CS277017B6

CS277017B6 - Process of amikacin

Info

Publication number: CS277017B6
Application number: CS887779A
Authority: CS
Inventors: Alberto Mangia
Original assignee: Pierrel Spa
Priority date: 1987-11-27
Filing date: 1988-11-25
Publication date: 1992-11-18
Also published as: EP0317970B1; DE3854225D1; DK661588A; NO885270L; NZ227113A; FI885489L; AU2596388A; PL161416B1; JPH01186900A; JPH0637512B2; IT8722783A0; CS777988A3; US5763587A; HU201771B; NO171505B; RO102339B1; DK661588D0; NO171505C; ATE125544T1; NO885270D0

Description

Vynález se týká způsobu syntézy amikacinu.

Amikacin, (0-3-amino-3-desoxy-alfa-D-glukopyranosyl-(l—» 6)

-0-[6-amino-6~desoxy-alfa-D-glukopyranosyl-( 1—» 4 ) ]-N¹-(amino-2“ -hydroxy-l-oxybutyl)“2-desoxy-D-streptamin) vzorce I

NH

OH

NH, (I) je polosyntetické antibiotikum v širokém rozsahu používané k terapii. Formálně ho lze odvodit acylací kanamycinu A vzorce II

CH NH₂

HO (II)

Úkolem tohoto vynálezu je vyřešit selektivní acylaci aminoskupiny v poloze 1 2-deoxystreptaminového jádra vhodného derivátu kanamycinu co nej jednodušším způsobem, který by se vyhnul použití toxických, nákladných a obtížně likvidovatelných rozpouštědel a reakčnich činidel.

Acylačním činidlem je derivát L-(-)-4-amino-2-hydroxymáselné kyseliny vzorce III (dále označované L-HABA), který je vhodně aktivován a chráněn metodami známými z literatury:

(III)

Způsob podle vynálezu konkrétně vychází z derivátu (IV) chráněného v polohách N-6', a N-3 benzyloxykarbonylskupinou

NKR (IV) (V) (VI) kde jednotlivé symboly v obecných vzorcích IV až VI mají tento význam:

(IV) : R = Ph-CH₂-OCO, R' = H a R = H, (V) : R » Ph-CH₂-OCO, R' = CF₃CO a R » H, (VI) : R = Ph-CH₂-OCO, R' = H a R = CO-CH(OH)-CH₂-CH₂NH-CO-OCH₂ Ph, přičemž ph = fenyl.

Meziprodukt (IV) je popsán v práci T.L. Nagabhushan a další, J. Amer. Chem. Soc., 100, 5254 (1978) a v příbuzném patentu US č. 4 136 254 a v publikaci T. Tsuchiya a další, Tet. Lett., 4951, (1979) a v belgickém patentu č. 879 925.

Při postupu podle posledně uvedeného patentu se dvakrát chráněný meziprodukt (IV) převádí na odpovídající 3-trifluoracetamidoslouceninu (V) reakcí s ethyItrifluoracetátem a vzniklý produkt se acyluje v poloze 1 reakcí s vhodně voleným derivátem L-HABA.

Dvě různé ochranné skupiny, tj. trifluoracetyl a benzyloxykarbonyl, se v uvedeném pořadí odštěpí působením amoniaku a vodíku, za vzniku výsledného produktu amikacinu.

Uvádí se, že výtěžky jsou uspokojivé, ale postup není vhodný pro průmyslové provedení, protože je třeba používat ethyltrifluoracetátu, což je toxická a nákladná reakčni složka a dimethylsulfoxidu, což je nákladné a díky vysoké teplotě varu, těžko regenerovatelné rozpouštědlo.

Celkové náklady se také zvyšují o případné náklady na likvidaci odpadů.

Hlavním úkolem předloženého vynálezu je vyvinout takový postup, který by odstraňoval problémy a obtíže v krátkosti uvedené shora.

Předmětem vynálezu je způsob syntézy amikacinu vzorce I, při němž se dvojnásobně chráněný derivát kanamycinu A obecného vzorce

karbonyl-, alkoxykarbonyl-, ftaloyl- a halogenalkylkarbonylCS 277017 B6 skupinu kde R' a R znamená vodík acyluje derivátem L-(-)-4-amino-2-hydroxymáselné kyseliny a z reakčního produktu se o sobě známými postupy odštěpí výchozí ochranné skupiny, vyznačující se tím, že se acylace provádí v reakčnim prostředí tvořeném směsí vody a aprotického rozpouštědla, v němž je rozpustnost vody nižší než 0,1% hmot., přičemž hodnota pH se reguluje v intervalu od 3 do 10 a reakční teplota leží v intervalu od 0 do 60 °C.

Způsob podle tohoto vynálezu se tedy vyznačuje tím, že se acylace dvojnásobně chráněného meziproduktu (IV) provádí za použití vody, jako výlučného rozpouštědla. Výhody, které z toho vyplývají při průmyslové aplikaci, jak z hlediska nákladnosti, tak z ekologického hlediska, jsou zcela zřejmé.

Druhý hlavní znak spočívá v tom, že se meziprodukt (IV) přímo acyluje na triacylovaný meziprodukt (VI) tím, že se reguluje pH reakční směsi, které je hlavním faktorem zodpovědným za selektivitu acylace mezi aminoskupinami v polohách 1 a 3.

Dosažení selektivity acylace je původním a novým výsledkem, který nebylo možno předvídat na základě údajů uvedených v literatuře. V práci J.J. Wright a další, J. Antibiotics, 29, 714 (1976) se uvádí možnost, že selektivita reakčního prostředí závisí na hodnotě pH a že se dramaticky mění, při volbě reakčních podmínek, při kterých jsou aminoskupiny antibiotické sloučeniny plně protonovány. Podle informací, které autoři uvádějí se N-acylované deriváty několika aminoglukosidů (sisomicynu, verdamycinu a gentamycinu C-^a) mohou získat ve výtěžcích, které jsou vždy nižší než 30 %. Ve stejné práci se dále jasně uvádí, že při acylaci vysoce hydroxylovaných antibiotik, jako je gentamycin B a kanamycin, byla pozorována nízká selektivita.

S ohledem na toto explicitně vyjádřené tvrzení je tedy nutno skutečnost, že při způsobu podle vynálezu je acylace v poloze N-1 diacylovaného derivátu kanamycinu vysoce selektivní, jakožto funkce pH reakční směsi, považovat za zcela novou a nepředvídatelnou.

V US patentu č. 4 136 254 uděleném několika ze shora uvedených autorů je v příkladu 23 uvedena přímá acylace stejného meziproduktu (IV) v homogenním roztoku 50 % obj.)tetrahydrofuranu a vody s reaktivním esterem s N-hydroxysukcinimidem N-benzyloxykarbonyl L-HABA kyseliny, rozpuštěným v dimethylformamidu. Pracovní podmínky použité při tomto postupu jsou však jiné než při způsobu podle vynálezu, protože reakce podle US patentu je prováděna v homogenní fázi za úplné solubilizace reakčních složek, zatímco při způsobu podle vynálezu se reakce provádí v heterogenní fázi. Pod pojmem heterogenní fáze se rozumí, že je přítomna směs nemísitelných rozpouštědel nebo směs neutišitelných rozpouštědel a třetí pevné fáze. Při způsobu podle vynálezu není tedy nutno používat nákladných rozpouštědel, jako je tetrahydrofuran a dimethylformamid. Způsob podle vynálezu konkrétně vychází z kanamycinu A chráněného v polohách 6'- a 3- a zahrnuje reakci této látky s vhodně zvoleným reaktivním derivátem L-HABA kyseliny v heterogenním prostředí a za podmínek regulovaného pH.

Reakční produkt (VI) se potom zbaví ochranných skupin pomocí standardních postupů a výsledný surový produkt se přečistí chromatografii. Tak se získá amikacin v optimálním výtěžku.

Jako výchozího produktu se konkrétně může použít jakéhokoliv derivátu kanamycinu k, v němž jsou aminoskupiny v polohách 6a 3- chráněny substitucí vodíkového atomu acylovou skupinou, jako například benzyloxykarbonylskupinou nebo substituovanou benzyloxykarbonylskupinou, jako je p-nitrobenzyloxykarbonyl nebo p-methoxybenzyloxykarbonylskupina, alkoxykarbonylskupinou, jako je terč.butoxykarbonyl- nebo terč.amyloxykarbonylskupína, ftaloylskupina, halogenalkylkarbonylskupinou, jako je trifluoracetyl- nebo chloracetylskupina nebo jinými vhodnými ochrannými skupinami. Přednostně by měly být aminoskupiny v polohách 6' a 3 chráněny benzyloxykarbonylskupinou nebo substituovanými benzyloxykarbonylskupinami, protože , jak již bylo uvedeno, tyto skupiny je možno na konci reakce snadno odštěpit katalytickou redukcí .

Výchozí látky tohoto typu je možno připravit způsobem popsaným v belgickém patentu č. 855 704 nebo způsobem popsaným v kanadském patentu č. 1 131 628.

Chráněný meziprodukt se potom suspenduje ve vodě při předem určené hodnotě pH, která může ležet v rozmezí od 3 do 10, přičemž nej lepších výsledků se dosahuje při pH od 4,5 do 6,5 a selektivně se acyluje v poloze 1 přidáním zvoleného reaktivního derivátu L-HABA kyseliny, rozpuštěného v aprotickém rozpouštědle, které je špatně rozpustné ve vodě. Jako příklady organických rozpouštědel, kterých lze použít při tomto postupu, je možno uvést alifatické uhlovodíky a halogenované sloučeniny, jako je methylenchlorid, chloroform, 1,2-dichlorethan, atd.

Reakce se provádí při teplotě v rozmezí od 0 do 60 °c za míchání po dobu několika hodin. Po dokončení reakce se organické rozpouštědlo odpaří a ochranné skupiny v polohách 3a 6' se odštěpí známými postupy.

Tak například, když získaný produkt, ve shodě s přednostní alternativou vynálezu, obsahuje jako ochranné skupiny popřípadě substituované benzyloxykarbonylskupiny, provádí se odštěpování ochranných skupin standardním postupem katalytické hydrogenolýzy za použití katalyzátoru obsahujícího platinu, palladium, oxid palladia nebo oxid platiny. Ftaloylskupiny, jakožto ochranné skupiny, se snadno odštěpují hydrolýzou hydrazinem. Terč.-butoxykarbonylskupiny, jakožto ochranné skupiny, se snadno odstraňují pomocí kyseliny mravenčí, atd.

T?kto získaný surový produkt se potom přečistí chromatografickými postupy, které jsou pro čištění amikacinu známy z literatury.

Acylace výchozího 3,6'-di-N-chráněného kanamycinu A podle předloženého vynálezu za podmínek regulovaného pH a v heterogenní fázi probíhá s neočekávaně vysokou selektivitou, pokud se týká místa, protože se přednostně tvoří amikacin místo BB-K11 nebo produktů vzniklých dvojnásobnou acylací v polohách N-l a N-3. velmi výhodnou skutečností kromě toho je, že při způsobu podle vynálezu mohou být v konečném produktu přítomny jako potenciální nečistoty pouze produkt označovaný jako BB-K11 a produkt diacylovaný v polohách N-l a N-3”, jejichž toxicita je nižší než toxicita produktu označovaného jako BB-K29, který je hlavní potenciální nečistotou, která vzniká při jiných známých syntetických postupech .

Způsob podle vynálezu, kterým se získává produkt ve vysokém výtěžku a s vysokou čistotou, je obzvláště bezpečný z hlediska průmyslové hygieny, protože se používá téměř neškodných reakčních složek a rozpouštědel. Způsob se snadno provádí, protože není nutno oddělovat žádný intermediární produkt.

Chemické a fyzikální vlastnosti reakčního produktu (VI) získaného selektivní acylací způsobem podle vynálezu nebyly dosud nikdy popsány, ačkoliv se jedná o reakčni produkt citovaný v US patentu č. 4 136 254 a o neseparovaný meziprodukt uvedený v již citované práci (Tsuchiya).

Místo toho, aby se přímo odštěpovaly tři ochranné skupiny přítomné na aminoskupinách intermediárního produktu (VI), může se tento produkt vysrážet, aby se zlepšila jeho čistota a potom se může v syntéze pokračovat s nižšími množstvími vedlejších produktů.

Analytická stanovení prováděná na tomto meziproduktu, který má při způsobu podle vynálezu klíčový význam, poskytuje následující výsledky:

- celkový obsah dusíku podle Kjeldahla: 7,16 % ^-(teoretický obsah 7,09, molekulová hmotnost 988,03);

- potenciometrický titr s 0,1 N HC10₄ : 96 % teorie;

- volná kyselost (vyjádřená jako kyselina mravenčí):

0,5 %;

- volný amoniak : nepřítomen.

Intermediární produkt (VI) byl dále podroben chromatograf ické analýze, jednak chromatografii na tenké vrstvě (TLC) a jednak kapalinové chromatografii (HPLC).

Chromatografie na tenké vrstvě byla prováděna za těchto podmínek: silikagelové desky pro analytickou chromatografii (Merck), eluční činidlo: směs obsahující objemově 125 dílů chloroformu, 60 dílů methanolu, 5 dílů kyseliny octové a 10 dílů vody. Chromatograf ická komora byla předem nasycena a po stanovení byla vysušena proudem horkého vzduchu. Detekce byla prováděna vizuálně za použití roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethanolu (o koncentraci 10 % objemových). Komora byla znovu vysušena proudem horkého vzduchu a potom byla postříkána ninhydrinem. Potom byla udržována po dobu 5 minut v sušárně o teplotě 105 °C.

I

Skvrny, vztahující se k potenciálním vedlejším produktům, kterými jsou tetraacyláty kanamycinu (se čtyřmi aminoskupinami blokovanými zvolenou ochrannou skupinou) a triacyláty kanamycinu (v nichž je třetí ochranná skupina substituována v poloze N-l nebo N-3, kromě dvou skupin v polohách N-3 a N-6’) odpovídají méně než 2 % celkového produktu, na základě srovnání se standardním vzorkem.

Analýza kapalinovou chromatografii HPLC se provádí za těchto podmínek: sloupec: RB-8,5 μπι; 250 mm x 4,6 mm (Brownee Labs) eluční činidlo: A) tlumivý roztok KH₂PO₄ o pH 2,5, připravený rozpuštěním 1,36 g KH₂PO₄ v 1 litru vody a nastavením pH na požadovanou hodnotu pomocí 5% kyseliny fosforečné a přefiltrováním přes filtr 0,45 μιη; B) směs acetonitrilu a tlumiče o pH 2,5 v objemovém poměru 80 : 20 ;

průtok: 2 ml . min“¹;

gradient : od 15 % B do 90 % B během 15 minut;

teplota: 30 °C, detekce: UV/350 nm, derivatizační roztok: roztok 2,4,6-trinitrobenzensulfonové kyseliny ve směsi voda/pyridin (50/50).

Na obr. 1 je znázorněn chromatogram HPLC, zatímco na obr. 2 je uvedeno infračervené spektrum v KBr.

Při provádění syntézy podle tohoto postupu kromě toho nemůže vznikat isomemí produkt amikacinu označovaný jako ΒΒ K29, který je toxičtější než amikacin. Jako potenciálně přítomné nečistoty přicházejí v úvahu je produkt BB-K11 a produkt vzniklý dvojnásobnou acylaci v polohách N-l a N-3.

- Bylo provedeno několik pokusů za účelem porovnání mortality, toxicity a akutní všeobecné tolerovatelnosti produktu dostupného na trhu od firmy Bristol Myers (BB-K8), amikacinu vyrobeného syntetickým postupem podle předloženého vynálezu a potenciálních nečistot (BB-K11, BB-K29 a diacylátu L-HABA v poloze N-l a N-3) na myších při intravenosním podání (caudální céva) za použití skupin po 10 zvířatech. Hodnoty LD₅₀ byly vypočítány metodou FinneyProbits.

Dosáhlo se těchto výsledků:

LD₅₀ (mg/kg) 5 % interval spolehlivosti

BB-K8 Bristol	202,3	(170	až	228)
Amikacin	241	(241	až	271)
BB-K29	126	(119	až	134)
BB-K11	356	(264	až	480)

diacylát (N-l a N-3)

268 (247 až 290)

Shora uvedená data jasně ukazují nadřazenost syntetického postupu podle vynálezu, protože se při něm získají konečné produkty, v nichž jsou možné nečistoty nejen přítomny ve velmi nízkých množstvích, ale navíc jejich toxicita je podstatně nižší než toxicita BB-K29, který může být přítomen v produktech získaných jinými syntetickými postupy než způsobem podle vynálezu.

Vynález je lépe objasněn v následujících příkladech provedení. Příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném směru neomezují.

Příklad 1

53,4 g meziproduktu (IV) se suspenduje v 1 000 ml vody a rozpustí přídavkem 38,5 ml kyseliny octové. Po 30 minutovém míchání při teplotě místnosti se pH nastaví 30 % hydroxidem sodným na 6 (asi 52 ml). Po dalších 30 minutách při teplotě místnosti se v jedné dávce přidá 34,9 g N-benzyloxykarbonyl-L-HABA-N-hydroxysukcinimidu rozpuštěného ve 1 442 ml methylenchloridu. Směs se přes noc udržuje za intenzivního míchání při teplotě místnosti a potom se organické rozpouštědlo odpaří při teplotě nižší než 40 °C a hodnota pH se nastaví kyselinou octovou na 4,2.

Odštěpování tří benzyloxykarbonylových ochranných skupin se provádí standardním způsobem tak že se k roztoku přidá 50 g 2,5 % palladiovaného uhlí, potom se při teplotě místnosti přikape 50 ml kyseliny mravenčí. Po odfiltrování uhlí na dekalitu a promytí vodou se získá 1 900 ml vodného roztoku obsahujícího následující koncentrace látek:

araikacin 11,52 g/1 kanamycin A 2 g/1

BBK 11 0,25 g/1 di (HABA) KANA 1,3 g/1 což odpovídá stechiometrickému výtěžku amikacinu 65 %, vztaženo na výchozí diacylát (IV).

Roztok se po nastavení pH na 7,5 absorbuje na ionexové pryskyřici typu Zerolit (chráněná známka firmy ROHM and HAAS), ve slabě kyselé formě. Kanamycin se eluuje lineárním gradientem amoniaku od 0,5 N do 1,5 N a vychází z kolony jako první a je následován amikacinem. Zachycují se frakce 300 až 350 ml, které se za vakua koncentrují za účelem úplného odstranění amoniaku a dosažení výsledné koncentrace amikacinu 20 %. Roztok se okyselí 50% kyselinou sírovou na pH 2,5 a přečistí aktivním uhlím. Po 30 minutovém míchání při teplotě místnosti se aktivní uhlí odfiltruje, zbytek se promyje a methanolem se vysráží disulfát amikacinu. Po dvouhodinovém míchání při teplotě místnosti se získaná bílá pevná látka odfiltruje, promyje a za vakua vysuší při 45 °C (16 hodin).

Výtěžek je 33,3 g.

Titr amikacinové báze je 68 % podle stanovení kapalinovou chromatografii HPLC. Mikrobiologický titr je 690 μg/mg. Ostatní vlastnosti odpovídají vlastnostem sulfátu amikacinu.

Příklad 2 g 3,6'-di-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A (IV) jehož čistota podle HPLC je 89,5 % (59,3 mmol) a obsah vody je 3,3 % a který jako hlavní nečistotu obsahuje 1,3,6'-tri-N-benzyloxykarbonylkanamycin A, se suspenduje v 1 500 ml deionizované vody. Po 30 minutovém míchání se přidá ledová kyselina octová v množství potřebném pro úpravu pH na 6 + 0,2. V tomto okamžiku se prakticky získá roztok. Při teplotě místnosti se přidá reaktivní ester N-hydroxysukcinimidu L-(-)-gamma-benzyloxykarbonyl amino-alfa-hydroxymáselné kyseliny ve formě roztoku v methylenchloridu (25 g látky, což odpovídá 80,6 mmol) v 1 000 ml rozpouštědla. Směs se po dobu asi 2 hodin intenzivně míchá a potom se ještě za míchání udržuje přes noc. Organická fáze se oddělí a její pH se přídavkem 3N roztoku amoniaku upraví na 10. Vzniklá bílá sraženina se za vakua odfiltruje na Buchnerově nálevce a promyje vodou. Slabě krystalická pevná látka se po dobu asi 30 hodin vakuově suší při 30 °C.

Získá se 30,9 g 3,6'-di-N-benzyloxykarbonyl-l-N-L-(-)-gamma-benzyloxykarbonylamino-alfa-hydroxybutyryl-kanamycinu A (VI), jehož titr je 70 % (HPLC).

Produkt obsahuje tyto hlavní nečistoty:

výchozí diacylát (IV) < 1 % triacylát (N-l, N-3 a N-6' benzyloxykarbonyl substituovaný): 2 % ztráta sušením: 4,5 % (3 hodiny, 105 °C) sírovaný popel: 0,15 %.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob syntézy amikacinu vzorce I

NH.

při němž se dvojnásobně chráněný derivát kanamycinu A obecného vzorce

NHR’ který je v polohách 6' a 3 chráněn acyloVou skupinou, jako například skupinou zvolenou ze souboru zahrnujícího benzyloxykarbonyl-, p-nitrobenzyloxykarbonyl-, p-methoxybenzyloxykarbonyl-, alkoxykarbonyl-, ftaloyl a halogenalkylkarbonyl11 skupinu, a kde R'a R znamenají vodík acyluje derivátem L-(-)~ -4-amino-2-hydroxymáselné kyseliny a z reakčního produktu se odštěpí výchozí ochranné skupiny, vyznačující se tím, že se acylace provádí v reakčnim prostředí tvořeném směsí vody a aprotického rozpouštědla, v němž je rozpustnost vody nižší než 0,1 % hmot., přičemž hodnota pH se reguluje v intervalu od 3 do 10 a reakční teplota leží v intervalu od 0 do 60 °C.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že hodnota pH při reakci leží v intervalu od 4,5 do 6,5.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že aprotické rozpouštědlo je zvoleno ze skupiny alifatických uhlovodíků a halogenovaných alifatických uhlovodíků.
4. Způsob podle bódu 3, vyznačující se tím, že aprotické rozpouštědlo je zvoleno ze skupiny zahrnující methylenchlorid, chloroform a 1,2-dichlorethan.

2 výkresy