NO180149B

NO180149B - Framgangsmåte for framstilling av en blanding for systemisk administrering gjennom slimhinner

Info

Publication number: NO180149B
Application number: NO901372A
Authority: NO
Inventors: Lisbeth Illum
Original assignee: Danbiosyst Uk Ltd
Priority date: 1987-10-10
Filing date: 1990-03-26
Publication date: 1996-11-18
Also published as: GB8723846D0; EP0396549B1; FI97691B; DK89090D0; NO180149C; DK89090A; FI901787A0; JP2914671B2; NO901372D0; US5204108A; WO1989003207A1; FI97691C; CA1333258C; DE3886772T2; NO901372L; EP0396549A1; DE3886772D1; JPH03503160A

Description

Oppfinnelsen angår en framgangsmåte for framstilling av en blanding for systemisk administrering gjennom slimhinner i vagina, øyet eller nesen, slik det framgår av den innledende del av patentkrav 1.

Bakgrunn

Et hovedproblem ved frigjøring av medikamenter er den effektive absorpsjon av høymolekylære forbindelser slik som proteiner og peptider gjennom biologiske membraner. Normalt blir slike molekyler ikke tatt opp i legemet hvis det blir gitt til fordøyelsesorganene, til slimhinnene i munnhulen, i rektum eller i vagina, eller gitt som et intranasalt system. Senere studier med preparatet insulin har vist at absorpsjon av en slik forbindelse kan økes hvis det blir gitt sammen med en såkalt absorpsjonspromotor. Disse absorpsjonsforbedrende midlene har omfattet overflateaktive forbindelser av ikke-ionisk type så vel som ulike derivater av gallesalt. En økt permeabilitet i membraner i nærvær av disse typer overflateaktive forbindelser er ikke uventet, og i litteraturen innenfor området gastroenterologi finnes det virkelig mange slike absorpsjons-promotorer. (For en oversikt, se Davis et al, Delivery Systems for Peptide Drugs, Plenum Press, NY, 1987). Slike forbindelser vil imidlertid sannsynligvis ikke være akseptable for kronisk administrering av farmakologiske midler på grunn av deres irriterende effekt på membraner. Dette omfatter ikke bare det ikke-ioniske utvalg av overflateaktive forbindelser men også gallesalter og gallesalt-derivater (f.eks. fusidinsyre).

EP-A-023 359 og EP-A-122 023 viser en pulverformig farmasøytisk blanding for anvendelse i neseslimhinner samt framgangsmåter for administrering av denne. Den farmasøytiske sammensetning tillater at polypeptider og derivater av disse absorberes effektivt gjennom neseslimhinna. Tilsvarende beskriver US patentskrift 4.250.163 en framgangsmåte for administrering av et medikament til neseslimhinna der den foretrukkete sammensetning har slim-adhesive egenskaper.

EP-A-230 264 beskriver et system for administrering av væskeformig nese-medikament for vaksiner inneholdende et høymolekylært medikament, et geldannende middel (f.eks. hydroksyetylcellulose) og i noen tilfeller andre additiver (f.eks. overflateaktive forbindelser, glycerol og polyetylenglykol).

Ingen av de ovennevnte patentskrifter eller søknader beskriver bruken av mikrosfærer for nasal administrering.

Et mikrosfære-preparat for nasal administrering er beskrevet i PCT/GB86/00721. Denne søknaden refererer kun til ett spesifikt medikament (natruim kromglykat) for lokal effekt, heller enn administrering til det generelle system. (Se også J. Controlled Release, 1, 15-22, 1984). Det essensielle var: funksjonen til ionebytter-forbindelsene var å holde medikamentet i kontakt med slimoverflata i lengre tid, ikke for å fremme absorpsjon.

I J. Pharm. Pharmacol., vol 37, side 135-136, 1985 er det likeledes vist bruken av en nasal gel (igjen polyakrylsyre) som et leveringssystem for insulin og calcitonin til rotter. En vesentlig økning av glukosenivået i plasmaet ble oppnådd sammenliknet med den normale formulering, og indikerte således en økning i absorpsjonsefifktiviteten.

Fram til denne tid er nesen foreslått som en alternativ rute for administrering av medikamenter som vil virke innen systemets sirkulasjon. Spesiell oppmerksomhet er rettet mot natur-identiske peptider eller proteiner eller analoge eller fragmenter av disse, produsert ved rekombinante DNA-teknikker. Andre medikamenter som er blitt foreslått er de som dårlig absorberes oralt, eller som i stor grad metaboliseres enten i fordøyelses-systemet i seg selv eller som underlegges førstegangs metabolisme i levra.

Imidlertid framviser de fleste polypeptid-medikamenter en lav bio-tilgjengelighet når de blir gitt intranasalt.

Den raske forsvinning av nasalspray fra nesen kan sannsynligvis betraktes å være en hovedfaktor ved påvirking av tap av medikamenter fra potensielle absorpsjonsoverflater. I tillegg, i tilfellet med peptider og proteiner, kan enzymatisk degradering av medikamentet og molekylstørrelse også spille en rolle ved den lave bio- tilgjengelighet.

PCT/GB/ 88/00396 viser intranasale mikrosfære-preparater som inneholder en promotor. I henhold til den foreliggende oppfinnelsen er det funnet at med peptidmedikamenter som har en molekylvekt under 6000, er promotor ikke påkrevet, og er faktisk uønsket.

Formål

Formålet med oppfinnelsen er derfor å anvise en framgangsmåte for framstilling av en blanding for systemisk administrering gjennom slimhinner i vagina, øyet eller nesen, og som omfatter et medikament og et flertall mikrosfærer, der medikamentet fordeles i hele kroppssystemet og har en maksimal molekylvekt på 6000 (fortrinnsvis minst 1000), og der sammensetningen er hovedsakelig fri for promotor.

Oppfinnelsen

Disse formål oppnås med en framgangsmåte ifølge den karakteriserende del av patentkrav 1. Ytterligere trekk framgår av de uselvstendige kravene 2 til 7.

Med "promotor" eller "forbedrer" menes her et materiale som øker absorpsjon gjennom slimet. Slike materialer omfatter mucolytiske midler, degraderende enzyminhibitorer og forbindelser som øker permeabiliteten i slimhinnecellene. Nærmere bestemt, alle promotorene som er vist i PCT/GB 88/00396 er utelatt fra den foreliggende sammensetning. Hvorvidt en gitt forbindelse er en "promotor", kan bestemmes ved å sammenlikne to resepter bestående av et ikke-assosiert, lite polart molekyl som medikamentet, med eller uten promotoren, i en levende eller god modelltest og bestemme hvorvidt opptaket av medikamentet blir forbedret i en klinisk betydelig grad.

Betegnelsen "medikament" representerer her ethvert farmakologisk aktivt peptid, inkludert mindre molekyler, hormoner, polypeptider og vaksiner eller komponenter av disse, for eksempel isolerte antigener eller deler av antigener eller etterlikninger av slike.

Mikrosfærene blir fortrinnsvis tildelt i form av et frysetørret pulver ved spraying, og har bioadhesive egenskaper. Mikrosfærene bør ha en størrelse mellom 10 og 100 (im, fortrinnsvis 40 til 60 um, (etter svelling) og være laget av et bio-forenbart materiale som vil danne gel i kontakt med slimoverflata. Hovedsakelig ensartete og faste mikrosfærer er foretrukket. Mikrosfærer av stivelse (kryssbundet om nødvendig) er et materiale som er foretrukket. Andre mikrosfærer omfatter gelatin, dextran og derivater av dextran. Tilvirking av disse mikrosfære- systemene er godt beskrevet i den framasøytiske litteratur (se f.eks. Davis et al, "Microspheres and Drug Therapy", Elsevier Biomedical Press, 1984). Emulsjons- og faseseparasjons-metoder er begge egnete. De ferdige mikrosfærene kan modifiseres ved kjemisk kryssbinding eller varmebehandling. Det aktive midlet kan innarbeides i mikrosfærene under deres dannelse, og sorberes inn/på systemet etter tilvirking. Systemets effektivitet kan kontrolleres ved mikrosfæremassens fysiske natur og, f.eks., graden av kryssbinding. Mikrosfære- leveringssystemet kan også inkludere mikrosfærer laget av det aktive proteinet eller peptidet i seg selv, slik som insulin- mikrosfærer.

Som en ekstra fordel kan partiklene ha variable kontrollerte frigjørings-karakteristikker gjennom modifikasjoner i mikrosfæressystemet, for eksempel ved å kontrollere graden av kryssbinding eller ved innarbeiding av bindemiddel som endrer diffusjonsegenskapene for det tildelte medikament. Mengde medikament som kan bæres av mikrosfærene betegnes som lastekapasitet, som bestemmes ved de fysiokjemiske egenskapene i medikament-molekylet og i særdeleshet dets størrelse og affinitet overfor partikkelmassen. Større lastekapasiteter forventes når det tildelte medikamentet innarbeides i mikrosfærene under selve tilvirkingsprosessen av mikrosfærene. Det er kjent at for mange peptider og proteiner vil mengde medikament som skal tildeles for å gi en resulterende terapeutisk effekt være i størrelsesorden noen få milligram eller mindre. Mikrokapsler med en tilsvarende størrelse, som er bioadhesive og som har kontrollerte frigjøringsegenskaper, ville også forventes å gi tilsvarende fordeler i form av økte og modifiserte biotilgjengeligheter av tildelte medikamenter. Disse mikrokapslene kan produseres ved flere framgangsmåter. Kapslenes overflate kan være klebende i seg selv, eller kan modifiseres ved å belegge dem på måter som er vanlig innen faget. Disse beleggene er fortrinnsvis bioadhesive polymere slik som polykarbofil, karbopol, DEAE-dextran eller alginater. Disse mikrokapslene er ansett for å være "mikrosfærer" ved anvendelser i dette henseende, og har fortrinnsvis en diameter på 10 til 100 (im.

Ved bruk av kombinasjonen av mikrosfærer og medikamenter, er det funnet at de bioadhesive mikrosfære-systemene har evne til vesentlig å forbedre biotilgjengeligheten av polare medikamenter når de blir tildelt sammen.

Denne sterke effekt er antatt å være forårsaket av større retensjon av leveringssystemet i nesehulen.

Mikrosfære-blandingen kan også gi beskyttelse av medikamentet mot degradering av enzymer.

Sammensetningene kan brukes med medikamenter slik som insulin, calcitoniner (f.eks. fra gris, menneske, laks, kylling eller ål) og syntetiske modifikasjoner av disse<*>, enkephaliner<*>, LHRH og analoge<*> (Nafarelin, Buserelin, Zolidex), GHRH (veksthormon-frigjørende hormon)<*>, nifedipin, THF (thymisk humoral faktor)<*>, CGRP (calcitonin-gen-relatert peptid)<*>, atrialt natriuretisk peptid<*>, antibiotika, metoklopramid<*>, ergotamin<*>, Pizotizin<*>, nasale vaksiner (spesielt AIDS-vaksiner, meslinger, rhinovirus type 13 og respiratorisk "syncitial" virus)<*> og pentamidin.

De avmerkete medikamentene er spesielt foretrukket for administrering med blandingen framstilt ifølge oppfinnelsen.

Administrering

Mikrosfærene kan tildeles via nesen ved bruk av en anordning for nasal innblåsning eller aeorosol-trykkflaske. Eksempler på slike er allerede i bruk med kommersielle pulversystemer for anvendelser i nesen.

Effekten av blandingen framstilt ifølge oppfinnelsen belyses ved eksempler for behandling av et menneske eller andre pattedyr ved administrering av et preparat som beskrevet ovenfor til ei slimhinne i dette mennesket eller pattedyret, for eksempel i vagina, øyet eller nesen.

Anvendelser av den foreliggende oppfinnelsen vil bli beskrevet i det etterfølgende og med henvisning til tegningene, der: figur 1 viser plasma-glukosenivå i sau oppnådd ved intranasal administrering av insulin i ulike former og intravenøst;

figur 2 viser de tilhørende kurver for plasma-insulinnivå i sau;

figur 3 viser plasma-glukosenivå i sau ved gjentatt administrering av insulin i kombinasjon med mikrosfærer av stivelse.

figur 4 viser passende samsvarende kurver for plasmainsulin i sau;

figur 5 viser plasma-glukosenivå i menneske (n=5) oppnådd ved intranasal administrering av insulin i kombinasjon med mikrosfærer av stivelse;

figur 6 viser plasma-glukosenivå i menneske oppnådd ved intranasal administrering av mikrosfærer av stivelse (referanse);

figur 7 viser plasma-glukosenivå i ett utvalgt objekt oppnådd ved intranasal administrering av insulin i kombinasjon med mikrosfærer av stivelse;

figur 8 viser beskyttelsen av insulin innarbeidet i mikrosfærer mot enzymatisk degradering;

figur 9 viser midlere plasmaglukosenivå som funksjon av tiden fra intranasal administrering av insulin ved 2 IE/kg i kombinasjon med 2.5 mg/kg SMS som et pulver lyofilisert fra vann, i sau;

figur 10 er et diagram tilsvarende figur 9 men i kombinasjon med 2.5 mg/kg gelatin-mikro sfærer;

figur 11 er et diagram tilsvarende figur 9 og 10 men i kombinasjon med 2.5 mg/kg Sephadex-kuler;

figur 12 er et logaritmisk diagram som viser en sammenlikning av midlere plasmaglukosenivå som funksjon av tiden for de ulike mikrosfæresystem fig. 9-11;

figur 13 viser midlere plasmaglukosenivå for mikrosfæresystemene SMS, gelatin og Sphadex som funksjon av tiden;

figur 14 viser midlere plasmaglukosenivå for insulin (2 IE/kg) i kombinasjon med 2.5 mg/kg mikrosfærer av humant serumalbumin i form av et pulver lyofilisert i vann, administrert intranasalt i sau;

figur 15 viser midlere plasmaglukosenivå for insulin (2 IE/kg) i kombinasjon med 2.5 mg/kg mikrosfærer av DEAE-dextran administrert intranasalt i form av et pulver lyofilisert i vann, i sau; og

figur 16 er et logaritmisk diagram som viser midlere plasmaglukosenivå som funksjon av tiden ved bruk av DEAE-dextran-mikrosfærer.

Mikrosfærene er lett tilgjengelige, f.eks. stivelses-sfærer er tilgjengelige som "Spherex"

(Pharmacia), men kan generelt lages ved framgangsmåtene som er vist i Davis et.al., loe. eit. De etterfølgende eksemplene er spesifikke.

A Ibumin- mikrosfærer ( kontrollpreparat)

En 10 ml 25% HSA-løsning (pH=5) ble omrørt (500 opm) under tilsetning av en 30% løsning av PEG (ca. 2.5 ml) inntil faseseparasjon inntraff. Systemet ble ytterligere omrørt i 15 minutter før albumindråpene ble størknet ved langsom oppvarming av løsningen til 90 °C, og holde den ved denne temperaturen i 30 minutter. Istedet for denaturering med varme kan glutaraldehyd brukes for å kryssbinde albumin, men den sistnevnte metoden ser ut til å aggregere partiklene i større grad enn det som observeres med varme-denaturering. Mikrosfærene ble deretter isolert ved filtrering og frysetørret.

Med en rørehastighet på 500 opm ble det produsert partikler med en middelstørrelse på 43 um ± 6 um.

Mikrosfærer av stivelse

En 15 ml 5% løsning av stivelse (pH=7) ble holdt ved en konstant temperatur på 70°C og omrørt (500 opm) under tilsats av en 30% løsning av PEG (ca. 7 ml) inntil faseseparasjon fant sted. Systemet ble deretter ytterligere omrørt i 15 minutter før det ble kjølt ned på is under konstant omrøring. Mikrosfærene ble deretter isolert ved filtrering og frysetørret. Med en rørehastighet på 500 opm ble det produsert partikler med en middelstørrelse på 33 um ± 10 (im.

Mikrosfærer av gelatin

30 ml 10% oksegelatin (pH=8.5) ble holdt ved en konstant temperatur lik 50°C og omrørt (500 opm) under tilsats av en 30% løsning av PEG (ca. 20 ml) inntil sammenhopningspunktet ble nådd. For å kontrollere dette trinnet kan det brukes et nefelometer. Blandingen ble kjølt på is under konstant omrøring. Mikrosfærene ble isolert ved filtrering og frysetørret.

Med en rørehastighet på 500 opm ble det produsert partikler med en middelstørrelse på 60 um ± 10 um.

Mikrosfærer av gelatin inneholdende insulin

10 ml 2.5% ZN-insulin ble utfelt med en liten mengde 0. IN HC1 under omrøring, og ble deretter blandet med 10 ml 10% gelatin fra gris, der temperaturen ble holdt konstant ved 35°C. Under omrøring av denne blandingen ble det tilsatt en 30% løsning av PEG (ca. 8 ml) inntil sammenhopning fant sted. Systemet ble deretter kjølt på is, og mikrosfærene ble isolert ved filtrering og frysetørret.

Mikrosfærer av albumin inneholdende insulin ( kontrollpreparat)

Disse mikrosfærene ble laget ved sammenhopningsmetoden.

Til 5 ml 20% (w/v) menneskeserum-albumin (pH=5), omrørt ved 500 opm, ble det langsomt tilsatt 5 ml 2.5% Zn-insulin (pH=6.7), og den lave pH i albumin-løsningen felte ut insulinet. Til dette ble det tilsatt en 30% løsning av PEG 4000 (ca. 2 ml) inntil partiklene ble dannet. Deretter ble 100 mikroliter 25% glutaraldehyd tilsatt, og blandingen ble omrørt i 3 minutter før 15 ml destillert vann ble tilsatt for å motvirke aggregering av albuminpartiklene. Kryssbindingen ble tillatt å fortsette i totalt 20 minutter. Partiklene ble isolert ved filtrering, vasket med destillert vann (pH=5) og frysetørret.

Tilvirkingen av stivelse/insulin-systemet ble utført ved å tilsette, til de frysetørrete mikrosfærene av stivelse, en fosfatbuffer-løsning (pH=7.3) som inneholdt insulinet, blande i 1 time og frysetørre inntil det ble oppnådd et lett pulver. En typisk konsentrasjon av insulin vil være 1 IE per mg mikrosfærer. Mikrosfærene kan forsynes med mindre eller mere medikament.

Nasale administreringssystemer

Følgende studier av nasal administrering i dyr (sau) og menneske ble utført.

Insulin

I alle dyrene som ble studert ble glukose-plasmanivået analysert ved bruk av glukoseoksidase-metoden. Plasmainsulin- nivåene ble for saue-eksperimentene bestemt ved bruk av radioaktive isotoper ved en dobbel- antistoftfeknikk.

Eksempel 1: Studier av sau

Zn-krystallisert svært ren halvsyntetisk menneskeinsulin ble brukt, der hvert milligram rent protein var ekvivalent med 28 IE insulin. Insulinløsninger ble laget i 1/75 M fosfatbuffer (pH=7.3).

Atten krysningssauer (Suffolk og Texel) ble brukt i denne studien. For intranasal administrering av løsninger ble det innført en kanyle ("blueline umbilical") med lengde 35 cm (størrelse 6 FG) i sauens nesebor i en forutbestemt lengde på 10 cm før løsningen ble tildelt fra en 1 ml sprøyte. For intranasal administrering av pulverformige preparater ble et BOC (endotrakealt) rør (rød gummi, med mansjett) med en størrelse på 6.5 mm ifylt pulverpreparatet og deretter innført i neseboret til sauen til en forutbestemt dybde på 6 cm før pulveret ble blåst inn i nesehulen.

Sauens middelvekt var 35.9 kg (± 2.7 kg standardavvik). Dyrene ble ikke fastet forut for administreringen av insulin fordi dette er vanskelig å oppnå i praksis og på grunn av muligheten for å indusere motstand mot insulinet i dyrene. Med motstand menes at under slike betingelser ville blodsukkernivåene i sauen ikke reagere så lett overfor det tildelte insulin.

Tilvirking av insulinløsninger og pulvere:

Stammeløsninger av insulin ble laget i 1/75 M fosfatbuffer (pH=7.3). Disse ble deretter brukt som væskepreparater for intravenøs og intranasal administrering, og også i tilvirking av de lyofiliserte mikrosfære-preparatene. De sistnevnte ble laget ved å dispergere den påkrevde mengde mikrosfærer i insulinløsningen, røre i 1 time ved romtempteratur, og deretter frysetørre for å oppnå pulverpreparatet.

Administrering av insulinpreparater:

Insulin ble tildelt intranasalt i en mengde på 0.1 IE/kg, 0.2 IE/kg hypodermisk, og 2 IE/kg nasalt. Tre sauer ble brukt i hvert forsøk.

(1) intravenøs administrering av insulin som en væskeløsning laget med 4 IE/ml.

(2) Intranasal administrering av en væskeløsning laget med 200 IE/ml.

(3) Intranasal administrering av insulin i kombinasjon med mikrosfærer av stivelse (2.5 mg/kg) som et lyofilisert pulver. Dette preparatet ble laget ved å dispergere 500 mg Spherex i 30 ml 1/75 M fosfatbuffer (pH=7.3) som inneholdt 400IE insulin, hvoretter blandingen ble omrørt i 1 time og deretter frysetørret. (4) Intranasal administrering av insulin i kombinasjon med mikrosfærer av stivelse (2.5 mg/kg). Sauene ble administrert to ganger med et mellomrom på 4 timer. Dette preparatet ble laget som under (3) ovenfor. (5) Intranasal administrering av stivelses-mikrosfærer (2.5 mg/kg) uten insulin (referanse). Preparatet ble laget ved å dispergere 500 mg Spherex i 30 ml 1/75 M fosfatbuffer (pH=7.3), blande i 1 time og deretter frysetørre. (6) Hypodermisk administrering av insulin som en væskeløsning med 4.2 IE/ml.

Blodprøver på 5 ml ble samlet på knust is fra sauens halsvene. Hver blodprøve ble inndelt i to deler. For insulinanalyse ble de samlete blodprøvene (2.5 ml) forsiktig blandet i 5 ml hepariniserte (Li Heparin) rør. For glukoseanalyse ble det samlete blodet (2.5 ml) forsiktig blandet i 5 ml fluoridoksalat-rør. Alle blodprøvene ble etter uttrekking holdt på knust is i avvente av sentrifugering som ble utført ved 4°C og 3000 opm. Det samlete plasmaet ble lagret ved -20°C i avvente av insulin- og glukoseanalyse (radioimmuno-tester for insulin).

Figur 1 viser plasma-glukosenivåene som ble oppnådd ved intranasal administrering av en enkel insulinløsning, av blanke mikrosfærer av stivelse, av insulin i det kombinerte mikrosfære-preparatet og den intravenøse administrering av insulin. Figur 2 viser de samsvarende kurver for nivå av plasma- insulin. Det går fram at insulin tildelt intranasalt som en enkel løsning ikke har noen effekt av betydning på plasma-glukosenivået, og mengde insulin som absorberes på denne måten er faktisk svært lav. Figursymbolene er forklart på side 13.

Administrering av insulinet i kombinasjon med mikrosfærene av stivelse resulterer i en økning på 180% i AUC av plasmainsulin sammenliknet med en enkel nasal insulinløsning. På samme tid øker toppen i insulinnivået med 350%. Den skarpe toppen framtrer etter 15 til 20 minutter og avtar raskt som for intravenøst insulin.

Figur 3 viser plasma-glukosenivåene etter den doble administrering av insulin i kombinasjon med mikrosfærer av stivelse. En konstant dose-responseffekt ble oppnådd, med den laveste toppen i glukosenivå etter omlag 50 minutter etter den første administrering og 55 minutter etter den andre administrering. Det ser ikke ut til å være noen interferens mellom responsen fra den andre innføringen og den første. For nivåene av plasmainsulin (figur 4) ble det oppnådd et liknende bilde med to separate skarpe topper som opptrådte 15 minutter og 35 minutter etter henholdsvis den første og andre administrering.

Eksempel 2: Studier av mennesker - insulin

Friske, ikke-røkende, mannlige og kvinnelige frivillige (vekt i området 50 til 70 kg) ble rekruttert til dette forsøket. De fire preparatene a) insulin (1 IE/kg) i kombinasjon med mikrosfærer av stivelse (1 mg/kg) og b) mikrosfærer alene (1 mg/kg), ble tildelt etter en faste som varte over natta. Preparatene ble tildelt ved bruk av et nasalt innblåsningssystem. Glukosenivået i blodet ble målt hvert 5 minutt i blodprøver skaffet fra en stasjonær kanyle innstukket retrograd i venen på oversida av hånda.

Na-krystallisert svært ren halvsyntetisk menneskeinsulin ble brukt, der hvert milligram rent protein er ekvivalent med 28 IE insulin. Preparatet av insulin/mikrosfærer ble laget som for saueforsøkene; insulinløsningen ble imidlertid laget uten bruk av fosfatbuffer.

Figurene 5 og 6 (n=5) viser at plasma-glukosenivåene som ble oppnådd ved administrering mikrosfærene alene ikke viser noen økning, mens det ble oppnådd en vesentlig økning i plasma- glukosenivået ved administrering av insulin i kombinasjon med mikrosfærene. Figur 7 viser verdier fra objekt D med et plasma-glukosenivå som avtok fra 4.5 til 3.4 mmol/1 etter administrering av 1 IE/kg insulin i kombinasjon med mikrosfærene av stivelse.

Eksempel 3: Stabilitets-studier

Det er vist at peptider og proteiner slik som insulin er mottakelige for degradering av slimhinneenzymer slik som aminopeptidaser. Det ble utført forsøk for å studere hvorvidt et peptid eller et protein innkapslet i et mikrosfæresystem til en viss grad ville beskyttes mot en slik enzymatisk degradering som normalt finner sted i nesehulen.

Insulin i 0.1 M Tris-buffer (5.6 IE/ml) eller innarbeidet i albumin-mikrosfærer (0.4 IE/ml) ble inkubert med 1.0 ml av en 0.05% trypsinløsning i opptil 180 minutter. Prøver ble tatt ut ved passende tidspunkter og testet med hensyn til innholdet av ikke-degradert insulin.

Figur 8 viser hvordan blandingen framstilt ifølge oppfinnelsen, som i dette eksemplet omfatter albumin, kan beskytte et medikament, i dette eksemplet insulin, mot enzymatisk degradering. Dette vil være av betydning ved beskyttelse av peptider og proteiner mot degradering i slimhinna i nesen etter innføring.

Eksempel 4: Sammenlikning av ulike mikrosfærer på nasal absorpsjon av insulin fra pulverblandinger i sau.

Dette eksemplet har til hensikt å undersøke effekten av gelatin, albumin og Sephadex-mikrosfærer i pulverform på absorpsjon av insulin i sau. En kontrollgruppe ble tilført insulin og stivelses-mikrosfærer. Det ble anvendt halvsyntetisk humant Na-insulin (omlag 1900 DE, 69 mg, Novo BioLabs, Batch Ho 1034, 28 IE/mg, eller tilsvarende). Vanninnholdet og andre urenheter i materialet utgjorde 22%, slik at en renhet på 78% er brukt i de påfølgende beregningene. Det ble brukt stivelsesmikrosfærer (SMS, omlag 600 mg, Eldexomer, Batch 013) fra Perstorp, gelatin-mikrosfærer (omlag 600 mg, Batch EB 1) og mikrosfærer av humant serumalbumin (HSA) (omlag 600 mg) framstilt i instituttet for farmasøytisk teknologi (Department of Pharmaceutical Sciences) på Nottingham universitet, og Sephadex G-75-mikrosfærer (omlag 600 mg, Lot 70H0692) fra Sigma. I alle forsøkene ble det brukt ultrarent vann ("Elgastat UHP", Eiga). Alle andre reagenser var i det minste av laboratoriekvalitet.

Sau

Tolv (12) sauer av blandingsrase med kjent vekt ble brukt i denne studien. Den gjennomsnittlige vekt av sauene var omlag 30 kg. Sauene ble ikke fastet før insulinadministrering. En innebygget Viggo secalon-kanyle med indre diameter 1.2 mm forsynt med en universal-strømningsbryter (secalon), ble plassert omlag 15 cm inn i en av de utvendige halsvenene av hvert dyr på den første dag av studien, og ble når nødvendig holdt åpen ved å spyle den med heparinisert (25 IE/ml) 0.9% saltløsning. Denne kanylen ble fjernet når studien var ferdig hvoretter sauene ble returnert til normalt husdyrhold.

Framstilling av insulin- preparat

En råløsning av insulin ble laget av 1920 IE, 69 mg rent insulin i 20 ml vann for å framstille en løsning med konsentrasjon 96 IE/ml (3.45 mg/ml). For framstilling av de lyofiliserte mikrosfæreblandingene ble den påkrevete mengde av mikrosfærer (600 mg per blanding, tilstrekkelig for 8 sauer på 30 kg hver tilført en dose på 2.5 mg/kg) i to kolber, og 5 ml av råløsningen av insulin ble tilsatt hver kolbe. Volumet ble justert med det påkrevete volum av vann (35 ml) for å opprettholde forholdet mellom mikrosfærer og væske på 15:1 (mg:ml). Et sammendrag av blandingene er vist i tabell 1 nedenfor. De resulterende suspensjoner ble omrørt i en time ved romtemperatur, og ble deretter frysetørret for å oppnå pulverblandingene (blanding 1-4).

Frysetørringen ble utført på en Edwards Modulyo frysetørrer forsynt med en glassklokke-montasje og drevet ved et trykk på 0.08 torr, en kondensertemperatur på -53 °C og en produktlagringstemperatur på omlag 20°C. Fysetørringsprosessen fikk fortsette i 48 timer, hvoretter sluttproduktet ble fylt inn i administrerings-innretninger og deretter lagret i eksikator ved 4°C i 16 timer før administrering i sauene.

Administrering

Sauene ble inndelt i fire grupper på fire dyr hver og behandlet som vist nedenfor i tabell 2.

For intranasal administrering av disse pulverblandingene ble et ordinært (blueline) silikonisert oralt/nasalt rør (6.5 mm x 8.8 mm, i.d. x y.d., Portex) fylt med pulverblandingen og deretter ført inn i neseboret i sauen til en forutbestemt dybde på 6 cm før pulveret ble blåst inn i nesehulrommet.

Sedatering/ blodprøvetaking

Sauene ble sedatert ved bruk av en intravenøs dose av ketamin-hydroklorid (Ketalar™, 100 mg/ml injeksjon) ved 2.25 mg/kg. Dette ble gjort for å roe ned dyret og for å motvirke nysing under administrering. Anestesien varte i omlag 3 minutter. Blodprøver på 4.0 ml ble samlet på knust is fra den kanylerte halsvenen i sauen ved 15 og 5 minutter før insulinadministrering og ved 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 150, og 180 minutter etter administrering. Blodprøver ble blandet forsiktig i 4 ml hepariniserte reagensrør (Lithium Heparin, 60IE, Sarstedt, Leicester, U.K.). Plasma be separert ved sentrifugering ved 4°C og 3000 opm. Hver plasmaprøve ble inndelt i to like store deler, en for insulinanalyse og en for glukoseanalyse. Plasma ble deretter lagret ved -20 °C i påvente av de respektive analysene.

Resultatene fra dette eksemplet er angitt i figur 9-14.

Eksempel 5: Sammenlikning av effekten av DEAE-dextran-mikrosfærer og stivelses-mikrosfærer på den nasale administrering av insulin fra pulverblandinger i sau.

Dette eksemplet har til hensikt å undersøke effekten av DEAE-dextran-mikrosfærer i pulverform på absorpsjon av insulin i sau. En kontrollgruppe ble tilført insulin/stivelses-mikrosfærer. Det ble anvendt halvsyntetisk humant Na-insulin (omlag 1000 IE, 36 mg, Novo BioLabs, Batch Ho 1034, 28 IE/mg, eller tilsvarende). Vanninnholdet og andre urenheter i materialet utgjorde 22%, slik at en renhet på 78% er brukt i de påfølgende beregningene. Det ble brukt stivelsesmikrosfærer (SMS, omlag 600 mg, Eldexomer, Batch 013) fra Perstorp. Det ble brukt DEAE-dextran-mikrosfærer (omlag 600 mg, DEAE-dextran A-25, A-25-120, Lot 100H0315) fra Sigma. I alle forsøkene ble det brukt ultrarent vann ("Elgastat UHP", Eiga). Alle andre reagenser var i det minste av laboratoriekvalitet.

Sau

Sauene ble behandlet tilsvarende som i eksempel 4 foran men med bruk av totalt åtte sauer.

Framstilling av insulin- preparat

Det ble laget pulverblandinger på tilsvarende måte som i eksempel 4 foran, men med bruk av en råløsning av insulin laget av 1008 IE, 36 mg rent insulin i 10.5 ml vann for å framstille en løsning med konsentrasjon 96 IE/ml (3.429 mg/ml). Sammensetningen av blandingene framgår av tabell 3 nedenfor.

Frysetørringen ble utført på tilsvarende måte som i eksempel 4 foran.

Administrering

Sauene ble inndelt i to grupper på fire dyr hver og behandlet som vist nedenfor i tabell 4. Administreringen ble utført på tilsvarende måte som i eksempel 4 foran.

i

Sedatering/ blodprøvetaking

Sedatering og blodprøvetaking ble utført på tilsvarende måte som i eksempel 4 foran, men i dette eksemplet ble det i tillegg tatt en blodprøve 240 minutter etter administrering.

Med henvisning til figur 9-13 fra eksempel 4 foran, kan en se at gelatin og dextran-mikrosfærer også viser seg å produsere en tilsvarende biotilgjengelighets-profil sammenliknet med insulin. Med alle disse tre mikrosfære-materialenie ble det observert en rask reduksjon i plasmaglukose-nivå, som indikerer en tilsvarende økning i plasmainsulin-nivå, og at det minimale plasmaglukose-nivå som oppnås, særlig med stivelse, er større enn det som ville forventes fra den kjente teknikk. Likheten i profilene som ble oppnådd med stivelse-, gelatin- og dextran-mikrosfærene framgår tydelig av figur 12 og 13.

Den overraskende og utforutsigbare natur av resultatene oppnådd med stivelse-, gelatin-og dextran-mikrosfærer er enda tydeligere når verdiene oppnådd med albumin- og DEAE-dextran-mikrosfærer sammenliknes, som vist i figur 14-16 fra eksempel 4 og 5 foran.

Beskrivelse av figursymbolene

Figur 1

o Mikrosfærer av stivelse

• Insulin-løsning

A Insulin + mikrosfærer av stivelse

▲ Insulin tildelt intravenøst

Figur 2

o Mikrosfærer av stivelse

• Stivelsesløsning

A Insulin + mikrosfærer av stivelse

Claims

1. Framgangsmåte for framstilling av en blanding for systemisk administrering gjennom slimhinner i vagina, øyet eller nesen, ved å tilvirke et flertall mikrosfærer som danner gel ved kontakt med slimhinna og et aktivt medikament, karakteriser! t ved at det i mikrosfærer omfattende gelatin, stivelse eller derivater av samme, eller dextran eller derivater av samme unntatt DEAE-dextran, innarbeides aktivt medikament i form av et peptid med en maksimal molvekt på 6000, og at blandingen ikke omfatter promotor.

2. Framgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mikrosfærene framskaffes med en midlere diameter mellom 10 i og 100 um.

3. Framgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at materialet i mikrosfærene kryssbindes i det minste delvis.

4. Framgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at peptidet framskaffes med en molvekt på minst 1000.

5. Framgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at polypeptidet anvendes i form av insulin eller calcitonin.

6. Framgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 5, karakterisert ved at medikamentet (polypeptidet) sorberes i eller på mikrosfærene, etter tilvirkingen av disse, hvoretter det resulterende produkt frysetørkes.

7. Framgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 6, karakterisert ved at medikamentet framskaffes i form av en antigenisk vaksine.