NO318379B1 - Ester av 5-aminolevulinsyre som fotosensibiliseringsmiddel i fotokjemoterapi, anvendelse derav, samt farmasoytisk blanding, produkt, utstyrsett og fremgangsmate for in vitro-diagnostisering. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår ester av 5-aminolevulinsyre som fotosensibiliseringsmiddel i fotokjemoterapi, anvendelse derav, samt farmasøytisk blanding, produkt, utstyrssett og fremgangsmåte for in vitro-diagnostisering.

Fotokjemoterapi eller fotodynamisk terapi (PDT), som det også er kjent

som, er en nylig fremkommet teknikk forbehandling av forskjellige abnormaliteter eller forstyrrelser i huden eller andre epitelorganer eller slimhinner, spesielt kreftformer eller før-kreftskader samt visse ikke-maligne skader, for eksempel hud-lidelser så som psoriasis. Fotokjemoterapi innbefatter påføring av fotosensibiliserende (fotokjemoterapeutiske) midler på det angrepne område av kroppen, fulgt av eksponering for fotoaktiverende lys for aktivering av fotosensibiliseringsmidlene og omdannelse av dem til cytotoksisk form, hvorved de angrepne celler drepes eller deres proliferative potensial reduseres.

Det er kjent en rekke fotosensibiliseringsmidler innbefattende spesielt psoralenene, porfyrinene, klorinene og ftalocyaninene. Slike medikamenter blir toksiske når de eksponeres for lys.

Fotosensibiliserende medikamenter kan utøve sine virkninger ved mange forskjellige mekanismer, direkte eller indirekte. Således blir for eksempel visse fotosensibiliseringsmidler direkte toksiske når de aktiveres av lys, mens andre virker slik at det dannes toksiske materialer, f.eks. oksydasjonsmidler så som singlett-oksygen eller andre oksygenavledede frie radikaler, som er meget destruktive overfor cellemateriale og biomolekyler så som lipider, proteiner og nukleinsyrer. Psoralener er et eksempel på direkte virkende fotosensibiliserings-midler; ved utsettelse for lys danner de addisjonsprodukter og tverrbindinger mellom de to kjeder av DNA-molekyler, hvorved de inhiberer DNA-syntesen. Den uheldige risiko med denne terapi er at det kan oppstå uønskede mutagene og karsinogene bivirkninger.

Denne ulempe kan unngås ved at man velger fotosensibiliseringsmidler med en alternativ indirekte virkningsmåte. For eksempel har porfyriner, som virker indirekte ved dannelse av toksiske oksygenforbindelser, ingen mutagene bivirk-ninger og representerer gunstigere kandidater for fotokjemoterapi. Porfyriner er naturlig forekommende forløpere ved syntetisering av heme. Spesielt dannes heme når jem (Fe<3+>) inkorporeres i protoporfyrin DC (Pp) ved innvirkning av

enzymet ferrochelatase. Pp er et ytterst potent fotosensibiliseringsmiddel, mens heme ikke har noen fotosensibiliserende effekt.

Ett slikt porfyrinbasert legemiddel, fotofrin, er nylig blitt godkjent som foto-sensibiliseirngsmiddel ved terapi av visse krefttyper. Hovedulempen er at siden det må administreres parenteralt, vanligvis intravenøst, forårsaker det fotosensibi-lisering av huden som kan vare i flere uker etter i.v.-injeksjon. Fotofrin består av store oligomerer av porfyrin og trenger ikke lett inn i huden når det påføres topisk. Liknende problemer finnes når det gjelder andre porfyrinbaserte fotosensibilise-ringsmidler så som det såkalte «hematoporfyirn-derivat» (Hpd), som også er blitt

rapportert for anvendelse ved kreft-fotokjemoterapi (se f.eks. S. Dougherty, J. Nati. Cancer Ins., 1974,52 :1333; Kelly og Snell, J. Uroi., 1976,115: 150). Hpd er en kompleks blanding som fås ved behandling av hematoforfyrin med eddiksyre og svovelsyre, hvoretter det acetylerte produkt oppløses med alkali.

For å overvinne disse problemer er forløpere til Pp blitt undersøkt med hensyn til

fotokjemoterapeutisk potensial. Spesielt er Pp-forløperen 5-amino-levulinsyre (ALA) blitt undersøkt som fotokjemoterapeutisk middel for visse hud-krefttyper. ALA, som dannes av suksinyl-CoA og glycin idet første trinn av heme-syntesen, er i begrenset omfang i stand til å trenge inn i huden og føre til en lokalisert opphoping av Pp; siden virkningen av ferrochelatase (det metalliserende enzym) er det hastighetsbegrensende trinn ved hemesyntese, fører et overskudd av ALA til opphoping av Pp, det fotosensibiliserende middel. Ved topisk påføring av ALA på hud-tumorer og deretter, etter flere timer, eksponering av tumorene for lys, kan det fås en gunstig fotokjemoterapeutisk effekt (se for eksempel WO91/01727). Siden de huddekkende basilomer og squamøse celle-karsinomer lettere gjennomtrenges av ALA enn frisk hud, og siden konsentrasjonen av ferrochelatase er lav i hudtumorer, er det blitt funnet at topisk påføring av ALA til en selektivt forøket dannelse av Pp i tumorer.

Skjønt anvendelse av ALA representerer et betydelig fremskritt på området, er imidlertid ikke alltid fotokjemoterapi med ALA helt tilfredsstillende. ALA er ikke i stand til å trenge gjennom alle tumorer og andre vev med tilstrekkelig effektivitet til muliggjøring av behandling av et vidt område av tumorer eller andre tilstander, og ALA har også tendens til å være ustabil i farmasøytiske preparater. Det er derfor behov for forbedrede fotokjemoterapeutiske midler.

Den foreliggende oppfinnelse er rettet mot dette behov og har spesielt det mål å tilveiebringe fotokjemoterapeutiske midler som er bedre i stand til å trenge gjennom tumoren eller annen abnormalitet, og som har en forøket fotokjemo-terapeutisk effekt i forhold til slike som er beskrevet innenfor teknikkens stand.

Ved ett aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse således forbindelser kjennetegnet ved at de har formelen I,

(hvor R<1> kan representere Cmo alkyl eventuelt substituert med hydroksy-, alkoksy-, acyloksy-, alkoksykarbonyloksy-, amino-, aryl-, okso- eller fluorgrupper, og eventuelt avbrutt av oksygen-, nitrogen-, svovel- eller fosforatomer; og R2 representerer et hydrogenatom og salter av disse for anvendelse ved fotokjemoterapi eller diagnostisering.

Mer spesielt er forbindelsene kjennetegnet ved at de er ALA-metylester, ALA-etylester, ALA-propylester, ALA-heksylester, ALA-heptylester eller ALA-oktylester eller salter av disse.

Database Xfire, adkomstnumre 3060978,5347132,5499790, 5620924, 5633390, 5991317 og 6517740 (Beilstein); Cosmo Sogo Kenkyusho KK, Patent Abstracts of Japan, vol. 16; nr. 156 (C-0930) 16.4.1992; EP-A-316179 (Tokuyama Soda KK); GB-A-2058077 (Hudson et al) og DE-A-2411382 (Boehringer Sohn Ingelheim) beskriver alkylesterderivat av 5-aminolevulinsyre, og derivater og salter av dette samt fremgangsmåter for fremstilling av disse.

Foretrukne forbindelser for anvendelse ifølge oppfinnelsen innbefatter slike hvor R<1 >representerer en usubstituert alkylgruppe.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er videre kjennetegnet ved at arylgruppen er fenyl eller en monocyklisk 5-7-leddet heteroaromatisk forbindelse.

Forbindelsene for anvendelse ved opprinnelsen kan fremstilles ved anvendelse av standardprosesser og -metoder som er velkjente på området for derivatisering av flerfunksjonene forbindelser, og spesielt forestring. Som kjent på området, kan slik forestring av forbindelser innbefatte beskyttelse og fjerning av beskyttende grupper fra passende grupper slik at bare de nødvendige grupper forblir aktive og deltar i reaksjonen under forestringsbetingelsene. Således kan for eksempel substituentene i substituerte alkanoler som anvendes til fremstilling av esterne, beskyttes under forestringen. Likeledes kan NR2<2->gruppen på forbindelsen som medvirker til at denne utgjør forbindelser med formel I, beskyttes under reaksjonen, og deretter fjernes beskyttende grupper. Slike fremgangsmåter med beskyttelse og fjerning av beskyttende grupper er velkjente på området for fremstilling av derivater og spesielt estere av velkjente aminosyrer, se f.eks. Mcomie i «Protective Groups in Organic Chemistry», Plenum, 1973, og T. W. Greene i «Protective Groups in Organic Chemistry», Wiley-lnterscience, 1981.

Ved fremstilling av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan det dannes en ester av karboksygruppen av en 5aminolevulinsyre. Fremstillingen kan videre omfatte at omsetting av en 5-aminolevulinsyre, eller et forestringsbart derivat derav, med en alkanol eller et esterdannende derivat av denne.

Betingelsene ved forestringsreaksjonene vil avhenge av den anvendte alkohol, og betingelsene kan velges slik at det fås maksimalt utbytte av esteren. Siden forestringsreaksjonene er reversible likevektsreaksjoner, kan reaksjons-betingelsene velges på en slik måte at det fås maksimalt utbytte av esterproduktet. Slike betingelser kan oppnås ved valg av et løsningsmiddel som kan fjerne vannet som dannes ved en typisk forestringsreaksjon, ved dannelse av en azeotrop med vann. Slike løsningsmidler er eksemplifisert ved aromatiske hydrokarboner eller andre som kan danne azeotroper med vann, f.eks. en del klorerte hydrokarboner så som kloroform. For dannelse av de lavere estere av 5-ALA kan likevekts-reaksjonen drives til estersiden ved anvendelse av et stort overskudd av alkoholen. Med andre estere kan likevekten drives mot esterproduktet ved anvendelse av et stort overskudd av syren.

Forestringsreaksjoner er velkjente på området, for eksempel som beskrevet

av Saul Patai i «The chemistry of the Carboxylic acids and esters», (Ch. 11, s.

505, Jnterscience 1969) og Houban Weyl, (Methoden der Organische Chemie,

volum E5, «Carbonsauren und carbonsauren-derivate», s. 504, Georg Thieme Verlag, 1985). Dannelse av derivater av aminosyrer er beskrevet i volum XI/2 i

den samme serie, (Houben Weyl, Methoden der Organiosche Chemie, volum XI2, «Stickstoffverbindungen», s. 269, Georg Thieme Verlag, 1958).

Reaksjonene vil hensiktsmessig bli utført i nærvær av en katalysator, f.eks. en uorganisk eller organisk syre eller et syrebindingsmiddel så som en base.

Forbindelsene som anvendes som utgangsmaterialer, er kjent fra litteraturen og i mange tilfeller kommersielt tilgjengelige, eller de kan oppnås ved anvendelse av i og for seg kjente fremgangsmåter. ALA er for eksempel kjent fra Sigma eller fra Photocure, Oslo, Norge.

Som nevnt ovenfor, kan forbindelsene for anvendelse ifølge oppfinnelsen ha form av farmasøytisk akseptable salter. Slike salter er fortrinnsvis syre-addisjonssalter med fysiologisk akseptable organiske eller uorganiske syrer. Egnede syrer innbefatter for eksempel saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, melkesyre, citronsyre, vinsyre, ravsyre, maleinsyre, fumar-syre og askorbinsyre. Fremgangsmåter for

saltdannelse er vanlige på området.

Som nevnt ovenfor, har forbindelsene for anvendelse ifølge oppfinnelsen

samt deres salter verdifulle farmakologiske egenskaper, nemlig som fotosensibiliseringsmiddel som gjør dem egnet som fotokjemoterapeutiske midler.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig farmasøytisk blanding, kjennetegnet ved at den omfatter en forbindelse som definert i hvilket som helst av kravene 1-4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, sammen med minst én farmasøytisk bærer eller eksipiens. 1 likhet med ALA utøver forbindelsene sine virkninger ved forøking av dannelsen av Pp; ved avgivelse til det ønskede virkningssted bryter hydrolytiske enzymer så som esteraser som finnes i målcellene, esterne ned til moder-ALA, som så så går inn i hemesynteseveien og fører til en opphoping av Pp. Imidlertid har forbindelsene for anvendelse ifølge oppfinnelsen en rekke fordeler fremfor ALA selv. For det første er forbindelsene bedre i stand til å trenge inn i huden og andre vev sammenliknet med ALA; inntrengingen er både dypere og hurtigere. Dette er en viktig fordel, særlig for topisk administrering. For det annet er det overraskende blitt funnet at esterne er bedre midler til forøking av Pp-dannelse enn ALA; Pp-dannelsesnivåer etter administrering av ALA-esteme er høyere enn med ALA alene. For det tredje oppviser forbindelsene for anvendelse ved oppfinnelsen forbedret selektivitet overfor mål-vevet som skal behandles; den økende virkning når det gjelder Pp-dannelse er nemlig lokalisert til den ønskede mål-skade og strekker seg ikke til de omgivende vev. Dette er spesielt tydelig når det gjelder tumorer. Endelig ser forbindelsene ut til å lokalisere seg bedre til mål-vevet ved administrering. Dette er spesielt viktig når det gjelder systemisk tilføring, siden det betyr at uønskede fotosensibiliseirngsvirkninger, rapportert i litteraturen for andre porfyrinbasete fotosensibiliseringsmidler, kan reduseres eller unngås.

Ved enda et ytterligere aspekt er det også tilveiebrakt anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, eller et farmasøytisk salt derav, for fremstilling av et terapeutisk middel for anvendelse ved fotokjemoterapi, eller et diagnostisk middel for anvendelse til diagnostisering, hvor fotokjemoterapi eller diagnose blir utført på forstyrrelser eller abnormaliteter på ytre eller indre overflater av kroppen som responderer overfor fotokjemoterapi.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre et produkt, kjennetegnet ved at det omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, sammen med minst ett overflategjennomtrengnings-understøttende middel, og eventuelt ett eller flere chelateringsmidler som et kombinert preparat for samtidig, separat eller sekvensiell anvendelse til behandling eller diagnostisering av forstyrrelser eller abnormaliteter hos ytre eller indre overflater av kroppen som er mottakelige for fotokjemoterapi.

Det er videre beskrevet en fremgangsmåte for in vitro-diagnostisering av abnormaliteter eller forstyrrelser ved undersøkelse av en prøve av kroppsfluid eller vev fra en pasient, kjennetegnet ved at den minst omfatter trinnene

i) blanding av kroppsfluidet eller vevet med en forbindelse som angitt i hvilket

som helst av kravene 1-4,

ii) eksponering av blandingen for lys,

iii) observering av fluorescensnivået, og

iv) sammenlikning av nivået for fluorescens med kontrollnivåene.

Abnormalitetene og forstyrrelsene som kan behandles innbefatter hvilke som helst maligne, pre-maligne og ikke-maligne abnormaliteter eller forstyrrelser som er mottakelige for fotokjemoterapi, f.eks. tumorer eller andre vekster, hudsykdommer så som psoriasis eller aktiniske keratoser, hudavskrapninger og andre sykdommer eller infeksjoner, f.eks. bakterie-, virus- eller soppinfeksjoner, for eksempel Herpesvirus-infeksjoner. Oppfinnelsen er spesielt egnet for behandling av sykdommer, forstyrrelser eller abnormaliteter hvor det er dannet atskilte skader på hvilke blandingene kan påføres direkte (skader anvendes i det foreliggende i vid betydning, og innbefatter tumorer og liknende).

De indre og ytre kroppsoverflater som kan behandles innbefatter huden og alle andre epitelialoverflater og serøse overflater, innbefattende for eksempel slimhinner, de indre vegger i organer, f.eks. i respirasjonssystemet, det gastrointestinale system kjønnsorganene og urinveiene samt kjertler med kanaler som tømmes på slike overflater (f. eks. lever, hårfollikler med talgkjertler, og sædvesikler). 1 tillegg til huden, innbefatter slike overflater for eksempel den indre vegg ivagina, endometriet og uroteliet. Slike overflater kan også innbefatte hulrom dannet i kroppen etter bortskjæring av sykt vev eller kreft-vev, f.eks. hjernehulrom etter bortskjæring av tumorer så som gliomer.

Eksempler på overflater innbefatter således: (i) hud og conjunctiva; (ii) de indre overflater i munnen, svelget, spiserøret, magesekken, tarmer og tarmvedheng, rektum og endetarmskanalen; (iii) den indre vegg i nesegangene, nesehulene, nesesvelg, luftrøret, bronkiene og bronkiolene; iv) den indre vegg i ureter, urinblæren og uretra; (v) den indre vegg i vagina, livmorhalsen og livmoren, (vi) parietal-hinnen og innvollshinner; (vii) den indre vegg i bukhulen og bekken-hulen, samt overflaten av organene som finnes i disse hulrom; (viii) dura mater og meningene, (ix) hvilken som helst tumor i fast vev som kan gjøres tilgjengelig

for fotoaktiverende lys, f.eks. enten direkte, på operasjonstidspunktet eller via en optisk fiber som innføres via en nål.

Blandingene ifølge oppfinnelsen kan utformes på vanlig måte med én eller flere fysiologisk akseptable bærere eller eksipienser i henhold til teknikker som er velkjente på området. Blandingene kan administreres topisk, oralt eller systemisk.

Topiske blandinger er foretrukket, og disse innbefatter geler, kremer, salver,

spray, balsam, stifter, såper, pulver, pessarer, aerosoler, dråper og hvilke som helst av de andre vanlige farmasøytiske former på området.

Salver og kremer kan for eksempel utformes med vandig basis eller olje-basis med tilsetting av egnede fortyknings- og/eller geldannelsesmiddler. Lotioner kan utformes med en vandig basis eller oljebasis og vil vanligvis også inneholde ett eller flere emulgerings-. dispergerings-, suspenderings-, fortyknings- eller fargemidler. Pulvere kan dannes ved hjelp av hvilken som helst egnet pulverbasis. Det kan utformes dråper med vandig eller ikke-vandig basis, som også omfatter ett eller flere dispergerings-, solubiliserings- eller suspenderingsmidler. Aerosolspraypreparater avgis hensiktsmessig fra trykkinnpakninger under anvendelse av et egnet drivmiddel.

Blandingene kan alternativt tilveiebringes i en form som er tilpasset oral eller parenteral administrering, for eksempel ved intradermal, subkutan, intra-peritoneal eller intravenøs injeksjon. Alternative farmasøytiske former innbefatter således rene eller belagte tabletter, kapsler, suspensjoner og løsninger som inne-holder den aktive komponent, eventuelt sammen med én eller flere inerte vanlige bærere og/eller fortynningsmidler, f.eks. med maisstivelse, laktose, sakkarose,

mikrokrystallinsk cellulose, magnesiumstearat, polyvinylpyrrolidon, citronsyre,

vinsyre, vann, vann/etanol, vann/glycerol, vann/sorbitol, vann/polyetylenglykol, propylenglykol, stearylalkohol, karboksymetylcellulose eller fettsubstanser så som hardt fett, eller egnede blandinger av disse.

Konsentrasjonen i blandingene av forbindelsene som beskrevet i det foreliggende, avhenger av forbindelsens beskaffenhet, sammensetningen, administreringsmåten og pasienten, og kan varieres eller justeres etter valg. Imidlertid er konsentrasjonsområder på fra 1 til 50 vekt% vanligvis egnet. Når det gjelder terapeutiske anvendelser, er konsentrasjonsområder på 10-50 vekt% blitt funnet egnet, f.eks. 15-30 vekt%.

Etter administrering på overflaten eksponeres det behandlede område for lys for oppnåelse av den fotokjemoterapeutiske effekt. Tidslengden ved hvilken lyseksponeringen finner sted etter administrering vil avhenge av blandingens beskaffenhet og administreringsformen. Dette kan generelt være i størrelses-ordenen fra 1/2 til 48 timer, f.eks. fra 1 til 10 timer.

Bestrålingen vil vanligvis bli påført ved et dosenivå på fra 40 til 200 Joule

pr. cm<2>, for eksempel ved 100 joule pr. cm<2>.

Bølgelengden for lys som anvendes for bestråling, kan velges slik at det oppnås en mer effektiv fotokjemoterapeutisk effekt. Når porfyriner anvendes ved fotokjemoterapi, bestråles de vanligvis med lys ved omkring porfyrinets absorpsjonsmaksimum. Således ble det for eksempel ved anvendelse av ALA ved fotokjemoterapi av hudkreft ifølge teknikkens stand anvendt bølgelengder i området 350-640 nm, fortrinnsvis 610-635 nm. Ved valg av et vidt bølgelengde-område for bestråling som strekker seg ut over absorpsjonsmaksimum for porfyrinet kan imidlertid den fotosensibiliserende effekt forøkes. Skjønt man ikke ønsker å være bundet av noen teori, antas dette og skyldes at når Pp og andre porfyriner eksponeres for lys med bølgelengder innenfor disses absorpsjonsspektrum, blir det nedbrutt til forskjellige fotoprodukter innbefattende spesielt foroprotoporfyrin (PPp). PPp er en klorforbindelse og har en betydelig fotosensibiliserende effekt; dets absorpsjonsspektrum strekker seg til lengre bølge-lengder over bølgelengdene ved hvilke Pp absorberer, dvs. opptil nesten 700 nm (Pp absorberer nesten intet lys over 650 nm). Ved vanlig fotokjemoterapi eksiterer således ikke de anvendte bølgelengder PPp, og følgelig oppnås ikke fordelen med dets tilleggsfotosensibiliseringseffekt. Bestråling med bølgelengder av lys i området 500-700 nm er blitt funnet å være spesielt effektivt. Det er spesielt viktig å innbefatte bølgelengdene 630 og 690 nm.

Fremgangsmåter for bestråling av forskjellige områder på kroppen, f.eks. ved hjelp av lamper eller lasere, er velkjent på området (se for eksempel Van den Bergh, Chemistry in Britain, mai 1986, s. 430-439).

Forbindelsene for anvendelse ved oppfinnelsen kan utformes og/eller administreres med andre fotosensibiliseringsmidler, for eksempel ALA eller fotofrin, eller med andre aktive komponenter som kan forøke den fotokjemo-terapeutiske effekt. For eksempel kan chelateringsmidler med fordel innarbeides for forøking av opphoping av Pp; chelatering av jern med chelateringsmidlene forhindrer inkorporering av det i Pp under dannelse av heme ved påvirkning av enzymet ferrochelatase, noe som fører til en opphoping av Pp. Den fotosensibili-serende effekt blir således forøket.

Aminopolykarboksylsyre-chelateringsmidler er spesielt egnet for anven-delse i

denne henseende, innbefattende hvilke som helst av chelateringsmidlene som er beskrevet i litteraturen for metall-detoksifisering eller for chelatering av paramagnetiske metall-ioner i kontrastmidler for magnetisk resonnans-avbilding. Det kan spesielt nevnes EDTA, CDTA (cykloheksandiamintetraeddiksyre), DTPA og DOTA. EDTA er foretrukket. For oppnåelse av den jernchelaterende effekt kan

det også anvendes desferrioksamin og andre sideroforer, f.eks. i forbindelse med aminpolykarboksylsyre-chelateringsmidler så som EDTA.

Chelateringsmidlet kan hensiktsmessig anvendes i en konsentrasjon på fra 1 til 20 vekt%, f. eks. fra 2 til 10 vekt%.

Det er dessuten blitt funnet at midler som understøtter overflateinntrenging, og spesielt dialkylsulfoksyder så som dimetylsulfoksyd (DMSO), kan ha fordelaktig virkning ved forøking av den fotokjemoterapeutiske effekt. Dette er beskrevet detaljert i vår samtidig verserende patentsøknad nr. PCT/GB94/01951, og en kopi av beskrivelsen i denne er knyttet til denne patentsøknad.

Det overflateinntrengings-understøttende middel kan være hvilket som helst av de hudinntrengings-understøttende midler som er beskrevet i den farmasøy-tiske litteratur, f.eks. HPE -101 (leveres fra Hisamitsu), DMSO og andre dialkyl-sulfoksyder, spesielt n-dekylmetylsulfoksyd (NDMS), dimetylsulfacetamid, dimetyl-formamid (DMFA), dimetylacetamid, glykoler, forskjellige pyrrolidon-derivater (Woodford et al., J. Toxicol. Cut. & Ocular Toxicology, 1986, 5: 167-177) og Azone® (Stoughton et al., Drug Dpv. lnd. Pharm. 1983,9: 725-744) eller blandinger av disse.

DMSO har imidlertid en rekke fordelaktige virkninger og er sterkt foretrukket I tillegg til at DMSO har en overfiateinntrengings-understøttende effekt (DMSO er spesielt effektivt til forøking av dybden av inntrenging av det aktive middel i vevet), har det antihistamin- og EM-inflammatoriske virkninger. Dessuten er DMSO blitt funnet å øke aktiviteten av enzymet ALA-syntase og ALA-dehydrogenase (enzymene som henholdsvis danner og kondenserer ALA til porfobilinogen), hvorved dannelse av den aktive form, Pp, forøkes.

Det overflateinntrengende middel kan hensiktsmessig tilveiebringes i et konsentrasjonsområde på fra 2 til 50 vekt%, f.eks. ca. 10 vekt%.

I henhold til den tilstand som behandles samt blandingens beskaffenhet, kan forbindelsene for anvendelse ved oppfinnelsen ko-administreres med slike andre eventuelle midler, for eksempel i en enkelt blanding, eller de kan admini-streres sekvensielt eller atskilt. I mange tilfeller kan det faktisk oppnås en spesielt fordelaktig fotokjemoterapeutisk effekt ved for-behandling med det overflate-inntrengings-understøttende middel i et atskilt trinn, før administrering av forbindelsene for anvendelse ved oppfinnelsen. I noen situasjoner kan videre en for-behandling med det overflateinntrengings-understøttende middel, fulgt av administrering av det fotokjemoterapeutiske middel sammen med det overflateinntrengnings-understøttende middel, være fordelaktig. Nåt det anvendes et overflateinntrengings-understøttende middel ved for-behandling, kan dette anvendes i høye konsentrasjoner, f.eks. opp til 100 vekt%. Hvis det anvendes et slikt forbehandlingstrinn, kan det fotokjemoterapeutiske middel deretter admini-streres opp til flere timer etter for-behandlingen, f eks. med en pause på fra 5 til 60 minutter etter forbehandling.

Ut fra et alternativt synspunkt tilveiebringer dette aspekt ved oppfinnelsen

også et utstyrssett for anvendelse til diagnostisering eller fotokjemoterapi av forstyrrelser eller abnormaliteter hos ytre eller indre overflater på kroppen, kjennetegnet ved at det omfatter:

a) en første beholder som inneholder en forbindelse som angitt i hvilket som helst av kravene 1-4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt av denne, b) en andre beholder som inneholder minst ett overflategjennomtrengnings-understøttende middel; og eventuelt c) ett eller flere chelateringsmidler som enten finnes i den første beholder eller i en tredje beholder.

Når det overflateinntrengende middel tilføres i et atskilt forbehandlingstrinn, kan det tilføres i høyere konsentrasjon, for eksempel opp til 100 vekt%.

Man vil forstå at terapi hvor det anvendes forbindelser som beskrevet i det foregående, uunngåelig innbefatter fluorescens av forstyr-relsen eller abnormaliteten som skal behandles. Skjønt intensiteten av denne fluorescens kan anvendes til eliminering av unormale celler, kan lokaliseringen av fluorescensen anvendes til visualisering av størrelsen, omfanget og situasjonen ved abnormaliteten eller forstyrrelsen. Dette gjøres mulig ved ALA-esteres overraskende evne til preferensiell lokalisering til ikke-normalt

vev.

Abnormaliteten eller forstyrrelsen som således blir identifisert eller bekreftet på undersøkelsesstedet, kan så behandles ved hjelp av alternative terapeutiske teknikker, f.eks. kirurgisk eller kjemisk behandling, ved stadig opphoping av fluorescens eller ved ytterligere tilføring av forbindelser ifølge oppfinnelsen til det hensiktsmessige sted. Man vil forstå at diagnostiske teknikker kan fordre lavere nivåer av fluorescens for visuaslisering enn det som anvendes ved terapeutiske behand-linger. Således er vanligvis konsentrasjonsområder på fra 1 til 50 vekt%, f.eks.

1-5 vekt%, egnet. Steder, fremgangsmåter og administreringsmåter er blitt vurdert før med hensyn til de terapeutiske anvendelser, og kan også anvendes for diagnostiske anvendelser beskrevet i det foreliggende. Forbindelsene for anvendelse ved oppfinnelsen kan også anvendes for in vitro-diagnostiske teknikker, for eksempel for undersøkelse av cellene som finnes i kroppsvæsker. Den høyere fluorescens som er forbundet med unormalt vev, kan hensiktsmessig angi en abnormalitet eller forstyrrelse. Denne fremgangsmåte er meget følsom og kan anvendes for tidlig påvisning av abnormaliteter eller forstyrrelser, for eksempel blære- eller lungekarsinomer, ved undersøkelse av epitelcellene i henholdsvis urin- og spyttprøver. Andre egnede kroppsfluider som kan anvendes for diagnostisering i tillegg til urin og spytt, innbefatter blod, sæd, tårer, spinalvæske osv. Vevsprøver eller - preparater kan også vurderes, for eksempel biopsivev eller benmargsprøver.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet mer detaljert i de følgende eksempler, under henvisning til tegningene, hvor: Fig. 1 viser fluorescens-intensitet (relative enheter sammenstilt med bølgelengde (nm)) for PplX i normal hud hos mus etter topisk administrering av Fig. 2 viser fordelingen av PplX målt ved fluorescens-intensiteten (relative enheter sammenstilt med bølgelengde (nm)) i hjerne, hud, øre, lever og muskel 14 timer etter topisk administrering til normal hus hos mus av Fig. 3 viser PplX-fluorescens (fluorescens-intensitet, relative enheter, sammenstilt med bølgelengde (nm)), i huden hos mus, 15 minutter, 1 time, 4 timer og 10 timer etter intraperitoneal injeksjon av ALA-metylester (150 mg/kg), Fig. 4 viser PplX-fluorescens (fluorescens-intensitet, relative enheter, sammenstilt med bølgelengde (nm)) (A) 1 Vz time og (B) 4 timer etter topisk administrering av ALA-metylester til basalcelle-karsinom-(BCC)-skader på huden hos mennesker (- tumor; — normal hud); Fig. 5 viser PplX-fluorescens (fluorescens-intensitet, relative enheter, sammenstilt med bølgelengde (nm)) (A) 1 V2 time og (B) 4 timer etter topisk administrering av ALA-etylester til basalcelle-karsinom-(BCC)-skader på huden hos mennesker (- tumor; — normal hud); Fig. 6 viser PplX-fluorescens (fluorescens-intensitet, relative enheter, sammenstilt med bølgelengde (nm)) (A) 1 lA time og (13) 4 timer etter topisk administrering av ALA-propylester til basalcelle-karsinom-(BCC)-skader på huden hos mennesker (-tumor; — normal hud); Fig 7 viser PplX-fluorescens (fluorescens-intensitet, relative enheter, sammenstilt med bølgelengde (nm)) (A) 1 Vz time og (B) 4 timer etter topisk administrering av ALA til basalcelle-karsinom-(BCC)-skader på huden hos mennesker

(-tumor; —normal hud);

Fig. 8 viser måling av PplX-dannelse etter topisk tilføring av ALA-metylester, i human

BCC og omgivende normal hud ved CDD-mikroskopering av biopsier -

(A) grafisk fremstilling som viser fluorescens-intensiteten sammenstilt med dybden (um), og (B) mikroskopfotografi; Fig. 9 viser måling av PplX-dannelse etter topisk tilføring av topisk tilføring av ALA-metylester, i human BCC og omgivende normal hud ved CDD-mikroskopering av biopsier - (A) grafisk fremstilling som viser fluorescens-intensiteten sammenstilt med dybden (um) og (B) mikroskopfotografi; Fig. 10 viser PplX-fluorescens (fluorescens-intensitet, relative enheter, sammenstilt med bølgelengde (nm)) 24 timer etter topisk administrering av ALA-metylester til BCC-skade og til normal hud hos mennesker; Fig. 11 viser PplX-fluorescens (fluorescens-intensitet, relative enheter, sammenstilt med bølgelengde (nm)) 24 timer etter topisk administrering av ALA til BCCskade og til normal hud hos mennesker;

Fig. 12 viser måling av PpDX-dannelse 4VS time etter topisk tilføring av ALA-

metylester, i human BCC ved CDD-mikroskopering av biopsier -

(A) grafisk fremstilling som viser fluorescens-intensiteten sammenstilt med dybden (nm), og (B) mikroskopfotografi; Fig. 13 viser måling av PplX-dannelse 4lA time etter topisk tilføring av ALA-metylester, i human normal hud ved CDD-mikroskopering av biopsier - (A) grafisk fremstilling som viser fluorescens-intensiteten sammenstilt med dybden (pm), og (B) mikroskopfotografi; Fig. 14 viser måling av PplX-dannelse 24 timer etter topisk tilføring av ALAmetylester, i human BCC ved CDD-mikroskopering av biopsier - (A) grafisk fremstilling som viser fluorescens-intensiteten sammenstilt med dybden (um), og (B) mikroskopfotografi; Fi g. 15 viser måling av PnlX-dannelse 24 timer etter topisk tilføring av ALA- metylester, i human normal hud ved CDD-mikroskopering av biopsier - (A) grafisk fremstilling som viser fluorescens-intensiteten sammenstilt med dybden (um), og (B) mikroskopfotografi;

Fig. 16 viser måling av PplX-dannelse 24 timer etter topisk tilføring av fri ALA,

i human BCC ved CDD-mikroskopering av biopsier -

(A) grafisk fremstilling som viser fluorescens-intensiteten sammenstilt med dybden (um), og (B) mikroskoptofografi;

Fig. 17 viser måling av PplX-dannelse 24 timer etter topisk tilføring av fri ALA,

i human normal hud ved CDD-mikroskopering av biopsier -

(A) grafisk fremstilling som viser fluorescens-intensiteten sammenstilt med dybden (fim), og (B) mikroskopfotografi; Fig. 18 viser måling av PplX-dannelse 4 Vi time etter topisk tilføring av fri ALA og 20% DMSO, i human BCC ved CDD-mikroskopering av biopsier - (A) grafisk fremstilling som viser fluorescens-intensiteten sammenstilt med dybden (um), og (B) mikroskopfotografi; Fig. 19 viser måling av PplX-dannelse 4'/2 time etter topisk tilføring av fri ALA og 20% DMSO i human normal hud ved CDD-mikroskopering av biopsier - (A) grafisk fremstilling som viser fluorescens-intensiteten sammenstilt med dybden (nm), og (B) mikroskopfotografi;

Fig. 20 viser et tidsforløp (fluorescens-intensitet, relative enheter, sammenstilt med tiden (timer)) for ALA-metylester-indusert (PplX)-fluorescens i musehuden etter topisk påføring av ALA-metylester alene (-■-), ALA-metylester pluss DMSO (- A-), ALA-metylester pluss desferrioksamin (DIF) (-■-) eller ALA-metylester pluss DIF

og DMSO (-▼-). Hvert punkt er middelverdien for målinger fra minst tre mus;

Fig. 21 viser fluorescens-fotografier av musehuden tatt 1 time etter topisk påføring av fritt

ALA alene (A), ALA-metylester (B), ALA-etylester (C) og ALA-propylester (D), som viser fluorescens i epidermis (Ep), epitelialhårfollikler og talgkjertler (piler), men ikke i dermis (De). Opprinnelig forstørrelse x 250.

Fig. 22 er et diagram som viser relativt tumorvolum mot tiden (dager) etter behandling av human WiDr-kolonikarsinomer transplantert subkutant i hårløse mus med ALA eller ALA-metylester pluss DF; (- A-) kontroll; (-T-) DF alene;

(-■-) ALA + DF + DMSO; (-) ALA-metylester + DF + DMSO.

Fig 23 viser PplX-fluorescensforhoId mellom BCC-skader og omgivende normal hud etter topisk påføring av ALA eller dens estere.

Eksempel 1

Fremstilling av metyl 5- aminolevulinat- hvdroklorid

1 en 500 ml glassreaktor som inneholdt 200 ml metanol, ble det tilsatt 1 g 5-aminolevulinsyrehydroklorid og 1 dråpe konsentrert HCI. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt over natten ved 60°C. Forestringsforløpet ble fulgt ved hjelp av 'H-NIVIR. Overskudd av metanol ble fjernet ved destillasjon, og produktet ble tørket videre under vakuum ved 30-40°C, hvorved man fikk metyl-5-amino-levulinathydroklorid. Strukturen ble bekreftet ved <l>H-NIVIR i DMSO-d6.

Eksempel 2

Fremstilling av etyl 5- aminolevulinat- hvdroklorid ( ALA- etvlester)

1 g 5-aminolevulinsyrehydroklorid ble tilsatt til 200 mi tørr etanol som inneholdt 1-2 dråper kons. saltsyre, i en 250 ml glassreaktor utstyrt med rører, tilbake-løpskondensator og termometer. Forestringen ble utført ved tilbakeløp over natten (70-80°C). Etter at reaksjonen hadde gått til fullførelse, ble etanolen fjernet under vakuum. Til slutt ble produktet tørket under høy-vakuum ved 30-40°C, hvorved man fikk 0,94 g etyl-5-amiolevulinat-hydroklorid. Bekreftelse av strukturen ble utført ved hjelp av 'H-NMR i DMSO-de-

Eksempel 3

Fremstilling av n- propvl- 5- arninolevulinat- hydroklorid f ALA- propylestert

0,5 g 5-aminolevulinsyrehydroklorid ble oppløst i 100 ml tørr n-propanol

som inneholdt 1-2 dråper kons. saltsyre, i en 250 ml glassreaktor med rører, tilbakeløpskondensator og termometer. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 70-80°C i ca. 20 timer. Etter at all 5-aminolevuIinsyren var blitt omdannet til sin n-propylester (fulgt av 'H-NMR), ble overskuddet av propanol fjernet og produktet tørket under høy-vakuum (< 100 Pa) ved 40-50°C. Reaksjonen ga 0.49 g propyl-5-aminolevulinat-hydroklorid. Strukturen ble bekreftet ved hjelp av <]>H-NMR i DMSO-de.

Eksempel 4

Fremstilling av n- heksvl- 5- aminolevulinat- hydroklorid ( ALA- heksvlester)

2 g 5-aminolevulinsyrehydroklorid ble oppløst i 25 g tørr n-heksanol med

5-6 dråper kons. saltsyre tilsatt, i en 50 ml glassreaktor med utstyrt med tilbake-løpskondensator og termometer. Reaksjonsblandingen ble holdt på 50-60°C i ca.

3 dager. Overskuddet av n-heksanol ble fjernet under vakuum, og produktet ble til slutt tør-ket under høy-vakuum, hvorved man fikk 2,4 gram n-heksyl-5-amino-levulinat-hydroklorid. Strukturen ble bekreftet ved hjelp av 'H-NMR-spektroskopi i DMSO-dV

Eksempel 5

Fremstilling av n- heptvl- 5- aminolevulinsvrehvdroklorid ( ALA- heptylester)

0,5 g 5-aminolevulinsyrehydroklorid ble tilsatt til 30 gram n-heptanol som inneholdt 5 dråper kons. saltsyre, i en 100 ml glassreaktor utstyrt med rører, tilbakeløpskondensator og termometer. Etter at all 5-aminolevulinsyren var blitt oppløst, ble reaksjonsblandingen omrørt ved 70-80°C i ca. 48 timer. Etter at 5-aminolevulinsyren var blitt omdannet til sin n-heptylester (fulgt av 1 H-NMR), ble overskuddet av alkohol fjernet og produktet tørket under høy-vakuum (< 100 Pa) ved 70°C. Reaksjonen ga 1,5 g n-heptyl-5-aminolevulinat-hydroklorid. Strukturen ble bekreftet ved hjelp av <!>H-NMR i DMSO-d6.

Eksempel 6

Fremstilling av n- oktyl- 5- aminoIevulinsyrehydroklorid ( ALA- oktvlester).

1 g 5-aminolevulinsyrehydroklorid ble tilsatt til 30 gram tørr n-oktanol som inneholdt 5-6 dråper kons. saltsyre, i en 50 ml glassreaktor utstyrt med tilbakeløps-kondensator, rører og termometer. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 65-70°C

i ca. 2 dager. Overskuddet av n-oktanol ble fjernet under vakuum, og produktet ble til slutt tørket under høy-vakuum, hvorved man fikk 1,5 gram n-oktyl-5amino-levulinat-hydroklorid. Strukturen ble bekreftet ved hjelp av 'H-NMR-spektroskopi i DMSO-d6.

Eksempel 7

Utforming

20% kremer ble fremstilt ved blanding av den aktive komponent, ALA, ALA metylester, ALA-etylester eller ALA-propylester (fremstilt ifølge henholdsvis eksempler 1-3), med krembasisen «Urguentum Merck» (leveres fra Merck), som består av silisiumdioksyd, flytende paraffin, vaselin, albumin, cetostearol, polysorbat 40, glycerolmonostearat, Miglyol®812 (en blanding av plantefettsyrer), polypropylenglykol og renset vann.

Det ble også fremstilt tilsvarende kremer som i tillegg inneholdt 3-20% DMSO.

Eksempel 8

Bestemmelse av dannelse av <p>roto<p>orfyrin DC i huden hos mus ved hjelp av CCD-mikroskopering av biopsier: En kommersiell olje-i-vann-krem inneholdende (20 vekt%) ett av kjemikaliene (fri ALA, ALA-metylester, ALA-etylester og ALA-propylester) (se eksempel 1) ble påført topisk på normal hud hos hårløse nu/nu-mus i Vi, 1, 3 og 6 timer, og deretter ble det tatt biopsiprøver som ble vurdert ved hjelp av mikroskopisk fluorescensfotometri som innbefattet et lysfølsomt termoelektrisk avkjølt ladnings-koplet apparat-(CCD)-kamera. Resultatene viser at fri ALA og dens tre ester-derivater opptas av hudvevet, idet de forestrede ALA-derivater deforestres i huden og omdannes til protoporfyrin DC (PplX) Vi time etter topisk påføring. Fluorescens-intensiteten av PplX i huden øket med tiden for påføringen, og maksimale mengder av fluorescens ble sett ca. 6 timer (det siste undersøkte tidspunkt) etter påføringen i alle tilfeller.

Eksempel 9

Målinger in situ av protoporfyrin IX- dannelse i huden hos mus ved et system basert på optiske fibrer

Målet med denne undersøkelsen var å utforske opphoping av forestret ALA-ester-bevirket porfyrinfluorescens i normal hud hos hårløse mus in vivo etter topisk eller systemisk administrering av ALA-esterderivater.

MATERIALER OG METODER

Kjemikalier

5-aminolevulinsyre-(ALA)-metyl-, -etyl- og -propylestere (H2N-CH2COOCH2-CH2COO-R; R kan være CH3, CH2-CH2-CH3) ble fremstilt av Norsk Hydro Research Center (Porsgrunn, Norge) som beskrevet i eksemplene 1-3. Fritt ALA-hydroklorid og desferrioksaminmesylat (DF) ble anskaffet fra Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo, USA). Dimetylsulfoksyd (DMSO) ble anskaffet fra

Janssen Chimica (Geel, Belgia). Kommersielle olje-vann-kremer (Unguentum Merck, Darmstadt, Tyskland) inneholdende 20% av ett av ALA-esterderivatene (på vektbasis), 20% fri ALA, 20% ALA-metylester pluss 5% DF, 20% ALA-metylester pluss 20% DMSO, eller 20% ALA-metylester pluss 5% DF og 20% DMSO ble fremstilt friskt før anvendelse. Alle kremer ble laget av apoteket ved Det Norske Radiumhospital. For intraperitoneal injeksjon ble ALA og dens metylester

ny-oppløst i saltløsning. Alle andre anvendte kjemikalier hadde den høyeste renhet som er kommersielt tilgjengelig.

Dvr

Hårløse athymiske hunnmus av typen Balb/c nu/nu ble anskaffet fra dyre-laboratohet ved Det Norske Radiumhospital og holdt under spesifikk-patogenfrie betingelser. Ved starten av forsøkene var musene 6-7 uker gamle og veide 18-24 g. Tre mus ble oppbevart i hvert bur med autoklaverte lokk i et mørkt rom under forsøkene.

Behandlingsmetode

En av kremene ble malt på den normale hud i høyre sideområde på hver mus og dekket med en halvgjennomtrengelig bandasje (3M, St. Paul, MN, USA) i forskjellige tidsrom (fra % til 24 timer) før fluorescensmålinger in situ eller før det ble tatt biopsiprøver for mikroskopisk fluorescensavbilding. Det ble på ca. 0,2 g krem på et område av huden på ca. 2,25 m<2>. Når det gjaldt i.p.-injeksjon, ble musene gitt ALA eller dens metylester i en dose på 150 mg/kg. Det ble anvendt minst tre mus for hver tilstand.

Fluorescensspektroskopiske målinger in situ

Det ble anvendt et fluorescensspektrometer av typen Perkin Eimer LS-50 utstyrt med en rød-følsom fotomultiplikator (Hamamatsu R 928). Dette instrument har en pulset Xenon-buelyskilde og fasefølsom detektering slik at fluorescens lett kan måles. En del av eksitasjonsstrålen (innstilt på 408 nm for fluorescens-målinger) ble reflektert i en optisk multimodus-kvartsfiber med 600 um kjerne

(nr. 3501 393, Dornier Medizintechnik, GmbH, Germering,Tyskland) ved hjelp av et speil for påføring på gjenstanden ved hjelp av en håndprobe. Stråling i området 550-750 nm ble målt via emisjonsfibrer som oppsamlet informasjon via proben.

Fluorescensmikroskopi

Etter at kremene var blitt påført på huden hos mus i forskjellige tidsrom (som angitt ovenfor), ble det tatt biopsiprøver fra huden, og de frosne vevsdeler ble kuttet med en kryostat til en tykkelse på 8 um. Fluorescensmikroskoperingen ble utført under anvendelse av et aksioplan-mikroskop (Zeiss, Tyskland) med en 100 W kvikksølvlampe. FluorescensbiIdene ble tatt med et lysfølsomt termo-elektrisk avkjølt ladningskoplet apparat-(CCD)-kamera (oppløsning 385 x 578 pixel med et dynamisk område på 16 bit pr. pixel) (Astromed CCD 3200,Cambridge, UK) og hardkopier på en videoprinter (Sony multiscanning videoprinter UP-930). Filterkombinasjonen som ble anvendt for påvisning av porfyrinfluorescens, besto av 390-440 nm eksitasjonsfilter, en 460 nm stråledeler og et emisjonsfilter på

> 600 nm.

Resultater

PplX-fluorescens ble målt in situ ved et system basert på optiske fibrer, i normal hud hos hårløse mus, Vi, 1, IVi, 2Vit 3, 3J4 og 14 timer etter topisk påføring av fri ALA eller én av dens esterderivater som beskrevet ovenfor. Som vist på fig. 1, var PplX-fluorescensen allerede opphopet 1 time etter topisk påføring når det gjaldt alle derivater, mens fluorescensen ble sett 1 Vi time etter påføring av fri ALA. Den maksimale fluorescensintensitet ble funnet 14 timer etter påføringen i alle tilfellene, men PplX-fluorescens indusert av ALA-estere i huden var sterkere enn fra fri ALA. Videre ble det, som det vil kunne sees av fig. 2,14 timer etter påføring ikke påvist noen fluorescens av ALA-ester-indusert PplX på andre områder av huden eller indre organer innbefattende øre, dermis, muskel, hjerne og lever. Når det gjaldt fri ALA, ble det imidlertid også sett en sterk fluorescens i øret samt i de andre områder av huden. Etter topisk påføring ble det således funnet ALA-esterindusert PplX lokalt i huden, mens PplX indusert av fri ALA ikke bare var fordelt lokalt, men også i andre områder av huden. Vi stiller forslag om at ALA transporteres i blodet og at PplX deretter dannes i alle organer som inneholder enzymene I hemesynteseveien, og/eller at PplX dannes i huden og deretter transporteres til andre vev via blodsirkulasjonen. Sistnevnte situasjon kan føre til fotofølsomhet hos huden på områder hvor fri ALA ikke påføres topisk. Etter intraperitoneal injeksjon av ALAmetylester i en dose på 150 mg/kg, ble dessuten PplX-fluorescensen i huden hos mus opphopet 15 minutter etter injeksjon, toppverdien ble funnet rundt 4 timer etter injeksjonen og fluorescensen forsvant innen 10 timer etter injeksjonen (fig. 3). Dette kinetiske mønster er likt mønsteret for fluorescensen av porfyriner indusert av fri ALA i huden etter i.p.-injeksjon av samme dose, skjønt fluores-censen avtok hurtigere når det gjaldt esteren enn når det gjaldt den frie ALA.

Eksempel 10

Målin<g>er av dannelse av <p>rotoporfyrin DC i humane basalcelle- karsinomer ( BCC) og omgivende normal hud ved et system basert på optiske fibrer

Pp|X-fluorescensen i BCC-skadene og omgivende normal hud hos mennesker ble målt in situ ved et system basert på optiske fibrer, etter topisk påføring av 20% fri ALA og dens derivater ved forskjellige tidsintervaller.

Fig. 4, 5, 6 og 7 viser at sammenliknet med fri ALA ble PplX som var indusert av ALA-derivatene, hurtigere opphopet, mer dannet og lokalisert mer selektivt i BCC-skadene

(dvs. mye mindre fluorescens i den omgivende normale hud), spesielt når det gjaldt ALA-metylester.

Eksempel 11

Overflate- fluorescensmålinger in vivo av PplX- dannelse i human BCC og om<g>ivende normal hud ved hjelp av CCD- mikroskopering av biopsier

Hos en 78 år gammel kaukasisk mann som hadde multiple ulcero små-knuteformige BCCer ble skadene eksponert for kommersielle olje-i-vann kremer som enten inneholdt ALA alene (20 vekt%) eller ALA-metylester (20 vekt%) (som beskrevet i eksempel 7) dekket med en halvgjennomtrengelig bandasje i 24 timer. Etter fjerning av bandasjer og krem ble in vivo-fluorescensen målt ved overflaten av tumorvev og tilstøtende normal hud ved hjelp av et spektrofluorometer. Det ble tatt utstansede («punch») biopsier fra de samme områder, og prøvene ble umiddelbart nedsenket i flytende nitrogen. Vevssnittene ble kuttet med en kryostat-mikrotom til en tykkelse på 8 um. Lokalisasjonsmønsteret for porfyrin-fluorescensen i vevssnittene ble observert direkte ved hjelp av fluorescens-mikroskopering. De samme frosne snitt ble deretter farget med H&E rutinefarging for histologisk identifisering. Fluorescensmikroskopering ble utført med et aksioplan-mikroskop (Zeiss,Tyskland). Fluorescencbilder og kvantitative målinger ble utført ved hjelp av et lysfølsomt termoelektrisk avkjølt ladningskoplet apparat-(CCD)-kamera (Astromed CCD 3200, Cambridge, UK) og en bildefremkallings-enhet /Astromed/Visilog, PC 486DX2 66 MHz VL). Hovedformålet for slike kvantitative målinger er å bestemme den nøyaktige gjennomtrenging av ALA-induserte porfyriner fra vevsoverflate til bunnlagene i kreftskader. Resultatene er vist på fig. 8 og 9, hvor fluorescens-intensiteten er uttrykt som funksjon av dybden av kreftskade.

Som vist på fig. 8 og 9 sees det en homogen fordeling av PplX-fluorescens fra toppen til bunnen av hele BCC-skadene etter anvendelse av enten fri ALA eller dens metylester. Dette tyder på at ALA-metylester er minst like god som fri ALA når det gjelder gennomtrengning og PplX-dannelse i BCC-skaden. Dessuten

kunne det ikke sees noen PplX-fluorescens i den omgivende normale hud etter topisk påføring av ALA-metylester, noe som viste at ALA-metylester-industert PplX bare fant sted meget selektivt i BCC-skaden.

In vivo-fluorescens etter 24 timer viste minst doblet fluorescens-intensitet for ALA-metylester sammenliknet med ALA for de valgte tumorer og dessuten en økning når det gjaldt tilsvarende normale vev, men denne var bare på ca. 50%. Forholdet mellom tumor og normalt vev var ca. 1,2:1 for ALA og 2:1 for ALAmetylesteren. Resultatene er vist på fig. 10 og 11.

Ved kontroll 1 uke etter behandling viste alle behandlingsområder et sentralt nekrotisk område svarende til tumoren. I den tilstøtende normale hud som ble eksponert for krem og lysbestråling, ble det observert en markert hudrødme når det gjaldt ALA, mens det bare ble observert moderat hudrødme når det gjaldt ALA-metylesteren.

Eksempel 12

In vivo- overflatefluorescensmålinger av PplX- dannelse i human BBC oe omgivende normal hus ved CCD- mikroskopering av biopsier

De foreliggende data viser lokalisasjonsmønstrene og dannelsen av porfyriner (hovedsakelig protoporfyrin IX (PplX)) etter topisk påføring av fri ALA og én av dens derivater (metylester) i 4 Vi og 24 timer i de knuteformede basalcelle-karsinomer (BCCer) og omgivende normal hud hos pasienter. Testene ble utført som beskrevet i eksempel 11.

Hver av følgende figurer viser både (B) fluorescensbilder av enten bunn-Iaget av BCC-skader eller av den omgivende normale hud. Kurver som angir fluorescens-intensiteten som funksjon av dybden av BCC-skadene eller av normal hud, er også vist (A). Fig. 12 viser en homogen fordeling av PplX-fluorescens frembrakt ved ALA-metylester i bunnlaget av en BCC 414 timer etter topisk påføring. Det er også en viss porfyrinfluorescens i omgivende normal hud (fig. 13). Fluorescensintensitets-forholdet mellom BCC og den normale hud er ca. 2. Videre er den absolutte mengde av fluorescensen indusert av ALA-metylester høyere enn den som induseres av fri ALA og 20% DMSO etter topisk påføring i AVi time, som vist nedenfor.

Fig. 14 og 15 viser en jevn fordeling av porfyrinfluorescens indusert ved

topisk påføring av ALA-metylester i 24 timer i bunnlaget av BCC og omgivende normal hud. Forholdet mellom fluorescensen i BCC og i normal hud er også omkring 2. Videre er fluorescensintensiteten av ALA-metylester-induserte porfyriner i BCC nesten dobbelt så høy som i BCC etter topisk påføring av fri ALA alene i 24 timer, som vist nedenfor.

Fig. 16 og 17 viser en homogen fordeling av porfyriner indusert av fri ALA i bunnlaget av BCC og omgivende normal hud 24 timer etter topisk påføring. Imidlertid er fluorescensintensitetsforholdet mellom BCC og normal hud ca. 1, noe som angir lav selektivitet av denne behandling. Videre er dannelsen av porfyriner i BCC mindre enn denne dannelse når det gjelder ALA-metylester.

Fig. 18 og 19 viser en homogen fordeling av ALA-induserte porfyriner i bunnaget av BCC og omgivende normal hud etter topisk påføring av fri ALA og 20% DMSO i 4/2 time. Imidlertid er fluorescensintensitetsforholdet mellom BCC og normal hud bare litt større enn 1, noe som viser at DMSO sannsynligvis reduserer tumorselektiviteten hos de dannede porfyriner. Videre dannes det også i dette tilfelle mindre porfyriner i BCC enn ved påføring av ALA-metylester.

Eksempel 13

Undersøkelse av virkningene av chelateringsmidlet desferiroksamin ( DF) og/ eller DMSO og fluorescens hos huden I. Virkningen av DF ogleller DMSO på opphoping av fluorescens i normal hud hos mus in situ ble observert på forskjellige tidspunkter etter topisk administrering av ALA-metylester. Metodene ble utført som beskrevet i eksempel 9.

RESULTATER

Topisk påføring av kremen alene som bare inneholdt DMSO, viste ingen fluorescens i normal musehud, men det var en del fluorescens av PplX etter at DF alene var påført.

DF eller DF pluss DMSO (et velkjent hudgjennomrrengings-forøkende middel) forøket dannelsen av PplX indusert av ALA-metylester i betydelig grad.

II. Fluorescensavbilding av huden som var behandlet med tre derivater

(utført som beskrevet i eksempel 9) viste fluorescens av de esterderivatinduserte porfyriner i epidermis, epitelhårfolliklene og talgkjertlene 1 time etter topisk påføring (fig. 21). Porfyrinenes fluorescensintensitet øket med tiden etter påføringen.

OPPSUMMERING

Et stort antall pasienter med basalcellekarsinomer (BCCer) er blitt behandlet topisk med ALA-basert PDT i vårt sykehus i løpet av de siste fem år, og mer enn 90% av overflate-BCCer har vist fullstendig regresjon. Imidlertid hadde knuteformige BCCer lav fullstendig responsverdi på grunn av dårlig ALA-retensjon og følgelig en lav ALA-indusert porfyrindannelse i de dype lag av skadene. For forbedring av teknikken anvendte vi ALA-esterderivater i stedet for fri ALA. De foreliggende oppnådde data som er vist i dette eksempel og i eksempel 9 ved hjelp av både fluorescensspektroskopiske målinger in situ og fluorescens-spektroskopiske målinger av vevsbiopsier, viser at alle de tre undersøkte ester-derivater ble tatt opp, deforestret og til slutt omdannet til porfyriner i epidermis, epiteliahårfolliklene og talgkjerlene hos de hårløse mus med høyere porfyrindannelse enn med fri ALA. Dette er i overensstemmelse med de foregående eksempler som angår en undersøkelse av humane knuteformede basalcelle-karsinomer som viser at fluorescensen av de ALA-esterinduserte porfyriner ble hurtigere opphopet med høyere intensitet og en mer homogen fordeling enn for porfyriner indusert av fri ALA i skadene.

Den foreliggende undersøkelse viser også at DF har en betydningsfull virkning til forøking av dannelsen av ALA-metylester-avledet PplX i normal hud hos musene etter topisk påføring.

Det er interessant at det ble funnet en sterk fluorescens av porfyriner indusert av fri ALA i områdene av huden utenfor området hvor kremen var påført topisk (fig. 2). Dette viser at fri ALA transporteres i blodet etter topisk påføring, og porfyriner dannes deretter i alle organer som inneholder enzymene i heme-synteseveien, eller porfyriner dannes i begynnelsen i huden og/eller leveren og transporteres deretter til andre vev via blodsirkulasjonen. Dette kan føre til fotofølsomhet hos huden på områder hvor fri ALA til og med ikke påføres topisk. Imidlertid induserte ingen av de undersøkte esterderivater porfyrinfluorescens i andre deler av huden.

Eksempel 14

Virknin<g>er av ALA- metylester eller ALA-, DF- og DMSO- PDT på tumorveksten i WiPr-humankolonikarsinom- transplanterte hårløse mus

Hårløse mus ble transplantert med WiDr-humankoloni-karsinomceller ved subkutan injisering i det høyre sideområde. Følgende kremer, utformet som beskrevet i de foregående eksempler, ble påført topisk på tumorstedet: 10% DF alene; 20% ALA + 10% DF + 20% DMSO; eller 20% ALA-metylester + 10% DF + 20% DMSO, fulgt av laserlysbestråling 14 timer senere (632 nm, 150 mW/cm i

15 minutter). En separat gruppe dyr som bar samme tumormønster, men som ikke mottok noen topisk påføring av kremen, tjente som kontroll. Responsene hos de behandlede tumorer ble vurdert som tumor-regresjon pr. gjenveksttid. Når tumorene nådde et volum som var 5 ganger volumet på lysbestrålingsdagen, ble musene avlivet. Resultatene er vist på fig. 22. (Staver: middel-standardfeil (SEM) basert på 3-5 individuelle dyr i hver gruppe). Resultatene viser at det tok 34 dager for tumorer behandlet med ALA-metylester + DF + DMSO å nå et volum som var fem ganger volumet på dagen like før lysbestråling, mens det når det gjaldt fri

ALA + DF + DMSO tok 24 dager for de behandlede tumorer å vokse til 5 gangers størrelse. Således er ALA-metylester mer effektivt enn ALA til nedsettelse av gjenvekst av tumorer.

Eksempel 15

Selektivitet av ALA- estere ( metyl, heksvl. heptvl oe oktvl) overfor ikke- normalt vev

PplX-fluorescensforholdene mellom BCC-skader og omgivende normal hud etter topisk påføring av ALA eller dens estere (20% i 4 timer) ble undersøkt under anvendelse av metoder beskrevet i tidligere eksempler. Resultatene er vist på

fig. 23 og viser at alle estere mer selektivt kan indusere PplX i BCC-skader enn fri ALA, spesielt når det gjelder ALA-metylester og ALA-heksylester.

Claims (11)

1. Forbindelser, karakterisert ved at de har formelen I, Rz^-CHjCOCHj-CHzCO-OR<1> (I) (hvor R<1> kan representere Cmo alkyl eventuelt substituert med hydroksy-, alkoksy-, acyloksy-, alkoksykarbonyloksy-, amino-, aryl-, okso- eller fluorgrupper, og eventuelt avbrutt av oksygen-, nitrogen-, svovel- eller fosforatomer; og R representerer et hydrogenatom og salter av disse for anvendelse ved fotokjemoterapi eller diagnostisering.

2. Forbindelser ifølge krav 1,karakterisert ved at arylgruppen er fenyl eller en monocyklisk 5-7 leddet heteroaromatisk forbindelse.

3. Forbindelser ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at R<1> representerer en usubstituert alkylgruppe.

4. Forbindelser ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved a t forbindelsene er ALA-metylester, ALA-etylester, ALA-propylester, ALA-heksylester, ALA-heptylester eller ALA-oktylester eller salter av disse.

5. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved a t den omfatter en forbindelse som definert i hvilket som helst av kravene 1-4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, sammen med minst én farmasøytisk bærer eller eksipiens.

6. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, eller et farmasøytisk salt derav, for fremstilling av et terapeutisk middel for anvendelse ved fotokjemoterapi, eller et diagnostisk middel for anvendelse til diagnostisering, hvor fotokjemoterapi eller diagnose blir utført på forstyrrelser eller abnormaliteter på ytre eller indre overflater av kroppen som responderer overfor fotokjemoterapi.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor fotokjemoterapien eller diagnose blir utført på maligne, pre-maligne eller ikke-maligne abnormaliteter eller forstyrrelser som responderer overfor fotokjemoterapi, hudforstyrrelser, hudabrasjoner eller infeksjoner.

8. Produkt, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, sammen med minst ett overflategjennomtrengnings-understøttende middel, og eventuelt ett eller flere chelateringsmidler som et kombinert preparat for samtidig, separat eller sekvensiell anvendelse til behandling eller diagnostisering av forstyrrelser eller abnormaliteter hos ytre eller indre overflater av kroppen som er mottakelige for fotokjemoterapi.

9. Produkt ifølge krav 8, karakterisert ved at det overflateinntrengnings-understøttende middel er DMSO.

10. Fremgangsmåte for in vitro-diagnostisering av abnormaliteter eller forstyrrelser ved undersøkelse av en prøve av kroppsfluid eller vev fra en pasient, karakterisert ved at den minst omfatter trinnene i) blanding av kroppsfluidet eller vevet med en forbindelse som angitt i hvilket som helst av kravene 1-4, ii) eksponering av blandingen for lys, iii) observering av fluorescensnivået, og iv) sammenlikning av nivået for fluorescens med kontrollnivåene.

11. Utstyrssett for anvendelse til diagnostisering eller fotokjemoterapi av forstyrrelser eller abnormaliteter hos ytre eller indre overflater på kroppen, karakterisert ved at det omfatter: a) en første beholder som inneholder en forbindelse som angitt i hvilket som helst av kravene 1-4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt av denne, b) en andre beholder som inneholder minst ett overflategjennomtrengnings-understøttende middel; og eventuelt c) ett eller flere chelateringsmidler som enten finnes i den første beholder eller i en tredje beholder.