KR100250939B1

KR100250939B1 - 콜라겐 성숙 장애 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100250939B1
Application number: KR1019970701754A
Authority: KR
Inventors: 얀 마에; 리오넬 브흐똥; 쟝-밥티스트 갈리; 브뤼노 베르나르
Original assignee: 조지안느 플로; 로레알
Priority date: 1994-09-19
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 2000-05-01
Also published as: DE69525539T2; CA2199995C; ES2171550T3; MX9701996A; BR9508841A; EP0783307B1; US5846552A; FR2724561A1; PT783307E; FI971127A0; EP0783307A1; JP2945482B2; PL319279A1; AU3476595A; CA2199995A1; CN1070702C; CZ84297A3; JPH10506886A; HU223143B1; WO1996009048A1

Abstract

2,4-디아미노 피리미딘 3-옥사이드 또는 그의 생리학적으로 허용가능한 염을치료용 조성물의 활성 성분으로서 이용하는 방법이 개시되어 있다. 상기 치료용 조성물은 콜라겐의 성숙 및 구조 장애를 치료하는데 유용하다.

Description

[발명의 명칭

콜라겐 성숙 장애 치료용 조성물

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 콜라겐 성숙 및 구조 장애를 치료하기 위한 약학적 또는 수의학적조성물로서 2,4-디아미노피리미딘 3-옥사이드 또는 그의 염을 활성 성분으로 가지고 있는 조성물에 관한 것이다.

[배경기술]

프로콜라겐 다발은 조면 소포체(endoplasmic reticulum) 내에서 전프로콜라겐의 프롤릴 및 리실 잔기 소정 갯수를 하이드록실화시킨 다음, 골기체 내에서 하이드록시리실 잔기를 글리코실화시킴으로써 얻을 수 있다. 이러한 콜라겐의 성숙화가 다각도로 연구되고 있다.

따라서, 여러 유형의 고혈압 및 안드론젠성 탈모증의 치료에 사용되는 것으로 된 공지되어 있는 미녹시딜, 즉 2,4-디아미노-6-피페리디노피리미딘 3-옥사이드는 콜라겐의 성숙 과정에 참여하는 효소인 리실 하이드록실라아제의 특이적인 저해제로서 많이 연구되고 있다.

이와 관련하여, 머래드 등(Murad et al., Arch. of Biochem. Biophys., Vol. 292, No. 1, pp 234-238(1992) 및 Vol. 308, No. 1, pp. 42-47(1994))의 연구 결과, 리실 하이드록실라아제는 2,4-디아미노피리미딘 고리의 N-옥사이드 작용기에 대하여 파라 위치에 3차 아민기가 있어야 저해될 수 있으며 이러한 아민기가 미녹시딜에서는 피페리딘기인 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다.

사실상, 2,4-디아미노피리미딘 3-옥사이드(또는 이하에서는 2,4-DPO로 나타냄)는 2,4-디아미노피리미딘 고리의 N-옥사이드 작용기에 대하여 파라 위치에 3차아민기를 포함하고 있지는 않지만 리실 하이드록실라아제를 특이적으로 저해할 수 있다는 사실이 놀랍게도 그리고 예기치 않게 발견되기에 이르렀다.

이 화합물은 이미 국제특허공개공보 W0 92/01437호에 국소 투여에 의해 모발 손실을 치료할 수 있는 화장품용 치료제의 활성 성분으로서 개시된 바 있다. 그러나, 미녹시딜과는 달리, 2,4-DPO는 항고혈압성 효과를 전혀 가지지 않으며, 따라서 특히 안전성 면에서 만족스러우면서 미녹시딜과 동일하거나 심지어는 그 이상의 리실 하이드록실라아제 억제 활성을 갖는다.

그러므로, 본 발명은 사람 또는 동물의 콜라겐 성숙 장애를 치료할 수 있는 약학적 또는 수의학적 조성물 제조시에 2,4-DPO 또는 그의 염을 활성 성분으로서 사용하는 것을 목적으로 한다.

이하, "2,4-DPO"라는 용어는 2,4-DPO 자체만을 의미하는 것이 아니라 이하 정의되는 바와 같은 그의 염도 포함한다.

본 발명에 있어서, 콜라겐 성숙 장애는 바람직하지 않은 콜라겐의 모든 축적 형태, 특히 피부 조직 또는 구상 결막의 콜라겐 기질의 모든 구조적 장애를 의미하는 것으로 이해되어야 하는데, 이들 장애는 자연 발생적이거나 외상 또는 수술 후유증으로 인해 생길 수 있다. 이러한 장애중에서 특히 유리체 망막 증세, 전신성 공피증, 자외선에 의해 피부가 두꺼워지는 증상 및 반흔성 켈로이드를 들 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따른 2,4-DPO를 사용하면 특히 치료가 진행중인 환자의 외양을 개선할 수 있다.

한편, 본 발명에 따르면 이들 증상은 매우 효과적으로 치료될 수 있으나 콜라겐이 구조화된 다음 축적되는 중에는, 특히 반흔이 형성되는 중에는 예방 차원에서 사용되는 것이 바람직하다.

2,4-DP0는 국소 투여, 경피 투여 또는 피내 투여될 수 있는 형태로 제공되는 치료용 조성물의 제조시에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 생리학적으로 허용가능한 염이란 황산, 염산, 인산, 초산, 벤조산, 살리실산, 글리콜산, 아세트아미도아세트산, 숙신산, 니코틴산, 타르타르산, 말레인산, 메탄설폰산, 피크린산 및 젖산과 같은 산과의 부가염을 의미하는 것이다.

치료용 조성물이 국소 투여될 수 있는 형태로 존재하는 경우에 2,4-DPO의 비율은 조성물의 총중량을 기준으로 하여 통상 0.0001-5중량%, 바람직하게는 0.01-2중량%이다.

전달매체는 광범위하게 선택되어 사용될 수 있으나, 바람직하게는 활성 성분과 혼화성이 있는, 국소 투여용의 생리학적으로 허용가능한 매질이다.

이러한 매질 중에서 2,4-DPO는 용해된 상태, 또는 특히 마이크론 크기로 미세하게 분산된 형태일 수 있다.

생리학적으로 허용가능한 매질은 물 또는 물과 용매의 혼합물, 또는 용매의 혼합물로 이루어질 수 있다. 사용가능한 용매로는, 구체적으로 에탄올, 이소프로판올 및 t-부탄올과 같은 C₁-C₄저급 알콜; 알킬렌글리콜; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르 및 디에틸렌글리콜모노에틸에테르와 같은 알킬렌글리콜과 디알킬렌글리콜의 알킬에테르를 예로 들 수 있다. 국소 투여용 조성물은 적어도 하나의 통상적인 부가제 또는 활성성분(active principle)을 포함할 수도 있다.

그 예로는 구체적으로 메톡시신나메이트 및 벤조페논 유도체와 같은 UV-A 및 UV-B 스크리닝제(screening agent); DMSO, α-토코페롤, BHA, BHT 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제와 같은 항산화제 및/또는 유리 라디칼 제거제; 우레아, 글리세롤, 젖산, 하이드록시산, 티아모르폴리논과 그의 유도체 및 피롤리돈카르복실산의 유도체, 특히 그의 나트륨 및 칼륨염과 같은 수화제, 하이드로코르티손; β-메타손, 덱사메타손, 아세틸살리실산, 인도메타신, 이부프로펜, 비타민 D 또는 니플루민산과 같은 스테로이드성 및 비스테로이드성 소염제; 및 마크로라이드, 피라노사이드 및 테트라사이클린 군에 속하는 에리트로마이신과 같은 항균제를 들 수 있다.

이들 조성물은 또한 방부제, 안정화제, pH 조절제, 삼투압 조절제 및 에멀젼화제를 포함할 수 있다.

이들 조성물은 2,4-DPO를 주성분으로 하는 국소 투여용 조성물로서, 예를 들어 로션, 겔, 포말제, 소포 분산제, 스프레이 또는 에어로졸 포말제와 같은 여러가지 형태를 가질 수 있다.

또한, 이들 조성물은 겔화되거나 농축된 조성물의 형태일 수도 있다. 겔화된 조성물 중에 크산탄 검, 스클레로글루칸(scleroglucans) 또는 셀룰로오즈 유도체,특히 셀룰로오즈에테르와 같은 헤테로바이오폴리사카라이드로 겔화된 수성 조성물,또는 폴리하이드록시에틸아크릴레이트 또는 메타크릴레이트로 겔화된 수성 알콜 조성물을 들 수 있다. 농축된 수성 조성물로서는 특히 카보폴(Carbopol

, 굿리치사제조)이라는 상품명으로 시판되고 있는 것과 같은 다관능성 시약 (polyfunctional agent)에 의해 가교된 폴리아크릴산을 사용하여 얻어진 것을 들 수 있다. 그러나, 농후제로서는 약학적 또는 피부약학적으로 통상 사용될 수 있는 약제라면 어느 것을 사용하여도 무방함은 물론이다.

국소 투여시, 2,4-DPO는 통상 치료되어야 하는 신체의 일부분에 0.0001-5㎎/kg/1일, 바람직하게는 O.OO1-1㎎/kg/1일의 양으로 투여된다. 치료는 통상적으로 콜라겐의 축적이 일어나고 있는 기간동안 지속되는데, 바람직하게는 이 기간이 지나고도 90일 동안 지속적으로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 경피 투여하기 위한 치료용 조성물 제조시에도 2,4-DPO를 사용할 수 있다.

이때, 2,4-DP0의 비율은 통상 조성물의 총중량을 기준으로 하여 0.001-5중량%, 바람직하게는 0.01-2중량%이다.

이들 조성물에서 사용되는 부형제는, 필요에 따라서는 침투 촉진제가 첨가된비닐 중합체 또는 공중합체로부터 선택될 수 있다.

경피 투여용의 조성물은 피부에 접착되어 피부를 통하여 제어된 량의 활성성분이 적어도 24시간 동안 혈류에 지속적으로 공급되도록 하는 자기 접착 시스템(self-adhesive system)을 이용하여 투여될 수 있다.

이러한 시스템으로는 특히 틸덤 캄파니(Tilderm Company)에 의해 시판되고 있는 것뿐 아니라 프랑스 특허출원 FR 88/11685호(특허 제2,635,979호)에 개시된 것들을 예로 들 수 있다.

또한, 2,4-DPO는 피내 투여하기 위한 치료용 조성물의 제조시에도 사용될 수 있다.

2,4-DPO의 함량비는 통상 조성물의 총량을 기준으로 하여 0.0001-5중량%, 바람직하게는 0.01-1중량%이다.

이때, 2,4-DPO는 생리식염수와 같은 생리학적으로 허용가능한 전달매체에 용해된 용액의 형태이다.

피내 투여하기 위한 조성물은, 예를 들어 항균제, 항산화제, 및 스테로이드성 및 비스테로이드성 소염제와 같은 각종 치료제를 더 포함할 수 있다.

2,4-DPO는 통상 5㎎/kg/1일, 바람직하게는 0.0001-lmg/㎏/1일을 초과하지 않는 범위내에서 피내 투여된다. 치료는 통상 콜라겐의 축적이 일어나는 기간 동안 실시되며, 필요하다면 상기 기간이 지난 후에도 30일 동안은 지속적으로 이루어질 수 있다.

약학적으로 적용하기 위한 조성물에 대하여 구체적으로 언급하기는 하였으나이들 조성물은 수의학적인 용도, 특히 말과 같은 말과의 동물의 치료시에 사용될 수 있는 적당한 리실로 제형화될 수 있다.

의도하는 투여 또는 적용 방식에 관계없이, 본 발명에 따른 조성물은 공지의 방법에 따라 제조된다.

2,4-DPO뿐 아니라 여러 종류의 치료학적 조성물의 효능을 나타낼 수 있는 연구 결과를 들어 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다.

I. 리실 하이드록실라아제(LH)를 코딩하는 mRNA의 발현 저해에 대한 연구

사람 모발의 외부 결합조직초로부터 유래하는 섬유아세포의 계대 배양물로부터 얻어진 2×10⁵개의 섬유아세포를, 2mM의 L-글루타민, 1mM의 소듐 피루베이트, 100유니트/㎖의 페니실린 G, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신 S, 250mg/㎖의 암포테리신 및 10%의 태내 송아지의 혈청(Company Gibco BRL 제품)이 첨가된 둘베코의 변형된 이글 배양배지(Dulbecco,s modified Eagle's culture medium)가 들어있는 직경 60mm의 페트리디쉬에 접종한다.

37℃ 및 95% 공기/5% CO₂분위기의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후, 상기 배지를 태내 송아지 혈청이 들어있지 않은 것을 제외하고는 상기 배지와 유사한 다른 배지로 교체한다. 이어서, 세포를 5mM의 미녹시딜, 5mM의 2,4-DPO 또는 5mM의 미녹시딜 설페이트 존재하에 37℃에서 3시간 동안(도1a) 또는 18시간 동안(도1b) 배양한다.

참조문헌(Short protocols in molecular biology, Harvard Medica1 School, J . Wiley and Sons publisher, 1992)에 기재된 방법에 따라서, 전체 RNA를 각각의 세포 배양물로부터 추출한 다음, 280nm에서 UV 분광광도 측정을 실시하여 정량분석한다.

mRNAs의 발현을 분석하기 위하여 중합 사슬 반응(polymerization chain reaction: PCR)에 의해 mRNA를 증폭시킨다.

각각의 세포 배양물로부터 얻어진 2㎍의 전체 RNA로부터, 역전사 키트(상품명 : First Strand C-DNA Synthesis Kit, Pharmacia LKB Biotechnology AB. 제품)를 이용하여 상보적 DNA를 시험관에서 합성한다. 이어서, 상기에서 얻어진 소정량의 상보적 DNA를 하기와 같은 리실 하이드록실라아제(LH) 및 프롤릴 하이드록실라아제(PH)에 대한 특이 프라이머의 존재하에서 PCR 방법에 의해 증폭시킨다(최종부피 : 50㎕):

LH 센스 프라이머 : 5' GAAATGGGCCATGTGAGAGCG 3'

LH 안티센스 프라이머 : 5' TGTGGATGACAATAGTCGGCACG 3'

PH 센스 프라이머 : 5' GTGGATGGAACAAGCCCTAAGGC 3'

PH 안티센스 프라이머 : 5' CCTCCCCACGGCACAGCATTTCG 3'.

PCR 후에 얻어진 20㎕의 혼합물을 O.5㎍/㎖의 에티듐 브로마이드 및 1 × 트리스-아세테이트 EDTA(TAE) 전기영동 버퍼의 존재하에서 2% 아가로오스 전기영동 겔에 주입한다.

10OV의 전계에서 1시간동안 넣어둔 후에, 리실 하이드록실라아제 및 프롤릴하이드록실라아제를 코딩하는 mRNA에 각각 상응하는 밴드의 강도를 이미지 분석기및 소프트웨어(상품명 : Bioprofil

, Vilbert Lourmat 제품)를 이용하여 정량적으로 분석한다.

상술한 바와 동일한 방법에 따라서, 아무런 처리도 되지 않은 섬유아세포를배양한지 3시간 및 18시간 후의 리실 하이드록실라아제 및 프롤릴 하이드록실라아제를 코딩하는 mRNA의 상대적 발현도를 측정한다.

이 결과가 도1a 및 도1b에 나타나 있다.

그 결과, 섬유아세포를 미녹시딜 또는 미녹시딜 설페이트의 존재하에 3시간동안 배양하면 리실 하이드록실라아제를 코딩하는 mRNA의 상태적 발현도가 감소하여 0.75가 된다는 것을 알 수 있다.

2,4-DPO의 존재하에 3시간 동안 배양후 리실 하이드록실라아제를 코딩하는 mRNA의 상대적 발현도는 0.55이다.

즉, 2,4-DPO는 미녹시딜 또는 그의 설페이트 유도체에 비해 리실 하이드록실라아제를 코딩하는 mRNA의 발현을 더 억제한다.

여러 종류의 저해제의 존재하에 18시간 동안 배양한 후에도 유사한 결과가 관찰된다.

또한, 미녹시딜 또는 미녹시딜 설페이트의 존재하에 3시간 동안 배양후 프롤릴 하이드록실라이제를 코딩하는 mRNA의 상대적 발현도는 각각 1.25 및 1.85로 높아진다.

2,4-DPO의 존재하에 3시간 동안 배양한 후에 프롤릴 하이드록실라아제를 코딩하는 mRNA의 상대적 발현도 역시 높아져서 1.3 정도가 된다.

미녹시딜 또는 미녹시딜 설페이트, 또는 2,4-DP0의 존재하에서 18시간 동안배양한 후에 프롤릴 하이드록실라아제를 코딩하는 mRNA의 상대적 발현도는 각각 1.6, 1.3 및 1.15로 나타난다.

즉, 이들 세가지 화합물에 의해 프롤릴 하이드록실라아제를 코딩하는 mRNA의 상대적 발현도는 전혀 저해되지 않는 것을 알 수 있다.

따라서, 테스트된 화합물은 리실 하이드록실라아제에 대하여만 특이적인 억제 활성을나타낸다.

II. 배양물의 섬유아세포의 세포외 간질에 존재하는 콜라겐 네트워크 상에서의 2,4-DPO의 효과에 대한 연구

1O%의 태내 송아지 헐청이 첨가된 DMEM 배지에서 배양된, 유방성형시에 얻어지는 물질로부터 유래하는 인간의 피부 섬유아세포의 1차 배양물에 10μM의 2,4-DPO를 첨가한다.

3일후, 저삼투압 충격을 주어 세포를 용혈시키고 콜라겐 침적물을 5% 글루타르알데하이드 용액으로 고정시킨다.

이어서, 섬유아세포의 세포외 간질을 주사 전자현미경으로 관찰한다.

미처리된 섬유아세포의 1차 배양물의 세포외 간질 역시 주사 전자현미경으로 관찰한다.

이 사진이 도2 및 3에 나타나 있다.

도2 및 도3에 나타낸 사진에서 보여지는 바와 같이, 미처리된 섬유아세포의 세포외 간질은 콜라겐 네크워크가 없는 넓은 영역을 둘러싸는 커다란 섬유상 덩어리를 나타내는 반면에, 2,4-DPO로 처리된 섬유아세포의 세포외 간질은 커다란 섬유 덩어리가 발견되지 않으며 콜라겐 네트워크가 없는 부분의 크기가 훨씬 작고 보다 더욱 규칙적으로 조직화되어 있는 것으로 나타나 있다.

따라서, 2,4-DPO를 섬유아세포의 배양물에 가하면 콜라겐 섬유의 공간적 재배열이 일어나 마이크로 네트워크 구조로 된다.

[실시예]

치료용 조성물의 예

[실시예 1 : 스킨 크림]

하기의 성분을 혼합하여 스킨 크림 10Og을 제조한다:

- 2,4-DPO 0.5g

- 세테아레트30(Ceteareth 30) 7g

- 글리세릴 스테아레이트 2g

- 세틸알콜 1.5g

- 폴리디메틸실록산 1.5g

- 액상 파라핀 15g

- 글리세롤 코덱스, 정제품 20g

- 방부제 적당량

- 탈이온수 나머지량

[실시예 2 : 스프레이용 스킨 로션]

하기의 성분들을 혼합하여 스프레이용 스킨 로션 10Og을 제조한다:

- 2,4-DPO 0.25g

- 에탄올 30g

- 탈이온수 나머지량

[실시예 3 : 주사제]

하기의 성분들을 혼합하여 피내 주사용 용액 1㎖을 제조한다:

- 2,4-DPO 0.7㎎

- 생리식염수(9g NaCl/100㎖나 수용액) 나머지량

Claims

(정정) 2,4-디아미노피리미딘 3-옥사이드(2,4-DPO) 및 그의 생리학적으로 허용가능한 염을 활성성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 사람 또는 동물의 콜라겐 성숙 및 구조 장애 치료용 약학적 또는 수의학적 조성물.
(정정) 제1항에 있어서, 상기 염이 황산, 염산, 인산, 초산, 벤조산, 살리실산, 글리콜산, 아세트아미도아세트산(aceturic acid), 숙신산, 니코틴산, 타르타르산, 말레인산, 메탄설폰산, 피크린산 및 젖산으로 이루어진 군으로부터 선택된 산과의 부가염으로부터 선택되는 것을 특징으로 조성물.
(정정) 제1항에 있어서, 국소 투여, 경피 투여 또는 피내 투여될 수 있는 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
(정정) 제1항 내지 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 조성물이 국소 투여될 수 있는 형태로 되어 있으며, 2,4-DP0의 비율이 조성물의 총량을 기준으로 하여 0.0001 내지 5중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
(정정) 제4항에 있어서, 상기 2,4-DPO의 비율이 조성물의 총량을 기준으로 하여 0.01 내지 2중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
(정정) 제1항 내지 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 조성물이 경피 투여될 수 있는 형태로 되어 있으며, 2,4-DPO의 비율이 조성물 총량을 기준으로 하여 0.001 내지 5중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
(정정) 제6항에 있어서, 상기 2,4-DPO의 비율이 상기 조성물의 총량을 기준으로 하여 0.01 내지 2중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
(정정) 제1항 내지 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 조성물이 내피 투여될 수 있는 형태로 되어있으며, 2,4-DPO의 비율이 조성물 총량을 기준으로 하여 0.0001-5중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
(정정) 제8항에 있어서, 상기 2,4-DPO의 비율이 상기 조성물의 총량을 기준으로 하여 0.01-1중량%인 것을 특징으로 하는 2,4-DPO 및 그의 생리학적으로 허용가능한 염.
(정정) 제1항에 있어서, 상기 동물이 말과에 속하는 동물인 것을 특징으로 하는 조성물.