NO175872B

NO175872B -

Info

Publication number: NO175872B
Application number: NO871573A
Authority: NO
Original assignee: Daiichi Seiyaku Co
Priority date: 1986-04-14
Filing date: 1987-04-14
Publication date: 1994-09-12
Also published as: JPS6344897A; IL82207A; PH26343A; FI97550C; DK189987D0; AU7151687A; FI97550B; DE3750348T2; CN1034427C; EP0244677A3; FI871607A; KR870010190A; CN87102823A; IL82207A0; EP0244677A2; EP0244677B1; US5019499A; CN1107513A; CA1297434C; FI871607A0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en plasmidvektor, en fremgangsmåte for fremstilling av ønskede peptider og myelomcelle transformert med den nevnte plasmidvektor.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Forskjellige forsøk er blitt utført for å fremstille peptider ved transformering av dyreceller og dyrking av transfor-mantene. Eksempler på dette er angitt i det etterfølgende sammen med de omtrentlig beregnede produktiviteter.

(i) BPV (bovint papilloma virus)-mus C127 system:

Humant IFN-y gen (cDNA), SV40 tidlig promoter,

3 x IO<5> u/ml (R. Fukunaga et al., Proe. Nati.

Acad. Sei. USA, 81, 5086 (1984)),

(ii) SV40-CV-1 system: Humant IFN-fJ gen (cDNA) , SV40 tidlig promoter, 2 x IO<4> u/ml (D. Gheysen et al., J. Mol.

Appl. Genetics, 1, 305 (1982)),

(iii) SV40-COS system: Humant insulingen (cDNA), SV40 tidlig promoter (O. Laud et al., J. Biol. Chem., 258, 6043

(1983)), (iv) Eco-gpt-CHO system: Humant IFN-y gen (cDNA), SV40 tidlig promoter, 1 x 10<4> u/ml (T. Kadotani et al., Seikagaku, 56, 915 (1984)), og (v) dhfr-CHO system: Humant IFN-y gen (cDNA), SV40 tidlig promoter, 1 x IO<5> u/ml (S. Scahill et al., Proe.

Nati. Acad. Sei. USA, 80, 4654 (1983)).

Selv om alle disse metodene har sine karakteristiske trekk, er hver metode likevel utilfredsstillende, og særlig med hensyn til produktiviteten av det ønskede peptid.

Myelomceller er også anvendt som antistoffproduserende celler i fremstillingen av monoklonale antistoff-peptider. Deres anvendelse for fremstilling av andre peptider er imidlertid ikke kjent.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en plasmidvektor som har en SV40 tidlig promotersekvens på både 5' oppstrøms- og 3' nedstrømssidene av et gen som koder for et ønsket peptid og er kjennetegnet ved at plasmidvektoren omfatter i 5' > 3' retningen: 1) en første SV40 tidlig promotersekvens som er lokalisert i regionen av flere titalls basepar opp-strøms fra startkodonet til et gen som koder for det

ønskede peptid,

2) et gen som koder for et ønsket peptid,

3) en første SV40 terminator,

4) en andre SV40 tidlig promotersekvens som er lokalisert i regionen av flere kilobasepar nedstrøms fra

genet som koder for det ønskede peptid,

5) et gen som koder for en selektiv markør, og

6) en andre SV40 terminatorsekvens.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av de ønskede peptider som er kjennetegnet ved at den omfatter : 1) transformering av myelomceller med en plasmidvektor som har en SV40 tidlig promotersekvens på både 5' oppstrøms- og 3' nedstrømssidene av sekvenser som omfatter genet som koder for det ønskede peptid og en SV40 terminatorsekvens lokalisert på en nedstrømsside

fra genet som koder for det ønskede peptid,

2) dyrking av de transformerte celler, og

3) rensing av de ønskede peptider.

Oppfinnelsen vedrører endelig en myelomcelle som er kjennetegnet ved at den er transformert med den ovennevnte plasmidvektor og istand til å uttrykke genet som koder for det ønskede peptid.

Myelomceller er fordelaktige ved at de har evnen til å vokse hurtig in vivo og in vitro, ved at de har en høy protein-syntetiseringskapasitet (med hensyn til IgG) og at de er i stand til å formere seg til en høyere celletetthet. Et frem-tredende trekk ved oppfinnelsen er at man oppnår en stor mengde peptider ved å kombinere de ovennevnte fordelaktige trekk for myelomceller med den potente ekspresjonsforsterkende effekt av SV40 promotoren og enhanceren. Fig. 1 og fig. 2 viser hver et skjema for oppbygging av en vektor Fig. 3 og fig. 4 viser hver restriksjonskartet til et DNA

fragment, og

Fig. 5 til 12 viser hver et grovt skissert restriksjonskart til hvert av de anvendte plasmider.

Den SV40 tidlige promotersekvens på 5' oppstrømssiden av genet som koder for de ønskede peptider bør være tilstede innen området av flere titalls basepar oppstrøms fra startkodonet, foretrukket innen flere basepar eller umiddelbart oppstrøms fra startkodonet. Vedrørende en annen SV40 tidlig promoter på 3' nedstrømssiden, er det passende at den er tilstede innen området av flere kilobasepar, for eksempel 2,5 kbp, nedstrøms fra genet som koder for de ønskede peptider.

Plasmidet som innføres i dyrecellene innlemmes i dyrekromoso-mal DNA og forblir stabilt der. Geneproduktet, d.v.s. peptidet fremstilles stabilt fra de transformerte celler og de transformerte celler kan overleve permanent.

Ved anvendelse av myelomceller som ikke danner eller utskiller IgG kan man unngå kontaminering med IgG. Dette er følgelig fordelaktig ved rensing av det ønskede peptid. Videre, da myelomceller kan formeres i bukhulen hos et dyr slik som mus, kan geneprodukter (peptider) bifremstilles som forventet i store mengder.

Anvendelsen av en vektor med SV40 promoteren plassert både ved 5' oppstrøms- og 3' nedstrømsendene av det heterologe gen som koder for det ønskede peptid (for eksempel IFN) gir en omtrent ti ganger økning i produktivitet av genproduktet.

Vedrørende celler som kan anvendes som vertsceller, kan man nevne en rekke myelomceller, for eksempel fra mus og rotter og humane myelomceller. Blant disse, er ikke-IgG-produserende eller ikke-IgG-sekresjonsceller passende sett ut fra et synspunkt vedrørende produktrensing. Cellelinjene P3-X63-Ag8-Ul (ikke-sekresjonstype) HGPRT-, X63-Ag8-6.5.3 (ikke-produktiv type) HGPRT- og SP2/0-Agl4 (ikke-produktiv type) HGPRT- er eksempler på musemyelomcellelinjer og er vel kjente (Munemura (ed.): Saibo Baiyo Manual (Manual of Cell Culture), Kodansha, Tolyko (1982), Iwasaki et al.: Tankuron Kotai (Monoclonal Antibodies), Kodansha, Tokyo (1982)).

Vektoren som anvendes har en potent promoter som er i stand til å bevirke genekspresjon i dyreceller og en selektiv markør. Som promoter anvendes som nevnt en SV40 promoter. Som den selektive markør kan man f. eks. nevne Eco-gpt (som beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 2072-2076)), tk (som beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, 3757 (1979)) og dhfr (som beskrevet i Molec.

Cell. Biol., 1, 845-864 (1981)), som alle er kjente. Andre kjente selektive markører kan også anvendes.

Basesekvensen til SV40 promoteren er gitt i Science, 200, 495-498 (1978). En vektor hvor SV40 promoteren er kombinert med genet for det ønskede polypeptid kan lett konstrueres av en fagkyndig på området, for eksempel i henhold til de etter-følgende eksempler. Kutting, syntese, analyse, isolering og andre behandlinger av DNA-fragmenter som er nødvendige for vektorkonstruksjon, kan gjennomføres ved anvendelse av vanlig kjente teknikker. (Am. J. Hum. Genet., 31, 531 (1979), T. Maniatis et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (19 82)).

Protoplastfusjonsmetoden, kalsiumfosfatmetoden e.l. kan anvendes for å transformere dyrecellene med det rekombinante plasmid for å innføre det aktuelle gen i cellene. (Mol. Cell. Biol., 1 (8), 743-752 (1981), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80, 825-829 (1983), Ogawara: Wakariyasui Idenshi Kumikae (Compre-hensible Gene Recombination), side 144-165, Hirokawa Shoten, Tokyo (1985)). Celleformering kan utføres in vitro, eller in vivo ved anvendelse av passende metoder. Celleformerings-systemet kan passende velges avhengig av tilfellet og med den hensikt å effektivt produsere det ønskede polypeptid (Iwasaki et al: Tankuron Kotai (Monoclonal Antibodies, Kodansha, Tokyo

(1982)) .

For dyrking in vitro kan medier som generelt anvendes for dyrking av myelomceller in vitro anvendes, for eksempel RPMI-1640 medium supplert med 10 % (v/v) føtalt kalveserum (FCS) eller RDF medium (RPMI-1640:DMEM:F12 = 8:1:1) supplert med 10 % (v/v) FCS eller syntetisk serum slik som Nu-serum, eller serumfritt medium slik som RDF medium (RPMI-1640:DMEM:F12 = 3:1:1) supplert med ITES (insulin, transferrin, etanolamin og selen) og albumin. (Supplement nr. 27 til Tanpakushitsu, Kakusam, Koso (Protein, Nucleic Acid and Enzyme), 453-455

(1984)) .

For dyrking in vitro kan man anvende petriskåler og rulle-flasker. Som dyrkingsmetode kan man anvende metoden med høy tetthet hvor dyrkingen gjennomføres med en celletetthet på IO<6 >celler/ml eller større (107-108) . Spesifikke eksempler derav omfatter hulfiberdyrking (som beskrevet i Science, 17 8, 65

(1972)), mikrokapseldyrking (som beskrevet i US-patent 4.409.331), "air lift"-dyrking (som beskrevet i Briochem. Soc. Trans., 13, 10 (1985)) og membranperfusjonsdyrking (inkubatoren er tilgjengelig fra Millipore Co., USA). Blant disse er hulfiberdyrkingen effektiv og fordelaktig (inkubatoren er tilgjengelig fra Amicon Co. eller Endotronics Co.). Dyrking in vitro kan utføres ved hjelp av vel kjente metoder (Munemura (ed): Saibo Baiyo Manual (Manual of Cell Culture), Kodansha, Tokyo (1982) og Fukui et al. (ed): Saibo Baiyo Gijutsu (Cell Culture Technology), Kodansha, Tokyo (1985)). In vitro celle-dyrking kan således for eksempel gjennomføres i nærvær av 5 % kabondioksyd. In vivo formering av myelomceller kan gjennomføres i bukhulen ved anvendelse av dyr. Dette er vel kjent innen teknikkens stand. Med hensyn til dyret skal man spesielt nevne muse-stammen Balb/c nu/nu eller Balb/c hvori myelomcelletrans-plantasjon er mulig (disse musestammene er tilgjengelige fra Charles River Japan, Inc.).

De ønskede peptider fremstilt ifølge oppfinnelsen er valgt fra lymfokiner som interferoner, tumornekrosesfaktor og inter-leukiner, hormoner som insulin og veksthormon, antigenproteiner som hepatittvaksine og influensavaksine, vevsplasminogenaktivator og somatomediner.

Det fremstilte peptid kan isoleres og renses ved hjelp av passende kjente metoder, f. eks. affinitetskolonne-kromatografi, ionebytterkromatografi, molekylfiltrering o.s.v.

Det følgende eksempel hvor y-interferon (y-IFN) ble anvendt som et eksempel på peptidet vil ytterligere illustrere den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL.

I. Vektorkonstruksjon ( fig. 1).

a) Innføring av y-IFN gen i basisvektor:

Plasmidet pKSV-10 (Pharmacia P-L Biochemicals, se fig. 5,

restriksjonskartet til Kpnl-BamHI fragmentet av dette plasmid er vist i fig. 3) ble kuttet i Bglll-stedet umiddelbart etter den SV40 tidlige promoter og butte ender ble oppnådd ved anvendelse av Klenow-fragmentet, etterfulgt av innføring av en Smal-linker (Takara Shuzo). Det således oppnådde plasmid pKSV-10-SmaI (se fig. 6) ble propagert i Escherichia coli HB101.

Et humant y-IFN gen-holdig plasmid, pMK-5 (deponert ved Fermentation Research Institute i form av E. Coli MK-5, depo-neringsnummer: FERM BP-1329 (se fig. 11)), ble behandlet med Banlll og BamHI. Det således fjernede y-IFN gen (genom) fikk butte ender ved behandling med Klenowfragmentet og innført i pKSV-10-SmaI ved Smal-stedet til å gi pKSV-10-y (se fig. 7).

b) Innføring av selektiv markør Eco-gpt gen i pKSV-10-y: Plasmidet pSV-2-gpt (Bethesda Research Laboratories (se

fig. 8) eller ATCC nr. 37145) ble behandlet med PvuII og EcoRI. Det således fjernede Eco-gpt fragmentet ble ligert med fragmentet som var oppnådd ved at plasmidet pUC13 (Pharmacia P-L Biochemicals) ble behandlet med Smal og EcoRI, til å gi plasmidet pUC13-SV-gpt (se fig. 9). Eco-gpt genet (SV40 promoter + Eco-gpt + SV-terminator) ble fjernet fra ovennevnte pUC13-SV-gpt med BamHI. Det resulterende fragment, hvis restriksjonskart er vist i fig. 4, ble innført i pKSV-10-y (se fig. 7) (med et BamHI-sted ved SV40 terminatorenden Opå 3' siden av y-IFN genet) ved BamHI stedet til å gi pKSV-10-y-gpt (se fig. 10).

Da ovennevnte Eco-gpt genet har den SV40 tidlige promoter på 5' oppstrømssiden, er y-IFN genet i plasmidet som er kon-struert over i sandwich-form mellom to SV40 promoterer. Dette plasmid ble anvendt for transformasjon. c) Introduksjon av selektiv markør tk gen i pKSV-10-y (se fig. 2): tk genet (tk promoter + tk + tk terminator) ble fjernet fra plasmidet pFG-5 (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, 3757

(1979) med BamHI og innført i pKSV-10-y (se fig. 7) ved BamHI stedet til å gi plasmidet pKSV-10-y-tk (se fig. 12). Dette plasmid har kun en SV40 tidlig promoter på 5' siden av

y-IFN genet. Dette ble anvendt for transformasjon.

II. Etablering av transformert mvelomlinje.

a) Plasmidintroduksjon ved protoplastfusjon:

(1) Protoplastfremstilling.

Escherichia coli med vektoren pKSV-10-y-gpt (se fig. 10) ble dyrket ved 37°C i "L-broth" (LB) inneholdende glukose (slutt-konsentrasjon 1 (vekt/volum)%) og ampicillin (sluttkonsentra-sjon 50 }lg/ml) (sluttvolum 50 ml) inntil turbiditeten (OD) ved 600 nm ble 0,5. De påfølgende behandlinger ble gjennomført ved 4°C. Kulturen ble sentrifugert ved 3.000 rpm i 15 minutter, sedimentet ble renset med 0,05 M Tris buffer (pH 8) inneholdende 20 (vekt/volum)% sukrose, 1,25 ml av den samme buffer ble tilsatt og blandingen ble omrørt. 0,25 ml lysozym (Sigma) (oppløst i 0,25 M Tris buffer (pH 8) til 5 mg/ml), ble tilsatt dertil og sluttblandingen fikk stå i fem minutter. Etter ytterligere tilsetning av 0,5 ml 0,25 M EDTA fikk blandingen stå i fem minutter.

Til den ovennevnte blanding ble det tilsatt 0,5 ml 0,05 M Tris buffer (pH 8) , og temperaturen ble økt til 37°C og blandingen fikk stå i 15 minutter. Til denne blandingen ble det tilsatt 10 ml av et DME-medium som var tilsatt sukrose (slutt-konsentrasjon 10 (vekt/volum)%) og magnesiumklorid (slutt-konsentrasjon 10 mM). Den oppnådde blanding fikk stå ved 37°C i ti minutter. (2) Fusjon av protoplaster og myelomceller (fremstilling av transformerte celler.

Myelomceller (lxlO<7> celler, X63-Ag8-6.5.3 (HGPRT-)) (Flow Laboratories Inc.-Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) ble tilsatt til kulturen som var oppnådd over i (1). Blandingen ble sentrifugert ved 1.500 rpm i fem minutter. Supernatanten ble fjernet og sedimentet ble løsnet og 0,5 ml av en polyetylen-glykolløsning (fremstilt ved tilsetning av fosfatbuffret fysiologisk saltvann (PBS) til 9 g PEG 4000 (Sigma) til å danne 2 0 ml) ble tilsatt sakte til sedimentet for dermed å oppnå en jevn oppløsning av sedimentet. Etter henstand i ett minutt, ble åtte 1-ml porsjoner av DME-mediumet tilsatt til suspensjonen med 30 sekunders intervaller. Hele blandingen ble sentrifugert og sedimentet ble oppløst i RPMI-XHT medium med en sammensetning som er gitt i det følgende. Den således oppnådde cellesuspensjon ble fordelt i tre 96-brønns plater og inkubert i 48 timer.

Sammensetning av RPMI- XHT medium: Til RPMI-1640 (Gibco,

for 1 liter) ble det tilsatt 36 mg kanamycin, 120 mg streptomycin, 250 mg xantin, 13,6 mg hypoxantin, 3,87 mg tymidin, 3,5 jxg 2-merkaptoetanol og 2,0 g natriumbikarbonat.

Totalt volum ble justert til 1 liter. Til denne løsning ble det tilsatt 100 ml FCS (føtalt kalveserum).

Seksjon av transformerte celler ble deretter utført ved dyrking i ovennevnte medium som var supplert med mykofenolsyre til 6 mg/liter (RPMI-XHMT). Etter dyrking i to uker mens halvparten av mediumet ble byttet ut med frisk medium pr. tredje døgn, var seleksjonen ferdig.

For L(tk-) celler (tymidinkinase-krevende musefibroblastceller som beskrevet i Exp. Cell. Res., 31, 297-312) ble pKSV-10-y-gpt og pKSV-10-y-tk innført ved hjelp av kalsiumfosfatmetoden og seleksjonen ble gjennomført på samme måte som angitt over ved anvendelse av henholdsvis RPMI-XHMT medium og RPMI-HAT medium.

III. Ekspresjon av y- IFN.

De pKSV-10-y-gpt transformerte myelomceller X63-Ag8-6.5.3 (HGPRT-) ble innstilt til 5 x 10<4> celler/ml med et medium som hadde en sammensetning som angitt under. En 2 0-ml porsjon av suspensjonen ble plassert i en skål med diameter 100 nm og dyrket i en inkubator ved 37°C i fire døgn. Cellene ble samlet og plassert i en rulleflaske med en celletetthet på 8 x IO<4> celler/ml og et dyrkingsvolum på 100 ml, og dyrket i et rom med konstant temperatur på 37°C med en omdreinings-hastighet på 50 rpm.

Mediumsammensetninq: I en blanding av 8 volumdeler RPMI 1640 (Sigma, for 1 liter), 1 volumdel DME (Sigma) og

1 volumdel F-12 (Sigma), ble det oppløst 25 mM HEPES

(Sigma), 4 g glukose, 2 g natriumbikarbonat, 3,5 (lg 2-merkaptoetanol, 3 6 mg kanamycin, 150 mg streptomycin,

250 mg xantin, 13,6 mg hypoxantin og 3,87 mg tymidin, idet

totalvolumet var 1 liter. Mykofenolsyre (til 6 mg/liter)

ble tilsatt til blandingen. Sluttblandingen fikk ytterli gere tilført 100 ml NU-serum (Collaborative Research).

Fra den femte dag ble halvparten av mediumet byttet ut med en frisk porsjon medium hver av de følgende dager. Dyrkingen ble fortsatt mens celletettheten i rulleflasken ble holdt fra 1,0 x IO<6> til 1,5 x IO6 pr. ml. Kultursupernatanten som ble utvunnet hver dag ble målt som beskrevet under.

Med hensyn til de transformerte L-cellene som ble oppnådd i II, ble de dyrket i 60 mm skåler på vanlig måte og hver supernatant ble analysert som beskrevet under.

Separat, ble syv uker gamle Balb/c nu/nu mus inokulert intraperitonealt med 0,5 ml pristane (2,6,10,14-tetrametylpenta-dekan, Wako Pure Chemical Industries), og etter en uke, ble de ytterligere inokulert intraperitonealt med 1 x 10<7> myelomceller X63-Ag8-6.5.3 (HGPRT-) transformert med pKSV-10-y-gpt. Etter at musene var foret i ytterligere tyve døgn ble bukhule-væsken samlet og analysert som beskrevet under.

IV. Analyse av Y- IFN.

Kultursupernatanten og prøver av bukhulevæske ble analysert med hensyn til y-IFN ved anvendelse av 50 % cytopatisk effekt (CPE) inhiberingsanalyse i en 96-brønns mikrotiterplate, som beskrevet av Philip et al. (Methods in Enzymology, 78, 389394

(1981)), ved anvendelse av humane fosterhinneavledede FLceller og SV (Shindbis virus) sammen med standard cc-IFN oppnådd fra NIH og y-IFN oppnådd fra Genentech's.

Resultatene som ble oppnådd er vist i det følgende.

In vitro kultur:

Intraperitoneal kultur i Balb/c nu/nu mus:

pKSV-10-Y-gpt X63-Ag8-6.5.3 (HGPRT-) 7 x IO<5>

Mens den roterende dyrking ble fortsatt i tyve døgn, forble produksjon i halvparten av mediumet, som ble utvunnet hver dag fra den femte dyrkingsdag, nesten uforandret. Ekspresjonen av 4 x IO<5> u/ml tilsvarer 50 ml medium/100 ml rulleflaske/dag og er svært bra. Det er antatt at en kultur med høy tetthet ved anvendelse av hulfiber, skulle gi en ekspresjon på 5 x IO<7 >u/ml. Således tilveiebringer oppfinnelsen en utmerket metode for fremstilling av peptider.

Ekspresjon av a-IFN genet som ble anvendt i stedet for

y-IFN genet i pKSV- 10- v- gpt- L( tk-) o g pKSV- 10- 7- tk-

L( tk-) kombinasjonene ga titre på henholdsvis

1 x 10<4> u/ml og 2 x IO<3> u/ml.

Når en ekspresjon ble utført i pKSV- 10- V- gpt og X63-Ag8-6.5.3 kombinasjonen i en roterende kultur under anvendelse av et medium som ikke inneholdt serum (inneholdende insulin, transferrin, selen, etanolamin og bovint serum albumin (BSA) istedet for FCS), ble det oppnådd et titer på

1 x IO<6> u/ml

Claims

1. En plasmidvektor som har en SV40 tidlig promotersekvens på både 5' oppstrøms- og 3' nedstrømssidene av et gen som koder for et ønsket peptid, karakterisert ved at plasmidvektoren omfatter i 5' > 3' retningen:

1) en første SV40 tidlig promotersekvens som er lokalisert i regionen av flere titalls basepar opp-strøms fra startkodonet til et gen som koder for det ønskede peptid,

2) et gen som koder for et ønsket peptid,

3) en første SV40 terminator,

4) en andre SV40 tidlig promotersekvens som er lokalisert i regionen av flere kilobasepar nedstrøms fra genet som koder for det ønskede peptid,

5) et gen som koder for en selektiv markør, og

6) en andre SV40 terminatorsekvens.

2. Plasmidvektor som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte ønskede peptid er valgt fra gruppen bestående av lymfokiner, hormoner, antigenproteiner, vevsplasminogenaktivator og somatomediner.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av de ønskede peptider, karakterisert ved at den omfatter: 1) transformering av myelomceller med en plasmidvektor som angitt i krav 1 eller 2, 2) dyrking av de transformerte celler, og 3) rensing av de ønskede peptider. 4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte myelomcelle er valgt fra gruppen bestående av musemyelomceller, rottemyelom-celler og humane myelomceller. 5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte musemyelomceller er valgt fra gruppen bestående av P3-X63-Ag8-Ul HGPRT-, X63-Ag8-6.5.3 HGPRT- og SP2/0-Agl4 HGPRT-. 6. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte ønskede peptid er valgt fra gruppen bestående av lymfokiner, hormoner, antigen- proteiner, vevsplasminogenaktivator og somatomediner.

7. Myelomcelle, karakterisert ved at den er transformert med en plasmidvektor som angitt i krav 1 eller 2, og istand til å uttrykke genet som koder for det ønskede peptid.