PT1328277E - Compostos bisfosfónicos para o fortalecimento do osso cortical. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSTOS BISFOSFÓNICOS PARA O FORTALECIMENTO DO OSSO CORTICAL"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito à preparação de composições farmacêuticas para o fortalecimento do osso cortical. Essas composições farmacêuticas podem utilizar-se como tal ou em associação com outros tratamentos activos do osso incluindo bifosfonatos e agentes modificadores específicos de receptores de estrogénios (SERMs).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os bifosfonatos utiiizam-se como agentes terapêuticos para o tratamento da destruição patológica do osso de origem diversa, como a doença óssea osteolitica devida a malignidade, a doença de Paget, e a osteoporose. São análogos dos pirofosfatos inorgânicos fisiológicos. A estrutura básica P-C-P dos bifosfonatos torna possível desenhar um grande número de diferentes compostos mediante alteração das cadeias laterais do átomo de carbono. Um método diferente consiste em formar diversos derivados dos grupos fosfato.

Em geral, os bifosfonatos inibem a actividade dos osteoclastos, isto é das células que são responsáveis pela reabsorção óssea. Os bifosfonatos conhecidos ligam-se à matriz óssea, penetram nos osteoclastos de reabsorção e reduzem a actividade dos osteoclastos maduros. Inibem a reabsorção óssea quer in vitro quer in vivo. Absorção limitada pelo trato gastrintestinal, incorporação rápida no 2 tecido ósseo, e excreção inalterada na urina constituem todas as características dos bifosfonatos conhecidos.

Nas Patentes de invenção norte-americana N° 4 447 256, alemã 28 31 578 e japonesas 55089210, 55098105, 55043054, 55043055 descrevem-se processos para a preparação de alguns ésteres tetralquilicos do ácido bisfosfónico. Sugere-se a utilização dos compostos descritos como herbicidas.

Por outro lado a Patente de invenção norte-americana N° 5 866 556 descreve ésteres tetralquilicos do ácido piridi-nilaminometileno bisfosfónico com uma elevada biodisponibili-dade oral e praticamente sem afinidade para o osso. De acordo com essa patente, afirma-se que os compostos descritos possuem menos efeitos secundários sem perda da sua actividade anti-absorçâo. Também as patentes de invenção europeias 563107 e 563096 descrevem um ácido bisfosfónico substituído no grupo metilénico sob a forma parcial de um éster para o tratamento de diversas doenças ósseas, tal como para a prevenção da reabsorção óssea e da osteoporose. Ά Patente de invenção internacional WO 9 607 418 descreve associações da hormona paratiróide (PTH), incluindo associações PTH bifosfonato que podem aumentar a massa óssea.

Presentemente descobriu-se que um grupo de ésteres de ácidos metileno-bisfosfónicos desempenha um efeito inibidor ou supressor da formação de osteoclastos, isto é influencia a formação dos osteoclastos na fase inicial do seu processo de génese mas não apresenta um efeito directo sobre o osso.

Tem-se observado que é possível suprimir a actividade osteoclástica em uma fase precoce do processo de formação dos osteoclastos, em vez de exercer um efeito sobre o osteoclasto 3 maduro. Isso é claramente evidenciado como um efeito de fortalecimento especifico do osso cortical. Observa-se também um efeito na densidade do osso trabecular, mas no que diz respeito especialmente ao fortalecimento do osso, o fortalecimento do osso cortical mais denso é rnais importante do que o fortalecimento do osso trabecular. A presente invenção é especialmente útil na preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de combate à fragilização do osso cortical em um doente tratado com corticosteróides, quimioterapias de cancros ou outras terapias que reduzem a dureza do osso, em um doente com metástases de cancros no osso, e em um doente cuja dureza óssea está diminuída por factores locais ou sistémicos (citocinas, etc.} segregados pelas células cancerosas, além do tratamento do osso trabecular, na mulher pós-menopáusica, na criança e no homem de idade avançada. A descoberta feita no decurso da presente invenção pode aplicar-se no tratamento do fortalecimento ou do combate ao enfraquecimento do osso cortical.

Tem-se verificado também que o agente activo utilizado não se liga ao osso, em consequência do que não é retido pelo organismo, facto que é importante do ponto de vista dos efeitos secundários. Mais, os compostos utilizados não inibem a remodelação do osso, isto é a regeneração normal do osso em que parte do mesmo é reabsorvida e se forma novo osso. Isto é especialmente importante no tratamento da criança e da mulher fértil.

Os bisfosfonatos conhecidos ligam-se ao osso e aí ficam retidos até durante longos períodos. Os mesmos inibem também todas as reabsorções ósseas, incluindo a remodulação normal 4 do osso. Consequentemente, não se podem utilizar por exemplo no tratamento da criança e da mulher fértil. A presente invenção é dirigida para a utilização de compostos de fórmula geral I' O'

na qual o símbolo Z representa um grupo hidroxi ou hidroxi protegido que é um grupo alcoxi inferior com 1 a 4 átomos de carbono, um grupo ariloxi como um grupo benziloxi, ou um grupo aciloxi, como um grupo alquil(inferior)-aciloxi, por exemplo um grupo acetoxi, um grupo pivaloiloxi-, aril- ou alquilsililoxi, e os grupos Ri a R4 são iguais ou diferentes, e representam um grupo alquilo com 1 a 5 átomos de carbono, pelo que um dos grupos Ri a R4 pode representar também um átomo de hidrogénio, na preparação de uma composição farmacêutica para o fortalecimento do osso cortical ou para combater o enfraquecimento do osso cortical.

Na fórmula mencionada antes, o símbolo Z representa de preferência um grupo hidroxi, e os grupos Ri a R4 são iguais, e representam de preferência grupos etílo. Esse composto é especialmente o éster tetra-etílico do ácido [ [(3-hídroxi-2--piridinil)amínojmetílideno]bisfosfónico.

Os compostos citados bem como a preparação dos mesmos é como tal conhecida, ver por exemplo as Patentes de invenção norte-americana N° 5 866 556, europeias EPS63 107 e 563 096. 5

As composições farmacêuticas preparadas de acordo com a presente invenção podem administrar-se, por exemplo, por via oral, parentérica, tópica ou rectal por meio de uma qualquer formulação farmacêutica útil para a citada administração, e contendo o componente activo em uma quantidade eficaz e aceitável sob o ponto de vista terapêutico em associação com veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, adjuvantes ou veículos conhecidos na arte. A produção dessas formulações farmacêuticas é bem conhecida na arte.

Assim a composição farmacêutica pode apresentar-se em uma forma de dosagem apropriada para utilização oral, como comprimidos, cápsulas, formas de dosagem líquidas, como soluções, suspensões, emulsões, xaropes, geles. Todas essas fórmulas são produzidas utilizando per se técnicas de formulação conhecidas bem como veículos, adjuvantes e aditivos conhecidos. Excipientes apropriados para formas de administração oral são diluentes, os que se utilizam por exemplo em comprimidos incluindo açúcares, como a lactose, o manitol, a sacarose, preparações de celulose, como o amido, gelatinas, metilcelulose, hidroxipropilcelulose, celulose microcristalina, ou celulose microcristalina silicifiçada.

Os compostos de fórmula geral 1' podem também administrar-se por via parentérica, por exemplo como perfusões ou injectáveis, utilizando suspensões, emulsões, ou dispersões aquosas ou oleosas que contêm o agente activo em associação com excipientes convencionais aceitáveis, como tampões, agentes suspensores e/ou de dispersão, conservantes. Consideram-se também formulações para utilização tópica ou transdérmica sob a forma de cremes, pomadas, geleias, soluções, suspensões, ou sob a forma de sistemas de administração transdérmica, fórmulas que os entendidos na 6 matéria conhecem na sua totalidade. Para administração rectal, os compostos associam-se com uma substância apropriada para esse tipo de administração como ceras ou gorduras ou outras bases de supositórios conhecidas. Também é possível administrar os compostos sob a forma de fórmulas de libertação controlada, das quais os entendidos na arte conhecem diversas formas. Um outro modo de administração consiste na forma de implantes, como implantes subcutâneos, ou como implantes prostéticos, tal como o tratamento da prótese com o composto a administrar, ou sob a forma de címentos ósseos. A dose terapêutica a administrar a um doente com necessidade de tratamento variará de acordo com o peso corporal e a idade do doente, do caso particular que se pretende tratar, bem como do modo de administração e será facilmente determinada por um perito na arte. Uma quantidade apropriada pode assim variar dentro de amplos limites, e qualquer médico experiente a pode determinar facilmente. Para a maioria dos problemas uma dose oral de aproximadamente 0,01 a 15 mg/Kg de peso corporal/dia será apropriada, por exemplo quando administrada 1 a 4 vezes por dia. Essa dose representa uma dose diária de aproximadamente 1 a 1200 mg para um indivíduo pesando 80 Kg. ENSAIO DA ACTIVIDADE SOBRE CULTURAS DE CÉLULAS (EXEMPLOS DE REFERÊNCIA) A actividade inibidora de um composto representativo a utilizar de acordo com a presente invenção, designadamente o éster tetra-etílico do ácido [[(3-hidroxi-2-pirídinil)amino] -metilideno]bisfosfóníco (composto em ensaio, TC) testou-se em diferentes culturas de células de ratos e murganhos, de modo 7 a avaliar a sua actividade como inibidor da formação de osteoclastos.

Culturas utilizadas A. Cultura de medula óssea de murganho

Esse sistema de cultura é o método mais utilizado para estudar a diferenciação osteoclástica (Takahashi et al. 1988a). Células de medula óssea de murganho podem induzir-se para formar osteoclastos activos em 6 a 8 dias na presença de um factor osteotrópico, como l,25(OH)2D3, hormona paratirói-de, interleucina-1 ou prostaglandina E2 (Takahashi et al. 1988b, Shinar et al. 1990, Collins e Chambers 1992, Jimie et al. 1999). Caracteristicamente, cultivam-se 106 células/ml de meio durante 6 dias. Seguidamente, fixam-se as células com aldeído fórmico polimerizado a 3% em PBS e coram-se com um marcador osteoclástico, como a fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP). Pode utilizar-se o kit imuno-histoquímico fornecido por Sigma. As células com múltiplos núcleos positivas à TRAP, que contêm pelo menos 3 núcleos, contam-se como osteoclastos (Hentunen et al. 1998). B. Cultura de células de baço de murganho

Tem-se demonstrado que o baço contém uma população precoce de percursores osteoclásticos que se pode induzir de modo a diferenciar-se em osteoclastos na presença de células estromais, que apresentam a capacidade de estimular a formação de osteoclastos (Udagawa et al. 1989). Sem essas células estromais de estimulação, as células esplénicas não se diferenciam em osteoclastos. C. Cultura de osteoblastos de murganho

As células estromais da medula óssea conhecem-se há muito tempo como uma fonte de células osteoprogenitoras (Owen e Frienstein 1988). Comummente as células estromais de medula óssea de murganho induzem-se para formar pré-osteoblastos cultivando-as durante 6 dias na presença de um glucocorticóide, o ácido ascórbico e o β-glicerofosfato de sódio. Esses pré-osteoblastos podem ainda induzir-se para formar osteoblastos activos conservando as culturas durante duas ou mais semanas na presença de um estrogénio (17p-estra-diol). Durante esse período de cultura as células começam a expressar níveis crescentes de marcadores osteoblásticos, como fosfatase alcalina, colagénio do tipo I e osteocalcina, e finalmente são capazes de formar osso. A formação de osso detecta-se por formação de nódulos ósseos e deposição de cálcio nas culturas (Qu et al. 1998) . D. Co-cultura de células de baço/osteoblastos de murganho

Tem-se demonstrado que o baço contém uma população de precursores precoces de osteoblastos que se pode induzir de modo a diferenciar-se em osteoclastos na presença de células estromais, que apresentam a capacidade de estimular a formação de osteoclastos (Udagawa et al. 1989). Sem essas células estromais de estimulação, as células esplénicas não se diferenciam em osteoclastos. Desenvolveu-se um sistema de co-cultura, que contem células de baço de murganho e células osteoprogenitoras primárias de murganho. Prepararam-se células osteoprogenitoras provenientes de medula de murganho como descrito na secção C. 9 E. Cultura de osteoclastos de rato

Os osteoclastos podem isolar-se a partir de ossos longos de algumas espécies e cultivam-se sobre cortes de osso ou de dentina para estudar a sua actívidade de reabsorção (Boyde et al. 1984, Chambers et al. 1984). A maioria das vezes, utilizam-se osteoblastos quer de rato quer de coelho. Isolam--se a partir de animais recém-nascidos e cultivam-se durante 1 a 2 dias. A actívidade de reabsorção determina-se ou por contagem do número de fendas ("pits") de reabsorção sobre os cortes de osso/dentina ou determina-se a área de reabsorção total utilizando um microscópio de contraste de fase e um sistema de análise de imagens. Habitualmente utilizamos osteoclastos isolados de rato e cultivamo-los sobre cortes de osso bovino durante dois dias, após o que se fixam as células. Coram-se as células com azul de toluidina e contam--se com o auxílio do microscópio (Arnett e Dempster 1987, Lakkakorpi et al 1989). Seguidamente removem-se as células movendo-as rapidamente e coram-se as fendas de reabsorção ("pits") com lectina de geme de trigo ("lectin WGA"), que se liga à lacuna de reabsorção no corte ósseo. Quantificam-se o número e a área de fendas {"pits") (Selander et al. 1994).

Nesses testes a variação da concentração do composto em ensaio foi IO'10 a 1CT5 M.

Resultados dos estudos das culturas A. Cultura de medula óssea de murganho

Em uma cultura de medula óssea, o composto em ensaio inibiu, de um modo dependente da dose, a formação de osteoclastos induzida por 1,25 (OH) 2D3- e PTH. A inibição de 10 60% da formação de osteoclastos obteve-se na concentração de 10"6 M. Observou-se a capacidade do composto em ensaio inibir totalmente na concentração de 10"5 M a formação de MNC positivas à TRAP sem apresentar efeito tóxico sobre outras células (Fig. 1 & Fig. 2}. B. Cultura de células de baço de murganho

Em uma cultura de células de baço, o composto em ensaio inibiu também de um modo dependente da dose a formação de osteoclastos. Na concentração de IO"6 M obteve-se uma inibição de 60% como no sistema de cultura de medula. Na concentração de 10"5 M bloqueou totalmente a formação de células mononucleares (MNC) positivas à TRAP (Fig.3). Quando o composto esteve presente apenas nos dias 1 a 3, a inibição da formação de osteoclastos foi superior a 60%, enquanto o mesmo composto esteve presente nos dias 4 a 6, a inibição foi aproximadamente 40% (Fig. 3) . Isso sugere que o referido composto influencia as fases precoces da maturação osteoclástica. Porque na cultura não estavam presentes células osteoblásticas ou estromais, parece que o composto influencia directamente os precursores osteoclásticos. O mecanismo de acção, contudo, permanece ainda por esclarecer. No entanto, na concentração de ΙΟ"5 Μ o mesmo composto bloqueou totalmente a formação de células semelhantes aos osteoclastos não se encontrando presentes na cultura células mononucleares ou MNC positivas à TRAP (dados não apresentados). Isso sugere que o composto inibiu a diferenciação de células precursoras osteoclásticas antes de ter iniciado a expressão da TRAP. 11 C. Co-cultura de células de baço/osteoblastos de murganho

Quando se cultivaram esses dois tipos de células na presença de l,25(OH)2D3, formaram-se alguns osteoclastos. Células de baço apenas com l,25(OH)2D3 não foram capazes de se diferenciarem em osteoclastos. Células de murganho osteoprogenitoras, que foram capazes de estimular a formação de osteoclastos, incubaram-se primeiro com 10~5 M do referido composto de ensaio durante 24 horas e utilizaram-se depois na co-cultura com células de baço de murganho. Observou-se que os pré-osteoblastos assim tratados estimularam a formação de osteoclastos de um modo similar ao utilizado pelos pré-osteoblastos não tratados (dados não apresentados). Essa observação sustenta a ideia de que o composto em ensaio apresenta um efeito inibitório directo sobre os precursores dos osteoclastos. D. Cultura de osteoclastos de ratos 0 composto não apresentou qualquer efeito sobre a reabsorção óssea mediada por osteoclastos (dados não apresentados). 0 mesmo composto não apresentou qualquer efeito sobre a apoptose de osteoclastos, quando se cultivaram os mesmos durante 1 a 2 dias sobre cortes de osso bovino (Fig. 4) .

TESTES EM RATOS OVARIECTOMIZADOS A actividade do éster tetra-etílico do ácido [[(3-hídro-xi-2-piridil}amino]metilideno]bisfosfóníco tem sido avaliada em ratos ovariectomizados. Nos referidos ensaios, administrou-se o composto a ensaiar a ratos corri: seis meses de idade. Os ratos controlo submeteram-se a uma cirurgia ou a 12 uma ovariectomizaçâo simulada ("sham-operated") e trataram-se com o veículo. 0 composto administrou-se aos ratos ovariectomizados por via oral de 7 dias a uma semana durante 12 semanas com início imediatamente após a cirurgia. As doses foram 10, 50 e 100 mg/Kg/dia. No final do estudo, avaliou-se a densidade mineral e a geometria do osso com uma TCQp (tomografia computadorizada quantitativa periférica) . Avaliou-se a dureza do osso com uma aparelho de testes de materiais electromecânicos. Os locais de avaliação foram a extremidade proximal da tíbia (ausência de dureza), a vértebra lombar, o colo femural, a diáfise média da tíbia. Os parâmetros a avaliar foram a densidade óssea do osso trabecular ou cortical, a área cortical e a dureza do osso.

Na Fig. 5 apresentam-se as imagens da TCQp. Na linha superior, da esquerda para a direita, apresentam-se as densidades minerais ósseas de uma secção transversal da tíbia proximal de um rato normal [(submetido a uma cirurgia simulada) "sham-operated"j, de um rato ovariectomizado, e de um rato ovriectomizado tratado com o composto a ensaiar. A partir dos resultados é evidente que a densidade óssea em um rato ovariectomizado está significativamente reduzida quando comparada com a de um rato normal, e também que o composto ensaiado inibiu eficazmente essa alteração. A linha inferior mostra os correspondentes resultados de avaliação relativos ao osso cortical de um rato normal, um rato ovariectomizado, e um rato ovariectomizado tratado com o composto a ensaiar (considerados da esquerda para a direita) . Como se pode observar, a ovariectomia reduz manifestamente a espessura do osso cortical quando comparada com uma situação normal, alteração que o composto a ensaiar pode inibir. 13 A Fig. 6 mostra que a ovaríectomia reduz a densidade do osso trabecular e a área e a dureza do osso cortical na vértebra lombar. As duas doses ma i s elevadas do composto ensaiado, isto é 50 e 100 mg/Kg/dia, inibem essas alterações. A Fig. 7 por sua vez mostra que 50 mg/Kg/dia do composto ensaiado inibem a alteração na área cortical do colo femural originada pela ovaríectomia; a dose de 100 mg/Kg/dia do composto ensaiado inibe a alteração da densidade trabecular.

Na diáfise média da tíbia, a ovaríectomia não induziu alterações substanciais, contudo, uma dose de 50 mg/Kg/dia originou um aumento na área cortical quando se comparou um rato normal e um rato ovariectomizado. A dureza também melhorou, apesar de não ter atingido um grau significativamente expressivo (Fig. 8).

Os resultados anteriores mostram que se obtém um efeito benéfico sobre o osso cortical de acordo com a presente invenção, e que os compostos influenciam o processo da formação osteoclástíca em vez dos osteoclastos maduros. TESTES EM UM MODELO DE METÁSTASE NO MURGANHO (EXEMPLOS DE REFERÊNCIA) 0 efeito do composto em ensaio tem sido avaliado em um modelo de metástase no murganho. Catorze dias após a inoculação com células humanas de cancro da mama, quando se detectaram radiologicamente lesões ósseas osteolíticas, trataram-se os animais ou com PBS (controlo) ou com o composto em ensaio (50 mg/Kg/dia, via subcutânea) durante 10 dias. No fim do estudo, avaliaram-se histomorfometricamente o número de osteoclastos e a área óssea. Quando comparado com o 14 controlo, o composto em ensaio reduziu significativamente o número de osteoclastos no interface tumor-osso (Fig. 9} . 0 tratamento com o composto em ensaio inibiu também a redução induzida pelo tumor da área óssea na região das metástases (Fig. 10) . EXEMPLO 1

Utilizando os seguintes componentes pode preparar-se uma composição farmacêutica para administração oral sob a forma de um comprimido (por comprimido) Éster tetra-etílico do ácido [[(3-hidroxi-2-piridi- 40,0 mg nil)-amíno]metileno]bisfosfónico

Celulose microcristalina 20,0 mg

Lactose 67,0 mg

Amido 10,0 mg

Talco 4,0 mg

Estearato de magnésio 1,0 mg

Misturam-se os componentes em um comprimido utilizando métodos convencionais de preparar essa forma de apresentação. Eventualmente, pode revestir-se o comprimido com uma camada entérica para controlar o momento de libertação do componente activo. EXEMPLO 2

Utilizando os seguintes componentes pode preparar-se uma composição farmacêutica sob a forma de cápsula (por cápsula) Éster tetra-etiiico do ácido [[(3-hidroxi-2-piridi- 10,0 mg nil)-amino]metileno]bisfosfónico

Amido 20, 0 mg

Estearato de magnésio 1,0 mg 15

Misturam-se os componentes de um modo conhecido para se obter uma mistura destinada a acondicionar em uma cápsula de dimensão apropriada.

BIBLIOGRAFIA

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Lisboa, 20 de Abril de 2007

Claims (3)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de compostos de fórmula geral 1' O

na qual o símbolo Z representa um grupo hidroxi, ou hidroxi protegido que é um grupo alcoxi, ariloxi, aciloxi, aril- ou alquilsililoxi em Ci a C4f e os grupos Ri a R4 são iguais ou diferentes, e representam um grupo alquilo cora 1 a 5 átomos de carbono, peio que um dos grupos Ri a R4 pode representar também um átomo de hidrogénio, na preparação de uma composição farmacêutica utilizada em um tratamento para fortalecer o osso cortical ou combater a fragilidade desse mesmo osso.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1., em que o símbolo Z representa um grupo hidroxi.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1., caracterizada pelo facto de o composto de fórmula geral V ser o éster tetra-etílico do ácido [[(3-hidroxi-2-piridinil)-amino]metilideno]bifosfónico. Lisboa, 20 de Abril de 2007