NO311646B1 - Androstenderivater - Google Patents

Description

Teknisk område for oppfinnelsen:

Oppfinnelsen vedrører nye androstenderivater med anti-inflammatorisk aktivitet, farmasøytiske blandinger omfattende disse derivater, nye kjemiske mellomprodukter som er nyttige ved fremstilling av disse derivater, og fremgangsmåter ved administrering av disse derivater til pattedyr ved behandling av betennelse.

Teknikkens stand;

Topisk eller en annen lokal påføring av sterke glukokortikoider kan føre til sterke toksiske virkninger så som Cushingske symptomer, undertrykking av hypofyse/binyrer, hudatrofi, immunosuppresjon og hemming av sårgroingen. Andre typer toksiske responser, så som allergier og katar-rer, har resultert etter langvarig bruk av legemidler av denne type.

En oftalmisk påføring av glukokortikosteroider er forbundet med ytterligere problemer. Beskyttelsesmekanismene som er bygget inn i øyet, tillater kun små mengder av doser som påføres øyet, å nå det tilsiktede sted innen øyet. Generelt vil over 90% av den påførte dose finne sin vei inn i den generelle sirkulasjon. Dette fører i sin tur til alvorlige bivirkninger av den ovennevnte type. Videre forekommer en alvorligere og mer spesiell bivirkning når disse legemidlene brukes i øyet, og dette er et økt intraokulært trykk (IOP). Kortikosteroid-indusert kronisk eller akutt glaukom er faktisk blitt beskrevet helt siden begynnelsen av 1960-tallet. Generelt trenges kortikosteroidet kun topisk for å begrense betennelsen. Imidlertid er absorbert steroid an-svarlig for de ovennevnte alvorlige bivirkninger. Man tror at virkningen av kort ikosteroid på vannutskillingsbanen og glykosaminoglykaner (GAG'er) i omkringliggende vev er viktig i utviklingen av glukokortikoid-indusert okulær nypertensjon.

Det finnes derfor et alvorlig behov for sterke lokale anti-inflammatoriske steroider som mangler systemisk aktivitet, og som derfor ikke fører til de alvorlige systemiske bivirkninger som forbindes med legemidler av denne type.

De naturlige glukokortikosteroider og flere av deres handelstilgjengelige derivater er A<4-> og A<1,4->pregnener med 21-hydroksy-substituenter. Det beskrives imidlertid et antall anti-inflammatoriske A<4-> og A<1,4->androstener i litteraturen. Slik beskriver Anner et al., US-patent nr. 3.636.010, utstedt den 18. januar 1972, estere av A<4-> og A1,4-16a-metyl-6cc, 9a-dif luor-llp, 17a-dihydroksy-3-oksoandrostadien-17-karboksylsyre med "god anti-inf lamma tor i sk og tymolytisk aktivitet". Tymolytisk aktivitet er imidlertid et tegn på systemisk aktivitet.

På 1970-tallet og tidlig 1980-tall ble flere patenter utstedt som beskriver andros tender ivater som påstås å ha et bedre forhold mellom den anti-inf lammatoriske virkning og uønskede bivirkninger. Disse omfatter den britiske patentbeskrivelse nr. 1.384.372; Phillips et al., US-patent nr. 3.828.080; Phillips et al., US-patent nr. 3.856.828; Phillips et al., US-patent nr. 4.093.721; UK-patentsøknad GB 2.014.579; Edwards, US-patent nr. 4.188.385; Alvarez, US-patent nr. 4.198.403; og Edwards, US -patent nr. 4.263.289. A<4-> og A<1,4->3-oksoandrostenderivatene ifølge disse patenter kan ha forskjellige substituenter i 6-, 9-, 11- og 16-stilling, og har vanligvis en 17a-hydroksy- eller 17a-alkanoyloksy-substituent. 170-gruppen er enten en karboksyl syrealkylester, en karboksylsyrehalogenalkylester eller en tiokarboksylsyrealkylester. I den britiske patentbeskrivelse nr. 1.578.243 og det tilsvarende US-patent nr. 4.285.937, Kalvoda et al., beskrives også androstadien-17-karboksylsyrer og deres estere. Forbindelsene ifølge Kalvoda et al. beskrives i US-patentet 4.285.937 å være nye estere av androstadien-17-karboksylsyrer og å ha formel hvor R' betyr en fri hydroksylgruppe eller en hydroksylgruppe som er f ores tret med en karboksyl syre som ikke har flere enn 7 karbonatomer, R" betyr en metylgruppe i a-eller p-stilling eller metylengruppen, R betyr H eller Cl, X og Y hver betyr et hydrogen-, klor- eller fluoratom, under det forbehold at minst én av disse substituenter er et av disse halogenatomer når R betyr Cl, og at Y kun kan bety Cl eller F og X kun kan bety Cl når R betyr H, og at androstadien-17-karboksylsyreestergruppen ikke inneholder flere enn 11 karbonatomer. Disse forbindelser sies å ha en utpreget anti-inflammatorisk virkning kombinert med bemer-kelsesverdig lave systemiske bivirkninger, og de sies også å være spesielt godt egnet for dermatologisk bruk. Esterne av de steroide 17-karboksylsyrer avledes fra alkoholer som inneholder 1-10 karbonatomer av den alifatiske, aralifatis-ke eller heterocykliske type som er usubstituert eller substituert med klor, fluor, brom, hydroksyl, lavere alkoksy eller lavere alkanoyloksy. Disse alkoholer sies å omfatte de lavere alkanoler (metanol, etanol, isopropanol osv.). 17-Estergruppen kan også være klormetoksykarbonyl, fluor-metoksykarbonyl eller 2-klor- eller 2-fluoretoksykarbonyl. Den forestrede hydroksygruppe R<1> sies å være avledet fra en mettet eller umettet Cj^C,-karboksyl syre som er usubstituert eller substituert med halogenatomer, hydroksyl- eller lavere alkoksygrupper. Som eksempler på R' nevnes formyl-oksy, acetoksy, propionyloksy, butyryloksy, valeryloksy, dietylacetoksy, kaproyloksy, kloracetoksy, klorpropionyl-oksy, oksypropionyloksy og acetoksypropionyloksy. Imidlertid er den eneste bestemte forbindelse som beskrives av Kalvoda et al. hvor 2-stillingen er usubstituert, metyl-9cc-klor-6a-fluor-lip-hydroksy-16a-metyl-3-okso-17a-propionyl-oksyandrosta-l,4-dien-17-karboksylat. Faktisk er alle de bestemte forbindelser som nevnes av Kalvoda et al., 17a-propionyloksyforbindelser. I betraktning av at forbindelsene til Kalvoda et al. forventes å hydrolysere in vivo for å frigi syren som 17a-esteren avledes fra, er det ikke overraskende at syren som foretrekkes av Kalvoda et al. for å derivatisere 17a-hydroksylen, er propionsyre, som er kjent for å ha en LDs0-verdi i rotter på bare 4,29 g/kg oralt. Eddiksyre, som i grunnen også er ikke-toksisk, har en LD50-verdi i rotter på 3,53 g/kg oralt. Derimot er den orale LD50-verdi i rotter av kloreddiksyre 76 mg/kg, hvilket er relativt sterkt toksisk.

I senere tid er det blitt utviklet myke steroider i et for-søk på å danne forbindelser med en sterk anti-inflammatorisk aktivitet med en minimal systemisk aktivitet. Disse forbindelser omfatter A<4-> og A<1,4->17a-alkoksy-lip-hydroksy-3-oksoandrostener som valgfritt bærer forskjellige subst i-tuenter i 6-, 9- og 16-stillingene, og beslektede 11-sub-stituerte forbindelser som er estere eller tioestere av 17P-karboksylsyrer. Disse 17a-etere beskrives i Bodor, US-patent nr. 4.710.495. Foretrukne forbindelser sies å være halogenalkylesterne av 17a-alkoksy-lip-hydroksyandrost-4-en-3-on-17p-karboksylsyrer.

En annen rekke myke steroider som beskrives å ha sterk anti-inflammatorisk aktivitet med en minimal systemisk aktivitet, er 17a-karbonatene som beskrives av Bodor, US-patent nr. 4.996.335. Disse forbindelser omfatter som foretrukne utførelser halogenalkyl-17a-alkoksykarbonyloksy-lip-hydroksyandrost-4-en-3-on-17P-karboksylater og de tilsvarende A<1,4->forbindelser, som valgfritt kan bære 6a- og/eller 9a-fluor- og metylsubstituenter. En av disse forbindelser er 17a-etoksykarbonyloksy-lip-hydroksyandrosta-l, 4-dien-3 - on-17p-karboksylat, som også er kjent som loteprednoletabonat, hvis kliniske utvikling er fullført og som venter på en endelig godkjennelse fra FDA.

Imidlertid finnes det innen dette fag et sterkt behov for nye anti-inflammatoriske steroider som har en sterk lokal anti-inflammatorisk aktivitet mens de har en minimal eller ikke-eksisterende systemisk aktivitet.

Sammenfatning av oppfinnelsen:

Foreliggende oppfinnelse frembringer nye androstenderivater med anti-inf lammatorisk virkning, hvilke derivater har den strukturelle formel hvor:

Rx betyr C^-C^-alkyl som er usubstituert eller som bærer én substituent utvalgt fra gruppen omfattende klor, fluor, Cx-C4-alkyltio, C^-C^-alkylsulfinyl og Ci-C^-alkylsulfonyl;

R3 betyr hydrogen, oc-metyl eller p-metyl,;

R« betyr hydrogen, fluor eller klor;

R5 betyr hydrogen;

X betyr -O-;

Z betyr (3-hydroksymetylen;

og den stiplede linje i ring A betyr at 1,2-bindingen er mettet eller umettet.

Innen denne gruppe av forbindelser foretrekkes de følgende undergrupper: (1) forbindelser hvor R3 betyr H, R4 betyr H eller F, og R5 betyr H; (2) forbindelser hvor R3 betyr <x-CH3 eller P-CH3, R4 betyr H eller F, og R5 betyr H;

Spesielt foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen er slike med formel (I) som har ett eller flere av de følgende strukturelle kjennetegn: (1) Ri betyr usubstituert Cx-C^-alkyl eller klormetyl, spesielt når Rx betyr usubstituert alkyl, mest spesielt når Rx betyr metyl eller etyl; (2) 1,2-bindingen er umettet; spesielt når variablene R3, R4 og R5 har de foretrukne betydninger som ble beskrevet i forrige avsnitt. En gruppe spesielt foretrukne derivater ifølge oppfinnelsen har den strukturelle formel

hvor R1X betyr metyl, etyl, isopropyl eller klormetyl, spesielt når RX1 betyr metyl, etyl eller isopropyl.

Androstenderivatene med formel (I) er meget sterke lokale

anti-inf lammatoriske midler, men de mangler systemisk aktivitet. Derfor kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse brukes ved lokal (f.eks. topisk) behandling av beten-

nelsestilstander uten de alvorlige bivirkninger som led-sager bruken av mange kjente glukokortikosteroider. Videre, grunnet deres utmerkede receptorbinding og vasokonstrikto-riske egenskaper, er forbindelsene ifølge oppfinnelsen en ny type sikre og virksomme steroide anti-inf lammatoriske midler med en utmerket sikkerhetsprofil.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen;

Med hensyn til de forskjellige grupper som omfattes av de generiske uttrykk som brukes her og i hele beskrivelsen, gjelder de følgende definisjoner og forklaringer: Alkylgruppene kan være rettkjedede eller forgrenede grupper som inneholder det nevnte antall karbonatomer. Likeledes kan alkyldelene av alkyltio-, alkylsulfinyl- og alkylsulfonylgrupper være rettkjedet eller forgrenet.

Bestemte eksempler på alkylradikaler som omfattes av formel (I), være seg som bestemte betydninger av Rx eller som andel av en Rj^-gruppe, omfatter metyl, etyl, n-propyl, isopropyl og n-butyl.

Alkyltio-, alkylsulf inyl- og alkylsulf onylgruppene er av typen

-S-alkyl

-SO-alkyl hhv.

-S03-alkyl,

hvor alkyl er som beskrevet og nevnt i form av eksempler ovenfor.

Selv om alle forbindelsene som omfattes av formel (I) ovenfor, i det vesentlige tilfredsstiller formålene for oppfinnelsen, foretrekkes allikevel visse grupper av forbindelser, så som de som har de foretrukne substituenter som ble nevnt i avsnittet "Sammenfatning av oppfinnelsen" ovenfor. En spesielt foretrukken gruppe forbindelser med formel (I) ble beskrevet å ha formel (Ia) i avsnittet "Sammenfatning av oppfinnelsen".

Enda en annen spesielt foretrukken gruppe forbindelser omfatter forbindelsene med formel (I) som har en 16a-metyl-eller 16p-metylsubstituent, spesielt forbindelser hvor Z, X og Rx har betydningene som ble angitt for formel (I) , og resten av variablene er identiske med gruppene som foreligger i de tilsvarende stillinger av deksametason eller beta-metason, spesielt når Rx er usubstituert C^-C^-alkyl eller klormetyl, mest foretrukket når Rx er usubstituert Ci-C*-alkyl. Innen denne gruppe foretrukne forbindelser har forbindelsene som er av spesiell interesse, formel

hvor RX1 har betydningen som ble angitt for formel (Ia) , R31 betyr <x-CH3 eller |3-CH3, R41 betyr H eller F, og RS1 betyr H, spesielt når RX1 betyr metyl eller etyl.

En annen gruppe foretrukne forbindelser omfatter forbindelsene med formel (I) hvor Z, X og Rx har betydningene som ble angitt for formel (I) ovenfor, og resten av de strukturelle variasjoner er identiske med strukturene i de tilsvarende stillinger av hydrokortison (dvs. R3, R4 og R5 betyr hver et hydrogenatom, og 1,2-bindingen er mettet) eller av prednisolon (dvs. R3, R4 og Rs betyr hver et hydrogenatom, og 1,2-bindingen er umettet), spesielt når Rj betyr usubstituert Ci-C^-alkyl eller klormetyl, mest spesielt når Rx betyr usubstituert C^-C^-alkyl.

En annen foretrukken gruppe forbindelser omfatter 9a-fluorkongener av forbindelsene som ble nevnt i forrige avsnitt. Innen denne gruppe foretrekkes spesielt forbindelsene hvor Z, X og Rx er som definert for formel (I) og resten av de strukturelle variabler er identiske med gruppene i de tilsvarende stillinger av fluorkortison eller isofluprednon eller difluprednat, spesielt når Rx betyr usubstituert Ci-C^-alkyl eller klormetyl, mest spesielt når Rx betyr usubstituert C^-C^-alkyl.

Forbindelsene med formel (I) kan generelt fremstilles ved kjente fremgangsmåter, idet den mest fordelaktige fremgangsmåte er avhengig av identiteten av de forskjellige substituenter i det ønskede sluttprodukt.

En generelt nyttig metode ved fremstilling av forbindelsene med formel (I) benytter seg av steroide utgangsstoffer med formel

hvor R«, R5 og den stiplede linje i ring A har betydningene som ble angitt for formel (I) , og R3' betyr hydrogen, a-metyl eller P-metyl (og som med fordel kan fremstilles ved behandling av det tilsvarende 21-hydroksypregnenolon med formel hvor R4, R5, R3' og den stiplede linje i ring A har de ovennevnte betydninger, med NaI04 i et organisk oppløsningsmid-del ved romtemperatur eller hevet temperatur) . I henhold til denne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, omsettes et utgangsstoff med formel (II) med dikloracetylklorid (C12CHC0C1) under vannfrie betingelser i et egnet inert organisk oppløsningsmiddel så som metylenklorid, kloroform eller tetrahydrofuran, fortrinnsvis i nærvær av en egnet syremottaker (f.eks. trietylamin, pyridin, kalsiumkarbonat, natriumbikarbonat eller en annen egnet base). Varighet og temperatur er ikke kritiske faktorer, men reaksjonen utfø-res imidlertid bekvemt ved en temperatur mellom 0°C og romtemperatur, i 1-6 timer. Det dannede nye 17p-karboksylsyre-17a-dikloracetat har formel

hvor R4, R5 og den stiplede linje i A-ringen har betydningene som ble angitt ovenfor, og R3<n> betyr H, cc-CH3 eller p-CH3.

Når 17<x-substituenten innføres som beskrevet i forrige avsnitt, har man funnet at en rensing av mellomproduktene kan være tidskrevende fordi R,-verdiene av urenhetene og av de ønskede mellomprodukter med formel (III) kan være meget like. Når imidlertid utgangsstoffet med formel (II) omsettes med dikloracetylklorid i heksametylfosforamid (HMPA) i nærvær av sølvcyanid og under oppvarming, kan de ønskede mellomprodukter erholdes i høyt (i enkelte tilfeller tilnærmet kvantitativt) utbytte og med så få urenheter at de lett kan renses, eller de kan brukes i det følgende trinn uten ytterligere rensing. Omsetningen kan med fordel utfø-res ved ca. 80 °C over et kort tidsrom, f .eks. i størrelses-orden 10-15 minutter.

Etter den ovenfor beskrevne innføring av 17a-substituenten, kan det nye mellomprodukt med formel (III) lett omdannes til den tilsvarende forbindelse med formel (I) ved behandling med et alkylhalogenid Rj-Hal (f .eks. CH3I, C2H5I, (CH3) aCHI], eller når RA betyr et halogenalkyl, behandling med et halogenalkylhalogenid [f.eks. C1CH2I] eller et halogenalkyl-klorsulfat Hal-SO^ [f.eks. C1S03CH2C1]. Når Rx betyr alkyltioalkyl i sluttproduktet, kan et alkyltioalkylhalogenid omsettes med mellomproduktet med formel (III) . Dette trinn av reaksjons sekvensen kan med fordel utføres ved romtemperatur i ca. 1-24 timer, i et egnet oppløsningsmiddel så som metylenklorid.

Omsetningen som ble beskrevet i forrige avsnitt, er blitt utført ved bruk av et alkylhalogenid i natriumbikarbonat i nærvær av tetrabutylammoniumhydrogensulfat (TBA) som fase-overføringskatalysator, men gir sluttproduktene i et lavt samlet utbytte. Videre er separasjonen av urenhetene og de ønskede produkter tidskrevende. Når imidlertid mellomproduktet med formel (III) fremstilles ved sølvcyanid-prosessen i HMPA, og dette mellomprodukt omsettes med et alkyljodid i nærvær av kaliumkarbonat i HMPA ved romtemperatur, heves det samlede utbytte merkbart til rundt 90%. Faktisk kan et tilnærmet kvantitativt utbytte oppnås i det andre trinn når mellomproduktet med formel (III) brukes i renset form. Reaksjonen får fremskride inntil den er full-stendig (vanligvis ca. 1,5-2 timer).

Forbindelsene med formel (I) hvor Rj betyr en sulfinyl-eller sulfonyl-holdig gruppe, kan fremstilles ved oksida-sjon av de tilsvarende tiosteroider. F.eks. kan en forbindelse med formel (I) , hvor ^ betyr alkyltioalkyl, omsettes med 1 ekv. m-klorperoksybenzosyre ved 0-25°C i 1-24 timer, i et egnet oppløsningsmiddel så som kloroform, for å gi den tilsvarende forbindelse med formel (I) hvor Rx betyr alkylsulf inylalkyl, eller med 2 ekv. m-klorperoksybenzosyre for å gi den tilsvarende forbindelse med formel (I) hvor Rx betyr alkylsulfonylalkyl.

En annen mulig fremgangsmåte ved fremstilling av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, som kan brukes ved fremstilling av forbindelser med formel (I) , benytter seg av de ovennevnte 17p-karboksylsyre-17a-dikloracetat-mellomprodukter med den ovennevnte formel (III). Ifølge denne fremgangsmåte, behandles et mellomprodukt med formel (III) suksessivt først med et mildt acylkloriddannende middel, f.eks. så som dietylklorfosfat eller oksalylklorid, for å danne det tilsvarende nye syreklorid med formel

hvor R3", R4, Rs og den stiplede linje i ring A har de ovennevnte betydninger, og deretter med RjXM<1> hvor Rx og X har de ovennevnte betydninger og M<1> betyr hydrogen eller M,

hvor M er et egnet metall, f .eks. et alkalimetall (såsom natrium eller kalium), alkalijordmetall/2 eller thallium eller NH4, i et inert oppløsningsmiddel (f .eks. CHC13, THF, acetonitril eller DMF), ved en temperatur mellom ca. 0°C og kokepunktet for oppløsningsmidlet, i 1-6 timer, for å gi den tilsvarende forbindelse med formel (I) . Når det brukes en forbindelse med formel RXXM" hvor M<1> betyr hydrogen, foreligger fortrinnsvis et syrerensemiddel så som trietylamin i reaksjonssystemet. De to trinnene av denne fremgangsmåte kan meget bekvemt utføres i samme oppløsningsmid-del, uten å isolere syrekloridet med formel (IV) som dannes i det første trinn.

En halogenutbyttereaksjon på grunnlag av de relative opp-løseligheter kan brukes for å omdanne et kloralkyl-17|3-karboksylat med formel (I) til det tilsvarende fluoralkylderi-vat. Sølvfluorid kan benyttes i denne reaksjon, som utføres i et egnet organisk oppløsningsmiddel (f.eks. acetonitril) og som er spesielt nyttig ved fremstilling av forbindelser hvor Rx betyr fluormetyl eller fluoretyl.

21-Hydroksypregnolonene som de steroide utgangsstoffer med formel (II) fremstilles fra, kan erverves i handelen eller fremstilles ved kjente fremgangsmåter. Også de ikke-steroide utgangsstof f er som brukes i de forskjellige beskrevne prosesser, er tilgjengelige i handelen eller kan fremstilles ved kjente kjemiske fremgangsmåter.

Dessuten kan et utgangsstof f med den ovennevnte formel (II) omsettes med dikloracetylklorid for å gi et mellomprodukt med formel hvor Rj<n>, R4/ R, og den stiplede linje i ring A har de ovennevnte betydninger, som kan omdannes til det tilsvarende mellomprodukt med den ovennevnte formel (III) ved en delvis hydrolyse, med eller uten isolering av forbindelsen med formel (V) . Denne omsetning av et utgangsstof f med formel (II) med dikloracetylklorid kan utføres under de samme betingelser som omsetningen av en forbindelse med formel (II) med dikloracetylklorid som beskrevet ovenfor, unntatt at dikloracetylklorid brukes i en mengde på 2 mol eller mer pr. 1 mol forbindelse med formel (II). Den delvise hydrolyse av den dannede forbindelse med formel (V) kan utføres i et inert oppløsningsmiddel i nærvær av en katalysator. Eksempler på egnede katalysatorer omfatter tertiære alkylaminer så som trietylamin, trimetylamin eller lignende; aromatiske aminer så som pyridin, 4,4-dimetylaminopyridin, kinolin eller lignende; sekundære alkylaminer så som di-etylamin, dimetylamin eller lignende; og uorganiske baser så som natriumhydroksid, kaliumhydroksid, kaliumbikarbonat eller lignende. Fortrinnsvis brukes pyridin og kaliumbikarbonat. Eksempler på egnede inerte oppløsningsmidler for bruk i hydrolysen omfatter vann; lavere alkoholer så som etanol, metanol eller lignende; etere så som dimetyleter, dietyleter, dimetoksyetan, dioksan, tetrahydrofuran eller lignende; halogenerte hydrokarboner så som metylenklorid, kloroform eller lignende; tertiære aminer så som pyridin, trietylamin eller lignende; eller en blanding av to eller flere av de ovennevnte oppløsningsmidler. Omsetningen utfø-res generelt ved en temperatur fra 0-100°C, fortrinnsvis ved fra romtemperatur til 50 °C, i 1-48 timer, fortrinnsvis i 2-5 timer.

Resultatene av forskjellige aktivitetsundersøkelser av representative forbindelser ifølge oppfinnelsen, som skal beskrives i detalj i det følgende, viser tydelig den sterke anti-inf lammatoriske virkning og den minimale systemiske aktivitet/toksisitet av forbindelsene med formel (I) . I betraktning av denne ønskelige terapeutiske indeks, dvs. separasjon av lokale og systemiske aktiviteter, kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen brukes ved behandling av topiske eller andre lokale inflammatoriske tilstander uten å forårsake de alvorlige systemiske bivirkninger som vanligvis oppvises av de kjente naturlige og syntetiske glukokortikosteroider så som kortison, hydrokortison, hydrokortison-17a-butyrat, betametason-17-valerat, triamcinolon, betametasondipropionat og lignende. Receptorbindingsunder-søkelser som også skal beskrives i det følgende, demonstre-rer at forbindelsene ifølge oppfinnelsen har utmerkede receptorbindingsegenskaper. Videre tyder humane vaso-konstriksjonstester, som også skal beskrives i det føl-gende, på at forbindelsene ifølge oppfinnelsen er sterke og langvarig virkende. Andre tester har vist at forbindelsene med formel (I) også oppviser det ønskede stabilitetsnivå.

Mens man ikke ønsker å binde seg til noen bestemt teori, tror man at de fordelaktige egenskapene av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er forbundet med måten de metaboliseres på. Til tross for den hemmede natur av 17a-dikloracetoksygruppen, har man i in vivo-tester og i tester i blod overraskende funnet at 17a-gruppen hydrolyseres foretrukket og raskt for å gi 17a-hydroksy-17P-karbok-sylsyrealkylester, som deretter hydrolyseres for å gi den ikke-toksiske kortiensyre eller en kongener derav. Dette er i motsetning til metabolismen av enkle 17a-alkanoyloksy-17p-karboksylsyrealkylestere, hvor hydrolysen av 17p-gruppen finner sted først for å gi en 17a-alkanoyloksy-17P-karboksylsyre, som vil være gjenstand for en intramolekylær gruppeoverføring av acyldelen til 17p-stillingen for å danne et reaktivt blandet anhydrid ifølge skjemaet:

ØREØDEM- TEST

I behandlingsgrupper av mus ble utvalgte mengder av testforbindelsen oppløst i aceton som inneholdt 5% krotonolje, og deretter påførte man 50 ul av oppløsningen på den indre flate av høyre øre på hver mus. En kontrollgruppe av mus ble behandlet på samme måte med kun vehikkel, dvs. 5% krotonolje i aceton. Seks timer etter behandlingen med krotonolje ble tykkelsen av hvert øre målt. Testresultatene viste en hemming av hevelse på 37,4% og 92,1% for doser på henholdsvis 10 ug/ml og 100 ug/ml, av en representativ forbindelse ifølge oppfinnelsen, nemlig metyl-17a-dikloracetoksy-9a- fluor- lip-hydroksy- 16a-metylandrosta-1,4 -dien-3-on-17p~ karboksylat. Disse resultatene skilte seg vesentlig fra kontrollverdiene, ved p < 0,001, og viste at den representative forbindelsen ifølge oppfinnelsen har en sterk lokal anti-inflammatorisk virkning.

HUDVEKTTEST

Hann Sprague-Dawley-rotter som veide ca. 210 g, ble lett

bedøvet med eter, barbert og merket på tre områder av hver side med intradermalt injisert blå farge. Områder på høyre side tjente som ubehandlede kontrollområder, mens områdene på venste side fikk topisk påført 0,1% oppløsninger av den utvalgte testforbindelse i N,N-dimetylformamid (DMF) . Behandlede kontrolldyr fikk daglige topiske påføringer av kun vehiklet (DMF). Oppløsningsmiddel og testforbin-delseoppløsninger (10 ul) ble påført én gang pr. dag i 10

påfølgende dager, mens man barberte etter behov. På den ellevte dag ble dyrene avlivet, huden ble fjernet og man stanset ut plugger med 16 mm diameter fra hvert område. Pluggene ble skrapt forsiktig for å fjerne subkutant fett og muskler, og deretter fikk de renne av på filterpapir og ble veid. Resultatene vises i den følgende Tabell I. Hudatrofi er en kjent bivirkning forbundet med topisk påførte anti-inf lammatoriske steroider. Resultatene viser at den representative forbindelse, selv om den er mer aktiv enn hydrokortison-17-butyrat, forårsaker mindre hudatrofi.

GRANULOMADANNELSESTEST

Test forbindelsen ble oppløst i aceton, og alikvoter med forskjellige konsentrasjoner ble injisert i bomullspelle-ter. Pelletene ble tørket, og deretter ble en pellet implantert under huden av hver testrotte. Seks dager senere ble dyrene avlivet, og granuleringsvevet (granuloma) som hadde blitt dannet i og rundt den implanterte pellet, ble fjernet, tørket og veid. I tillegg ble tymus og binyrene fjernet og veid. En forbindelses evne til å hemme granulomadannelse i denne test er en direkte indikasjon på lokal anti-inf lammatorisk virkning. Jo lavere vekten av granuleringsvevet, desto bedre er dermed den anti-inf lammatoriske aktivitet. På den andre side er en signifikant nedsatt vekt av tymus et tegn på en signifikant systemisk aktivitet. Derimot når en testforbindelse ikke senker tymus<1> vekt merkbart sammenlignet med kontrolldyret, tyder dette på en mangel på (eller meget minimale) systemiske bivirkninger.

Når den ble testet på denne måte, oppviste en representativ forbindelse ifølge oppfinnelsen, nemlig metyl-17a-dikloracetoksy- 9a- fluor- lip -hydroksy- 16a-metylandrosta-1,4-dien-3-on-17p-karboksylat, en signifikant anti-inf lammatorisk aktivitet mens den hadde en relativt meget lavere systemisk virkning.

Utifrå resultatene som ble erholdt med den ovenfor beskrevne test, ble ED50-verdiene og de relative styrker av en representativ forbindelse ifølge oppfinnelsen og kjente steroider beregnet, og disse er oppført i den følgende Tabell II. En av de kjente steroider, nemlig betametason-valerat, fikk tildelt en potensverdi på 100 ved EDs0-nivå-et, og styrken av de andre forbindelsene uttrykkes i forhold til dette. EDS0-verdiene er doseringen som er nødven-dig for å oppnå en 50% nedsatt vekt av granuleringsvevet.

TESTING AV TYMUSHEMMINGEN

Flere ytterligere undersøkelser ble utført for å bestemme virkningene av en utvalgt forbindelse ifølge oppfinnelsen og av kjente steroider på vekten av tymus i rotter når legemidlene ble administrert systemisk. I hver av disse undersøkelser brukte man hann Sprague-Dawley-rotter. Testforbindelsene ble suspendert i 0,5% CMC (karboksymetyl-cellulose) og injisert subkutant én gang om dagen i tre dager. På den femte dag (48 timer etter den siste behandlingen) ble dyrene avlivet, og vekten av tymus ble registrert. Økningen i kroppsvekten ble målt 24 timer etter den siste behandling. Utifrå testresultatene ble TED40-verdiene (tymolytisk effektive doser, dvs. dosene som er nødvendig for å forårsake en 40% minking av tymus<*> vekt) og den relative styrke beregnet for en representativ forbindelse ifølge oppfinnelsen og for referansesteroider. I den føl-gende Tabell II har den relative styrke for den steroide referanseforbindelse betametason-17-valerat ved dosen for TED40 fått tildelt verdien 100, og styrken av de andre forbindelsene uttrykkes i forhold til dette. Det er åpenbart at jo høyere hemmingen av tymusaktiviteten er ved en gitt dose, desto mer toksisk er forbindelsen.

EDS0 -verdiene som ble beregnet for analysen med lokal granuloma utløst av bomullspelleten og TED40-verdiene som ble beregnet på grunnlag av tymushemmingstesten som beskrevet ovenfor, ble brukt for å gi en relativ styrkemessig og terapeutisk indeks for en representativ forbindelse ifølge oppfinnelsen sammenlignet med kjente steroider. Jfr. den følgende Tabell II, som tydelig viser den sterke anti-inf lammatoriske virkning og den minimale systemiske toksisitet av den representative forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ytterligere representative forbindelser ifølge oppfinnelsen ble underkastet forskjellige stabilitets- og receptor-bindingsundersøkelser samt human vasokonstriksjonstesting, som skal beskrives i detalj i det følgende.

STABILITETSUNDERSØKELSER

Analytisk metode

En høyytelses væskekromatografisk (HPLC) metode ble utviklet for den kvantitative bestemmelse av de følgende forbindelser ifølge oppfinnelsen:

Dette er foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen som har formel (Ia) som beskrevet tidligere i denne beskrivelse.

En Whatman C-18-kolonne (4,6 mm x 108 mm) ble forbundet med et Spectra-Physics komponentsystem omfattende en SP8810 isokratisk presisjonspumpe, en Rheodyne 7125 injektor (20 Hl injeksjonsvolum) , en SP 8450 UV/VIS detektor med variabel bølgelengde (230 nm) og en SP 4290 integrator. Systemet ble drevet ved omgivelsestemperaturen. Den mobile fase bestod av acetonitril, eddiksyre og vann (60 : 0,1 : 40). Ved strømningshastigheten 1,0 ml/min, var retens jons tidene for testforbindelsene 4,74 minutter for Forbindelse A, 5,84 minutter for Forbindelse B, 6,93 minutter for Forbindelse C og 5,72 minutter for Forbindelse D.

HPLC-topparealet og toppens høyde ble brukt for å måle konsentrasjonen av testforbindelsene, og dette ble plottet mot tiden for å bedømme forsvinningshastigheten av forbindelsene. Stabiliteten ble bestemt ved å måle pseudo-hastig-hetskonstanten av første orden (k^ i min"<1>) eller halveringstiden (t1/2 i min) for forsvinningen av test forbindelsen i buffer, k^ ble bestemt utifrå stigningen av log-verdien av forsvinningskurven [k^ = stigning x (-2,303)], og t1/a-verdien for testforbindelsen ble beregnet utifrå lig-ningen t1/2 = 0,693/k^.

Stabilitet i buffere

Stabiliteten av testforbindelsene A, B, C og D ble testet i bufferoppløsninger i pH-området 4,0-9,0. En 0,1 ml porsjon av hver forbindelse i konsentrasjonen 1 mM ble blandet med 10 ml fosfatbuffer (fremstilt ved å kombinere 0,05 M NaH2P04 og 0,05 M Na2HP04 med 0,05 M NaCl) for å gi den endelige konsentrasjon 0,01 mM. Blandingene ble inkubert ved 37°C, og prøver ble tatt og injisert i HPLC-systemet med egnede tidsintervaller. pH-profilen for hver testforbindelse vises i den følgende Tabell III.

Stabilitet i biologisk medium

En 0,2 ml alikvot av stamoppløsning (1 mM) av hver av testforbindelsene A, B, C og D ble tilsatt til 2 ml av hvert biologiske medium (heparinisert rotte-fullblod, 20% rotte-leverhomogenat og 6 volumdeler fortynnet lungehomogenat i isotonisk buffer ved pH 7,40, som ble fremstilt ved å kombinere 0,05 M Na2HP04 og 0,05 M NaH2P04 med 0,05 M NaCl) , som ble holdt i et 37°C vannbad, for å gi en endelig konsentrasjon på 0,1 mM i hvert biologiske medium. Prøver på

0,1 ml ble tatt med egnede tidsintervaller i 2 timer (etter 0, 3, 5, 10, 20, 40, 60, 90 og 120 minutter) og blandet med 0,2 ml acetonitril som inneholdt 5% DMSO. Hver blanding ble sentrifugert, og supernatanten ble injisert i HPLC. Stabiliteten (t1/3, halveringstiden) av testforbindelsene i rot-teblod, leverhomogenat og lungehomogenat er oppført i den følgende Tabell IV.

Stabilitet i cytosol

For å bestemme om forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan være stabile under inkubasjonsperioden, ble testforbindelsene A, B, C og D undersøkt for sin stabilitet under inku-basjonsbetingelsene, som er romtemperatur og 2 timer, for receptorbindingsundersøkelser. Det frosne cytosol som ble fremstilt for receptorbindingsundersøkelsen, ble tint i et vannbad og fortynnet med 1 del inkubasj onsbuffer (10 mM Tris/HCl, 10 mM natriummolybdat og 2 mM 1,4-ditiotreitol) som inneholdt en 15 mM konsentrasjon av enzymhemmer, nemlig diisopropylfluorfosfat. Porsjoner (560 ul) av det fortynnede cytosol ble tilsatt til sentrifugerør som inneholdt 80 ul porsjoner av ren inkubas j onsbuf f er istedenfor en volum-del merkestoff ([<3>H]triamcinolonacetonid) som ville brukes i receptorbindingsundersøkelsen (RBS) , 80 ul oppløsning av A<1->kortiensyre (0,1 mM) i buffer (den endelige konsentrasjon av A<1->kortiensyre i inkubasjonsmediet var 10 nM) , og 80 ul 100.000 nM konsentrasjoner av testforbindelsene i etanol for å gi den endelige konsentrasjon 10.000 nM. Denne blanding ble holdt ved romtemperatur i 2 timer. Prøver på 0,1 ml ble tatt med egnede tidsintervaller (0, 0,5, 1, 1,5 og 2 timer), og ble blandet med 0,2 ml acetonitril som inneholdt 5% DMSO. Hver blanding ble sentrifugert, og supernatanten ble injisert i HPLC. Stabiliteten (% som var igjen etter inkubasjonen) av testforbindelsene i cytosol under forskjellige betingelser er oppført i Tabell V.

YTTERLIGERE STABILITETS- OG METABOLISMEUNDERSØKELSER

Analytisk metode

En høyytelses væskekromatografisk (HPLC) metode som ble utført ved romtemperatur, ble utviklet for identifikasjon

En Waters NOVA-PAK-fenylkolonne ble forbundet med et Spectra-Physics komponentsystem omfattende en SP8810 isokratisk presisjonspumpe, en Rheodyne 7125 injektor (injeksjonsvolum 20 ul) , en SP 8450 DV/VIS detektor med variabel bølgelengde (drevet ved 254 nm) og en SP 4270 integrator. Den mobile fase bestod av acetonitril, vann og eddiksyre i volumforholdet 40:60:0,1 drevet ved strømningshastigheten 1 ml/minutt. Retensjonstiden for Forbindelse B ifølge oppfinnelsen og dens metabolitter F og H var henholdsvis 6,32, 2,25 og 1,66 minutter. Retensjonstiden for Forbindelse J ifølge oppfinnelsen og dens metabolitter L og M var henholdsvis 8,64, 2,70 og 2,45 minutter. Retensjonstiden for Forbindelse I ifølge oppfinnelsen og dens metabolitter N og 0 var henholdsvis 5,84, 2,70 og 1,81 minutter. Retens jons-tiden for kortiensyre var 1,00 minutt.

Stabilitet i human eller rotte- plasma

Ferskt innsamlet human eller rotte-plasma ble brukt. En alikvot av 10 mM testforbindelse i etanoloppløsning ble tilsatt til på forhånd oppvarmet (37°C) plasma for å gi den endelige konsentrasjon 100 uM. Med egnede tidsintervaller tok man prøver (0,1 ml) og blandet dem med 0,2 ml 5% di-metylsulfoksid/acetonitril-oppløsning. Blandingene ble sentrifugert, og supernatantene ble analysert ved HPLC. Pseudohastighetskonstanten av første orden for forsvinningen av forbindelsen i det biologiske medium ble bestemt ved lineær regresjonsanalyse utifrå plotten over logaritmen av topparealet og topphøyden mot tiden.

Stabiliteten ble bestemt ifølge pseudohastighetskonstanten av første orden (k, time"<1>) og halveringstiden (t1/2, time) for forsvinningen av test forbindelsen i mediet. Resultatene oppsummeres i de følgende Tabeller VI og VII.

Kinetiske data som ble generert ved å følge forsvinningen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen ved HPLC, viste en dannelse av alle de forventede metabolitter, dvs. de tilsvarende forbindelser med formel (VII) hvor R13 betyr H (H, L, H) og slike hvor betyr H (P, M, 0) samt de endelige metabolitter hvor R13 betyr H og Rj3 betyr H (kortiensyre og den tilsvarende 9a-fluor-16a-metylsyre).

RECEPTORBINDINGSUNDERSØKELSER

Materialer

Umerkede kjemikalier ble ervervet fra Sigma Chemical Co.

(St. Louis, MO). Den radiomerkede forbindelse, nemlig l,2,4-[<3>H]-triamcinolonacetonid (45 Ci/mmol) ble ervervet fra New England Nuclear (Boston, MA) . Oppløsningsmidler for den mobile fase var av HPLC-kvalitet som var sertifisert ifølge ACS.

Anordning

For receptorbindingsanalyser ble det følgende brukt: T line Laboratory homogeniserer (Talboys Engineering Corp., Emer-son, NJ) ; Virtis 45 homogeniserer (The Virtis Co., Gardi-ner, NY) ; Beckman L8-70 M ultrasentrifuge med T-170-rotor (Palo Alto, CA) ; Fischer mikrosentrifuge modell 235C (Fischer Scientific Co., Fairlawn, NJ) ; Beckman LS 500 TD, væskescintillasjonsteller (Fullerton, CA) .

Fremstilling av cytosolen

Hann Sprague-Dawley-rotter som hver veide 150-200 g, ble brukt 6 dager etter en adrenalektomi. Rottene ble avlivet ved hodeavkapping. Umiddelbart etter reseksjon av lungene ble vevet frosset med is. Cytosolen ble fremstilt ved bruk av en liten modifikasjon av en tidligere beskrevet metode (Dahlberg, 1984): etter tilsetning av 6 volumdeler iskald inkubas j onsbuf fer (10 mM Tris/HCl, 10 mM natriummolybdat og 2 mM 1,4-ditiotreitol), ble vevet homogenisert med Virtis 45-homogeniseringsanordningen som ble drevet ved høyeste hastighet, i 4 perioder på 10 sekunder med en 10 sekunders kjøleperiode mellom hvert trinn. Homogenatet ble sentrifugert ved 35.000 gil time ved 4°C i en Beckman ultrasentrifuge L8-70M som var utstyrt med en T170-rotor. Porsjoner (5 ml) av cytosolen ble frosset i flytende nitro-gen og lagret ved -80°C.

Bindingsundersøkelser

De følgende forbindelser A, B, C og D ifølge oppfinnelsen og deres formentlige metabolitter E, F, G og H ble under-søkt i disse undersøkelser:

De representative forbindelser ifølge oppfinnelsen (A, B, C og D) , deres metabolitter (E, F, 6 og H) , deksametason og triamcinolonacetonid ble hver for seg oppløst i absolutt etanol for å gi 1 mM konsentrasjon og fortynnet for å gi forskjellige konsentrasjoner i området fra 300.000 nM til 10 nM med 40% etanol i vann. Cytosolen ble deretter tinet i et vannbad og fortynnet med 1 del inkubas j onsbuf fer som inneholdt 15 mM konsentrasjon av diisopropylfluorfosfat. Porsjoner (140 ul) av den fortynnede cytosol ble tilsatt til sentrifugerør som inneholdt 20 ul porsjoner av en stamoppløsning av [<3>H]triamcinolonacetamid i inkubas j onsbuf - fer (hvor den endelige konsentrasjon av merkestoffet i inkubas jonsmediet var 10 nM) , 20 ul oppløsning av A1-kort i-ensyre (0,1 mM) i buffer (den endelige konsentrasjon av A<1->kortiensyre i inkubas jonsmediet var 10 nM) og 20 ul av forskjellige konsentrasjoner av konkurrerende forbindelse

(Forbindelsene A, B, C og D ifølge oppfinnelsen; deres metabolitter B, F, 6 og H; deksametason; og triamcinolonacetonid) i etanol. Etter en 2 timers inkubasjonsperiode

ved romtemperatur (24 °C) , ble det ubundne steroid fjernet ved tilsetning av en 2% suspensjon av aktivkull i inkuba-sjonsbuffer (400 ul) . Blandingen ble inkubert i 5 minutter ved romtemperatur og ble deretter sentrifugert ved ca. 10.000 g i 3 minutter i mikrosentrifugen. Radioaktiviteten (cpm) i supernatanten (400 ul) ble bestemt ved væskescin-tillasjonstelling. Den ikke-spesifikke binding ble bestemt i nærvær av umerket deksametason (10"s) , og var i hvert tilfelle lavere enn 10% av den samlede binding.

lC50-verdien av det undersøkte steroid (konsentrasjonen av konkurrerende forbindelse som var nødvendig for å flytte 50% av det bundne [<3>H]triamcinolonacetonid) og stignings-faktoren for den erholdte konkurransekurve ble bestemt ved en ikke-lineær kurvetilpasningsmetode ved bruk av NON-LIN-modulen av SYSTAT-versjonen fra Macintosh. Dataene tilpas-ses til den følgende logistiske funksjon:

hvor B = CPM i nærvær av konkurrerende middel, T = CPM i fravær av konkurrerende middel, C = konsentrasjon av konkurrerende middel, N = Hills stigningsfaktor og NS = CPM under ikke-spesifikke bindingsbetingelser. Den erholdte IC50-verdi ble omdannet til en relativ bindingsaffinitet (RBA) ved bruk av deksametason (RBA = 100) som referanse-standard:

Receptorbindingsaffinitetene (RBA) av representative forbindelser A, B, C og D ifølge oppfinnelsen og deres formentlige metabolitter E, F, 6 og H for rottelunge-gluko-kortikoidreceptor er oppført i den følgende Tabell VIII. En annen representativ forbindelse ifølge oppfinnelsen, nemlig metyl - 17a-dikloracetoksy- 9a- fluor- lip-hydroksy- 16a-metylandrosta-1,4-dien-3-on-17P-karboksylat, har vist seg å ha en RBA-verdi på 495 når den ble testet på denne måte. Loteprednoletabonat har tidligere vist seg å ha en RBA-verdi på 420. Derimot har det vist seg at forbindelser med formel (VI) hvor R12 betyr etyl og Rj betyr lavere alkanoyl, dvs. de velkjente alkyl-17a-alkanoyloksy-17p-karboksylat-analoger av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, har RBA-verdier under 1.

Virkning av A^- kortiensyre på receptorbindingsaffiniteten

For den representative Forbindelse B ifølge oppfinnelsen ble receptorbindingsaf f initeten undersøkt med og uten A<1->kortiensyre i inkubasjonsoppløsningen for å undersøke virkningen av Ax<->kortiensyre på receptorbindingen. Resultatene vises i den følgende Tabell IX.

Loteprenoletabonat har tidligere vist seg å ha en RBA-verdi på 152 uten A<1->kortiensyre, mens dens RBA-verdi med A<1->kortiensyre har vist seg å være 420. Til forskjell fra loteprednoletabonat bindes forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse ikke til transkortin. Dermed er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse mer tilgjengelige for den ønskelige enzymatiske deaktivering, hvilket i sin tur ytterligere forsterker deres mangel på uønskede bivirkninger.

YTTERLIGERE RECEPTORBINDINGSUNDERSØKELSER

Ytterligere undersøkelser for å bedømme de relative receptorbindingsaf f initeter av forbindelser ifølge oppfinnelsen, andre forbindelser med den ovennevnte formel (VII) og velkjente anti-inflammatoriske steroider ble utført ved bruk av fremgangsmåtene som ble beskrevet i avsnittet "Receptor-bindingsundersøkelser" ovenfor. Oe velkjente steroider som ble testet, var deksametason, triamcinolonacetonid, fluor-metolon og betametason-17-valerat. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen som ble testet, var Forbindelsene A, B, C, D, I og J som beskrevet ovenfor. For sammenligning testet man også den følgende forbindelse som har den ovennevnte formel

(VII):

Resultatene presenteres i den følgende Tabell X.

HUMAN VASOKONSTRIKSJONSTEST

Testforbindelsene (10 mM) ble oppløst i etanol/propylenglykol-oppløsning (9/1) , og 50 ul av blandingene ble påført på runde lapper med 8 mm diameter. Etter fordamping av eta-nolen ble lappene påført underarmen til et frivillig menneske og dekket med en vanntett film i 3 timer. Intensiteten av vasokonstriksjonen ble bedømt 1, 8, 17 og 24 timer etter at lappene var blitt fjernet.

Graderingsskalaen for vasokonstriksjonsaktiviteten var som følger: 0: normal hud; 1: svak blekhet med utydlig omkrets; 2: blekhet med minst to skarpe hj ørner; 3: j evn blekhet med en klar kontur av påføringsstedene; 4: meget intens blekhet.

Fordi blekhetsgraden er avhengig både av styrken av testforbindelsen og av mengden forbindelse som kommer frem til virknings stedet, kan man konkludere at de representative forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er sterke og langvarig virkende topiske anti-inf lammatoriske midler med gode permeas j onsegenskaper.

YTTERLIGERE HUMAN VASOKONSTRIKSJONSTESTING

Metode 1

Testforbindelsene (0,1-10 mM) ble oppløst i etanol/propylenglykol-oppløsning (9/1) for å gi en klar blanding. 50 ul store mengder av blandingene ble påført på runde lapper (8 mm diameter). Etter fordampningen av etanol ble lappene påført på underarmen til et frivillig menneske og dekket med en vanntett film i 3 timer. Intensiteten av vasokonstriksjonen (skala 0 til 4) ble bedømt med forskjellige tidsintervaller etter fjerning av lappene. Graderingsskalaen var som følger: 0: normal hud; 1: svak blekhet med utydlig omkrets; 2: blekhet med minst to skarpe hjørner; 3: jevn blekhet med en klar kontur av påfø-ringsstedene; 4: meget intens blekhet. Hudtestene (2-4 tester av hver forbindelse) ble utført på én og samme person. Resultatene er oppført i de følgende Tabeller XII og XIII.

Metode 2

Testforbindelsene (0,1-5 mM) ble oppløst i etanol/propylenglykol-oppløsning (9/1) . 20 ul store mengder av blandingene ble påført på runde lapper (ca. 0,6 cm diameter) . Lappene ble påført på underarmen til et frivillig menneske og dekket med en vanntett film i 3 timer. Vasokonstriksjonsaktiviteten ble bedømt ifølge opptreden av blekhet ved forskjellige tidspunkter etter at lappene var blitt fjernet. Testene ble utført på én og samme person, og resultatene ble erholdt fra 2-4 observasjoner. Resultatene er oppført i den følgende Tabell XIV.

Deksametason, betametason-17-valerat og loteprednoletabonat ble brukt som referanseforbindelser for sammenlignings-formål. De følgende forbindelser med den ovennevnte formel (VII) ble også testet:

Forbindelsene A, B, C og D er forbindelser ifølge oppfinnelsen med formel (Ia). Forbindelsene I, J og K er forbin-deiser ifølge oppfinnelsen med formel (Ib). Forbindelse P er en 17<x-ikke-halogenert alkanoyloksyforbindelse som ble valgt for sammenlignings f ormål.

I Tabell XIV ovenfor betyr n-n at et negativt resultat ble erholdt. I de andre tabellene i -foreliggende beskrivelse betyr n-n ikke testet.

Human vasokontriksjonstesting er blitt brukt som indeks for den perkutane absorpsjon, aktiviteten og biotilgjengelighe-ten av glukokortikoider. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, strukturelt beslektede forbindelser og velkjente anti-inf lammatoriske midler ble sammenlignet. Resultatene som er oppført i Tabell XII ovenfor, viser at 3 timer og 20 timer etter fjerning av lappen, oppviste representative forbindelser ifølge oppfinnelsen med formel (I) en vasokonstrik-sjonsaktivitet som var lik eller større enn den tilsvarende aktivitet av betametason-17-valerat.

Én times re-okklusjon 20 timer etter fjerning av lappen, førte til en tydelig gjenopptreden av blekhet på huden. Som vist i Tabell XIII ovenfor, oppviste representative forbindelser ifølge oppfinnelsen med formel (I) en vasokonstrik-sjonsaktivitet som var lik eller sterkere enn aktiviteten av betametason-17-valerat.

I Tabell XIV ovenfor brukte man resultatene av en enklere bedømning av vasokonstriksjonsaktiviteten, hvor kun "posi-tive" (blekhet ble observert) eller "negative" (blekhet ble ikke observert) resultater ble registrert. Igjen viste de representative forbindelser ifølge oppfinnelsen med formel (I) like god eller sterkere aktivitet sammenlignet med betametason-17-valerat. Tabellene XII, XIII og XIV viser også at når den karakte-ristiske 17a-dikloracetoksygruppe i forbindelsene med formel (I) erstattes med en 17a-propionyloksygruppe, nedsettes den lokale anti-inflammatoriske virkning sterkt. Disse tabellene viser også at 17a-dikloracetoksyforbindelsene ifølge oppfinnelsen generelt har sterkest aktivitet når 17p-gruppen er en etyl- eller metylester.

Forbindelsene med formel (I) kan kombineres med egnede ikke-toksiske farmasøytisk akseptable bærere for å gi far-masøytiske sammensetninger for bruk ved behandling av topisk eller annen lokal betennelse. Grunnet sin mangel på systemisk aktivitet, er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse åpenbart ikke ment å brukes ved behandling av tilstander hvor en systemisk adrenokortikal terapi er indi-kert, f.eks. adrenokortikal insuffisiens. Som eksempler på betennelsestilstander som kan behandles med farmasøytiske blandinger som inneholder minst én forbindelse ifølge oppfinnelsen og én eller flere farmasøytiske bærere, kan de følgende nevnes: dermatologiske lidelser så som atopisk dermatitt, akne, psoriasis eller kontaktdermatitt; allergiske tilstander så som bronchial astma; oftalmiske og otiske sykdommer omfattende akutte og kroniske allergiske og inflammatoriske reaksjoner (f.eks. oftalmiske inflammatoriske tilstander så som blefaritt, konjunktivitt, episkleritt, skleritt, keratitt, anteriør uveititt og sym-patetisk oftalmi); respiratoriske sykdommer; betennelser i munnen, tannkjøttet og/eller halsen, så som gingivitt eller oral aftha; betennelser i neseslimhinnen, f.eks. forårsaket av allergier; betennelser i de øvre og nedre tarmer, så som ulcerativ kolitt; betennelser forbundet med artritt; og anorektal betennelse, pruritus og smerter forbundet med hemorroider, proktitt, kryptitt, fissurer, postoperative smerter og pruritus ani. Slike sammensetninger kan også påføres lokalt som forébyggende skritt mot betennelse og vevutstøtning som kan finne sted i forbindelse med trans-plantater .

Åpenbart vil valget av bærerstoff(er) og doseringsformer variere med den bestemte tilstand som blandingen skal administreres mot.

Eksempler på forskjellige typer preparater for topisk/lokal administrasjon omfatter salver, lotioner, kremer, pulvere, dråper (f.eks. øye-, øre- eller nesedråper), sprayer (f.eks. for nesen eller halsen), suppositorier, retensjons-klystere, tyggbare eller sugbare tabletter eller pelleter (f.eks. for behandling av aftøse ulcere) og aerosoler. Salver og kremer kan f.eks. formuleres med på vandig eller oljete basis under tilsetning av egnede tykningsmidler og/eller geleringsmidler og/eller glykoler. En slik basis kan f.eks. omfatte vann og/eller en olje så som flytende parafin eller en vegetabilsk olje så som arakinolje eller ricinusolje, eller et glykoloppløsningsmiddel så som propylenglykol eller 1,3-butandiol. Tykningsmidler som kan brukes i betraktning av naturen av basisen, omfatter myk parafin, aluminiumstearat, cetostearylalkohol, polyetylenglyko-ler, ullfett, hydrogenert lanolin og bivoks og/eller glyce-rylmonostearat og/eller ikke-ioniske emulgeringsmidler.

Oppløseligheten av steroidet i salven eller kremen kan for-bedres ved å innlemme en aromatisk alkohol, så som benzyl-alkohol, fenyletylalkohol eller fenoksyetylalkohol.

Lotioner kan formuleres på vandig eller oljete basis, og vil generelt også omfatte ett av de følgende, nemlig: emulgeringsmidler, dispersjonsmidler, suspensjonsmidler, tykningsmidler, oppløsningsmidler, fargestoffer og parfyme. Pulvere kan dannes ved hjelp av hvilken som helst egnet pulverbasis, f.eks. talkum, laktose eller stivelse. Dråper kan formuleres med vandig base som også omfatter ett eller flere dispers jonsmidler, suspensjonsmidler eller opp-løseliggjørende midler osv. Spraysammensetninger kan f.eks. formuleres som aerosoler ved hjelp av et egnet drivstoff, f.eks. diklordifluormetan eller triklorfluormetan.

Forstøvede eller pulveriserte formuleringer kan fremstilles for oral inhalasjon ved behandling av astma, som er velkjent innen faget. Oppløsninger og suspensjoner kan fremstilles for en oral eller rektal administrasjon for bruk ved behandling av betennelser i tarmene, f.eks. som beskrevet i større detalj i de følgende eksempler. Parente-rale/injiserbare formuleringer kan fremstilles for direkte injeksjon i leddene ved behandling av artritt ifølge fremgangsmåter som er velkjent for fagmannen i faget parente-rale formuleringer.

Innhold av aktiv ingrediens i sammensetningene ifølge oppfinnelsen vil variere med den nøyaktige forbindelse som brukes, typen av formulering som fremstilles og den bestemte tilstand som sammensetningen skal administreres mot. Formuleringen vil generelt inneholde 0,0001-5,0 vekt% forbindelse med formel (I). Topiske preparater vil generelt inneholde 0,0001-2,5%, fortrinnsvis 0,01-0,5%, og vil administreres én gang om dagen eller etter behov. Generelt kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen også innlemmes i topiske og andre lokale sammensetninger som hovedsakelig formuleres på samme måte som dagens tilgjengelige typer sammensetninger som inneholder kjente glukokortikosteroider, i omtrent lik (eller i tilfellet av de sterkeste forbindelsene ifølge oppfinnelsen, i tilsvarende lavere) doseringsmengde som de kjente meget aktive midler så som metylprednisolonacetat og beklometasondipropionat, eller i betraktelig lavere dose-ringsnivåer enn mindre aktive kjente midler så som hydrokortison.

Slik kan f .eks. en inhalas jons formuler ing som er egnet for bruk ved behandling av astma, fremstilles i form av en aerosolenhet med oppmålte doser som inneholder en representativ forbindelse ifølge oppfinnelsen, så som etyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylat eller metyl-17a-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksy-16a-metylandrosta-l, 4-dien-3 -on-17p-karboksylat, ifølge fremgangsmåter som er velkjent for fagmannen innen farmasøytiske formuleringer. En slik aerosolenhet kan inneholde en mikrokrystallinsk suspensjon av den ovennevnte forbindelse i egnede drivstoffer (f.eks. triklorfluormetan og diklordifluormetan) med oleinsyre eller et annet egnet dispersjonsmiddel. Hver enhet inneholder vanligvis 1-10 mg av den ovennevnte aktive ingrediens, hvorav 5-50 jag frigis ved hver aktivering.

Et annet eksempel på en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen er et skum som er egnet for behandling av vidt forskjellige inflammatoriske anorektale lidelser, til anal eller perianal administrasjon, omfattende 0,05-0,1% av en forbindelse med formel (I) , så som etyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-1,4-dien-3-on-17P-karboksylat eller metyl - 17a-dikloracetoksy- 9a- fluor- lip -hydroksy- 16a-metyl - androsta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylat, og 1% lokalbedøvel-sesmiddel så som pramoxinhydroklorid, på mukoadhesiv skum-basis av propylenglykol, etoksylert stearylalkohol, poly-oksyetylen-10-stearyleter, cetylalkohol, metylparaben, pro-pylparaben, trietanolamin og vann, med inerte drivstoffer.

Enda en annen farmasøytisk formulering ifølge oppfinnelsen er en oppløsning eller suspensjon som er egnet for bruk som retensjonsklyster, hvorav en enkelt dose vanligvis inneholder 20-40 mg av en forbindelse ifølge oppfinnelsen så som etyl - 17a-dikloracetoksy-1 lp -hydroksyandrosta-1,4 -dien- 3 -on-17P-karboksylat eller metyl-17a-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksy-16a-metylandrosta-l,4-dien-3-on-17P-karboksylat, sammen med natriumklorid, polysorbat 80 og ca. 28-170 g vann (hvor vannet tilsettes rett før bruk). Suspensjonen kan administreres i form av en retensjonsklyster eller ved kontinuerlig drypping flere ganger i uken ved behandling av ulcerativ kolitt.

Andre farmasøytiske formuleringer ifølge oppfinnelsen skal illustreres i de følgende eksempler.

Uten ytterligere forklaring tror man at en fagman ved bruk av beskrivelsen ovenfor kan benytte seg av foreliggende oppfinnelse i full utstrekning. Derfor skal de følgende eksempler kun anses å være illustrative, og ikke på noen måte begrensende for resten av beskrivelsen og kravene.

I synteseeksemplene som følger, var alle ikke-steroide kjemikalier og oppløsningsmidler som ble brukt, av reagens-middelkvalitet. Alle smeltepunkter ble bestemt ved bruk av en smeltepunktanordning fra Fisher-Johns, og de er ikke korrigert. 300 MHz ^-NMR-spektraldataen ble erholdt ved bruk av et Varian T-90-, QE-300- eller Varian Unity-300-spektrometer, og angis i deler pr. million (6) i forhold til tetrametylsilan. Elementanalysene ble utført av Atlan-tic Microlab, Inc., Atlanta, Georgia, USA. Massespektrene ble erholdt ved bruk av et Kratos MFC 500-instrument og rask kjernebombardering ("Fast Atom Bombardment" : FAB) . Tynnsj iktskromatografi (TLC) ble utført ved bruk av DC-alu-miniumfolieplater fra Merck som var bestrøket 0,2 mm tykt med kiselgel 60 som inneholdt fluorescerende (254) indika-tor. Kiselgel (partikkelstørrelse 32-63) ble ervervet fra Selecto Scientific.

EKSEMPEL 1

Til en oppløsning av prednisolon (15 g; 0,04 mol) i tetrahydrofuran (120 ml) og metanol (30 ml) ved romtemperatur blir en varm (ca. 50°C) oppløsning av natriummetaperjodat (25,7 g; 0,12 mol) i vann (100 ml) satt til. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 5 timer og inndampes deretter under redusert trykk for å fjerne tetrahydro-furanet og metanolen. Det faste stoff tritureres med 50 ml vann, separeres ved filtrering, vaskes flere ganger med vann og tørkes under vakuum ved 50°C i 3 timer. Produktet lip, 17a-dihydroksyandrosta-l, 4-dien-3-on-17p-karboksylsyre 1 (som også kan benevnes A1-kortiensyre) , erholdes i form av et hvitt pulver i omtrent 94% utbytte (13,5 g) , og har smeltepunktet 231-232°C. ^-NMR (DMSO-d6) 8 (ppm) : 5,51 (s, 1, CH=CH) , 1,41 (s, 3, 19-CH3) , 0,92 (s, 18-CH3) . Elementanalyse: Beregnet for C20H26Os: C 69,36; H 7,51. Funnet: C 69,31; H 7,56. Produktet har den strukturelle formel:

EKSEMPEL 2

Bruk av en ekvivalent mengde av et av utgangsstof fene som nevnes i det følgende, istedenfor prednisolonet som ble brukt i Eksempel 1, og en tilnærmet gjentakelse av fremgangsmåten som beskrives der, gir de angitte produkter:

EKSEMPEL 3

Anvendelse av en ekvivalent mengde av et av utgangsstof f ene som er nevnt i det følgende, istedenfor prednisolonet som ble brukt i Eksempel 1, og en tilnærmet gjentakelse av fremgangsmåten som beskrives der, gir de angitte produkter:

EKSEMPEL 4 lip, l7a-Dihydroksyandrosta-l,4-dien-3-on-17P-karboksylsyre 1 (3,12 g; 9,0 mmol) oppløses i en oppløsning av natriumbikarbonat (7,56 g; 90 mmol) i vann (100 ml) . Metylenklorid (100 ml) settes til, etterfulgt av tetrabutylammoniumhydrogensulfat (1,0 g). Blandingen omrøres kraftig, og dikloracetylklorid (1,51 g; 17 mmol) i metylenklorid (10 ml) settes dråpevis til i løpet av 5 minutter. Omrøringen fortsettes i ca. 5 timer, og deretter separeres den organiske fase og vaskes suksessivt med 5% vandig natrium-bikarbonatoppløsning, vann og mettet vandig natriumtio-sulfatoppløsning. Den organiske oppløsning tørkes over natriumsulfat og inndampes under vakuum. Det dannede faste råstoff renses ved kromatografi under eluering med 1:100 volumdeler metanol:metylenklorid. <1>H-NMR (DMS0-d6) 8 (ppm): 1,00 (s, 18-CH3) , 1,42 (s, I9-CH3) ; 4,30 (m, 11-CH) ; 5,93 (s, 4-CH) ; 6,24 (m, 2-CH) ; 6,87 (s, C0CHC12) ; 7,30 (m, 1-CH=C). FAB-massespektrum: 457 (M+) . Elementanalyse: Beregnet for C22H26OsCl2: C 57,77; H 5,69; Cl 15,54. Funnet: C 56,58; H 5,83; Cl 15,14. Produktet, nemlig 17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-l,4-dien-3-on-17P-karboksylsyre 4, har den strukturelle formel:

EKSEMPEL 5

Anvendelse av en ekvivalent mengde 9a-fluor-lip,17a-di-hydroksy-16a-metylandrosta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylsyre istedenfor lip,l7a-dihydroksyandrosta-l, 4-dien-3-on-17P-karboksylsyren som ble brukt i Eksempel 4, og en tilnærmet gjentakelse av fremgangsmåten som beskrives der, gir 17a-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksy-16a-metylandrosta-l, 4-dien-3-on-17p-karboksylsyre 5, som har den strukturelle

Rensing av råproduktet ved flash-kromatografi på kiselgel med 10:100 metanol:metylenklorid gav 5 i 90% utbytte. MS: 490,7 ([M+H]) , 510,7 ([M+Na]) .

EKSEMPEL 6

Ved å følge den generelle fremgangsmåte fra Eksempel 4 og der erstatte de passende reaktanter, erholdes de følgende nye mellomprodukter ifølge foreliggende oppfinnelse:

Forbindelsene 6-1 til 6-3 kan benevnes som følger:

6-1: 17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrost-4-en-3-on-17p - karboksyl syre

6-2: 17a-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksyandrost-4-en-3-on-17P-karboksylsyre

6-3: 17a-dikloracetoksy-9a-f luor-lip-hydroksy-16p-metyl-andros ta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylsyre

EKSEMPEL 7

Ved å følge den generelle fremgangsmåte fra Eksempel 4 og deri erstatte de passende reaktanter, erholdes de følgende nye mellomprodukter ifølge foreliggende oppfinnelse:

Forbindelsene 7-1 til 7-15 kan benevnes som følger:

7-1: 17a-dikloracetoksyandrost-4-en-3, ll-dion-l7[3-karboksylsyre 7-3: i7a-dikloracetoksy-16p-metylandrosta-l,4-dien-3,11-dion-17p-karboksylsyre

7-5: i7a-dikloracetoksyandrosta-l, 4-dien-3, ll-dion-17p-karboksyl syre

7-9: i7a-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksyandrosta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylsyre

7-11: 9a-klor-17a-dikloracetoksy-llp-hydroksy-16p-metyl-androsta-1,4 -dien-3 -on- 17p-karboksyl syre

7-14: 9a, lip-diklor-17a-dikloracetoksyandrosta-l, 4-dien-3-on-17p-karboksylsyre

7-15: 9a-klor-17a-dikloracetoksy-llp-hydroksy-16a-metyl-andros ta-l,4-dien-3-on-17P - karboksyl syre

EKSEMPEL 8

17a-Dikloracetoksy- llp-hydroksyandrosta-1,4 -dien-3-on-17p~ karboksylsyre 4 (0,23 g; 0,5 mmol) oppløses i en oppløsning av natriumbikarbonat (0,2 g; 2,34 mmol) i vann (50 ml) . Metylenklorid (50 ml) settes til, etterfulgt av tetrabutyl-ammoniumhydrogensulfonat (0,2 g) . Blandingen omrøres kraftig mens metyljodid (0,16 g; 1,12 mmol) i metylenklorid (1 ml) settes dråpevis til i løpet av 5 minutter. Omrøringen fortsettes i ca. 5 timer, og deretter separeres den organiske fase og vaskes med suksessivt 5% vandig natrium-bikarbonatoppløsning, vann og mettet vandig natriumtio-sul f at oppløsning. Den organiske oppløsning tørkes over natriumsulfat og inndampes under vakuum. Det dannede faste råstoff renses ved kromatografi under eluering med 1:200 volumdeler metanol:metylenklorid. Produktet erholdes i 85% utbytte (0,2 g) . Ytterligere rensing ved omkrystallisering fra en blanding av n-heksan og dietyleter gir metyl-17a-dikloracetoksy- lip-hydroksyandrosta-1,4 -dien-3 -on- 17p-kar-

boksylat 8, som smelter ved 115-117°C og har den strukturelle formel:

<1>H-NMR (CDClj) 8 (ppm) : 1,02 (s, 18-CH3) ; 1,40 (s, 19-CH3) ; 3,75 (S, COOCH3) ; 4,51 (m, 11-CH) ; 5,93 (s, 4-CH); 6,24 (m, 2- CH) ; 6,85 (s, COCHCl2) ; 7,30 (m, 1-CH=C) . FAB-massespektrum: 471 (M*) . Elementanalyse: Beregnet for C23H2806C12: C 58,60; H 5,94; Cl 15,07. Funnet: C 58,64; H 6,15; Cl 14,73.

EKSEMPEL 9

Ved å gjenta den generelle fremgangsmåte fra Eksempel 8, men ved bruk av en ekvivalent mengde etyljodid istedenfor metyljodidet som ble brukt der, erholdes etyl-17a-dikloracetoksy- lip-hydroksyandrosta-1,4 -dien- 3 -on- 17|3-karboksylat 9, som smelter ved 208-210°C og har den strukturelle formel

^-NMR (CDClj) 8 (ppm): 1,05 (s, 18-CH3) ; 1,27 (t, CH2CH3) ; 1,37 (s, 19-CH3) ; 4,25 (s, COOCH2) ; 4,51 (m, 11-CH); 5,93 (s, 4-CH); 6,24 (m, 2-CH) ; 6,87 (s, C0CHC12) ; 7,30 (m, 1-CH=C) . FAB-massespektrum: 485 (M+) . Elementanalyse: Beregnet for C24H300SC12: C 59,38; H 6,19; Cl 14,64. Funnet: C 59,48; H 6,26; Cl 14,72.

EKSEMPEL 10

Ved å gjenta den generelle fremgangsmåte fra Eksempel 8, men ved bruk av en ekvivalent mengde isopropyljodid istedenfor metyljodidet som ble brukt der, erholdes isopropyl - 17a-dikloracetoksy- lip-hydroksyandrosta-1,4 -dien- 3 - on-17P-karboksylat 10, som smelter ved 222-223°C og har den

<X>H-NMR (CDClj) 8 (ppm): 1,01 (s, 18-CH3) ; 1,22 (d, CH(CH3)a); 1,39 (s, 19-CH3) ; 4,25 (s, COOCH) ; 4,51 (m, 11-CH); 5,93

(S, 4-CH); 6,24 (m, 2-CH) ; 6,86 (s, C0CHCla) ; 7,32 (m, 1-CH=C). FAB-massespektrum: 499 (M*) . Elementanalyse: Beregnet for CasH3a06Cl2: C 60,12; H 6,41; Cl 14,23. Funnet: C 59,99; H 6,49; Cl 14,31.

EKSEMPEL 11

Ved å gjenta den generelle fremgangsmåte fra Eksempel 8, men ved bruk av en ekvivalent mengde klormetyl jodid istedenfor metyl jodidet som ble brukt der, erholdes klormetyl- 17a-dikloracetoksy- lip-hydroksyandrosta-1,4 -dien- 3 - on-17p~karboksylat 11, som smelter ved 122-123 °C og har den strukturelle formel:

<1>H-NMR (CDClj) 8 (ppm): 0,98 (s, 18-CH3) ; 1,36 (s, 19-CH3) ; 4,45 (m, 11-CH); 5,76 (ABq, CH2C1) ; 5,95 (s, 4-CH); 6,24

(m, 2-CH) ; 6,89 (s, C0CHC12) ; 7,28 (m, 1-CH=C) . FAB-massespektrum: 505 (M+) . Elementanalyse: Beregnet for C23H2706C13: C 54,65; H 5,35; Cl 21,09. Funnet: C 54,61; H 5,41; Cl 20,94.

Det samme produktet fremstilles mer foretrukket ved å følge fremgangsmåten som beskrives i det følgende: 17a-Dikloracetoksy- lip-hydroksyandrosta-1,4 -dien-3 -on-17p - karboksylat 4 (0,024 mol) oppløses i vann (100 ml) som inneholder natriumbikarbonat (9,90 g) . Metylenklorid (80 ml) settes til, etterfulgt av tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,47 g; 1,18 mmol). Klormetylklorsulfat (4,75 g; 0,029 mol) i metylenklorid (20 ml) settes dråpevis til i løpet av 30 minutter under kraftig omrøring. Etter omrøring i 2 timer separeres den organiske fase, tørkes over natriumsulfat og inndampes til tørrhet under vakuum for å gi ubehandlet klormetyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-1,4-dien-3-on-17p-karboksylat 11. Etter rensing ved kromatograf i og omkrystallisering som beskrevet i Eksempel 8, smelter produktet ved 122-123°C.

EKSEMPEL 12

Ved å gjenta den generelle fremgangsmåte fra Eksempel 8, men ved bruk av en ekvivalent mengde 17a-dikloracetoksy-9a- fluor- lip-hydroksy- 16a-metylandrosta-1,4 -dien- 3 -on- 17P - karboksylsyre 5 istedenfor 17a-dikloracetoksy-llp-hydroksyandrosta-1,4-dien-3-on-17p-karboksylsyren 2 som ble brukt der, erholdes metyl-17a-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksy-16a-metylandrosta-l, 4-dien-3-on-17p-karboksylat 12, som har den strukturelle formel:

og ytterligere kjennetegnes ved smeltepunktet 248-251 °C.

EKSEMPEL 13

17a-Dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylsyre 4 (7,00 mmol) behandles med 7,00 ml 1 M meta-nolsk natriumhydroksidoppløsning, og 500 ml etyleter tilfø-res deretter for å utløse utfelling. Bunnfallet separeres ved filtrering og tørkes over natten i et tørkeapparat under vakuum for å gi det ønskede salt, dvs. natrium-17a-dikloracetoksy- lip-hydroksyandrosta-1,4 -dien-3 -on- 17p-karboksylat. Saltet oppløses i 40 ml heksametylfosforamid, og 1 ekv. klormetylmetylsulfid settes langsomt til. En utfelling av natriumklorid dannes raskt. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i ca. 1 time, fortynnes deretter med etylacetat til det samlede volum 200 ml og vaskes med suksessivt 3% natriumbikarbonat og vann. Det organiske sjikt separeres, tørkes med magnesiuimsulfat og filtreres.

Filtratet inndampes under vakuum til en olje, og denne olje kromatograferes fra kiselgel ved bruk av etylacetat, kloroform og eddiksyre som elueringsmidler. Det kromatograferte produkt krystalliseres fra en blanding av etyleter og heksan for å gi metyltiometyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylat, som kjennetegnes ved den strukturelle formel Til en oppløsning av metyltiometyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-l,4-dien-3-on-17P-karboksylat (1 mmol) i 2 ml diklormetan settes m-klorperoksybenzosyre (2 mmol per-syre) til. En eksoterm reaksjon utløses, som snart er avsluttet. Reaksjonsblåndingen omrøres ved romtemperatur i 1 time. Bunnfallet som dannes, fjernes ved filtrering, og filtratet inndampes under vakuum for å gi metylsulfonyl-metyl- 17a-dikloracetoksy- lip -hydroksyandrosta-1,4 -dien- 3 - on-l7p-karboksylat med den strukturelle formel

En gjentakelse av fremgangsmåten som ble beskrevet i forrige avsnitt, men ved bruk av kun 1 mmol m-klorperoksybenzosyre, gir metylsulfinylmetyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-1,4-dien-3- on- 17P-karboksylat.

EKSEMPEL 14

Til en oppløsning av 3 g klormetyl-17<x-dikloracetoksy-lip - hydroksyandrosta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylat i 100 ml acetonitril tilsettes et 10:1 molart forhold av AgF i forhold til steroid, og blandingen omrøres ved romtemperatur i 12 dager mens reaksjonssystemet beskyttes for lys. Deretter filtreres reaksjonsblandingen, og det faste stoff på filte-ret vaskes grundig med etylacetat. Filtratet og etylacetat-oppløsningen slås sammen, og blandingen vaskes med vann og en mettet vandig natriumkloridoppløsning og tørkes over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlene avdestilleres, hvilket gir et krystallinsk råprodukt. Produktet underkas-tes preparativ tynnsjiktskromatografi (kiselgel 60F254 fra Merck) ved bruk av en blanding av kloroform og metanol (15:1) som elueringsmiddel. Deretter omkrystalliseres produktet fra en blanding av tetrahydrofuran og n-heksan for å gi fluormetyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-l,4-dien-3-on-17P-karboksylat.

EKSEMPEL 15

Til en blanding av 9a-f luor-lip, 17a-dihydroksy-16a-metyl-androsta-1,4-dien-3-on-17p-karboksylsyre (1 g; 2,64 mmol; 1 ekv.) og sølvcyanid (0,78 g; 5,83 mmol; 2 ekv.) i 10 ml HMPA (heksametylfosforamid, Aldrich), ble dikloracetylklorid (1,42 g; 9,63 mmol; 3,6 ekv.) satt til i én porsjon ved romtemperatur. Blandingen ble omrørt i et oljebad ved 80°C i 12 minutter. Deretter ble blandingen satt dråpevis til en mettet vandig natriumkloridoppløsning (200 ml) under omrøring, hvorved det ble dannet et bunnfall. Bunnfallet ble samlet ved filtrering og oppløst i tetrahydrofuran. Tetrahydrofuranoppløsningen ble filtrert for å fjerne uoppløselig fast AgCN. Filtratet ble inndampet til ca. 10 ml og felt ved fortynning med 200 ml mettet vandig NaCl-oppløsning. Det samlede bunnfall (1,29 g; 100% utbytte) viste en enkelt TLC-flekk med 13:100 MeOH/CH2Cl2. Dette bunnfall kunne brukes direkte i det følgende trinn uten noen ytterligere rensing. Den fargeløse rene forbindelse, nemlig 17a-dikloracetoksy-9a-f luor-lip-hydroksy-16<x-metylandrosta-1,4-dien-3-on-17P-karboksylsyre, kunne prepareres for analyse ved flash-kromatografi på kiselgel med 13:100 MeOH/CH2Cl2, smp. 217-218°C. <X>H-NMR (CDC13-DMS0-d6) : 0,96 (3H, d, 16-CH3) , 1,12 (3H, s, 18-CH3) , 1,55 (3H, S, 19-CH3) , 2,59 (1H, m, 6a-H), 2,65 (1H, m, 6p-H), 3,42 (1H, m, 16p-H), 4,24 (1H, bredd, 11-H), 1,28, 1,76, 1,81, 1,84, 2,12, 2,16, 2,22 og 2,40 (8H, m, andre H på ringen), 6,03 (1H, s, 4-H), 6,25 (1H, d, 2-H), 6,43 (1H, s, CHC12) , 7,33 (1H, d, 1-H) ppm.

EKSEMPEL 16

Til en blanding av 17a-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksy- 16a-metylandrosta-1,4 -dien- 3 -on- 17P -karboksyl syre (0,80 g; 1,63 mmol), natriumbikarbonat (0,69 g; 8,2 mmol; 5 ekv.) og tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,11 g; 0,32 mmol; 0,2 ekv.) i 25 ml vann og 25 ml metylenklorid ble jodetan (0,54 g; 3,5 mmol; 2,1 ekv.) i 5 ml metylenklorid satt til ved romtemperatur under kraftig omrøring. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5 timer. Det organiske sjikt ble separert og vasket med mettet vandig NaCl-oppløs-ning. Fjerning av oppløsningsmidlet gav et råprodukt, som ble renset ved flash-kromatografi på kiselgel med 3,5:100 og 13:100 MeOH/metylenklorid for å gi etyl-17a-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksy-16a-metylandrosta-l, 4-dien-3-on-l7p-karboksylat (154 mg; 22,6%), smp. 234-236°C. MS: 518,1

([M+H]) .

EKSEMPEL 17

Til en blanding av lip, 17a-dihydroksyandrosta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylsyre (1,09 g; 3,14 mmol; 1 ekv.), NaHC03 (2,64 g; 31,4 mmol; 10 ekv.) og tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,31 g; 0,91 mmol; 0,3 ekv.) i metylenklorid og vann (150 ml hver) ble dikloracetylklorid (6,28 mmol; 2 ekv.) i 5 ml metylenklorid satt til ved romtemperatur under kraftig omrøring. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5 timer. Det organiske sjikt ble separert og vasket med mettet vandig NaCl-oppløsning. Fjerning av oppløsningsmid-let gav et råprodukt som ble renset ved f lash-kromatograf i på kiselgel med 10:100 metanol/metylenklorid for å gi ren 17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-l, 4-dien-3-on-17p-karboksylsyre i 95% utbytte.

EKSEMPEL 18

Til en blanding av 17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-1,4-dien-3-on-170-karboksylsyre (3,24 g; 7,09 mmol; 1 ekv.), natriumbikarbonat (2,96 g; 35,4 mmol; 5 ekv.) og tetrabutylammoniumhydrogensulfat (2,96 g; 8,72 mmol; 1,2 ekv.) i 60 ml metylenklorid og 60 ml vann ble etyljodid (2,21 g; 14,17 mmol; 2 ekv.) i 5 ml metylenklorid satt til ved romtemperatur under kraftig omrøring. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5 timer. Det organiske sjikt ble separert, vasket med mettet vandig NaCl-oppløsning, tørket over natriumsulfat og rotasjonsinndampet for å gi et råprodukt. Råproduktet ble renset ved f lash-kromatograf i på kiselgel med 2,1:100 metanol/metylenklorid for å gi etyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-1,4-dien-3-on-17p-karboksylat som en ren forbindelse (1,89 g; 54,9% utbytte), smp. 207-208°C. MS: 484,8 ([M*]) .

EKSEMPEL 19

Til en blanding av urenset 17a-dikloracetoksy-9ct-fluor-lip-hydroksy-16oc-metylandrosta-1,4-dien-3-on- 17p-karboksylsyre (1 g; 2,0 mmol; 1 ekv.) som ble fremstilt i Eksempel 15, og vannfritt KaCOj (0,72 g; 5,21 mmol; 2,61 ekv.) i heksametylfosforamid (12 ml) ble metyljodid (3,8 g; 26,8 mmol; 13,4 ekv.) satt til ved romtemperatur. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Blandingen ble satt til en mettet vandig NaCl-oppløsning (200 ml) under omrøring, hvilket gav et bunnfall. Bunnfallet ble oppløst i metanol (200 ml) . Metanoloppløsningen ble felt ved fortynning med en mettet vandig NaCl-oppløsning (200 ml) . Bunnfallet ble renset ved f lash-kromatograf i på kiselgel (150 g) med 3:100 metanol/metylenklorid for å gi rent metyl-17a-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksy-16a-metylandrosta-l, 4-dien-3-on-17p-karboksylat (0,95 g; 92% utbytte beregnet på utgangsstoffet fra Eksempel 15, dvs. 9a-fluor-lip,17a-dihydroksy-16a-metylandrosta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylsyre) . En prøve for elementanalyse ble erholdt ved å oppløse produktet i metylenklorid, filtrere oppløsningen og inndampe den for å gi et fast stoff, som deretter ble krystallisert fra en blanding av metylenklorid og heksan, smp. 252-253°C. ^-NMR (CDCI3) : 1,01 (3H, d, 16-CH3) , 1,09 (3H, s, 18-CH3) , 1,56 (3H, s, I9-CH3), 2,43 (1H, m, 6(X-H) , 2,63 (1H, m, 60-H), 3,38 (1H, m, 16P-H), 3,75 (3H, s, C02CH3), 4,41 (1H, bredd, 11-H), 1,36, 1,64, 1,69, 1,72, 1,85, 2,18, 2,21 og 2,38 (8H, m, andre H på ringen), 5,94 (1H, s, CHC12) , 6,13 (1H, S, 4-H), 6,35 (1H, d, 2-H), 7,22 (1H, d, 1-H) ppm.

Når den ovenfor beskrevne omsetning ble utført ved bruk av isolert 17a-dikloracetoksy-9a-f luor-lip-hydroksy-16a-metyl-androsta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylsyre, var utbyttet av reaksjonen kvantitativt.

EKSEMPEL 20

Til en blanding av 17<x-dikloracetoksy-9<x-fluor-lip-hydroksy-16a-metylandrosta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylsyre (0,50 g; 1,02 mmol; 1 ekv.) og KjCOj (0,36 g; 2,60 mmol; 2,6 ekv.) i heksametylfosforamid (10 ml) ble klormetyl jodid (1,18 g; 6,69 mmol; 6,6 ekv.) satt til ved romtemperatur. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og deretter satt til 200 ml vandig mettet NaCl-oppløsning. Luftbob-ler ble blåst gjennom den vandige oppløsning for å fremme dannelsen av et bunnfall. Bunnfallet ble oppløst i metanol (10 ml) og satt til mettet vandig NaCl-oppløsning (200 ml) . Felningen som ble dannet, ble renset ved flash-kromatografi på kiselgel (47 g) med 3:100 metanol/metylenklorid for å gi rent klormetyl-17oc-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksy-16a-metylandrosta-l,4-dien-3-on-17p-karboksylat (0,29 g;

53% utbytte), som smeltet ved 228-229°C (spaltning). 'H-NMR (CDCI3) : 1,01 (3H, d, I6-CH3) , 1,16 (3H, s, 18-CH3) , 1,56 (3H, s, I9-CH3) , 2,42 (1H, m, 6a-H) , 2,64 (1H, m, 6p-H) , 3,42 (1H, m, 16P-H), 4,45 (1H, m, bredd, 11-H), 1,35, 1,63, 1,73, 1,78, 1,83, 1,88, 2,22 og 2,37 (8H, m, andre H

på ringen), 5,56 og 5,94 (2H, 2d, CH2C1) , 5,96 (1H, s, CHC12) , 6,14 (1H, S, 4-H), 6,37 (1H, d, 2-H), 7,23 (1H, d,

1-H) ppm. Analyse for C2<H28ClFOs: beregnet: C 53,60; H 5,25. Funnet: C 53,81; H 5,56.

EKSEMPEL 27

EKSEMPEL 28

EKSEMPEL 29

De ovennevnte ingredienser kombineres, og deretter kontrol-leres pH-verdien og justeres om nødvendig til 5,0-5,5 ved alkalisering med natriumhydroksid eller surgjøring med saltsyre.

Claims (35)

1. Forbindelse med formel hvor: Rx betyr C^-C^-alkyl som er usubstituert eller som bærer én substituent utvalgt fra gruppen omfattende klor, fluor, Cx-C4-alkyltio, Cx-C4-alkylsulf inyl og Ci-C^-alkylsulfonyl, R3 betyr hydrogen, a-metyl eller p-metyl, R4 betyr hydrogen, fluor eller klor, Rs betyr hydrogen, X betyr -0- Z betyr P-hydroksymetylen, og den stiplede linje i ring A betyr at 1,2-bindingen er mettet eller umettet.

2. Forbindelse ifølge krav 1, som har et eller flere av de følgende kjennetegn: (a) R4 betyr hydrogen eller fluor, (b) Rx betyr usubstituert Ci-C^-alkyl eller klormetyl, (c) 1,2-bindingen er umettet.

3. Forbindelse ifølge krav 1, som har formel hvor Rlt R3, R5 og den stiplede linje har betydningene som ble angitt i krav 1; og R4 betyr hydrogen eller fluor.

4. Forbindelse ifølge krav 3, hvori 1,2-bindingen er umettet.

5. Forbindelse ifølge krav 1, som har formel hvor RX1 betyr ububstituert Ci-C^-alkyl eller klormetyl.

6. Forbindelse ifølge krav 5, som er: metyl - 17a-dikloracetoksy- lip-hydroksyandrosta-1,4 -dien- 3 - on-17 p-karboksylat, etyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-l, 4-dien-3-on-170-karboksylat, isopropyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-l, 4-dien-3-on-17p-karboksylat eller klormetyl-17a-dikloracetoksy-lip-hydroksyandrosta-l, 4-dien-3-on-17P~karboksylat.

7. Forbindelse ifølge krav 1, som har formel hvor Ru betyr usubstituert Ci-C^-alkyl eller klormetyl, R31 er 0C-CH3 eller P-CH3; og R41 betyr hydrogen eller fluor.

8. Forbindelse ifølge krav 7, som er: metyl - 17a-dikloracetoksy- 9a- fluor- lip -hydroksy- 16a-metyl - androsta-1,4-dien-3 -on-17p-karboksyl at, etyl - 17a-dikloracetoksy- 9a- fluor- lip-hydroksy- 16a-metyl - androsta-1,4-dien-3-on-17p-karboksylat eller klormetyl-17a-dikloracetoksy-9a-fluor-lip-hydroksy-16a-metylandrosta-1,4-dien-3-on-17p-karboksylat.

9. Forbindelse med formel hvor: R3 betyr hydrogen, a-metyl eller Ø-metyl, R4 betyr hydrogen, fluor eller klor, R5 betyr hydrogen, Z betyr p-hydroksymetylen, og den stiplede linje i ring A betyr at 1,2-bindingen er mettet eller umettet.

10. Forbindelse ifølge krav 9, hvor R4 betyr hydrogen eller fluor.

11. Forbindelse ifølge krav 9 som har formel hvor Z har betydningen som ble angitt i krav 9, R31 betyr <x-CH3 eller P~CH3, R41 betyr hydrogen eller fluor, og RS1 betyr hydrogen.

12. Forbindelse ifølge krav 9, som er 17<x-dikloracetoksy-11P - hydr oksyandr o sta-l,4-dien-3-on-17p~ karboksyl syre.

13. Forbindelse ifølge krav 11, som er 17a-dikloracetoksy-9a- fluor- lip-hydroksy- 16a-metylandrosta-1,4 -dien-3 -on- 17p-karboksylsyre.

14. Farmasøytisk sammensetning omfattende en anti-inf lammatorisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8 og en ikke-toksisk farmasøytisk akseptabel bærer for den, passende for topisk eller annen lokal påføring.

15. Oftalmisk sammensetning omfattende en anti-inf lammatorisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8 og en ikke-toksisk oftalmisk akseptabel bærer for den.

16. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 14, formulert som en salve, lotion eller krem.

17. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 14, formulert som et pulver.

18. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 14, formulert som dråper eller som en spray.

19. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 14, formulert som et suppositorie eller retensjonsklyster eller skum.

20. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 14, formulert som en tablett eller pellet som kan tygges eller suges.

21. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 14, formulert som en aerosol.

22. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 14, formulert som en forstøvet eller pulverisert formulering for oral inhalasjon.

23. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 14, formulert som en oppløsning eller suspensjon.

24. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 14, formulert for parenteral eller annen injiserbar administrasjon.

25. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8, i fremstillingen av et medikament for behandling av topisk eller annen lokal betennelse.

26. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8, i fremstillingen av et medikament for behandling av oftalmisk inflammasjon.

27. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8, i fremstillingen av et medikament for behandling av dermatologisk betennelse.

28. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8, i fremstillingen av et medikament for behandling av otisk betennelse.

29. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8, i fremstillingen av et medikament for behandling av astma.

30. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8, i fremstillingen av et medikament for behandling av betennelse i munnen, tannkjøttet eller halsen.

31. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8, i fremstillingen av et medikament for behandling av nasal betennelse.

32. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8, i fremstillingen av et medikament for behandling av betennelse i de øvre og nedre tarmer.

33. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8, i fremstillingen av et medikament for behandling av betennelse forbundet med artritt.

34. Anvendelse av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 8, i fremstillingen av et medikament for behandling av anorektal betennelse.

35. Forbindelser ifølge ethvert av kravene l til 8, for anvendelse i terapi.