornos de la piel tales como soriasis, cánceres tales como leucemia y condiciones cosméticas tales como arrugas, son sólo algunas de las aplicaciones propuestas para tales compuestos. Los compuestos de 17-eno se describen en las Patentes de los Estados Unidos 5,545,633; 5,929,056 y 6,399,797, mientras que los compuestos de 2-alquilideno que tienen una cadena lateral con un enlace doble en la misma, se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5,843,928.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida hacia los análogos de 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-vitamina D, su actividad biológica y varios usos farmacéuticos para estos compuestos. Estos nuevos compuestos de la vitamina D no conocidos hasta ahora, son los análogos de 19-nor-vitamina D que tienen un grupo metileno en la posición 2 (C-2) y un enlace doble localizado entre los átomos de carbono 20 y 21 en la cadena lateral. El análogo de vitamina D preferido es la 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-l , 25-dihidroxivitamina D3 (referidai aquí posteriormente como "Vit III 20-21" ) .

Estructuralmente , estos análogos de 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-vitamina D están caracterizados por la fórmula general I mostrada a continuación: en donde ??, X2 y X3, que pueden ser los mismos o diferentes, se seleccionan cada uno de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi . El análogo preferido es la 2-metilen-20 (21) -deshidro- 19 -ñor- la, 25 -dihidroxivitamina D3, que tiene la siguiente fórmula la: Los compuestos I anteriores, particularmente la, exhiben un patrón deseado y sumamente ventajoso de actividad biológica. Estos compuestos están caracterizados por una unión relativamente alta a los receptores de la vitamina D, que es aproximadamente igual a aquella de la hormona nativa la, 25-dihidroxi vitamina D3. Estos compuestos también tienen la capacidad de fomentar el transporte del calcio intestinal in vivo, de una manera dependiente de la dosis, y se clasificarían como que tienen aproximadamente la misma o igual actividad de transporte del calcio intestinal, en comparación con aquella de la 1a·, 25 -dihidroxivitamina D3. Estos compuestos I, y particularmente la, también tienen la capacidad de movilizar el calcio del hueso, y se clasificarían como que tienen una actividad para movilizar el calcio óseo menor, en comparación con la la, 25 -dihidroxivitamina D3. Es indeseable elevar el calcio en suero a niveles suprafisiológicos cuando se suprime el gen de la hormona preproparatiroidea (Darwish y DeLuca, Arch. Biochem. Biophys. 365, 123-130, 1999), y la proliferación de la glándula paratiroidea . Se espera que estos análogos que tienen una actividad de movilización del calcio óseo relativamente baja, mientras que también son muy activos en la diferenciación, sean útiles como una terapia para la supresión del hiperparatiroidismo secundario de la osteodistrofia renal.

También se ha descubierto que los compuestos I, particularmente la, de la invención, están especialmente adecuados para el tratamiento y profilaxis de trastornos humanos, que están caracterizados por un desequilibrio en el sistema inmune, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes, incluyendo esclerosis múltiple, lupus, diabetes mellitus, hospedero versus rechazo del injerto y rechazo de transplantes de órganos; y además para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide, asma, y enfermedades inflamatorias del intestino, tales como enfermedad celíaca, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. El acné, alopecia e hipertensión son otras condiciones que pueden tratarse con los compuestos de la invención.

Los compuestos I anteriores, y particularmente la, también están caracterizados por una actividad de la diferenciación celular relativamente alta y por fomentar la transcripción. Así, estos compuestos también proporcionan un agente terapéutico para el tratamiento de la soriasis, o como un agente anticancerígeno, especialmente contra la leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de piel y cáncer de próstata. Además, debido a su actividad de la diferenciación celular relativamente alta, estos compuestos proporcionan un agente terapéutico para el tratamiento de varias condiciones de la piel, incluyendo arrugas, falta de hidratación dérmica adecuada, es decir, piel seca, falta de firmeza de la piel adecuada, es decir, piel flácida y secreción de sebo insuficiente. El uso de estos compuestos, por lo tanto, no sólo resulta en la humectación de la piel, sino que también mejora la función de barrera de la piel .

Los compuestos de la invención de fórmula I, y particularmente de fórmula la, también son útiles para evitar o tratar la obesidad, inhibiendo la diferenciación de los adipocitos, inhibiendo la transcripción del gen SCD-1, y/o reduciendo la grasa corporal en sujetos animales. Por lo tanto, en algunas modalidades, un método para evitar o tratar la obesidad, inhibiendo la diferenciación de los adipocitos, inhibiendo la transcripción del gen SCD-1, y/o reduciendo la grasa corporal en un sujeto animal, incluye administrar a un sujeto animal, una cantidad efectiva de uno o más de los compuestos o una composición farmacéutica que incluye uno o más de los compuestos de fórmula I. La administración de uno o más de los compuestos o las composiciones farmacéuticas al sujeto, inhibe la diferenciación de los adipocitos, inhibe la transcripción del gen, y/o reduce la grasa corporal en el sujeto animal.

Uno o más de los compuestos pueden estar presentes en una composición para tratar las enfermedades y trastornos indicados anteriormente, en una cantidad de aproximadamente 0.01 g/g a aproximadamente 1000 yg/g de la composición, de manera preferida de aproximadamente 0.1 ug/g a aproximadamente 500 yg/g de la composición, y pueden administrarse de manera tópica, transdérmica, oral, rectal, nasal, sublingual o parenteral en dosificaciones de aproximadamente 0.01 yg/día a aproximadamente 1000 yg/día, de manera preferida de aproximadamente 0.1 yg/día a aproximadamente 500 yg/día.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos: Las Figuras 1-5 ilustran varias actividades biológicas de la 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-la, 25-dihidroxivitamina D3, referida aquí posteriormente como "Vit III 20-21", en comparación con la hormona nativa la, 25-dihidroxivitamina D3, aquí posteriormente "1, 25 (OH) 2D3" .

La Figura 1 es .una gráfica que ilustra la actividad relativa de Vit III 20-21 y l,25(OH)2D3 para competir para la unión con [3H] -1 , 25- (OH) 2-D3 al receptor de la vitamina D de rata recombinante, de longitud completa; La Figura 2 es una gráfica que ilustra el por ciento de diferenciación de las células HL-60 como una función de la concentración de Vit III 20-21 y 1 , 25 (OH) 2D3 ; La Figura 3 es una gráfica que ilustra la actividad de transcripción in vitro de l,25(OH)2p3 en comparación con Vit III 20-21; La Figura 4 es una gráfica que ilustra la actividad de movilización del calcio óseo de l,25(OH)2D3 en comparación con Vit III 20-21; y La Figura 5 es una gráfica que ilustra la actividad del transporte del calcio intestinal de l,25(OH)2D3 en comparación con Vit III 20-21.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-la, 25-dihidroxivitamina D3 (referida aquí posteriormente como "Vit III 20-21"), un análogo de la 19-nor vitamina D, que está caracterizado por la presencia de un sustituyente de metileno en el carbono 2 (C-2) , un enlace doble localizado entre las posiciones 20 y 22 de los átomos de carbono en la cadena lateral, se sintetizó y probó. Tal análogo de la vitamina D, pareció un objetivo interesante debido a que el grupo metileno relativamente pequeño en la posición C-2, no debería interferir con la unión al receptor de la vitamina D. Estructuralmente, este análogo 19-nor está caracterizado por la fórmula general la ilustrada previamente en la presente, y su profármaco (.en la forma hidroxi protegida) , está caracterizado por la fórmula general I ilustrada previamente en la presente.

La preparación de los análogos de 2-metilen- 20 (21) -deshidro-19-nor-vitamina D que tienen la estructura I, puede lograrse mediante un método general común, es decir, la condensación de una cetona II bicíclica del tipo de Windaus-Grundmann, con el óxido de fosfina alílico III del análogo de 2-metilen-19-nor-vitamina D IV correspondiente, seguido por la desprotección en C-l y C-3 en el último compuesto (véase el Esquema de Reacción IV en la presente) : En las estructuras II, III y IV, los grupos Xlf X2 y X3 son grupos protectores de hidroxi, de manera preferida, t-butildimetilsililo, también se entiende que cualquiera de las funcionalidades que pueden ser sensibles o que interfieran con la reacción de condensación, están protegidas de manera adecuada como es bien conocido en la técnica. El proceso mostrado anteriormente, representa una aplicación del concepto de la síntesis convergente, que se ha aplicado de manera efectiva para la preparación de compuestos de vitamina D [por ejemplo, Lythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 590 (1978); Lythgoe, Chem. Soc . Rev. 9, 449 (1983); Toh et al., J. Org. Chem. 48, 1414 (1983); Baggiolini et al., J. Org. Chem. 51, 3098 (1986); Sardina et al., J. Org. Chem. 51, 1264 (1986); J. Org. Chem. 51, 1269 (1986); DeLuca et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,086,191; DeLuca et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,536,713] .

La hidrindanona de la estructura general II no se conoce. Puede prepararse mediante el método mostrado en los Esquemas de Reacción I, II y III presentes (véase la preparación del compuesto Vit III 20-21) .

Para la preparación de los óxidos de fosfiná requeridos de la estructura general III, se ha desarrollado una ruta sintética empezando a partir del derivado de quinicato de metilo, que se obtiene fácilmente del ácido ( IR, 3R, 4S , 5R) - ( - ) -quínico comercial, como se describe por Perlman et al., Tetrahedron Lett . 3_2, 7663 (1991) y DeLuca et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,086,191.

El proceso general de la síntesis de los compuestos I y la se ilustra y describe más completamente en la Patente de los Estados Unidos No. 5,843,928, titulada "Compuestos de 2-Alquiliden-19-Nor-Vitamina D" , la especificación de la cual se incorpora de manera específica en la presente como referencia.

Como se utiliza en la descripción y en las reivindicaciones, el término "grupo protector de hidroxi", significa cualquier grupo utilizado comúnmente para la protección temporal de las funciones hidroxi, tales como, por ejemplo, grupos alcoxicarbonilo, acilo, alquilsililo o alquilarilsililo (referido aquí posteriormente simplemente como grupos "sililo"), y grupos alcoxialquilo . Los grupos protectores de alcoxicarbonilo son agrupaciones de alquil-O-CO-, tales como metoxicarbonilo , etoxicarbonilo , propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, ter-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo o aliloxicarbonilo . El término "acilo" significa un grupo alcanoilo de 1 a 6 carbonos, en todas sus formas isoméricas, o un grupo carboxialcanoilo de 1 a 6 carbonos, tales como un grupo oxalilo, malonilo, succinilo, glutarilo, o un grupo acilo aromático tal como benzoilo, o un grupo halo, nitro o benzoilo sustituido con alquilo. La palabra "alquilo" , como se utiliza en la descripción o en las reivindicaciones, denota un radical alquilo de cadena lineal o ramificada de 1 a 10 carbonos, en todas sus formas isoméricas . Los grupos protectores de alcoxialquilo son agrupaciones tales como metoximetilo, etoximetilo, metoxietoximetilo. o tetrahidrofuranilo y tetrahidropiranilo . Los grupos protectores de sililo preferidos son trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, dibutilmetilsililo, difenilmetilsililo, fenildimetilsililo, difenil-t-butilsililo y radicales sililo alquilados análogos. El término "arilo" especifica un grupo fenilo sustituido con fenilo, o un alquilo, nitro o halo.

Un grupo "hidroxi protegido" es un grupo hidroxi derivado o protegido por cualquiera de los grupos anteriores utilizados comúnmente para la protección temporal o permanente de las funciones hidroxi, por ejemplo, los grupos sililo, alcoxialquilo, acilo o alcoxicarbonilo, como se definió previamente. Los términos "hidroxialquilo" , "deuteroalquilo" y "fluoroalquilo" , se refieren a un radical alquilo sustituido con uno o más grupos hidroxi, deuterio o flúor, respectivamente.

De manera más específica, deberá hacerse referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos y a la descripción, así como a los Esquemas de Reacción I, II, III en la presente, para una ilustración detallada de la preparación del compuesto Vit III 20-21.

En este ejemplo, los productos específicos identificados cono números arábicos (1, 2, 3), se refieren a estructuras específicas identificadas en los Esquemas de Reacción I, II, III y IV.

EJEMPLO Química. Los espectros de absorción ultravioleta (UV) se registraron con un espectrómetro UV-vis Hitachi Modelo 60-100 en el solvente indicado. Los espectros de la resonancia magnética nuclear de 1H (RMN) se registraron a 500 MHz con un espectrómetro Bruker AM-500 FT en deuteriocloroformo . Los desplazamientos químicos (d) , se reportaron campo abajo del Me4Si interno (d 0.00) . Los espectros de masas se registraron a 70 eV en un instrumento Kratos DS-50 TC equipado con un sistema de datos Kratos MS-55. Las muestras se introdujeron en la fuente iónica mantenida a 120-250°C vía una sonda de inserción directa. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se realizó en un cromatografo para líquidos Waters Associates equipado con un sistema de suministro de solvente Modelo 6000A, un inyector Universal Modelo 6 UK, un detector de absorbancia afinable Modelo 486, y un refractómetro diferencial R 401.

Ejemplo 1 Des-A, B-23, 24 -dinorcolan- 8ß, 22-diol (2). Un matraz de dos cuellos secado a la llama de 1000 mL, se cargó con ergocalciferol 1 (5 g, 12.6 mmoles) , piridina (5 mL) , y MeOH anhidro (400 mL) . La solución se enfrió a -78°C en una atmósfera de argón. Se burbujeó 03 a través de la solución hasta que se desarrolló y persistió un color azul oscuro (aproximadamente 1 hora) . La solución se trató con 0 hasta que el color azul oscuro se desvaneció (15 minutos). A continuación, se agregó NaBH (1.5 g, 39.7 mmoles) . Después de 15 minutos, se agregó una segunda porción de NaBH4 (1.5 g, 39.7 mmoles), y la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. A continuación, se agregó una tercera porción de NaBH4 (1.5 g, 39.7 mmoles), y la reacción se agitó durante la noche. La reacción se enfrió agregando agua (50 mL) . El metanol se evaporó in vaccuo y el residuo se disolvió en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con una solución acuosa de HC1 1N (100 mL) , una solución saturada de NaHC03 (100 mL) y salmuera (100 mL) . La fase orgánica se secó (Na2S04) , se filtró y evaporó. La purificación mediante cromatografía sobre gel de sílice (25% de acetato de etilo/hexano) , proporcionó 2.18 g (10.3 mmoles, 81%) del diol 2 como un sólido blanco. P. f. 110-111°C ?? RMN (400 MHz , CDC13) d: 0.96 (3H, s) , 1.03 (3H, d, J = 6.6 Hz) , 3.38 (1H, dd, J = 10.5, 6.7 Hz), 3.64 (1H, dd, J = 10.5, 3.2 Hz) , 4.09 (1H, m) ; 13C RMN (100 MHz, CDC13) d: 69.2, 67.8, 52.9, 52.4, 41.8, 40.2, 38.2, 33.6, 26.6, 22.6, 17.4, 16.6, 13.6; MS m/z (intensidad relativa): 212 (M+, 2), 194 (M+-H20, 15), 179 (M+-H20-CH3, 18), 125(43), 111 (100); la masa exacta calculada para Ci3H220 [M-H20] + es 194.1671, la medida es 194.1665.

Des -A, B-22- (p-toluensulfoniloxi) -23,24-dinorcolan-dß-?? (3). Una solución del diol 2 (1 g, 4.71 mmoles) en piridina anhidra (12 mL) , se enfrió a -25°C y una solución preenfriada de cloruro de tosilo (1.08 g, 5.66 mmoles) en piridina anhidra (2 mL) , se agregó gota a gota. La mezcla de reacción se agitó a esa temperatura durante 4 horas y se dejó calentar a 0°C y se agitó a esa temperatura durante 20 horas adicionales. La mezcla de diluyó con CH2C12 (50 mL) y se lavó con una solución saturada de CuS04 (30 mL) , HC1 1N (30 mL) , y agua (50 mL) . La fase orgánica se secó (NaS04) , se filtró y se concentró. La purificación mediante cromatografía sobre gel de sílice (25% de acetato de etilo/hexano) , proporcionó 1.7 g (4.64 mmoles, 98%) del hidroxil tosilato 3. H RMN (400 MHz , CDC13) d: 0.89 (3H, s) , 0.96 (3H, d, J = 6.6 Hz) , 2.45 (3H, s) , 3.8 (1H, dd, J = 9.2, 6.2 Hz), 3.95 (1H, dd, J = 9.2, 3.0 Hz) , 4.06 (1H, m) , 7.35 (2H, d, J = 8.2 Hz) , 7.78 (2H, d, J = 8.2 Hz); 13C RMN (100 MHz, CDC13) d: 144.7, 133.0, 129.8, 127.9, 75.6, 69.0, 60.4, 52.2, 41.9, 40.1, 35.7, 33.5, 26.4, 22.4, 21.6, 17.3, 16.7, 13.4; MS m/z (integración relativa): 366 (M+, 6), 194(14), 179(16), 125(30), 111(100); la masa exacta calculada para C2oH3oS04Na (M + Na+) es 389.1763, la medida es 389.1768.

Des-A, ?-8ß- [ (ter-butildimetilsilil) oxi] -22- (p-toluensulfoniloxi) -23 , 24 -dinorcolano (4). A una solución enfriada a 0°C de hidroxil tosilato 3 (1.5 g, 4.09 ramoles) en DMF anhidro (20 mL) , se le agregó 2,6-lutidina (0.580 mL, 0.52 g, 4.92 mmoles) , seguido por TBSOTf (1.1 mL, 1.30 g, 4.92 mmoles) . La solución se agitó a 0°C durante 15 minutos y se agregó agua (10 mL) . La mezcla se extrajo con CH2C12 (3 x 40 mL) , y las fases orgánicas combinadas se lavaron con un solución acuosa de NaOH 1N (40 mL) , se secaron (Na2S04) , se filtraron y concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (5% de acetato de etilo/hexano) para proporcionar 1.94 g (4.04 mmoles, 99%) de 4. XH RMN (400 MHz, CDC13) d: 0.01 (6H, s) , 0.88 (12H, s) , 0.96 (3H, d, J = 6.8 Hz), 2.45 (3H, s) , 3.81 (1H, dd, J = 9.2, 6.4 Hz), 3.97 (1H, dd, J = 9.7, 3.0 Hz) , 3.99 (1H, m) , 7.34 (2H, d, J = 8.08 Hz) , 7.79 (2H, d, J = 8.2 Hz) . 13C RMN (100 MHz, CDC13) d: 114.5, 133.4, 129.8, 127.9, 74.8, 69.3, 52.3, 52.6, 42.2, 40.5, 35.8, 34.4, 26.6, 25.9, 23.0, 21.6, 18.0, 17.6, 16.8, 13.7, -4.8, -5.1.

Des-A, ?-8ß- [ (ter-butildimetilsilil) oxi] -23, 24-dinorcolan-22-al (5). Una solución de 4 (1.9 g, 3.96 mmoles) en DMSO (5 mL) se agregó a una suspensión de NaHC03 (1.5 g, 17.9 mmoles) en DMSO (20 mL) a temperatura ambiente. La mezcla se calentó a 150°C bajo argón durante 15 minutos y se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó agua (50 mL) seguida por acetato de etilo (50 mL) y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 mL) . Las fases orgánicas combinadas s.e secaron (Na2S04) , se filtraron y concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (2% de acetato de etilo/hexano) para proporcionar 0.93g (2.87 mmoles, 73%) del aldehido 5. H1 RMN (400 MHz , CDC13) d: 0.01 (6H, 2s) , 0.89 (9H, s), 0.97 (3H, s) , 1.09 (3H, d, J = 6.8 Hz) , 2.35 (1H, ra), 4.03 (1H, m) , 9.58 (1H, d, J = 3.2 Hz) . 13C RMN (100 MHz, CDCl3) d: 205.2, 69.1, 52.4, 51.8, 49.1, 42.7, 40.5, 30.8, 34.3, 26.2, 25.8, 23.3, 17.6, 14.1, 13.3, -4.7, -5.1.

Des-A, ?-8ß- [ (ter-butildimetilsilil ) oxi] -pregnan-20-ona (6) . Un matraz secado a la llama se cargó con t-BuOK (1.55 g, 13.9 mmoles) y t-BuOH anhidro (30 mL) a temperatura ambiente. Se burbujeó 02 a través de la solución durante 15 minutos. Una solución del aldehido 5 (0.9 g, 2.78 mmoles) en t-BuOH anhidro (15 mL) se agregó a la mezcla de reacción y se burbujeó 02 a través de la solución durante 10 minutos adicionales. La reacción se enfrió con agua (15 mi) y se extrajo con éter (3 x 30 mL) . Las fases orgánicas combinadas se secaron (Na2S04) , se filtraron y concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (3% de acetato de etilo/hexano) para proporcionar 0.61 g (1.97 mmoles, 71%) de la cetona 6. 1H RMN (400 MHz, CDC13) d: 0.01 (6H, s), 0.84 (3H, s), 0.87 (9H, s) , 2.08 (3H, s), 2.46 (1H, t, J = 9.1Hz), 4.03 (1H, m) . 13C RMN (100 MHz, CDC13) d: 209.5, 69.0, 64.5, 53.2, 43.7, 39.8, 34.2, 31.6, 25.8, 23.2, 21.8, 17.6, 15.5, -4.8, -5.2. 5-Bromo-2-metil-2-pentanol (8) . A una solución enfriada a -20°C de etil-4-bromobutirato 7 (5 g, 25.6 mmoles) en éter dietílico anhidro (50 mL) , se le agregó una solución 3M de bromuro de metilmagnesio en éter dietílico (17.1 mL, 6.11 g, 51.3 mmoles) bajo una atmósfera de argón durante un periodo de 30 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche . Se agregó una solución saturada de cloruro de amonio para hidrolizar la mezcla de reacción, seguido por una solución de HC1 1N para disolver las sales inorgánicas formadas . La fase acuosa se extrajo con éter (3 x 50 mL) . Los extractos combinados se lavaron con agua (100 mL) , una solución saturada de NaCl (100 mL) , se secaron (Na2S04) , se filtraron y concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna para proporcionar 3.1 g (17.1 mmoles, 67%) del alcohol terciario 8. XH RMN (400 MHz , CDC13) d: 1.27 (6H, s) , 1.64 (2H, m) , 1.96 (2H, m) , 3.44 (2H, t, J = 6.68 HZ) . 5-Bromo-2-metil-2 [ter-butildimetilsilil) oxi] -pentano (9) . A una solución enfriada a -50°C del alcohol 8 (3 g, 16.6 mmoles) en CH2C12 anhidro (50 mL) , se le agregó 2 , 6-lutidina (2.32 mL, 2.13 g, 19.89 mmoles), seguido por TBSOTf (4.57 mL, 5.26 g, 19.9 mmoles). La solución se agitó a 0°C durante 15 minutos y se agregó agua (10 mL) . La mezcla se extrajo con CH2C12 (3 x 40 mL) , y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa de NaOH 1N (40 mL) , se secaron (Na2S04) , se filtraron y concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (5% de acetato de etilo/hexano) para proporcionar 3.9 g (13.2 mmoles, 80%) de 9. XH RMN (400 MHz , CDC13) d: 0.07 (6H, s) , 0.85 (9H, s) , 1.21 (6H, s) , 1.55 (2H, m) , 1.95 (2H, ra), 3.41 (2H, t, J = 6.8 Hz) Des-A, B-colest-20 (21) -en- 8ß, 25 -diol (16): Una solución del 5-bromo-2-metil-2 [ (ter-butildimetilsilil) oxi] pentano 9 (2.84 g, 9.68 mmoles) en éter anhidro (20 mL, que contienen una cantidad catalítica de yoduro) se agregó gota a gota a una suspensión agitada de polvo de magnesio (0.23 g, 9.68 mmoles) en éter dietílico anhidro (5 mL) a temperatura ambiente, con calentamiento ocasional hasta 35 °C bajo atmósfera de argón. Después de que se terminó la adición, la mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y durante 1 hora a 40°C. A continuación, se enfrió a 0°C y una solución de la cetona 6 (0.6 g, 1.94 mmoles) en éter dietílico anhidro (10 mL) se agregó gota a gota durante un periodo de 30 minutos. Después de agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 3 horas, se hidrolizó con una solución acuosa de NH4C1 (20 mL) . La capa orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 mL) . Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (40 mL) , se secaron (Na2S04) y evaporaron. La cromatografía en columna del residuo proporcionó 0.95 g (94%) de la mezcla de alcoholes 10. Se agregó gota a gota oxicloruro de fósforo (3 mL)a una solución de la mezcla de alcoholes 10 (0.95 g, 1.8 mmoles) en piridina anhidra (20 mL) bajo atmósfera de argón. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se vertió en agua con hielo y se extrajo con éter (3 x 20 mL) . La capa orgánica se lavó con una solución saturada de CuS04 (30 mL) , HC1 1N (30 mL) , agua (50 mL) . La fase orgánica se secó (NaS04) , se filtró y se concentró. La cromatografía en columna de la mezcla cruda proporcionó 0.72 g (78%) de la mezcla de definas lia, 11b, 12a, 12b, 13. La mezcla de olefinas sin purificación adicional se disolvió en metanol (20 mL) y se agregó monohidrato de ácido p- toluensulfónico (p-TSA) (0.100 g) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 días [Se agregaron de manera sucesiva cantidades adicionales de p-TSA (100 mg, 24 horas; 75 mg, 36 horas; 50 mg, 48 horas)] . El metanol se evaporó y el residuo se diluyó con acetato de etilo (30 mL) . La fase orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03 (20 mL) , agua (20 mL) , se secó (Na2C03) y evaporó. El residuo se purificó en cromatografía en columna para proporcionar 284 mg de la mezcla de alcoholes de olefina.

Des-A, B-20 (21) -en-dß, 25-diol (16). Los alcoholes de olefina se separaron con HPLC (columna zorbax-sil de 9.4 mm x 25 cm, 4 ml/minuto) utilizando un sistema de solvente de IPA/hexano (5/95) . El diol 17-20Z 15b y el diol 20-21 16 se eluyeron juntos a Rv = 45 mL. Los alcoholes se oxidaron juntos. 25- (Trietilsililoxi) -des-A, B-colestan-20 (21) -en- 8-ona (22) . A una solución de la mezcla de alcoholes 15b y 16 (34 mg, 121 moles) en CH2C12 anhidro (5 mL) , se le agregó PDC (68 mg, 182 µp????e) a temperatura ambiente. Después de agitar la reacción durante 3 horas bajo atmósfera de argón, la solución se pasó a través de una almohadilla de celite con acetato de etilo. El filtrado se concentró y se aplicó en un cartucho Sep-Pak y se eluyó con acetato de etilo/hexano (20/80) para proporcionar 30.2 mg de una mezcla de cetonas (108 ymoles, 89%) como un aceite incoloro. A una solución enfriada a -50°C de las cetonas (30.2 mg, 108 ymoles) en CH2C12 anhidro (10 mL) , se le agregó 2,6-lutidina (25 yL, 23 mg, 217 ymoles), seguido por TESOTf (37 yL, 43 mg, 163 ymoles) . La solución se agitó a 0°C durante 15 minutos y se agregó agua (10 mL) . La mezcla se extrajo con CH2C12 (3 x 5 mL) , y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa de NaOH 1N (10 mL) , se secaron (Na2S04) , se filtraron y concentraron. El residuo se purificó con HPLC (columna Zorbax-Sil de 9.4 mm x 25 cm, 4 ml/minuto) , utilizando un sistema de solvente de acetato de etilo/hexano (5/95). La cetona pura 22, 8.7 mg (22 ymoles, 20%) se eluyó a Rv = 38 mL como un aceite incoloro. XH RMN (400.13 MHz , CDC13) d: 0.56 (3H, s) , 0.57 (6H, c, J = 7.84 Hz) , 0.94 (9H, t, J = 7.96 Hz) , 1.20 (6H, s) , 4.83 y 4.92 ( 1H y 1H, cada s) ; 13CRMN (100MHZ, CDC13) d: 211.7, 148.1, 110.7, 73.3, 61.6, 56.29,.50.3, 44.8, 40.8, 37.9, 37.8, 29.9, 25.5, 24.0, 23.0, 18.9, 13.2, 7.1, 6.8. MS m/z (intensidad relativa): No M+, 363 ( [M - C2H5]+, 17), 334 ( [M - 2xC2H5]+, 4), 103 (100). La masa exacta calculada para C24H4402SiNa [M+Na] + es 415.3008, encontrada 415.3004. 1a, 25 Dihidroxi-20 (21) -en-2 -metilen- 19 -norvitamina D3 (24) . A una solución de óxido de fosfina 18 (62 mg, 106 pmoles) en THF anhidro (750 yL) a -25°C, se le agregó lentamente PhLi 1.8 M en éter di-n-butílico (65 pL, 9.8 mg, 117 moles) bajo argón con agitación. La solución se volvió de color anaranjado profundo. La mezcla se agitó a esa temperatura durante 20 minutos y se enfrió a -78°C. Una solución preenfriada (-78°C) de la cetona 17 (8.7 mg, 22 moles) en THF anhidro (100 yL) se agregó lentamente. La mezcla se agitó bajo atmósfera de argón a -78°C durante 3 horas y a 0°C durante 18 horas. Se agregó acetato de etilo y la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó (Na2S0 ) y evaporó. El residuo se aplicó en un cartucho Sep-Pak, y se eluyó con acetato de etilo/hexano al 1% para proporcionar el derivado de vitamina 19 -ñor protegido. La vitamina se purificó además mediante HPLC (columna Zorbax-Sil de 9.4 mm x 25 cm, 4 ml/minuto) , utilizando un sistema de solvente de hexano/lPA (99.95:0.05). El compuesto 23 puro, 14.8 mg (19 moles, 88%) se eluyó a Rv = 18 mL como un aceite incoloro. [ ]20D -9.74 (c 0.74, CHC13) ; UV (en hexano) : ? 245.1, 253.8, 263.7 nm; XH RMN (400 MHz , CDC13) d: 0.034, 0.053, 0.076, 0.084 (cada 3H, cada s) , 0.45 (3H, s) , 0.56 (6H, c, J = 7.86 Hz), 0.87, 0.90 (cada 9H, cada s), 0.95 (9H, t, J = 7.88 Hz) , 1.20 (6H, s), 2.19 (1H, dd, J = 12.4, 8.4 Hz) , 2.35 (1H, dd, J = 12.68, 1.88 Hz) , 2.47 (1H, dd, J = 13.4, 4.96 Hz) , 2.53 (1H, dd, J = 13.2', 5.8 Hz) , 2.83 (1H, dd, J = 11.96, 2.16 Hz), 4.43 (2H, m) , 4.81, 4.88, 4.93 y 4.97 (cada 1H, cada s) , 5.86 y 6.22 (cada 1H, cada d, J = 11 Hz) ; MS m/z (intensidad relativa) : No M+, 481 (2) , 263 (100) ; La masa exacta calculada para C45H8403SÍ3Na [M+Na]+ es 779.5624, encontrada 779.5629.

La vitamina 23 protegida (14.8 mg, 19 mmoles) se disolvió en THF anhidro (500 yL) y se trató con TBAF (196 L, 51.2 mg, 190 moles) y se agitó a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche. El solvente se eliminó in vaccuo y el residuo se aplicó en un cartucho Sep-Pak, y se eluyó con acetato de etilo/hexano al 30% para obtener la vitamina desprotegida. La vitamina se purificó además mediante HPLC (columna Zorbax-Sil de 9.4 mm x 25 cm, 3 mL/minuto) utilizando hexano/TPA (85/15) como el sistema de solvente. La vitamina 24 pura, 4.1 mg (9.9 moles, 51%) se eluyó a Rv = 33 mL. UV (en etanol) : max 244.8, 253.2, 262.8 nm; XH RMN (400 MHz, CDC13) d: 0.46 (3H, s) , 1.22 (6H, s) , 1.57 (3H, s amplio), 2.29 (2H, m) , 2.57 (1H, dd, J = 13.3, 3.6 Hz) , 2.84 (2H, M) , 4.48 (2H, m) , 4.83 y 4.88 ( 1H y 1H, cada s) , 5.09 y 5.11 (1H y 1H, cada s) , 5.90 y 6.35 (1H y 1H, cada d, J = 11.2 Hz) MS m/z (intensidad relativa): 414 (M+, 85), 396 (M-H20+, 23), 381 [M-CH3-H20] +, 10), 285 (20), 243 (30) , 91 (100) ; la masa exacta calculada para C27H4203Na ([M+NaD es 437.3032, la medida es 437.3042.

Esquema de Reacción I 6 Esquema de Reacción II ?G' ' ^OTBS 9 Esquema de Reacción III Esquema de Reacción IV ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA 2-METILEN-20 (21) -DESHIDRO- 19 -NOR- la, 25-DIHIDROXIVITAMINA D3 La introducción del grupo metileno en la posición 2 y un enlace doble entre los átomos de carbono 20 y 21 en la cadena lateral, tuvo poco efecto en la unión de Vit III 20-21 al receptor de la vitamina D de rata recombinante , de longitud completa, en comparación con la, 25-dihidroxivitamina D3. El compuesto Vit III 20-21 se unió con casi la misma afinidad al receptor de la vitamina D nuclear en comparación con el estándar de l(25-(OH)2D3 (Figura 1) . Puede esperarse de estos resultados, que el compuesto Vit III 20-21 tendría una actividad biológica equivalente. De manera sorprendente, sin embargo, el compuesto Vit III 20-21 es un análogo altamente selectivo con actividad biológica única.

La Figura 5 muestra que Vit III 20-21 tiene una capacidad significativa para incrementar la actividad el transporte de calcio intestinal in vivo, de una manera dependiente de la dosis, y claramente tiene aproximadamente la misma actividad en comparación con aquella de la 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25 (OH) 2D3) , la hormona natural, para estimular el transporte del calcio intestinal. Vit III 20-21 estimula el transporte del calcio intestinal de manera tan potente como l,25(OH)2D3.

La Figura 4 demuestra que Vit III 20-21 tiene menos actividad de movilización del calcio óseo, en comparación con l,25(OH)2D3. Aunque Vit III 20-21 tiene algo de actividad de movilización del calcio óseo, claramente tiene una potencia menor para movilizar el calcio del hueso en comparación con l,25(OH)2D3.

Las Figuras 4 y 5 ilustran así, que Vit III 20-21 puede caracterizarse como que tiene una actividad de transporte del calcio intestinal relativamente significativa, pero una actividad de movilización del calcio óseo relativamente baja.

La Figura 2 ilustra que Vit III 20-21 es aproximadamente 3 a 4 veces más potente que l,25(OH)2D3 en la diferenciación de las células HL-60, es decir, causa la diferenciación de las células HL-60 en monocitos, haciéndolo un candidato excelente para el tratamiento de la soriasis y el cáncer, especialmente contra la leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de piel y cáncer de próstata. Además, debido a su actividad de diferenciación celular relativamente alta, este compuesto proporciona un agente terapéutico para el tratamiento de varias condiciones de la piel, incluyendo arrugas, falta de hidratación dérmica adecuada, es decir, piel seca, falta de firmeza de la piel adecuada, es decir, piel flácida y secreción de sebo insuficiente. El uso de este compuesto, por lo tanto, no sólo resulta en la humectación de la piel, sino también que mejora la función de barrera de la piel.

La Figura 3 ilustra que en las células óseas, el compuesto Vit III 20-21 es un logaritmo, es decir, 10 veces más potente que l,25(OH)2D3 para incrementar la transcripción del gen de 24 -hidroxilasa . Este resultado, junto con la actividad de diferenciación celular de la Figura 2, sugiere que Vit III 20-21 será muy efectivo en la soriasis, debido a que tiene una actividad celular directa para causar la diferenciación celular, la transcripción del gen y suprimir el crecimiento celular. Estos datos también indican que Vit III 20-21 puede tener una actividad significativa como un agente anticancerígeno, especialmente contra la leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de piel y cáncer de próstata.

La fuerte actividad de Vit III 20-21 en la diferenciación de HL-60 sugiere que será activo para suprimir el crecimiento de la glándula paratiroidea y en la supresión del gen preproparatiroideo .

MÉTODOS EXPERIMENTALES Unión al Receptor de la Vitamina D Material de Prueba Fuente de la Proteína El receptor de rata recombinante , de longitud completa se expresó en un células Codón Plus RIL de E. coli BL21 (DE3) y se purificó a homogeneidad utilizando dos sistemas de cromatografía en columna diferentes. El primer sistema fue una resina de afinidad de níquel que utiliza la marca de histidina C terminal en esta proteína. La proteína que se eluyó de esta resina se purificó además utilizando cromatografía de intercambio iónico (Flujo Rápido de S-Sepharose) . Las alícuotas de la proteína purificada se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C hasta el uso. Para el uso en los ensayos de unión, la proteína se diluyó en TEDK50 (Tris 50 mM, EDTA 1.5 mM, pH 7.4, DTT 5 mM, KC1 150 mM) con detergente Chaps al 0.1%. La concentración de la proteína y el ligando del receptor se optimizó de manera que no más del 20% del ligando radiomarcado agregado se unió al receptor .

Fármacos del Estudio Los ligandos no marcados se disolvieron en etanol y las concentraciones se determinaron utilizando espectrofotometría UV ( 1 , 25 (OH) 2D3 : coeficiente de extinción molar = 18,200 y ?p,3? = 265 nm; Análogos: coeficiente de extinción molar = 42,000 y max = 252 nm) . El ligando radiomarcado (3H-1, 25 (OH) 2D3, ~159 Ci/mmoles) , se agregó en etanol a una concentración final de 1 nM.

Condiciones del Ensayo Los ligandos radiomarcados y no marcados se agregaron a 100 mcl de la proteína diluida a una concentración final de etanol de <10%,· se mezclaron en incubaron durante la noche en hielo para alcanzar el equilibrio de unión. Al siguiente día, se agregaron 100 mcl de una suspensión acuosa espesa de hidroxilapatita (50%) a cada tubo y se mezcló a intervalos de 10 minutos durante 30 minutos. La hidroxilapatita se recolectó mediante centrifugación y a continuación se lavó tres veces con amortiguador de Tris-EDTA (Tris 50 mM, EDTA 1.5 mM, pH 7.4), que contiene Titron X-100 al 0.5%. Después del lavado final, los pellets se transfirieron a viales de centelleo que contienen 4 mi de cóctel de centelleo Biosafe II, se mezclaron y se colocaron en un contador de centelleo. La unión total se determinó de los tubos que contienen sólo el ligando radiomarcado.

Diferenciación de HL-60 Material de Prueba Fármacos del Estudio Los fármacos del estudio se disolvieron en etanol y las concentraciones se determinaron utilizando espectrofotometría UV. Se prepararon diluciones seriales de manera que el intervalo de concentraciones del fármaco pudiera probarse sin cambiar la concentración final de etanol (<0.2%) presente en los cultivos celulares.

Células Las células de leucemia promielocítica humana (HL60) , se cultivaron en medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal al 10%. Las células se incubaron a 37 °C en la presencia de C02 al 5%.

Condiciones del Ensayo Las células HL60 se emplacaron a 1.2 x 105 células/ml. Dieciocho horas después del emplacado, las células por duplicado se trataron con el fármaco. Cuatro días más tarde, las células se recolectaron y se realizó un ensayo de reducción con nitro azul de tetrazolio (Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974). El porcentaje de células diferenciadas se determinó contando un total de 200 células, y registrando el número que contenía los depósitos de formazan negros-azules intracelulares . La verificación de la diferenciación a células monocíticas se determinó midiendo la actividad fagocítica (datos no mostrados) .

Ensayo de Transcripción in vitro La actividad de la transcripción se midió en células ROS 17/2.8 (hueso), que se transíectaron de manera estable con un promotor del gen de 24 -hidroxilasa (240hasa) corriente arriba de un gen reportero de luciferasa (Arbour et al., 1998) . A las células se les proporcionó un intervalo de dosis. Dieciséis horas después de la dosificación, las células se recolectaron y las actividades de la luciferasa se midieron utilizando un luminómetro.

RLU = unidades relativas de luciferasa.

Transporte del Calcio Intestinal y Movilización del Calcio Óseo Ratas Sprague-Dawley macho, destetadas, se pusieron a dieta con la Dieta 11 (0.47% de Ca) + aceite AEK durante una semana, seguido por la Dieta 11 (0.02% de Ca) + aceite AEK durante 3 semanas . Las ratas se cambiaron a continuación a una dieta que contiene 0.47% de Ca durante una semana, seguido por dos semanas con una dieta que contiene 0.02% de Ca. La administración de la dosis empezó durante la última semana con la dieta de 0.02% de calcio. Cuatro dosis ip consecutivas se proporcionaron, separadas aproximadamente 24 horas . Veinticuatro horas después de la última dosis, la sangre se recolectó del cuello cortado, y la concentración del calcio en suero se determinó como una medida de la movilización del calcio óseo. Los primeros 10 cm del intestino también se recolectaron para el análisis del transporte del calcio intestinal utilizando el método del saco del intestino vuelto hacia afuera.

INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS Resumen de los Hallazgos Biológicos. Este compuesto se une a VDR con casi la misma afinidad que la hormona nativa, pero muestra una actividad de la diferenciación celular aproximadamente 3 a 4 veces mayor y una actividad de transcripción del gen in vitro de más de 10 veces en comparación con l,25(OH)2D3. In vivo, este compuesto exhibe significativamente menos actividades de movilización del calcio óseo y de transporte del calcio intestinal, en comparación con la hormona nativa, haciendo a este compuesto un agente potencialmente valioso para el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer, osteodístrofia renal, enfermedades autoinmunes, condiciones de la piel y soriasis. Aunque este compuesto es más potente en comparación con l,25(OH)2D3 in vitro, muestra una actividad menor in vivo en la movilización del calcio óseo y una actividad similar en el intestino, en comparación con la hormona nativa. Vit III 20-21 sigue siendo un compuesto potencialmente valioso para el desarrollo terapéutico puesto que tiene una potencia menor para movilizar el calcio del almacenámiento óseo, pero una potencia mayor en la diferenciación celular que resulta potencialmente en un compuesto con una ventana de seguridad mayor que la que se había generado previamente. Vit III 20-21 puede no ser únicamente útil en el tratamiento de las enfermedades listadas anteriormente, sino también en la prevención de las enfermedades listadas anteriormente.

Unión a VDR, diferenciación de las células HL60 y actividad de transcripción. Vit III 20-21 (¾ = 1 x 10"10M) es casi tan activo como . la hormona natural la, 25-dihidroxivitamina D3 (?? = 9 x 10 M) en su capacidad para competir con [3H] -1, 25 (OH) 2D3 para unirse al receptor de la vitamina D de rata recombinante , de longitud completa (Figura 1) . Vit III 20-21 muestra una actividad aproximadamente 3 a 4 veces mayor (EC50 = 7 x 10"10M) en su capacidad (eficacia o potencia) para fomentar la diferenciación de las células HL-60 en comparación con la, 25-dihidroxivitamina D3 (EC50 = 2 x 10~9M) (Véase la Figura 2) . También, el compuesto Vit III 20-21 (EC50 = 2 x 10_11?) tiene una actividad transcripcional de más de 10 veces mayor en las células óseas que la, 25-dihidroxivitamina D3 (EC50 = 2 x 10"10M) (Véase la Figura 3). Estos resultados sugieren que Vit III 20-21 puede ser muy efectivo en la soriasis, debido a que tiene una actividad celular directa para causar la diferenciación celular, la transcripción del gen y en suprimir el crecimiento celular. Estos datos también indican que Vit III 20-21 tendrá una actividad significativa como un agente anticancerígeno, especialmente contra la leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de piel y cáncer de próstata, así como contra condiciones de la piel tales como piel seca (falta de hidratación dérmica) , flacidez indebida de la piel (firmeza de la piel insuficiente) , secreción de sebo insuficiente y arrugas. También se esperaría que sea muy efectivo para suprimir el hiperparatiroidismo secundario .

Movilización del calcio del hueso y la absorción del calcio intestinal en animales deficientes de vitamina D. Utilizando ratas deficientes, de vitamina D con una dieta baja en calcio (0.02%), se probaron las actividades de Vit III 20-21 y l,25(OH)2D3 en el intestino y el hueso. Como se esperaba, la hormona nativa (1, 25 (OH) 2D3) incrementó los niveles de calcio en suero a la dosis de 260 pmol/día (Figura 4) . El estudio reportado en la Figura 4, muestra que Vit III 20-21 tuvo una actividad relativamente baja, o pequeña, para movilizar el calcio del hueso. La administración de 260 pmoles/día durante 4 días consecutivos no resultó en la movilización del calcio óseo, y no fue hasta que la cantidad de Vit III 20-21 se incrementó a 2340 pmoles/día, que se observó algún efecto sustancial.

El transporte de calcio intestinal se evaluó en los mismos grupos de animales utilizando el método del, saco del intestino vuelto hacia afuera (Figura 5) . Estos resultados muestran que el compuesto Vit III 20-21 fomenta el transporte del calcio intestinal cuando se administra a 260 pmoles/día, y su actividad es aproximadamente la misma que, o igual a l,25(OH)2D3, que también proporciona un incremento significativo a la dosis de 260 pmoles/día.

Así, puede concluirse que Vit III 20-21 tiene una actividad de transporte del calcio intestinal similar a las dosis menores recomendadas que aquélla de l,25(OH)2D3.

Estos resultados ilustran que Vit III 20-21 es un candidato excelente para numerosas terapias humanas como se describe en la presente, y que puede ser particularmente útil en varias circunstancias, tales como la supresión del hiperparatiroidismo secundario de la osteodistrofia renal, enfermedades autoinmunes, cáncer, numerosos tipos de condiciones de la piel y soriasis. Vit III 20-21 es un candidato excelente para tratar la soriasis debido a que: (1) tiene una unión a VDR, una actividad de transcripción y una actividad de diferenciación celular significativas; (2) tiene poca propensión hipercalcémica a dosis relativamente bajas, a diferencia de l,25(OH)2D3; y (3) se sintetiza fácilmente. Puesto que Vit III 20-21 tiene una actividad de unión significativa al receptor de la vitamina D, pero tiene poca capacidad para elevar el calcio en suero en la sangre, puede ser particularmente útil para el tratamiento del hiperparatiroidismo secundario de la osteodistrofia renal .

Estos datos también indican que el compuesto Vit III 20-21 de la invención puede ser especialmente adecuado para el tratamiento y profilaxis de trastornos humanos, que están caracterizados por un desequilibrio en el sistema inmune, por ejemplo, en las enfermedades autoinmunes, incluyendo esclerosis múltiple, lupus, diabetes mellitus, hospedero versus rechazo del injerto y rechazo de transplantes de órganos; y adicionalmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide, asma, y enfermedades inflamatorias del intestino tales como enfermedad cellaca, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. El acné, la alopecia y la hipertensión son otras condiciones que pueden tratarse con el compuesto Vit III 20-21 de la invención.

Los compuestos de la invención de fórmula I, y particularmente la fórmula la, también son útiles para prevenir o tratar la obesidad, inhibiendo la diferenciación de los adipocitos, inhibiendo la transcripción del gen SCD-1, y/o reduciendo la grasa corporal en sujetos animales. Por lo tanto, en algunas modalidades, un método para prevenir o tratar la obesidad, inhibiendo la diferenciación de los adipocitos, inhibiendo la transcripción del gen SCD-1, y/o reduciendo la grasa corporal en un sujeto animal, incluye administrar al sujeto animal, una cantidad efectiva de uno o más de los compuestos o una composición farmacéutica que incluye uno o más de los compuestos de fórmula I. La administración del compuesto o las composiciones farmacéuticas al sujeto, inhibe la diferenciación de los adipocitos, inhibe la transcripción del gen, y/o reduce la grasa corporal en el sujeto animal. El animal puede ser un humano, un animal doméstico tal como un perro o un gato, o un animal agrícola, especialmente aquéllos que proporcionan carne para el consumo humano, tales como aves de corral, tales como pollos, pavos, faisanes o codornices, así como animales bovinos, ovinos, caprinos o porcinos.

Para propósitos de prevención y/o tratamiento, los compuestos de esta invención, definidos por la fórmula I, particularmente Vit III 20-21, pueden formularse para aplicaciones farmacéuticas como una solución en solventes inocuos, o como una emulsión, suspensión o dispersión en solventes o portadores adecuados, o como pildoras, tabletas o cápsulas, junto con portadores sólidos, de acuerdo con los métodos convencionales conocidos en la técnica.

Cualquiera de tales formulaciones también puede contener otros componentes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos, tales como estabilizantes, antioxidantes, aglutinantes, agentes colorantes o agentes emulsificantes o que modifican el sabor.

Los compuestos de fórmula I y particularmente Vit III 20-21, pueden administrarse de manera oral, tópica, parenteral , rectal, nasal, sublingual o transdérmica . El compuesto se administra de manera ventajosa mediante inyección o mediante infusión intravenosa o soluciones estériles adecuadas, o en la forma de dosis liquidas o sólidas vía un canal de alimentación, o en la forma de cremas, ungüentos, parches o vehículos similares adecuados para las aplicaciones transdérmicas . Una dosis de 0.01 a 1000 µg por día de los compuestos I, particularmente Vit III 20-21, de manera preferida, de aproximadamente 0.1 µq a aproximadamente 500 µg por día, es apropiada para propósitos de prevención y/o tratamiento, tal dosis se ajusta de acuerdo con la enfermedad a ser tratada, su severidad y la respuesta de los sujetos, como es bien entendido en la técnica. Puesto que los compuestos exhiben una especificidad de acción, cada uno puede administrarse de manera adecuada solo, o junto con dosis graduadas de otro compuesto de vitamina D activo, por ejemplo, la-hidroxivitamina D2 o D3, o la, 25-dihidroxivitamina D3, en situaciones en donde se encuentra que diferentes grados de movilización del mineral óseo y la estimulación del transporte del calcio son ventajosos.

Las composiciones para utilizarse en los tratamientos mencionados anteriormente, comprenden una cantidad efectiva de los compuestos I, particularmente Vit III 20-21, como se definió por la fórmula I y la anteriores, como un ingrediente activo, y un portador adecuado. Una cantidad efectiva de tal compuesto para utilizarse de acuerdo con esta invención, es de aproximadamente 0.01 pg a aproximadamente 1000 pg por g de la composición, de manera preferida de aproximadamente 0.1 pg a aproximadamente 500 pg por gramo de la composición, y puede administrarse de manera tópica, transdérmica, oral, rectal, nasal, sublingual o parenteral en dosificaciones de aproximadamente 0.01 pg/día a aproximadamente 1000 pg/día, y de manera preferida de aproximadamente 0.1 pg/día a aproximadamente 500 pg/día.

Los compuestos I, particularmente Vit III 20-21, pueden formularse como cremas, lociones, ungüentos, parches tópicos, pildoras, cápsulas o tabletas, supositorios, aerosoles o en forma líquida como soluciones, emulsiones, dispersiones o suspensiones en solventes o aceites farmacéuticamente inocuos y aceptables, y tales preparaciones pueden contener, además otros componentes farmacéuticamente inocuos o benéficos, tales como estabilizantes, antioxidantes, emulsificantes , agentes colorantes, aglutinantes o agentes que modifican el sabor.

Los compuestos I, particularmente Vit III 20-21, pueden administrarse de manera ventajosa en cantidades suficientes para efectuar la diferenciación de los promielocitos a macrófagos normales. Las dosificaciones como las descritas anteriormente son adecuadas, se entiende que las cantidades proporcionadas se deben ajustar de acuerdo con la severidad de la enfermedad y la condición y respuesta de los sujetos, como es bien entendido en la técnica .

Las formulaciones de la presente invención comprenden un ingrediente activo en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable, por lo tanto, y opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos. El portador debe ser "aceptable" . en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de las formulaciones y no perjudicial para el receptor de las mismas.

Las formulaciones de la presente invención, adecuadas para la administración oral, pueden estar en la forma de unidades discretas tales como cápsulas, sobrecitos, tabletas o pastillas para chupar (lozenges) , cada una que contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en la forma de un polvo o granulos; en la forma de una solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o en la forma de una emulsión aceite en agua o una emulsión agua en aceite.

Las formulaciones para la administración rectal pueden estar en la forma de un supositorio que incorpora el ingrediente activo y un portador tal como manteca de cacao, o en la forma de un enema .

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral comprenden de manera conveniente un aceite estéril o una preparación acuosa del ingrediente activo, que es de manera preferida isotónica con la sangre del receptor.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica, incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas , tales como linimentos, lociones, aplicadores, emulsiones aceite en agua o agua en aceite tales como cremas, ungüentos o pastas; o soluciones o suspensiones tales como gotas; o como rocíos (sprays) .

Para la administración nasal, puede utilizarse la inhalación del polvo, formulaciones autopropelentes o de rocío, distribuidas con una lata de rocío, un nebulizador o un atomizador. Las formulaciones, cuando se distribuyen, de manera preferida tienen un tamaño de partícula en el intervalo de 10 a 100 µ.

Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en una forma de unidad de dosificación y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Mediante el término "unidad de dosificación" , se quiere decir una dosis unitaria, es decir, una sola dosis que es capaz de administrarse a un paciente como una dosis unitaria física y químicamente estable que comprende el ingrediente activo tal cual o una mezcla del mismo con diluyentes o portadores farmacéuticos sólidos o líquidos.

Claims (1)

1. 48 REIVINDICACIONES : compuesto que tiene la fórmula en donde Xi, X2 y X3, que pueden ser los mismos o diferentes, se seleccionan cada uno de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi . 2. El compuesto según la reivindicación 1, en donde X3 es hidrógeno. 3. El compuesto según la reivindicación 1, en donde Xi es hidrógeno. 4. El compuesto según la reivindicación 1, en donde Xi, X2 y X3 son todos t-butildimetilsililo . 5. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva de al menos un compuesto según la reivindicación 1, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable . 6. La composición farmacéutica según la reivindicación 5, en donde la cantidad efectiva comprende de aproximadamente 0.01 µg a aproximadamente 1000 µ? por gramo de la composición. 7. La composición farmacéutica según la reivindicación 5, en donde la cantidad efectiva comprende de aproximadamente 0.1 \iq a aproximadamente 500 yg por gramo de la composición. 8. La 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-la, 25-dihidroxivitamina D3 que tiene la fórmula: 9. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva de la 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-loc, 25-dihidroxivitamina D3, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. 10. La composición farmacéutica según la reivindicación 9, en donde la cantidad efectiva comprende de aproximadamente 0.01 µ? a aproximadamente 1000 yg por gramo de la composición. 11. La composición farmacéutica según la reivindicación 9, en donde la cantidad efectiva comprende de aproximadamente 0.1 yg a aproximadamente 500 por gramo de la composición. 12. Un método para tratar la soriasis, que comprende administrar a un sujeto con soriasis, una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmula: en donde X1( X2 y X3, que pueden ser los mismos o diferentes, se seleccionan cada uno de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi . 13. El método según la reivindicación 12, en donde el compuesto se administra oralmente. 14. El método según la reivindicación 12, en donde el compuesto se administra parenteralmente. 15. El método según la reivindicación 12, en donde el compuesto se administra transdérmicamente . 16. El método según la reivindicación 12, en donde el compuesto se administra de tópicamente. 17. El método según la reivindicación 12, en donde el compuesto se administra rectalmente. 18. El método según la reivindicación 12, en donde el compuesto se administra nasalmente . 19. El método según la reivindicación 12, en donde el compuesto se administra sublingualmente . 20. El método según la reivindicación 12, en donde el compuesto se administra en una dosificación de aproximadamente 0.01 µ?/día a aproximadamente 1000 g/dia. 21. El método según la reivindicación 12, en donde el compuesto es 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-la, 25-dihidroxivitamina D3 , que tiene la fórmula: 22. Un' método para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de piel o cáncer de próstata, que comprende administrar a un sujeto con la enfermedad, una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmula: en donde Xi, X2 y X3, que pueden ser los mismos o diferentes, se seleccionan cada uno de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi . 23. El método según la reivindicación 22, en donde el compuesto se administra oralmente. 24. El método según la reivindicación 22, en donde el compuesto se administra parenteralmente. 25. El método según la reivindicación 22, en donde el compuesto se administra transdérmicamente . 26. El método según la reivindicación 22, en donde el compuesto se administra rectalmente. 27. El método según la reivindicación 22, en donde el compuesto se administra nasalmente. 28. El método según la reivindicación 22, en donde el compuesto se administra sublingualmente . 29. El método según la reivindicación 22, en donde el compuesto se administra en una dosificación de aproximadamente 0.01 g/día a aproximadamente 1000 yg/día. 30. El método según la reivindicación 22, en donde el compuesto es 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-loc, 25-dihidroxivitamina D3 , que tiene la fórmula: 31. Un método para tratar una enfermedad autoinmune, seleccionada del grupo que consiste de esclerosis múltiple, lupus, diabetes mellitus, hospedero versus rechazo del injerto y rechazo de transplantes de órganos, que comprende administrar a un sujeto con la enfermedad, una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmul : en donde Xi, X2 y X3 , que pueden ser los mismos o diferentes, se seleccionan cada uno de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi . 32. El método según la reivindicación 31, en donde el compuesto se administra oralmente. 33. El método según la reivindicación 31, en donde el compuesto se administra parenteralmente. 34. El método según la reivindicación 31, en donde el compuesto se administra transdérmicamente . 35. El método según la reivindicación 31, en donde el compuesto se administra rectalmente. 36. El método según la reivindicación 31, en donde el compuesto se administra nasalmente . 37. El método según la reivindicación 31, en donde el compuesto se administra sublingualmente. 38. El método según la reivindicación 31, en donde el compuesto se administra en una dosificación de aproximadamente 0.01 g/día a aproximadamente 1000 g/día. 39. El método según la reivindicación 31, en donde el compuesto es 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor- la, 25-dihidroxivitamina D3 , que tiene la fórmula: enfermedad inflamatoria seleccionada del grupo que consiste de artritis reumatoide, asma y enfermedades inflamatorias del intestino, que comprende administrar a un sujeto con la enfermedad, una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmula: en donde Xi, X2 y X3, que pueden ser los mismos o diferentes, se seleccionan cada uno de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi . 41. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto se administra oralmente. 42. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto se administra parenteralmente . 43. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto se administra transdérmicamente . 44. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto se administra rectalmente. 45. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto se administra nasalmente . 46. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto se administra sublingualmente . 47. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto se administra en una dosificación de aproximadamente 0.01 yg/día a aproximadamente 1000 yg/día. 48. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto es 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-la, 25 -dihidroxivitamina D3, que tiene la fórmula: 49. Un método para tratar una condición de la piel seleccionada del grupo que consiste de arrugas, falta de firmeza de la piel adecuada, falta de hidratación dérmica adecuada y secreción de sebo insuficiente, que comprende administrar a un sujeto con la condición de la piel, una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmula : en donde ??, X2 y X3 , que pueden ser los mismos o diferentes, se seleccionan cada uno de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi . 50. El método según la reivindicación 49, en donde el compuesto se administra oralmente. 51. El método según la reivindicación 49, en donde el compuesto se administra parenteralmente. 52. El método según la reivindicación 49, en donde el compuesto se administra transdérmicamente . 53. El método según la reivindicación 49, en donde el compuesto se administra de tópicamente. 54. El método según la reivindicación 49, en donde el compuesto se administra rectalmente . 55. El método según la reivindicación 49, en donde el compuesto se administra nasalmente. 56. El método según la reivindicación 49, en donde el compuesto se administra sublingualmente . 57. El método según la reivindicación 49, en donde el compuesto se administra en una dosificación de aproximadamente 0.01 µ?/día a aproximadamente 1000 g/dia. 58. El método según la reivindicación 49, en donde el compuesto es 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-la, 25-dihidroxivitamina D3, que tiene la fórmula: 59. Un método para tratar la osteodistrofia renal, que comprende administrar a un sujeto con osteodistrofia renal una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmula: en donde ??, X2 y X3 , que pueden ser los mismos o diferentes, se seleccionan cada uno de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi . 60. El método según la reivindicación 59, en donde el compuesto se administra oralmente. 61. El método según la reivindicación 59, en donde el compuesto se administra parenteralmente. 62. El método según la reivindicación 59, en donde el compuesto se administra transdérmicamente . 63. El método según la reivindicación 59, en donde el compuesto se administra rectalmente. 64. El método según la reivindicación 59, en donde el compuesto se administra nasalmente. 65. El método según la reivindicación 59, en donde el compuesto se administra sublingualmente . 66. El método según la reivindicación 59, en donde el compuesto se administra en una dosificación de aproximadamente 0.01 pg/día a aproximadamente 1000 pg/día. 67. El método según la reivindicación 59, en donde el compuesto es 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor- la, 25-dihidroxivitamina D3, que tiene la fórmula: 68. Un método para tratar o prevenir la obesidad de un animal, inhibiendo la diferenciación de los adipocitos, inhibiendo la transcripción del gen SCD-1, y/o reduciendo la grasa corporal en un animal, que comprende administrar a un animal en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmula: en donde Xi, X2 y X3 , que pueden ser los mismos o diferentes, se seleccionan cada uno de hidrógeno o un grupo protector de hidroxi . 69. El método según la reivindicación 68, en donde el compuesto se administra oralmente. 70. El método según la reivindicación 68, en donde el compuesto se administra parenteralmente. 71. El método según la reivindicación 68, en donde el compuesto se administra transdérmicamente . 72. El método según la reivindicación 68, en donde el compuesto se administra rectalmente. 73. El método según la reivindicación 68, en donde el compuesto se administra nasalmente . 74. El método según la reivindicación 68, en donde el compuesto se administra sublingualmente . 75. El método según la reivindicación 68, en donde el compuesto se administra en una dosificación de aproximadamente 0.01 yg/día a aproximadamente 1000 yg/día. 76. El método según la reivindicación 68, en donde el compuesto es 2-metilen-20 (21) -deshidro-19-nor-la, 25-dihidroxivitamina D3, que tiene la fórmula: 77. El método según la reivindicación 68, en donde el animal es un humano. 78. El método según la reivindicación 68, en donde el animal es un animal doméstico. 79. El método según la reivindicación 68, en donde el animal es un animal agrícola.