HU223143B1

HU223143B1 - 2,4-Diamino-pirimidin-3-oxid és sói alkalmazása a kollagénérés és strukturálódás rendellenességei kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására

Info

Publication number: HU223143B1
Application number: HU9701236A
Authority: HU
Inventors: Bruno Bernard; Lionel Breton; Jean-Baptiste Galey; Yann Mahe
Original assignee: L'oreal
Priority date: 1994-09-19
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 2004-03-29
Also published as: FI971127A0; PL319279A1; JPH10506886A; CN1070702C; FR2724561A1; CZ84297A3; FR2724561B1; BR9508841A; KR970705998A; WO1996009048A1; DE69525539T2; ES2171550T3; AU691336B2; DE69525539D1; CA2199995C; CA2199995A1; CN1159755A; RU2153874C2; NO311784B1; FI971127A

Abstract

A találmány tárgya hatóanyagként 2,4-diamino-pirimidin-3-oxid(rövidítve 2,4-DPO) és sói alkalmazása gyógyszerészeti vagyállatgyógyászati, a kollagén érése és strukturálódása rendellenességeikezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására. ŕ

Description

A találmány tárgya hatóanyagként 2,4-diamino-pirimidin-3-oxid (rövidítve 2,4-DPO) és sói alkalmazása gyógyszerészeti vagy állatgyógyászati, a kollagén érése és strukturálódása rendellenességei kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.

A natív prokollagénnyalábok kialakulásához a durva endoplazma hálózat belsejében lévő preprokollagén bizonyos számú prolii- és lizilcsoportjainak hidroxilezése, majd a hidroxi-lizil-csoportok Golgi-készülékben történő glikozilezése szükséges. A kollagén ezen érési folyamatával számos tanulmány foglalkozik.

így például számos tanulmány foglalkozik a minoxidillel, ami a 2,4-diamino-6-piperidino-pirimidin-3-oxid, és amelyről ismert, hogy bizonyos magas vérnyomások kezelésére, továbbá androgén hajhullás kezelésére használatos, mint a lizil-hidroxiláz, vagyis a kollagén érési folyamatában szerepet játszó enzim specifikus inhibitorával.

így például Murád és munkatársai vizsgálatai [lásd Arch. of Biochem. Biophys. Vol. 292, 1, 234-238 (1992) és Vol. 308,1, 42-47 (1994)] kimutatták, hogy a lizil-hidroxiláz gátlásához egy olyan tercier aminocsoport jelenléte szükséges, amely a 2,4-diamino-pirimidin-gyűrű N-oxid-csoportjával para-helyzetű, és hogy előnyösen ez a csoport egy piperidincsoport, mint ahogy az a minoxidilben van.

Meglepő és teljesen váratlan módon azt tapasztaltuk, hogy a 2,4-diamino-pirimidin-3-oxid annak ellenére, hogy nem tartalmaz a 2,4-diamino-pirimidin-gyűrű N-oxid-csoportjával para-helyzetben tercier aminocsoportot, specifikus módon gátolja a lizil-hidroxilázt.

Ez a vegyület már ismert a WO 92/01437 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésből, ott kozmetikai kezelésre használható hatóanyagként írták le, amelyet helyileg kell alkalmazni a hajhullás ellen. A minoxidillel ellentétben azonban a 2,4-DPO semmilyen vérnyomáscsökkentő hatással nem rendelkezik, tehát tökéletesen ártalmatlan amellett, hogy a lizil-hidroxiláz-gátló hatása legalább akkora, sőt nagyobb, mint a minoxidilé.

A találmány tárgya tehát hatóanyagként 2,4-diamino-pirimidin-3-oxid (rövidítve 2,4-DPO) és sói alkalmazása gyógyszerészeti vagy állatgyógyászati, a kollagén érése és strukturálódása rendellenességei kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, amelyet embernél vagy államál lehet használni.

A leírásunkban az elkövetkező részben a „2,4DPO” kifejezésen nemcsak magát a 2,4-DPO-t, hanem a későbbiekben meghatározandó sóit is értjük.

A kollagénérési zavarokon a találmány szerint minden olyan kollagén nemkívánatos felhalmozódást értünk, közelebbről minden olyan rendellenességet, amely a bőrszövet vagy a szemkötőszövet kollagén mátrixának a szerkezetében előfordulhat; az ilyen rendellenességek lehetnek spontán, baleseti vagy műtét utáni eredetűek. Az ilyen rendellenességek közül példaként a következőket említhetjük: üveges recehártya-bántalom, keményedéses bőrgyulladás, ultraibolya sugarak által kiváltott bőrvastagodás és hegdaganat.

A találmány szerinti 2,4-DPO alkalmazás tehát a kezelt beteg esztétikai javulását teszi lehetővé.

Habár a találmány szerint a kezelés lehet gyógyító célú is, mindazonáltal előnyösen megelőző célból végezzük a kezelést, vagyis abban az időszakban, amikor a kollagén strukturálódása, következésképpen a felhalmozódása végbemegy, ez pedig a hegképződés időszaka.

A 2,4-DPO felhasználható helyileg, transzdermálisan vagy intradermálisan adagolható gyógyszerkészítmény előállítására.

Fiziológiailag alkalmazható són a találmány értelmében a savaddíciós sókat, például a következő savakkal alkotott addíciós sókat értjük: kénsav, sósav, foszforsav, ecetsav, benzoesav, szalicilsav, glikolsav, borostyánkősav, nikotinsav, borkősav, maleinsav, metánszulfonsav, pikrinsav és tejsav.

Amikor a gyógyszerészeti készítmény helyileg adagolható formában van kiszerelve, a 2,4-DPO-tartalma általában 0,0001 és 5 tömeg%, előnyösen 0,01 és 2 tömeg% közötti a készítmény összes tömegére vonatkoztatva.

A vivőanyag nagyon változatos lehet, előnyösen olyan fiziológiailag alkalmazható közeg, amely helyi alkalmazásra használható, és amely természetesen kompatibilis a hatóanyaggal.

A 2,4-DPO ebben a közegben előfordulhat oldott állapotban vagy diszpergált, például mikronizált állapotban.

A fiziológiailag alkalmazható közeg állhat vízből vagy víz és oldószer elegyéből vagy oldószerelegyből. Az oldószerek közül, amelyek használhatók, például az 1 -4 szénatomos alkoholokat, például az etanolt, izopropanolt, tercier butanolt említhetjük, továbbá az alkilénglikolokat, az alkilénglikol-alkil-étereket, a dialkilénglikol-alkil-étereket, például az etilénglikol-monoetil-étert, a propilénglikol-monometil-étert vagy a dietilénglikolmonoetil-étert. Az ilyen helyi alkalmazásra szánt készítmények tartalmazhatnak egy vagy több szokásos adalékot vagy egy másik hatóanyagot is.

Ezek közül megemlíthetjük az UV-A és UV-B szűrőket, például a metoxi-cinnamátokat vagy a benzofenonszármazékokat, továbbá az antioxidánsokat és/vagy a szabadgyök-elnyelő anyagokat, például a DMSO-t, az α-tokoferolt, a BHA-t, a BHT-t, a bizmutáz-szuperoxidot, a hidratálószereket, például a karbamid-glicerin-tejsav-hidroxisavak, tiamorfolinon és származékai, pirrolidonkarbonsav és származékai, például nátrium- vagy káliumsója, a szteroid és nem szteroid gyulladásgátló szereket, például a hidrokortizon, a β-metazon, a dexametazon, az acetil-szalicilsav, indometacin, izoprofén, Dvitamin vagy nifluminsav, és a baktériumellenes szereket, amelyek tartozhatnak a makrolidok, a piranozidok vagy a tetraciklinek csoportjába, például az eritromicin.

A készítmények tartalmazhatnak ezenkívül konzerválószereket, stabilizálószereket, pH-szabályozókat, ozmózisnyomás-módosító és emulgeálószereket is.

Az ilyen 2,4-DPO-t tartalmazó, helyileg alkalmazandó készítmények különböző formákban fordulhatnak elő, például folyadék, gél, hab, vezikuláris diszperzió, spray vagy aeroszolhab formában.

A készítmények előfordulhatnak gélesített vagy sűrített készítmény formájában is. A gélesített készítmények közül megemlíthetjük azokat a főként vizes készít2

HU 223 143 Bl ményeket, amelyeket heterobiopoliszacharidokkal, például xantángumival, szkleroglükánnal vagy cellulózszármazékkal, főként cellulóz-éterrel gélesítünk, továbbá a vizes alkoholos készítményeket, amelyeket polihidroxi-etil-akriláttal vagy -metakriláttal gélesítünk. A sűrített vizes készítmények közül példaként azokat említhetjük, amelyeket valamely többfunkciós szerrel térhálósított poliakrilsawal állítunk elő, mint amilyenek például a Goodrich cég Carbopol® kereskedelmi néven forgalmazott termékei. Természetesen azonban sűrítőszerként bármely egyéb, a gyógyszerészeiben vagy bőrgyógyászatban szokásosan használt sűrítőszer alkalmazható.

Helyileg a 2,4-DPO-t általában a kezelendő testrészre visszük fel napi 0,0001-5 mg/kg, előnyösen 0,001-1 mg/kg dózisban. A kezelést általában mindazon időtartam alatt folytatjuk, amíg a kollagénfelhalmozódás képződik, és adott esetben folytatható ezután még 90 napig.

A találmány szerint a 2,4-DPO-t felhasználhatjuk olyan gyógyszerészeti készítmények előállítására is, amelyeket transzdermálisan adagolunk.

A 2,4-DPO-arány ilyenkor általában 0,01 és 5 tömeg% közötti, előnyösen 0,01 és 2 tömeg% közötti a készítmény összes tömegére vonatkoztatva.

Az ilyen készítményekben alkalmazott vivőanyag általában valamely vinil vagy más kopolimer, amelyhez adott esetben penetrációt elősegítő szert is adagolunk.

A transzdermális alkalmazásra szánt készítményeket például a bőrhöz ragadó öntapadós rendszer segítségével adagolhatjuk, amelyek legalább 24 órán keresztül biztosítják, hogy a bőrön keresztül a vérkeringésbe szabályozott mennyiségű hatóanyag folyamatos leadása történjen.

Az ilyen rendszerek közül példaként megemlíthetjük azokat, amelyek az FR-8811685 (2,635,979) számú szabadalmi bejelentésben szerepelnek, továbbá amelyeket a Tildéim cég hoz kereskedelmi forgalomba.

A 2,4-DPO-t olyan gyógyászati készítmények előállítására is felhasználhatjuk, amelyek intradermális úton adagolandók.

A 2,4-DPO-tartalom ilyenkor általában 0,0001 és 5 tömeg% közötti, előnyösen 0,01 és 1 tömeg% közötti a készítmény összes tömegére vonatkoztatva.

A 2,4-DPO ilyenkor a fiziológiailag alkalmazható vivőanyagban, például a fiziológiás oldatban oldható formában van.

Az intradermális adagolásra alkalmas készítmények tartalmazhatnak különböző gyógyhatású anyagokat, például baktériumellenes szereket, antioxidánsokat, valamint szteroid és nem szteroid gyulladásgátló hatóanyagokat.

A 2,4-DPO-t általában intradermálisan 5 mg/kg/nap vagy ennél kisebb dózisban, előnyösen 0,0001 és 1 mg/kg/nap dózisban adagoljuk. A kezelést általában azon teljes periódus alatt végezzük, ami alatt a kollagén felhalmozódik, és adott esetben még ezután 30 napig folytathatjuk.

Bár az eddigiekben főként gyógyszerészeti célra szolgáló készítményről beszéltünk, magától értetődik, hogy a készítményeket olyan formában is kiszerelhetjük, amely alkalmasabb az állatgyógyászati felhasználásra, elsősorban lófélék, például ló kezelésére.

A találmány szerinti készítmények függetlenül az adagolás módjától vagy a felhasználási céltól, ismert eljárásokkal állíthatók elő.

Az alábbiakban illusztráció céljából megadunk néhány vizsgálati eredményt, amely a 2,4-DPO hatékonyságát igazolja, továbbá néhány készítmény-előállítási példát ismertetünk.

1. Lizil-hidroxilázt (LH) kódoló mRNS-expresszió gátlásának vizsgálata

Emberi haj külső kötőszöveti hüvelyéből származó, öt lépésben szubklónozott fibroblaszttenyészetből 2 χ 10⁵fibroblasztot 60 mm átmérőjű Petri-csészére szélesztünk, amely Dulbecco szerint módosított „Eagle” tápközeget tartalmaz, és a következőkkel van kiegészítve: 2 mmol L-glutamil, 1 mmol nátrium-piruvát, 100 egység/ml penicillin-G, 100 pg/ml sztreptomicin-S, 250 mg/ml amfoterin és 10% borjú-magzatiszérum, amelyet a Gibco BRL cég forgalmaz.

A tenyészetet 24 órán keresztül 37 °C-on 95% levegő/5% CO₂-gázáramban inkubáljuk, majd a tápközeget egy olyan analóg közeggel helyettesítjük, amely abban tér el, hogy nem tartalmaz borjú magzati szérumot. Ezután a sejteket 37 °C-on 3 órán keresztül (ezt az 1A. ábrán mutatjuk be), vagy 18 órán keresztül (lásd 1B. ábra) inkubáljuk, 5 mmol minoxidil, 5 mmol 2,4-DPO vagy 5 mmol minoxidil-szulfát jelenlétében.

A „Short protocoles in molecular biology, Harvard medical school, J. Willey ans Sons publisher, 1992” irodalmi helyen ismertetett eljárással valamennyi sejtpreparátumból kivonjuk az összes RNS-t, majd UV-spektrofotometriás eljárással 280 nm-en meghatározzuk a mennyiségét.

Az mRNM-expresszió analizálhatósága érdekében amplifikálást végzünk polimerizációs láncreakcióval (PCR).

Két pg előzőek szerint kapott összes RNS-ből minden sejtpreparátumra in vitro előállítjuk a komplementer DNS-t egy reverz transzkripciós kitt segítségével, amelyet a Société Pharmacia LKB Biotechnology AB. cég „First Strand C-DNA Synthesis kit” néven hoz forgalomba. Az így előállított komplementer DNS aliquot mennyiségét azután amplifikáljuk magával a PCReljárással a következő lizil-hidroxiláz (LH) és prolilhidroxiláz (PH) specifikus láncindítói jelenlétében:

LH szensz láncindító: 5’GAAATGGGCCATGTGAGAGCG3’,

LH antiszensz láncindító: 5’TGTGGATGACAATAGTCGGCACG3’,

PH szensz láncindító: 5’GRGGATGGAACAAGCCTAAGGC3’,

PH antiszensz láncindító: 5’CCTCCCCACGGCACAGCATTTCG3’ pl teljes térfogatra.

pl PCR után kapott keveréket gélelektroforézisnek vetünk alá 2% agarózon 0,5 pg/ml etidium-bromid és EDTA-Trisz-acetát (TAE) 1 χ elektroforézis puffer jelenlétében.

HU 223 143 Bl

Egy órán keresztül 100 V elektromos mezőben történő migrálás után elemezzük a lizil-hidroxilázt, illetve a prolil-hidroxilázt kódoló mRNS-nek megfelelő sávok intenzitását, és meghatározzuk ebből a mennyiségeket a Société Vilbert Lourmat cég által „Bioprofil®” kereskedelmi név alatt forgalomba hozott szoftver és egy képanalizátor segítségével.

Az előzőekben ismertetett módon mérjük meg a lizil-hidroxilázt és a prolil-hidroxilázt kódoló mRNSre vonatkozó expressziófokot 3 óra és 18 óra elteltével a fíbroblaszttenyészetben mindenféle kezelés nélkül.

Az eredményeket az 1A. és IB. ábrán tüntetjük fel.

Megfigyelhető tehát, hogy a fibroblaszt inkubálása 3 órán keresztül minoxidil vagy minoxidil-szulfát jelenlétében csökkenti a lizil-hidroxilázt kódol mRNS-re vonatkozó expressziófokot, ez ekkor 0,75.

A 2,4-DPO jelenlétében végzett 3 órás inkubálás után a lizil-hidroxilázt kódoló mRNS-re vonatkozó expressziófok 0,55.

A 2,4-DPO tehát jobban gátolja a lizil-hidroxilázt kódoló mRNS-expressziót, mint a minoxidil vagy szulfátéit analógja.

Analóg eredményeket figyelhetünk meg a különböző vizsgált inhibitorok jelenlétében végzett 18 órás tenyészet után is.

Egyébként 3 órás minoxidil vagy minoxidil-szulfát jelenlétében végzett tenyészet után a prolil-hidroxilázt kódoló mRNS-re vonatkozó expresszió foka növekszik, 1,25, illetve 1,85 értéket ér el.

Három órán keresztül 2,4-DPO jelenlétében végzett inkubálás után a prolil-hidroxilázt kódoló mRNS-re vonatkozó expressziófok szintén magasabb, kb. 1,3 értéket ér el.

órán keresztül minoxidil vagy minoxidil-szulfát vagy 2,4-DPO jelenlétében végzett tenyészet után a prolil-hidroxilázt kódoló mRNS-re vonatkozó expressziófok 1,6,1,3, illetve 1,15 a fenti sorrendben.

A prolil-hidroxilázt kódoló mRNS-re vonatkozó expressziófok gátlása tehát ezen három vegyület esetén nem figyelhető meg.

A vizsgált vegyületek tehát specifikusan a lizil-hidroxilázt gátló hatással rendelkeznek.

II. 2,4-DPO hatásának vizsgálata a tenyészetben lévő fibroblasztok extracelluláris mátrixában jelen lévő kollagénhálózatra

Emlőplasztidból származó emberi bőr fibroblaszt primer tenyészetéhez 10% boíjú-magzatiszérummal kiegészített DMEM-tápközegbe 10 pmol 2,4-DPO-t adagolunk.

Három nap elteltével a sejteket hipoozmotikus sokk segítségével feloldjuk, és a kollagénlerakódást 5%-os glutáraldehid-oldattal rögzítjük.

Ezután a fibroblasztok extracelluláris mátrixát pásztázó elektronmikroszkóp segítségével megfigyeljük.

Ugyancsak pásztázó elektronmikroszkóp segítségével megfigyeljük a nem kezelt fibroblaszt primer tenyészet extracelluláris mátrixát.

Az így készített fényképfelvételeket a 2. és 3. ábrán mutatjuk be.

Amint az a 2. és 3. ábrán lévő fényképek alapján megállapítható, a nem kezelt fibroblasztok extracelluláris mátrixában nagy rostos halmazok vannak, amelyek kollagénháló-mentes nagy területeket vesznek körül, míg a 2,4-DPO-val kezelt fibroblasztok extracelluláris mátrixában sokkal szabályosabb az elrendeződés, nem figyelhetők meg nagy rosthalmazok, és a kollagénhálómentes területek sokkal kisebbek.

A fibroblaszttenyészeten alkalmazott 2,4-DPO tehát a kollagénrostok mikrohálózatának térbeli átrendeződését eredményezi.

A következőkben megadjuk néhány gyógyszerészeti készítmény előállításának módját.

1. példa

Bőrkrém

Bőrre alkalmazandó krémet állítunk elő a következő komponensek összekeverésével:

2,4-DPO 0,5 g

Ceteareth 30 7 g gliceril-sztearát 2 g cetil-alkohol 1,5 g polidimetil-sziloxán 1,5 g paraffinolaj 15 g tiszta, gyógyszerkönyvi minőségű glicerin 20 g konzerválószerek q. s.

ionmentes víz q. s. p. 100 g

2. példa

Porlasztható, bőrre alkalmazandó folyadék Porlasztható, bőrre alkalmazandó folyadékot állítunk elő a következő komponensek összekeverésével: 2,4-DPO 0,25 g etanol 30 g ionmentes víz q. s. p. 100 g

3. példa

Injektálható oldat

Intradermálisan injektálható oldatot állítunk elő a következő komponensek összekeverésével:

2,4-DPO 0,7 mg fiziológiás sóoldat (9 g NaCl/H₂O q. s. p. 100 ml) q. s. p. 1 ml

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Hatóanyagként 2,4-diamino-pirimidin-3-oxid (rövidítve 2,4-DPO) és sói alkalmazása gyógyszerészeti vagy állatgyógyászati, a kollagén érése és strukturálódása rendellenességei kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy sóként egy, a következőkben felsorolt savval alkotott savaddíciós sót alkalmazunk: kénsav, sósav, foszforsav, ecetsav, benzoesav, szalicilsav, glikolsav, borostyánkősav, nikotinsav, borkősav, maleinsav, metánszulfonsav, pikrinsav vagy tejsav.

HU 223 143 Bl
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a készítmény helyileg, transzdermális vagy intradermálisan adagolható formában van.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a készítmény helyileg adagolható formában van, a 2,4-DPO-tartalom 0,0001-5 tömeg%, előnyösen 0,01-2 tömeg% a készítmény összes tömegére vonatkoztatva.
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a készítmény transzdermálisan adagolható formában van, és a 2,4-DPO-arány 0,01 és 5 tömeg% közötti, előnyösen 0,01 és 2 tömeg% közötti a készítmény összes tömegére vonatkoztatva.
6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a készítmény intradermálisan adagolható formában van, és a 2,4-DPO-tartalom 0,0001 és 5 tömeg% közötti, előnyösen 0,01 és 1 tömeg% közötti a készítmény összes tömegére vonatkoztatva.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a készítmény embernél kollagénérési rendellenességek kezelésére szolgál.
8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a készítmény állatnál kollagénérési rendellenességek kezelésére szolgál.
9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az állat valamely lóféle.