NO311830B1 - Promedikamenter, samt fremstilling derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår glykosyl-avstandsstykke-medikament-forbindelser (promedikamenter).

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling av slike promedikamenter.

Terapien av maligne tumorer, inflammatoriske sykdommer og autoimmune sykdommer er ved siden inadekvat effektivitet ved terapien, vanligvis forbundet med alvorlige bivirkninger. Denne mangelen kan hovedsakelig bli forklart ved det faktum at in vivo-selektiviteten til de benyttede medikamentene er for lave. I mange tilfeller kan således kunstige farmakologiske egenskaper in vitro av medikamenter ikke bekreftes in vivo.

Vitenskapen har vært opptatt av dette problem i mange år, riktignok uten stor suksess. En forskningsretning er opptatt med fremstillingen og anvendelse av stoffer som blir metabolisert in vivo til promedikamenter som derefter blir spaltet sete-spesifikt ved enzymer for å gi medikamenter. Sweeney og medarbeidere ("Cancer Research" 31, 477-478, 1971) benyttet således mykofenolsyre som ble metabolisert in vivo til inert mykofenolsyreglukuronid, for behandling av maligne tumorer hos dyr. De observerte effektene på tumorvekst ble forklart av forfatterne ved enzymatisk eliminering av cellemembran, fulgt av opptak av mykofenolsyre inn i tumorcellene. Forsøk på terapi basert på et identisk konsept ble utført av Young et al. ("Cancer" 38, 1887-1895, 1976) med anilinsennep i en klinisk prøve. De behandlet tumorpasienter hvis tumorer ble funnet å ha høye p<->glukuronidase-nivåer med anilinsennep som ifølge deres hypotese må gjennomgå hydroksy-lering i leveren fulgt av glukuronidering og så bli spaltet tumoren av p<->glukuronidase til toksisk hydroksyanilinsennep. De terapeutiske resultatene er imidlertid skuffende.

En annen forskningsretning gikk et trinn videre og omfattet kjemisk fremstilling av anilinsennepmetylglukuronat eller 6-merkaptopuringlukuronid. Disse promedikamentene viste imidlertid en lav grad av detoksifisering, noe som ble et hinder for in vivo-anvendelse. Gunstige egenskaper ble vist med 5—fluoruracil O-p<->D-glukuronid (FUOG) eller 5-fluoruracil-N-glukuronid (FUNG), forbindelser fra en japansk forskningsgruppe (Baba et al., "Gann", 69, 283-284, 1978). Glukuronideringen av 5-fluoruracil reduserte LD50 fra 200 mg/kg for 5—FU til 5000 mg/kg for det tilsvarende glukuronid. Imidlertid ble den distinkte effekten nådd kun med FUOG efter i.v.-administrering og glukosesurgjøring ved behandlingen av en brystkreft hos mus. Det må imidlertid her antas at behandlingen ble startet så tidlig som 24 efter implantering av et stykke tumor, en tid ved hvilken det ikke enda er mulig å snakke om en etablert tumor. Sannsynligvis forårsaket av potensiell vevsskade under implanteringen, ble lysosomal glukuronidase frigitt i tumoren og, kombinert med pH-reduksjon forbundet med glukosebehandling, førte dette til in vivo-aktivitet. Relevansen til denne modellen for den kliniske situasjonen synes imidlertid tvilsom. Det faktum at til dags dato ikke er funnet noe terapeutisk middel som resultat av disse forbindelsene, indikerer den lave in vivo-aktiviteten til forbindelsene.

Katzenellenbogens forskningsgruppe (WO 81/01145) forventet en forbedring i aktiviteten av promedikamenter fra syntesen av peptid-avstandsstykke-medikamenter i stedet for glukuronylmedikamenter. De aktiverende enzymene som er ment for anvendelse i dette tilfellet, er tumor-assosierte fibrino-lytiske eller koagulerende proteaser som for eksempel plasmin eller plasminogen-aktivatorer. In vivo-farmakologisk aktivitet ble ikke vist hverken for doksorubicin- eller arabinosylcytosin-avstandsstykke-peptider beskrevet i WO 81/01145 eller i "Journal of Medicinal Chemistry", 24, 479-480 (1981 ) og som kan aktiveres in vitro av proteaser. Mangelen på selektivitet in vivo-aktivitet av disse forbindelsene kan forklares på bakgrunn av vår nåværende viten om en allestedsnærværende ekstracellulær opptreden av de ovenfor nevnte proteasene i det menneskelige legme.

På tross av et stort antall indikasjoner i litteraturen sitert ovenfor om de ikke meget suksessfulle anvendelsene av promedikamenter inneholdende glukuronsyre, selv i kombinasjon med glukosesurgjøring (Baba, T. et al., "Gann" 69, 283-284, 1978), fikk Rubin i 1984 et US-patent (nr. 4 481 195) hvor han foreslo anvendelsen av glukuronsyre-medikament-forbindelser efter surgjøring av tumoren og alkalisering av det normale vev. Det ser imidlertid ikke ut til at det er kommet noe terapeutisk middel som kan benyttes med klinisk suksess fra denne oppfinnelsen.

I tillegg er smørsyre-promedikamenter som kan spaltes av esteraser, beskrevet. Imidlertid ble det funnet at den terapeutiske effekten av smørsyren som skyltes ble gitt fra promedikamentene in vivo, er dårligere enn den til standard cytostatika (cisplatin).

Alle de studir som er diskutert hittil er basert på aktivering av promedikamenter av endogene enzymer. De in vivo-terapeutiske effektene som kan oppnås ved dette prinsippet, synes imidlertid ikke å være bedre enn en standard kjemoterapi .

Uavhengig av forskningsretningen som beskrevet ovenfor (pro-medikamentaktivering av endogene enzymer) har det vært en utvikling av en ny forskningsretning som forsøkte, efter prelokalisering av xenogene antistoff-enzymkonjugater i målvevet, å spalte promedikamenter av selektivt til cytotoksiske medikamenter i målvevet (Philpott et al., "Surgery", 74, 51, 1973; "Cancer Res.", 34, 2159, 1974). Bagshawe (WO 88/07378) foreslo, basert på arbeidet til Philpott, anvendelsen av xenogene antistoff-enzymkonjugater i kombinasjon med promedikamenter for behandling av tumorer. Han benyttet monoklonale antistoffer fra mus, kjemisk koblet til bakter-iell karboksypeptidase G2 som antistoff-enzymkonjugat og glutamylsennep som promedikament. Senter (US 4 975 278) beskrev kombinasjon av antistoff-enzymkonjugater sammensatt av monoklonale antistoffer fra mus kjemisk bundet til alkalisk fosfatase eller penicillin V amidase med etoposid-fosfat og N—(p-hydroksyfenoksyacetyl)adriamycin eller promedikamenter. Begge systemer (Bagshaw og Senter) har ulempene at det benyttede antistoff-enzymkonjugatet er xenogent og således sterkt immunogent. Dette betyr at det sannsynligvis ikke er mulig å benytte dem gjentatte ganger på den samme pasienten i flere terapeutiske cykler. I tillegg, har Senters system den ulempen at fosfataser opptrer i betydelige mengder i humant blod, noe som betyr at det er en systematisk aktivering av promedikamentet.

Som et resultat av disse manglene, fremstilte Bosslet et al.

("Br. J. Cancer", 65, 234-238, 1992) et fusjonsprotein som er sammensatt av det humaniserte F(ab' )2-f ragmentet av et anti-CEA-antistoff og human p-glukuronidase og som er enzymatisk aktivt, har tumorselektivitet, er i stand til å spalte glukuronylmedikamenter (Florent et al., "Int. Carbohydr. Symposium", s. 297, Abstract A262, Paris, 1992; Gesson et al., "Int. Carbohydr. Symposium", s. 298, Abstract A263, Paris, 1992; Andrianomenjanahary et al., "Int. Carbohydr. Symposium", s. 299, Abstract A264, Paris, 1992) og, ifølge nåværende viten, har liten eller ingen immunogenitet.

Under studiene av syntesen og in vivo-farmakologisk testing av forbindelser man trodde ble optimalt spaltet av dette fusjonsproteinet, er det uventet funnet stoffer som spaltes meget effektivt i tumorer med en markert andel desintegrerte celler, i inflammatoriske prosesser og i autoimmune sykdommer uten forégående administrasjon av fusjonsproteinet.

I dette tilfellet blir forbindelsene aktivert ved enzymer som i friske individer opptrer hovedsakelig på innsiden av celler, men som under de ovenfor nevnte patofyslologiske betingelsene har en lokal ekstracellulær opptreden.

Disse forbindelsene har den generelle formel glykosyl-avstandsstykke-medikament, hvor glykosylradikalet og avstandsstykket kan spaltes fra medikamentet under fysio-logiske eller patofysiologiske betingelser. Egenskapene til disse forbindelsene er slik at generelt blir poly-, oligo-eller monoglykosylradikalet spaltet av enzymatisk hydrolyse og at avstandsstykket så blir spontant spaltet av ved kjemisk hydrolyse. Medikament betyr et kjemisk stoff med biologisk effekt, spesielt et farmasøytisk middel, så vel som derivatene av disse fremstilt ved innføring av ytterligere hydroksyl-, amino- eller iminogrupper.

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser av denne typen.

Foreliggende oppfinnelse angår således forbindelser som karakteriseres ved at de har formelen:

hvor

glykosyl er et poly-, oligo- eller monosakkarid som kan

spaltes av enzymatisk,

W er en aromatisk eller heteroaromatisk eller alifatisk gruppe med konjugerte dobbeltbindinger eller et aminosyre-derivat som cykliserer efter eliminering av glykosylresten, hvor substituentene

R er like eller forskjellig og er, H, metyl, metoksy,

karboksyl, metyloksykarbonyl, CN, hydroksyl, nitro, fluor, klor, brom, sulfo, sulfamoyl eller (C^_4 )-alkylsulfamoyl

og

p er 0 eller 1,

n er et helt tall,

X er 0, NH, metylenoksy, metylenamino eller metylen-(C^_^)-alkylamino og

Y er 0 eller NH, og

medikament er en forbindelse som er bundet via en hydroksyl-,

amino- eller iminogruppe og har en biologisk effekt, bortsett fra antracykliner bundet via en 3'-aminogruppe når p = 0.

Foretrukne forbindelser er slike som karakteriseres ved at

W er en aromatisk eller heteroaromatisk gruppe eller en alifatisk gruppe med konjugerte dobbeltbindinger eller en aminosyrederivatrest som cykliserer etter eliminering av glykosylradikalet og har 5-20 karbonatomer og 0-4 hetero-atomer, hvor heteroatom betyr N, 0 eller S, til hvilke det kan være bundet substituenter, og R, p, n, X, Y og medikamenter som definert i krav 1.

Spesielt foretrukne forbindelser er slike som karakteriseres ved at W er en fenylrest eller polysubstituert fenylrest hvor substi tuentene R er like eller forskjellig og er H, metyl, metoksy, karboksyl, metyloksykarbonyl, CN, hydroksyl, nitro, fluor, klor, brom, sulfo, sulfamoyl eller alkylsulfamoyl, n er 1 til 4, og p, X, Y og medikamenter som definert i krav 1.

Helt spesielt foretrukne forbindelser er slike som karakteriseres ved at

Wer en fenyl eller et monosubsti tuert fenyl hvor en av substituentene R er metoksy, metyloksykarbonyl, CN, hydroksyl, nitro, fluor, klor, brom, sulfo eller sulfamoyl og de andre er hydrogen, og p, X, Y og medikament er som definert i krav 1.

Foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er de følgende: Forbindelser hvor glykosylradikalet kan spaltes av ved enzymatisk hydrolyse, hvor avstandsstykket spontant kan spaltes av ved kjemisk hydrolyse, hvor medikamentet er et farmasøytisk middel eller et av dets derivater fremstilt ved innføring av ytterligere hydroksyl, amino eller iminogrupper, som er mer hydrofile enn medikamentet, som in vivo fører til færre toksiske reaksjoner enn selve medikamentet, hvor medikamentet er et farmasøytisk aktivt stoff, hvor medikamentet er ytterligere substituert med en eller flere hydroksyl, amino eller iminogrupper og reduserer tumorveksten, hvor medikamentet er et standard cytostatika hvor medikamentet er en antimetabolitt, hvor medikamentet er 5—fluoruracil, t-fluorcytidin, 5-fluoruridin, cytosinarabi-nosid eller metotrexat, hvor medikamentet er et stoff som interkalaterer inn i DNA, hvor medikamentet er doksorubicin, daunomycin, idarubicin, epirubicin eller mitoxantron, hvor medikamentet hemmer topoisomerase I + II, hvor medikamentet er kamptotecin, etoposid eller M-AMSA, hvor medikamentet er en tubulinhemmer, hvor medikamentet er vinkristin, vinblastin, vindesin, taksol, nokodazol, kolchicin eller etoposid, hvor medikamentet er et alkyleringsmiddel, hvor medikamentet er cyklofosf amid, mitomycin C, rachelmycin, cisplatin, fosforamidsennep, melfalan, bleomycin, nitrogensennep eller N,N-bis(2-kloretyl)-4-hydroksyanilin, hvor medikamentet er neocarcinostatin, kalicheamicin, denymicin eller esperamicin A, i hvilket medikamentet er en forbindelse som inaktiverer ribosomer, i hvilket medikamentet er verrucarin A, i hvilket medikamentet er en tyrosin-fosfokinasehemmer, i hvilket medikamentet er quercetin, genistein, erbstatin, tyrfostin eller rohitukinderivat, i hvilket medikamentet er en differensieringsinduserer, i hvilket medikamentet er retinoinsyre, smørsyre, forbolester, DMSO eller aclacinomycin, i hvilket medikamentet er et hormon, hormonagonist eller hormonantagonist, hvor medikamentet er progesteron, buserelin, tamoksifen, mifepriston eller onapriston, i hvilket medikamentet er et stoff som forandrer den pleiotropiske motstanden for cytostatika, i hvilket medikamentet er kalmodulinhemmer, i hvilket medikamentet er en proteinkinase C-hemmer, i hvilket medikamentet er en P-glykoproteinhemmer, i hvilket medikamentet er en modulator av den mitokondrielt bundne heksokinase, i hvilket medikamentet er en hemmer av p<->glutamylcysteinsyntetase eller av glutation-S-transferase, i hvilket medikamentet er en hemmer av superoksyddismutase, i hvilket medikamentet er en hemmer av det proliferasjons-forbundne protein definert av MAb Ki67 i cellekjernen i celler som gjennomgår deling, i hvilket medikamentet er et stoff som har immunoundertrykkende effekter, i hvilket medikamentet er en standard immuno-suppressant, i hvilket medikamentet er et makrolid, i hvilket medikamentet er cyklosporin A, rapamycin, FK 506, i hvilket medikamentet er azatioprin, metotrexat, cyklofosfamid eller klorambucil, i hvilket medikamentet er et stoff som har antiinflammatorisk effekt, i hvilket medikamentet er et ikke-steroidalt antiinflammatorisk stoff, i hvilket medikamentet er et saktevirkende antireumatisk medikament, i hvilket medikamentet er et steroid, i hvilket medikamentet er et stoff som har antiinflammatorisk, analgesisk eller anti-pyretisk effekt, i hvilket medikamentet er et derivat av en organisk syre, i hvilket medikamentet er et ikke-surt analgesisk/antiinflammatorisk middel, i hvilket medikamentet er oksyfenbutazon, i hvilket medikamentet er et lokalt anestetikum, i hvilket medikamentet er et antireumatisk middel, i hvilket medikamentet er en Ca<++->antagonist, i hvilket medikamentet er et antihistamin, i hvilket medikamentet er en hemmer av fosfodiesterase, i hvilket medikamentet er et parasympatomimetikum, i hvilket medikamentet er et sympatomimetikum eller i hvilket medikamentet er et stoff med en hemmende effekt på human urokinase; og videre forbindelser i hvilket

glykosylresten er en a- eller p<->O-glykosidalt bundet D-glukuronyl, D-glukopyranosyl, D-galaktopyranosyl, N-acetyl-D-glukosaminyl, N-acetyl-D-galaktosaminyl, D-mannopyranosyl eller L-fucopyranosylradikal, eller som er 4'-0-[4-(a-D-glukopyranosyloksy)fenylaminokarbonyl]etoposid, 4 '-0-[4-(p-D-glukopyranosy1oksy)fenylaminokarbonyl]etoposid, 4'-0-[4-(a-D-galaktopyranosyloksy)fenylaminokarbonyl]etoposid, 4'-0-[4-(p<->D-glukuronyloksy)fenylaminokarbonyl]etoposid, 4'-0-[4-(p<->D-

glukuronyloksy)-3-nitrobenzylaminokarbonyl]etoposid, 4'-0-[4-[P-D-glukuronyloksy )-3-klorbenzylaminokarbonyl] etoposid, 1-N-[4-(p<->D-glukuronyloksy)benzyloksykarbonyl]mitomycin C, 14-0-[4-(p-D-glukuronyloksy)-3-nitrobenzylaminokarbonyl]doksorubicin, 4-0-[4-(p-D-glukuronyloksy )benzyl aminokarbonyl] -4-hydroksy-N ,N-bis(2-kloretyl )anilin, 4-0-[4-(p-D-glukuronyloksy )benzylaminokarbonyl]terfenadin, 3'-0-[4-(p-D-glukuronyloksy )benzylaminokarbonyl] terbutalin, 3 ' -0-[4-(3-D-glukuronyloksy)benzylaminokarbonyl] fenoterol, 1"-0-[4-(p-D-glukuronyloksy)benzylaminokarbonyl]salbutamol, 3-0-[4-(p-D-glukuronyloksy)benzylaminokarbonyl]muscarin, 4'-0-[4-(p-D-glukuronyloksy)benzylaminokarbonyl]oksyfenbutazon, 2-0-[4-(P-D-glukuronyloksy )benzylaminokarbonyl]salicylsyre, N-[4-(p-D-glukuronyloksy )benzyloksykarbonyl]diklofenac, N-[4-(p-D-glukuronyloksy )benzyloksykarbonyl]flufenaminsyre, 4-N-[4-(p<->D-glukuronyloksy ) benzyl ok sykarbonyl] -4-metylaminof enazon , 7-N- [4 - (p-D-glukuronyloksy )benzyloksykarbonyl] teofyll in, 1-N-[4-(p<->D-glukuronyloksy)benzyloksykarbonyl]nifedipin, 4-(p-D-glukuronyloksy )-3-nitrobenzyl-2-[l-cyano-1-(N-4-trifluormetylfenyl)karbamoyl]propen-l-ylkarbonat, 3'-N-[4-N-(a-D-galaktosyloksykarbonyl)-4-aminobenzyloksykarbonyl]doksorubicin, 9-0-[4-( p-D-glukuronyloksy )-3-klorbenzyloksykarbonyl]kinin eller metyl-18-0-[3,5-dimetoksy-4-[4-(p-D-glukuronyloksy )-3-klorbenzyloksykarbonyl]benzoyl] reserpat.

Disse forbindelsene kan omdannes til en passende farmasøytisk presentasjon (f.eks. liposomer eller med humanproteiner som bærere) og bli benyttet som farmasøytika.

<1> Som nevnt innledningsvis angår oppfinnelsen også en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel I som beskrevet ovenfor og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter å omsette et fenylglykosid med formel (II), (fremstilt som beskrevet av Andrianomenjanahary et ' al., "Int. Carbohydr. Symposium", s. 299, Abstract A264,

Paris, 1992):

hvor

glykosyl er et poly-, oligo- eller monosakkarid hvis hydroksylgrupper er fri eller beskyttet ved acetyl eller mono-, di- eller trihaloacetyl-beskyttende grupper med halogen som er fluor eller klor, eller benzyl-beskyttende

grupper,

W, R, p, n, Z og Y er som definert i krav 1, og

Z er en reaktiv avspaltbar gruppe valgt blant gruppen

bestående av klor, brom, azid eller N-succinimidoksy,

med et medikament som definert i krav 1, i nærvær av en organisk base valgt blant trietylamin, diisopropyletylamin eller dimetylaminopyridin og et oppløsningsmiddel valgt blant acetonitril, dioksan, tetrahydrofuran, diklormetan eller dikloretan, for å gi et beskyttet mellomprodukt, og derefter eliminere de beskyttende gruppene ved hydrolyse med alkali-metallhydroksydoppløsning, alkalimetallkarbonat, alkali-metallcyanid, bariumoksyd, piperidin eller morfolin i nærvær av metanol, etanol eller vann, for å gi en forbindelse med formel (I).

Den farmakologiske aktiviteten til glykosyl-avstandsstykke-medikament-forbindelsen ifølge oppfinnelsen (herefter kalt promedikament) ble testet in vivo i relevante eksperimentelle dyresystemer. Den valgte modellen for den onkologiske indikasjon var en i hvilke humane tumorer ble transplantert subkutant i nakne mus og promedikamentene ifølge oppfinnelsen ble administrert i.v. etter etablering av tumoren.

Resultatene (eksempler 26-28 med tabletter) viser at for tumorer med en signifikant andel disintegrerende tumorceller, er promedikamentene ifølge oppfinnelsen betydelig mer effektive enn standard kjemoterapi utført med de maksimale tolererte dosene medikament. Det er uten betydning i denne sammenheng om disintegreringen av en betydelig andel av tumorcellene er forårsaket av størrelsen til tumoren og den resulterende manglende næringstilførselen til deler av tumoren (sentral nekrose) eller er Indusert av et eksogent administrert stoff (immunotoksin, bestråling, fusjonsprotein som overlegen utførelsesform av et antistoff-enzymkonjugat, fusjonsprotein sammensatt av en bindingsregion og av DNAse 1, for eksempel scFVDNAsel, cytostatika, og så videre) i et behandlingstrinn som går foran, skjer samtidig eller blir benyttet efterpå. Den overlegne farmasøytiske aktiviteten til promedikamentene ifølge oppfinnelse skyldes de følgende egenskapene : a) Promedikamentene er betydelig 70 ganger) mindre toksiske in vivo enn standard medikamenter som er

inneholdt i promedikamentet.

b) Mengden av cytotoksisk medikament frigitt fra promedikamentet in vivo ved aktiveringsstedet (tumoren) er

under de eksperimentelle betingelsene ovenfor, 5-50 ganger høyere enn mengden medikament som kan bli oppnådd i

tumoren ved standard i.v. terapi.

c) Mengden medikament som ikke-spesifikt frigis fra promedikamentet i normalt vev, eller medikamentkonsentrasjon i

normalt vev forårsaket av potensiell migrering ut av medikamentet generert i tumoren, er betydelig lavere enn konsentrasjonen av medikamentet i normalt vev oppnådd efter i.v.-administrasjon av standard medikament. Denne observasjonen støtter de data som demonstrerer den drastiske reduksjonen av in vivo-toksisiteten hos promedikamentet sammenlignet med medikamentet (a).

d) Farmakokinetiske plasmaundersøkelser og urinanalyser viser at promedikamentene ifølge oppfinnelsen i sunne dyr

blir utskilt meget hurtig (t% = 12 min.) som uspaltede promedikamenter hovedsakelig via nyrene.

Disse observasjonene førte til den konklusjon at promedikamentene ifølge oppfinnelsen har tilstrekkelig hydrofile egenskaper, noe som resulterer i hovedsakelig ekstracellulær distribusjon in vivo.

Siden glykosyldelen av promedikamentet ifølge oppfinnelsen er utvalgt slik at den kan spaltes kun av enzymer som frigis lokalt under patofysiologiske betingelser, kan de lipofile medikamentene likeledes kun frigis ved målvevet og vise sin cytotoksiske effekt der.

Den overlegne effekten til et promedikament ifølge oppfinnelsen med en cytotoksisk medikamentkomponent, kan økes ved å kombinere den med promedikamentet ifølge oppfinnelsen med en annen cytotoksisk medikamentkomponent. I dette tilfellet, er fordelaktige promedikamentkombinasjoner de hvor aktivitets-mekanismen er forskjellige for de benyttede cytotoksiske komponentene, tilsvarende til polykjemoterapi . Det synes spesielt passende å benytte medikamenter som er meget effektivt forårsaker enkeltstrengs- og dobbeltstrengsbrudd i DNA, som kalicheamicin. Promedikamentkombinasjoner ifølge oppfinnelsen som er spesielt fordelaktige, er i imidlertid de hvor et medikament har cytotoksisk potensiale, men det andre for eksempel blokkerer multippel medikamentresistanse. Spesielt passende i denne sammenheng er promedikamentet ifølge foreliggende oppfinnelse hvis medikamentkomponent påvirker multippelmedikamentresistanse ved å hemme tyrosin-fosfokinase, indusere differensiering, viser en hormonell eller hormonantagonistisk effekt, er en kalmodulinhemmer, er en proteinkinase-C-hemmer, er en P-glykoproteinhemmer, er en ionkanalblokkerer, hemmer mitokondrien heksokinase eller hemmer ■y-glutamylcysteinsyntetase, glutation-S-transferase og superoksydismutase. Andre interessante medikamenter for påvirkning av tumorvekst er forbindelser som funksjonelt blokkerer det prolifereringsinduserte protein beskrevet av Gerdes et al. ("Amer. J. Pathol", 138, 867-873, 1991). Spesielt som medikamentkomponent i glykosyl-avstandsstykke-medikament-forbindelsene ifølge oppfinnelsen, burde det være mulig å benytte spesielt selektivt effektiviteten til disse medikamentene efter lokal enzymatisk aktivering.

Spesielt fordelaktig terapeutiske effekter ble oppnådd når for eksempel et glukuronyl-avstandsstykke-kinin-promedikament blir benyttet i kombinasjon med et glukuronyl-avstandsstykke-doksorubicin-promedikament (se tabell 2). Analytisk under-søkelse har vist at i en kombinasjon av denne typen er kininkonsentrasjonen i tumoren øket til en tilsvarende stor verdi ved sammenligning med konvensjonell kininbehandling, noe som også gjelder den cytostatiske medikamentkonsen-trasjonen sammenlignet med konvensjonelle cytostatikaterapi.

De følgende eksperimentelle systemene ble valgt for den farmakologiske testingen av promedikamentene ifølge oppfinnelsen, for undersøkelse av ikke-onkologiske forstyrrelser:

a) Granuloma-pose-modellen hos mus.

Bottomley et al., "Brit. J. Pharmacol.", 93, 627-635

(1988)

b) Adjuvant artritis hos rotte,

Schorlemmer et al., "Exptl. Clin. Res.", XVII (10/11) 471-483 (1991)

c) DTH-modell hos mus,

Dickneite et al., "Infect. Immun.", 44(1), 168-174 (1984)

d) Colitis-indusert ved dekstransulfat hos mus,

Okayasu et al., "Gastroenterology", 98, 694-702 (1990)

e) EAE-modell,

Schorlemmer et al., "Drugs Exptl. Clin. Res". XVII

(10/11), 461-469 (1991)

f) MRL-l-modell,

Schorlemmer et al., "Int. J. Immunother", VII(4), 169-180

(1991).

Aktiviteten, spesielt til promedikamentforbindelse 8 eller 23 beskrevet i detalj i eksempel 8 og 22, ble undersøkt i disse modellene. En overlegen aktivitet av promedikament 22 sammenlignet med det aktive stoffet (Leflunomide) selv ble funnet spesielt for adjuvant artritis og for EAE. En overlegen effekt av promedikament 8 ved sammenligning med standard terapi ble funnet for DTH. I en tilsvarende måte for å gjennomføre undersøkelser på de onkologiske indikasjonene, ble den overlegne aktiviteten forbundet med høyere konsentra-sjoner av medikament, spesielt i det synoviale fluidet (adjuvant artritis).

Disse observasjonene i de ikke-onkologiske modellene nevnt ovenfor, antydet at promedikamentene ifølge oppfinnelsen har generell anvendelse. Passende medikamentkomponenter er alle stoffer hvis terapeutiske anvendelse er forbundet med ubehagelige bivirkninger eller hvis effektive konsentrasjon kun marginelt blir nådd in vivo. Disse omfatter ved siden av de immunoundertrykkende aktive stoffene fra eksempel 22, andre immunosuppresanter (azatioprin, metotrexat, cyklofosfamid, klorambucil, 15-deoksyspergualin, cyklosporin A, FK 506, osv.), ikke-steroidale antiinflammatoriske medikamenter (NSAIDs, eksempler, ibuprofen, indometacin, aspirin, osv.), sakte-virkende antireumati ske medikamenter (SAARDs, eksempler: sulfasalazin, penicillamin, klorkin) og steroider (eksempler: deksametason, prednisolon, osv.). Videre passende som medikamentkomponenten i promedikamentene ifølge oppfinnelsen, er stoffene med antiinflammatoriske, analgesiske og antipyretiske effekter som er nevnt som eksempler under.

Eksempler på stoffer med antiinflammatoriske, analgesiske og antipyretiske effekter:

1. Derivater av organiske syrer:

salicylsyre

p-aminosalicylsyre

diklofenac

flufenaminsyre

mefenaminsyre

2. Ikke-syre analgesiske/antiinflammatoriske midler: paracetamol

pyrazolonderivater (f.eks. 4-aminofenazon, 4-metylaminofenazon)

3. Oksyfenbutazon.

Andre medikamenter som passer som komponent i promedikamentet ifølge oppfinnelsen er Ca<++->antagonister (eksempel: nifedipin, indikasjon: inflammatoriske forstyrrelser), anti-histaminer (eksempel: terfenadin, indikasjon: allergi, astma, inflammatoriske forstyrrelser), hemmer av fosfordiesterase (eksempel: teofyllin, indikasjon: astma, allergi, inflammatoriske forstyrrelser), parasympatomimetika (eksempel: muscarin, indikasjon: autoimmune sykdommer) og sympatomi-metika (eksempler: terbutalin, fenoterol, sulbutamol, orciprenalin, isoprenalin, indikasjon: astma). En klasse av stoffer som er spesielt nyttige som medikamenter for promedikamentene ifølge foreliggende oppfinnelse er representert ved de syntetiske urokinasehemmerne (som f.eks. p-nitrofenylguanidinobenzoat, amilorid, osv.) som fortrinnsvis kan bli benyttet i fremtiden i promedikamentform for behandling av inflammatoriske forstyrrelser.

Ved oppsummering må det enda en gang understrekes at de ovenfor nevnte medikamentene og promedikamentene som kan fremstilles fra disse, kun representerer eksempler. Promedikamentene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for alle ikke-onkologikale forstyrrelser hvor makrofager, granulocytter og blodplater opptrer, spesielt i den aktiverte tilstand. I den aktiverte tilstand utskiller de ovenfor nevnte cellene hovedsakelig intracellulære enzymer som gjør sete-spesifikke aktivering av promedikamentene ifølge oppfinnelsen mulig.

For den onkologiske indikasjonen, blir aktiveringen av promedikamentene ifølge oppfinnelsen bevirket ved intracellulære enzymer frigitt fra døende tumorceller. Dette fenomenet skjer spesielt ved større tumorer (> 0,3 cm), men også efter skade på tumoren ved behandling med immuno-toksiner, cytostatika, bestråling, fusjonsproteiner, antistoff-enzymkonjugater, og så videre. Videre er det mulig å utelukke bidrag til promedikamentaktiveringen fra aktiverte celler som er til stede i tumoren (spesielt makrofager, granulocytter, osv).

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen:

Eksempel 1

4 ' - 0- r4- a- D- glukop. yranosyloks. v ) f enylaminokarbonyl! etoposid

( forbindelse 1)

500 mg (0,68 mmol) 2",3"-di-0-kloracetyletoposid ble oppløst i 50 ml DMF og, ved romtemperatur, ble 0,34 ml (3 ekvivalen-ter) diisopropyletylamin og 0,12 ml (1,5 ekv.) difosgen tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer og derefter ble 0,22 ml diisopropyletylamin og 250 mg (0,9 mmol) 4-(a-D-glukopyraosyloksy)anilin, oppløst i 50 ml DMF, tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 14 timer, hvorpå etylacetat ble tilsatt og blandingen vasket tre ganger med citratbuffer (pH 5). Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og dampet av under vakuum. Resten ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel (50 g) med kloroform: metanol 6:1. 438 mg 4'-0-[4-(a-D-glukopyranosyl-oksy)fenylaminokarbonyl]-2" ,3"-di-0-kloracetyletoposid ble oppnådd. Analyse ved tynnsjiktskromatografi: Rf = 0,6 i kloroform: metanol 3:1.

Det resulterende konjugatet (400 mg) ble oppløst i 80 ml metanol og 3,0 g Dowex-1 x 8 ionebytter ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer og harpiksen ble filtrert av og vasket. Filtratet ble dampet av under vakuum. Resten ble renset på silikagel (50 g) med kloroform: metanol: og iseddik 5:2:2. 256 mg av forbindelsen i tittelen ble fremstilt. Analyse ved tynnsjiktskromatografi: Rf = 0,46 i kloroform: metanol: og iseddik 5:2:2.

Eksempel 2

4 ' -0- F 4- ( p- D- glukopyranosvloksy ) fenylaminokarbonyll etoposid

( forbindelse 2)

500 mg (0,68 mmol) 2", 3"-di-0-kloracetyletoposid ble oppløst i 50 ml DMF og, ved romtemperatur, ble 0,34 ml (3 ekv.) diisopropyletylamin og 0,12 ml (1,5 ekv,) difosgen tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer og derefter ble 0,22 ml diisopropyletylamin og 250 mg (0,9 mmol) 4-(3-D-gluko-pyranosyloksy)anilin oppløst i 50 ml DMF, tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 14 timer, så ble etylacetat tilsatt og blandingen vasket tre ganger med citratbuffer (pH 5). Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og dampet av under vakuum. Resten ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel (50 g) med kloroform: og metanol 6:1. 450 mg 4'-0-[4-(P-D-glukopyranosyloksy)fenylaminokarbonyl]-2",3"-di-0-kloracetyletoposid ble fremstilt. Analyse ved tynnsjiktskromatografi: Rf = 0,56 i kloroform: og metanol 3:1.

Det resulterende konjugatet (400 mg) ble deblokkert i 80 ml metanol med 3,0 g Dowex-1 x 8 ionebytter som beskrevet i eksempel 1. 270 mg av forbindelsen i tittelen ble fremstilt. Analyse ved tynnsjiktskromatografi: Rf = 0,44 i kloroform:

metanol: og iseddik 5:2:2.

Eksempel 3

4' - 0- f 4 - ( q- D- galaktopyranosyloksy) fenyl aminokarbonyl 1 etoposid

( forbindelse 3)

500 mg (0,68 mmol) 2", 3"-di-0-kloracetyletoposid ble oppløst i 50 ml DMF og, ved romtemperatur, ble 0,34 ml (3 ekv.) diisopropyletylamin og 0,12 ml (1,5 ekv.) difosgen tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer og derefter ble 0,22 ml diisopropyletylamin og 250 mg (0,9 mmol) 4-(cx-D-galaktopyranosyloksy)anilin oppløst i 50 ml DMF, tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 14 timer, så ble etylacetat tilsatt og blandingen vasket tre ganger med

citratbuffer (pH 5). Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og dampet av under vakuum. Resten ble renset ved kolonnekromatograf i på silikagel (50 g) med kloroform: metanol 6:1. 460 mg 4'-0-[4-(a-D-galaktopyranosyloksy)fenyl-

aminokarbonyl]-2",3"-di-0-kloracetyletoposid ble fremstilt. Analyse ved tynnsjiktskromatografi: Rf = 0,46 i kloroform: metanol 3:1.

Det resulterende konjugatet (420 mg) ble deblokkert i 80 ml metanol med 3,0 g Dowex-1 x 8 ionebytter som beskrevet i eksempel 1. 250 mg av forbindelsen i tittelen ble fremstilt. Analyse ved tynnsj iktskromatograf i: Rf = 0,41 i kloroform: metanol: iseddik 5:2:2.

Eksempel 4

4 ' -0- f 4- ( p- D- glukuronyloksy ) fenylaminokarbonyl] etoposid

( forbindelse 4)

500 mg (0,68 mmol) 2",3"-di-0-kloracetyletoposid ble oppløst i 50 ml DMF og, ved romtemperatur, ble 0,34 ml (3 ekv.) diisopropyletylamin og 0,12 ml (1,5 ekv.) difosgen tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer og så ble 0,22 ml diisopropyletylamin og 250 mg (0,86 mmol) 4-(6-0-metyl-p-D-glukuronyloksy)anilin oppløst i 50 ml DMF, tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 14 timer, så ble etylacetat tilsatt og blandingen vasket tre ganger med citratbuffer (pH 5). Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og dampet av under vakuum. Resten ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel (50 g) med kloroform: metanol 6:1. 460 mg 4'-0-[4-(6-0-metyl-p-D-glukuronyloksy)-fenylaminokarbonyl]-2",3"-di-0-kloracetyletoposid ble fremstilt. Analyse ved tynnsjiktskromatografi: Rf = 0,63 i kloroform: metanol 3:1.

Det resulterende konjugatet (400 mg) ble deblokkert i 80 ml metanol med 2,0 g bariumoksyd. 280 mg av forbindelsen i tittelen ble fremstilt. Analyse ved tynnsjiktskromatografi: Rf = 0,24 i kloroform: metanol: iseddik 5:2:2.

Eksempel 5

4 ' - 0- f 4-( p- D- glukuronyloksy )- 3- nltrobenzylamlnokarbonyll-etoposid ( forbindelse 5)

500 mg (0,68 mmol) 2",3"-di-0-kloracetyletoposid ble oppløst i 50 ml DMF og, ved romtemperatur, ble 0,34 ml (3 ekv.) diisopropyletylamin og 0,12 ml (1,5 ekv.) difosgen tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer og så ble 0,22 ml diisopropyletylamin og 250 mg (0,80 mmol) 4-(6-0-metyl-p<->D-glukuronyloksy )-3-nitrobenzylamin oppløst i 50 ml DMF, tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 14 timer, så ble etylacetat tilsatt og blandingen vasket tre ganger med citratbuffer (pH 5). Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og dampet av under vakuum. Resten ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel (50 g) med kloroform: metanol 6:1. 456 mg 4'-0-[4-(6-0-metyl-p<->D-glukuronyloksy)-3-nitrobenzylaminokarbonyl]-2",3"-di-0-klor-acetyletoposid ble fremstilt. Analyse ved tynnsjiktskromato-graf i : Rf = 0,64 i kloroform: metanol 3:1.

Det resulterende konjugatet (400 mg) ble deblokkert i 80 ml metanol med 2,0 g bariumoksyd. 320 mg av forbindelsen i tittelen ble fremstilt. Analyse ved tynnsjiktskromatografi: Rf = 0,27 i kloroform: metanol: iseddik 5:2:2.

Eksempel 6

4 ' -0- f4-( p- D- glukuronyloksy)- 3- klorbenzylaminokarbonyll-etoposid ( forbindelse 6)

500 mg (0,68 mmol) 2", 3"-di-0-kloracetyletoposid ble oppløst i 50 ml DMF og, ved romtemperatur, ble 0,34 ml (3 ekv.) diisopropyletylamin og 0,12 ml (1,5 ekv.) difosgen tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer og så ble 0,22 ml diisopropyletylamin og 250 mg (0,80 mmol) 4-(6-0-metyl-p<->D-glukuronyloksy)-3-klorbenzylamin oppløst i 50 ml DMF, tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 14 timer, så ble etylacetat tilsatt og blandingen vasket tre ganger med citratbuffer (pH 5). Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og dampet av under vakuum. Resten ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel (50 g) med kloroform: metanol 6:1. 430 mg 4'-0-[4-(6-0-metyl-p<->D-glukuronyloksy )-3-klorbenzylaminokarbonyl] -2" ,3"-di-0-klor-

acetyletoposid ble fremstilt. Analyse ved tynnsjiktskromato-graf i: Rf = 0,68 i kloroform: metanol 3:1.

Det resulterende konjugat (400 mg) ble deblokkert med 80 ml metanol med 2,0 g bariumoksyd. 340 mg av forbindelsen i tittelen ble fremstilt. Analyse ved tynnsjiktskromatografi: Rf = 0,29 i kloroform: metanol: iseddik 5:2:2.

Eksempel 7

1- N- f4-( p- D- glukuronyloksy ) benzyloksykarbonyl~ lmitomycin C

( forbindelse 7)

500 mg (1,13 mmol) 4-(6-metyl-2,3,4-tri-O-acetyl-p<->D-glukuronyloksy)benzylalkohol ble oppløst i 20 ml toluen og 440 mg (3 ekv.) diisopropyletylamin og 315 mg (1,5 ekv.) fosgen ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Derefter ble 680 mg (1,8 ekv.) mitomycin C og 290 mg (2 ekv. diisopropyletylamin oppløst i 50 ml DMF, tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 14 timer, så ble etylacetat tilsatt og blandingen vasket med citratbuffer. Den organiske fase ble tørket over natriumsulfat og dampet av under vakuum. Råutbyttet: 651 mg ( 72%). Konjugatet (600 mg) ble oppløst i 30 ml kloroform: metanol 2:1 og 250 mg bariumoksyd ble tilsatt. Efter omrøring i 4 timer ble blandingen filtrert og filtratet ble avdampet. Resten ble renset ved kolonnekromatograf i på Sephadex med metanol: vann. Utbyttet av forbindelsen i tittelen: 335 mg (75$).

Eksempel 8

14- 0- f 4-( p- D- glukuronyloksy )- 3- nitrobenzyl aminokarbonyl"! - doksorubicln ( forbindelse 8)

400 mg (0,52 mmol) 3'-N-fluorenylmetyloksykarbonyldokso-rubicin ble oppløst i 20 ml toluen og 200 mg (3 ekv. ) diisopropyletylamin og 144 mg (1,5 ekv.) fosgen, ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time og 294 mg (1,8 ekv. 4-( 6-0-metyl-p-D-glukuronyloksy)-3-nitro-benzylamin og 134 mg (2 ekv.) diisopropylamin oppløst i 50 ml DMF, ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 14 timer, så ble

etylacetat tilsatt og blandingen vasket med citratbuffer (pH 5). Den organiske fase ble tørket over natriumsulf at og konsentrert under vakuum. Råproduktet ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel. Utbyttet: 370 mg (65$). Det beskyttede mellomproduktet (300 mg) ble oppløst i 20 ml THF og 1,0 ml piperidin ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 14 timer og så dampet av under vakuum og samdestillert med toluen. Resten ble oppløst i 20 ml metanol og 250 mg bariumoksyd ble tilsatt. Efter omrøring i 5 timer ble reaksjonsblandingen filtrert og filtratet ble dampet av under vakuum. Resten ble renset ved kolonnekromatografi på Sephadex med metanol: vann. Utbyttet av forbindelsen i tittelen: 140 mg (56$).

Eksempel 9

4- 0- f 4- ( p- D- glukuronyloksy ) benzylaminokarbonyn - 4- hvdroksy-N. N- bis( 2- kloretyl) anllin ( forbindelse 9)

400 mg (171 mmol) 4-hydroksy-N,N-bis-(2-kloretyl)ani1 in ble oppløst i 20 ml toluen, og 950 mg diisopropyletylamin og 500 mg (1,5 ekv.) difosgen, ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time og så. ble 960 mg (1,8 ekv.) 4-(6-0-metyl-p<->D-glukuronyloksy )benzylamin og 0,63 ml diisopropyletylamin oppløst i 50 ml DMF, tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 14 timer, så ble etylacetat tilsatt og blandingen ble vasket med citratbuffer. Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat og dampet av under vakuum. Resten (550 mg) ble oppløst i metanol og 400 mg bariumoksyd ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 4 timer, filtrert og dampet av under vakuum. Resten ble renset ved kolonnekromatograf i på Sephadex. Utbyttet av forbindelsen i tittelen: 420 mg.

Eksempel 10

4- 0- f4-( P- D- glukuronyloksy) benzylaminokarbonyl1 terfenadin

( forbindelse 10)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 9 med utgangspunkt i terfenadin og 4-(6-0-metyl-p-D-glukuronyloksy )benzylamin .

Eksempel 11

3 ' - 0- T4-( p- D- glukuronyloksy ) benzyl am inokarbonyllterbutal in

( forbindelse 11)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 9 med utgangspunkt i terbutalin og 4-(6-0-metyl-p-D-glukuronyloksy)benzylamin.

Eksempel 12

3 ' - 0- f4-( p- D- glukuronyloksy ) benzyl aminokarbonyl 1 fenoterol

( forbindelse 12)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 9 med utgangspunkt i fenoterol og 4-(6-0-metyl-p-D-glukuronyloksy)benzylamin.

Eksempel 13

l"- 0- f 4-( p- D- glukuronyloksy ) benzylaminokarbonyll salbutamol

( forbindelse 13)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 9 med utgangspunkt i salbutamol og 4-(6-0-metyl-p-D-glukuronyloksy)benzylamin.

Eksempel 14

3- 0- f 4- ( p- D- glukuronyloksy ) benzylaminokarbonyl1 muscarin

( forbindelse 14)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 9 med utgangspunkt i muscarin og 4-(6-0-metyl-p-D-glukuronyloksy)benzylamin.

Eksempel 15

4'-0- F 4-( p- D- glukuronyloksy) benz v lam inokarbonyll oksyfenbutazon ( forbindelse 15)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 9 med utgangspunkt i oksyfenbutazon og 4-(6-0-metyl-P-D-glukuronyloksy )benzylamin.

Eksempel 16

2- 0- f4-( p- D- glukuronyloksy) benzyl am inokarbonyll sal i evl syre

( forbindelse 16)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 9 med utgangspunkt i metylsalicylat og 4-(6-0-metyl-P-D-glukuronyloksy)benzylamin.

Eksempel 17

N- f 4- ( p- D- glukuronyloksy ) benzyloksykarbonyl1 diklof enac

( forbindelse 17)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 7 med utgangspunkt i 4-(6-metyl-2,3,4-tri-O-acetyl-P-D-glukuronyloksy)benzylalkohol og diklofenac.

Eksempel 18

N- f 4- ( p- D- glukuronyloksy ) benzyloksykarbonyll f lufenaminsyre

( forbindelse 18)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 7 med utgangspunkt i 4-(6-metyl-2,3,4-tri-0-acetyl-P-D-glukuronyloksy)benzylalkohol og flufenaminsyre.

Eksempel 19

4- N- f 4 - ( p- D- glukuronyloksy ) benzyloksykarbonyll - 4- metyl aminofenazon ( forbindelse 19)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 7 med utgangspunkt i 4-(6-metyl-2,3,4-tri-O-acetyl-P-D-glukuronyloksy)benzylalkohol og 4-metylaminofenazon.

Eksempel 20

7- N- f 4 - ( p- D- glukuronyloksy ) benzyloksvkarbonyl1 teof yl lin

( forbindelse 20)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 7 med utgangspunkt i 4-(6-metyl-2,3,4-tri-0-acetyl-P-D-glukuronyloksy)benzylalkohol og teofyllin.

Eksempel 21

1- N- f 4- ( p- D- glukuronyloksy ) benzyloksykarbonyllnif edipln

( forbindelse 21)

Forbindelsen i tittelen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 7 med utgangspunkt i 4-(6-metyl-2,3, 4-tri-O-acetyl-P-D-glukuronyloksy)benzylalkohol og nifedipin.

Eksempel 22

4 - ( p- D- glukuronyloksy )- 3- nitrobenzyl- 2- l" l- cyano- l-( N- 4-trif luorme tyl fenyl ) karbamoyll pr open- 1- yl- karbonat ( forbindelse 22)

Klormaursyreesteren (4-[(2,3,4-tri-O-acetyl-p<->D-glukopyranosyl )metyluronat]-3-nitrobenzylkarbonylklorid) kan fremstilles ved kjente fremgangsmåter, for eksempel fra metyl-(4-hydroksyme tyl-2-nitrofenyl-2,3,4-tri-O-acetyl-P-D-glukopyra-nosid)uronat og fosgen. Metyl-(4-hydroksymetyl-2-nitrofenyl-2 ,3 ,4-tri-O-acetyl-p-D-glykopyranosid)uronat kan fremstilles fra metyl-(2,3 ,4-tri-O-acetyl-p-D-glukopyranosyl)uronatbromid ved omsetning med 2-hydroksy-5-nitrobenzaldehyd og påfølgende reduksjon.

2- cyano-3-hydroksy-N-( trifluormetylfenyl )krotonamid er den aktive metabolitten av leflunomid, hydroksykrotonamid-derivatet 2 (WO 91/17748). Det fremstilles ifølge eksempel 4B beskrevet der ved alkalisk ringåpning av leflunomid. 5,5 g (0,091 mol) 4-[(2,3 ,4-tri-0-acetyl-p-D-glukopyranosyl)-metyluronat]-3-nitrobenzyloksykarbonylklorid og 2,7 g (0,01 mol) 2-cyano-3-hydroksy-N-(trifluormetylfenyl)krotonamid ble oppløst i 80 ml acetonitril. Tilsetning av 1,7 g (0,01 mol) AgN03 ble fulgt av oppvarming ved 60 °C i 3 timer under omrøring. Filtratet oppnådd efter avkjøling og filtrering ble dampet av til tørrhet under redusert trykk. Råproduktet ble oppløst i 200 ml kloroformrmetanol 2:1 (volum:volum), og 1,5 g bariumoksyd ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 5 timer og filtratet oppnådd efter filtrering ble dampet av til tørrhet. Rensing ved kolonnekromatografi ga forbindelse 22.

Eksempel 23

N- f 4- ( a- D- galaktopyranosyloksykarbonylamino ) benzyloksy-karbonylldoksorubicin ( forbindelse 23)

2, 3. 4. 6- tetra- O- acetvl- D- galaktopyranosid ( 2)

Hydrazinacetat (3,5 g, 38 mmol) ble satt til en oppløsning av penta-O-acetyl-D-galaktose (10 g, 25,6 mmol) i DMF. Blandingen ble oppvarmet til 80°C i 15 minutter. Den avkjølte oppløsningen ble fortynnet med vann (100 ml) og ekstrahert med etylacetat. Den organiske fasen ble vasket med saltvann, tørket (MgSC^) og dampet av. Flashkromatografi av resten (cykloheksan:etylacetat, 3:2, volum/volum) ga 4,95 g (55$) av forbindelse 2 som faststoff.

Forbindelse 2: C^B^oOio» smeltepunkt: 104° C

[a]<g>° = +95° (Cl, CHC13)

N- f2. 3. 46- tetra- O- acetyl- a- D- galaktopyranosyloksyl- p- toluidin

( 3)

p-tolylisocyanat (4,4 g, 33 mmol) ble satt til en oppløsning av forbindelse 2 (3,48 g, 10 mmol) i DMF (50 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 40°C i 15 timer og så fortynnet med H2O (120 ml) og ekstrahert med etylacetat. Den organiske fasen ble vasket først med 2 x 50 ml H2O og så med saltvann, så tørket over MgSC>4 og dampet av under redusert trykk. Flashkromatografi (cykloheksan:etylacetat, 2:1, volum:volum) resulterte i forbindelse 3 (2,2 g, 45$).

Forbindelse 3: C22H27<0>11<N,> smeltepunkt: 93°C

[a]§° = + 84° (Cl, CHC13)

N- ( 2 . 3 . 4 . 6- tetra- O- acetyl- a- D- galaktopyranosyloksvkarbonyl )-4- f ormylanilin ( 6) og N-( 2 . 3 . 4 . 6- tetra- O- acetyl- cx- D- galaktopyranosyloksvkarbonyl)- 4- hydroksymetylanilin ( 7) N-bromsuccinimid (420 mg, 1,1 ekv.) og 120 mg benzoylperoksyd ble satt til en oppløsning av forbindelse 3 (1 g) i CCI4 (60 ml). Blandingen ble omrørt med tilbakeløpskjøling i 4 timer og så avkjølt og filtrert og filtratet ble vasket først med H2O og så med saltvann og tørket over MgSC>4. Avdamping under redusert trykk resulterte i en rest på 1 g som ble renset ved flashkromatograf i og ga 800 mg av en blanding av monobrom- og dibromforbindelsene. Denne blandingen ble direkte benyttet videre. 800 mg av blandingen ble oppløst i aceton (14 ml) og en vandig oppløsning av sølvnitrat (0,1N, 14 ml) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Filtratet efter filtrering gjennom Celite, ble dampet av under redusert trykk og den gjenværende vandige fasen ble ekstrahert med CHgClg (diklormetan). Den organiske fasen ble vasket med H2O og saltvann, tørket over MgS04 og dampet av under redusert trykk. Den resulterende resten ble renset ved flashkromatografi (cykloheksan:aceton, 2:1, volum:volum) og ga 120 mg av forbindelse 6 og 260 mg av forbindelse 7.

Forbindelse 6: C22<H>25°12N» smeltepunkt: 81°C

[a]<g>° = + 109° (Cl, CHCI3)

Forbindelse 7: C22<H>27°12^» smeltepunkt: 850C

[a]g° = + 129° (Cl, CHCI3)

N- ( 2 . 3 . 4 . 6- tetra- O- acetyl- q- D- galaktopyranosyloksykarbonyI )-4- nitrofen. vloks. ykarbonvloksymetylanilin ( 8) p-nitrofenylklorformat (360 mg) og pyridin (0,18 ml) ble tilsatt en oppløsning av forbindelse 7 (300 mg) i CH2CI2 (30 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer og så fortynnet med H2O (50 ml) og ekstrahert. De sammenslåtte, organiske fasene ble vasket med H2O og saltvann og tørket over MgS04. Resten oppnådd under avdamping under redusert trykk ble renset ved flashkromatografi (cyklo-heksan : aceton , 2:1, volum: volum) og ga 380 mg (51$) av forbindelse 8.

Forbindelse 8: C29<H>30<O>16N2, smeltepunkt: 92°C

[a]<g>° = + 81° (Cl, CHCI3)

N- f 4 -( 2 . 3 . 4 , 6- tetra- O- acetyl - a- D- galaktopyranosyloksykarbonylamino ) benzyloksykarbonylldoksorubicin ( 9)

100 mg doksorubicin og 80 jjI trietylamin ble satt til en oppløsning av forbindelse 8 (100 mg) i DMF. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 6 timer. Resten, oppnådd efter avdamping under redusert trykk (1 mm, A = 50°-C), ble renset ved flashkromatograf i og ga 80 mg ( 50%) av forbindelse 9.

Forbindelse 9: C5Q<O>24H54N2, smeltepunkt: 142°C

[a]<g>° = + 196° (Cl, CHCI3)

Forbindelse 23

20 mg natr iummetanolat ble tilsatt til en oppløsning av forbindelse 9 (100 mg) i MeOH (metanol) (30 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 3 timer og nøytralisert med Amberlite IRC-50 (H<+>). Filtratet efter filtrering ble konsentrert under redusert trykk og ga en fast rest. Flashkromatografi på silika (acetonitril:vann, 9:1, volum:volum) av denne resten ga 67 mg (80$) av forbindelse 23.

Forbindelse 23: <C>42<H>46<0>2oN2' smeltepunkt: 136°C

[a]g° = + 225° (C 0,1, EtOH)

1-H NMR (270 MHz, D20): S 1,3 (d, J=6,3H, Me-6), 1,9 og 2,2

(AB, 2H, CH2-8, J=9), 2,8 og 2,9 (AB, 2H, CH2-2, J = 20), 3,8 (S, 3H, OCH3), 5,3 (m, 1H, H-l' ), 6,0 (d, 1H, J=3,5), 7,1 (d, 1H, J=8, H-3), 7,3 (d, J=8, 1H, H-2), 7,5 (d, 1H, J=8, H-l), 7,8 (m, H-arom).

Eksempel 24

9- 0- f4-( p- D- glukuronyloksy )- 3- klorbenzyloksykarbonyl1 kinin

( forbindelse 24)

4- p- D- metylglukuronyloksy- p- klorbenzaldehyd ( 1)

En oppløsning av 4-(2,3,4-tri-0-acetyl-p<->D-metylglukuronyloksy)-3-klorbenzaldehyd (3,05 g, 6,45 mmol) i 0,IN metanolisk natr iummetanolat (50 ml) ble omrørt ved 0°C i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble nøytralisert ved tilsetning av Amberlite IRC 120 H+ ionebytteharplks, filtrert og dampet av under redusert trykk for å gi 4-p<->D-metylglukuronyloksy-3-klorbenzaldehyd (1) som et skum (2,17 g, 97$).

<C>14H15C108, M = 346,5

IR (KBr) >7 cm-<1>: 3400, 3030, 2975, 1375, 1040, 835.

<!>h NMR (300 MHz, (CD3)2S0): 3,25-4,25 (4H, m), 3,70 (3H, s),

5,05 (1H, d, J=7 Hz), 7,28 (1H, d, J=8 Hz), 7,75 (1H, dd, J=8 Hz, J'=2 Hz), 7,90 (1H, d, J=2 Hz), 9,85 (1H, s).

MS (DCI/NH3): M/z: 364/366 (M+NH4)<+.>

4 - ( 2 . 3 . 4 - tr i - 0-( 4- metoksybenzyl )- P- D- metylglukuronyloksy )- 3-klorbenzaldehvd ( 2)

En oppløsning av 4-p<->D-metylglukuronyloksy-3-klorbenzaldehyd (2,10 g, 6,06 mmol) i tørr dimetylformamid (20 ml) ble sakte satt til en suspensjon av natriumhydrid (2 g) i 20 ml vannfri dimetylformamid. 4-metoksybenzylklorid (3,2 ml, 23,5 mmol) ble tilsatt dråpevis i løpet av 30 minutter under avkjøling for å holde reaksjonsblandingen ved omkring 20° C. Oppløsningen ble så omrørt i 18 timer og opparbeidet ved tilsetning av metanol (5 ml). Efter 1 time ble oppløsningen helt i is og bragt til pH 8 med IM saltsyre. Den organiske fasen ble ekstrahert med 2 x 50 ml etylacetat. Efter vasking med 2 x 50 ml vann ble den organiske fasen dampet av til tørrhet. Rensing av resten ved kolonnekromatografi på silikagel 60 H [heksan:etylacetat 8:2, volum:volum] ga 4-(2,3,4-tri-0-( 4-metoksybenzyl ) -p-D-metylglukuronyloksy )-3-klorbenzaldehyd (2) som et f arveløst skum (1,97 g, 46$).

C38H39C1011 , M = 706,5

IR (KBr) -J cm-<1>: 3040, 2945, 1725, 1505, 1375, 1230, 1040,

825.

<X>H NMR (300 MHz, CDC13): 3,30-4,50 (4H, m) , 3,73 (3H, s),

3,85 (3H, s), 3,88 (3H, s), 3,92 (3H, s), 4,50-4,90 (6H, m), 5,12 (1H, d, J=7 Hz), 6,90-7,80 (15H, m), 10,02 (1H, s).

MS (DCI/NH3): M/z: 722/724 (M+NH4)<+.>

2- klor- 4- h. vdroksvmetvlfen. vl- 2 . 3 . 4- tri- 0-( 4- metoksybenzyl )- g-D- metvlglukuronid ( 3)

En oppløsning av aldehydet 2 (1,57 g, 2,22 mmol) i metanol (30 ml) hie behandlet med natriumborhydrid (0,7 g) og reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0° i 90 minutter. Denne vann-stansede reaksjonen ble så ekstrahert med 3 x 20 ml diklormetan. Rensing ved kolonnekromatografi på silikagel 60 H [heksan:etylacetat 7:3, volum:volum] ga 2-klor-4-hydroksy-metylf enyl -2 ,3 ,4-tri-0-( 4-metoksybenzyl )-P-D-metylglukuronid (3) som et amorft faststoff (1,28 g, 81*).

C38H41C101;L , M = 708,5

IR (KBr) V cm-<1>: 3420, 3030, 2935, 1725, 1510, 1510, 1375,

1230, 1040, 825.

<1>H NMR (300 MHz, CDC13): 3,25-4,50 (4H, m), 3,69 (3H, s),

3,85 (3H, s), 3,87 (3H, s), 3,91 (3H, s), 4,50-4,80 (8H, m), 5,08 (1H, d, J=7 Hz), 6,85-7,90 (15H, m).

MS (DC1/NH3): m/z: 724/726 (M+NH4)<+.>

4- f 2 . 3 . 4- tri- 0-( 4- metoksybenzyl)- p- D- metvlglukuronvloksyl- 3-klorbenzvl- 4- nitrofenvlkarbonat ( 4)

Alkoholen 3 (0,25 g, 0,35 mmol) ble oppløst i etylacetat (1,5 ml) og pyridin (0,15 ml). 4-nitrofenylklorformat (0,30 g, 1,48 mmol) ble tilsatt og den resulterende blanding ble omrørt over natten. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk. Rensing av resten ved kolonnekromatografi på silikagel 60 H [heksan:etylacetat 7:3, volum:volum] ga 4- [2 , 3 , 4-tr i -0-( 4-metoksybenzyl )-p-D-metylglukuronyloksy] -3-klorbenzyl-4-nitrofenylkarbonat (4) (0,16 g, 52%).

<C>45H44C1N015, M = 873,5

IR (KBr) - J cm-<1>: 3055, 2930, 1735, 1515, 1370, 1320, 1230,

1040, 830.

<1>H NMR (300 MHz, CDC13): 3,25-4,50 (4H, m), 3,71 (3H, s),

3,82 (3H, s), 3,87 (3H, s), 3,91 (3H, s), 4,45-4,85 (6H, m), 5,05 (1H, d, J=7 Hz), 5,15 (2H, s), 6,80-8,40 (19H, m).

MS (DCI/NH3): 891/893 (M+NH4)<+>

Til en omrørt oppløsning av 4 (0,15 g, 0,17 mmol) i diklormetan (20 ml) og trietylamin (188 pl) ble det satt kinin (50 mg, 0,15 mmol). Blandingen ble holdt ved romtemperatur i 18 timer. Oppløsningsmidlene ble dampet av under redusert trykk. Rensing av resten ved kolonnekromatografi på silikagel 60 H [diklormetan:metanol 95:5, volum:volum] ga 5 som et farveløst skum (0,057 g, 36%).

<C>59H63C1N2°14• M = 1058,5

IR (KBr) V cm-<1>: 3050, 2940, 1740, 1520, 1370, 1320, 1230,

1010, 835, 810

<*>H NMR (300 MHz, CDC13): 1,80-4,40 (15H, m), 3,72 (3H, s), 3,85 (3H, s), 3,93 (6H, s), 3,95 (3H, s), 4,45-4,85 (6H, m), 5,10 (1H, d, J=7 Hz), 5,15 (2H, s), 5,30 (2H, m), 5,72 (1H, m), 6,30 (1H, d, J=7 Hz), 6,80-8,40 (19H, m), 8,75 (1H, d, J=5 Hz).

MS (DCI/NH3): 1076/1078 (M+NH4)<+.>

Til en omrørt oppløsning av 5 (0,050 g, 0,05 mmol) i diklormetan (10 ml) inneholdende vann (0,5 ml) ble det satt 2,3-diklor-5,6-dicyano-l,4-benzokinon (0,017 g, 0,075 mmol) ved 5°C. Efter 1 time ble mettet, vandig NaHC03 (10 ml) tilsatt og blandingen ble hurtig ekstrahert med 3 x 15 ml diklormetan. Den organiske fasen ble vasket med vann, tørket over Na2SC"4 og fordampet under redusert trykk. Resten ble kromatografert over en silikagel 60 H kolonne [diklormetan imetanol 80:20, volum:volum] for å gi 6 som et amorft faststoff (0,023 g, 66*).

<C>35<H>39C1N2°11« m = 698»5

IR (KBr) a7 cm"<1>: 3420, 3040, 2940, 1735, 1530, 1375, 1320 ,

1235, 1020, 830.

% NMR (300 MHz, (CD3)2S0): 1,80-4,30 (15H, m), 3,70 (3H,

s), 3,94 (3H, s), 5,12 (1H, d, J=7 Hz), 5,17 (2H, s), 5,30 (2H, m), 5,71 (1H, m), 6,34 (1H, d, J=7 Hz), 7,10-8,00 (6H, m), 8,77 (1H, d, J=5 Hz).

MS (FAB, matriks: nitrobenzylalkohol): 699/701 (M+H)<+>.

Forbindelse 24

Til en oppløsning av 6 (0,020 g, 0,03 mmol) i vandig fosfatbuffer (pH = 8) (24 ml) ble det satt griselever-esteraseoppløsning (Sigma # E-3128) (0,6 ml) og aceton (12 ml). Blandingen ble holdt ved 37°C i 4 timer og dampet av under redusert trykk. Rensing av resten ved kolonnekromatograf i på silikagel 60 H [acetonitril:vann 95:5, volum:volum] ga forbindelse 24 som et farveløst faststoff (0,011 g, 56*).

C34H37C1N2°11• M = 684,5

IR (KBr) V cm-<1>: 3450, 3060, 2950, 1730, 1520, 1370, 1320,

1240, 1020, 820.

<1->H NMR (300 MHz, (CD3)2S0): 1,80-4,30 (15H, m), 3,94 (3H,

s), 5,10 (1H, d, J=7 Hz), 5,22 (2H, s), 5,32 (2H, m), 5,70 (1H, m), 6,32 (1H, d, J=7 Hz), 7,10-8,00 (6H, m), 8,79 (1H, d, J=5 Hz).

MS (FAB, matriks: nitrobenzylalkohol): 685/687 (M+H)<+>.

Eksempel 25

Metyl- 18- 0- f 3 . 5- dimetoksy- 4- f 4-( p- D- glukuronyloksy )- 3-klorben?:Y1o ksykarbonyllbenzoyllreserpat ( forbindelse 25) 4- p- D- glukuronyloksy- 3- klorbenzaldehyd ( 8)

Til en oppløsning av 4-p<->D-metylglukuronyloksy-3-klorbenzaldehyd (1) (3,52 g, 10,1 mmol) i tetrahydrofuran (60 ml) og vann (40 ml) ble det dråpevis satt 2M vandig natrium-hydroksyd (10 ml) i løpet av 30 minutter. Blandingen ble omrørt i 2 timer, nøytralisert ved tilsetning av Amberlite IRC 50S H+ ionebytterharpiks, filtrert og dampet av til tørrhet for å gi 4-p<->D-glukuronyloksy-3-klorbenzaldehyd (8) som et farveløst skum (2,62 g, 78*).

C13H13C108, M = 332,5

IR (KBr) >7 cm-<1>: 3400, 3050, 2940, 1735, 13380, 1040, 830.

<1>H NMR (300 MHz, (CD3)2S0): 3,25-4,25 (4H, m), 5,05 (1H, d,

J=7 Hz), 7,31 (1H, d, J=8 Hz), 7,77 (1H, dd, J=8 Hz, J'=2 Hz), 7,92 (1H, d, J=2 Hz), 9,82 (1H, s), 11,85 (1H, br. s).

MS (DCI/NH3); m/z: 350/352 (M+NH4)<+.>

4-( 2. 3 , 4- tri- O- benzyl )- P- D- benzylglukuronvloksy- 3- klor-benzaldehvd ( 9)

En oppløsning av 4-(2,3,4-tri-O-benzyl)-e-D-benzylglukuronyl-oksy-3-klorbenzaldehyd (9) (2,55 g, 7,67 mmol) i tørr dimetylf ormamid (20 ml) ble sakte satt til en suspensjon av natriumhydrid (2 g) i 20 ml vannfri dimetylformamid. Benzylbromid (5,0 ml, 42 mmol) ble dråpevis tilsatt i løpet av 30 minutter under avkjøling for å holde reaksjonsblandingen ved omkring 20°C. Oppløsningen ble så omrørt i 18 timer og opparbeidet ved tilsetning av metanol (5 ml). Efter 1 time ble oppløsningen helt i vann og bragt til pH 8 med IM saltsyre. Den vandige fasen ble ekstrahert med 2 x 50 ml etylacetat. Efter vasking med 2 x 50 ml vann ble den organiske fasen dampet av til tørrhet. Rensing av resten ved kolonnekromatografi på silikagel 60 H [heksan:etylacetat 85:15, volum:volum] ga 4-(2,3,4-tri-0-benzyl)-p<->D-benzyl-glukuronyloksy-3-klorbenzaldehyd (9) som et farveløst skum (2,04 g, 38*).

<C>41H37C108, M = 692,5

IR (KBr) s} cm-<1>: 3050, 2930, 1730, 1520, 1370, 1330, 1230,

1040, 825.

<1>H NMR (300 MHz, CDCI3): 3,40-4,50 (4H, m), 4,50-5,00 (8H,

m), 5,08 (1H, d, J=7 Hz), 6,90-7,70 (23H, m), 9,93 (1H, s).

MS (DCI/NH3); m/z: 710/712 (M+NH4)<+.>

2- kl or- 4 - hvdroksymetyl f enyl - 2, 3. 4 - tr i- O- benzyl- p- D- benzyl-glukuronid ( 10)

En oppløsning av aldehydet 9 (2,00 g, 2,88 mmol) i metanol (30 ml) ble behandlet med natriumborhydrid (0,7 g) og reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 90 minutter. Den vann-stoppede reaksjonen ble så ekstrahert med (3 x 20 ml) diklormetan. Rensing ved kolonnekromatografi på silikagel 60 H [heksan:etylacetat 7:3, volum:volum] ga 2-klor-4-hydroksy-metylfenyl-2,3,4-tri-0-benzyl-p-D-benzylglukuronid (10) som et amorft faststoff (1,91 g, 95*).

C41H3gC108, M = 694,5

IR (KBr) O cm-<1>: 3400, 3040, 2940, 1725, 1515, 1370, 1330,

1230, 1040, 825.

<1>H NMR (300 MHz, CDC13): 3,40-4,50 (4H, m), 4,50-5,00 (10H,

m), 5,12 (1H, d, J=7 Hz), 6,90-7,75 (23H, m).

MS (DCI/NH3); m/z: 712/714 (M+NH4)<+. >4 - f ( 2 . 3 . 4- tr i - 0- benzyl )- p- D- benzylglukuronyloksyl - 3- klor-benzyl- 4- nitrofenylkarbonat ( 11).

Alkoholen 10 (0,40 g, 0,57 mmol) ble oppløst i etylacetat (2 ml) og pyridin (0,2 ml). 4-nitrofenylklorformat (0,40 g, 1,97 mmol) ble tilsatt og den resulterende blandingen ble omrørt over natten. Oppløsningsmidlene ble fjernet under redusert trykk. Rensing av resten ved kolonnekromatografi på silikagel 60 H [heksan:etylacetat 7:3, volum:volum] ga 4-[(2,3,4-tri-O-benzyl )-p-D-benzylglukuronyloksy]-3-klorbenzyl-4-nitro-fenylkarbonat (11) (0,23 g, 47*).

C48H42C1012, M = 845,5

IR (KBr) V cm-<1>: 3050, 2940, 1735, 1510, 1360, 1320, 1230,

1050, 835, 810.

<1>H NMR (300 MHz, CDCI3): 3,40-4,50 (4H, m), 4,55-5,00 (8H,

m), 5,12 (1H, d, J=7 Hz), 5,21 (2H, s), 6,80-8,40 (27H, m).

MS (DCI/NH3); m/z: 863/865 (M+NH4)<+.>

Til en omrørt oppløsning av 11 (0,20 g, 0,235 mmol) i diklormetan (20 ml) og trietylamin (260 ul) ble det satt metyl-18-0-(3,5-dimetoksy-4-hydroksybenzoyl)reserpat [Lucas et al., "J. Am. Chem. Soc", 1959, 81, 1928-1932] (130 mg, 0,22 mmol). Blandingen ble holdt ved romtemperatur i 22 timer. Oppløsningsmidlet ble dampet av under redusert trykk. Rensing av resten ved kolonnekromatografi på silikagel 60 H [diklormetanrmetanol 90:10, volum:volum] ga 12 som et farveløst skum (0,127 g, 44*).

C74H75C1N2018, M = 1314,5

IR (KBr) V cm-<1>: 3050, 2940, 1750, 1720, 1515, 1360, 1320,

1280, 1230, 1050, 835.

1-H NMR (300 MHz, CDC13): 1,80-4,50 (19H, m), 3,46 (3H, s),

3,80 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,97 (6H, s), 4,60-5,00 (8H, m), 5,05 (1H, dd, J=12,9, 5 Hz), 5,14 (1H, d, J=7 Hz), 5,22 (2H, s), 6,70-7,90 (28H, m).

MS (FAB, matriks: tioglyserol): 1315/1317 (M+H)<+>.

Forbindelse 25

Til en oppløsning av 12 (0,100 g, 90,07 mmol) ble det satt palladium (10*) på karbon (0,2 g) og den resulterende blandingen ble holdt under hydrogen (1 atmosfære) i 3 timer. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering gjennom Celite. Filtratet ble dampet av under redusert trykk. Rensing av resten ved kolonnekromatografi på silikagel 60 E [aceto-nitrilrvann 92:8, volum:volum] ga forbindelse 25 som et farveløst skum (0,034 g, 51*).

C46H51C1N2018, M = 954,5

IR (KBr) ^ cm-<1>: 3450, 3050, 2940, 1740, 1725, 1520, 1500,

1360, 1280, 1230, 1050, 825.

XE NMR (300 MHz, (CD3)2S0): 1,80-4,50 (19H, m), 3,44 (3H,

s), 3,79 (3H, s), 3,81 (3H, s), 3,99 (6H, s), 5,04 (1H, dd, J=12,9, 5 Hz), 5,12 (1H, d, J=7 Hz), 5,21 (2H, s), 6,70-7,80 (8H, m).

MS (FAB, matriks: tioglyserol): 955/957 (M+H)<+.>

Den farmakologiske aktiviteten til glykosyl-avstandsstykke-medikamentforbindelsene (herefter kalt promedikament) som syntetisert i eksemplene 1-25 ble testet in vivo i relevante eksperimentelle dyresystemer. Modellen som ble valgt for den onkologiske indikasjonen var en hvor human

tumorer var transplantert subkutant på nakne mus og promedikamentene ifølge foreliggende oppfinnelse ble administrert i,v. efter etablering av tumoren.

Eksempel 26

Bestemmelse av akutt toksisitet

For å bestemme den akutte toksisiteten, ble nakne mus (CD-1, nu/nu) infusert på dag 0 med forskjellige doser av teststoff oppløst i 0,5 ml 5* glukoseoppløsning i løpet av 5 minutter. Kontrollgrupper mottok kun 0,5 ml 5* glukoseoppløsning. 5 mus ble benyttet pr. konsentrasjon av teststoffet. Antallet mus som overlevde på dag 14 ble bestemt, og Litchfield Wilcoxon-metoden ble benyttet for å bestemme LD5Ø. Toksisiteten til det undersøkte promedikamentet sammenlignet med medikamentene (doksorubicin) er oppsummert i tabell 1.

Eksempel 27

Hemming av veksten til humane tumorer som vokser subkutant hos nakne mus

Testen for den vekst-hemmende aktiviteten til teststoffene var basert på fremgangsmåten beskrevet av Fiebig et al.

("Proe. Europ. Soc. Med. Oncol". "Cancer Chemother. Pharmacol.", Suppl. 9, 18, 1982; "Verh. dtsch. Ges. inn. Med.", 88, 966, 1982) og Inoue et al. ("Cancer Chemother. Pharmacol.", 10, 182-186, 1983). De testede human-tumorene ble rutinemessig vedlikeholdt og passert i nakne mus. Tumorene ble testet for human-karakteristika ved immun-histokjemi ved bruk av monoklonale antistoffer ved hver 3. passering. Tumorene ble fjernet under sterile betingelser og kuttet i småbiter på 5-10 mm5 . Et stykke tumor ble implantert subkutant i siden til hver nakne mus. Efter omkring 7-14 dager ble tumoren festet til det omgivende vev og tumor-størrelsen A ble bestemt ved hjelp av et skyvelær og måling av to motsatte diametere (a, b) ved den følgende formel:

Efter at en ytterligere måling av tumorstørrelsen var utført i et intervall på 3 dager, ble dyrene randomisert til kontrollgruppen og til gruppen som skulle behandles (6 dyr i hver gruppe). Kun dyr hvor det ble funnet en progressiv tumorvekst, ble benyttet for dette. Med start på randomi-seringsdagen (dag -7), ble dyrene behandlet med teststoffene ifølge skjemaet anvist under. To ganger i uken ble to tumordiametere målt for hver mus og de individuelle tumorare-alene ble beregnet ifølge den ovenfor nevnte formel.

Efter fullførelse av eksperimentet, ble de relative tumor-størrelsene for hvert individuelle dyr på den bestemte målingen, beregnet ved formelen: Ar = A(dag x)^<A>(dag 0)<* >Medianen for den behandlede gruppen (AT) ble så relatert til medianen for den relative kontrolltumorstørrelsen (Ac) og T/C* = A<T>/A<C> x 100 ble beregnet. Den statistiske signifi-kansen til antitumoreffekten ble bestemt ved hjelp av Wilcoxons U-test.

Resultater

De eksperimentelle data som er representert i tabell 2 viser at tumorveksten er mindre hurtig (T/C ~ 40*) i dyrene behandlet med fusjonsproteinet og promedikamentet eller med promedikament alene enn tumorveksten (T/C ~ 80*) observert med doksorubicinbehandling. Forskjellene mellom doksorubicinbehandling og promedikamentterapi, og doksorubicinbehandling og fusjonsprotein + promedikamentterapi, er statistisk signifikant (p <0,05).

Terapien i promedikamentgruppen var overraskende like effektiv som i gruppen som mottok fusjonsproteinet i kombinasjon med promedikament. Det var mulig å forklare denne uventede observasjonen med de følgende vevsanalyser: Histologiske undersøkelser på kryopreservert LoVo-tumorer som ble tatt fra tumor-bærende nakne mus samtidig med promedikament eller doksorubicinterapien (tabell 2, dO) viste at tumorene hadde utviklet en stor sentral nekrose. Det var mulig ved hjelp av en histokjemisk test (Murray et al., The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 37, 643-652, 1989) for bestemmelse av funksjonell human p<->glukuronidase, å vise at funksjonelt aktivt human p-glukuronidase er til stede i nekrosen; det vil si celler hvis cytoplasmiske membraner allerede er blitt skadet, inneholder fremdeles funksjonelt aktiv p<->glukuronidase i cytoplasma. Denne human p<->glukuronidase som er lokalisert i nekrosen og ikke er beskyttet ved den cytoplasmiske membran, forårsaker spaltingen av det hydrofile promedikamentet til medikamentet i LoVo-tumoren. Dette uventede funnet av endogen aktivering av promedikamentet ved sentral nekrose, ble bekreftet i et stort antall humane tumorxenografter (ovarie, bryst, mage, lunge og tarmkarsinomas). Histologiske og histokjemiske undersøkelser eller biopsimaterialer fra humane karsinomas viser at den sentrale nekrose ikke er et artefakt som opptrer kun i humane tumorer som har gjennomgått xenotransplantasjon til nakne mus, men tvert imot er et utbredt patofysiologisk fenomen som fører til forventningen om at promedikament-monoterapi hos mennesker har mange mulige anvendelser. Imidlertid, kan ikke tumorer som ikke utvikler en signifikant andel nekrose, bli behandlet med promedikament-monoterapi (data vist under). For tumorer av denne typen, er det absolutt nødvendig å være i stand til å benytte den overlegne effekten til promedikament-terapien, og anvende et fusjonsprotein som tidligere har gjennomgått ekstracellulær lokalisering i tumoren (eksempel: diseminerte metastaser, små ikke-nekrotiske primærtumorer, og så videre).

Eksempel 28

Farmakokinetikk til promedikament og doksorubicin i tumor-bærende nakne mus

For å evaluere konsentrasjonen av promedikament og doksorubicin i vev og tumorer, ble promedikamentet (500 mg/kg) og doksorubicin (10 mg/kg) infusert over en periode på 5 minutter inn i nakne mus som hadde gjennomgått subkutan implantasjon av en human colontumor (Mz-Sto-1) 14 dager tidligere. Efter infusjonen ble dyrene avlivet ved forskjellige tider og organene og tumoren ble fjernet. I hvert tilfelle ble 770 pl 20 mM f osf atbuf f er, 10 mM sakkarolakton, pH 3,0, satt til 230 mg vev og prøvene ble homogenisert ved bruk av en Ultraturrax. 40 pl 3,3* sølvnitratoppløsning og 160 pl acetonitril ble satt til hver 200 pl av dette homogenatet. Efter at prøvene var ystet i 30 minutter og derefter sentrifugert (5 minutter, 12000 g), ble 100 pl av supernatanten fjernet og fortynnet med 300 pl f osfatbuf f er, 10 mM sakkarolakton, pH 6,0, og innholdet av promedikament og doksorubicin analysert ved hjelp av en automatisk for-kolonneekstraksjon på C-18 Bondelut-kassetter (AASP) og høytrykksvæskekromatografi.

Resultater

Eksempel 29

Effekten av 14-0-[4-(p<->D-glukuronyloksy)-3-nitrobenzylamino-karbonyl]doksorubicin (promedikament) på inflammasjon ble undersøkt i en modell av forsinket type kutan reaksjon (Delayed Type Hypersensitivity, DTE) tilsvarende den fremgangsmåte som er beskrevet av Collins og Mackaness ("J. Immunol.", 101, 830-845, 1968).

I denne modellen ble mus immunisert med en definert mengde av avlivet Salmonella typhimurium-bakterie (109) to ganger med et intervall på en uke. Tre uker efter den første immuni-seringen ble en DTE-reaksjon fremkalt ved intraplantar injeksjon av et Salmonella typhimurium-antigen (STA). Et lokalt inflammatorisk infiltrat som var sammensatt av granulocytter, makrofager, lymfocytter og oppsamlet inte-stitiell væske, ble utviklet. Graden av reaksjon ble målt ved økningen i en fot som svellet 24 timer efter fremkalling av reaksjonen. Effekten av promedikamentet på den inflammatoriske reaksjonen, ble testet med to behandlingsskjemaer. En gruppe mottok en enkel intravenøs administrasjon av 500 mg/kg promedikament 2 timer efter STA-injeksjonen og den andre gruppen mottok tre injeksjoner, i hvert tilfelle 300 mg/kg promedikament ved tidene 2, 5 og 8 timer efter STA-injeksjonen .

Som tabell 4 viser, førte begge promedikamentbehandlings-skjemaene til en betydelig reduksjon av den inflammatoriske reaksjonen og de tre administrasjonene av promedikamentet var svakt bedre enn standardterapien med det antiinflammatoriske ibuprofen.

Eksempel 30

14-0-[4-(p-D-glukuronyloksy )-3-nitrobenzylaminokarbonyl] - doksorubicin (promedikament) ble innkapslet i "Stealth" liposomer som beskrevet av D. Papahadjopoulos et al. ("PNAS", USA, 88:11460-11464, 1991). Efter i.v.-injeksjon i CD1 nu/nu mus, var plasma-halveringstiden til promedikamentet lukket inn i liposomer, ca. 40 timer, noe som er klart lenger enn plasma-halveringstiden til det frie medikament (ca. 20 minutter) (data ikke vist). Denne signifikante økningen i ttø<p >førte til en forbedret farmakologisk effektivitet. En mindre distinkt økning i plasma-halveringstiden ble oppnådd ved preinkubering av promedikamentet med 50 g/l humant serumal-bumin eller human syre a-l-glykoprotein.

Claims (7)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formelen hvor glykosyl er et poly-, oligo- eller monosakkarid som kan spaltes av enzymatisk, W er en aromatisk eller heteroaromatisk eller alifatisk gruppe med konjugerte dobbeltbindinger eller et aminosyre-derivat som cykliserer efter eliminering av glykosylresten, hvor substituentene R er like eller forskjellig og er, E, metyl, metoksy, karboksyl, metyloksykarbonyl, CN, hydroksyl, nitro, fluor, klor, brom, sulfo, sulfamoyl eller (C^_4)-alkylsulfamoyl og p er 0 eller 1, n er et helt tall, X er 0, NH, metylenoksy, metylenamino eller metylen-(C1—4 )- alkylamino og Y er 0 eller NE, og medikament er en forbindelse som er bundet via en hydroksyl-, amino- eller iminogruppe og har en biologisk effekt, bortsett fra antracykliner bundet via en 3'-aminogruppe når p = 0.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at W er en aromatisk eller heteroaromatisk gruppe eller en alifatisk gruppe med konjugerte dobbeltbindinger eller en aminosyrederivatrest som cykliserer etter eliminering av glykosylradikalet og har 5-20 karbonatomer og 0-4 hetero-atomer, hvor heteroatom betyr N, 0 eller S, til hvilke det kan være bundet substituenter, og R, p, n, X, Y og medikamenter som definert i krav 1.

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at W er en fenylrest eller polysubstituert fenylrest hvor substituentene R er like eller forskjellig og er, H, metyl, metoksy, karboksyl, metyloksykarbonyl, CN, hydroksyl, nitro, fluor, klor, brom, sulfo, sulfamoyl eller (c1_4 )-alkylsulfamoyl, n er 1 til 4, og p, X, Y og medikamenter som definert i krav 1.

4. Forbindelse ifølge krav 3, karakterisert ved at W er en fenyl eller et monosubstituert fenyl hvor en av substituentene R er metoksy, metyloksykarbonyl, CN, hydroksyl, nitro, fluor, klor, brom, sulfo eller sulfamoyl og de andre er hydrogen, og p, X, Y og medikament er som definert i krav 1.

5 . Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at medikament er et antracyklin som ikke er bundet ved 3'-aminogrupper og p = 0, fortrinnsvis doksorubicin, 4'-epidoksorubicin, 4- eller 4'-deoksydoksorubicin eller medikamentet er en forbindelse som er valgt blant gruppen bestående av etoposider, N ,N-bis(2-kloretyl)-4-hydroksy-anilin, 4—hydroksycyklofosfamid, vindesin, vinblastin, vinkristin, terfenadin, terbutalin, fenoterol, salbutamol, muscarin, oksyfenbutazon, salicylsyre, p-aminosalicylsyre, 5—fluoruracil, 5-fluorcytidin, 5-fluoruridin, metotrexat, diklofenac, flufenaminsyre , 4-metylaminofenazon, teofyllin, nifedipin, mitomycin C, mitoxantron, kamfotecin, m-AMSA, taksol, nokodazol, kolchicin, cyklofosfamid, rachelmycin, cisplatin, melfalan, bleomycin, nitrogensennep, fosforamidsennep, verrucarin A, neokarcinostatin, kalicheamicin, dynemicin, esperamicin A, quercetin, genistein, erbstatin, tyrfostin, rohitukinderivat, retinoinsyre, smørsyre, forbolester, DMSO, aclacinomycin, progesteron, buserelin, tamoksifen, mifepriston, onapriston, N-(4-aminobutyl )-5-klor-2-naftalensulfonamid, pyridinyloksazol-2-on, kinolyl-, isokinolyloksazol-2-on, staurosporin, etanolamin, verapamil, forskolin, 1,9-dideoksyfoskolin, kinin, kinidin, reserpin, metyl-18-0-(3,5-dimetoksy-4-hydroksybenzoyl )reserpat, ionidamin, butionin-sulfoksimin, dietylditiokarbamat, cyklosporin A, rapamycin, azatioprin, klorambucil, hydroksy-krotonamidderivat 2, 15-deoksyspergualin, FK 506, ibuprofen, indometacin, aspirin, sulfasalazin, pencillamin, klorquin, deksametason , prednisolon, mefenaminsyre, paracetamol, 4-aminofenazon, muskosin, orciprenalin, isoprenalin, amilorid, p-nitrofenylguanidinobenzoat eller deres derivater som eventuelt er substituert med en eller flere hydroksyl-, amino- eller iminogrupper, hvor foretrukne aktive substanser allerede har en hydroksyl-, amino- eller iminogruppe.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter å omsette et fenylglykosid med formel (II): hvor glykosyl er et poly-, oligo- eller monosakkarid hvis hydroksylgrupper er fri eller beskyttet ved acetyl eller mono-, di- eller trihaloacetyl-beskyttende grupper med halogen som er fluor eller klor, eller benzyl-beskyttende grupper, W, R, p, n, Z og Y er som definert i krav 1, og Z er en reaktiv avspaltbar gruppe valgt blant gruppen bestående av klor, brom, azid eller N-succinimidoksy, med et medikament som definert i krav 1, i nærvær av en organisk base valgt blant trietylamin, diisopropyletylamin eller dimetylaminopyridin og et oppløsningsmiddel valgt blant acetonitril, dioksan, tetrahydrofuran, diklormetan eller dikloretan, for å gi et beskyttet mellomprodukt, og derefter eliminere de beskyttende gruppene ved hydrolyse med alkali-metallhydroksydoppløsning, alkalimetallkarbonat, alkali-metallcyanid, bariumoksyd, piperidin eller morfolin i nærvær av metanol, etanol eller vann, for å gi en forbindelse med formel (I).

7. Forbindelse, karakterisert ved at ved den er 4'-0-[4-(a-D-glukopyranosyloksy)fenylaminokarbonyl]-etoposid, 4'-0-[4-(p<->D-glukopyranosyloksy)fenylaminokarbonyl] etoposid, 4'-0-[4-(a-D-galaktopyranosyloksy)-fenylaminokarbonyl]etoposid, 4'-0-[4-(p<->D-glukuronyloksy)-fenylaminokarbonyl]etoposid, 4'-0-[4-(p<->D-glukuronyloksy)-3-nitrobenzylaminokarbonyl]etoposid, 4 *-0-[4-[p-D-glukuronyloksy )-3-klorbenzylaminokarbonyl] etoposid , l-N-[4-(p<->D-glukuronyloksy)benzyloksykarbonyl]mitomycin C, 14-0-[4-(p<->D-glukuronyloksy)-3-nitrobenzylaminokarbonyl]doksorubicin, 4-0-[4- ( p-D-glukuronyloksy )benzylaminokarbonyl]-4-hydroksy-N,N-bis(2-kloretyl)anilin, 4-0-[4-(p<->D-glukuronyloksy)-benzylaminokarbonyl]terfenadin, 3'-0-[4-(P-D-glukuronyloksy )benzylaminokarbonyl]terbutalin, 3'-0-[4-(p<->D-glukuronyloksy )benzylaminokarbonyl] fenoterol , l"-0-[4-(p<->D-glukuronyloksy)benzylaminokarbonyl]salbutamol, 3-0-[4-(p-D-glukuronyloksy)benzylaminokarbonyl]muscarin, 4 ' -0-[4-(P-D-glukuronyloksy )benzylaminokarbonyl]oksyfenbutazon, 2-0-[4-(p<->D-glukuronyloksy )benzylaminokarbonyl]salicylsyre, N-[4-(p<->D-glukuronyloksy)benzyloksykarbonyl]diklofenac, N-[4-(p<->D-glukuronyloksy )benzyloksykarbonyl]flufenaminsyre, 4-N-[4-(P-D-glukuronyloksy ) benzyl ok sykarbonyl ] -4-metylaminofenazon , 7—N-[4-(p-D-glukuronyloksy )benzyloksykarbonyl]teofyllin, 1—N- [4-(p-D-glukuronyloksy )benzyloksykarbonyl]nifedlpin, 4-(p-D-glukuronyl ) -3-ni trobenzyl -2- [ l-cyano-l-(N-4-trif luormetyl-fenyl )karbamoyl]propen-l-ylkarbonat, N-[4-(a-D-galaktopyranosyloksy-karbonyl amino)benzyloksykarbonyl]doksorubicin, 9-0 - [4- ( p-D-glukuronyloksy ) - 3-klorbenzyloksykarbonyl]kinin eller metyl-18-0-[3 ,5-dimetoksy-4-[4-(p-D-glukuronyloksy)-3-klorbenzyloksykarbonyl]benzoyl]reserpat.