KR101134053B1 - 뼈 성장 촉진 및 뼈 흡수 억제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일면은 뼈의 성장을 촉진 또는 뼈의 재흡수 억제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 하기 화학식으로 표시되는 융합 피라졸릴 화합물의 투여가 필요한 대상에게 유효량의 상기 화합물을 투여하는 단계를 포함한다:

(화학식)

(상기 화학식에서,

A가 H, R, 또는

이고,

Ar₁, Ar₂ 및 Ar₃가 각각 독립적으로 페닐, 티에닐, 푸릴 또는 피롤릴이고,

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆가 각각 독립적으로 H, 니트로, 할로겐, R, OH, OR, C(O)OH, C(O)OR, C(O)SH, C(O)SR, C(O)NH₂, C(O)NHR, C(O)NRR', ROH, ROR', RSH, RSR', ROC(O)R'OH, NHR, NRR', RNHR' 또는 RNR'R"; 또는 R₁ 및 R₂가 함께, R ₃ 및 R₄가 함께, 또는 R₅ 및 R₆가 함께 ORO이고,

R, R' 및 R"가 각각 독립적으로 C₁～C₆의 알킬기이고,

n이 1, 2 또는 3임).

융합 피라졸릴 화합물, 골다공증, 뼈 성장 촉진, 뼈 흡수 억제

Description

뼈 성장 촉진 및 뼈 흡수 억제 방법 {ENHANCEMENT OF BONE GROWTH AND INHIBITION OF BONE RESORPTION}

본 출원은 2003년 9월3일자 미국 가출원 제60/499,696호에 근거한 우선권을 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.

뼈는 복합 조직으로서, "뼈 재형성(bone remodeling)"이라 일컫는 과정을 통해 연속적으로 복구 및 재생된다. 이러한 뼈 재형성 과정을 관장하는 2가지 주요 세포형으로는 뼈를 재흡수하는 파골세포(osteoclast), 및 새로운 뼈를 생성하는 골모세포(osteoblast)가 있다. 상기 뼈 재형성 과정은 몇 종의 전신 호르몬(systemic hormone)(예를 들면, 부갑상샘 호르몬, 1,25-디하이드록시바이타민 D₃, 성 호르몬 및 칼시토닌), 및 국소 인자들(예를 들면, 산화질소, 프로스타글란딘, 성장 인자 및 사이토킨)에 의해 조절된다. 뼈의 재흡수 몇 생성 과정이 대등하게 이루어지지 않고, 뼈의 생성 반응보다 뼈의 파괴가 우세한 경우에는 골다공증이 유발된다. 골다공증은 호르몬 불균형, 질환 또는 투약(예를 들면, 코르티코스테로이드 또는 항간질제)과 같은 기타 조건에 의해 유발되기도 한다.

뼈의 재흡수를 억제하거나 또는 뼈의 생성을 활성화함으로써 뼈 재형성 과정을 조절하는 화합물은 뼈의 성장을 촉진하는 잠재력이 있어, 골다공증의 치료에 이용할 수 있다.

본 발명은 융합 피라졸릴 화합물이 뼈의 재흡수를 억제하고 뼈의 성장을 촉진한다는 예상 밖의 발견에 근거한 것이다.

본 발명의 일면은 뼈의 성장을 촉진 또는 뼈의 재흡수 억제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 하기 화학식으로 표시되는 융합 피라졸릴 화합물의 투여가 필요한 대상에게 유효량의 상기 화합물을 투여하는 단계를 포함한다:

(화학식)

(상기 화학식에서,

A가 H, R, 또는

(이하, "(CH₂)_nAr₃(R₅)(R₆)"라 칭함)이고,

Ar₁, Ar₂ 및 Ar₃가 각각 독립적으로 페닐, 티에닐, 푸릴 또는 피롤릴이고,

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆가 각각 독립적으로 H, 니트로, 할로겐, R, OH, OR, C(O)OH, C(O)OR, C(O)SH, C(O)SR, C(O)NH₂, C(O)NHR, C(O)NRR', ROH, ROR', RSH, RSR', ROC(O)R'OH, NHR, NRR', RNHR' 또는 RNR'R"; 또는 R₁ 및 R₂가 함께, R ₃ 및 R₄가 함께, 또는 R₅ 및 R₆가 함께 ORO이고,

R, R' 및 R"가 각각 독립적으로 C₁～C₆의 알킬기이고,

n이 1, 2 또는 3임).

상기 화학식에 있어서, 화학식 (Ⅰ)의 화합물 일 구현예에서, Ar₁이 페닐이고, R₁ 및 R₂가 각각 페닐의 4번 위치 및 5번 위치에 치환되어 있다. 다른 구현예에서, Ar₂는 5'-푸릴기이고, R₃ 및 R₄ 중 하나가 5'-푸릴기의 2번 위치에서 치환되어 있다. 또 다른 구현예에서는 Ar₃가 페닐이고 n이 1이다.

상기 화학식으로 표시되는 화합물은 A가 H인 것을 특징으로 한다. 일 구현예에서, Ar₁이 페닐이고, R₁ 및 R₂가 각각 페닐의 4번 위치 및 5번 위치에 치환되어 있다. 다른 구현예에서, Ar₂가 5'-푸릴기이고, R₃ 및 R₄ 중 하나가 5'-푸릴기의 2번 위치에 치환되어 있다.

상기 화학식으로 표시되는 또 다른 화합물은 Ar₁이 페닐기이거나, 또는 Ar₂가 5'-푸릴기인 것을 특징으로 한다.

본 명세서에 사용된 용어 "알킬기"는 탄소 원자 1～10개를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소를 칭한다. 이러한 알킬기를 예시하면 메틸기, 메틸렌기, 에 틸기, 에틸렌기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기, i-부틸기 및 t-부틸기를 들 수 있으나, 전술한 바에 제한되지 않는다. 상기 알킬기는 선택적으로 치환될 수 있다. 그 치환체를 예시하면 할로(halo), 하이드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 메르캅토, 알콕시카르보닐, 아미도, 카르복시, 알칸설포닐, 알킬카르보닐, 카르바미도, 카르바밀, 카르복실, 티오우레이도(thioureido), 티오시아나토, 설폰아미도, 알케닐, 알키닐, 알킬옥시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클릴 및 헤테로사이클릴을 들 수 있으나 전술한 바에 제한되지 않으며, 상기 알케닐, 알키닐, 알킬옥시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클릴 및 헤테로사이클릴은 추가로 치환될 수 있다.

전술한 바와 같은 융합 피라졸릴 화합물은 허용 가능한 그의 염 및 전구약물(prodrug)을 포함한다. 상기 융합 피라졸릴 화합물의 허용 가능한 염은 예를 들면, 융합 피라졸릴 화합물 상의 음전하를 띄는 치환체(예를 들면, 카르복실레이트)와 양이온 사이에서 형성될 수 있다. 상기 양이온으로서 적절한 것을 예시하면 소듐 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 및 테트라메틸암모늄 이온과 같은 암모늄 양이온을 들 수 있으나, 전술한 바에 제한되지 않는다. 이와 마찬가지로, 양전하를 띄는 치환체(예를 들면, 아미노)는 음전하를 띄는 카운터이온(counterion)과 함께 염을 형성할 수 있다. 상기 카운터 이온으로서 적절한 것을 예시하면 클로라이드, 브로마이드, 요다이드(iodide), 설페이트, 나이트레이트, 포스페이트 및 아세테이트를 들 수 있으나, 전술한 바에 제한되지 않는다. 상기 전구약물을 예시하면, 상기 전구 약물을 대상에게 투여 시에 전술한 바와 같은 융합 피라졸릴 화합물을 제공할 수 있는 에스테르 및 기타 제약학적으로 허용 가능한 유 도체를 들 수 있다.

본 발명의 다른 일면은 골다공증의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 전술한 바와 같은 융합 피라졸릴 화합물의 투여가 필요한 대상에게 유효량의 상기 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법을 수행하는데 이용할 수 있는 융합 피라졸릴 화합물을 예시하면 하기와 같다:

.

또한, 뼈의 성장 촉진, 뼈의 재흡수 억제 또는 골다공증 치료를 위한 약물의 제조용으로서의 전술한 화합물의 용도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.

이하, 본 발명의 다양한 구현예를 들어 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 이점은 본 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위에 명백하게 나타날 수 있다.

본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 융합 피라졸릴 화합물은 동 기술 분야의 당업자들에게 공지된 과정에 따라 제조될 수 있다(예를 들면, 미국특허 제5,574,168호 참조). 상기 융합 피라졸릴 화합물의 제조 방법은 하기의 방법을 포 함한다. 상기 융합 피라졸릴 화합물을 제조하기 위해 먼저, 아릴카르보닐 클로라이드를 또 다른 아릴 화합물과 커플링하여 아릴아릴케톤을 제조한다. 상기 아릴 화합물 중 하나는 선택적으로 모노치환 또는 디치환된다. 그런 다음, 상기 케톤을 아릴기가 선택적으로 모노치환 또는 디치환되어 있는 알킬히드라진과 반응시켜, 3개의 아릴기를 함유하는 히드라존기를 생성한다. 상기 히드라존기는 알킬렌 링커에 의해 융합 피라졸릴 코어로 전환되고, 다른 아릴기는 상기 피라졸릴 코어의 4번 위치 탄소 및 5번 위치 탄소에서 융합되며, 세 번째 아릴기는 상기 피라졸릴 코어의 3번 위치 탄소에 직접 연결된다. 또한, 상기 용융 피라졸릴 화합물의 유도체는 상기 임의의 아릴기 상에 치환체를 변환시킴으로써 얻어질 수 있다.

전술한 합성 방법에 사용되는 화학 물질을 예시하면, 용매, 반응제, 촉매, 보호기 및 탈보호기 반응제를 들 수 있다. 또한, 전술한 방법은 궁극적으로 상기 융합 피라졸릴 화합물을 합성하기 위해, 특히 본 명세서에 기재한 단계 이전 또는 이후에 적절한 보호기를 첨가 또는 제거하는 단계를 포함한다. 아울러, 바람직한 화합물을 제공하기 위해 순서 또는 차수를 변경하여 다양한 합성 단계를 수행할 수 있다. 허용 가능한 융합 피라졸릴 화합물을 합성하는데 유용한, 합성한 화학물의 전환 및 보호기 방법론(보호 및 탈보호)은 동 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH publishers(1989); T.W. Greene 및 P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons(1991); L. Fieser 및 M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons(1994); 및 L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons(1995) 및 그 후속판을 들 수 있다.

이와 같이 합성된 용융 피라졸릴 화합물은 칼럼 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC: high pressure liquid chromatography) 또는 재결정화와 같은 방법에 따라 더욱 정제될 수 있다.

본 발명의 일면은 뼈의 성장 촉진 또는 뼈의 재흡수 억제 방법이다. 따라서, 본 발명의 방법은 골다공증, 골절, 관절고정술 실패, 연골형성이상(dyschondroplasia), 연골무형성(achondroplasia) 또는 선천성 가성관절증(congenital pseudoarthrosis)의 치료 방법을 포함하나, 전술한 바에 제한되지 않는다. "골다공증"을 예시하면, 폐경후 골다공증, 특발성 골다공증, 노인성 골다공증, 코르티코스테로이드 유발성 골다공증, 신부전증, 부갑상샘항진증, 비타민 D 결핍과 관련한 골다공증 및 운동억제(immobilization)를 포함하나, 전술한 바에 제한되지 않는다. "골절"을 예시하면 불유합, 지연유합 및 병적 골절(pathological fracture)을 들 수 있으나, 전술한 바에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법은 1종 이상의 피라졸릴 화합물 및 제약학적으로 허용 가능한 담체가 필요한 대상에게 유효량의 1종 이상의 피라졸릴 화합물 및 제약학적으로 허용 가능한 담체를 투여하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 이용된 바와 같이 용어 "치료(treating)"란, 골다공증과 같은 부적절한 뼈의 성장과 관련된 질환을 치료, 처치, 경감, 완화, 변화(altering), 치유(remedy), 개선(ameliorating) 또는 예방하는 것을 칭한다. "유효량"이란, 상기 융합 피라졸릴 화합물의 투여가 필요한 대상에게 투여 시에 상기 대상에게 치료 효과를 나타내는데 필요한 상기 융합 피라졸릴 화합물의 양으로서 정의된다. 이 유효량은 동 기술 분야의 당업자들에게 알려진 바와 같이, 투여 방법, 부형제 사용 여부, 및 뼈의 성장을 촉진하기 위한 기타 시약 또는 골다공증 치료를 위한 기타 시약과의 공용 가능성에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 방법을 수행하기 위해, 상기 융합 피라졸릴 화합물 및 제약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 경구, 비경구, 흡입 스프레이를 통해, 또는 이식된 저장소(implanted reservoir)를 통해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활맥낭내(inrasynovial), 흉골내, 경막내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

경구 투여용 조성물은 경구로 투여 가능한 임의의 제형일 수 있으며, 캡슐, 정제, 에멀젼 및 수성 현탁액, 분산액 및 용액을 포함하나, 전술한 바에 제한되지 않는다. 경구 투여용 정제의 경우, 통상적으로 사용되는 담체로서 락토오스 및 옥수수 전분이 포함된다. 일반적으로, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제도 포함된다. 경구 투여용 캡슐형의 경우에는 유용한 희석제로서 락토오스 및 건조 옥수수 전분이 포함된다. 상기 수성 현탁액 또는 에멀젼을 경구 투여하는 경우에는 유화제 또는 현탁제와 결합된 오일상에 활성 성분을 현탁 또는 용해시킬 수 있다. 바람직한 경우에는 해당 향미제, 감미제 또는 착색제를 첨가할 수 있다. 제약학적 제제 기술 분야에 공지되어 있는 기법에 따라 식염수 흡입용 조성물을 제조할 수 있다. 흡입용 조성물은 약학적 조성물 분야에서 공지된 기술에 따라 제조될 수 있 으며, 벤질 알코올 또는 기타 적절한 방부제, 생체 내 이용 효율을 강화하기 위한 흡수 촉진제, 플루오르 카본 및/또는 당업계에 공지된 기타 용액화 또는 분산제를 사용하여 식염수 내의 용액으로서 제조될 수 있다.

무균의 주사 조성물, 예를 들어, 멸균의 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액은 적절한 분산 또는 습윤제 (예를 들어, Tween 80) 및 현탁화제를 사용하여 당해 기술분야에서 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있다. 무균 주사 조제는, 예를 들어, 1,3-부탄디올내의 용액과 같이, 비독성의 비경구투여가 가능한 희석제 또는 용매내에 무균의 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는, 허용 가능한 부형제 및 용매는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장의 염화나트륨 용액을 포함한다. 또한, 무균의 고정된 오일이 용매 또는 현탁 매질(예를 들어, 모노 또는 디 글리세리드)로서 사용될 수 있다. 올레산 및 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 주사용 조제 내에서 유용하며, 올리브오일 또는 카스톨 오일, 특히 이들의 폴리옥시에틸레이트화된 것 등, 천연의 약학적으로 허용가능한 오일도 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 나아가, 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제, 또는 카르복시메틸 셀룰로오즈 또는 유사한 분산제를 포함할 수 있다.

약학적 조성물에서 담체는, 조제의 활성 성분과 상용성이 있고, (바람직하게는 상기 성분을 안정화시키며) 치료 대상에 유해하지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 예를 들어, 융합 피라졸릴 화합물과 특정하고 보다 가용성인 배위체를 형성하는 사이클로덱스트린과 같은 용해제 또는 하나 이상의 용해제가 융합 피라졸릴 화합물의 전달을 위한 약학적 부형제로서 사용될 수 있다. 다른 담체의 예 들은, 콜로이드성 이산화규소, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스, 소듐 라우릴 설페이트 및 D&C Yellow #10을 포함한다.

융합 피라졸릴 화합물 뼈의 결절 생성을 증가시키는 것이 가능한지의 여부를 사전에 평가하기 위해 적절한 체내 분석을 이용할 수 있다. 체내 스크리닝은 동 기술 분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 이에 대해서는 후술할 실시예를 참조한다.

추가의 설명 없이도, 상기 기재에 의해 본 발명을 적절하게 구현할 수 있다. 따라서, 하기 실시예들은 단순히 설명을 위한 것으로 이해되어야 하며, 어떠한 방식으로든 나머지 개시를 한정하고자 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 특허를 포함하여, 본 명세서에서 인용된 모든 문헌들이 참조 문헌으로서 그 전문이 본 명세서에 병합된다.

(실시예)

화학 합성

우선, 무수 THF (20 ㎖)내에서 무수 칼슘 클로라이드(88.8 ㎎, 0.8mmole)를 소듐 보로하이드라이드 (60 ㎎, 1.6mmole)과 함께 4시간 동안 교반하여 칼슘 보로하이드라이드를 합성하였다. 이어서, 상기 칼슘 보로하이드라이드 용액에 88.0 ㎎의 1-벤질-3-(5'-메톡시카르보닐-2'-푸릴)-인다졸 (0.27 mmole)을 함유한 30 ㎖의 THF 용액을 30±2℃에서 적가하였다. 상기 혼합물은 6시간 동안 가열하여 환류시킨 후, 냉각하고 분쇄 얼음으로 켄칭(quenching)한 다음, 감압 하에 두어 THF를 제거하고, 이를 여과하여 고체 생성물을 수득하였다. 상기 고체를 디클로로메탄으로 추 출하였다. 상기 추출물을 50 ㎖로 농축하고 페트롤륨 에테르를 첨가하면 고체가 석출된다. 상기 석출물을 수집하여 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔-벤젠)를 통해 정제하여 70.0 ㎎의 1-벤질-3-(5'-하이드록시메틸-2'-푸릴)-인다졸을 수율 87%로 수득하였다. 상기 화합물을 이하, "인다졸 1"이라 한다.

생물학적 분석

방법

1차 골모세포 배양: 하기 방법에 따라, 18일령의 태아 스프라그 돌리(Sprague Dawley: SD) 래트의 머리덮개뼈로부터 1차 골모세포를 제조하였다. 즉, 임신한 래트에 트리클로로아세트알데히드(200 ㎎/㎏)를 복강 내 주사하여 마취 상태에 두었다. 그런 다음, 무균 조작법(aseptic technique)을 이용하여 상기 태아 래트의 머리덮개뼈를 절개하였다. 그리고, 해부 현미경으로 관찰하면서 연조직을 제거하였다. 절개한 머리덮개뼈를 작은 조각으로 나누어, 37℃의 온도에서 0.1%의 콜라겐 분해 효소(collagenase)(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 용액으로 10분간 처리하였다. 그런 다음, 20분간 연속적으로 2회의 콜라겐 분해 효소를 소화시켜 상기와 같이 처리한 머리덮개뼈로부터 세포를 유리하고, 이 세포들을 채집하여 70 ㎛의 나일론 필터(Falcon, BD BioSciences, San Jose, CA)를 통해 여과시켰다. 그리고, 상기 세포들을 20 mM의 HEPES와 10%의 열 비활성화형 FCS, 2 mM의 글루타민, 페니실린(100 U/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)(pH 7.6으로 조정됨)으로 보충된 배지 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Gibco, Grand Island, NY)를 이용하여 비율 95:5의 공기-CO₂ 조건 하의 플라스틱 세포 배양 접시에서 성장시켰다. 상기 세포 배지를 1주일에 2회 교환하였다. 알칼리성 포스파타제(ALP: alkaline phosphatase)의 모폴로지(morphology) 및 발현을 통해 골모세포를 확인하였다. 골모세포의 성숙을 시험하기 위해, 상기 세포들을 아스코르브산(50 ㎍/㎖)(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 및 β-글리세로포스페이트(10 mM)(Sigma Chemical, St. Louis, MO)를 함유하는 성장 배지 내에서 14일 이하 동안 배양하되, 상기 배지를 3일마다 교환하였다.

알칼리성 포스파타제 활성 분석: 인다졸 1의 존재 또는 부재 조건 하에, 6-웰 플레이트에서 배양된 세포들을 1 ㎖의 0.2% Nonidet P-40 내에 수집하고, 세포 현탁액을 초음파 처리하여 파쇄하였다. 그런 다음, 1500 g에서 5분 동안 원심 분리한 후, Lowry 등(1954)의 방법(J. Biol Chem 207:19-37 참조)을 이용하여 상청액 내의 ALP 활성을 측정하였다.

본 코사 염색(von Kossa staining): 50 ㎍/㎖의 비타민 C 및 10 mM의 β-글리세로포스페이트를 함유하는 DMEM 내에서 골모세포를 2주간 배양하되, 상기 배지를 3일마다 교환하였다. 결절 생성 여부를 확인하기 위해, 상기 세포를 4%의 파라 포름알데히드 내에서 10분간 고정하고, 물로 세척한 다음, 1%의 질산은 용액으로 염색하여, UV 램프 하에 30분간 배치한 후, 물로 세척하고 5%의 소듐 티오설페이트 용액으로 2분간 처리하였다. 상기와 같이 처리된 세포를 물로 2회 세척한 다음, 그 기질을 가시화하기 위해 1%의 사프라닌-O를 이용하여 대조 염색하였다. 현미경을 이용하여 세포마다 생성된 결절의 개수를 세었다. 그리고, 배양된 골모세포 내의 4-하이드록시프롤린의 함량을 측정하여, 콜라겐 합성 여부를 확인하였다. 50 ㎍/㎖의 비타민 C 및 10 mM의 β-글리세로포스페이트를 함유하는 DMEM 내에서 배양된 세포를 116℃의 온도에서 6N의 HCl 용액 내에서 16시간 동안 가수 분해하였다. 이어서, 상기 용해질을 동결 건조하고 다시 증류수에 탄 다음, Berg(1982)에 의한 Meth Enzymol . 82: 372-398에 기재된 바와 같이, 550 ㎚에서 분광광도법을 이용하여 4-하이드록시프롤린의 함량을 확인하였다.

세포 증식 분석: 골모세포(2×10⁴ 세포/웰)를 24-웰 플레이트(Costar, Cambridge, MA)에 접종하였다. 상기 세포를 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양한 다음, 인다졸 1을 첨가하였다. 인다졸 1을 첨가하여 24시간 동안 배양한 다음, 10 μM에서 BrdU를 적용하여 추가로 24시간 동안 배양하였다. 형광 카운터(TopCount; Packard Instruments, Meriden, CT)를 이용하여,ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 화학발광 검출 키트의 프로토콜에 따라 효소 결합된 BrdU 배합물을 분석하였다. 전술한 분석을 통해 확인된 초 당 개수는 DNA 합성량 및 증식한 세포의 수와 직접적인 관련이 있기 때문에, 증식시킨 세포의 수로서 간주된다.

파골세포의 형성( osteoclastogenesis ): 6 내지 8주령의 SD 래트의 대퇴골을 제거하고, 20 mM의 HEPES 및 10%의 열 비활성화형 FCS, 2 mM의 글루타민, 페니실린(100 U/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)으로 보충된 배지 DMEM를 이용하여 골수 공간(bone marrow cavity)을 채워, 골수 세포를 제조하였다. 그리고 24시간 후, 비유착 세포(조혈 세포)를 수집하여 파골세포의 전구체로서 이용하였다. 상기 세포를 인간의 재조합 가용성 RANKL(50 ng/㎖, Peprotech EC Ltd., London, United Kingdom) 및 마우스의 M-CSF(20 ng/㎖, Genzyme, Cambridge, MA)의 존재 하에, 24-웰 플레이트 내에 1×10⁶ 세포/웰(0.5 ㎖)로 접종하였다. 그리고, 상기 배지를 3일마다 교환하였다. 이렇게 8～10일 후, TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 분석법에 따라 파골세포의 생성을 확인하였다(Kotake 등, 1999 참조). 포스페이트-완충 식염수 내의 10%의 포름알데히드를 이용하여 상기 유착 세포들을 3분간 고정하였다. 고정한 세포들을 에탄올/아세톤(50:50 v/v)으로 1분간 처리한 다음, 상기 세포 표면을 공기 중에서 건조시키고, 실온에서 50 mM의 소듐 타르타레이트 존재 하에 0.01%의 나프톨 AS-MX 포스페이트(Sigma) 및 0.03% fast red violet LB염(Sigma)을 함유하는 아세톤 완충액(0.1M의 소듐 아세테이트, pH 5.0) 내에서 10분간 배양하였다. TRAP 양성이고 3개 이상의 핵을 포함하는 다핵 세포의 개수를 세어, 각각의 웰에서 파골세포와 유사한 TRAP 양성 세포의 수를 기록하였다.

파골세포의 뼈 재흡수에 대한 분석: 전술한 바와 같이 래트의 대퇴골로부터 파골세포 전구체를 분리하였다. 상기 세포를 완전한 DMEM 배지 내에서 재현탁시키고, 칼슘 포스페이트 아파타이트로 코팅된 24-웰 플레이트(OAAS, Oscotec, OCT USA Inc.) 내에 1×10⁶ 세포/0.5 ㎖ 웰로 접종하였다. 상기 세포를 M-CSF(20 ng/㎖) 및 sRANKL(50 ng/㎖)의 존재 하에 5일간 배양하였다. 그리고, M-CSF 및 sRANKL가 존재하지 않은 상태로 인다졸 1을 3일간 매일 주입하였다. 배양 8일째 날에 배양을 종료하고, 1N의 NaOH 용액을 이용하여 플레이트 내의 나머지 세포들을 용해하였다. 그런 다음, 도립 현미경(inverted microscope)(200×)을 이용하여 웰 당 5개의 이미지를 얻어, 재흡수된 영역을 이미지 분석기로 측정하였다.

국소 주사: 체중이 70 내지 88 g인 수컷 SD 래트를 이용하였다. 삽입관(22G)을 펜토바르비탈(pentobarbial)로 마취된 래트의 후외측에서 상기 래트의 양쪽 사지 내의 근위 경골 골단간으로 이식하였다. 이 때, 상기 삽입관의 바깥쪽 단부는 피하 조직 내에 존재한다. 상기 삽입관을 통해 인다졸 1을 상기 래트의 근위 경골로 1일/1회씩 1주일간 경피 주사하였다. 비교를 위해, 통상의 식염수로 희석된 상기 인다졸 1과 동일한 농도의 DMSO를 우측에 주사하였다. 그 14일 째 날에 상기 래트를 치사시키고, 상기 경골을 4℃, 10%의 포름알데히드 내에서 48시간 동안 고정하였다.

뼈의 조직 형태 계측법 ( histomorphometry ): 경골을 포르말린으로 고정한 다음, 0.5N 염산에서 칼슘을 제거하고, 에탄올 용액 및 아세톤의 순으로 탈수시키고, 파라핀에 함몰시켰다. 연속 절편(5 ㎛)을 종방향으로 절단하여, Mayer의 헤마톡실 린-에오신 용액(Yang 등(1993) Calcif Tissue Int 52:57-61)을 이용하여 염색하였다. 그 성장판 및 근위 경골의 이미지를 MGDS(photoMicroGraphic Digitize integrate System, Total-Integra Technology Co., Ltd., Taipei, Taiwan)를 이용하여 사진으로 찍었다. 1차 해면질 하부에 위치하며 거대한 지주 네트워크로 이루어진 것을 특징으로 하는 2차 해면질 전체에 대해 뼈의 부피를 측정하였다. 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 측정한 뼈의 부피를 계산하였다. 뼈의 측정은 단일맹검법에 의해 수행되었다.

난소절제술 및 좌골 신경 절단술: 다 자란 암수 래트(3개월령)에 대해 각각 난소절제술 및 좌골 신경 절단술을 수행하였다. 수술 후에, 각각의 래트에 대해 인다졸 1(복강 내 주사(i.p.: intraperitoneal), 1 ㎎/㎏) 또는 비히클을 매일 4주간 주입하였다. 최종적으로 주사한 날에 상기 래트를 치사시키고, 래트의 경골 및 대퇴골을 제거하였다.

경골 및 대퇴골의 조직 표본: 상기 프로그램의 마지막에 상기 래트를 단두하여 치사시켰다. 상기 경골을 제거하고, 연조직을 세척하여, Weinerb 등(1991)의 J Bone Miner Res 6:725-731에 기재된 바와 같이 정밀 캘리퍼스(±0.5 ㎜)를 이용하여 경골의 길이를 측정하였다. 상기 경골을 4℃, 10%의 포름알데히드 내에서 48시간 동안 고정하여 뼈의 조직 형태계측법에 따라 분석하였다. 또한, 약간의 경골 및 대퇴골을 제거하여 20℃에 보관하여 뼈 미네랄 분석을 수행하였다.

뼈 미네랄 밀도( BMD : bone mineral density) 및 뼈 미네랄 함량( BMC : bone mineral content): DEXA(dual-energy X-ray absorptiometer) XR-26(Norland, Fort Atkinson, WI)을 이용하여, 상기 경골 및 대퇴골의 BMD 및 BMC를 측정하였다. 작은 대상을 측정하는데 적용되는 모드를 채택하였다. 그 허리 모형에 대해 BMD를 1년 이상 동안 매일 측정하여 계산한 결과, 변화율 계수가 0.7%이었다(Yang 등(1998) Calcif Tissue Int 63:86-90). 상기 경골 및 대퇴골을 실온으로 해동한 다음, 뼈 미네랄 분석을 수행하였다. 전체 경골 및 대퇴골을 스캔하고, 흡수계를 이용하여 BMD 및 BMC를 측정하였다.

생체역학적 3점 굽힘 테스트: MTS-858 테스트 기계(MTS System Inc., Minneapolis, MN)를 이용하여 3점 굽힘 테스트를 통해 뼈 조직의 역학적 성질을 평가하였다. 2개의 지지점 간격을 20 ㎜로 하고, 변형 속도를 1 ㎜/분으로 하였다. 그리고, Team 490 소프트웨어(버전 4.10, Nicolet Instrument Technologies Inc., Madison, WI)를 이용하여 하중/변형 곡선을 얻었다. Sigma Plot 6.0 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, IL)를 이용하여, 최대 하중, 극한 하중, 최대 하중에 대한 에너지, 극한 하중에 대한 에너지 및 선형 경직도를 포함하여 뼈 샘플의 외인 물성을 계산하였다. 상기 최대 하중에 대한 에너지 및 상기 극한 하중에 대한 에너지를 상기 하중/변형 곡선 아래 부분의 영역으로서 계산하였다. 상기 선형 경직도는 상기 하중/변형 곡선에서 직선부의 기울기로서 계산하였다. 또한, 단면이 타원형이라는 가정 하에, 단면 모멘트를 계산하였다(Turner 등, The effects of fluoridated water on bone strength, Orthop Res(1992) 10:581-587).

Turner 등에 의한 Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial, Bone(1993) 14:595-608에 기재된 방법을 이용하여, 최대 응력, 극한 응력 및 탄성 률(영률: Young's modulus)을 계산하였다.

결과

뼈의 성장: 체중이 70 내지 90 g인 어린 수컷 래트(SD)를 6개의 군으로 분류하였다. 각각의 군에 속한 래트의 평균 체중은 73.9±1 g이었다. 인다졸 1을 DMSO에 용해하고, 최종 농도가 10 μM인 식염수로 희석하였다. 상기 6개군 중 한 군을 대조군으로 하고, 기타 군들에 대해서는 침형 삽입관 단독으로 천공한 다음, 각각 침형 삽입관을 이용하여 비히클을 주사(1일, 1회), 인다졸 1을 주사(1일, 1회), 침형 삽입관을 이용하여 비히클을 주사(매일, 1～7일간) 및 인다졸 1을 주사(매일, 1～7일간)하였다. 주사 14일 이후, 상기 래트를 치사시킨 경우, 뼈의 부피는 침형 삽입관(22G)을 단독으로 천공하거나, 또는 침형 삽입관을 이용하여 비히클을 주사하는 것에 영향받지 않았다. 그러나, 상기 래트에 인다졸 1(0.1 nmole)을 7일간 주사한 다음, 이어서, 추가로 7일간 사육한 후의 2차 해면질의 뼈의 부피는 크게 증가하였다. 상기 2차 해면질 내의 지주골은 인다졸 1을 7일간 국소 투여한 후 90%까지 증가했다. 경골이 길이에 있어서는 인다졸 1의 국소 주사에 의한 영향을 그다지 받지 않은 것으로 확인되었다(경골 길이: 대조군에서는 3.31±0.01 ㎝, 인다졸-1 처리군에서는 3.32±0.02 ㎝, n=9).

어린 수컷 래트에 인다졸 1을 단독 주사하거나, 또는 인다졸 1 및 N^G-니트로-L-아르기닌-메틸에스테르(L-NAME, 0.6 nmole/일), NO 합성 효소(NOS) 억제제를 주사하였다. 인다졸 1만을 단독 주사한 경우에 비해, 인다졸 1과 L-NAME을 공동 투 여한 경우에 인다졸 1의 2차 해면질에서의 뼈 생성 촉진 효과가 현저하게 격감하였다.

뼈의 손실 방지: 다 자란 암컷 래트(n=28)에 대해 난소절제술(OVX: ovariectomy)을 수행하였다. 난소절제술을 수행한 다음, 일군의 난소 절제된 래트(n=16)에 인다졸 1(i.p., 1 ㎎/㎏/일)을 주입하고, 기타 군(n=12)에는 인다졸 1을 주입하지 않았다. 난소 절제되지 않은 15마리의 암컷 래트를 겉보기 수술 대조군으로 이용하고, 인다졸 1을 주사하지 않았다. 상기와 같은 난소절제술은 경골 및 대퇴골의 길이 및 중량에는 큰 영향을 끼치지 않은 것으로 확인되었으나, 경골 및 대퇴골 모두에 있어서 뼈 미네랄 밀도(BMD) 및 뼈 미네랄 함량(BMC)은 감소하였다. 이 같은 결과는 표 1을 참조한다. 예상 밖으로, 인다졸 1을 매일 주사한 경우에는 경골 및 대퇴골에 있어서 난소절제술에서 유도된 BMD 및 BMC의 손실이 억제되는 것으로 확인되었다. 상기 겉보기 대조군과 비교해 볼 때, 난소절제술로 인해 경골의 2차 해면질의 지주골이 감소되었다. 또한, 난소절제술 수행 4주 후에 뼈 부피가 60% 감소되는 것으로 관찰되었다. 한편, 인다졸 1(1 ㎎/㎏)을 매일 4주간 주사한 경우에는 지주골의 손실이 감소하였다. 인다졸 1을 주사한 경우의 뼈 부피는 겉보기 수술한 대조군의 76%에 달했다.

표 1: 뼈 미네랄 밀도 및 함량에 대한 인다졸 1의 효과

주: 다 자란 암컷 래트에 대해 난소절제술을 수행한 다음, 인다졸 1을 복강 내 주사(i.p. injection)로 매일 한 달간 투여하였다. 대조군에 대해 비히클(3% DMSO, 0.3 ㎖)을 제공하였다.

a: 겉보기 수술한 군과 비교할 때, p＜0.05

b: OVX군에 비해 p＜0.05

BMD: 뼈 미네랄 밀도

BMC: 뼈 미네랄 함량

상기 데이터는 평균±표준 오차(S.E.)로서 존재함.

대퇴골에서 3점 굽힘 테스트를 수행하였다. 겉보기 수술한 대조군에 비해, 상기 OVX 래트군에서는 대퇴골의 극한 응력 및 영률(Young's modulus)이 크게 감소한 것으로 확인되었다. 예상 외로, 인다졸 1을 처리한 OVX 래트군에서는 대퇴골의 극한 응력 및 영률(Young's modulus)이 약간 감소하였을 뿐이다. 상기 테스테에 대해서는 표 2를 참조한다.

표 2: 대퇴골의 생체역학적 성질

주: 다 자란 암컷 래트에 대해 난소절제술을 수행한 다음, 인다졸 1을 복강 내 주사(i.p. injection)로 매일 한 달간 투여하였다. 대조군에 대해 비히클(3% DMSO, 0.3 ㎖)을 제공하였다.

^* 겉보기 수술한 대조군과 비교할 때, P＜0.05

^§ OVX군과 비교할 때, P＜0.05

다 자란 수컷 래트에 대해 좌골 신경 절단술을 수행하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 후외측과 비교해 볼 때, 수술 시의 경골 및 대퇴골 길이 모두가 좌골 신경을 절단 1개월 후에도 크게 변화하지 않았다. 그러나, 경골 및 대퇴골 양쪽의 중량, BMD, BMC 및 뼈의 부피에 있어서는 좌골 신경 절단에 따라 감소되었다. 예상 외로, 좌골 신경을 절단한 직후, 인다졸 1(1 ㎎/㎏)을 매일 4주간 주사한 경우에는 신경 절단에서 기인한 뼈의 손실에 대항하는 결과를 얻었다. 이에 대해 표 3을 참조한다.

표 3: 인다졸 1의 좌골 신경 절단에서 기인한 뼈의 손실 억제

주: 다 자란 수컷 래트에 대해 좌골 신경 절제술을 수행한 다음, 인다졸 1을 복강 내 주사로 매일 한 달간 투여하였다. 대조군에 대해 비히클(3% DMSO, 0.3 ㎖)을 제공하였다. 상기 자료는 평균±표준 오차(S.E.)로서 존재함(대조군에서는 n=14이고, 인다졸 1 처리군에서는 n=10).

배양된 골모세포에 대한 효과: 인다졸 1의 알칼리성 포스파타제에 대한 지속적 치료 효과를 평가하였다. 1차 골모세포 배양법에 따라 골모세포를 배양하고, 인다졸 1(10 μM)로 2주간 처리하였다. 이 같은 처리로 인해 ALP 염색에 의해 확인된 바와 같이 ALP 활성이 크게 증가하였다. 인다졸 1에 의한 ALP 활성의 증가 현상은 농도 의존적이며, L-NAME(60 μM), ODQ(20 μM) 또는 KT5823(2 μM)은 상기 ALP 활성에 대항하였다. 또한, 인다졸 1의 체내 뼈 결절 생성에 대한 효과를 평가하였다. 그 결과, 골모세포를 비타민 C 및 β-글리세로포스페이트를 함유하는 배지 내에서 배양 시에 미네랄화된 결절의 생성을 확인할 수 있었다. 이 미네랄화된 결절이 활성 골모세포와 함께 뼈의 구조를 제공하고, 전자 현미경으로 뼈세포, 세포 외 콜라겐 원섬유 및 하이드록시아파타이트 침착물을 포착하여, 이 시스템을 유효한 모델로 하여 시험관 내에서의 뼈의 생성을 연구하였다. 예상외로, 인다졸 1을 이용하여 2주간 치료한 결과, 농도에 의존하여 뼈 결절 개수가 증가하였다(뼈 결절은 본 코사 염색법에 의해 관찰됨). 0.1 μM 및 1 μM에서의 인다졸 1은 골모세포의 증식을 증가시켰다(각각 대조군의 119.3% 및 126.1%).

섬유결합소(Fn, fibronectin)는 골모세포의 유착, 이동 및 성숙을 조절하는데 중요한 역할을 한다. Fn 원섬유 형성은 뼈의 미네랄화 과정과 연관이 있다. 배양된 골모세포에서의 인다졸 1의 Fn 원섬유 형성 효과를 시험하였다. 면역 세포 화학법을 이용하여, 단층의 3～5일째의 골모세포에 의해 내부적으로 유리된 Fn으로부터 형성된 원섬유 형성의 고정형을 연구하였다. 인다졸 1(10 μM)을 이용하여 3일째의 골모세포를 24시간 동안 배양한 결과, 세포 외 Fn 어셈블리가 증가하였다. 흐름 세포 측정법을 이용하여 인다졸 1의 α5 인테그린 및 β1 인테그린의 세포 표면 발현에 대한 효과를 분석하였다. 예상외로, 인다졸 1로 24시간 동안 처리한 경우, 상기 α5 인테그린 및 β1 인테그린 모두의 세포 표면 발현도가 증가함을 확인하였다. 한편, 10 μM보다 높은 농도 조건에서만 인다졸 1에 의한 콜라겐 합성이 증가했다.

파골세포의 분화 및 활성화에 대한 효과: M-CSF(20 ng/㎖) 및 sRANKL(50ng/㎖)의 존재 하에 파골세포 전구체를 8일간 배양하여, 성숙한 표현형 표지, 예를 들면, TRAP가 얻어지는 것을 특징으로 하는 거대하고 다핵의 성숙한 파골세포의 형성 을 유도하였다. 인다졸 1은 농도에 의존하여 파골세포의 분화를 기대 이상으로 억제하였다.

아울러, 파골세포의 뼈 재흡수 활성에 대한 인다졸 1의 효과를 시험하였다. 파골세포 전구체를 M-CSF 및 sRANKL의 존재 하에 5일간 배양하고, 파골세포 활성 분석 기질 플레이트 상의 배지로부터 상기 M-CSF 및 sRANKL을 제거하였다. 상기 배지에 서로 다른 농도의 인다졸 1을 첨가하고 추가로 3일간 배양하였다. 대조군과 비교해 볼 때, 인다졸 1은 농도에 의존하여 파골세포의 뼈 재흡수 활성을 크게 억제하였다.

기타 구현예

본 명세서에 기재된 모든 특징들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 각각의 특징은 동일하고 등가의 또는 유사한 목적을 제공하는 다른 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 별도의 언급이 없는 한, 본 명세서에 기재된 각각의 특징은 등가의 또는 유사한 특징의 실시예일 뿐이다.

전술한 바와 같이, 동 기술 분야의 당업들이라면 본 발명의 본질적인 특징을 확인하여, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 투여량 및 조건을 적용하여 본 발명의 다양한 변화 및 변형이 가능하다. 예를 들면, 본 발명을 수행하는데 융합 피라졸릴 화합물과 구조적으로 유사한 화합물을 이용할 수 있다. 따라서, 기타 구현예 또한 본 발명의 특허청구범위 내에 포함된다.

본 발명의 융합 피라졸릴 화합물은 뼈의 재흡수를 억제하거나 또는 뼈의 생 성을 활성화함으로써 골다공증 등의 치료에 이용할 수 있다.

Claims (32)

1. 하기 화학식으로 표시되는 화합물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 뼈의 성장 촉진 또는 뼈의 재흡수 억제용 약학 조성물:

   (화학식)

   

   .
2. 하기 화학식으로 표시되는 화합물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 골다공증 치료용 약학 조성물:

   (화학식)

   

   .
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