NO171505B - Fremgangsmaate for syntese av amikacin - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for syntese av amikacin, (0-3-amino-3-desoksi-alfa-D-glykopyranosyl-(l-»6 )-0-[6-amino-6-desoksi-alfa-D-glukopyranosyl-(l-*4 )]-N1-(4-amino-2-hydroksy-l-oksibutyl)-2-desoksi-D-streptamin) med formel (I): er et halvsyntetisk antibiotikum, mye brukt i terapi, som oppfinnelig starter fra acylering av kanamycin A (II)

Et stort antall synteseskjemaer for amikacin er kjent og er blitt sitert sammen med tilsvarende litteratur i EP-patent-søknad nr. 86.201.663.1 inngitt 25. september 1986.

Hensikten med denne oppfinnelsen er den selektive acyleringen av aminogruppen i posisjon 1 i 2-deoksistreptaminkJernen til et passende derivat av kanamycin på den enklest mulige måten, ved å unngå bruk av toksiske, kostbare og vanskelige løsningsmidler og reaktanter. Acyleringsmidlet er et derivat av L-(-)-4-amino-2-hydroksismørsyre (III) (heretter kalt L-HABA) som er hensiktsmessig aktivert og beskyttet i henhold til metoder kjent i litteraturen: Mer detaljert starter fremgangsmåten i følgende oppfinnelse med derivat (IV) som er beskyttet i posisjon N-6' og N-3 med benzyloksikarbonylgruppen

der R = benzylokarbonyl, substituert benzyloksykarbonyl, alkoksykarbonyl, ftaloyl, haloalkylkarbonylgrupper, R' = H, R" = H, acyleres, idet acyleringen blir gjennomført med et derivat av L-(- )-4-amino-2-hydroksismørsyre (L-HABA), som er et N-benzyloksy-L-(-)-4-amno-2-hydroksysuksinimid, de beskyttende N-benzyloksykarbonylgruppene fjernes deretter fra reaksjonsproduktene ved hjelp av i og for seg kjente fremgangsmåter, kjennetegnet ved at acyleringen gjennomføres ved å anvende som reaksjonsoppløsningsmiddel vann og et

aprotisk oppløsningsmiddel valgt blant alifatiske hydrokarboner og halogenerte alifatiske hydrokarboner, og ved regulering av pH til en verdi mellom 4,5 og 6,5, idet reaksjonstemperaturen er mellom 0 og 60°C.

Et slikt mellomprodukt er blitt beskrevet av T.L. Nagabhushan et al., J. Amer. Chem. Soc, 100. 5254 (1978) og i US-patent nr. 4.136.254 og i artikler til T. Tsuchiya et al., Tet. Lett., 4951 (1979) og i belgisk patent nr. 879,925.

I det sistnevnte patent blir det dobbeltbeskyttede mellomprodukt (IV) omdannet til den tilsvarende 3"-trifluoracet-amid-forbindelse (V) med etyltrifluoracetat og deretter acylert i posisjon 1 med det passende utvalgte L-HABA-derivat.

De to ulike beskyttelsesgruppene, trifluoracetyl og bensyl-oksikarbonyl, fjernes i denne rekkefølge med ammoniakk og hydrogen, hvilket som sluttprodukt gir amikacin.

Utbyttene angis å være tilfredsstillende, men prosessen er ikke industriell skikket siden etyltrifluoacetat, en toksisk og kostbar reaktant, og dimetylsulfoksid, et kostbart og vanskelig gjenvinnbart oppløsningsmiddel på grunn av dets høye kokepunkt, må brukes.

Hovedhensikten med foreliggende oppfinnelse er å tilveie-bringe en fremgangsmåte som løser de problemene og ulempene som kort er nevnt over.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelsen er kjennetegnet ved at acyleringen av det dobbeltbeskyttede mellomprodukt (IV) utføres ved at den utelukkende bruker vann som oppløsningsmiddel med de opplagte fordeler det er for industriprosesser både fra økonomisk og økologisk synspunkt. Et annet hovedtrekk består i at mellomprodukt (IV) blir direkte acylert og danner det triacylerte mellomprodukt (VI) ved å regulere reaksjons-pH som er hovedansvarlig for acyleringsselektiviteten mellom aminogruppene i posisjon 1 og 3".

En slik acyleringsselektivitet er et originalt og nytt resultat som ikke var forutsigbart på basis av det som er rapportert i litteraturen.

Faktisk diskuteres det i artiklene av J.J. Wright et al., J. Antibiotics, 29, 714 (1976) muligheten av at selektiviteten i reaksjonsmediumet avhenger av pH og at den endres dramatisk ved å velge reaksjonsforhold der aminogruppene til den antibiotiske forbindelsen er fullstendig protonert.

Under henvisning til informasjon gitt av forfatterne, kan utbyttet av N-acylerte derivater av forskjellige aminogluko-sider (sisomicyn, verdamycin, gentamycin C^a) oppnås med utbytte som alltid er lavere enn 30%.

I samme artikkel blir det imidlertid angitt at "svak selektivitet er blitt observert i acylering av hydroksilerte antibiotika slik som gentamycin B og kanamycin".

På basis av et slikt utsagn, så er det faktum at acyleringen i foreliggende fremgangsåte i posisjon N-l til et diacylert derivat av kanamycin er meget selektiv som en funksjon av reaksjons-pH, fullstendig nytt og uforutsigbart.

I US-patentnr. 4.136,254 er det i eksempel 23 angitt en direkte acylering av det samme mellomprodukt (IV) i en homogen oppløsning (50$ V/V) av tetrahydrofuran og vann med den aktive ester med N-hydroksisuccinimid av N-benzyloksikarbonyl L-EABA-syre oppløst i DMF. Disse betingelser er imidlertid forskjellig fra de som benyttes i den foreliggende oppfinnelse siden reaksjonen, i US-patentet, utføres i homogen fase med fullstendig oppløseliggjøring av reaktant-ene, mens i foreliggende fremgangsmåte utføres reaksjonen i heterogen fase (med heterogen fase menes at det foreligger en blanding av ikke-blandbare oppløsningsmidler eller av en blanding av ikke-blandbare oppløsningsmidler og en tredje fast fase) uten bruk av kostbare løsningsmidler slik som tetrahydrofuran og dimetylformamid.

Mer presist blir fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse som starter fra kanamycin Å beskyttet i posisjonene 6'-og 3-, omfatter reaksjonen derav med et passende utvalgt reaktivt derivat av L-HABA-syre i et heterogent medium og under regulert pH.

Reaksjonsproduktet (VI) blir så behandlet for fjerning av beskyttelsesgrupper i henhold til standard metoder og det resulterende råproduktet blir renset ved kromatografi til amikacin med optimalt utbytte.

Mer spesielt, som et utgangsprodukt, kan et hvert derivat av kanamycin A brukes der aminogruppene i posisjon 6- og 3- er beskyttet ved substitusjon av et hydrogenatom med en acylgruppe, slik f.eks. en benzyloksikarbonylgruppe eller en substituert benzyloksikarbonylgruppe som p-nitrobenzyloksi-karbonyl eller p-metoksibenzyloksikarbonyl, en alkoksikarbo-nylgruppe slik som t-butoksikarbonyl eller t-amiloksikarbo-nyl, en ftaloylgruppe, en halogenalkylkarbonylgruppe slik som trifluoracetyl eller kloracetyl, eller andre passende beskyttende grupper. Men det er å foretrekke at aminogruppene i posisjonene 6' og 3 blir beskyttet med benzyloksikarbonyl eller substituert benzyloksikarbonylgrupper, siden, som det allerede er pekt på, disse gruppene raskt kan fjernes på slutten av reaksjonen ved en katalytisk reduksjon.

Utgangsproduktene av denne type kan fremstilles etter de metoder som er beskrevet i det belgiske patent nr. 855,704 eller etter metoden beskrevet i kanadisk patent nr. 1,131,628.

Et slikt beskyttet mellomprodukt blir så suspendert i vann ved en forhåndsbestemt pH som kan variere fra 3 til 10, og de beste resultatene oppnås mellom 4,5 og 6,5 og blir selektivt acylert i posisjon 1 ved å tilsette det utvalgte reaktive derivat av L-HÅBA-syre løst i et aprotisk og svakt vann-løselig oppløsningsmiddel.

Blant de organiske oppløsningsmidler som hensiktsmessig kan brukes er alifatiske hydrokarboner og halogenerte forbind-elser slik som metylenklorid, kloroform og 1,2-dikloretan.

Reaksjonen utføres ved temperaturer mellom 0°C og 60°C i noen timer under omrøring.

Når reaksjonen er fullstendig, fordampes det organiske løsningsmidlet og de beskyttende grupper i posisjonene 3 og 6' fjernes i henhold til konvensjonelle metoder.

Når f.eks. de beskyttende grupper er karbobenzyloksikarbonyl-grupper, kan de fjernes ved en standard katalytisk hydrogeno-lyse med platina, palladium, palladiumoksid eller platina-oksidkatalysator og når disse beskyttende gruppene er ftaloylgrupper, kan de sistnevnte raskt fjernes ved hydrolyse med hydrazin, eller til og med t-butoksikarbokylbeskyttende grupper kan raskt fjernes med maursyre etc.

Det således oppnådde råprodukt kan så renses ved kromatografiske teknikker som er kjent i litteraturen i forbindelse med rensing av amikacin.

Acyleringen som utføres ifølge foreliggende fremgangsmåte på 3,6'-di-N-beskyttede kanamicin A under betegnelsen med regulert pH og i heterogen fase, gir en regio-selektivitet som er uventet meget høy siden amikacin fortrinnsvis dannes i stedén for BB-K11 eller isteden for de produkter som er avledet fra den doble acyleringen ved N-l og N-3". Det er videre et meget relevant faktum at sluttproduktet ifølge foreliggende metode bare kan ha som mulige forurensninger de to produktene kalt BB-K11 og produktet som er diacylert ved N-l- og N-3"-posisjonene, og toksisiteten av disse er lavere enn til produktet som kalles BB-K29 som er mulig hoved-forurensningskilde i de andre kjente syntesemetodene.

Fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse, som er kjennetegnet ved et høyt utbytte og renhet av produktet, er spesielt sikker utfra et yrkeshygienisk synspunkt siden nærmest ufarlige reaktanter og løsningsmidler brukes og prosessen utføres raskt siden man slipper å separere ut mellomprodukter.

Med hensyn til reaksjonsproduktet (VI) som kommer fra den selektive acyleringen ifølge oppfinnelsens fremgangsmåte, så har de kjemiske og fysikalske egenskaper ikke blitt beskrevet tidligere, selv om reaksjonsproduktet er sitert i US-patent nr. 4,136.254 og ikke-separert mellomprodukt som nevnt i den allerede siterte Tsuchiya-artikkelen.

Isteden for å direkte utføre fjerning av de tre beskyttende gruppene som er tilstede på aminogruppene til mellomproduktet (VI), kan dette mellomprodukt felles ut for å øke renhets-graden og deretter kan syntesen fortsette med lavere nivåer av biprodukter.

De analytiske beregningene som ble utført på dette mellomprodukt som er sentralt i fremgangsmåten, ga følgende resultater: total nitrogen i henhold til Kjeldahl: 7,16$ (teoretisk

7,09 - molekylvekt 988,03),

potensiometrisk titer med 0,1N HCIO4: 9b% av teoretisk verdi;

fri surhetsgrad (uttrykt ved maursyre): 0, 5%

fri ammoniakk; fravær.

Videre kromatografiske bestemmelser både ved tynnsjikt (TLC) og ved vaeskekromatograf i (HPLC) har blitt utført på dette mellomprodukt (VI).

TLC-betingelsene var som følger: Merck-silisiumoksidgelplater for analytisk kromatografi, elueringsmiddel: en blanding som inneholdt 125 deler (ved volum) kloroform, 60 deler metanol, 5 deler eddiksyre og 10 deler vann.

Kromatograferingskammeret blir på forhånd mettet og etter kjøringen blir det tørket i en varm luftstrøm.

Synliggjøringsprosessen utføres med en løsning av saltsyre i etanol, ( 10% v/v), kammeret tørkes igjen i en varm luftstrøm og sprayes med ninhydrin. Til slutt oppbevares den i 5 minutter i ovn ved 105'C.

Flekkene som tilhører de potensielle biproduktene, som er tetracylater av kanamycin (med de fire aminogruppene blokkert ved den utvalgte beskyttelsesgruppen) og triacylater av kanamicin (der den tredje beskyttelsesgruppen er substituert på N-l eller N-3", ved siden av de to gruppene i N-3 og N-6') er normalt mindre enn 2% når man sammenligner med standard-prøve.

HPLC-analysen utføres under de følgende betingelsene: Kolonne: EB-8,5 pm; 250 mm x 4,6 mm (Brownlee Labs) Elueringsmiddel: A) Buffer løsning KH2P04ved 2,5 (1,36 g av KH2P04løst i 1 liter vann, og justert til ønsket pH med 556 fosforsyre, filtrert på filter ved 0,45 pm). B) Blanding av acetonitril-buf f er ved pH 2,5 (80/20 v/v), strømningshastighet 2 ml/minutt.

Gradient: Fra 15% B til 90% B i 15 minutter.

Temperatur: 30°C

Påvisning: UV/350 nanometer

Derivatiseringsløsning: 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre i vann-pyridin (50/50).

I de medfølgende figurene viser fig. 1 et HPLC-mønster, mens fig. 2 viser et IR-spektrum i KBr.

Ifølge denne synteseplanen vil det isomere produkt av amikacin, kalt BB K29, som er mer toksisk enn amikacin, ikke bli dannet.

De mulige urenheter som kan være tilstede kan bare være BB-Kll og produktet som kommer fra den doble acyleringen ved N-l og N-3".

Noen eksperimenter har derfor blitt utført for å sammenligne dødeligheten, toksisitet og akutt generell toleranse, mellom produktet som er tilgjengelig på markedet fra Bristol Myers (BB-K8), amikacin fremstilt etter fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen og de mulige urene produktene (BB Kli, BB K29 og diacylatet med L-HABA i N-l og N-3"), i mus ved intravenøs behandling (kaudal vene) på grupper av 10 dyr. LD5Q-verdiene er blitt beregnet ved Finney-Probits-metode.

Resultatene er som følger:

Dissé data viser uten tvil den foreliggende syntesemetodens overlegenhet siden sluttproduktene som dannes og med de mulige forurensninger som foreligger i meget lave verdier i sluttproduktet, er mye mindre toksiske enn BB-K29 som kan være tilstede i synteser som er ulik den ifølge foreliggende oppfinnelse.

For bedre å illustrere fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen er noen eksempler beskrevet her, og disse er ikke ment å være en begrensning.

Eksempel 1

53,4 g av mellomprodukt (IV) suspenderes i 1000 ml vann og oppløses med 38,5 ml eddiksyre; etter 30 minutters omrøring ved romtemperatur justeres pH med 30% NaOH til 6 (ca. 52 ml).

Etter videre 30 minutter ved romtemperatur, tilsettes på en gang 34,9 g av N-benzyloksi-karbonyl-L-HÅBA-N-hydroksisuccinimid løst i 1442 ml metylenklorid.

Blandingen settes så under kraftig omrøring ved romtemperatur over natten, så inndampes det organiske løsningsmidlet ved temperaturer under 40°C og pH justeres med eddiksyre opp til verdien 4,2.

Avbeskyttelsen av de tre benzyloksikarbonylbeskyttende gruppene utføres med en standard metode, ved å tilsette til løsningen 50 g av 2,5$ av Pd/C og ved å tilsette dråpevis ved romtemperatur 50 ml maursyre. Etter filtrering av karbon på dekalitt og vasking med vann, er resultatet som oppnås 1900 ml væske som har følgende innhold:

Detté tilsvarer et støkiometrisk utbytte av amikacin på b5% når man starter fra diacylat (IV).

Løsningen absorberes på et ionebytterharpiks, type Zerolit (varemerke til ROHM and HAAS), i den svake syreformen, etter justering av pH til 7,5.

Kanamycinet elueres med en lineær gradient av ammoniakk fra 0,5 N til 1,5 N, og kommer først ut av kolonnen etterfulgt av amikacin.

Fraksjonene 300-350 samles og konsentreres under vakuum for å eliminere totalt all ammoniakk og for å oppnå en sluttkonsen-trasjon av amikacin på 20%.

50% p/v H2SO4brukes for å surgjøre til pH 2,5 og en behandling med karbon utføres.

Etter 30 minutters omrøring ved romtemperatur filtreres karbonet fra, resten vaskes og amikacindisulfat utfelles med metanol.

Etter 2 timers omrøring ved romtemperatur, blir det hvite faste stoffet filtrert og vasket og tørket under vakuum ved 45'C i 16 timer og har en vekt på 33,3 g.

Titeren av amikacinbase er b8% som ble bestemt ved HPLC (med en mikrobiologisk titer av 690/pm/mg), de andre spesifika-sjonene er i samsvar med de til amikacinsulfat.

Eksempel 2

50 g av 3,6'-di-N-benzyloksikarbonylkanamycin A (IV) fra en 89,5$ HPLC-prøve (59,3 mmol), et innhold av vann på 3, 3% og et innhold av hovedforurensning 1,3,6'-tri-N-benzyloksi-karbonilkanamycin A, suspenderes i 1500 ml deionisert vann. Etter 30 minutters omrøring tilsettes iseddik i en mengde som er nødvendig for å bringe pH-verdien til 6 ± 0,2.

Ved dette punktet har man nesten oppnådd en fullstendig løsning. Den aktive esteren til N-hydroksisuccinimid av L-( — )-gamma-benzyloksikarbonyl-amino-alfa-hydroksi smørsyre tilsettes ved romtemperatur som en løsning av metylenklorid (25 g som tilsvarer 80,6 mmol) i 1000 ml av løsningsmidlet.

Blandingen omrøres kraftig i ca. 2 timer og omrøringen opprettholdes over natten.

Etter separasjon av den organiske fasen, bringes løsningen til pH 10 med en 3N NB^-løsning.

Det således dannede hvite bunnfall filtreres på en Buckner under vakuum og vaskes med vann.

Det svakt krystallinske faste stoffet tørkes under vakuum ved 30°C i ca. 30 timer.

Det oppnås 30,9 g av 3,6'-di-N-benzyloksikarbonyl-l-N-L-( - ) - gamma-benzyl ok s ikarbonyl amino-al f a-hydroksibutiryl-kanamycin A (VI) som har en titer av 70% (HPLC).

Hovedurenhetene er:

Startdiacylat (IV) <1%

Triacylat (N-l, N-3 og N-6' med benzyloksikarbonylgrupper): 2%

Tørketap: 4,5$ (3 timer, 105"C)

Svovelsyrerester: 0,15$

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for syntese av amikacin med følgende formel:

der et dobbelt beskyttet derivat av kanamycin A med følgende formel:

der R = benzylokarbonyl, substituert benzyloksykarbonyl, alkoksykarbonyl, ftaloyl, haloalkylkarbonylgrupper, R' = H, R" = H acyleres, idet acyleringen blir gjennomført med et derivat av L-(-)-4-amino-2-hydroksismørsyre (L-HABA), som er et N—benzyloksy-L-(-)-4-amno-2-hydroksysuksinimid, de beskyt- tendé N-benzyloksykarbonylgruppene fjernes deretter fra reaksjonsproduktene ved hjelp av i og for seg kjente fremgangsmåter,karakterisert vedat acyleringen gjennomføres ved å anvende som reaksjonsopp-løsningsmiddel vann og et aprotisk oppløsningsmiddel valgt blant alifatiske hydrokarboner og halogenerte alifatiske hydrokarboner, og ved regulering av pH til en verdi mellom 4,5 og 6,5, idet reaksjonstemperaturen er mellom 0 og 60°C.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte aprotiske oppløsningsmiddel blir valgt blant metylenklorid, kloroform og 1,2-dikloretan.