NO171443B - Fremgangsmaate for fremstilling av farmasoeytiske preparater inneholdende syntetiske lipider - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater inneholdende syntetiske,

i det vesentlige rene, fosfolipider og et farmasøytisk virksomt stoff.

De farmasøytiske preparatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen anvendes i form av liposomer i vandige disper-

sjoner.

Liposomer er beskrevet i litteraturen i tallrike publika-

sjoner. Deres oppbygning og anvendelse har vært gjenstand for mange undersøkelser. Man skiller mellom unilamellære liposomer med et dobbeltsjikt av lipider og multilamellære liposomer med flere dobbeltsjikt av lipider, anordnet på tilsvarende måte som skallene i en løk.

For farmasøytisk anvendelse egner seg spesielt liposomer med

en populasjon av mest mulig homogen størrelse"og et tverr-

snitt på 2,0 x IO"<8> til 5,0 x IO"<6> m, fortrinnsvis 2,0 x IO-<8> til 3,0 x IO-<6> m. Den kuleformige omhyllingen består av

et eller flere dobbeltsjikt av lipidkomponentene, f.eks. amfipatiske lipider, som fosfolipider, f.eks. lecitin,

kefalin eller fosfatidsyre og eventuelt nøytrale lipider,

f.eks. kolesterin. Disse dobbeltsjiktene omfatter et indre rom som inneholder den vandige fasen med en forbindelse som skal innesluttes, hvor forbindelsen som skal innesluttes avhengig av strukturen og andre parametre som temperatur eller konsentrasjon, kan være tilstede i den vandige fasen og/eller i dobbeltsjiktet.

Det er knyttet stor interesse til den terapeutiske an-

vendelsen av liposomer som bærere for virksomme stoff av forskjellige typer. Liposomer er f.eks. foreslått som bærere for proteiner, f.eks. antistoffer eller enzymer, hormoner, vitaminer eller gener, eller til analytiske formål som bærere for merkede forbindelser.

Farmasøytiske tilførselssystemer på liposombasis er beskrevet i oversiktsverket av Gregoriadis G. (utgiver) "Liposome Technology", bind II, "Incorporation of Drugs, Proteins

and Genetic Material", CRC Press 1984. I et oversiktsverk av Knight, C.G. (utgiver), "Liposomes: From Physical Struc-ture to Therapeutic Applications", Elsevier 1981, er i kapitel 16 på s. 166 fordelene ved en farmasøytisk admini-streringsform på liposombasis sammenfattet.

1. Liposomer trenger gjennom biologiske membraner og letter transporten av virksomme stoff over barrierer som normalt ikke lar seg overvinne. Spesielt letter liposomene den intracellulære gjennomtrengningen med en innkapslet forbindelse. 2. Liposomer kan anvendes med tanke på målrettet vekselvirk-ning med visse cellevevarter, forhøyet selektivitet og redusert toksisitet. 3. Farmakokinetikken for det virksomme stoffet kan påvirkes i gunstig retning ved hjelp av liposomer, f.eks. ved endring av frigivelsen, fordeling og fjernelse fra den systemisk sirkulasjonen. 4. Når det gjelder endringer ved kjemiske påvirkninger eller metabolisme kan følsomme virksomme stoff ved hjelp av liposomer beskyttes mot deaktivering. 5. Ved stimulering av immunreaksjoner på liposom-innkapslede antigener kan immunmodulatoriske virkninger oppnås.

Herved oppnås også videre fordeler som redusert mengde virksomt stoff som er påkrevet ved liposom-anvendelse sammen-liknet med fritt virksomt stoff for å oppnå en terapeutisk virkning, eller forlengede intervalltider for administreringen av det virksomme stoffet.

Spesielle fordeler har tilførselssystemer på liposombasis

ved innslusing av stoffer i endocyterende celler, spesielt i retikuloendotelsystemet. Eksempelvis observerer man en lettet transport av antibiotika i endocyterende celler og en forbedret bekjempelse av sykdomsfremkallerne'i. disse cellene. Endocyterende celler er også involvert ved beten-nelsestilstander. Man observerer en raskere innslusing av liposom-kapslede antireumatiske virksomme stoffer i slike.celler enn i det omliggende vevet. Cytostatika som er innkapslet i form av liposomer kan innsluses i det spesi-fikke organet i retikuloendotelsystemet (lever, milt, ben-marg), eller kan anrikes i lungen som følge av innfiltrasjoner i lungekapillærene og etterfølgende transport ved utvandrende blodmonocytiske virksomme stoffer i alveolære makrofager,

og derved oppnås en forbedring av virkningen på lunge-

eller levertumorer ved samtidig reduksjon av toksisiteten.

Liposomer med innkapslede immunmodulatorer kan bevirke

en målrettet endring av reaksjonen i immunsystemet (immun-stimulering, immunundertrykking). Poste G. et al. beskriver i Cancer Research 39, 881 (1979) observasjon av en aktivering av tumoricide egenskaper for mus-makrofager ved liposom-innkapslet lymfokin. Sone S. og I.J. Fidler, Cell. Immunol. 57, 42 (1981) beskriver en in-vitro-aktivering av tumoricide egenskaper i alveolære makrofager fra rotter ved syntetiske muramyldipeptider innkapslet i liposomer.

Liposomer med immunmodulatorer, f.eks. muramyldi- eller muramyltripeptider, humant Y-interferon eller makrofag-aktiverende faktor (MAF), egner seg til aktivering av de cellulære immunsystemer, f.eks. cellene i det monocytære systemet, f.eks. blodmonocytter eller de alveolære eller peritoneale makrofagene, til vern mot infeksjoner, spesielt virusinfeksjoner, og til bekjempelse av kreftceller i primært kreftvev i blod og lymfe, samt metastaser.

De hittil anvendte, naturlige materialer til fremstilling

av liposomer, f.eks. naturlige fosfolipider, som egg-fosfatidsyre, egg- eller soyalecitin eller egg- eller soyakefalin samt fosfatidylserin fra oksehjerne er, selv når dette materialet foreligger i renset form og er tynnsjikt- eller papirkromatografisk enhetlig, en blanding av fosfoglyserider med acylrester av forskjellig struktur. Tørrpreparater med naturlige fosfolipider er ikke termisk stabile og har kort holdbarhet, og naturlige fosfolipider i vandig fase er også ustabile, slik at holdbarheten av vandige liposom-blandinger også er begrenset.

På grunn av den varierende sammensetningen av liposom-blandingene fra naturlige fosfolipider, lavt utbytte, forskjellig størrelsesfordeling og den dårlige stabiliteten mangler både in-vitro- og in-vivo-forsøksresultatene, samt de klini-ske resultatene, den påkrevde reproduserbarheten, dette har lenge virket hemmende på den industrielle utnyttelsen av disse administrasjonsformene som lenge har vært kjente og er grundig utforskede.

Til grunn for foreliggende oppfinnelse ligger den oppgave

å fremstille farmasøytiske preparater som i vandig fase danner liposomdispersjoner med enhetlig størrelsesfordeling og høy stabilitet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske-preparater som inneholder

a) et syntetisk, umettet mer enn 90 vekt-% rent fosfolipid med formelen

der R]_ og R2 uavhengig av hverandre er C1o-C2o~a-lkenoyl

med likt antall C-atomer, n er et helt tall fra 1 til 3 og Y+ er kationet til farmasøytisk akseptabel base,

b) et syntetisk, umettet mer enn 90 vekt-% rent fosfolipid med formelen

der betyr C10-C2o-alkanC)y1 med likt antall C-atomer, R2 er <C>10-C2o-alkenoyl med likt antall C-atomer, Ra, Rj-, og Rc er hydrogen eller C1-C4-alkyl og n er et helt tall fra to til fire, c) et stoff eller en stoffblanding med biologisk virkning og eventuelt en bærervæske og/eller ytterligere faste bærermaterialer.

De generelle begrepene som er benyttet i beskrivelsen ovenfor og i den etterfølgende beskrivelsen har innenfor rammen av beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis følgende betydninger: Uttrykket "lavere" som anvendes i sammenheng med organiske rester, f.eks. laverealkyl, laverealkylen, laverealkoksy, laverealkanoyl osv., betyr at slike organiske rester, med mindre annet uttrykkelig er angitt, inneholder til og med 7 og fortrinnsvis til og med 4 karbonatomer. Nomenklaturen for fosfolipidene av formel I og II følger anbefalingene som er angitt i Eur. J. of Biochem. 79, 11-21 (1977) "Nomenclature of Lipids" fra IUPAC-IUB kommisjonen, for biokjemisk nomenklatur (CBN) (sn-nomenklatur, stereo-spesifikk nummerering).

For de farmasøytisk virksomme stoffene anvendes, når ikke annet er angitt, de frinavnene som er foreslått av verdens helseorganisasjon (WHO) (Recommended International Non-proprietary Names), som er tatt fra standardverket "Pharma-i zeutische Chemie" (E. Schroder, C. Rufer og R. Schmiechen, Thieme Verlag Stuttgart, 1982), samt Merck-indeksen (10. utgave).

Renheten av de anvendte syntetiske fosfolipidene utgjør

mer enn 90 vekt-%, fortrinnsvis mer enn 95 vekt-%.

I et syntetisk fosfolipid av formel I er R og R2 med betydningen "C10-C20-alkenoyl med like antall C-atomer" fortrinnsvis 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetradecenoyl, 9-cis-heksadec.enoyl, 6-cis-oktadecenoyl, 6-trans-oktadeeenoyl, 9-cis-oktadee;enoyl, 9-trans-oktade.cenoyl, 11-cis-oktade.cenoyl eller 9-cis-ikosenoyl.

ffi

Kationet Y av en farmasøytisk akseptabel base er f.eks.

et alkalimetall-, f.eks. litium-, natrium- eller kalium-

ion, ammoniumionet, et mono-, di- eller tri-C-^-C^alkyl-ammoniumion, f.eks. trimetyl-, etyl-, dietyl- eller trietyl-ammoniumion, et 2-hydroksyetyl-tri-C^-C4-alkylammoniumion, f.eks. kolinkationet, eller 2-hydroksyetylammoniumionet,

samt kationet fra en basisk aminosyre, f.eks. lysin eller arginin.

Y er fortrinnsvis natriumionet.

I et syntetisk fosfolipid av formel I er fortrinnsvis R^

og R2 like og står for 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetrade.cenoyl, 9-cis-heksadecenoyl, 9-cis-oktadeCenoyl eller 9-cis-ikosenoyl,

ffi

n er 1 og Y er natriumionet.

Et syntetisk fosfolipid av formel I er først og fremst natrium-1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidyl-(S)-serin.

I et syntetisk fosfolipid av formel II er R^ med betydningen "C10-C2Q-alkanoyl med like antall C-atomer" fortrinnsvis n-dodekanoyl, n-tetradekanoyl, n-heksadekanoyl, n-oktadekanoyl eller n-ikosanoyl.

I et syntetisk fosfolipid av formel II har R2 de under

formel I angitte betydninger.

I et syntetisk fosfolipid av formel II er gruppen av formel

-(CnH2n)- uforgrenet eller forgrenet alkylen, f.eks. 1,1-etylen, 1,1-, 1,2- eller l,3^propylen eller 1,2-, 1,S<m>-

eller 1,4-butylen, eller fortrinnsvis 1,2-etylen (n=2).

I et syntetisk fosfolipid av formel II betyr fortrinnsvis R-^ n-dodekanoyl, n-tetradekanoyl, n-heksadekanoyl eller n-oktadekanoyl, R2 9-cis-dode.cenoyl, 9-cis-tetradeeenoyl, 9-cis-heksadecenoyl, 9-cis-oktade'cenoyl eller 9-cis-ikosenoyl og Ra, R^ og Rc metyl og n er 2.

Et syntetisk fosfolipid av formel II er først og fremst lr-n-heksadekanoyl-2- ( 9-cis-oktadecenoyl) -3-sn-f osf atidiyl-kolin.

For acylrestene R^ og R2 i fosfolipidene av formel I og

II er de i parenteser angitte betegnelsene vanlige: 9-cis-dodecenoyl (lauroleoyl) , 9-cis-tetradec.enoyl (myri-stoleoyl), 9-cis-heksade.cenoyl (palmitoleoyl) , 6-cis-oktadecenoyl (petroseloyl), 6-trans-oktade: enoyl (petroselaidoyl), 9-cis-oktadecenoyl (oleoyl), 9-trans-oktadeeenoyl (elaidoyl), 11-cis-oktade.cenoyl (vakkenoyl), 9-cis-ikosenoyl (gadoleoyl), n-dodekanoyl (lauroyl), n-tetradekanoyl (myristoyl), n-heksadekanoyl (palmitoyl), n-oktadekanoyl (stearoyl), n-ikosanoyl (arachidoyl).

Stoffer eller stoffblandinger med biologisk virkning er først og fremst farmasøytisk virksomme stoffer og stoffblandinger fra gruppen antiflogistika, antibiotika, anti-leishmaniamidler, antimykotika, antineoplastika og immunmodulatorer .

Farmasøytiske virksomme stoffer fra gruppen antiflogistika er f.eks. glukokortikoider, f.eks. kortison, hydrokortison, prednison, prednisolon, fluokortolon, triamcinolon, metyl-prednisolon, prednyliden, parametason, deksametason, beta-metason, beklometason, fluprednyliden, desoksymetason, fluokinolon, flumetason, difluokortolon, klokortolon, klo-betasol eller fluorkortinbutylester, ikke-steroide beten-nelseshemmere fra gruppen substituerte fenyleddiksyresalter eller 2-fenylpropionsyresalter, f.eks. alofenak, ibufenak, ibuprofen, MK-830, BL-2365, klindanak, fenklorak, ketoprofen, fenoprofen, indoprofen, fenklofenak, diklofenak, flurbi-profen, pirprofen, naproksen, benoksaprofen, karprofen eller kikloprofen, antranilsyrederivater, f.eks. av formelen

hvor R^, R2 og R^ uavhengig av hverandre står for hydrogen, metyl, klor eller trifluormetyl, f.eks. mefenaminsyre, flufenaminsyre, tolfenaminsyre eller meklofenaminsyre, anilino-substituerte nikotinsyrederivater, f.eks. miflumin-syre, kloniksin eller fluniksin, heteroaryleddiksyrer eller 2-heteroaryleddiksyrer med en 2-indol-3-yl- eller pyrrol-2-yl-rest, f.eks. indometacin, oksmetacin, intrazol, ace-metacin, cinmetacin, zomepirak, tolmetin, kolpiirak eller tiaprofensyre, en indenyleddiksyre av sulindak-typen, samt analgetisk virksomme heteroaryloksyeddiksyrer, f.eks. benza-dak. Farmasøytiske virksomme stoffer fra gruppen antibiotika er f.eks. tetracyklin-antibiotika av formelen

hvor er hydrogen eller pyrrolidin-l-yl-metyl, R^ er hydrogen eller hydroksy, R^ er hydrogen, hydroksy eller metyl, R^ er hydrogen eller metyl og R,- er hydrogen, klor eller dimetylamino, f.eks. klortetracyklin, oksytetra-cyklin, tetracyklin, demetylklortetracyklin, metacyklin, doksycyklin, minocyklin eller rolitetracyklin, aminoglyko-sid, f.eks. kanamycin, amikacin, gentamycin C^a, C2, eller C^, sisomicin, netilmicin, spektinomycin, streptomycin, tobramycin, neomycin B, dibekacin eller kanendomycin, makro-lid, f.eks. maridomycin eller erytromycin, linkomycin, f.eks. klindamycin eller linkomycin, penicillansyre (6-APA)-og cefalosporansyre (7-ACA)-derivater med 66- hhv. 7B-acyl-aminogrupper, som er tilstede i 66-acylaminopenicillansyre-eller 7B-acylaminocefalosporansyrederivater som lar seg fremstille ved fermentativ, halv- eller helsyntese, eller i 7p<->acylaminocefalosporansyrederivater som er omvandlet i 3-posisjonen, penicillansyrederivater som f.eks. er gjort kjent under navnene penicillin G eller C, feneticillin, propicillin, nafcillin, oksacillin, kloksazillin, dikloks-cillin, flukloksacillin, cyklazillin, epicillin, mecillinam, meticillin, azlocillin, sulbenicillin, tikarcillin, mezlo-cillin, piperacillin, kardinacillin, azidocillin eller ciklazillin, eller cefalosporinderivater som er blitt kjent under navnene cefaklor, cefuroksim, cefazlur, cefacetril, cefazolin, cefalexin, cefadroksil, cefaloglysin, cefoksitin, cefaloridin, cefsulodin, cefotiam, ceftazidin, cefonicid, cefotaksim, cefmenoksim, ceftizoksim, cefalothin, cefradin, cefamandol, cefanon, cefapirin, cefroksadin, cefatrizin, cefazedon, ceftrikson eller ceforanid samt andre ø-laktam-

antibiotika av klavam-, penem- eller karbapenem-typen,

f.eks. moksalaktam, klavulansyre, nokardicin A, sulbaktam, aztreonam eller tienamycin, samt antibiotika av bikozamycin-, novobiocin-, klor- eller tiamfenikol-, rifampicin-, fosfo-mycin-, kolistin- eller vankomycin-typen.

Farmasøytiske virksomme stoffer fra gruppen av anti-leishmaniamidler er f.eks. antimon-forbindelser, f.eks. brekkvinsten (kalium-antimonyltartrat), stibofen, natriumstibokaptat samt natriumstiboglukonat.

Farmasøytiske virksomme stoffer fra gruppen antimykotika

er f.eks. tiokarbonsyrederivater, f.eks. dibenztion, tolnaftat eller tolciklat, imidazol-derivater, f.eks. klotrimazol, mikonazol, ekonazol, isokonazol eller ketokonazol eller polyen-antibiotika, f.eks. nystatin, natamycin eller amfo-tericin B.

Farmasøytisk virksomme stoffer fra gruppen antineoplastika

er f.eks. alkylanziner med bis-(2-kloretyl)-amingruppe,

f.eks. klormetin, klorambucil, melfalan, uramustin, manno-mustin, estramustinfosfat, mekloretaminoksyd, cyklofosfamid, ifosfamid eller trifosfamid, alkylanziner med aziridin-struktur, f.eks. tretamin, tiotepa, triazikon, eller mitomycin, alkylerende metansulfonsyreestere, f.eks. busulfan, alkylerende N-alkyl-N-nitrosourinstoffderivater, f.eks. karmustin, lomustin, semustin eller streptozotocin, som f.eks. alkylanzier av mitobronitol-, dekarbazin- eller prokarbazin-typen, antimetabolitter av folsyre-typen, f.eks. metotreksat, purinderivater, f.eks. merkaptopurin, tioguanin, azatioprin, tiamiprin, vidarabin eller puromycin, pyrimidin-derivater, f.eks. fluoruracil, floksuridin, tegafur, cytarabin, jodoksuridin, flucytosin, antibiotika, som anvendes i kjemoterapien ved kreft, f.eks. daktinomycin, daunorubicin, doksorubicin, mitramycin, bleomycin A., eller B2 eller etoposid, samt vinka-alkaloider, f.eks. vinkristin, eventuelt sammen med klormetamin, prednisolon eller prednison og prokarbazin.

Immunmodulatorer er f.eks. muramylpeptid, f.eks. muramyldipep-tid eller muramyltripeptid, spesielt av formelen

hvor X står for gruppen -C(=0)- eller -C(=0)-0-, R, er L-Ala-D-isoGln-L-Ala-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid-, L-Ala-D-Glu(CY-L-Ala-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid)-, L-Ala-D-isoGlnOH-, L-Ala-D-GlnNH2-a-n-butylester-, L-Ala-D-isoGln-L-(stearoyl)-Lys-, L-Val-D-Gln-NH2-a-n-metyl-ester-, L-Ala-D-isoGln-L-Ala-1,2-dipalmitoyl-sn-glyserin-ester- eller L-Ala-D-isoGln-L-Ala-kolesterinester-gruppen, R2 er hydrogen, metyl eller n-propyl, R^ er hydrogen, n-stearoyl, 10-(2,3-dimetoksy-l,4-diokso-5-metyl)-2,5-cykloheksadienoyl, 2-behenoyloksy-2-metylpropanoyl eller n-oktanoyl, R4 er hydrogen eller n-oktanoyl, R^ er c1~c4~ alkyl og Rg er hydrogen eller C-^-C^-alkyl samt de tilsvarende 2-palmitoyltio-derivatene derav, lipopeptider med immunmodulatoriske egenskaper av typen n-lauroyl-L-Ala-D-isoGln-(m-DAP-Gly)-NH2, n-lauroyl-L-Ala-D-isoGln-(L-DAP-Gly)-NH2, n-lauroyl-L-Ala-D-isoGln-(L-Lys-D-Ala)-NH2, n-oktanoyl-L-Ala-D-isoGln(L-Lys-D-Ala)-NH2 eller palmitoyl-Cys-((2R)-2,3-dilauroyloksypropyl)-Ala-D-Glu(Gly-taurin-Na)-NH2, eller er lymfokiner som utskilles av lymfocytter, monocytter eller makrofager når disse stimuleres ved antigener eller mitogener eller liknende.

Til gruppen av lymfokiner hører eksempelvis kjente interferon-typer, spesielt naturlig eller rekombinert, humant Y-interferon, f.eks. humant Y-interferon som kan fremstilles ifølge de europeiske patentpublikasjonene nr. 63.482, 77.670, 83.777, 88.540, 89.676, 95.350, 99.084, 110,044 og 112.967 og de internasjonale publikasjonene (PCT) WO 83/04.053 og WO 84/02.129.

Foretrukket er rekombinert, humant y-interferon ifølge europeisk patentpublikasjon 121.157 med følgende aminosyresekvens: og rekombinert, humant y-interferon ifølge britisk patent-publikas jon 2.107.718 med følgende aminosyresekvens:

Til gruppen av lymfokiner hører dessuten humant interleukin

2 som foreligger i renset form, og f.eks. kan oppnås etter aktivering av humane, neoplastiske leukemi- eller lymfom-celler ved T-cellemitogen i kulturfiltrat og interleukin 2 som er renset ved reversert fase-HPLC fra kulturer med menneskelige T-lymfocytter fra milt eller perifert blod etter stimulering ved antigener eller mitogener, f.eks.

humane T-celle-leukemi-lymfom-viruser (HTLV-I) fytohemagglu-tinin eller konkanavalin A, oppnåelige kulturfiltrater som inneholder blandinger av bestanddelene som er blitt kjent under begrepene makrofag-migrasjons-inhiberingsfaktor (MIF), leukocytt-migrasjons-inhiberingsfaktor, leukocytt-migrasjons-forsterkningsfaktor, makrofag-aktiverende faktor (MAF), koloni-stimulerende-faktor, interleukin 1 og 2 samt Y-interferon, spesielt slike kulturfiltrater eller isolater med en høy andel av makrofag-aktiverende-faktor (MAF).

De farmasøytiske preparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen utpeker

-9

seg ved en relativt enhetlig størrelse (ca. 2,0-3,0 x 10 m) og høy lagringsstabilitet. Eksempelvis er tørrpreparater (lyofilisater) bestående av de nevnte syntetiske fosfolipidene og muramylpeptidene holdbare i flere måneder til flere år. Tørrpreparatene lar seg kort før bruk dispergere i vandige pufferoppløsninger på enkel måte ved risting (virv-ling) eller vibrering og anvendes in situ, i de fleste tilfeller kan ekstra forholdsregler som filtrering, nøytra.-lisasjon, dialyse osv. unngås. Vandig liposomdispersjoner med syntetisk fosfolipider og muramylpeptider som inne-sluttede forbindelser er holdbare ved temperaturer under 10°C i flere uker til måneder, og kan også gjøres lagrings-stabilt som lyofilisat.

De farmasøytiske preparatene fremstilt .ifølge oppfinnelsen utpeker seg ved spesielt god fysiologisk tålbarhet, f.eks. lav toksisitet, og gunstig farmakokinetisk profil,.når de tilføres i form av en vandig dispersjon av liposomer.

De undersøkte liposompreparatene inneholder følgende lipidkomponenter: 1: 1,2-di-n-heksadekanoyl-3-sn-fosfatidyl-S-serin (Avanti Polar Lipids Inc. Birmingham Ala.) og 2,2-di-n-oktadekanoyl-3-sn-fosfatidylkolin (Avanti, 3:7 vektforhold),

2: 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidyl-S-serin (fremstilt ifølge Browning J. og Seelig J., Chem. and Physics of Lipids 24 (1979) 103) og 1,2-di-n-oktadekanoyl-3-sn-fosfatidylkolin (Avanti, 3:7 vektforhold),

3: 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidyl-S-serin (loe.eit.) og 1-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidylkolin (fremstilt ifølge Eibl H., Chem. and Physics of Lipids 26 (1980) 239 og Eibl H., Angewandte Chemie 96 (1984) 247, 3:7 vektforhold).

Liposomsammensetninger er fremstilt av søkerne på følgende måte: 1 ml av en kloroformoppløsning av lipidene tilsettes til en 15 ml ampulle. Etter fjernelse av oppløsningsmidlet avsettes lipidene på veggen av ampullen som en tynn film. Gjenværende oppløsningsmiddel fjernes ved fordampning ved romtemperatur i 15 timer. Ampullen forsegles deretter under nitrogenatmos-fære. Ampullene lagres ved -20°C. Liposomsammensetningen som skal undersøkes fremstilles fra disse filmene ved å oppvarme ampullen til 50'C og injisere 2,5 ml sterilt, kalsiumfri, fosfatbufret (pH 7,2 - 7,4) saltvannsoppløsning med en steril sprøyte, og for oppsvelling av filmen i ti minutter ved å la den stå ved romtemperatur og dispergering i ti minutter ved risting i en standardisert laboratorie-riste-apparatur (Vortex, skalainndeling 6).

Akutt toksisitet i mus - fremgangsmåte

Akutt intravenøs toksisitetsundersøkelser ble utført ved å anvende Tif:MAGf (SPF) mus på 17-24 g. Alle musene befant seg i et luftkondisjonert dyrerom ved en temperatur på 22 ± 2°C og en relativ fuktighet på 50-7%. Kunstig lys ble til-veiebragt 14 timer daglig. Dyrene ble holdt i "Macrolon"-bur.

Liposomsammensetningene (2,5 ml) ble fortynnet til en konsentrajson som muliggjorde injeksjon av et standardvolum på 10 ml/kg. Intravenøse injeksjoner ble gitt via halevenen ved en hastighet på 0,1 ml pr. 10 sekunder.

Det ble anvendt grupper på 3 dyr pr. dosenivå. Dyrene ble observert i 5 minutter etter behandling for å bestemme mortalitet.

Retultater

Fra disse resultatene kan det fastslås at liposomsammensetninger inneholdende to mettede lipidkomponenter 1,2-di-n-heksadekanoyl-3-sn-fosfatidyl-S-serin og 1,2-di-n-oktadekanoyl-3-sn-fosfatidylkolin eller liposomsammensetningene som inneholder en mettet lipidkomponent 1,2-di-n-oktadekanoyl-3-sn-fosfatidylkolin er toksiske ved dosenivåene på 250 mg/kg og 500 mg/kg (tre mus av totalt tre hadde dødd), mens liposomsammensetninger inneholdende to innettede lipidkomponenter 1,2-di-(9.cis-oktadecenoyl)3-sn-fosfatidyl-s-serin og 1-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidylkolin ved det høye dosenivået på 500 ml/kg (alle tre mus overlevde).

Liposomer bestående av de nevnte syntetiske fosfolipidene og et muramyldi- eller muramyltripeptid som innesluttet forbindelse lar seg spesielt godt anrikes i lungen og leveren og endocyteres raskt av makrofager. Spesielt stimuleres alevolære makrofager og overvinner fysiologisk uønskede materialer, f.eks. virus eller metastaserende kreftceller. Følgelig egner de farmsøytiske preparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen i form av liposomer seg i spesielt høy grad ved kreft-kjemoterapi til bekjempelse av metastasedannende tumorer.

Blandingen av fosfolipider (I) og (II) som anvendes ved fremstilling av farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen, har etter dispersjon i vandig fase en faseovergangs-temperatur (flytende-gelformig) som er lavere enn 37°C. Fremstillingen av liposomdispersjonen kan foregå uten opp-varming .

Vandige dispersjoner hvor fosfolipidene av formlene I og

II foreligger i form av liposomer, hvor de nevnte forbindelsene hhv. stoffblandingene med biologisk virkning er innesluttet, er farmasøytiske tilførselssystemer som, eventuelt etter konsentrering eller isolering av liposomene, f.eks. ved ultrasentrifugering, egner seg til terapeutiske formål for oral (p.o.) eller parenteral (i.v., i.m., i.p. eller topisk) tilførsel.

Ved oral administrering kan tilførselssystemer på liposombasis forbedre resorpsjonen av et virksomt stoff.

For oral tilførsel kan den liposom-holdige, vandige dispersjonen, som ved hjelp av puffer er innstilt på pH 7,0-7,8, fortrinnsvis 7,2-7,4, blandes med farmasøytisk tålbare fortynningsmidler eller bærestoffer eller med vanlige til-satsstoffer, f.eks. farge- eller smaksstoffer, og anvendes som sirup eller i form av kapsler.

For parenteral tilførsel dispergeres liposomene i en

steril vandig oppløsning som tjener som bærervæske, f.eks. steril, kalsium-fri, isotonisk koksalt- eller glukoseopp-løsning, som ved hjelp av puffer er innstilt på pH 7,0-

7,8, fortrinnsvis 7,2-7,4.

For topisk tilførsel blandes den liposom-holdige vandige dispersjonen, som er innstilt på pH 7,0-7,8, fortrinnsvis 7,2-7,4, med vanlige faste bærermaterialer, f.eks. fortyk-ningsmidler, f.eks. hydroksypropylcellulose samt egnede konserveringsmidler, antioksydanter og duftstoffer, og anvendes som lotion eller gel til påføring på huden eller på slimhinnene.

Oppfinnelsen vedrører nærmere bestemt fremstilling av farmasøytiske preparater som inneholder syntetiske, i det vesentlige rene fosfolipider i et blandforhold mellom fosfolipider av formel I og fosfolipider av formel II fra 10-90 til 50-50

mol-% og et farmasøytisk virksomt stoff eller en stoffblanding fra gruppen antiflogistika, antibiotika, anti-leishmaniamidler, antimykotika, antineoplastika og immunmodulatorer og eventuelt en bærervæske som er innstilt på pH 7,0-7,8 og/eller andre faste bærermaterialer.

Spesielt kan nevnes farmasøytiske pre<p>arater som inneholder

a) et syntetisk, i det vesentlige rent fosfolipid av for-

mel I, hvor R, og R-, er like og står for 9-cis-dodec.enoyl,

9-cis-tetradecenoyl, 9-cis-heksadecenoyl, 9-cis-oktadecenoyl eller 9-cis-ikosenoyl, n er 1 og Y er natriumionet,

b) et syntetisk, i det vesentlige rent fosfolipid av formel

II, hvor R^ er n-dodekanoyl, n-tetradekanoyl, n-heksadekanoyl eller n-oktadekanoyl, R.> er 9-cis-dode enoyl, 9-cis-tetrade. enoyl, 9-cis-heksadeeenoyl, 9-cis-oktadecenoyl eller 9-cis-ikosenoyl og R&, R^ og Rc er metyl,

c) et farmasøytisk virksomt stoff eller en stoffblanding fra gruppen antiflogistika, antibiotika, anti-leishmaniamidler, antimykotika, antineoplastika og immunmodulatorer og eventuelt en bærervæske som er innstilt på pH 7,2-7,4.

Videre kan nevnes farmasøytiske preparater som inneholder

a) syntetisk, i det vesentlige rent natrium-1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidyl-(S)-serin, b) syntetisk, i det vesentlige rent l-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidylkolin, c) et farmasøytisk virksomt stoff eller en stoffblanding fra gruppen antiflogistika, antibiotika, anti-leishmaniamidler, antimykotika, antineoplastika og immunmodulatorer og eventuelt en bærervæske som ved hjelp av buffer er innstilt på pH 7,2-7,4. Først og fremst kan nevnes farmasøytiske preparater som inneholder a) syntetisk, i det vesentlige rent natrium-1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidyl-(S)-serin, b) syntetisk, i det vesentlige rent l-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidylkolin, c) et farmasøytisk virksomt stoff eller en stoffblanding fra gruppen antiflogistika, f.eks. diklofenak eller

pirprofen, antineoplastika, f.eks. mitomycin, cytarabin, daktinomycin, daunorubicin, doksorubicin eller etoposid, immunmodulatorer, f.eks. N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C )-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid-dinatrium-salt, N-acetyl-desmetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt, N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-

natriumsalt, N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-glutamin-a-n-butylester, N°-(N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl)-N^-stearoyl-L-lysin eller 6-0-stearoyl-N-acetylmuramyl-L-alanin-D-isoglutamin, lymfokiner eller kombinasjoner derav, og eventuelt en bærervæske som ved hjelp av buffer er innstilt på pH 7,2-7,4.

Videre skal nevnes farmasøytiske preparater som inneholder

a) syntetisk, i det vesentlige rent natrium-1,2-di(9-cis-oktadeeenoyl)-3-sn-fosfatidyl-(S)-serin, b) syntetisk, i det vesentlige rent l-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidylkolin, c) et farmasøytisk virksomt stoff fra gruppen antineoplastika, f.eks. mitomycin, cytarabin, daktinomycin, daunorubicin, doksorubicin eller etoposid, og immunmodulatorer, f.eks. N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyfosfo-ryloksy)-etylamid, N-acetyl-desmetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt, N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt eller lymfokin, f.eks. humant Y-interferon eller interleukin 2 eller stoffblandinger som inneholdes i kulturfiltrater fra kulturer med menneskelige T-lymfocytter fra milt eller perifert blod etter stimulering ved antigener eller mitogener og er kjennetegnet ved høye andeler av makrofag-aktiverende faktor (MAF) eller kombinasjoner derav, og eventuelt en bærervæske som ved hjelp av buffer er innstilt på pH 7,2-7,4. Fremfor alt skal nevnes farmasøytiske preparater som inneholder a) syntetisk, i det vesentlige rent natrium-1,2-di(9-cis-oktadec.enoyl) -3-sn-f osf atidyl- (S) -serin, b) syntetisk, i det vesentlige rent l-n-heksadekanoyl-2- ( 9-cis-oktadec.enoyl) -3-sn-f osf atidylkolin, c) en immunmodulatorisk virksom forbindelse, f.eks. N-ace-tylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid, N-acetyl-desmetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natrium-salt eller N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt, eventuelt sammen med stoffblandinger som inneholdes i kulturfiltrater fra kulturer med menneskelige T-lymfocytter fra milt eller perifert blod etter stimulering ved antigener eller mitogener og som er kjennetegnet ved en andel av MAF på minst 70%, og eventuelt en bærervæske som ved hjelp av buffer er innstilt på pH 7,2-7,4.

De nevnte farmasøytiske preparatene kan omsettes som tørr-preparater og anvendes i form av en vandig liposomdispersjon i en bærervæske som ved hjelp av buffer er innstilt på pH 7,0-7,8.

Dosemengden for det virksomme stoffet som skal anvendes

er generelt lik mengden for det samme virksomme stoffet i den nåværende anvendelsesformen, og bestemmes av pasien-tens alder og helsetilstand, f.eks. i de maksimal- og mini-malmengder som er beskrevet i den tyske legemiddelboken (DAB - Deutschen Arzneimittelbuch). Vandige dispersjoner med liposomer fremstilt ifølge oppfinnelsen har også den fordelen at det virksomme stoffet anvendt i mindre mengder når frem til reseptorene og der kan det bevirke en terapeutisk virkning, eller at uønskede bivirkninger kan unngås ved anvendelse av høyere doser.

De foretrukne dosemengdene for de nevnte, i form av liposomer innkapslede immunmodulatorene av muramylpeptid- eller lipopeptidtypen utgjør 0,01 til 10 mg/kg legemsvekt pr. tilførsel. For lymfokin i liposomform, f.eks. humant Y-interferon eller blandinger som inneholder MAF utgjør den foretrukne dosemengden 100-100-000 enheter/ml ■y-interferon eller MAF.

Nevnes skal videre blandinger, spesielt homogene blandinger av syntetiske, i det vesentlige rene fosfolipider av formlene I og II, spesielt blandinger i et blandforhold mellom fosfolipider av formel I og fosfolipider av formel II på 10-90 til 50-50 mol-%. Fortrinnsvis er blandforholdet 30-70 mol—%. Disse blandingene lar seg anvende til fremstilling av liposomer i vandig fase som inneholder et vannoppløselig virksomt stoff.

De farmasøytiske preparatene, f.eks. de nevnte blandingene, fremstilles eksempelvis ved at man cx) ved film- eller lyofilisatdannelse blander syntetiske, umettede mer enn 90 vekt-% rene fosfolipider med formlene I og II i et blandingsforhold fosfolipider med formel I:fosfolipider med formel II på 20:90 til 50:50 mol-% og et lipofilstoff eller en stoffblanding med biologisk virkning i et blandingsforhold til totalmengden av lipider på 0,001 til 1,0:1,0 homogent og dispergerer den oppnådde homogene blanding i vandig fase ved risting eller omrøring for å danne liposomer, eller <p>) ved film- eller lyofilisatdannelse blander homogen syntetiske, umettede mer enn 90 vekt-% rene fosfolipider med formel I og II i et blandingsforhold fosfolipider med formel I:fosfolipider med formel II på 10:90 til 50:50 mol-% og, for dannelse av liposomer, dispergerer den oppnådde homogene blanding i vandig fase inneholdende et stoff eller en stoffblanding med biologisk virkning i et mengdeforhold til den totale mengde lipider på 0,001 til 1,0:1,0 ved risting eller omrøring og, hvis nødvendig, avbufrer den oppnådde vandige dispersjon til pH 7,0 til 7,8 og, hvis ønskelig, anriker og/eller separerer de oppnådde liposomer.

Fremstillingen av den homogene blandingen foregår eksempelvis ved film— eller fortrinnsvis ved lyofilisatdannelse. Filmdannelsen foregår ved fremgangsmåtevarianten a) ved oppløsning av de syntetiske fosfolipidene av formlene I og II og det lipofile stoffet eller stoffblandingen som skal innkapsles, eller ved fremgangsmåtevariant P) ved oppløsning av de syntetiske fosfolipidene av formlene I og II i et organisk oppløsningsmiddel med lavt smeltepunkt og deretter fjerner oppløsningsmidlet.

Utvalget av egnede oppløsningsmidler til fremstilling av en film avhenger av oppløseligheten for lipidkomponenten og forbindelsen som skal innesluttes. Egnede oppløsningsmidler til fremstilling av den homogene blandingen ved filmdannelse er f.eks. lavtkokende og —smeltende (under 0°C), usub-stituerte eller substituerte, f.eks. halogenerte, alifatiske eller cykloalifatiske hydrokarboner, f.eks. n-heksan, cykloheksan, metylenklorid eller kloroform, alkoholer, f.eks. metanol, laverealkankarboksylsyreester, f.eks. eddiksyre-etylestere, eller eter, f.eks. dietyleter eller blandinger av disse oppløsningsmidlene.

Oppløsningsmidler fjernes i vakuum, fortrinnsvis høyvakuum, eller ved avblåsing med inert gass, f.eks. nitrogen.

Lyofilisatdannelsen foregår ved fremgangsvariant a) ved lyofilisering av en oppløsning av de syntetiske fosfolipidene av formlene I og II og det lipofile stoffet eller stoffblandingen som skal innkapsles, eller ved fremgangsmåtevariant P) ved lyofilisering av en oppløsning av de syntetiske fosfolipidene av formlene I og II i et organisk oppløsningsmiddel med høyt smeltepunkt ved fremgangsmåten beskrevet i DE-A-2.818.655. Egnede oppløsningsmidler foreligger ved frysetørking, f.eks. ved temperaturen for metanol—, etanol— eller aceton-tørrisblandinger, sammen med lipidkomponentene og forbindelsene som skal innesluttes i fast tilstand, og er f.eks. organiske oppløsningsmidler med et smeltepunkt som ligger over -°C, f.eks. iseddik, benzen eller dioksan, spesielt tert-butanol.

En homogen blanding lar seg også fremstille ved spraytørking av en oppløsning av fosfolipidene og den lipofile forbindelsen som skal innesluttes i et organisk oppløsnings-middel, f.eks. kloroform. Man får den homogene blandingen i form av et pulver.

Til fremstilling av den homogene blandingen egner seg et omtrentlig blandforhold mellom fosfolipider av formel I og fosfolipider av formel II på 10-90 til 50-50 mol-%, spesielt 30-70 mol-%. Det omtrentlige blandforholdet mellom forbindelsen som skal innesluttes og den totale mengden lipider utgjør 0,001 til 0,1 til 1,0, fortrinnsvis 0,005 til 0,1 til 1,0 mol.

Man dispergerer eksempelvis ved risting (f.eks. virvel-blandinger) eller omrøring av den vandige fasen som man ifølge fremgangsmåtevariant a) har tilsatt den tidligere fremstilte homogene blandingen av fosfolipider (I) og (II) og de lipofile forbindelsene som skal innesluttes, eller som ifølge fremgangsmåtevariant P) inneholder den vannoppløselige forbindelsen som skal innesluttes og hvor man har tilsatt den på forhånd fremstilte homogene blandingen av fosfolipidene (I) og (II). Dannelsen av liposomer, som kan være store, små, unilamellære eller multilamellære, finner sted spontant (spontaneous vesiculation), dvs. uten ekstra energitilførsel og med stor hastighet. Det kan dispergeres 0,1 til 50 vekt-%, fortrinnsvis 2-20 vekt-% (beregnet på basis av den totale vekten av den vandige dispersjonen) av den homogene blandingen i vandig fase.

Man bufrer surt eller basisk reagerende vandige dispersjoner til pH 7,0-7,8, fortrinnsvis pH 7,2-7,4. Fortrinnsvis dispergerer man i en vandig fase som på forhånd er innstilt på denne pH-verdien.

Fremgangsmåtevariant a) egner seg spesielt når det skal innelsuttes lipofile og lite vannoppløselige virksomme stoffer i form av liposimer, f.eks. muranyldi— eller muramyltripeptid. Fremgangsmåtevariant P) egner seg når en liposomblanding av vannoppløselige virksomme stoffer, f.eks. cytarabin eller cytostatika av typen trifosfamid skal fremstilles.

Det dispergeres ved temperaturer under 36°C, fortrinnsvis ved romtemperatur. Dersom følsomheten av forbindelsene som skal innkapsles forlanger det, gjennofører man fremgangsmåten under avkjøling og eventuelt under en atmosfære av inert gass, f.eks. nitrogen eller argon. De fremstilte liposomene er meget bestandige i vandig fase (inntil flere uker eller måndeder). Farmasøytiske preparater i form av vandige liposomdispersjoner kan eventuelt gjøres lagringsdyktige ved fysetørking, eventuelt etter tilsats av stabilisatorer, f.eks. mannit eller laktose.

Størrelsen av de dannede unilamellære liposomene er blant annet avhengig av strukturen av det virksomme stoffet og lipidkomponentene, blandforholdet mellom komponentene og konsentrasjonen av disse komponentene i den vandige dis-pers jonen. Eksempelvis kan man ved å øke eller redusere konsentrasjonen av lipidkomponentene i den vandige fasen fremstille liposomer med en høy andel av små eller store liposomer.

Ved etterbehandling av liposomdispersjonen, f.eks. ved ultralydbehandling eller ekstrudering gjennom rettporede filtre (f.eks. "Nucleopore") kan man oppnå en spesielt enhetlig størrelsesfordeling for liposomene.

Adskillelsen av de store fra de små liposomene, dersom

dette er nødvendig, foregår ved kjente adskillelsesfrem-gangsmåter, f.eks. gelfiltrering, f.eks. med "Sepharose 4B" eller "Sephacryl" som bærer, eller ved sedimentering av liposomer ved ultrasentrifugering, f.eks. ved 160.000 x g. Eksempelvis sedimenteres etter flere timers, f.eks. tre timers, sentrifugering i dette tyngdefeltet de store liposomene, mens de små liposomene forblir dis-pergert og kan dekanteres. Etter flere gangers sentrifugering oppnår man en fullstendig adskillelse av de store fra de små liposomene.

Liposomer adskilles fortrinnsvis når ifølge fremgangsmåtevariant $) den vandige fasen inneholder ikke-innkapslede, vannoppløselige forbindelser. Spesielt bør vannoppløselige antineoplastika, f.eks. alkylanzier adskilles, f.eks. ved filtrering, ultrafiltrering, dialyse eller sentrifugering, siden tålbarheten av disse virksomme stoffene i oppløst form ikke er spesielt god. De anrikede liposomene kan blandes med en bærervæske, f.eks. isotonisk, steril koksalt-oppløsning. Vandige dispersjoner med små liposomer av relativt enhetlig størrelse oppnår man også ved behandling med ultralyd.

Også ved gelfiltrering kan man adskille alle liposomene

i den vandige fasen som har et tverrsnitt større enn

— 8

6,0 x 10 m, samt ikke-innkapslede lipofile virksomme stoffer og overskytende, dispergerte lipider, som foreligger i høymolekylære aggregater og derved fremstille en vandig dispersjon med en fraksjon av liposomer med relativt enhetlig størrelse.

Den oppnådde dannelsen av liposomer og deres innhold i vandig fase lar seg påvise ved hjelp av forskjellige fysikal-ske målemetoder, f.eks. ved fryseoppbrutte (freeze fracture) prøver og tynnsnitt i elektronmikroskop eller ved røntgen-diffraksjon, ved dynamisk lysspredning, ved massebestemmelse av filtratet i en analytisk ultrasentrifuge og fremfor alt spektroskopisk, f.eks. ved kjerneresonansspektrum ("'"H,

13C og31P).

Syntetiske, i det vesentlige rene fosfolipider av formlene

I og II er kjente. Eksempelvis beskrives av Browning J.

og Seelig J. i oversiktsartikkelen "Synthesis of Specifi-cally Deuterated Saturated and Unsaturated Phosphatidyl-serins" i Chem. and Physics of Lipids 24 (1979), 103-118, fremstillingen av 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfati-dyl- (S)-serin.

De farmasøytiske virksomme stoffene fra gruppen bestående

av antiflogistika, antibiotika, anti-leishmaniamidler og kreft-kjemoterapeutika er kjente, se Merck-Index, 10. utgave og det ovenfor nevnte oversiktsverket av Schrbder et al. "Pharmazeutische Chemie".

De nevnte immunmodulatorene av muramylpeptid-typen av formel VI er også kjente, se f.eks. de europeiske patent-skriftene nr. 25495 og 21367, samt det franske patentskrift nr. 7.637.091.

De nevnte immunmodulatorene av lipopeptid-typen er også kjente, f.eks. EP-A-114.787 eller europeisk patentskrift 330.

Fremstillingen av renset interleukin 2 er beskrevet i EP-A-0106179 samt i US patentskriftet 4.448.879.

Stoffblandinger som inneholder makrofag-migrering-inhiberingsfaktor (MIF), leukocytt-migrering-inhiberingsfaktor, leukocytt-migrerings-forsterkningsfaktor makrofag-aktiverende faktor (MAF), koloni-stimulerende faktor osv. er beskrevet i tallrike publikasjoner, f.eks. Salahuddi S.Z. et al. Science 223 (4637) 703-707 (1984). Fremstillingen av kulturfiltrater som inneholder en spesielt høy åndel av humant MAF er også beskrevet i tallrike publikasjoner, f.eks.

Le J. et al., J. Immunology, bind 131, 2821-2826 (1983),

Kleinermann et al., J. Clinical Investigation, 72, 304-

315 (1983), Cameron D.J., J. Clin. Lab. Immunol. (1984),

13, 47-50, samt Kleinermann E.S. og Fidler I.J., Lymphokine Research, bind 2, nr. 1, 7-12 (1983).

De anvendte bufferoppløsningene på pH 7,0-7,8 er fortrinnsvis sterile fosfatbufferoppløsninger på basis av dihydrogen-/ hydrogen-fosfat, som eksempelvis kan fremstilles ved fremgangsmåten angitt i Hagers "Handbuch der Pharmazeutischen Praxis", Springer Verlag, bind 1, s. 357-359. Spesielt anvendes steril, isotonisk kalsium-fri bufferoppløsning av pH 7,2 ("Dulbecco").

De følgende eksemplene anskueliggjør oppfinnelsen uten

å begrense denne. Temperaturene er angitt i °C.

Eksempel 1

I en rundkolbe oppløses 586 mg sterilt tert-butanol, 0,1

mg N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid (fremstilt ifølge europeisk patentskrift 25.495), 75 mg (95% renhet) natrium-1, 2-di-( 9-cis-oktadec.enoyl)-3-sn-f os-fatidyl-(S)-serin (fremstilt ifølge Browning J. og Seelig J., Chem. and Physics of Lipids 24 (1979) 103-118) og 175

mg (95% renhet) l-n-heksadekanoyl-2-( 9-cis-oktadec.enoyl) - 3-sn-fosfatidylkolin (Avanti, Polar Lipids). Oppløsningen filtreres sterilt over "Acrodisc" (2,0 x 10 ^ m) og nedfryses ved -45° etter fylling i en steril ampulle. Ampullen tørkes i vakuum inntil en temperatur på 25°C er nådd og lukkes under argonatmosfære.

Før bruk tilsettes dette tørre preparatet (lyofilisatet)

ved romtemperatur med en steril sprøyte 2,5 ml steril, kalsiumfri, fosfat-bufret (pH 7,2-7,4) koksaltoppløsning ("Dulbecco") og ampullen ristes med en standardisert laboratorierister (virvelrister, trinn 6) i 10 minutter. Den fremstilte liposomdispersjonen kan lagres ved 4° og egner

seg til parenteral (i.v.) anvendelse.

Eksempel 2

I en rundkolbe oppløses 586 mg steril tert-butanol, 0,1

mg N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid (fremstilt ifølge europeisk patentskrift 25.495), 75 mg (95% renhet) natrium-1, 2-di-( 9-cis-oktade.cenoyl) - 3-sn-fosfatidyl-(S)-serin (fremstilling ifølge Browning J.

og Seelig J., Chem. and Physics of Lipids 24 (1979) 103-118) og 175 mg (95% renhet) l-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadecenoyl ) -3-sn-f osf atidylkolin (Avanti, Polar Lipids). Oppløsningen filtreres sterilt over "Acrodisc" (2,0 x 10 7 m) og fylles i en steril ampulle. Ampullen bringes til rotasjon med 150 opm og oppløsningsmidlet blåses av i en strøm av nitrogen som er renset ved filtrering ved 1 bar. Der-

_2

etter evakueres ampullen i høyvakuum ved 6,0 x 10 mbar. Ampullen lukkes under en beskyttelsesgassatmosfære av argon.

Før bruk tilsettes det til denne fremstilte filmen ved romtemperatur, med en steril sprøyte, 2,5 ml steril, kalsium-fri, fosfatbufret (pH 7,2-7,4) koksaltoppløsning ("Dulbecco") og ampullen ristes på en standardisert laboratorierister (virvelrister, trinn 6) i 10 minutter. Den fremstilte liposomdispersjonen kan lagres ved 4° og egner seg til parenteral (i.v.) anvendelse.

Eksempel 3

Analogt eksempel 2 kan man fremstille vandige dispersjoner som inneholder liposomer bestående av 75 mg (0,091 mmol) natrium-1, 2-di- ( 9-cis-oktade.cenoyl) -3-sn-f osf atidylserin,

175 mg (0,231 mmol) l-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadeeenoyl)-3-sn-fosfatidylkolin og mer enn 0,1 mg til 10 mg N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmi-toyl-sn-glysero-3-hydroksyfosforyloksy)etylamid.

Eksempel 4

I en rundkolbe oppløses 586 mg steril tert-butanol, 75 mg (95% renhet) natrium-1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidyl-(S)-serin og 175 mg (95% renhet) l-n-heksadekanoyl-2- (9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidylkolin, det

-7

filtreres sterilt over "Acrodisc" (2,0 x 10 m) og fylles i en steril ampulle. Ampullen bringes til rotasjon ved 1750 opm og oppløsningsmidlet blåses av i en strøm av renset nitrogen som er filtrert ved 1 bar. Deretter evaku--2

eres ampullen i høyvakuum ved 6,0 x 10 mbar. Ampullen lukkes under argon-beskyttelsesatmosfære.

Før bruk tilsettes det til denne fremstilte filmen ved romtemperatur, med en steril sprøyte, 2,5 ml steril kalsium-fri fosfatbufret (pH 7,2-7,4) koksaltoppløsning ("Dulbeco") som inneholder doksorubicin i en konsentrasjon på 4 g/l og ampullen ristes på en standisert laboratorierister (virvelrister, trinn 6) i 10 minutter. Deretter sentrifugeres dispersjonen ved 40.000 g i 60 minutter. Filtratet fjernes og liposomene suspenderes i 2,5 ml 0,85 % steril koksaltoppløsning.

Eksempel 5

I en ampulle (15 ml) oppløses 506 mg steril tert-butanol,

75 mg (98% renhet) natrium-1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidyl-(S)-serin (fremstilling ifølge Browning J. og Seelig J., Chem. and Physics of Lipids 24 (1979)

103 og 175 mg (99,5% renhet) l-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadecenoyl ) -3-sn-f osf atidylkolin (fremstilt ifølge Eibl H., Chem. Physcis of Lipids 26 (1980) 239 og Eibl H., Angewandte Chemie 96 (1984) 247). Oppløsningen sterilfil-treres over "Acrodisc" (2,0 x 10 m) og nedfryses ved -45° etter fylling i en steril ampulle. Ampullen tørkes i vakuum inntil en temperatur på 25° er nådd og lukkes under argonatmosfære.

Før bruk tilsetter man til dette tørrpreparatet, med en steril sprøyte, 2,5 mg steril, kalsiumfri, fosfatbufret koksaltoppløsning ("Dulbeco") som inneholder doksorubicin i en konsentrasjon på 4 g/l og ampullen ristes på en standardisert laboratorierister (virvelrister, trinn 6) i et minutt. Etter tilsats av 22,5 ml steril, kalsiumfri, fosfatbufret koksaltoppløsning, brakt til likevekt ved 10°, ristes suspen-sjonen i 2 minutter og sentrifugeres deretter ved 10.000 g og 10° i 30 minutter. Resten fjernes og liposomene resuspen-deres i 25 ml av den sterile koksaltoppløsningen ved 10° C. Sentrifugeringsfremgangsmåten gjentas etter at liposomene

er resuspendert i 2,5 ml 0,85% steril koksaltoppløsning. Liposomsuspensjonen inneholder 9 mg doksorubicin pr. 250 mg lipid og egner .seg til i.v.-tilførsel.

Eksempel 6

Analogt eksempel 5 kan man fremstille liposomer som inneholder doksorubicin fra et tørrpreparat som inneholder 225 mg (0,297 mmol) (99,5% renhet) l-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadeaenoyl)-3-sn-fosfatidylkolin og 25 mg (0,030 mmol)

(98% renhet) natrium-1, 2-di-( 9-cis-oktade.cenoyl)-3-sn-f osf ati-dyl-S-serin. Liposomsuspensjonen inneholder 7 mg doksorubicin pr. 250 mg lipid og egner seg til i.v.-tilførsel.

Eksempel 7

Analogt eksemplene 4 og 5 kan man fremstille en liposomdispersjon ved dispersjon av et tørrpreparat av fosfolipidene i 2,5 mg steril, kalsiumfri, fosfatbufret (pH 7,2-7,4) koksaltoppløsning ("Dulbeco") som inneholder mitomycin C

i en konsentrasjon på 1 g/l, sentrifugering og oppslemming i en koksaltoppløsning.

Eksempel 8

Analogt eksempel 5, men ved utelatelse av sentrifugeringen, kan man fremstille en liposomdispersjon ved dispersjon av et tørrpreparat av fosfolipidene i 2,5 ml steril, kalsium-fri, fosfatbufret (pH 7,2-7,4) koksaltoppløsning ("Dulbeco") som inneholder 50-200 ug natrium-N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (britisk patent 1.570.625) og 1000-10.000 enheter rekombinert, menneskelig y-interferon, isolert ifølge patentpublikasjon nr. 121.157 (Kyowa Hakko Kogyo Co.)

Eksempel 9

Analogt eksempel 5, men under utelatelse av sentrifugeringen, kan man fremstille en liposomsuspensjon ved dispersjon av et tørrpreparat av fosfolipidene i 2,5 ml steril, kalsium-fri, fosfatbufret (pH 7,2-7,4) koksaltoppløsning ("Dulbeco") som inneholder 50-200 |ag natrium-N-acetyldesmetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin og 1000-100.000 enheter rekombinert menneskelig y-interferon.

Eksempel 10

Analogt eksempel 4, men under utelatelse av sentrifugeringen, kan man fremstille en liposomsuspensjon ved dispersjon av et tørrpreparat av fosfolipidene i 2,5 ml steril, kalsium-fri, fosfatbufret (pH 7,2-7,4) koksaltoppløsning ("Dulbeco") som inneholder 50-200 \ ig natrium-N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin og 1000-100.000 enheter rekombinert, menneskelig y-interferon.

Eksempel 11

Analogt eksempel 4, men under utelatelse av sentrifugeringen, kan man fremstille en liposomsuspensjon ved dispersjon av et tørrpreparat av fosfolipidene i 2,5 ml steril, kalsium-fri, fosfatbufret (pH 7,2-7,4) koksaltoppløsning ("Dulbeco") som inneholder ca. 50-200 |ag natrium-N-acetyldesmetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin og 1000-100.000 enheter rekombinert, humant y-interferon.

Eksempel 12

I en rundkolbe hvor det befinner seg 1 g sorbitol (krystall-størrelse 125-500 |am) tilsettes det dråpevis, under vakuum, 14,2 ml steril tert-butanol som inneholder 1-10 mg N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanyl-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid (fremstilling ifølge europeisk patentskrift 25.495), 75 mg natrium-1,2-di-(9-cis-oktadekenoyl)-3-sn-fosfatidyl-(S)-serin og 175 mg l-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadecenoyl)-3-sn-fosfatidylkolin. Deretter fjernes oppløsningsmidlet under vakuum med kontrol-lerte temperaturbetingelser. Det fremstilte tørrpulverprepa-ratet innelukkes under en argonatmosfære.

Før bruk tilsettes det ved romtemperatur til dette tørrprepa-ratet, med en steril sprøyte, 20 ml destillert sterilt vann og kolben ristes i 10 minutter.

Eksempel 13

Analogt eksempel 12 kan man i stedet for sorbitol også anvende glukose, sukrose, laktose eller natriumklorid som bærermateriale.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater inneholdende a) et syntetisk, umettet mer enn 90 vekt-% rent fosfolipid med formelen der Ri og R2 uavhengig av hverandre er Cio~<c>20~<a>lkenoyl med likt antall C-atomer, n er et helt tall fra 1 til 3 og Y<+> er kationet til farmasøytisk akseptabel base, b) et syntetisk, umettet mer enn 90 vekt-% rent fosfolipid med formelen der R± betyr Cio_c20"alkan°y1 med likt antall C-atomer, R2 er C]_o"c20"alken°yl med likt antall C-atomer, Ra, R]-, og Rc er hydrogen eller C1-C4-alkyl og n er et helt tall fra to til fire, c) et stoff eller en stoffblanding med biologisk virkning og eventuelt en bærervæske og/eller ytterligere faste bærere, karakterisert ved at man oc) ved film- eller lyofilisatdannelse blander syntetiske, umettede mer enn 90 vekt-% rene fosfolipider med formlene I og II i et blandingsforhold fosfolipider med formel I:fosfolipider med formel II på 20:90 til 50:50 mol-% og et lipofilstoff eller en stoffblanding med biologisk virkning i et blandingsforhold til totalmengden av lipider på 0,001 til 1,0:1,0 homogent og dispergerer den oppnådde homogene blanding i vandig fase ved risting eller omrøring for å danne liposomer, ellerP) ved film- eller lyofilisatdannelse blander homogen syntetiske, umettede mer enn 90 vekt-% rene fosfolipider med formel I og II i et blandingsforhold fosfolipider med formel I:fosfolipider med formel II på 10:90 til 50:50 mol-% og, for dannelse av liposomer, dispergerer den oppnådde homogene blanding i vandig fase inneholdende et stoff eller en stoffblanding med biologisk virkning i et mengdeforhold til den totale mengde lipider på 0,001 til 1,0:1,0 ved risting eller omrøring og, hvis nødvendig, avbufrer den oppnådde vandige dispersjon til pH 7,0 til 7,8 og, hvis ønskelig, anriker og/eller separerer de oppnådde liposomer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et farma-søytisk preparat inneholdende a) syntetisk, mer enn 90 vekt-% rent natrium-1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl) -3-sn-fosfatidyl-(S)-serin, b) syntetisk, mer enn 90 vekt-% rent l-n-heksadekanoyl-2-(9-cis-oktadecenoyl)-3 - sn-fosfatidylkolin, c) N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2 - (1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3 -hydroksyfosforyloksy)-etylamid, og en til pH 7,2-7,4 bufret bærervæske, karakterisert ved at man ved film- eller lyofilisatdannelse homogent blander fosfolipidene med formel I og II og N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyf osf oryloksy)-etylamid og, for dannelse av liposomene, dispergerer den oppnådde homogene blanding i vandig fase ved risting eller omrøring.