NO309271B1

NO309271B1 - Proteinkinase C-hemmere, farmasöytisk formulering inneholdende slike hemmere, anvendelse derav, fremgangsmåte for deres fremstilling, og mellomprodukt

Info

Publication number: NO309271B1
Application number: NO974453A
Authority: NO
Inventors: Jr William Francis Heath; Michael Robert Jirousek; Iii John Hampton Mcdonald; Christopher John Rito
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1995-03-30
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2001-01-08
Also published as: EP0735038A1; CZ286301B6; HUP9801250A3; US5674862A; CN1093767C; US5621098A; PL183600B1; US5821365A; WO1996030048A1; CN1185742A; EA199700280A1; KR100319945B1; CZ305197A3; US5780461A; US5719175A; EA000598B1; US5624949A; PL322584A1; AU701988B2; CA2216535A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye proteinkinase C-hemmere, farmasøytisk formulering inneholdende slike, anvendelse derav, fremgangsmåte for deres fremstilling, og mellomprodukt.

Proteinkinase C (PKC) består av en familie av nært beslektede enzymer som fungerer som serine/treoninkinaser. Proteinkinase C spiller en viktig rolle i celle-cellesignalering, genekspresjon og i regulering av celledifferensiering og vekst. For tiden er det minst ti kjente isozymer av PKC som adskiller seg i deres vevsfordeling, enzymatisk spesifisitet og regulering. Nishizuka Y. Annu. Rev. Biochem. 58: 31-44 (1989); Nishizuka Y. Science 258: 607-614 (1992).

Proteinkinase C isozymer er enkle polypeptidkjeder som er i området fra 592 til 737 aminosyrers lengde. Isozymene inneholder et regulatorisk område og et katalytisk område knyttet med et sammenbindende peptid. De regulatoriske og katalytiske områdene kan bli ytterligere underoppdelt i konstante og variable regioner. Det katalytiske området av proteinkinase C er meget lik det som man ser i andre proteinkinaser mens det regulatoriske området er unikt for PKC isozymer. PKC isozymer utviser mellom 40 og 80% homologi ved aminosyrenivået i gruppen. Homologien til et enkelt isozym mellom forskjellige arter er generelt høyere enn 97%.

Proteinkinase C er et membran-assosiert enzym som blir allosterisk regulert med et antall faktorer, inkludert membranfosfolipider, kalsium og visse membranlipider slik som diacylglyceroler som blir frigjort som respons på aktiviteter av fosfolipaser. Bell, R. M. og Burns, D.J., J. Biol. Chem. 266: 4661-4664 (1991); Nishizuka, Y. Science 258: 607

- 614 (1992). Proteinkinase C isozymer, alfa, beta-1, beta-2 og gamma, krever membranfosfolipid, kalsium og diacylglycerol/forbolestere for full aktivering. Delta-, epsilon-, eta- og teta-former av PKC er kalsium-uavhengig når det gjelder deres aktiveringsmåte. Zeta og lambda former av PKC er uavhengig både kalsium og diacylglycerol og antas å kreve bare membranfosfolipid for aktivering. Bare én eller to av proteinkinase C-isozymer kan være involvert i en gitt sykdomstilstand. Forhøyet blodglukosenivåer som finnes i diabetes, fører for eksempel til en isozym-spesifikk heving av beta-2 isozym i vaskulære vev. Inoguchi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89: 11059 - 11065 (1992). En diabetes-tilknyttet økning av beta isozym i humane plater har blitt korrolert med deres endrede respons til agonister. Bastyr III, E.J. og Lu, J. Diabetes 42: (Suppl. 1) 97A (1993). Human vitamin D reseptor er vist å bli selektivt fosforylert med proteinkinase C beta. Denne fosforyleringen har vært knyttet til endringer i funksjonering av reseptoren. Hsieh et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88: 9315-9319 (1991);Hsiehetal., J. Biol. Chem. 268: 15118-15126 (1993). I tillegg har senere arbeid vist at beta-2 isozym er ansvarlig for erythroleukemicelle proliferasjon mens alfa isozymet er involvert i megakaryocyt-differensiering i de samme cellene. Murray et al., J. Biol. Chem. 268: 15847-15853 (1993).

Den allesteds nærværende naturen til proteinkinase C isozymer og deres viktige roller innenfor fysiologien gir insentiver til å produsere meget selektive PKC nemmere. Gitt den åpenbare demonstrerende binding av visse isozymer til sykdomstilstandene, er det rimelig å anta at de hemmende forbindelsene som er selektive til en eller to proteinkinase C isozymer relativt til andre PKC isozymer og andre proteinkinaser er ypperlige terapeutiske midler. Slike forbindelser demonstrerer større effekt og lavere toksisitet i kraft av deres spesifisitet.

Den mikrobiologiske indolokarbazol, staurosporin, er en potent hemmer av proteinkinase C som reagerer med det katalytiske området av enzymer. Tamaoki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 135: 397-402 (1986); Gross et al., Biochem. Pharmacol. 40: 343-350 (1990). Den terapeutiske nyttigheten av dette molekylet og de nært beslektede forbindelsene er imidlertid begrenset av mangelen på spesifisitet for proteinkinase C i forhold til andre proteinkinaser. Ruegg, U. T. og Burgess, G.M., Trends Pharmacol. Sei. 10: 218-220(1989). Denne mangel på selektivitet resulterer i uakseptabel toksisitet innenfor denne klassen av molekyler.

I tillegg har en klasse av forbindelser som er beslektet med staurosporin, bisindolmaleimidene, vært i fokus i senere arbeid. Davis et al., FEBS Lett. 259: 61-63

(1989); Twoemy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 171: 1087-1092 (1990); Tollec et al., J. Biol. Chem. 266: 15771-15781 (1991); Davis et al., J. Med. Chem. 35: 994-1001 (1992); Bit et al., J. Med. Chem. 36: 21-29 (1993). Noen av disse forbindelsene har vist selektivitet for proteinkinase C i forhold til andre proteinkinaser.

Selv om forbindelser som har demonstrert spesifisitet til proteinkinase C har blitt oppdaget, er meget lite kjent vedrørende isozymselektivitet. Analyse av isozymselektivitet av staurosporin, viser for eksempel lite isozymselektivitet med unntak av dårlig hemming av zeta isozym relativ til andre isozymer. McGlynn et al., J. Cell. Biochem. 49: 239-250 (1992); Ward, N.E., og 0'Brian, C.A., Molec. Pharmacol. 41: 387-392 (1992). Studier av den PKC-selektive forbindelsen, 3-[l-(3-dimetylaminopropyl)-indol-3-yl]-4-(lH-indol-3-yl)-lH-pyrrol-2,5-dion, antyder en svak selektivitet for kalsiumavhengig isozymer. Toullec et al., J. Biol. Chem. 266: 15771-15781 (1991). Etterfølgende studier av denne forbindelsen observerte ingen forskjell, eller en mulig svak selektivitet for alfa i forhold til beta-1 og beta-2 isozymer. Martiny-Baron et al., J. Biol. Chem. 268: 9194-9197 (1993); Wilkinson, et al., Biochem. J. 294: 335-337 (1993). Til tross for mange års forskning og identifikasjon av klasser av forbindelser som hemmer proteinkinase C versus andre proteinkinaser, er det fremdeles et behov for terapeutisk effektive isozym-selektive nemmere.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye, potente proteinkinase C-hemmere. Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse er selektive til proteinkinase C i forhold til andre kinaser, og er relativt overraskende, høyt isozymselektrive. Som selektive nemmere er forbindelsene nyttige i behandling av tilstander forbundet med diabetes mellitus og dens komplikasjoner, iskemi, inflammasjon, forstyrrelser i sentralnervesystemet, kardiovaskulær sykdom, dermatologisk sykdom og cancer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt nye forbindelser som er kjennetegnet ved at de har formelen:

der:

WerO,

R2 er hydrogen,

Z er -(CH2)P-,

R« er -NH(CF3) eller -N(CF3) (CH3),

m er uavhengig 0, 1, 2 eller 3; og

p er uavhengig 0, 1 eller 2; eller

et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav.

En foretrukket forbindelse med formel I har formelen:

der Z er -CH2-; Re er -NH(CF3) eller N(CF3)(CH3).

Oppfinnelsen tilveiebringer også en forbindelse som er kjennetegnet ved at den har formelen:

hvor :

Ver-O-ellerN-CHs-,

WerO,

Z er -(CH2)P-,

Rs er -NH(CF3) eller -N(CF3)(CH3),

m er uavhengig 0, 1, 2 eller 3; og

p er uavhengig 0, 1 eller 2.

Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske formuleringer som er kjennetegnet ved at de har en forbindelse med Formel I sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable eksipienser, bærere eller fortynningsmidler.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen en forbindelse for bruk som terapeutikum, og denne forbindelsen er kjennetegnet ved at den har formel (I).

Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten anvendelse av forbindelsen med formel I for fremstilling av et legemiddel som har proteinkinase C-inhiberende effekt.

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av en forbindelse med formel I for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en tilstand valgt fra sentral iskemisk hjerneskade, kardiovaskulær iskemi, inflammasjon, restenose, aterosclerose, psoriasis, Alzheimers sykdom, kreft og diabetes mellitus.

I sammenheng med foreliggende oppfinnelse slik den er beskrevet og omtalt her, har følgende begreper og forkortelser de nedenfor angitte betydninger.

Begrepet "halogen" representerer fluor, klor, brom eller jod.

Begrepet "avspaltbar gruppe" slik det er anvendt her er kjent av personer med kunnskap innenfor fagområdet. En avspaltbar gruppe er generelt en hvilken som helst gruppe eller atom som forbedrer elektrofilisiteten til atomet til hvilket det er festet for erstatning. Foretrukkede avspaltbare grupper er triflat, mesylat, tosylat, imidat, klorid, bromid og jodid. Dersom alkyleringsmiddelet inneholder en aminosyreresidie (dvs. X, W og Y kombineres til å danne -(CH2)n-AA-) er den avspaltbare gruppen festet til karboksy fortrinnsvis pentafluorfenylester eller para-nitrofenylester.

Begrepet "karboksybeskyttende gruppe" slik det er anvendt her, refererer til en av esterderivatene av karboksylsyregruppen som vanligvis benyttes til å blokkere eller beskytte karboksylsyregruppen mens reaksjonen blir gjennomført på andre funksjonelle grupper på forbindelsen. Delene av karboksy-beskyttende grupper som benyttes er ikke kritisk så lenge den derivatiserte karboksylsyren er stabil til tilstanden i etterfølgende reaksjon(er) og kan bli fjernet ved passende punkt uten å forstyrre det gjenværende av molekylet. T.W. Greene og P. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis.^ John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991, kapittel 5, angir en liste av vanlig benyttede beskyttelsesgrupper. Se også E. Haslam, Protective Groups in Organic Chemisuy, J.G.W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, N.Y., 1973. Et beslektet begrep er "beskyttet karboksy" som refererer til en karboksybeskyttende gruppe.

Begrepet "hydroksybeskyttende gruppe" slik den blir anvendt heri, refererer til en av eter eller esterderivatene av hydroksygruppen som vanligvis benyttes til å blokkere eller beskytte hydroksygruppen mens reaksjonen blir gjennomført på andre funksjonelle grupper på forbindelsen. Typene av hydroksybeskyttende grupper som benyttes er ikke kritisk så lenge den derivatiserte hydroksygruppen er stabil under betingelsene ved etterfølgende reaksjon(er) og kan fjernes ved et passende stadium uten å forstyrre resten av molekylet. T.W. Greene og P. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis,, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991, skaffer tilveie en liste a vanlig benyttede beskyttelsesgrupper. Foretrukkede hydroksybeskyttende grupper er tert-butyldifenylsilyloksy (TBDPS), tert-butyldimetylsilyloksy (TBDMS), trifenylmetyl (trityl), metoksytrityl eller en alkyl eller arylester. Et beslektet begrep er "beskyttet hydroksy", som refererer til en hydroksybeskyttende gruppe.

Begrepet "aminbeskyttende gruppe" slik det blir anvendt heri, refererer til substituenter av aminogruppen som vanligvis benyttes til å blokkere eller beskytte amino-funksjonaliteten mens andre funksjonelle gruppe på forbindelsen blir reagert. Forbindelsen av amino-beskyttende grupper som benyttes er ikke kritisk så lenge den derivatiserte aminogruppen er stabil til tilstanden og etterfølgende reaksjon(er) og kan fjernes på et passende stadium uten å forstyrre resten av molekylet. T.W. Greene og P. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, kapittel 7, gir en liste av vanlig benyttede-beskyttelsesgrupper. Se også J. W. Barton, Protective Groups in Organic Chemistry.^ kapittel 2. Foretrukkede aminobeskyttende grupper er t-butoksykarbonyl, ftalimid, en cyklisk alkyl og benzyloksykarbonyl. Det beslektede begrep "beskyttet amin" definerer en amingruppe substituert med en aminbeskyttende gruppe som definert.

Begrepet "-NH beskyttende grupper" slik det blir anvendt heri refererer til under-klasse av aminbeskyttende grupper som vanligvis benyttes til å blokkere eller beskytte -NH funksjonaliteten mens andre funksjonelle grupper på forbindelsen reagerer. Forbindelsene av beskyttelsesgruppen som benyttes er ikke kritisk så lenge den derivatiserte amingruppen er stabil under betingelsene for etterfølgende reaksjon(er) og kan bli fjernet ved passende punkt uten å forstyrre det gjenværende av molekylet. T.W. Greene og P. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis* kapittel 7, s. 362-385, angir en liste av vanlige benyttede beskyttende grupper. Foretrukkede -NH beskyttende grupper er karbamat, amid, alkyl eller arylsulfonamid. Det beslektede begrep "beskyttet -NH" definerer en gruppe substituert med en -NH beskyttende gruppe som definert.

Begrepet "farmasøytisk effektiv mengde" slik det her blir anvendt, representerer en mengde av en forbindelse i oppfinnelsen som har evne til å hemme PKC aktivitet i pattedyr. Den spesielle dosen av forbindelsen som blir administrert i henhold til oppfinnelsen vil naturligvis bestemmes av de spesielle omstendigheter som omgir tilfellet, inkludert den administrerte forbindelsen, administreringsvei, den spesielle tilstand som skal behandles og tilsvarende betraktninger. Forbindelsene kan administreres ved tallrike administreirngsveier inkludert oralt, rektalt, transtermalt, sukutant, topisk, intravenøst, intramuskulært eller intranasalet. For alle indikasjoner vil en typisk daglig dose inneholde fra 0,1 mg/kg til 20 mg/kg av den aktive forbindelsen i oppfinnelsen. Foretrukkede daglige doser vil være 0,05 til 10 mg/kg, ideelt 0,1 til 5 mg/kg. For topisk administrering er imidlertid en typisk dosering 1 til 500 ug forbindelse pr. cm<2> av et påvirket vev. Den påførte mengden av forbindelsen vil fortrinnsvis være i området fra 30 til 300 ug/cm<2>, mer å foretrekke fra 50 til 200 ug/cm<2>, og mest å foretrekke fra 60 til 100 ug/cm<2>.

Begrepet "behandling" slik det her benyttes, beskriver behandling og pleie av en pasient med det formål å overvinne sykdom, tilstand eller forstyrrelse og innbefatter administrering av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse for å hindre igangsetting av symptomer eller komplikasjoner, lindre symptomer eller komplikasjoner eller eliminere sykdommen, tilstanden eller forstyrrelsen.

Begrepet "isozymselektiv" menes preferansehemming av proteinkinase C beta-1 eller beta-2 isozym i forhold til proteinkinase C isozymer, alfa, gamma, delta, epsilon, zeta og eta. Generelt viser forbindelsene minimum en åtte ganger forskjell (fortrinnsvis en ti ganger forskjell) i doser som er nødvendig for å hemme PKC beta-1 eller beta-2 isozym og dosering som er nødvendig for lik hemming av alfa proteinkinase C isozym som målt i PKC analysen. Forbindelsene demonstrerer denne forskjell i hele hemmingsområdet og blir eksemplifisert ved IC50, dvs. en 50% hemming. Isozym-selektive forbindelser hemmer beta-1 og beta-2 isozymer av proteinkinase C i mye lavere konsentrasjoner med lavere toksisitet i kraft av deres minimale hemming av andre PKC isozymer.

Som angitt over, tilveiebringer oppfinnelsen forbindelser med Formel I som selektivt hemmer proteinkinase C. De foretrukkede forbindelsene ifølge oppfinnelsen er som nevnt de forbindelsene med Formel I der Z er -(CH2)P-; og R6 er NH(CF3) eller N(CH3)(CF3) eller m er uavhengig av hverandre 0, 1, 2 eller 3 og p er 1.

I kraft av deres sure deler, innbefatter forbindelsene med Formel I de farmasøytisk akseptable baseaddisjonssaltene derav. Slike salter innbefatter de som er avledet fra uorganiske baser slik som ammonium og alkali- og jordalkalimetallhydroksider, karbonater, bikarbonater og lignende, så vel som salter avledet fra basiske organiske aminer slik som alifatiske og aromatiske aminer, alifatiske diaminer, hydroksyalkaminer og lignende. Slike baser er nyttige ved fremstilling av salter i oppfinnelsen og innbefatter således ammoniumhydroksid, kaliumkarbonat, natriumbikarbonat, kalsiumhydroksid, metylamin, dietylamin, etylendiamin, cykloheksylamin, etanolamin og lignende.

På grunn av den basiske delen, kan forbindelsene i Formel I også eksistere som farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter. Syrene som vanligvis blir benyttet for å danne slike salter innbefatter uorganiske syrer slik som saltsyre, bromsyre, jodsyre, svovelsyre og fosforsyre, så vel som organiske syrer som para-toluensulfonsyre, metansulfonsyre, oksalsyre, para-bromfenylsulfonsyre, karbonsyre, ravsyre, sitronsyre, benzosyre, eddiksyre og beslektede uorganiske og organiske syrer. Slike farmasøytisk akseptable salter innbefatter således sulfat, pyrosulfat, bisulfat, sulfitt, bisulfitt, fosfat, mono-hydrogenfosfat, dihydrogenfosfat, metafosfat, pyrofosfat, klorid, bromid, jodid, acetat, propionat, decanoat, kaprylat, akrylat, formiat, isobutyrat, heptanoat, propionat, karprylat, akrylat, formiat, isobutyrat, heptanoat, propiolat, oksalat, malonat, succinat, suberat, sebacat, fumarat, maleat, 2-butyn-l,4-dioat, 3-heksyn-2, 5-dioat, benzoat, klorbenzoat, hydroksybenzoat, metoksybenzoat, ftalat, xylensulfonat, fenylacetat, fenylpropionat, fenylbutyrat, citrat, laktat, hippurat, B-hydroksybutyrat, glykollat, maleat-, tartrat, metansulfonat, propansulfonat, naftalen- 1-sulfonat, naftalen-2-sulfonat, mandelat og lignende salter.

I tillegg til farmasøytisk-akseptable salter, er andre salter innbefattet i oppfinnelsen. De kan tjene som mellomprodukter i rensing av forbindelsene, i fremstilling av andre salter, eller i identifikasjon og karakterisering av forbindelsene eller mellomproduktene.

De farmasøytisk akseptable saltene fra forbindelsene med Formel I kan også eksistere som forskjellige solvater, slik som med vann, metanol, etanol, dimetylformamid, etylacetat og lignende. Blandinger av slike solvater kan også bli fremstilt. Kilden for slikt solvat kan være fra krystallisasjonsoppløsningsmiddelet, tilstedeværende i oppløsningsmiddelet for fremstilling eller krystallisasjon, eller tilfeldig til slikt oppløsningsmiddel. Slike solvater omfattes av foreliggende oppfinnelse.

Det er anerkjent at forskjellige stereoisomere former til forbindelser med Formel I kan eksistere; f. eks. kan W inneholde et kiralt karbonatom i den substituerte alkylendelen. Forbindelsene blir normalt fremstilt som racemater, og kan hensiktsmessig bli anvendt slik, men individuelle enantiomerer kan bli isolert eller syntetisert ved konvensjonelle teknikker dersom det er ønskelig. Slike racemater og individuelle enantiomerer og blandinger av disse danner en del av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter også de farmasøytisk akseptable promedikamentene av forbindelser med Formel I. Et promedikament er et medikament som har blitt kjemisk modifisert og kan være biologisk inaktivt på virkningsstedet, men som kan nedbrytes eller modifiseres av en eller flere enzymatiske eller andre in vivo prosesser til den opprinnelige bioaktive form. Dette promedikamentet bør ha en forskjellig farmakokinetisk profil enn det opprinnelige, muliggjør enklere absorpsjon over mukosal epitelium, bedre saltdannelse eller oppløselighet, og/eller forbedret systemisk stabilitet (f.eks. en økning av plasma-halveringstid). Slike kjemiske modifikasjoner innbefatter typisk følgende: 1) ester eller amidderivater som kan kløyves med esteraser eller lipaser; 2) peptider som kan gjenkjennes av spesifikke eller ikke-spesifikke proteaser; eller 3) derivater som akkumuleres på virkningsstedet gjennom membranseleksjon av en promedikamentform eller en promedikamentform; eller en hvilken som helst kombinasjon av 1 til 3, over. Konvensjonelle prosedyrer for seleksjon og fremstilling av egnede promedikament derivater er beskrevet, f.eks. i H., Bundgaard, Design of Prodrugs1

(1985).

Syntese av visse bis-indol-N-maleimidderivater er beskrevet i Davis et al., US patent 5,057,614. Generelt kan slike forbindelser fremstilles som følger:

Halo, dvs halogen, er de samme som tidligere definert. Halogen er fortrinnsvis klor, brom eller jod. Forbindelse III er fortrinnsvis 2,3-diklor N-metylmaleimid.

Reaksjonen mellom Forbindelse III og indolet, Forbindelse IV er vanligvis kjent som en Grignard-reaksjon. Reaksjonen gjennomføres i et inert organisk oppløsningsmiddel, slik som toluen, ved en temperatur mellom romtemperatur og tilbakestrømstemperaturen i reaksjonsblandingen. Det viktigste med reaksjonen som er vist i Skjema 1, er at den er avhengig av oppløsningsbetingelser. Når den gjennomføres i toluen:THF:eter oppløsningsmiddelsystem, vil reaksjonen gi Forbindelse V i mer enn 80% utbytte og mer enn 95% renhet. Produktet utfelles fra reaksjonsblandingen med ammoniumklorid, NH4CI. Resulterende mellomprodukt, Forbindelse V, kan isoleres ved standard teknikker.

Bis-3,4(3'-indolyl)-lN-metyl-pyrrol-2,5-dion, Forbindelse V, kan deretter omdannes ved alkalisk hydrolyse til tilsvarende anhydrid med Formel VI ved teknikker som er kjent innenfor fagområdet og beskrevet i Brenner et al., Tetrahedron 44: 2887-2892 (1988). Forbindelse V blir fortrinnsvis omsatt med 5 N KOH i etanol ved en temperatur i området fra 25°C til tilbakestrømning.

Forbindelser med Formel V er generelt mer stabile enn Forbindelser med Formel VI. Det er derfor foretrukket at Forbindelsene V omsettes i overensstemmelse med Skjema 2 for å oppnå forbindelser med Formel I. En person med kunnskap innenfor fagområdet erkjenner at forbindelsene med Formel VI også kan reageres i henhold til Skjema 2.

Z, og m er de samme som tidligere definert. L er en god avspaltbar gruppe slik som klor, brom, jod, mesyl, tosyl og lignende. L kan også være hydroksy eller annen forløper som raskt kan bli omdannet til en god avspaltbar gruppe ved teknikker som er kjent innenfor fagområdet. Hydroksy kan f. eks. raskt bli omdannet til en sulfonester slik som mesyl ved reaksjon av hydroksy med metansulfonylklorid for å produsere mesylatavspaltbar gruppe.

Reaksjonen representert ved Skjema 2 gjennomføres ved hvilke som helst av de kjente - metoder ved fremstilling av N-substituerte indoler. Denne reaksjonen involverer vanligvis tilnærmet ekvimolare mengder av to reagenser, selv om andre forhold, særlig de som alkyleringsreagenser er i overskudd, er operative. Reaksjonen gjennomføres best i et polart aprotisk oppløsningsmiddel som benytter et alkalimetallsalt eller andre slike alkyleringsbetingelser som de som er anerkjent innenfor fagområdet. Når den avspaltbare gruppen er brom eller klor, kan en katalytisk mengde av jodidsalt, slik som kaliumjodid bli tilsatt for å øke reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene innbefatter følgende: Kaliumheksametyldisilazid i dimetylformamid eller tetrahydrofuran, natriumhydrid i dimetylformamid.

Reaksjonen blir fortrinnsvis gjennomført under langsom revers tilsetning med cesiumkarbonat i enten acetonitril, dimetylformamid (DMF) eler tetrahydrofuran (THF). Temperaturen i reaksjonen er fortrinnsvis fra omgivelsestemperatur til tilbakeløps-temperatur i reaksjonsblandingen.

En person med kunnskap innenfor fagområdet er kjent med at reaksjonen som er beskrevet i Skjema 2 kan bli benyttet med forbindelser med Formel Vila:

X' og Y' er beskyttet karboksy, beskyttet hydroksy eller et beskyttet amin. Etter alkylering av Skjema 2, kan X' og Y' omdannes til deler som har evne til å koble for å danne forbindelsen i oppfinnelsen. Denne fremgangsmåten er den foretrukkede metoden for å fremstille forbindelser med Formel I der W er -S-, -O- eller NH. Kobling av X' og Y' for å danne forskjellige eter, tioeter eller aminoeterderivater er kjent innenfor fagområdet og beskrevet i f.eks. Ito, et al., Chem. Pharm. Bull. 41 (6): 1066-1073

(1993); Kato, et al., J. Chem. Pharm. Bull. 34: 486 (1986); Goodrow, et al., Synthesis 1981: 457; Harpp, et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 2437 (1971); og Evans, et al., J. Org. Chem. 50: 1830(1985).

En person med kunnskap innenfor fagområdet er også oppmerksom på at reaksjonen i Skjema 2 kan bli gjennomført ved å anvende passende beskyttelsesgrupper som en totrinns syntese. Det innebærer å anvende passende beskyttelsesgruppe-alkylering av hver indolylnitrogen av forbindelse med Formel V og VI kan foregå som beskrevet her i-to trinn (alkylering av en indolyl under langsom revers tilsetning og deretter lukking av makrocyklus ved alkylering av andre indolyl).

Det mest uventede er at forbindelsen i oppfinnelsen kan bli fremstilt i vesentlig høyere utbytte når alkylering blir gjennomført under langsom revers tilsetning til CS2CO3 i et polart aprotisk oppløsningsmiddel. Langsom revers tilsetning involverer kombinering av en blanding av forbindelse og alkyleringsmiddelet med en base ved en hastighet fra 0,1 ml/time til 2,0 ml/time. Konsentrasjonen av hvert reagens i blandingen er 1,5 molar til 0,001 molar. Langsom tilsetning resulterer i en konsentrasjon av reagenser i reaksjonsbeholderen på 0,01 umolar til 1,5 molar. En person med kunnskap innenfor fagområdet er klar over at en høyere hastighet på tilsetning av lavere konsentrasjon av reagenser kan bli anvendt i reaksjonen. På samme måte kan en langsommere tilsetningshastighet, og en høyere konsentrasjon av reagenser kan anvendes i reaksjonen. Forbindelsen blir fortrinnsvis tilsatt ved 0,14 ml/time med forbindelsen og alkyleringsmiddelet ved 0,37 molar. Det er foretrukket at CS2CO3 blir tilsatt i overskudd - mest å foretrekke et 4:1 forhold CS2CO3 til alkyleringsmiddelet. Foretrukkede polare aprotiske oppløsnings-midler er acetonitril, dimetylformamid (DMF), aceton, dimetylsulfoksid (DMSO), dioksan, dietylenglykolmetyleter (diglyme), tetrahydrofuran (THF) eller andre polare aprotiske oppløsningsmidler hvori reagensene er oppløselige. Reaksjonen blir gjennomført ved temperaturer i området fra 0°C til tilbakeløstemperatur. En person med kunnskap innenfor fagområdet erkjenner at forholdet av blandingen av forbindelsen og alkyleringsmiddelet ikke er kritisk. Det er imidlertid foretrukket at reagensene blir blandet i et forhold fra 0,5 til 3 ekvivalenter av hverandre. Det er mest å foretrekke at reagensene blir blandet 1:1.

Når V er N-CH3, blir Forbindelse II omdannet til tilsvarende anhydrid (V er O) ved alkalisk hydrolyse. Alkalisk hydrolyse involverer reagering av forbindelsen med en base, slik som natriumhydroksid eller kaliumhydroksid, i C1-C4 alkohol (fortrinnsvis etanol), DMSO/vann, dioksan/vann eller acetonitril/vann ved en temperatur i området fra 25°C til fortrinnsvis tilbakeløpstemperatur. Konsentrasjonen av reaktantene er ikke kritisk.

Anhydridet (V er O) blir omdannet til maleimid ved Formel I ved aminolyse. Aminolyse involverer reagering av anhydridet med et overskudd heksametyldisilazan eller et ammoniumsalt (ammoniumacetat, bromid eller klorid) og C1-C4 alkohol (fortrinnsvis metanol) i et polart aprotisk oppløsningsmiddel som DMF ved romtemperatur. Heksametyldisilazan eller et ammoniumsalt blir fortrinnsvis reagert ved et forhold som er høyere enn 5:1 ekvivalenter av anhydrid.

Ifølge oppfinnelsen er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge hvilket som helst av de medfølgende krav 1 og 2, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved omsetning av en forbindelse av formel:

hvor:

Ver -O-ellerN-CH3-,

WerO,

Z er -(CH2)P-,

Rs er -NH(CF3) eller -N(CF3)(CH3),

m er uavhengig 0, 1, 2 eller 3; og

p er uavhengig 0, 1 eller 2,

med et overskudd av en blanding av en reagens og en C1-C4 alkohol i et polart aprotisk oppløsningsmiddel hvor nevnte reagens velges fra heksametyldisilazan eller et ammoniumsalt.

Et mellomprodukt i foreliggende oppfinnelse fremstilles i overensstemmelse med Skjema 3. Rg er N3, NH-beskyttende gruppe, aminbeskyttende gruppe eller hydroksybeskyttende gruppe; m er uavhengig av hverandre 0, 1, 2 eller 3; og L er en god avspaltbar gruppe slik som klor, brom, jod, mesyl, tosyl og lignende. L er fortrinnsvis mesyl. Rg er fortrinnsvis en beskyttet hydroksy, mest å foretrekke -Otrityl. Skjema 3 representerer en stereoselektiv syntese av sammenbindingsdelen av makrocyklusen. S-enantiomeren er illustrert over; imidlertid vil en person med kunnskap innenfor fagområdet erkjenne at den komplementære enantiomer eller blandingen av enantiomerer kan fremstilles på analog måte. En person med kunnskap innenfor fagområdet er oppmerksom på at en analog reaksjon med et metylsubstituert epoksid eller Grignard reagens vil bli anvendt for å fremstille forskjellige sammenbindinger som inneholder en metylsubstituert alkylen.

I reaksjonen over blir epoksidet, Forbindelse (XIV), åpnet ved å anvende et Grignard reagens. Reaksjonen gjennomføres i nærvær av kobberkomplekseringsmiddel; imidlertid er andre alkyleringsbetingelser operative. Reaksjonen gjennomføres i et inert oppløsningsmiddel ved en temperatur mellom -30°C og tilbakestrømstemperatur av reaksjonsblandingen. Reaksjonen git Forbindelse (XV) som kan bli ytterligere reagert uten rensing. Forbindelse (XV) allyleres under generelle betingelser kjent innenfor fagområdet for fremstilling av etere. Reaksjonen som er illustrert i Skjema 3, er en Williamson syntese. Dannelse av natriumalkoksid ved å anvende NaH, NaOH eller KOH etterfulgt av allylering med allylbromid gir dienforbindelsen, Forbindelse (XVI). Forbindelse (XVI) omdannes til alkoholen, Forbindelse (XVII), under standard teknikker. Forbindelse (XVI) kan f. eks. omdannes til et ozonid ved behandling med ozon ved lave temperaturer. Ozonidet blir deretter redusert med NaBIL, LiAlFLt, BH3 eller katalytisk hydrogenering med overskudd H2 for å oppnå alkoholen, Forbindelse (XVII). Hydroksydelene av Forbindelse (XVII) omdannes til en avspaltbar gruppe L ved standard teknikker som reaksjon av alkohol med mesylklorid i trietylamin.

I alle skjemaene over er det foretrukket at reaksjonen gjennomføres med passende beskyttelsesgrupper. Det er særlig foretrukket at Ri beskyttes under alkylering og/eller acyleringer og etterfølgende avbeskyttelse. Dersom Ré på samme måte skal være en - NH(CF3), blir reaksjonene best gjennomført med en aminbeskyttende gruppe. En person med kunnskap innenfor fagområdet er klar over at mange av disse modifikasjonene kan gjennomføres uten beskyttelsesgrupper dersom passende reaksjonsbetingelser, blokkeringsmidler eller lignende blir anvendt. Det er foretrukket at når nanocyklusene inneholder en hydroksydel, så er den beskyttet som tert-butyldifenylsilyloksy (TBDPS) eller trifenylmetyl (trityl) under alkyleringen eller acyleringen av indolen. De resulterende forbindelsene med Formel I kan isoleres og renses ved standard teknikker.

Forbindelser i Skjemaene 1 - 3 og eventuelle andre reagenser som er nødvendig for ovenfor nevnte reaksjoner, er enten kommersielt tilgjengelig, kjent innenfor fagområdet eller kan fremstilles ved metoder som er kjent innenfor fagområdet. Forbindelse III kan feks. fremstilles ved teknikker som er beskrevet i Edge et al., Chem. and Ind. 130

(1991); Forbindelse IV blir fortrinnsvis fremstilt in situ ved reagering av passende substituert indol med et alkylmagnesiumhalogenid slik som etylmagnesiumbromid på kjent måte.

Følgende eksempler og fremstillinger skal ytterligere illustrere oppfinnelsen. For å hjelpe en person med kunnskap innenfor fagområdet, blir følgende struktur tilveiebragt for å illustrere med en representativ forbindelse nomenklaturen som her blir benyttet:

I følgende eksempler og fremstillinger, er smeltepunkt, kjernemagnetisk resonansspektra, massespektra, høytrykksvæskekromatografi over silikagel, N,N-dimetylformamid, palladium på trekull, tetrahydrofuran og etylacetat forkortet henholdsvis M.Pt, NMR, - MS, HPLC, DMF, Pd/C, THF og EtOAc. Begrepene "NMR" og "MS" viser at spektra var i overensstemmelse med den ønskede struktur.

Fremstilling 1

2. 3 - bis- f 3' - indolylVfuran- 1. 4- dion

Natriumetoksid (3,56 g, 50 mmol) ble tilsatt til en oppløsning inneholdende 2,3-diklormaleinanhydrid (5,56 g, 33,3 mmol) og metylamin hydroklorid (3,50 g, 55,0 mmol) i 40 ml eddiksyre. Blandingen ble omrørt under et CaCk tørkerør ved 25°C i 16 timer og deretter tilbakestrømmet i 4 timer. Den avkjølte blandingen ble tømt i vann (350 ml) og ekstrahert med EtOAc (3 x 75 ml). De kombinerte organiske ekstraktene ble vasket med 100 ml porsjoner av mettet vandig NaHCCb, vann og saltvann og tørket (MgS04). Oppløsningsmiddelet ble inndampet under redusert trykk. Resten ble krystallisert på nytt fra etanol og ga 3,82 g (64%) av 2,3-diklor N-metylmaleimid som hvite krystaller. Konsentrasjon av den opprinnelige væsken og kromatografi av resten ved radial preparativ lagkromatografi (Chromatotron, Harrison Research), ga ytterligere 0,81 g av 2,3-diklor N-metylmaleimid, og hever utbyttet til 77%.

En oppløsning av indol (10,5 g, 90 mmol) i 175 ml tørr toluen ble behandlet dråpevis i løpet av 1 time under N2 med en oppløsning av etylmagnesiumbromid (1,0 M i THF, 90 ml, 90 mmol). Etter at tilsetningen var fullført, ble den lysegrønne løsningen oppvarmet ved 40°C i 30 minutter og deretter avkjølt til 25°C. En oppløsning av 2,3-diklor N-metylmaleimid (3,8 g, 21 mmol) i 50 ml toluen ble tilsatt i løpet av en 30 minutters periode. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet ved 100°C i 3 timer, deretter avkjølt til 25°C og bråstanset med 100 ml av 20% vandig sitronsyre. Lagene ble separert. Den vandige fasen ble ekstrahert med EtOAc (50 ml). De kombinerte organiske lagene ble tørket over vannfri MgSCv Oppløsningsmiddelet ble inndampet under redusert trykk. Resten ble tatt opp i 30 ml aceton og fikk anledning til å stå ved 5°C i 40 timer. De faste stoffene ble samlet og vasket med iskald eter og ga 5,25 g (73%) av 3,4-bis-(3'-indolyl)-l-metyl-pyrrol-2,5-dion som et rødt faststoff. Smp. 276 - 278°C.

Til en oppløsning av 3,4-bis-(3'-indolyl)-l-metyl-pyrrol-2,5-dion i 150 ml etanol ble tilsatt 5N KOH (50 ml). Blandingen ble omrørt i 4 timer ved 25°C og fortynnet med 150 ml vann. Det meste av etanolen ble inndampet under redusert trykk. Blandingen ble deretter surgjort til pH 1. Det utfelte produktet ble filtrert og vasket med vann. Råproduktet ble oppløst i minimum CH2CI2 og langsomt filtrert gjennom en 5 cm kolonne av silikagel eluert med 50% EtOAc i heksan for å gi tittelforbindelsen (3,10 g, 79%) som et rødt faststoff. Smp. 225 - 228°C.

Fremstilling 2

l-( fert- butyldimetylsilylofe^

Til en vannfri CH2C12 (110 ml) oppløsning av 3-buten-l-ol (15 g, 0,21 mol) ble det tilsatt imidazol (28,6 g, 0,42 mol, 2 eq) etterfulgt av fe^butyldimetylsilylklorid (32 g, 0,22 mol). Etter 90 minutter var reaksjonen fullført som angitt ved TLC (10% EtOAc/heksan). CH2C12 oppløsningen ble overført til en skilletrakt, fortynnet med CH2C12 (110 ml), vasket med vann (200 ml) og saltvann (200 ml). Det organiske laget ble samlet, tørket over MgSCU, filtrert og oppløsningsmiddelet ble fjernet for å gi en olje (l-(0-TBDMS)-3-buten) som ble tatt til neste reaksjon. MS.

Oljen over ble oppløst i en blanding av aceton (400 ml) og vann (50 ml). N-metylmorfolin-W-oksid (85,2 g, 0,63 mol, 3 eq) ble deretter tilsatt. Den resulterende slurryen ble avkjølt til 0°C og etter 10 minutter ble en katalytisk mengde Os04 (0,3 g) tilsatt. Den resulterende slurryen fikk anledning til å omrøre over natten, gradvis oppvarmet til romtemperatur. TLC (25% ETOAc/heksan) viste at reaksjonen var fullført. Reaksjonsblandingen ble bråstoppet med natriumbisulfitt, fortynnet med eter (1 1), vasket med vann (400 ml) og saltvann (400 ml). Det organiske laget ble samlet. Det vandige laget ekstrahert med eter (2 x 500 ml). De kombinerte organiske lagene ble tørket, filtrert og konsentrert for å gi 4-(0-TBDMS)-l,2-butandiol som en olje, som ble tatt på til neste reaksjon.

Oljen over ble oppløst i vannfri CH2C12 (250 ml). Imidazol (30 g, 0,44 mol, 2,5 eq) ble tilsatt til oppløsningen som et faststoff under omrøring. Den resulterende oppløsningen ble avkjølt til 0°C. Etter avkjøling i 15 minutter ble en CH2C12 (50 ml) oppløsning av fert-butyldifenylsilylklorid (50 g, 0,18 mol, 1 eq) ble dråpevis tilsatt i løpet av 45 minutter. Etter at tilsetningen var fullført, ble omrøring fortsatt ved 0°C i 2,5 timer. Løsningen ble overført til en skilletrakt, fortynnet med CH2C12 (250 ml), vasket med vann, saltvann, tørket over MgS04 og filtrert. Oppløsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk, ga produktet som en olje. Råproduktet ble renset ved å eluere (10% EtOAc/heksan) det gjennom en kort kolonne av silikagel. Elueringsoppløsningsmiddelet ble fjernet i vakuum og det ble igjen en viskøs olje av mellomproduktet i tittelen. (78,1 g, 93% samlet utbytte). MS.

Fremstilling 3

1 -( fer?- butyldimetylsilyloksy)- 3 -( 3 - jodpropyloksy)- 4-( efr/- butyldifenylsilyloksy)- butari

Til en metylenklorid (20 ml)/cykloheksan (100 ml) oppløsning av alkoholen fra Fremstilling 4 ble tilsatt allyl trikloracetamid (17,82 g, 88 mmol, 2,2 eq) under en N2 ballong etterfulgt av trifluormetansulfonsyre (50 ul/g av utgangsmaterialet, 0,92 ml). Etter 20 timer ble oppløsningen filtrert, og filtratet ble vasket med mettet vandig NaHCC>3, vann og deretter saltvann. Det organiske laget ble samlet og tørket over MgSC>4. Oppløsningsmiddel ble fjernet for å gi en olje, som ble renset ved flash-kromatografi på silikagel eluert med heksaner og økning av polariteten til den mobile fasen til 5% etylacetat i heksaner i løpet av flere liter for å gi 19,27 g av allyleter, l-(tert-butyldimetylsilyloksy)-3-(propenoksy)-4-(ter?-butyldifenylsilyloksy)-butan som en lys brun olje (97% utbytte). MS.

Til THF (60 ml) oppløsning av den ovenfor nevnte allyleteren (14,16 g, 28,38 mmol, 1 eq) ble det tilsatt 9-BBN (9-borabicyklo[3.3.1]nonan, 0,5 M oppløsning i THF, 60 ml, 30 mmol, 1,1 eq) dråpevis under nitrogen. Etter 3 timer viste TLC (10% EtOAc i heksaner) fra reaksjonen at utgangsmaterialet hadde blitt konsumert. Til denne oppløsningen ble det tilsatt 3M vandig NaOH (10,41 ml, 31,22 mmol, 1,1 eq) etterfulgt av langsom (1,5 t) dråpevis tilsetning av 30% hydrogenperoksid (10,3 ml, 90,82 mmol, 3,2 eq). Reaksjonstemperaturen under peroksidtilsetningen ble holdt under 50°C (isbad).

Etter 30 minutter ble natriumklorid tilsatt inntil oppløsningen ble mettet. Det organiske laget ble fjernet; det vandige lag ble ekstrahert med eter; det kombinerte organiske laget ble tørket og filtrert; og filtratet konsentrert for å gi en olje. Råoljen ble renset ved flash kromatografi på silikagel eluering med 10% EtOAc/heksaner og økning av polariteten til 20% EtOAc/heksaner etter ca. 1,5 liter oppløsningsmiddel for å gi 9,53 g av en lys gul olje (65% utbytte). MS.

Til en vannfri 0°C eteroppløsning (150 ml) av alkoholen over ble det tilsatt trietylamin (2,93 g, 28,91 mmol, 1,5 eq) etterfulgt av dråpevis tilsetning av mesylklorid (3,31 g,

28,91 mmol, 1,5 eq) under kraftig omrøring. Etter 3 timer ved 0°C viste TLC (10% EtOAc i heksaner) at utgangsmaterialet var forbrukt. Reaksjonen ble fortynnet med eter, vasket med vann, saltvann, tørket over MgS04 og oppløsningsmiddelet ble fjernet. Den resulterende oljen ble ført gjennom en pute av silika eluert med 25% ETOAc/heksaner,

og elueringsmiddelet ble konsentrert. Til en acetonoppløsning (200 ml) av den

resulterende oljen ble det tilsatt NaHC03 (0,17 g, 1,93 mmol, 0,1 eq), og Nal (28,88 g, 192,7 mmol, 10 eq). Etter omrøring i 30 minutter ved romtemperatur under en nitrogenatmosfære, ble reaksjonen oppvarmet til 50°C med et vannbad. Etter 2,5 timer viste TLC (10% EtOAc i heksaner) at mesylatet var forbrukt. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med eter (500 ml), vasket med kald mettet vandig Na2S03, vann, saltvann, tørket (MgS04) og oppløsningsmiddelet fjernet. Den resulterende oljen ble ført gjennom en silikagel pute eluert med 5% EtOAc i heksaner og ga den rensede tittelforbindelsen 10,3 g som en fargeløs olje (85% utbytte).

Fremstilling 4

f±) 3. 4- rN. NM. lV3''- 3- tert- butvldfe^^

1 ( metylVpyrrol- 2. 5 - dion

En DMF (50 ml) oppløsning av bis-(3,3'-indolyl)]-l-(metyl)-pyrrol-2,5-dion (3,41 g, 10,0 mmol) inneholdende dibromidet 3-fer^butyldifenylsilyloksymetylen-l,6-dibromheksan (5,64 g, 11 mmol, fremstilt på en analog måte som benzoylderivatet i Fremstilling 2) ble tilsatt ved å anvende en sprøytepumpe i løpet av en 15 timers periode til en DMF slurry (350 ml) av Cs2C03 (11,2 g, 34,3 mmol) ved 60°C. Etter 4 timer fra fullføring av reaksjonen, ble reaksjonen avkjølt til romtemperatur, tømt i vann (1,5 1) og ekstrahert med CH2CI2 (3 x 300 ml). Den organiske fasen ble vasket med vann, tørket, filtrert og konsentrert. Konsentratet ble renset ved flash kromatografi eluert med 10% til 25% etylacetat/heksan for å gi makrocyklusen 3,4-[(N,N'-l,l'-(3"-3-terr-butyldifenylsilyloksymetylen)heksan)-bis-(3,3'-indolyl)]-l(metyl)-pyrrol-2,5dion. 2,95 g (43% utbytte som en rød olje. MS.

Fremstilling 5

( S Vmetyl 4- tert- butyldifenylsilyloksy- 3 -( aUyloksy) butyrat

Til en cykloheksanoppløsning (400 ml) av (S)-metyl 4-tert-butyldifenylsilyloksy-3-

) (hydroksy)butyrat (20,0 g, 53,7 mmol) ble det tilsatt allyltrikloracetimidat (21,74 g,

107,4 mmol), etterfulgt av trifluormetansulfonsyre (1 ml, 50 ml/g alkohol) i fem porsjoner i løpet av 30 minutter, med omrøring under en nitrogenatmosfære. Etter 70 timer ble de faste stoffene som var dannet filtrert, og filterkaken ble vasket med

cykloheksan, og de flyktige forbindelsene ble fjernet i vakuum. Den resulterende oljen

> ble plassert på en plugg av silika og vasket med heksan, og produktet eluert med 10%

etylacetat/heksan. NMR viste tilstedeværelse av resterende imidat (ca. 10%); materialet

ble imidlertid fortsatt uten ytterligere rensing. Restutbyttet 24,76 g av materialet, på tilnærmet 22,2 g var det ønskede produkt (100%). MS.

Fremstilling 6

( SV4- fe/,/- butyldifenylsilyloksy- 3-( 2- jodetoksy)- l- jodbutan

DIBAL-H (231 ml, 1,0 M i toluen, 231 mmol) ble tilsatt dråpevis i løpet av 40 minutter til en oppløsning av (S)-metyl 4-tert-butyldifenylsilyloksy-3-(allyloksy)-butyrat (23,8 g, 57 mmol) oppløst i vannfri THF (1,0 L) ved -75°C under N2. Etter omrøring i 1,5 timer, fikk blandingen anledning til å oppvarmes til -10°C og bråstoppet med 5% vann i metanol og en stor mengde Celite. Den bråstoppede reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom en pute av Celite; filtratet ble konsentrert og fordelt mellom eter og 20% sitronsyre. Eterlaget ble tørket og konsentrert i vakuum. Restoljen ble ført gjennom en pute av silika eluert med kloroform for å gi 20,6 g (93%) av (S) 4-tert-butyldifenylsilyloksy-3-allyloksy-butan-1 -ol.

Til en metanol (500 ml) oppløsning av (S) 4-tert-butyldifenylsilyloksy-3-allyloksybutan-l-ol (20,6 g, 53,6 mmol) ble det tilsatt ozon ved -78°C i tilnærmet 12 minutter. Reaksjonsblandingen utviklet en svak blå farge, NaBHt (12,2 g, 321 mmol, 6 eq) ble tilsatt reaksjonsbeholderen. Reaksjonen fikk anledning til å komme til romtemperatur. De flyktige forbindelsene ble fjernet i vakuum. Resten ble ført gjennom en silikaplugg eluert med etylacetat for å gi 16,4 g (79%) av (S) 4-tert-butyldifenylsilyloksy-3-(2-hydroksy-etoksy)-butan-l-ol som en fargeløs olje.

Til en eter (600 ml) oppløsning av (S) 4-tert-butyldifenylsilyloksy-3-(2-hydroksy-etoksy)-butan-l-ol (15,7 g, 40,4 mmol) ved 0°C under nitrogen ble tilsatt trietylamin (16,8 ml, 121 mmol) etterfulgt av mesylklorid (9,38 ml, 121 mmol). Etter 3 timer ble oppløsningen filtrert; filtratet ble vasket med vann (2 x), saltvann (2 x), tørket over Na2SC*4 og konsentrert i vakuum. Resten ga 21,9 g (>99%) av bismesylatet som en gul olje som ble fortsatt direkte. Bismesylatet ble oppløst i aceton (1,4 1) som hadde blitt destillert fra kaliumkarbonat. Til denne oppløsningen ble det tilsatt Nal (90,4 g, 603 mmol) og 0,05 eq. NaHC03 (170 mg, 2 mmol). Reaksjonsblandingen ble holdt ved 56°C i 24 timer og filtrert; og filtratet ble konsentrert i vakuum. Resten ble fordelt mellom eter og 10% Na2S03, eterlaget ble vasket med saltvann, tørket over Na2SC«4 og konsentrert for å gi 17,9 g (73,2%) av (S)-4-tert-butyldifenylsilyloksy-3-(2-jodetoksy)-l-jodbutan som en fargeløs olje. Det samlede utbyttet var 54%. MS: MW = 608,39; observert: 559 (M-fertbutyl; FD, CHC13).

Fremstilling 7

( S V 3 -( Ver^ butyldifenylsilyloksymetylenV 1. 6- dibromheksan

Ved å følge samme prosedyre som beskrevet for fremstilling av racemisk dibromid, ble 3-(tert-butyldifenylsilyloksymetyl)-l,6-dibromheksan, (S)-(-)-3-(tertbutyldifenylsilyloksymetyl)-l,6-heksandiol (4,85 g, 12,53 mmol) reagert medN-bromsuccinimid (5,35 g, 30,1 mmol) og trifenylfosfin (7,87 g, 30,1 mmol) CH2C12 (150 ml) ved 0°C for å gi forbindelsen (S)-(-)-3-(tert-butyldifenylsilyloksymetyl)-l,6-dibromheksan 4,81 (75%) som en klar, fargeløs olje som var homogen ved TLC (Rf = 0,8, 10% EtOAc i heksaner. Begge TLC egenskapene og <*>H spektra av denne forbindelsen var identisk i alle henseender med racemisk isomer. MS.

!H NMR (300 MHz, CDC13) 1,06 (s, 9H), 1,35 - 2,10 (m, 7H), 3,55 (m, 4H), 3,56 (app d, 2H, J = 4 Hz), 7,40 og 7,64 (m, 10 H).

Fremstilling 8

l-( tert- butyldimetylsilyloksy)- 3-( 2- jodetoksyV4-( tert- butvldifenyl)- butan

Allyleteren, 1 -(tert-butyldimetylsilyloksy)-3 -(allyloksy)-4-(tert-butyldifenyl)-butan, (21,6 g, 43,4 mmol) ble oppløst i metanol (500 ml) og avkjølt til -78°C under nitrogen. Ozon ble boblet inn i reaksjonen og etter 11 minutter ble den bedømt fullført ved TLC (9 heksan/1 etylacetat). Natriumborhydrid (9,9 g, 6 eq) ble tilsatt og etter 5 minutter fikk reaksjonen anledning til å oppvarmet til romtemperatur. Metanol ble fjernet;' vakuum. Resten ble suspendert i eter (800 ml). Eteren ble vasket med vann og det vandige tilbakevasket med eter. De kombinerte organiske forbindelsene ble vasket med saltvann, tørket (Na2S04), filtrert og konsentrert i vakuum for å gi en olje. Materialet ble ført gjennom en silikapute med 5% etylacetat/heksan etterfulgt av eluering av produktet med 25% etylacetat/heksan for gå 11,0 g (50% utbytte) av alkoholen, l-(tert-butyldimetylsilyloksy)-3-(2-(hydroksy)etoksy)-4-(tert-butyldifenyl)-butan som en lys gul olje. MS. NMR.

Til en vannfri eteroppløsning (200 ml) av alkoholen, l-(tert-butyldimetylsilyloksy)-3(2- -

(hydroksy)etoksy)-4-(tert-butyldifenyl)-butan (11,0 g, 21,9 mmol) under nitrogen ved 5°C ble tilsatt trietylamin (4,6 ml, 1,5 eq) og metansulfonylklorid (2,5 ml, 1,5 eq). Etter 1,5 timer var reaksjonen fullført ved TLC (5% etylacetat/diklormetan). Reaksjonen ble fortynnet med eter (250 ml), vasket med vann (2x), saltvann (2x), tørket (Na2S04),

filtrert og konsentrert i vakuum for å gi en olje. Materialet ble ført gjennom en silikapute eluert med 5% etylacetat/heksan etterfulgt av 25% etylacetat/heksan for å gi 11,6 g (91% utbytte) av mesylatet, l-(tert-butyldimetylsilyloksy)-3-(2-metansulfonyloksy)etoksy)-4-(tert-butyldifenyl)-butan som en olje. MS. NMR.

Til en acetonoppløsning (300 ml) av mesylatet, l-(tert-butyldimetylsilyloksy)-3-(2-(metansulfonyloksy)etoksy)-4-(tert-butyldifenyl)-butan (11,6 g, 20 mmol) under nitrogen ble tilsatt natriumjodid (44 g, 15 eq) og natriumbikarbonat (170 mg, 0,1 eq). Blandingen ble tilbakestrømmet i 18 timer etterfulgt av fjerning av acetonet i vakuum. Den resulterende resten ble suspendert i eter, vasket med vann (2x) og det vandige tilbakevasket med eter. De kombinerte eterporsjonene ble vasket med 10% natriumsulfittoppløsning, saltvann (2x), tørket (MgSCv), filtrert og konsentrert i vakuum for å gi 10,7 g (87% utbytte) av titteljodidet som en olje som ble anvendt uten ytterligere rensing. MS. NMR.

Fremstilling 9

3. 4- KN. N'-!. 1 '-( Y2"- etoksvl- 3' "( OV4' "-( hydroksy)- butan)- bis-( 3. 3 '- indolvni- l ( TD-pyrrol- 2. 5- dion

Til en dimetylformamidoppløsning (250 ml) av bis-(3,3'-indolyl)-l-(metyl)-pyrrol-2,5-dion (17,9 g, 52,5 mmol, 3 eq) under nitrogen ble det tilsatt cesiumkarbonat (68,4 g, 4 eq). Til den resulterende suspensjonen ble tilsatt jodidet, l-(fer^butyldimetylsilyloksy)-3-(2-jodetoksy)-4-(ferNbutyldifenylsilyloksy)-butan, (10,7 g, 17,5 mmol). Reaksjonen ble omrørt i 18 timer ved romtemperatur. TLC (5% etylacetat/heksan) viste bortfall av jodid. Reaksjonen ble tømt i etylacetat (1200 ml) og vasket med IN HC1 (400 ml) etterfulgt av tilbakevask med etylacetat (2x). Kombinerte etylacetatporsjoner ble vasket med mettet natriumbikarbonatoppløsning, saltvann (2x), tørket (MgSQ»), filtrert og konsentrert ned til vakuum. Dimetylformat ble fjernet ved azeotropbehandling med xylen. Den resulterende røde gummien ble oppslemmet i diklormetan og acetonitril for å gi en faststoffsuspensjon. Det ble konsentrert ned, mer diklormetan ble tilsatt, avkjølt og filtrert for å gi et rødt faststoff. Noe av det ønskede produktet ble ekstrahert fra dette faste stoffet med en annen triturering i diklormetan og deretter i etylacetat. Filtratet ble konsentrert i vakuum og den resulterende resten absorbert på silika og påført en stor flash kolonne. Dialkylert biprodukt ble fjernet ved eluering med 5 heksan/1 etylacetat etterfulgt av eluering av produktet med 3 heksan/1 etylacetat for å skaffe tilveie 8,2 g (57%) av monoalkylert produkt, 3-[(N-l-(2-etoksy-(3'"-(0)-4"'-(tert-butyldifenylsilyloksy)-1'' '-(tert-butyldimetylsilylo^ lN(metyl)-pyrrol-2,5-dion. MS. NMR.

Til en metanoloppløsning (450 ml) av tert-butyldimetylsilyleter, 3-[(N-l-(2-etoksy-(3"'-(0)-4' "-(tert-butyldifenylsilyloksy)-1'' '-(tert-butyldimetylsilyloksy)-butan))-indol-3 -yl]-4-[indol-3-yl]-lN(metyl)-pyrrol-2,5-dion (8,2 g, 9,9 mmol) under nitrogen ved 5°C ble tilsatt/7-toluensulfonsyre, monohydrat (0,16 g, 0,085 eq). Etter 2 timer viste TLC (50% etylacetat/heksan) at reaksjonen var nesten fullført. Reaksjonen ble bråstoppet med fast natriumbikarbonat (0,14 g). Metanol ble fjernet i vakuum. Den resulterende resten ble oppløst i etylacetat, vasket med 0, IN natriumhydroksid, saltvann (2x), tørket (MgSC^), filtrert og konsentrert i vakuum for å gi et rødt skum. Dette materialet ble absorbert på silika og plassert på en silikapute. Eluering med 2 heksan/1 etylacetat fjernet resterende utgangsmateriale etterfulgt av eluering med 1 heksan/1 etylacetat og 1 heksan/2 etylacetat for å skaffe tilveie 6,4 g (91%) av alkoholen, 3-[(N-l-(2-etoksy-(3"'-(0)-4"'-(tert-butyldifenylsilyloksy)-1"' -(hydroksy)-butan))-indol-3 -yl] -4- [indol-3 -yl] - lN(metyl)-pyrrol-2,5-dion. MS. NMR.

Til en vanfri eteroppløsning (500 ml) av alkoholen, 3-[(N-l-(2-etoksy-(3"'-(0)-4"'-(tert-butyldifenylsilyloksy)-r' '-(hydroksy)-butan))-indol-3 -yl]-4-[indol-3-yl]- lN(metyl)-pyrrol-2,5-dion (6,36 g, 8,9 mmol) under nitrogen ved 5°C ble tilsatt trietylamin (1,9 ml, 1,5 eq) og metansulfonylklorid (1,0 ml, 1,5 eq). Etter 3 timer ble ytterligere trietylamin (1,25 ml, 1,0 eq) og metansulfonylklorid (0,7 ml, 1,0 eq) tilsatt. Etter 1 time viste reaksjonen seg å være fullført ved TLC (50% etylacetat/heksan). Reaksjonen ble filtrert med eter (250 ml), vasket med vann, 0, IN HC1 og saltvann (2x). Eter ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert i vakuum for å skaffe tilveie 7,0 g av mesylat, 3-[(N-l-(2-etoksy-(3''' -(0)-4''' -(tert-butyldifenylsilyloksy)-1'' '-(metansulfonyloksy)-butan))-indol-3-yl]-4-[indol-3-yl]-lN(metyl)-pyrrol-2,5-dion. MS.

Til en acetonoppløsning (200 ml) av mesylatet, ble 3-[(N-l-(2-etoksy-(3"'-(0)-4"'-(tert-butyldifenylsilyloksy)-1"' -(metansulfonyloksy)-butan))-indol-3 -yl] -4- [indol-3 -yl] - lN(metyl)-pyrrol-2,5-dion, (7,0 g, 8,9 mmol) under nitrogen tilsatt natriumjodid (13,3 g, 10 eq) og natriumbikarbonat (75 mg, 0,1 eq). Blandingen ble omrørt ved 50°C i 13 timer. Reaksjonen ble konsentrert i vakuum, og resten ble oppløst i eter og vasket med - 10% natriumsulfittoppløsning. Lagene ble separert og eterdelen ble vasket med 10% natriumsulfittoppløsning, vann, saltvann (2x), tørket og konsentrert i vakuum. Resten ble ført gjennom en silikapute ved eluering med 1 heksan/1 etylacetat og 1 heksan/2 etylacetat for å skaffe tilveie 7,6 g av jodidet, 3-[(N-l-(2-etoksy-(3"'-(0)-4"'-(tert-butyldifenylsilyloksy)-1"'-(j od)-butan))-indol-3 -yl]-4- [indol-3 -yl] - lN(metyl)-pyrrol-2,5-dion som et faststoff (kvantitativt utbytte i to trinn). MS. NMR.

Til en dimetylformamidsuspensjon (11) av cesiumkarbonat (12,0 g, 4 eq) under nitrogen ble tilsatt jodidet, 3-[(N-l-(2-etoksy-(3"'-(0)-4'"-(tert-but<y>ldifen<y>lsil<y>loks<y>)-l'"-(jod)-butan))-indol-3-yl]-4-[indol-3-yl]-lN(metyl)-pyrrol-2,5-dion (7,6 g, 9,2 mmol), oppløst i dimetylformamid (25 ml) via sprøytepumpe i løpet av 65 timer. Tre timer etter tilsetningen var fullført, ble reaksjonen konsentrert i vakuum. Resten ble oppløst i etylacetat (700 ml), vasket med vann (2x 300 ml) og det vandige laget tilbakevasket med etylacetat (2x200 ml). Kombinerte etylacetatdeler ble vasket med saltvann (2x200 ml), tørket (MgS04), filtrert og konsentrert i vakuum for å skaffe tilveie en fiolett rest. Materialet ble absorbert på silika og påført en flash kolonne. Eluert med 3 heksan/1 etylacetat og deretter 1 heksan/1 etylacetat for å gi 5,2 g (82%) av makrocyklus, 3,4-[(N,N'-1, l'-((2"-etoksy)-3' "(0)-4' "-(tert-butyldifenylsilyloksy)-butan)-bis-(3,3 '-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion. MS. NMR.

En suspensjon av N-metylmaleimid, 3,4-[(N,N'-l,l'-((2"-etoksy)-3"'(0)-4"'-(tert-butyldifenylsilyloksy)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion i 5N KOH (150 ml) og etanol (300 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 65 timer og deretter 1 time ved 60°C. Reaksjonen ble konsentrert (150 ml) i vakuum, resten suspendert i vann, avkjølt til 5°C, og surgjort (pH 3) med konsentrert saltsyre. Den rød vandige suspensjonen ble ekstrahert med etylacetat (4x200 ml), tørket og konsentrert i vakuum for å gi 3,3 g av rå anhydridalkohol, 2,3-[(N,N'-1,1 '-((2"-etoksy)-3'"-(0)-4'"-(hydroksy)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-furan-l,4-dion som et fiolett faststoff. MS.

Til en dimetylformamid (250 ml) oppløsning av anhydridet, 2,3-[(N,N'-l,l'-((2"-etoksy)-3"'(0)-4"'-(hydroksy)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-furan-l,4-dion, (3,3 g, 7,5 mmol) under nitrogen ble det tilsatt 1, 1, 1,3, 3, 3 - heksametyldisilazan (32 ml, 2 eq) og

metanol (3 ml, 10 eq). Reaksjonen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer og deretter

i oppvarmet ved 60°C i 2 timer. Dimetylformamid ble fjernet i vakuum og den resulterende rest ble oppløst i acetonitril (250 ml). IN HC1 (50 ml) ble tilsatt. Reaksjonen ble omrørt i 15 minutter. Reaksjonen ble konsentrert, fordelt mellom etylacetat (11) og vann (250 ml). Produktet var et faststoff som utfelte og dette ga

alkoholmaleimidet, 3,4-[(N,N'-1,1 '-((2"-etoksy)-3' "(0)-4' "-(hydroksy)-butan)-bis-

; (3,3'-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion, 0,92 (28%) av produktet. En liten mengde (50 mg)

ble observert på silika og påført en flash kolonne. Eluert med diklormetan, 5% acetonitril/diklormetan og deretter 10% acetonitril/diklormetan for å gi 38 mg av

analytisk rent materiale. Etylacetat ble konsentrert og kromatografert for å gi ytterligere 8% av råproduktet. MS.

<*>H NMR (de-DMSO): 5 1,96 (1H, m); 2,09 (1H, m); 3,31 (1H, m); 3,40 (1H, m); 3,51 (1H, m); 3,62 (1H, m); 3,89 (1H, m); 4,18 (3H, m); 4,35 (1H, m), 4,68 (1H, t, J= 2 Hz); 7,11 (2H, m); 7,19 (2H, m); 7,44 (1H, s); 7,46 (1H, d, J= 9 Hz); 7,51 (1H, s); 7,53 (1H, d, J= 9 Hz); 7,79 (1H, d, J= 8 Hz); 7,83 (1H, d, J= 8 Hz); 10,91 (1H, s).

Fremstilling 10

3. 4- HN. N'- 1. V -(( T '- etoksvV3'' YOV4'' ^ fN. N- dimetvlaimnoVbutan)- bis-( 3. 3 '-indolvni- l( HVpvrrol- 2. 5- dion HC1 salt

Til en vannfri diklormetan (140 ml) suspensjon av alkohol, 3,4-[(N,N'-l,l'-((2"-etoksy)-3'''(0)-4'''-(hydroksy)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion, (472 mg, 1,07 mmol) under nitrogen ble det tilsatt pyridin (260 ul, 3 eq) og metansulfonanhydrid (242 mg, 1,3 eq). Etter 4 timer ble reaksjonen fortynnet med diklormetan, vasket med 0,1N HC1 (2x) og filtrert for å fjerne utgangsmaterial (54 mg). Diklormetandelen ble vasket med saltvann (2x), tørket og konsentrert for å gi rå mesylat som et fiolett faststoff. Materialet ble absorbert på silika og applisert på en flashkolonne som i rekkefølge ble eluert med diklormetan, 5% acetonitril/diklormetan og 10% acetonitril/diklormetan for å skaffe tilveie 288 mg (52% utbytte) av mesylatet, 3,4-[(N,N'-l,l'-((2"-etoksy)-3"'(0)-4'''-(metansulfonyloksy)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion. MS. NMR.

Til en tetrahydrofuranoppløsning (20 ml) av mesylatet, 3,4-[(N,N'-l,l'-((2"-etoksy)-3'"(0)-4'''-(metansulfonyloksy)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion, (304 - mg, 0,59 mmol) ble tilsatt 8,9 M oppløsning dimetylamin i tetrahydrofuran (7 ml, lOOeq). Etter oppvarming (65°C) i 24 timer i et forseglet rør, ble reaksjonen fortynnet med etylacetat (200 ml), vasket med saltvann (2x), tørket og konsentrert for å gi rådimetylaminderivatet som et faststoff. Materialet ble absorbert på silika og applisert på en flash kolonne som i rekkefølge ble eluert med 3 etylacetat/1 heksan, etylacetat og 2% isopropylamin/etylacetat for å gi dimetylaminderivatet 193 mg (70% utbytte) som var 90% rent ved HPLC. Dimetylaminderivatet, 3,4-[(N,N'-l,l'-((2"-etoksy)-3"'(0)-4"'-(N,N-dimetylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion, ble renset til mer enn 95% som trifluoracetatsaltet ved å anvende reversfase størrelseseksklusjon HPLC ved eluering med 85 acetonitril/15 (0,01% TFA/vann).

Trifluoracetatsaltet av 3,4-[(N,N'-1,1 '-((2"-etoksy)-3"'(0)-4'"-(N,N-dimetylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion ble omdannet til HC1 saltet ved suspendering av saltet i etylacetat og vasking forsiktig med 0, IN NaOH (5x50 ml). Etylacetatdelen ble vasket med saltvann (2x), tørket og konsentrert for å skaffe tilveie fri base, 3,4-[(N,N'-l,l'-((2''-etoksy)-3'''(0)-4'''-(N,N-dimetylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion. Til en vannfri metanolsuspensjon (50 ml) av den frie basen, 3,4-[(N,N'-l, 1 '-((2"-etoksy)-3'"(0)-4"'-(N,N-dimetylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion ble det tilsatt IN HC1 i vannfri eter (13 ml, 50 eq). Eteren ble inndampet og resten ble tørket under vakuum for å gi 143 mg (52% utbytte) av 3,4-[(N,N'-1,1 '-((2' '-etoksy)-3' "(0)-4" '-(N,N-dimetylamino)-butan)-bis-(3,3 '-indolyl)]-l(H)-pyrrol-2,5-dion hydrokloridsalt som et rødt faststoff. MS.

<*>H NMR (de-DMSO): 8 2,03 (1H, m); 2,26 (1H, m); 2,68 (6H, t, J= 5 Hz); 3,24 (1H, m); 3,28 (1H, m, etter D20 shake); 3,64 (1H, m); 3,77 (2H, m); 4,07 - 4,38 (4H, m);

7,08 (2H, m), 7,17 (2H, m); 7,43 (3H, m); 7,52 (1H, d, J= 8 Hz); 7,79 (2H, m); 10,33 (1H, bs); 10,92 (1H, s).

Eksempel 1

3. 4-[( N. N'- L l'-(( 2"- etoksy)-( 3' " rOV4'' ^( N- trilfuormetvlarninoVbutanVbis( 3. 3 indolvf)]- 1 ( H)- pyrrol- 2. 5- dion

3,4-[(N,N'-l,l'-((2',-etoksy)-3'''(0)-4'',-(N-metylarmn)-butan-bis(3 (metyl)-pyrrol-2,5-dion fremstilt på en måte som er analog til Fremstilling 10 (20 mg, 0,04 mmol) ble oppløst i THF (10 ml) inneholdende trietylamin (6,1 ul, 0,044 mmol) under nitrogen. Til denne oppløsning ble det tilsatt karbondisulfid (3 mikrol, 0,05 mmol), og etter 15 minutter ble metyljodid tilsatt. Reaksjonen var fullført etter 12 timer ved TLC (10% MeOH i CH2CI2). Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat, vasket med vann, saltvann, tørket og konsentrert for å gi et ditiokarbamat (23 mg, forventet masse) IS/MS 559 (M^+l) forventet masse 558.

Til en diklormetanoppløsning av ditiokarbamatet ble det tilsatt

tetrabutylammoniumdihydrogentrifluorid og N-bromsuccinimid. Opparbeiding og rensing ved kromatografi genererer 3,4-[(N,N'-l,l'-((2"-etoksy)-3"'(0)-4"'-(N,N+(trifluormetyl)metylamino)-butan-bis (3,3' indolyl)]-1 -(metyl)-pyrrol-2,5-dion, som blir omdannet til N-H maleimid.

Trifluormetylaminderivatet kan også bli fremstilt som følger:

Til en DMSO oppløsning av monometylaminet ble det tilsatt dibromdilfuormetan og tetrakis(dimetylamin)-etylen. Standard opparbeiding gir det ønskede trifluormetylaminderivatet. Trifluormetylderivatet vil bli omdannet til N-H maleimid som tidligere beskrevet.

Som angitt tidligere, er forbindelsene i oppfinnelsen potente, proteinkinase C nemmere. Forbindelsene er selektive for proteinkinase C i forhold til andre kinaser. Evnen til forbindelsene fra foreliggende oppfinnelse å selektivt hemme proteinase C ble bestemt i Calcium Calmodulin Dependent Protein Kinase Analysen, Casein Protein Kinase II analysen, cAMP-Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit analyse og Protein-Tyrosine Kinase analyse.

Calcium Calmodulin Dependent Protein Kinase Analyse ( CaM)

Calcium Calmodulin Dependent Protein Kinase analysen er beskrevet i Journal of Neuroscience, 3: 818 -831 (1983). Analysekomponentene er i et totalvolum på 250 ul: 55 mMHEPES (4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazin-etansulfonsyre), pH 7,5, 2,75 mM ditiotreitol, 2,2 mM EGTA (etylenbis(oksyetylennitrilo)tetraeddiksyre, anvendt i blindbufferen, 1,1 mM kalsiumklorid (Sigma, St. Louis, Missouri) (anvendt i kontrollbuffer), 10 mM magnesiumklorid (Sigma, St. Louis, Missouri), 200 ug/ml histon type HL (Worthington), 10 ul DMSO eller DMSO/hemmer og 30 uM (gamma 32P) ATP (DuPont). Reaksjonen blir startet ved tilsetning av kalsiumkalmodulin-avhengig proteinkinase (isolert fra rottehjerne homogenat), inkubert ved romtemperatur i 10 minutter og stoppet ved tilsetning av 0,5 ml iskald trikloreddiksyre (Amresco) etterfulgt av 100 ul av 1 mg/ml bovint serumalbumin (Sigma, St. Louis, Missouri). Utfellingen ble samlet ved vakuumfiltrering på glassfiberfiltere og kvantifisert ved telling i en beta scintilasjonsteller.

Bufferkomponenter:

i Analysekomponenter:

165 ul buffer

25 ul kalmodulin (250 ul/ml)

10 ul DMSO eller DMSO/hemmer

i 25 ul kinaseenzym

25 ul AT32P

i

Kaseinproteinkinase II analyse ( CK- IT)

Kaseinproteinkinase II analysen er beskrevet i Neurochem. Res., 13: 829 - 836 (1988). Analysekomponentene er totalt i et volum på 250 ul: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM natriumfluorid, 50 mg/ml kasein (Sigma, St. Louis, Missouri), 10 mM magnesiumklorid (Sigma, St. Louis, Missouri), 10 ul DMSO eller DMSO/hemmer og 30 um (gamma-32P) ATP (DuPont). Starting av reaksjonen ble gjennomført ved tilsetning av kaseinproteinase II (isolert fra rottehjerne homogenat), inkubert ved romtemperatur i 10 minutter og stoppet ved tilsetning av 0,5 ml iskald trikloreddiksre (Amresco) etterfulgt av 100 ul av 1 mg/ml bovint serumalbumin (Sigma, St. Louis, Missouri). Utfellingen ble samlet ved vakuumfiltrering på glassfiberfiltere og kvantifisert ved telling i en beta scintillasj onsteller.

Analysekomponenter etter rekkefølge for tilsetning

175 ul buffer

10 ul DMSO eller DMSO/hemmer

25 ul AT32P i 300 uM magnesiumklorid

40 ul enzym (ufortynnet)

Buffer fremstilt som følger:

(Sluttvolum = 3,5 ml: mengde av 20 analyser)

cAMP- Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit analyse ( PKA)

Analysekomponentene er i et totalvolum på 250 ul: 20 mM HEPES (Sigma, St. Louis, - Missouri) buffer pH 7,5, 200 ug/ml histon type HL (Worthington), 10 mM magnesiumklorid (Sigma, St. Louis, Missouri), 10 ul DMSO eller DMSO hemmer og 30 uM (gamma- 32P) ATP (DuPont). Reaksjonen blir startet ved tilsetning av bovin hjerte cAMP-avhengig kinase katalytisk subenhet (Sigma, St. Louis, Missouri), inkubert til 30°C i 10 minutter og stoppet ved tilsetning av 0,5 ml iskald trikloreddiksyre (Amresco) etterfulgt av 100 ul 1 mg/l bovint serumalbumin (Sigma). Utfellingen ble samlet ved vakuumfiltrering på glassfiberfiltere ved å benytte en TOMTEC™ og kvantifisert ved telling i en beta scintillasjonsteller. Denne analysen ble gjort identisk med proteinkinase C (PKC) enzymanalysen med unntagelse for at ingen fosforlipider eller diacylglycerol blir benyttet i analysen og histonsubstrat blir spesifisert for cAMP-avhengig katalytisk subenhet enzym.

Protein Tyrosine Kinase analyse ( src )

Analysekomponentene er følgende:

10 ulRaytide

10 ul kinase

4 ul DMSO eller DMSO/hemmer

6 ul 200 mM HEPES pH 7,5

10ulAT32P

Denne analysen er beskrevet av Onogene Science, Inc. Cat. #PK02 og PK03 (1990).

Forbindelsene i oppfinnelsen er også overraskende isozym-selektive nemmere, dvs. forbindelsene hemmer selektiv proteinkinase C beta-1 og beta-2 isozymer. Denne isozymselektiviteten ble bestemt i PKC enzymanalysen.

PKC Enzyme analyse

PKC enzymer = alfa, beta I, beta II, gamma, delta, epsilon, eta og zeta.

Analysekomponentene i et totalvolum på 250 ul er som følger:

Vesikler bestående av 120 ug/ml fosfatidylserin (Avanti Polar Lipids) og tilstrekkelig diacylglycerol (Avanti Polar Lipids) for å aktivere enzymet til maksimal aktivitet i 20 mM HEPES buffer (Sigma, St. Louis, Missouri), pH 7,5, 940 uM kalsiumklorid (Sigma, St. - Louis, Missouri) for analysering av alfa, beta-1, beta-2 og bare gamma enzym, 1 mM EGTA for alle enzymene, 10 mM magnesiumklorid (Sigma, St. Louis, Missouri) og 30 uM (gamma-32P) ATP (DuPont). For alle enzymene blir enten histon type HL (Worthington) eller myelin basisk protein anvendt som substrat. Analysen ble startet ved tilsetning av proteinkinase C enzym inkubert ved 30°C i 10 minutter og stoppet ved tilsetning av 0,5 ml kald trikloreddiksyre (Amresco) etterfulgt av 100 (il 1 mg/ml bovint serum albumin (Sigma, St. Louis, Missouri). Det utfelte ble samlet ved vakuumfiltrering på glassfiberfiltere ved å benytte et TOMTEC™ filtreringssystem og kvantifisert ved å telle i en beta scintillasjonsteller.

Forbindelsene i oppfinnelsen hemmer protein kinase C med en IC50 verdi under 100 um. I tillegg hemmer forbindelsene i oppfinnelsen selektivt beta-1 og beta-2 proteinkinase C isozymer og har en IC50 verdi med hensyn på disse enzymene under 10 um.

Som en hemmer av proteinkinase C, er forbindelsene nyttige i behandling av tilstander hvori proteinkinase C har demonstrert en rolle i patologi. Tilstandene som er anerkjent innenfor fagområdet, innbefatter: diabetes mellitus og dens komplikasjoner, iskemi, inflammasjon, sentralnervesysternforstyrrelser, kardiovaskulær sykdom, Alzheimers sykdom, dermatologisk sykdom og cancer.

Proteinkinase C nemmere har vist seg å blokkere inflammatoriske responser slik som neutrofil oksidativ brist, CD3 ned-regulering i T-lymfocytter og forbolindusert poteødem. Twoemy, B. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 171: 1087-1092

(1990); Mulqueen, M.J. et al. Agents Actions 37: 85-89 (1992). Som nemmere av PKC, er således foreliggende forbindelser nyttige i behandling av inflammasjon.

Proteinkinase C aktivitet spiller en sentral rolle i funksjonering av sentralnervesystemet. Huang, K.P. Trends Neurosci. 12: 425-432 (1989). I tillegg har proteinkinase C

nemmere vist seg å hindre skade som man ser i fokal og sentral iskemisk hjerneskade og hjerneødem. Hara, H. et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 10: 646 - 653 (1990); Shibata, S. et al. Brain Res. 594: 290 - 294 (1992). Proteinkinase C har i det siste blitt bestemt å være implisert i Alzheimers sykdom. Shimohama, S. et al., Neurology 43: 1407-1413

(1993). Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er således nyttige ved behandling av Alzheimers sykdom og iskemisk hjerneskade.

Proteinkinase C aktivitet har lenge vært assosiert med cellevekst, tumorfremming og cancer. Rotenberg, S.A. og Weinstein, I.B. Biochem. Mol. Aspects Sel. Cancer 1: 25 — 73 (1991). Ahmad et al., Molecular Pharmacology: 43 858 - 862 (1993). Det er kjent at nemmere av proteinkinase C nemmere er effektive i å hindre tumorvekst i dyr. Meyer, T. et al. Int. J. Cancer 43: 851 - 856 (1989); Akinagaka, S. et al. Cancer Res. 51: 4888 - 4892 (1991). Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse virker også som et multimedikament reversmidler (MDR) og gjør dem til effektive forbindelser når de blir administrert i forbindelse med andre kjemoterapeutiske midler.

Proteinkinase C aktivitet spiller også en viktig rolle i kardiovaskulær sykdom. Øket proteinkinase C aktivitet i vaskulaturen har vist seg å forårsake øket vasokonstruksjon og hypertensjon. En kjent proteinkinase C hemme forhindret denne økning. Bilder, G.E. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 252: 526 - 530 (1990). Fordi proteinkinase C nemmere demonstrerer hemming av neutrofil oksidativ brist, er proteinkinase C nemmere også nyttige i behandling av kardiovaskulær iskemi og forbedring av hjertefunksjon etter iskemi. Muid, R E. et al., FEBS Lett. 293: 169 - 172 (1990); Sonoki, H. et al., Kokyu-To Junkan 37: 669-674 (1989).

Rollen til proteinkinase C i platefunksjon har også vært undersøkt og som vist er forhøyde proteinkinase C nivåer blitt korrelert med øket respons til agonister. Bastyr III, E.J. og Lu, J. Diabetes 42: (Suppl. 1) 97A (1993). PKC har blitt implisert i den biokjemiske veien i plate-aktivitetsfaktor modulering av mikrovaskulær permeabilitet. Kobayashi et al., Amer. Phys. Soc. H1214-H1220 (1994). Potente proteinkinase C nemmere har blitt demonstrert å påvirke agonist-indusert aggregering i plater. Toullec, D. et al., J. Biol. Chem. 266: 15771 - 15781 (1991). Proteinkinase C nemmere blokkerer også agonist-indusert glattmuskelcelle proliferasjon. Matsumoto, H. og Sasaki, Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 158: 105 - 109 (1989). Foreliggende forbindelser er således nyttige i behandling av kardiovaskulær sykdom, aterosklerosé og restenose.

Unormal aktivitet av proteinkinase C har også blitt knyttet til dermatologiske forstyrrelser slik som psoriasis. Horn, F. et al. J. Invest. Dermatol. 88: 220 - 222

(1987); Raynaud, F. og Evain-Brion, D. Br. J. Dermatol. 124: 542 - 546 (1991).

Psoriasis er kjennetegnet ved unormal proliferasjon av keratinocytter. Kjente

proteinkinasehemmere har blitt vist å hemme keratinocytt-proliferasjon på en måte som i parallellfører deres potenthet som på PKC nemmere. Hegemann, L. et al., Arch.

Dermatol. Res. 283: 456 - 460 (1991); Bollag, W.B. et al., J. Invest. Dermatol. 100: 240 - 246 (1993). Forbindelsene som nemmere av PKC er således nyttige i behandling av psoriasis. i Proteinkinase C har vært knyttet til flere forskjellige aspekter av diabetes. Omfattende aktivitet av proteinkinase C har vært knyttet til insulinsignalerende defekter og derfor til insulinresistens som man ser i Type II diabetes. Karasik, A. et al., J. Biol. Chem. 265: 10226 - 10231 (1990); Chen, K.S. et al., Trans. Assoc. Am. Physicians 104: 206 - 212

(1991); Chin, J.E. et al., J. Biol. Chem. 268: 6338 - 6347 (1993). I tillegg har studier demonstrert en markert økning i proteinkinase C aktivitet i vev som er kjent å være utsatt for diabetiske komplikasjoner når det ble eksponert for hyperglykemiske tilstander. Lee, T.-S. et al., J. Clin. Invest. 83: 90 - 94 (1989); Lee, T.-S. et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86: 5141 - 5145 (1989); CravenP.A. ogDeRubertis, F R. J. Clin. Invest. 83: 1667 - 1675 (1989); Wolf, B A. et al. J. Clin. Invest. 87: 31 - 38 (1991); Tesfamariam, B. et al. J. Clin. Invest. 87: 1643 - 1648 (1991).

Forbindelsene i oppfinnelsen er også isozym-selektive. Forbindelsene hemmer fortrinnsvis proteinkinase C beta-1 og beta-2 isozym over proteinkinase C isozymer, dvs. alfa, gamma, delta, epsilon, zeta og eta. Generelt viser forbindelsene minimum ti ganger forskjell i doseringer som er nødvendig for å hemme PKC beta-1 eller beta-2 isozym og dosering som er nødvendig for lik hemming av alfa proteinkinase C isozym slik som målt i PKC analysen. Forbindelsene i oppfinnelsen hemmer således beta-1 og beta-2 isozymer av proteinkinase C ved mye lavere konsentrasjoner med minimal hemming av andre PKC isozymer.

På grunn av denne selektiviteten er forbindelsene særlig nyttig i behandling av de sykdomstilstandene hvori proteinkinase C isozym beta-1 eller beta-2 er assosiert. Forhøyede blodglukosenivåer som man f. eks. finner i diabetes, fører til en isozym-spesifikk heving av beta-2 isozym i vaskulære vev. Inoguchi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89: 11059 - 11065 (1992). En diabetes-bundet heving av beta isozym i humane plater har blitt korrelert med endret respons til agonister. Bastyr DI, E.J. og Lu, J. Diabetes 42: (Suppl 1) 97A (1993). Human vitamin D reseptoren har blitt vist å bli selektivt fosforylert av proteinkinase C beta. Denne fosforyleringen har blitt knyttet til endringer i funksjonering av reseptoren. Hsieh et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88: 9315 -9319 (1991); Hsieh et al., J. Biol. Chem. 268: 15118 - 15126(1993). I tillegg har senere arbeid vist at beta-2 isozym er ansvarlig for erytroleukemi celleproliferasjon mens alfa-isozym er involvert i megakaryocytt differensiering i de samme cellene. Murray et al., J. Biol. Chem. 268: 15847 - 15853 (1993).

Forbindelsene med Formel I blir fortrinnsvis formulert forut for administrering. Derfor - er en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk formulering som omfatter en forbindelse med Formel I og en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, fortynningsmidler eller eksipienter.

Foreliggende farmasøytiske formuleringer blir fremstilt ved kjente prosedyrer ved å anvende velkjente og lett tilgjengelige ingredienser. Ved å lage sammensetningene i foreliggende oppfinnelse, vil den aktive ingrediensen vanligvis være blandet med en

bærer, eller fortynnet med en bærer, eller innelukket i en bærer som kan være i form av

> en kapsel, pose, papir eller annen beholder. Når bæreren tjener som et fortynningsmiddel, kan den være et faststoff, halv-fast eller flytende materiale som virker som en bærer, ekspient eller medium for den aktive ingrediensen. Sammensetningene kan således være i form av tabletter, piller, pulvere, pastiller, poser, kapsler, eliksirer,

suspensjoner, emulsjoner, oppløsninger, siruper, aerosol (som et faststoff eller i et

) flytende medium), myke og harde gelatinkapsler, suppositorer, sterile injiserbare oppløsninger og sterile innpakkede pulvere.

Noen eksempler på egnede bærere, eksipienser og fortynningsmidler innbefatter laktose,

dekstrose, sukrose, sorbitol, mannitol, stivelser, gummi acacia, kalsiumfosfat, alginater,

> tragakant, gelatin, kalsiumsilikat, mikrokrystallin cellulose, polyvinylpyrrolidon,

cellulose, vannsirup, metylcellulose, metyl og propylhydroksybenzoater, talk, magnesiumstearat og mineralolje. Formuleringene kan i tillegg innbefatte smøremidler, fuktningsmidler, emulgeringsmidler og suspensjonsmidler, preserveringsmidler,

søtningsmidler og/eller aromamidler. Sammensetningene fra oppfinnelsen kan bli

) formulert slik at de skaffer tilveie hurtig, vedvarende eller forsinket frigjøring av den aktive ingrediensen etter administrering til pasienten. Sammensetningene blir fortrinnsvis formulert i en enhetsdoseform, hver dose inneholdende fra 1 til 500 mg, vanligere fra 5 til 30 mg av aktiv ingrediens. Det vil imidlertid være underforstått at den terapeutiske

dosen som blir administrert vil bli bestemt av den behandlende lege i lys av de relevante

5 omstendighetene som innbefatter tilstanden som skal behandles, valg av forbindelse som skal administreres og administreringsvei som velges. Begrepet "enhetsdoseringsform" refererer til fysikalsk adskilte enheter som er egnet som enhetsdoseringer for humane subjekter og andre pattedyr, der hver enhet inneholder en forhåndsbestemt mengde av

det aktive materialet beregnet til å produsere den ønskede terapeutiske effekt, i

3 sammenheng med en velegnet farmasøytisk bærer.

I tillegg til formuleringene over, kan forbindelsen i foreliggende oppfinnelse bli administrert topisk. Topiske formuleringer er salver, kremer og geler.

5 Salver blir generelt fremstilt ved å anvende enten (1) en oljeholdig base, dvs. en som består av fikserte oljer eller hydrokarboner, slik som hvit petrolatum eller mineralolje, eller (2) en absorberende base, dvs. en som består av en vannfri substans eller substanser som kan absorbere vann, f.eks. vannfri lanolin. Etter dannelse av basen, uavhengig av om det er oljeholdig eller absorbent, blir den aktive ingrediensen (forbindelsen) vanligvis tilsatt i en mengde som gir den ønskede konsentrasjon.

Kremer er olje/vann emulsjoner. De består av en oljefase (intern fase), og omfatter typisk fikserte oljer, hydrokarboner og lignende, slik som vokser, petrolatum, mineralolje og lignende, og en vandig fase (kontinuerlig fase), og omfatter vann og eventuelle vann-oppløselige substanser, slik som tilsatte salter. De to fasene blir stabilisert ved anvendelse av et emulgeringsmiddel, f.eks. et overflateaktivt middel, slik som natriumlaurylsulfat; hydrofile kolloider slik som acacia kolloidleire, veegum og lignende. Ved dannelse av emulsjonen, blir den aktive ingrediensen (forbindelsen) vanligvis tilsatt til en mengde for å oppnå den ønskede konsentrasjon.

Geler omfatter en basis som velges fra en oljeholdig base, vann eller en emulsjons-suspensjonsbase. Til basen blir tilsatt et geldanningsmiddel som danner en matriks i basen, økning av viskositet. Eksempler på geldanningsmidler er hydroksypropyl cellulose, akrylsyre polymerer og lignende. Den aktive ingrediensen (forbindelsen) blir vanligvis tilsatt formuleringen ved ønsket konsentrasjon ved et punkt som går foran tilsetningen av geldanningsmiddel.

Mengden av forbindelsen som er er inkorporert i en topisk formulering er ikke kritisk; konsentrasjonen bør bare være i et område som er tilstrekkelig til å tillate rask påføring av formuleringen til det påvirkede vevsområdet i en mengde som vil avlevere den ønskede mengden av forbindelsen.

Den vanlige mengden av en topisk formulering som skal bli påført et påvirket vev, vil avhenge av en påvirket vevstørrelse og konsentrasjon av en forbindelse i formuleringen. Generelt vil formuleringen bli påført det angjeldende vev i en mengde som gir fra 1 til 500 ug forbindelse pr. cm<2> av påvirket vev. Påført mengde av forbindelse vil fortrinnsvis være i et område fra 30 til 300 ug/cm<2>, mer å foretrekke fra 50 til 200 ug/cm2, og mest å foretrekke fra 60 til 100 ug/cm<2>.

Formulering 1

Harde gelatinkapsler blir fremstilt ved å anvende følgende ingredienser:

Mengde

(mg/kapsel)

Aktiv ingrediens 250

Stivelse, tørket 200

Magnesiumstearat 10

i

Totalt 460 mg

Ingrediensene over ble blandet og fylt i harde gelatinkapsler i 460 mg mengder.

Formulering 2

En tablett ble fremstilt ved å anvende ingrediensene under:

Mengde

i (mg/kapsel)

Aktiv ingrediens 250

Cellulose, mikrokrystallinsk 400

Silisiumdioksid, dampet 10

Stearinsyre 5

i

Totalt 665 mg

Komponentene ble dannet og presset sammen for å danne tabletter som hver veier 665

mg.

)

5

Formulering 3

En aerosoloppløsning ble fremstilt inneholdende følgende komponenter:

Den aktive forbindelse ble blandet med etanol. Blandingen ble tilsatt en porsjon av Propellant 22, avkjølt til -30°C og overført til en fylleinnretning. Den nødvendige mengde ble deretter tilført en rustfri stålbeholder og fortynnet med det gjenværende av drivmiddelet. Ventilenhetene er tilpasset beholderen.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved den har formelen: der: WerO, JÅ2 er hydrogen, Zer-(CH2)P-, Rs er -NH(CF3) eller -N(CF3) (CH3), m er uavhengig 0, 1, 2 eller 3; og p er uavhengig 0, 1 eller 2; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1 karakterisert ved at den har formel: der Z er -CH2-; Re er -NH(CF3) eller N(CF3)(CH3).

3 Farmasøytisk formuleringer, karakterisert ved at de omfatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 - 3 sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable eksipienser, bærere eller fortynningsmidler.

4. Forbindelse for bruk som terapeutikum, karakterisert v e d at den har formelen som definert i krav 1.

5. Anvendelse av forbindelsen som definert i krav 1 for fremstilling av et legemiddel som har proteinkinase C-inhiberende effekt.

6. Anvendelse av en forbindelse som definert i krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en tilstand valgt fra sentral iskemisk hjerneskade, kardiovaskulær iskemi, inflammasjon, restenose, aterosclerose, psoriasis, Alzheimers sykdom, kreft og diabetes mellitus.

7. Forbindelse, karakterisert ved at den har formelen: hvor: V er -O- eller N-CH3-, WerO, Zer-(CH2)P-, Rs er -NH(CF3) eller -N(CF3)(CH3), m er uavhengig 0, 1, 2 eller 3; og p er uavhengig 0, 1 eller 2.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 og 2, karakterisert ved omsetning av en forbindelse av formel: hvor: Ver-0-ellerN-CH3-, W er O, 2 er -(CH2)P-, Rs er -NH(CF3) eller -N(CF3)(CH3), m er uavhengig 0, 1, 2 eller 3; og p er uavhengig 0, 1 eller 2, med et overskudd av en blanding av et reagens og en C1-C4 alkohol i et polart aprotisk oppløsningsmiddel, hvor nevnte reagens velges fra heksametyldisilazan eller et ammoniumsalt.