NO317153B1 - Anvendelse av flavanolignaner for fremstilling av medikamenter med antiproliferativ aktivitet i uterus, ovarium og bryst - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av flavanolignaner, valgt fra silymarin, silybin, silidianin, silikristin, dehydroksysilybin, blandinger derav eller ekstrakter inneholdende slike for fremstilling av medikamenter med antagonistisk aktivitet på østrogenreseptorene av type II, spesielt er slike medikamenter egnet for behandling og profylakse av uterus-, ovarium- og brysttumorer.

Nylig har noen flavanoider blitt funnet å ha antitumoral aktivitet (Verna, Cancer Research 48, 5754, 1988) og kjemoprofylaktisk aktivitet i noen tumorer (Cassady, J. Nat. Prod. 53, 23, 1990). Spesielt har quercetin, et flavanoid som er nesten allestedsnærværende i planter, vist noe inhiberende aktivitet på proliferasjon av humane leukemiceller (Larocca, Br. J. of Haematology 75, 489, 1990) og på andre cellelinjer (Scambia, Br. J. Cancer 62, 942, 1990 - Int. J. Cancer 46, 1112, 1990 - Cancer Chemother. Pharmacol. 28, 255, 1991 - Gynecologic Oncology 45, 13, 1992)i tillegg til å ha en synergistisk aktivitet med de vanlige kjemoterapeutiske midler. Selv om mekanismen for en slik inhiberende virkning på proliferasjon er ukjent, synes den å være tilknyttet interaksjonen av dette flavanoid med østrogenreseptorer av type II (Markaverisch, J. steroid Biochem. 30, 71, 1988). Disse reseptorene, først beskrevet av Clark (J. Biol. Chem. 253, 7630, 1978) i rotteuterus, er annerledes enn de virkelige østrogenreseptorer (ER) siden disse foreligger i en høyere konsentrasjon og har en dissosiasjonsaffinitetskonstant (KD: 10-20 nM) for østradiol lavere enn for østrogenreseptorene (KD: 0,2-1 nM) .

Det er nå overraskende funnet at flavanolignaner, hvorav silymarin allerede er bredt anvendt i terapi ved behandling av hepatopathia av ulik opprinnelse, hvis tre viktigste komponenter er kjent under navnene silybin, silidianin, silikristin og dehydrosilybin og med strukturene gitt under:

har en høy affinitet for østrogenreseptorene av type II og en svært markert antiproliferativ aktivitet på uterus-, ovarium- og brysttumorale cellelinjer som er resistente for cisplatin og adriamycin. For å verifisere den antiproliferative effekt på flavanolignaner, er vekstkurvene for ulike stabiliserte cellelinjer avledet fra en rekke humane tumorer blitt undersøkt i nærvær av forbindelsene, og deres evne til å samvirke med Type II EBS i ovariale carcinoma-prøver har blitt undersøkt.

Bestemmelse av binding til østrogenreseptorer har blitt utført på celler fra ovarial tumor eller tumorer fra andre organer, kultivert i monolag ved anvendelse av Dulbecco Modified Medium tilsatt kalveserum og 200 enheter/ml penicillin som medium. Cellene som ble anvendt i forsøkene ble trypsinert hver uke og plassert på en plate med en tetthet på 8 x lo"<4>/ml og inkubert ved 37°C under luftatmos-fære inneholdende 5 % C02 og fuktighet. For kontroll av den antiproliferative aktivitet av produktene, ble cellene plassert på brønner (Flakong 3046, Besten Diskingen NY) med en konsentrasjon på 4 x i0"<4>/ml. Etter 24 t substitueres mediet med et friskt medium, og flavanolignanene oppløst i absolutt etanol settes til. Kontrollene behandles ved de samme eksperimentelle betingelsene kun med vehikkelen i fravær av den aktive ingrediens. Behandlingen beskrevet over gjentas med 24 timers intervaller i løpet av de 72 timene testtid. Inhibering av celleproliferasjon undersøkes ved direkte telling av cellene, sammenligning av veksten av kontrollene versus vekst av de behandlede prøvene.

For dosering av reseptorene inkuberes cellene etter 24 timer med skalare mengder merket østradiol (<3>H-E2 40 Ci/mmol, Amersham UK) alene eller i nærvær av en hundre ganger større mengde dietylstilbestrol ved 4°C i 2,5 t.

Mot slutten av inkubasjonstiden vaskes cellene raskt med ferskt substrat og inkuberes i 30 min med 1 M NaOH. Radio-aktivitet måles ved hjelp av en scintillasjonsteller, og bindingsspesifisitet kalkuleres fra forskjeller mellom preparat inneholdende eller ikke inneholdende dietylstilbestrol. Resultatene gis som antall bindingsseter per celle, i henhold til konvensjonelle metoder fra litteraturen (Raneletti, 1988) .

Inhiberingen av celleproliferasjon evalueres ved direkte telling av cellene, sammenligning av veksten av kontrollene med de behandlede.

Resultatene på ulike cellelinjer er gitt i Fig. 1 og i Tabell I og V. Spesielt viser Fig. 1 den antiproliferative aktivitet av silybin på A2780 WT, en ovarial carcinoma-cellelinje ER negative, type II positiv.

Resultatene er gjennomsnittet av to eksperimenter utført i triplikat. Standardavvikene er mindre enn 10 %.

Den antiproliferative aktivitet er dose-avhengig. Tabell I rapporterer data vedrørende silybin anvendt i konsentra-sjoner fra 0,01 - 20 uM i celleproliferasjon; silybin utviser en dose-avhengig antiproliferativ effekt på de ulike cellelinjene innbefattende de som er resistente overfor kjemoterapeutiske midler (MCF-7 ADRr, A2780 CIS) med IC50 i omrdået 4,8-24 uM.

For ytterligere å kunne studere den antiproliferative effekt i silybin, ble effekten av denne substansen på A2780 WT cellesyklus studert. Som gitt i Tabell II viser cyto-fluorometriske analyser at silybin forårsaker en reduksjon i prosent av fase S-celler og en mild økning av disse i fase G0/G1.

A2780 WT-celler ble kultivert i 2 dager med eller uten 10 uM silybin.

<*> Resultater er gitt som celleprosenten i hver fase av cellesyklusen. ;På grunnlag av disse resultatene ble silybin undersøkt for enhver forbedring på effekten av noen kjemoterapeutiske midler, spesielt cisplatin (CIS) og adriamycin (ADR). Som gitt i Tabell III observeres en synergistisk inhiberings-effekt på veksten når silybin anvendes i kombinasjon med CIS, sammenlignet med korresponderende doser av medikamentene anvendt alene. ;Lignende resultater erholdes ved anvendelse av silybin i kombinasjon med ADR. ;For å kunne verifisere om en slik effekt av en kombinasjon av silybin med adriamycin eller cisplatin skyldes en synergistisk eller additiv virkning, har dataene blitt analysert med den isobolske metode ifølge Berenbau (Adv. Cancer Res., 25, 269, 1981). Den resulterende kombina-sjonsindeks var mindre enn 1 ved både parenterale (A2780 WT, Tab. III) og resistente cellelinjer, hvilket således beviser at kombinasjonen av de to medikamentene utviser en synergistisk antiproliferativ aktivitet. ;Den antiproliferative aktivitet av silybin og dets analoger observeres ikke bare på stabiliserte cellelinjer, men også på primære kulturer av humane tumorer. En rekke av de undersøkte flavanolignaner har en lignende oppførsel. I tabell V er data vedrørende silybin, silidianin, silymarin og dehydrosilybin oppgitt. De diastereomere former av silybin og isosilybin er også aktive i disse forsøkene. ;Ytterligere ble flavanolignanene ovenfor vist å inhibere in vivo-celleproliferasjon ved å måle størrelsen av tumorene implantert i den nakne atymiske mus ifølge de konvensjonelle betingelser beskrevet i litteraturen. Behandling av dyrene i doser i området 1-100 mg/kg viste en markert regresjon av de studerte tumorer inntil deres forsvinning i en høy prosent av individene. I mennesker viste produktene seg å ha en aktivitet i ovarium, bryst- og uterustumorer, hvilken aktivitet var høyere enn for kjente medikamenter så som Tamoxifen. ;Silidanin, dehydrosilybin og de to diastereomere former av silybin viste en spesielt markert aktivitet. I in vitro-forsøkene ble flavanolignanene anvendt som sådan, mens det i in vivo-forsøkene ble anvendt komplekser derav med fosfolipider, beskrevet i EP-A- 0209038. ;De aktuelle flavanolignanene kan administreres oralt eller ved infusjon: for den orale rute har naturlige eller synte-tiske fosfolipider vist seg å være spesielt anvendelige som bærere siden de danner de ovenfornevnte lipoløselige sta-bile komplekser med forbindelsene; samt flytende semisyntetiske glyserider inneholdende mediumkjedete fettsyretrigly-serider eller analoger som kan fremme biotilgjengeligheten av de enkelte forbindelsene, av de naturlige blandinger derav eller av ekstraktene inneholdende slike. ;Plavanolignandoseringen kan variere i området 50-1500 mg/dag, hovedsakelig administrert ved den orale rute. ;De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere. ;Eksempel 1 ;Harde gelatinkapsler inneholdende komplekset av silybin med soyafosfat idylkolin. ;Eksempel 2 ;Myke gelatinkapsler inneholdende dehydrosilybin. ;Eksempel 3 ;Harde gelatinkapsler inneholdende komplekset av silymarin med naturlige fosfolipider fra soya. ;Sammensetning: ;;Eksempel 4 ;Harde gelatinkapsler inneholdende komplekset av silidianin med soyafosfatidylkolin. ;Sammensetning: ;*

Claims (7)

1. Anvendelsen av flavanolignaner valgt fra silymarin, silybin, silidianin, silikristin, dehydrosilybin, blandinger derav eller ekstrakter inneholdende slike for fremstilling av medikamenter med antagonistisk aktivitet på østrogenreseptorene av type II.

2. Anvendelsen av flavanolignaner valgt fra silymarin, silybin, silidianin, silikristin, dehydrosilybin, blandinger derav eller ekstrakter inneholdende slike for fremstilling av medikamenter med antiproliferativ aktivitet .

3. Anvendelse av komplekser av flavanolignaner valgt fra silymarin, silybin, silidianin, silikristin, dehydrosilybin, blandinger derav eller ekstrakter inneholdende slike, med fosfolipider for fremstillingen av medikamenter med antagonistisk aktivitet på østrogenreseptorene av type II.

4. Anvendelse av komplekser av flavanolignaner valgt fra silymarin, silybin, silidianin, silikristin, dehydrosilybin, blandinger derav eller ekstrakter inneholdende slike, med fosfolipider for fremstillingen av medikamenter med antiproliferativ aktivitet.

5. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2 hvor forbindelsen foreligger i form av komplekser med fosfolipider og alter-nativt i kombinasjon med kjemoimmunterapeutiske midler, foretrukket cisplatin eller adriamycin, for den samtidige, sekvensielle eller separate anvendelse.

6. Anvendelse ifølge krav 3 eller 4 egnet for den orale administrasjon.

7. Anvendelse ifølge krav 6 hvor flytende semisyntetiske mediumkjedete fettsyreglyserider er tilstede som bærere.