NO161261B

NO161261B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av 4-karbamoyloksyoksazafosforinderivater med cytostatisk virkning.

Info

Publication number: NO161261B
Application number: NO813063A
Authority: NO
Inventors: Gerhard Scheffler; Ulf Niemeyer; Norbert Brock; Joerg Pohl
Original assignee: Asta Pharma Ag
Priority date: 1980-09-10
Filing date: 1981-09-09
Publication date: 1989-04-17
Also published as: IE811951L; YU217981A; ATA386481A; PL232960A1; CA1161453A; SE8105340L; CH650787A5; EG15392A; DE3133309C2; AU538275B2; PT73645B; DE3133309A1; IT1198350B; RO83972B; RO83972A; AT386210B; FR2489825A1; LU83613A1; ES505324A0; IT8421372A0

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av 4-karbamoyloksyoksazafosforin-derivater med cytostatisk virkning.

Fra DE-OS 2 231 311 og 2 552 135 er det kjent at man ved innføring av en hydroperoksygruppe -00H i 4-stilling i molekylene til de kjente cytostatika 2-[bis-(2-kloretyl)-amino]-2-okso-tetrahydro-2H-l,3,2-oksazofosforin (cyklofosfamid), 3-(2-kloretylamino)-2-[bis-(2<1->kloretyl)-amino]-2-okso-tetrahydro-2H-l,3,2-oksazafosforin (trofosfamid), 3-(2-kloretylamino)-2-(2<1->kloretylamino)-2-okso-tetrahydro-2H-1,3,2-oksazafosforin (ifosfamid), 3-(2-kloretylamino)-2-(2<1->metansulfonyletylamino)-2-okso-tetrahydro-2H-l,3,2-oksazafosforin (sufosfamid) og andre cyklofosfamider med lignende strukturformel, kan oppnå forbindelser med verdifulle cytostatiske egenskaper, at disse forbindelser imidlertid har en så liten stabilitet at en forarbeiding til farmasøytiske preparater slik det er nødvendig i humanmedisinen ikke er mulig. Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe cyklofosfamider med en i 4-stilling ytterligere avledet hydroksygruppe som spesielt utmerker seg ved høycytostatisk virkning og forbedret stabilitet.

Ved oppfinnelsens analogifremgangsmåte fremstilles forbindelser med den generelle formel

der R]_, R2 og R3 er like eller forskjellige og betyr hydrogen eller 2-kloretyl og A er gruppen -0N(R4)- og R4 er en C-J.-6-alkylgruppe, X er oksygen og Z benzylamino, fenylamino eller C1_4-alkylamino, eller R4 er hydrogen, X er oksygen og Z er benzyloksy eller C1_4~alkoksy, eller der A er gruppen -

N(OH)- og Z er gruppen -NRgR7, X er oksygen eller svovel og R6 er hydrogen eller C1_4-alkyl, og R7 er hydrogen, benzoyl, cykloalkyl med 3-8 karbonatomer, rett eller forgrenet alkyl med 1-18 C-atomer, hvorved alkylresten også kan være substituert med -0H, -halogen, karboksy, karb-C1_2~alkoksy, benzyloksykarbonyl eller -PO(CH3)2. eller der R7 betyr fenyl-C1_4~alkyl, som eventuelt er substituert med en karboksygruppe, eller der R7 er fenyl, idet fenylresten eventuelt er substituert med en eller to C1_4~alkyl, nitro, halogen eller trifluormetyl, og der R6 og R7 sammen med nitrogenatomet danner en piperidinring eller en morfolinring, samt farmasøytisk akseptable salter derav.

På grunn av de spesielt gode egenskaper og den lette tilgjengelighet er derved 4-karbamoyloksy-oksazafosforiner med den generelle formel I der Z er gruppen NR5R7, X er oksygen, R5 og R6 som er like eller forskjelige er hydrogen, metyl eller etyl og R7 er hydrogen eller rettkjedet eller forgrenet alkyl med 1-18 karbonatomer, fenyl eller benzyl, foretrukket.

En annen gruppe foretrukne forbindelser med formel I er de hvori X er oksygen, R^, R2 og R3 som er like eller forskjellige, er hydrogen eller en 2-kloretylrest, R4, R5 og R6 er hydrogen, og R7 er hydrogen, benzyl, fenyl som er usubstituert eller substituert med en eller to karboksygrupper, eventuelt med en karboksygruppe substituert C1-4-alkyl eller fenyl-C1_4-alkyl, som eventuelt er substituert med 1 eller 2 karboksygrupper i fenyl- og/eller alkyldelen i resten.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av de nye 4-karbamoyloksy-oksazafosforiner med den generelle formel I karakteriseres ved at man omsetter et hydroksy-eller 4-metoksy- eller 4-etoksy-oksazafosforin med den generelle formel II

hvori R^, R2 og R3 har den samme betydning som i formel I og Y er hydrogen, metyl eller etyl, med et hydroksykarbamat-derivat med den generelle formel III hvori Z, R4 og X har den samme betydning som i formel I i nærvær av et inert oppløsningsmiddel, hvorved man oppnår forbindelser med formel I der A er gruppen >N(OH), når i formel III R4 står for hydrogen og Z for -NR5R7. Som egnet oppløsningsmiddel kommer i betraktning vann, lavalkylhalogenider som spesielt metylenklorid, laverealkylketoner slik som spesielt aceton, dietyleter, dimetylformamid (DMF), heksmetylfosforsyretriamid (HMPT) . eller lignende oppløsningsmidler henholdsvis blandinger av flere slike oppløsningsmidler. Reaksjonen gjennomføres ved temperaturer i området -35°C til +50°C, dvs. eventuelt under avkjøling, ved romtemperatur eller under oppvarming. Omsetningen kan skje i nærvær av en sur katalysator slik som en uorganisk syre, trikloreddiksyre, trifluormetansulfonsyre, p-toluensulfonsyre eller en Lewis-syre slik som A1C13, ZnCl2 eller TiCl4.

En ytterligere fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel I, hvor Z er -NR6R7 med R6 = H og R5 er hydrogen, karakteriseres ved at man omsetter et oksim med den generelle formel IV^er RI - R3 har den samme betydning som i formel I, i et inert oppløsningsmiddel ved en temperatur i området -70°C til +50°C, med en forbindelse med den generelle formel V

der X og R7 har den samme betydning som i formel I, hvorved det oppstår forbindelser med formel I der A er gruppen >N(0H) og Z gruppen -NHR7.

Eventuelt omdannes de oppnådde forbindelser til de tilsvarende salter.

Reaksjonen lar seg forfølge ved tynnsjiktskromatografi. Isolering av tynnsjiktskromatografisk enhetlige stoffer lykkes ved vanlige opparbeidingsmetoder for den slags produkter, spesielt ved krystallisering eller kromatografisk rensing. Strukturfastleggelsen skjer ved smeltepunkt-bestemmelse, tynnsjiktskromatografi, elementæranalyse og/eller IR- og <1>H-NMR-spektralanalyse.

De ifølge fremgangsmåten som utgangsstoffer anvendte forbindelser er i stor grad kjente og kan anvendes i krystal-linsk form eller som råprodukter og lar seg syntetisere som angitt nedenfor på i og for seg kjent måte.

4-hydroksy-oksazafosforiner oppnås ved reduksjon av 4-hydroksyperoksy-derivatene (f.eks. A. Takamizawa et al., "J. Med. Chem.<11>, 18, 376 (1975)). 4-metoksy- henholdsvis 4-etoksy-oksazafosforinene oppstår under sur katalyse fra 4-hydroksyderivatene i metanol henholdsvis etanol eller i inerte oppløsningsmidler som inneholder metanol henholdsvis

etanol. Hydroksyurinstoffderivatene fremstilles ved omsetning av tilsvarende substituerte isocyanater henholdsvis karbamid-syreklorider med hydroksylamin henholdsvis N-monosubstituerte

hydroksylaminer. På lignende måte kan man oppnå N-hydroksy-karbamidsyreestrene (hydroksykarbamater) ved omsetning av de tilsvarende klorkarbonsyreestre med hydroksylamin henholdsvis N-monosubstituerte hydroksylaminer. For syntese av hydroksyurinstoff- henholdsvis N-hydroksykarbamidsyreestre med en ytterligere hydroksy-, karboksy- eller sulfonsyregruppe er en syntesevei med beskyttelsesgruppe å anbefale.

Oksimene med formel IV kan oppnås via forskjellige synteser. Således kan de oppnås ved omsetning av tilsvarende 4-hydroksy-oksazafosforiner med hydroksylamin henholdsvis med hydroksylaminsalter, pH-verdien bør, hvis mulig, holdes mellom 2 og 7.

Fra 4-karbamoyloksy-oksazafosforinene ifølge oppfinnelsen kan man fremstille de racemiske cis- og trans-isomerer (cis = 2R,4R/2S,4S; trans = 2R.4S/2S,4R). Til-ordningen skjer i overensstemmelse med IUPAC-nomenklatur-reglene og med litteraturen over tilsvarende oksazafosforin-derivater. Cis- og henholdsvis transformen kan også fremstilles spesifikt, alt etter valg av reaksjonsbetingelsene.

Farmakologisk viser isomerene ingen signifikante forskjeller.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen utmerker seg ved bemerkelsesverdige kjemoterapeutisk verdifullle egenskaper. Sammenlignet med den tidligere kjente referansesubstans cyklofosfamid har de på eksperimentelle transplantasjons-tumorer hos rotter en tilnærmet like sterk cancerotoksisk kjemoterapeutisk virkning. De virker i vandig oppløsning direkte alkylerende og har in vitro en høy cytotoksisitet, mens cyklofosfamid trenger en enzymatisk aktivering og praktisk talt ikke virker cytotoksisk in vitro. Den akutte toksisitet for forbindelsene ifølge oppfinnelsen er ca. 4 ganger mindre enn referansesubstansen cyklofosfamid, det terapeutiske anvendelsesområdet er derved betraktelig utvidet. Også med henblikk på organotoksiske bivirkninger som leukocyttdepresjon og immunsupresjon oppviser forbindelsene ifølge oppfinnelsen tydelige fortrinn overfor referansesubstansen cyklofosfamid.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen egner seg til behandling av ondartede tumorer og lignende ondartede sykdommer som leukemi hos mennesker. Derved anvendes mengder i områder 0,01-100 mg/kg. De herved anvendte farmasøytiske preparater fremstilles i henhold til vanlige metoder under anvendelse av vanlige tilsetningsstoffer og bærere.

De følgende eksempler skal belyse oppfinnelsen nærmere uten å begrense den.

Eksempel 1

2-( bis-( 2- kloretvl)- amino)- 2- okso- tetrahvdro- 2H- l. 3. 2-oksazafosforin- 4- yl- oksv- urinstoff 15 g (54 mmol) 4-hydroksycyklofosfamid (det vil si 2-(bis-(2-kloretyl)-amino-4-hydroksy-tetrahydro-2H-l,3,2-oksazafosforin-2-oksyd) og 4,4 g (58 mmol) hydroksyurinstoff oppløses i 70 ml DMF som er surgjort med trikloreddiksyre til pH 3-4 og satt hen 20 timer ved 0°C i kjøleskap. Deretter ble krystallgrøten fortynnet med 70 ml eddiksyre og suget av etter 2 timer, vasket, tørket og omkrystallisert fra metanol. Utbytte: 11,3 g (62% av det teoretiske) av cisformen, smeltepunkt 139-143°C (under spalting).

Eksempel 2

2-( bis- f 2- kloretvl)- amino)- 2- okso- tetrahvdro- 2H- l. 3. 2-oksazafosforin- 4- yl- oksy- urinstoff. cis- form

1,1 g (4,0 mmol) 4-hydroksycyklofosfamid oppløses i metanol hvortil det er satt et spor trikloreddiksyre, og satt hen over natten ved -25°C hvoretter på mild måte metanol ble trukket av, resten tatt opp i lite metylenklorid, tørket og konsentrert til 1,2 g 4-metoksycyklofosfamid (det vil si 2-(bis-(2-kloretyl)-amino)-4-metoksy-tetrahydro-2H-l,3,2-oksazafosforin-2-oksyd. Deretter ble 1,2 g 4-metoksycyklofosfamid og 3+4 mg hydrdoksyurinstoff oppløst i 3 ml DMF og oppbevart 2 0 timer ved -25°C i kjøleskap. Krystallgrøten ble fortynnet med 3 ml eddiksyre, suget av, vasket, tørket og omkrystallisert fra metanol.

Utbytte: 11,3 g (62% av det teoretiske) av cis-formen, smeltepunkt 139-143°C (under spalting).

Eksempel 2

2-( bis-( 2- klkoretyl)- amino)- 2- okso- tetrahydro- 2H- l. 3. 2-oksazafosfarin- 4- yl- oksy- urinstoff. cis- form

1,1 g (4,0 mmol) 4-hydroksycyklofosfamid oppløses i metanol hvortil det er satt et spor trikloreddiksyre, og satt hen over natten ved -25°C hvoretter på mild måte metanol ble trukket av, resten tatt opp i lite metylenklorid, tørket og konsentrert til 1,2 g 4-metoksycyklofosfamid (det vil si 2-(bis-(2-kloretyl)-amino)-4-metoksy-tetrahydro-2H-l,3,2-oksazafosforin-2-oksyd. Deretter ble 1,2 g 4-metoksycyklofosfamid og 304 mg hydroksyurinstoff oppløst i 3 ml DMF og oppbevart 20 timer ved -25°C i kjøleskap. Krystallgrøten ble fortynnet med 3 ml eddiksyre, suget av, vasket, tørket og omkrystallisert fra metanol.

Utbytte: 670 mg (50% av det teoretiske) av det samme produkt

som i eksempel 1.

Eksempel 3

2- ( bis- f 2- kloretyl)- amino)- 2- okso- tetrahydro- 2H- l. 3. 2-oksazafosforin- 4- yl- oksy- urinstoff. trans- form

16 g (58 mmol) 4-hydroksycyklofosfamid og 5,2 g (68 mmol) hydroksyurinstoff ble oppløst i 160 ml vann, surgjort med trikloreddiksyre til pH 3-4 og satt hen i 20 timer ved 0°C i kjøleskap. Deretter ble krystallgrøten suget av, vasket med vann, tørket over P2O5 i høyvakuum og omkrystallisert fra metanol/kloroform. Utbytte: 12,7 g (65% av det teoretiske) av transformen av produktet ifølge eksempel 1 med smeltepunkt 148°C (under spalting). Eksempel 4 3- ( 2- kloretyl)- 2-( bis-( 2 1- kloretyl)- aminoi)- 2- okso- tetrahvdro- 2H- l. 3. 2- oksazafosforin- 4- vl- oksy- urinstoff 20 g (50 mmol) 4-hydroksytrofosfamid (det vil si 3-(2-kloretyl)-2-bis-(2-kloretyl)-amino)-4-hydroksy-tetrahydro-2H-1,3,2-oksazafosforin-2-oksyd og 5,3 (70 mmol) hydrok-syurinstof f ble oppløst i 100 ml DMF og avkjølt til -15°C. Deretter ble det hele surgjort med trikloreddiksyre til pH 3-4 og omrørt i 5 timer ved -15°C.

Etter henstand over natten ved 0°C ble reaksjonsopp-løsningen fortynnet med den dobbelte mengde vann. Deretter ble det hele rystet ut 4 ganger med 300 ml eddiksyre/metanol 1 forholdet 10:1, hvoretter de forenede esterfaser ble vasket

2 ganger med vann, tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum til 22 g olje. Etter opptak i eddiksyre/metanol

utkrystalliserte 4,2 g med smeltepunkt 106-110°C. Moderluten ble separert søylekromatografisk på silikagel med kloroform/- metanol i forholdet 10:1 og omkrystallisert sammen med det første krystallisat fra eddikester/metanol.

Utbytte: 7,0 g (35% av det teoretiske), smeltepunkt 115-116°C

(under spalting).

Eksempel 5

3- bensyl- l-\ 2 - fbis- f 2- kloretvl)- amino)- 2- okso- tetrahvdro- 2H-1. 3. 2- oksazafosforin- 4- yl- oksYl- urinstoff

Til 900 mg (3,25 mmol) 4-hydroksycyklofosfamid i 1 ml metylenklorid settes 540 mg (3,25 mmol) 3-benzyl-l-hydroksy-urinstoff i 40 ml aceton og en katalytisk mengde trikloreddiksyre. Blandingen oppbevares over natt ved -25°C, krystallene suges deretter av, vaskes med aceton og eter og omkrystalliseres fra eddiksyre.

Utbytte: 500 mg (40% av det teoretiske), semltepunkt 122-123"C (under spalting).

Eksempel 6

3-( o- bromfenvl)- l-[ 2-( bis-( 2- kloretyl)- amino) - 2- okso-tetrahydro- 2H- l. 3. 2- oksazafosforin- 4- yl- oksy1- urinstoff

560 g (2 mmol) 4-hydroksycyklofosfamid i 10 ml aceton tilsettes 460 mg 3-o-bromfenyl-l-hydroksyurinstoff og en katalytisk mengde trikloreddiksyre og settes hen ved -25'C.

Etter 2 dager suges krystallene av og omkrystalliseres fra aceton.

Utbytte: 320 mg (32% av det teoretiske), smeltepunkt 110-111'C (under spalting).

Eksemp_el_7

N- r2- fbis-( 2- kloretyl)- amino)- 2- okso- tetrahydro- 2H- l. 3. 2-oksazafosforin- 4- yl- oksyl- 4- morfolinokarboksamid

1,2 g (4,3 mmol) 4-hydroksycyklofosfamid i 15 ml aceton tilsettes 630 mg (4,3 mmol) N-hydroksy-morfolino-karboksamid og et spor trikloreddiksyre og oppbevares deretter ved -25°C. Etter 4 dager suges krystallene av og omkrystalliseres fra aceton.

Utbytte: 780 mg (45% av det teoretiske), smeltepunkt 123-124°C (under spalting).

Eksempel 49

Etyl- 2-( bis-( 2- kloretvl) - amino- 2- okso- tetrahydro-- 2H- l . 3. 2-oksazafosforin- 4- yl- oksv- karbamat

550 mg (2 mmol)4-hydroksycyklofosfamid og 210 mg (2 mmol) etylhydroksykarbamat (hydroksyuretan) ble oppløst i 5 ml tørr alkoholfri metylenklorid, tilsatt en katalytisk mengde trikloreddiksyre, tilsatt molekylsikt 4 A og satt hen ved -25°C i 3 dager. Deretter ble oppløsningen separert fra molekylsikten, vasket en gang i skilletrakt med fortynnet natriumhydrogenkarbonatoppløsning, den over natriumsulfat tørkede metylenkloridfase konsentrert i vakuum og fortynnet med eter. Etter 20 timers henstand ved -25°C ble krystallene suget av, vasket og tørket.

Utbytte: 290 mg (40% av det teoretiske), smeltepunkt 96°C.

Eksempel 50

Benzyl- 2-( bis-( 2- kloretyl)- amino- 2- okso- tetrahydro- 2H- l. 3. 2-oksazaforin- 4- yl- oksv- karbamat

750 mg (2,7 mmol) 4-hydroksycyklofosfamid og 450 mg (2,7 mmol) benzylhydroksykarbamat ble oppløst i 6 ml alkoholfri metylenklorid hvortil var satt noe trikloreddiksyre, satt hen ved -25°C i kjøleskap, filtrert etter 3 dager hvoretter moderluten ble fortynnet med 5 ml kloroform, vasket med vann, med fortynnet natriumhydrogenkarbonatoppløsning og en gang til med vann, tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum. Den oljelignende rest ble omkrystallisert fra eddikester/litt metanol.

Utbytte: 680 mg (59% av det teoretiske), smeltepunkt 112-114°C.

Eksempel 51

3- r2-( bis-( 2- kloretyl)- amino)- 2- okso- tetrahydro- 2H- l. 3. 2-oksazafosforin- 4- yl- oksy1- ureido - eddiksyre- cykloheksylamin-salt

a) 3- hydroksu- ureido- eddiksyre

56,5 g (0,28 mol) glycinbenzylester-hydroklorid ble

suspendert i 300 ml toluen og under omrøring ved en bad-

temperatur på 14 0°C ble det ført en tørr fosgengass i 2 timer. Deretter ble reaksjonsblandingen konsentrert i vakuum og resten destillert i høyvakuum.

Utbytte: 51 g (95% av det teoretiske) benzyl-isocyanato-acetat med kokepunkt 0,05: 100-102"C.

Til 28,7 g (0,15 mol) benzyl-isocyanato-acetat i 50 ml dioksan dryppes under omrøring og periodevis avkjøling 6,6 g (0,2 mol) hydroksylamin i 200 ml dioksan. Etter 1 times røring deretter ved romtemperatur ble det hele konsentrert i vakuum og resten omkrystallisert fra eddikester.

Utbytte: 28,1 g (83,6% av det teoretiske) benzyl-3-hydroksy-ureido-acetat med smeltepunkt 113-120°C.

22,4 g (0,1 mol) benzyl-3-hydroksy-ureido-acetat i 300 ml metanol ble tilsatt 5 g palladium-på-trekull og hydrert i en rystebeholder. Etter ca. 20 minutter var det tilsvarende hydrogenopptak avsluttet. Katalysatoren ble suget av, filtratet konsentrert i vakuum og den faste rest omkrystallisert fra dioksan.

Utbytte: 9,8 g (73% av det teoretiske) 3-hydroksy-ureido-eddiksyre, smeltepunkt 135'C. b) 2,4 g (18 mmol) 3-hydroksy-ureido-eddiksyre i 10 ml vann og 25 ml aceton ble tilsatt 6,1 g (2 mmol) 4-hydroksy-cyklofosfamid og satt hen over natten ved -25°C. Deretter ble det tilsatt 25 ml aceton og 1,8 g eller 18 mmol cykloheksylamin i 10 ml aceton, det hele ble suget av etter 2 timers henstand og omkrystallisert fra aceton med litt metanol.

Utbytte: 3,1 g (44% av det teoretiske), smeltepunkt 107-108°C.

Eksempel 52

3-[ N. N-( bis- f 2- kloretyl)- diamino- fosfinyl- oksy]- propion-aldehyd- oksim ( aldofosfamid- oksim

4,0 g (13,7 mmol) 4-hydroperoksycyklofosfamid suspenderes i 50 ml vann under isavkjøling og tilsettes 500 mg natrium-tiofosfat . 5 mol vann. Under omrøring ved 5-10°C ble pH-verdien kontrollert med et pH-meter og holdt mellom pH 4,5 og 5,5 med 2N svovelsyre, og det ble dyppet til en konsentrert oppløsning av natriumtiosulfat inntil pH-verdien ikke lenger steg. Det ble omrørt en halv time ved ca. 10°C, hvoretter det ble dryppet til en vandig oppløsning av 950 mg hydrok-sylaminhydroklorid. pH-verdien ble holdt på 5 med 2N natronlut, det hele ble satt hen over natt i kjøleskap ved 5°C, det ble ekstrahert 4 ganger med 50 ml eddikester hver gang, og de organiske ekstrakter ble etter tørking over natriumsulfat konsentrert i vakuum ved 30°C. Resten ble tatt opp i metylenklorid, og krystallene ble suget av etter 1 dag. Utbytte: 3,4 g (85% av det teoretiske), smeltepunkt 79-81°C.

Eksempel 53

3- p- bromfenvl- l-\ 2 -( bis- 2- kloretyl)- amino)- 2- okso- tetrahydro-2H- 1. 3. 2- oksazafosforin- 4- yl- oksy1- urinstoff

5,8 g (20 mmol) aldofosfamid-oksim i 60 ml aceton ble tilsatt 4 g (20 mmol) p-bromfenylisocyanat i 40 ml aceton og deretter omrørt i 5 timer under avkjøling. Etter 2 timer ble det avsugde krystallisat tørket under vakuum i en rotasjonsfordamper ved 40°C og omkrystallisert i metanol.

Utbytte: 8,1 g (82,8% av det teoretiske), smeltepunkt

118-120'C.

Eksemgel_54

m- trifluormetylfenyl- 1- f 2-( bis-( 2- kloretyl)- amino)- 2-oksotetrahydro- 2H- l. 3. 2- oksazafosforin- 4- yl- oksy1- urinstoff

7,3 g (25 mmol) aldofosfamidoksim i 80 ml aceton ble tilsatt 4,7 g (25 mmol) m-trifluormetylfenylisocyanat i 40 ml

aceton. Man omrørte 3 timer ved CC, det hele ble satt hen over natt i kjøleskap ved -25°C hvoretter det ble tilsatt 150 ml petroleter, og det hele ble suget av etter ytterligere henstand i kjøleskap over natt ved -25"C. Krystallisatet ble tørket ved 30'C og omkrystallisert fra isopropanol.

Utbytte: 9,2 g (76,8% av det teoretiske), smeltepunkt

91-93"C.

Eksemp_el_55_

3- cykloheksvl- 2-\ 2 -( bis-( 2- kloretyl)- amino)- 2- okso- tetrahydro- 2H- l. 3. 2- oksazafosforin- 4- yl- oksy]- urinstoff

5 g (18 mmol) aldofosfamidoksim og 2,2 g cykloheksyl-isocyanat ble oppløst i 10 ml aceton hver, slått sammen ved 0°C, og etter 2 timer ble krystallene suget av og ettervasket med aceton/eter. Utbytte: 4,2 g (56% av det teoretiske), smeltepunkt 113°C. Eksemp_el_56 3- etyl- l- r 2-( bis-( 2- kloretyl)- amino)- 2- okso- tetrahvdro- 2H-1. 3. 2- oksazafosforin- 4- yl- oksvl- urinstoff 5 g (18 mmol) aldefosfamidoksim og 1,2 g etyl-isocyanat ble hver oppløst i 15 ml aceton og slått sammen ved ca. 0°C. Etter 5 timer ble krystallisatet suget av og ettervasket med aceton/eter.

Utbytte: 3,5 g (54% av det teoretiske), smeltepunkt

lOl-C.

Eksempel_<57>

3-( fluoren- 2- vl)- 1- T2-( bis-( 2- kloretvl)- amino)- 2- okso-tetrahydro- 2H- l. 3. 2- oksazafosforin- 4- yl- oksyT- urinstoff

2,9 g (10 mmol) aldofosfamidoksim i 30 ml aceton ble tilsatt 2,1 g (10 mmol) fluorenyl-2-isocyanat i 20 ml aceton ved 0°C. Den neste dag ble det utfelte produkt suget av, tørket under vakuum ved 60°C og omkrystallisert fra isopropanol/metanol.

Utbytte: 2,5 g (40,1% av det teoretiske), smeltepunkt

114°C.

<Eks>emp_el_58

3- benzoyl- l- f 2- fbis-( 2- kloretyl)- amino- 2- okso- tetrahydro- 2H-1. 3. 2- oksazafosforin- 4- yl- oksy1- urinstoff

5,8 g (20 mmol) aldofosfamidoksim i 60 ml aceton ble tilsatt 2,9 g (20 mmol) benzoylisocyanat i 40 ml aceton. Det ble omrørt i5 timer i et isbad under nitrogenatmosfære hvoretter faststoffet ble suget av etter 2 timer, tørket i en rotasjonsfordamper ved 30°C og omkrystallisert fra metanol. Utbytte: 2,4 g (27,3% av det teoretiske), smeltepunkt

124-125°C.

Eksemp_el_59

3- p- nitrofenvl- 1- r 2- fbis- f 2- kloretyl)- amino)- 2- okso- tetrahydro- 2H- l. 3. 2- oksazafosforin- 4- yl- oksy1- urinstoff

Til 5,8 g (20 mmol) aldefosfamidoksim i 60 ml aceton ble det satt en oppløsning av 3,3 g (20 mmol) p-nitrofenyl-isocyanat i 40 ml aceton, hvoretter etter 2 timer det faste produkt ble suget av, tørket i rotasjonsfordamper ved 40°C og omkrystallisert fra dimetylformamid/etanol.

Utbytte: 6,7 g (73,5% av det teoretiske), smeltepunkt

117-118°C.

Den cytotoksiske aktivitet for forbindelser som fremstilles ifølge oppfinnelsen ble bestemt in vitro.

For bestemmelse av den cytotoksiske aktivitet in vitro ble i henhold til Schmåhl og Druckrey, "Naturwissen-schaften", 43., 199 (1956) nyoppnådde celler av Yoshida-Ascites-sarkomet inkubert i 2 timer ved 37°C med stigende konsentrasjon av prøvestoffene i Ringer-oppløsning. Etter utvasking av stoffene ble transplantabiliteten av tumor-cellene på ikke-behandlede forsøksdyr undersøkt. Ved å fastslå den konsentrasjon, EC50, ved hvilken halvparten av dyrenes videreutvikling av de etter inkubasjonen transplan-terte tumorceller forhindres, kan man oppnå en kvantitativ bestemmelse av den cytotoksiske aktivitet in vitro.

Dette inkubasjonsforsøk har vist seg spesielt gunstig for bedømmelse av den direkte cytotoksiske potens av alkylerende forbindelser og dermed for å skille mellom såkalte transport-og virksomme former. Cyklofosfamid som for virkning trenger en enzymatisk aktivering, er ennå ikke cytotoksisk virksom ved en konsentrasjon på 2600 jjg/ml, altså oppløselighets-grensen. I motsetning til dette er de her beskrevne forbindelser cytotoksisk virksomme in vitro ved konsentrasjoner fra 1 til 1000 pg/ml, det henvises til den følgende tabell.

Cytotoksisk aktivitet in vitro (37'C, 2 timer)

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av 4-karbamoyloksyoks-azafosforinderivater med cytostatisk virkning og med den generelle formel hvori , R2 og R3 er like eller forskjellige og betyr hydrogen eller 2-kloretyl og A er gruppen -ON(R4)- og R4 er en CX . —D ,,-alkylgruppe, X er oksygen og > Z benzylamino, fenylamino eller C1_4-alkylamino, eller R4 er hydrogen, X er oksygen og Z er benzyloksy eller C1_4~alkoksy, eller hvori A er gruppen -N(OH)- og Z er gruppen -NR5R7, X er oksygen eller svovel og Rg er hydrogen eller C1_4~alkyl, og R7 er hydrogen, benzoyl, cykloalkyl med 3-8 karbonatomer, rett eller forgrenet alkyl med 1-18 C-atomer, hvorved alkylresten også kan være substituert med -0H, -halogen, karboksy, karb-C1_2~ alkoksy, benzyloksykarbonyl eller -PO(CH3)2, eller hvori R7 betyr fenyl-C1_4~alkyl, som eventuelt er substituert med en karboksygruppe, eller hvori R7 er fenyl, hvorved fenylresten er usubstituert eller kan være substituert en eller to ganger med C1_4-alkyl, nitro, halogen eller trifluormetyl, og hvori R5 og R7 sammen med nitrogenatomet danner en piperidinring eller en morfolinring, samt farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved at man a) omsetter et 4-hydroksy- eller 4-metoksy- eller 4-etoksy-oksazafosforin med den generelle formel (II) hvori Rx, R2 og R3 har den samme betydning som i formel (I) og Y er hydrogen, metyl eller etyl, med et hydroksy-karbamatderivat med den generelle formel (III)

hvori Z, R4 og X har den samme betydning som i formel (I) i nærvær av et inert oppløsningsmiddel, hvorved man oppnår forbindelser med formel (I) der A er gruppen >N(OH), når i formel (III) R4 står for hydrogen og Z for -NR6R7, eller b) omsetter et oksim med den generelle formel (IV)

hvori Rx - R3 har den samme betydning som i formel (I), i et inert oppløsningsmiddel ved en temperatur i området —70"C til +50°C, med en forbindelse med den generelle formel (V)

hvori X og R7 har den samme betydning som i formel (I), hvorved det oppstår forbindelser med formel (I) der A er gruppen >N(0H) og Z gruppen -NHR7,

og eventuelt overfører de oppnådde forbindelser til de tilsvarende salter.