NO311784B1 - Anvendelse av 2,4-diaminopyrimidin-3-oksyd eller et salt derav for fremstilling av et farmasöytisk preparat for behandlingav maturasjons- og struktureringsforstyrrelser av kollagen - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder anvendelse av 2,4-diamino-pyrimidin-3-oksyd eller et av dets salter for fremstilling av et terapeutisk preparat for farmasøytisk eller veterinær anvendelse for behandling av sykdommer forbundet med modning og strukturering av kollagen.

Oppnåelse av et knippe av nativt prokollagen krever hydroksylering av et visst antall propyl- og lysylrester i preprokollagen i det indre av det grove, endoplasmiske nettet, og deretter glykosylering av hydroksylysylrester i Golgi-apparatet. Denne modningen av kollagen er gjort til gjenstand for en rekke undersøkelser.

Således er "Minoxidil", nemlig 2,4-diamino-6-piperidino-pyrimidin-3-oksyd, allerede beskrevet og anvendt ved behandling av visse høye blodtrykk og ved behandling av androgen skallethet, gjort til gjenstand for en rekke undersøkelser som spesifikk inhibitor for lysyl-hydroksylase, det enzymet som innvirker ved modning av kollagen.

Når det gjelder dette emne har undersøkelsene til Murad et al., publisert i Arch. of Biochem. Biophys., vol. 2 92, nr. 1, s. 234-238 (1992) og vol. 308, nr. 1, s. 42-47 (1994), kunnet vise at evnen til å inhibere lysyl-hydroksylase krever nærvær av en tertiær aminogruppe som befinner seg i para til N-oksydfunksjonen i 2,4-diaminio-pyrimidin-kjernen og at denne gruppe fortrinnsvis bør være en piperidinogruppe som i Minoxidil.

Det er nå overraskende og helt uventet konstatert at 2,4-diamino-pyrimidin-3-oksyd eller 2,4-DPO (i det følgende), selv om den ikke inneholder en tertiær aminogruppe i parastilling til N-oksydfunksjonen i 2,4-diamino-pyrimidin-kjernen, gjør det mulig på spesiell måte å inhibere lysyl-hydroksylasen.

Denne forbindelse er allerede beskrevet i WO-92/01437 som et aktivt middel for kosmetisk behandling av håravfall ved topisk applikasjon. I motsetning til Minoxidil har imidlertid 2,4-DPO ingen blodtrykkssenkende virkning og har således en spesielt tilfredsstillende uskadelighet, samtidig som den har en inhiberende aktivitet på lysyl-hydroksylasen som er like stor eller større enn aktiviteten av Minoxidil.

Foreliggende oppfinnelse har således som gjenstand anven-delsen av 2,4-DPO eller et av dets salter som aktiv substans for fremstilling av et terapeutisk preparat for farmasøytisk eller veterinær anvendelse for behandling av sykdommer ved modning av kollagen hos menneske eller dyr.

I det følgende betegner uttrykket "2,4-DPO" ikke bare 2,4-DPO selv, men likeledes et av dets salter, slik som defi-nert nedenfor.

Ved sykdom under modning av kollagen skal det ifølge

oppfinnelsen forstås enhver uønsket opphopning av kollagen, og særlig enhver sykdom ved strukturen av kollagenmatrisen i hudvevet eller øye-bindehinnen. Disse sykdommene kan være av spontan, traumatisk eller post-operativ opprinnelse. Blant disse sykdommene kan særlig nevnes

vitreoretinopatier, systemiske sklerodermier, hudfortykninger forårsaket av ultrafiolett stråling og keloide arr.

Anvendelse av 2,4-DPO ifølge oppfinnelsen gjør det således mulig å oppnå særlig en estetisk forbedring av den behandlede pasienten.

Behandlingen ifølge oppfinnelsen kan være helbredende, men den anvendes ikke desto mindre fortrinnsvis på preventiv måte, dvs. i løpet av den periode under hvilken struktureringen dannes, og som følge av dette en oppsamling av kollagen, idet dette finner sted spesielt under arrsettingsperioden.

2,4-DPO kan anvendes for fremstilling av et terapeutisk preparat i en form som kan administreres topisk, transdermalt eller intradermalt.

Med fysiologisk akseptable salter forstås det ifølge oppfinnelsen salter av en syre slik som saltene av svovelsyre, saltsyre, fosforsyre, eddiksyre, benzosyre, salicylsyre, glykolsyre, aceteddiksyre, ravsyre, nikotinsyre, vinsyre, maleinsyre, metansulfonsyre, picrinsyre og melkesyre.

Når det terapeutiske preparat foreligger i en form som kan administreres topisk, ligger mengden av 2,4-DPO generelt mellom 0,0001 og 5 vekt%, og fortrinnsvis mellom 0,01 og 2 vekt% i forhold til preparatets totalvekt.

Bæreren kan ha en meget variert natur, men utgjør fortrinnsvis et miljø som er fysiologisk akseptabelt for en topisk applikasjon, og må selvsagt være forenlig med den aktive substans.

2,4-DPO kan befinne seg i dette miljø enten i oppløst tilstand eller i dispergert tilstand, særlig i mikronisert form.

Det fysiologisk akseptable miljø kan bestå av vann eller en blanding av vann og et løsningsmiddel eller en blanding av løsningsmidler. Blant løsningsmidlene som kan anvendes, kan spesielt nevnes de lavere alkoholene, med C1-4 som etanol, isopropanol, tert-butanol, alkylenglykolen, alkylenetern av alkylenglykol og dialkylenglykol, slik som etylenglykol-monoetyleter, propylenglykol-monometyleter, dietylenglykol-monoetyleter. Preparatene for topisk anvendelse kan likeledes inneholde minst ett konvensjonelt additiv eller et aktivt stoff.

Blant disse kan spesielt nevnes UV.A- og UV.B-filtrene slik som metoksycinnamatene og benzofenonderivatene, antioksydantene og/eller oppfangerne av frie radikaler, slik som DMSO, a~tocoferol, BHA, BHT, dismutase-superoksyd, hydratiseringsmidler såsom urea, glyserol, melkesyre, hydroksysyrene, tia-morfolinon og dets derivater og pyrrolidonkarboksylsyrederivater, særlig saltene av natrium og kalsium, anti-inflammatoriske steroider og ikke-steroider, slik som hydrokortison, p-metason, deksametason, acetylsalisylsyre, indometacin, isoprofen, vitamin D eller niflumsyre, og antibakterielle midler såsom de som hører til gruppen makrolidene, pyranosidene og tetracyklinene, slik som erytromycin.

Disse preparatene kan likeledes inneholde

konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, pH-reguleringsmidler, midler for modifisering av osmotisk trykk og emulgeringsmidler. Preparatene som skal appliseres topisk på basis av 2,4-DPO kan foreligge i forskjellige former, slik som f.eks. i form av lotioner, geler, skum, blæreformede dispersjoner, sprayer eller aerosolskum.

Preparatene kan likeledes foreligge i form av geldannede eller fortykkede preparater. Blant de geldannede preparatene kan spesielt nevnes de, i hovedsak vandige, som er geldannet ved hjelp av heterobiopolysakkarider, såsom xantangummi, skleroglukanene eller cellulosederivater, og spesielt celluloseetere, eller hydroalkoholiske preparater som er geldannet med polyhydroksyetlakrylater eller - metakrylater. Blant de fortykkede, vandige preparatene kan nevnes de som er oppnådd spesielt ved hjelp av en polyakrylsyre som er fornettet med et polyfunksjonelt middel, såsom de som markedsføres under betegnelsen "Car-bopol®" fra Goodrich. Det er imidlertid selvsagt mulig å anvende som fortykningsmiddel ethvert middel som vanligvis anvendes i farmasien eller i dermofarmasien.

Topisk appliseres generelt 2,4-DPO på de deler av kroppen som skal behandles, i en mengde på 0,0001 til 5 mg/kg/dag og fortrinnsvis fra 0,001 til 1 mg/kg/dag. Behandlingen fortsettes vanligvis under hele den periode under hvilken det dannes opphopninger av kollagen og kan eventuelt fortsettes i 9 dager etter nevnte periode.

Ifølge oppfinnelsen kan det likeledes anvendes 2,4-DPO for fremstilling av terapeutiske preparater som skal fremstilles transdermalt.

Mengden 2,4-DPO ligger da generelt mellom 0,001 og 5% og fortrinnsvis mellom 0,01 og 2% i forhold til preparatets totalvekt.

Den eksipiens som anvendes i preparatene, velges generelt blant kopolymerene eller vinylkopolymerene, eventuelt tilsatt et inntrengningsfremmende middel.

Preparatene som skal appliseres transdermalt, kan særlig administreres ved hjelp av et selvklebende system som kleber til huden og sikrer kontinuerlig passasje, i minst 24 timer, av en regulert mengde aktiv substans, gjennom huden og inn i blodsirkulasjonen.

Blant disse systemene kan spesielt merkes de som er beskrevet i FR patentsøknad nr. 88.11685 (2.635.979) såvel som de som markedsføres av firmaet Tilderm.

2,4-DPO kan likeledes anvendes for fremstilling av terapeutiske preparater for intradermal administrasjon.

Mengden 2,4-DPO er da generelt mellom 0,0001 og 5 vekt%, og fortrinnsvis mellom 0,001 og 1 vekt% i forhold til totalvekten av preparatet.

2,4-DPO foreligger da i oppløselig form i en fysiologisk akseptabel bærer, slik som fysiologisk saltløsning.

Preparatene for intradermal administrasjon kan dessuten omfatte forskjellige terapeutiske midler, slik som f.eks. antibakterielle midler, antioksidanter og anti-inflammatoriske steroider og ikke-steroider.

2,4-DPO administreres generelt intradermalt i en dosemengde som er under eller lik 5 mg/kg/dag, og fortrinnsvis mellom 0,0001 og 1 mg/kg/dag. Behandlingen appliseres generelt hele den periode i hvilken det dannes kollagenopphopninger og kan eventuelt fortsettes i 30 dager etter nevnte periode.

Selv om det ovenfor spesielt er henvist til preparater som skal anvendes farmasøytisk, er det selvsagt at disse kan sammensettes i en slik form som passer bedre for veterinær bruk, særlig ved behandling av hovdyr, slik som hester.

Preparatene ifølge oppfinnelsen fremstilles ifølge kjente fremgangsmåter, uavhengig av hvilken administrasjonsmåte eller bruk de er bestemt til. Det skal nå som illustrasjon gis resultater av forsøk som viser effektiviteten av 2,4-DPO såvel som av forskjellige eksempler på terapeutiske preparater.

I - Undersøkelse av inhiberingen av ekspresjonen av RNAm som koder for lysyl- hydroksylase ( LH)

Utgående fra en fibroblastkultur som stammer fra ytre bindehinneskjeder fra menneskehår etter femte utplantning, utsås 2.IO<5> fibroblaster i Petriskåler på 60 mm diameter inneholdende et dyrkingsmiljø av typen "Eagle", modifisert Dulbecco og tilsatt 2 mM L-glutamin, ImM natriumpyruvat, 100 enheter/ml penicillin G, 100 ^g/ml streptomycin S, 250 mg/ml amfoterin og 10% kalvefoster-serum som markedsføres av Gibco BRL.

Etter 24 timers dyrkning ved 37°C i et varmeskap med 95% luft/5% CO2 erstattes miljøet med et analogt miljø, men som ikke inneholder kalvefoster-serum. Cellene inkuberes så ved 37°C i 3 timer (fig. IA) eller 18 timer (fig. IB) i nærvær av 5 mM Minoxidil, 5 mM 2,4-DPO eller 5 mM Minoxidil-sulfat.

Ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i "Short protocoles in molecular biology, Harvard medical School, J. Willey & Son, utgiver, 1992" ekstraheres total-RNA fra hvert av cellepreparatene, og så kvantifiseres denne ved hjelp av spektrofotometriske UV-målinger ved 270 nm.

For å muliggjøre analyse av ekspresjonen av RNAm gjennomføres en forsterkning av denne ved hjelp av en kjedepolymerisasjonsreaksjon (PCR).

Utgående fra 2 ^g total-RNA som er oppnådd foran for hvert cellepreparat, syntetiseres komplementær-DNA in vitro ved hjelp av en kit for revers transkripsjon, som markedsføres under betegnelsen "First Strand C-DNA Synthesis Kit" av Pharmacia LKB Biotechnology AB. En alikvot fraksjon av komplementær-DNA oppnådd foran forsterkes deretter ved hjelp av den opprinnelige PCR-metoden i nærvær av spesifikke stykker av følgende lysyl-hydroksylase (LH) og prolylhydroksylase (PH):

stykke LH sense: 5 *GAAATGGGCCATGTGAGAGCG3'

stykke LH antisense: 5<1>TGTGGATGACAATAGTCGGCACG3' stykke PH sense: 5<1>GTGGATGGAACAAGCCCTAAGGC3'

stykke PH antisense: 5'CCTCCCCACGGCACAGCATTTCG3'

for et sluttvolum på 50 ^1.

20 av den oppnådde blandingen etter PCR anbringes på en elektroforesegel med 2% agarose i nærvær av 0,5 |^g/ml etidiumbromid og elektroforesebufferen Tris acetat EDTA (TAE) lx.

Etter migrering i 1 time, under et elektrisk felt på 100 V, analyseres intensiteten av de bånd som tilsvarer RNAm som koder henholdsvis for lysyl-hydroksylase og kvantifiseres ved hjelp av en bilde- og logikkanalysator som markedsføres under betegnelsen "Bioprofil®" av firma Vilbert Lormat.

Ifølge samme arbeidsmåte som beskrevet foran måles likeledes den relative ekspresjonsmengden av RNAm som koder for lysyl-hydroksylase og for prolyl-hydroksylase etter 3 timers og 18 timers fibroblastdyrking i fravær av enhver behandling.

Resultatene kan ses i figurene IA og IB.

Det konstateres således at inkuberingen av fibroblaster i 3 timer i nærvær av Minoxidil eller Minoxidil-sulfat reduserer den relative ekspresjonsmengden av RNAm som koder for lysyl-hydroksylase, idet denne da er 0,75.

Etter 3 timers inkubering i nærvær av 2,4-DPO er den relative ekspresjonsmengden av RNAm som koder for lysyl-hydroksylase 0,55.

2,4-DPO inhiberer således ekspresjon av RNAm som koder for lysyl-hydroksylase mer enn Minoxidil eller dets sulfatanalog.

Det observeres analoge resultater etter 18 timers dyrkning i nærvær av de forskjellige testede inhibitorene.

Etter 3 timers dyrkning i nærvær av Minoxidil eller Minoxidil-sulfat øker for øvrig den relative ekspresjonsmengden av RNAm som koder for prolyl-hydroksylase, og når henholdsvis 1,25 og 1,85.

Etter 3 timers inkubering i nærvær av 2,4-DPO er den relative ekspresjonsmengden av RNAm som koder for prolyl-hydroksylase likeledes større, idet denne da er av størrelsesorden 1,3.

Etter 18 timers dyrkning i nærvær av Minoxidil, Minoxidil-sulfat eller 2,4-DPO er de relative ekspresjonsmengdene av RNAm som koder for prolyl-hydroksylase henholdsvis 1,6, 1,3 og 1,15.

Det observeres således ingen inhibering av den relative ekspresjonsmengden av RNAm som koder for prolyl-hydroksylase som respons på de tre forbindelsene.

De testede forbindelser har således en spesifikk inhiberende aktivitet på lysyl-hydroksylase.

II - Undersøkelse av effekten av 2 , 4 - DPO på det kollagennett

som foreligger i den ekstracellulære matrisen av fibroblaster under dyrking

Til en primær dyrking av humane hudfibroblaster som stammer fra en plastisk brystoperasjon i et DMEM-miljø tilsatt 10% kalvefoster-serum, tilsettes 10 ^m 2,4-DPO.

Etter 3 dager lyseres cellene ved hjelp av et hypo-osmotisk sjokk, og avsetningen av kollagen fikseres ved hjelp av en løsning av 5% glutaraldehyd.

Deretter observeres den ekstracellulære matrisen av

fibroblaster ved hjelp av et avsøknings-elektronmikroskop.

I et avsøknings-elektronmikroskop observeres likeledes den ekstracellulære matrisen av en primær kultur av ubehandlede fibroblaster.

Disse fotografiene vises i figurene 2 og 3.

Som det kan konstateres fra fotografiene på figurene 2 og 3, er den ekstracellulære matrisen av ubehandlede fibroblaster store fiberhoper, som omgir store områder uten kollagen-nett, mens den ekstracellulære matrisen av fibroblaster som er behandlet med 2,4-DPO, er en mer regulær organisasjon i hvilken det ikke observeres store fiberhoper og hvor størrelsen på områdene uten kollagennett er meget mer redusert.

Anvendelse av 2,4-DPO på en kultur av fibroblaster medfører således en romslig reorganisasjon til et mikro-nett av kollagenfibre.

EKSEMPLER FÅ TERAPEUTISKE PREPARATER

Eksempel 1; Hudkrem

Det fremstilles en hudkrem ved blanding av følgende ingredienser:

Eksempel 2: Hudlotion for pulverisering

Det fremstilles en hudlotion for pulverisering ved å blande følgende ingredienser:

Eksempel 3: Injiserbar løsning

Det fremstilles en injiserbar løsning for intradermal administrasjon ved blanding av følgende ingredienser:

Claims (9)

1. Anvendelse av 2,4-diamino-pyrimidin-3-oksyd (2,4-DPO) eller et av dets fysiologisk akseptable salter som aktiv substans for fremstilling av et terapeutisk preparat for farmasøytisk eller veterinær anvendelse, for behandling av sykdommer ved modning og strukturering av kollagen.

2. Anvendelse ifølge krav 1, der saltene er valgt blant dem som dannes av en syre av gruppen bestående av svovelsyre, saltsyre, fosforsyre, eddiksyre, benzosyre, salicylsyre, glykolsyre, aceteddiksyre, ravsyre, nikotinsyre, vinsyre, maleinsyre, metansulfonsyre, picrinsyre og melkesyre.

3. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, der nevnte preparat har en form som kan administreres topisk, transdermalt eller intradermalt.

4. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, der nevnte preparat har en form som kan administreres topisk, og hvor mengden 2,4-DPO er mellom 0,0001 og 5 vekt% i forhold til preparatets totalvekt.

5. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, der nevnte preparat har en form som kan administreres transdermalt, idet mengden 2,4-DPO er mellom 0,002 og 5 vekt% i forhold til preparatets totale vekt.

6. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, der nevnte preparat har en form som kan administreres intradermalt, idet mengden 2,4-DPO er mellom 0,0001 og 5 vekt% i forhold til preparatets totalvekt.

7. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, der nevnte preparat skal behandle kollagenmodningssykdommer hos mennesker.

8. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, der nevnte preparat skal behandle kollagenmodningssykdommer hos dyr.

9. Anvendelse ifølge krav 8, der dyret er en hesteart.