NO142175B

NO142175B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av sulfonater av s-adenosil-l-methionin

Info

Publication number: NO142175B
Application number: NO752499A
Authority: NO
Inventors: Alberto Fiecchi
Original assignee: Bioresearch Soc In Acc Semplic
Priority date: 1974-07-12
Filing date: 1975-07-11
Publication date: 1980-03-31
Also published as: FI751946A7; ES439316A1; GB1506640A; SU676169A3; ZA754167B; IE41421L; DK144946B; RO77525A; DK144946C; CH606085A5; NO142175C; CA1057681A; NL7508316A; DE2530898A1; FR2277590A1; JPS51125717A; DE2530898C2; AR221676A1; AU8295975A; IL47656A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte ved fremstilling av sulfonater av S-adenosil-L-methionin (SAM)_ T

SAM er særlig et produkt av naturlig opprinnelse, som finnes i alle levende organismer fra bakterier til planter, fra éncellede organismer til høyerestående pattedyr innbefattet mennesket, hvis struktur har vært kjent en tid og som illustreres av følgende formel:

hvor X er et ikke spesifisert anion

I levende organismer dannes SAM ved innvirkning av enzymer (S-adenosilmethioninsynthetasis eller S-adenosiltrans-ferasis) i det cytoplasmatiske område ut fra methionin som for-brukes som næringsmidler eller fra ATP som foreligger som energi-reserver i hver levende celle.

Det har også vært kjent i en viss tid at SAT! er et produkt av fundamental betydning i et stort antall biologiske reaksjoner ved enzymatisk transmethylering, hvorfor det alltid har vært betraktet som et meget viktig reagens innen biokjemien.

Det store problem med denne forbindelse har alltid vært dens store, ustabilitét ved eller over omgivende temperaturer, og fremgangsmåter, ved fremstilling av denne ér arbeidskrevende og . kan ikke lett utføres i industriell målestokk.

I de siste år har det vært forsket meget med henblikk på

å stabilisere SAM i en slik grad at det ér mulig å anvende denne, innen biologisk forskning, og imot fremstilling av salter som er stabile under normale temperaturer og fuktighet.

På denne måte er kloridet; og sulfatet av SAM blitt fremstilt, men disse kan bare anvendes som reagenser innen biokjemien i løpet av kort tid, på grunn av at deres stabilitet selv i tørr tilstand er begrenset ved lave temperaturer. Ennvidere er fremgangsmåten ved fremstilling av disse bare anvendbare ved fremstilling av små mengder, men ikke for fremstilling i industriell skala.

Der er nu ganske uventet funnet nye sulfonater av SAM

som er uendelig stabile med tiden ved temperaturer opp til 45°C,

og som kan fremstilles ved en fremgangsmåte som lett utføres øko-nomisk i industriell målestokk med høye utbytter.

Disse sulfonater har vist seg ganske overraskende å utvi-se en sterk legende styrke på mange områder innen medisinen, ofte tilsynelatende uten forbindelse mellom disse.

Oppfinnelsen angår således en analogifremgangsmåte for fremstilling av sulfonater av S-adenosil-L-methionin av formelen

hvor i

x = 0.1

n = 1.2

y = 0.5, 1, 1.5, 2,3,4

forutsatt at når: x = 0, er n = 1 og y = 3.4

x=0, ern=2ogy=1.5, 2

x=l, er n = 1 og y = 1.2

x=l, ern=2ogy=0.5,l

og hvori R er radikalet av en sulfonsyre valgt fra gruppen av methansulfonsyre, ethansulfonsyre, 1-n-dodecansulfonsyre, 1-n-octadecansulfonsyre, 2-klorethansulfonsyre, 2-bromethansulfonsyre,

2-hydroxyethansulfonsyre, 3-hydro.xypropansulfonsyre, d-r, 1-, d,l-10-kamfersulfonsyre, d-, 1^-, d, l~3-brQmkamfer^-lCH-s.ul f onsyre, cysteinsyre, benzensulfonsyre, p-klorbenzensulfonsyre, 2^mesityl-benzensulfonsyre, 4-bifenylsulfonsyre, 1-nafthalensulfonsyre, 2-nafthalensulfonsyre, 5-sulfosalicylsyre, p-acetylbenzensulfonsyre, 1,2-ethandisulfonsyre, O-benzendisulfonsyre og chondroitinsvovelsyre.

Det betydelige tekniske fremskritt som oppnåes ved disse nye sulfonater er deres stabilitet med tiden ved 45°C i tørr tilstand.

SAI'1-innholdet i alle disse sulfonater forblir uforandret selv efter 360 dager ved 45°C i tørr tilstand. De to hittil kjente mest stabile salter av SAM, kloridet og sulfatet, viser et SAM-innhold efter 30 dager ved 45°C i tørr tilstand på bare 20 % og 50 %, efter 60 dager er det førstnevnte fullstendig spaltet, mens sulfatet inneholder bare 5 % av det opprinnelige SAM.

Analogifremgangsmåten for fremstilling av de nye sulfonater av SAM er kjennetegnet ved at

a) der fremstilles en konsentrert, vandig oppløsning av SAM,

b) SAM tilstedeværende i den vandige oppløsning utfelles med en mettet oppløsning av picroloninsyre i vann eller i et organisk

oppløsningsmiddel som er oppløselig i vann,

c) det således utfelte picrolonat oppløses i en oppløsning av en sulfonsyre valgt fra gruppen bestående av methansulfonsyre,

ethansulfonsyre, 1-n-dodecansulfonsyre, 1-n-octadecansulfonsyre, 2-klorethansulfonsyre, 2-bromethansulfonsyre, 2-hydroxyethansulfonsyre, 3-hydroxypropansulfonsyre, d-, 1-, d,l-10-kamfersulfonsyre, d-, 1-, d,l-3-bromkamfer-10-sulfonsyre, cysteinsyre, benzensulfonsyre, p-klorbenzensulfonsyre, 2-mesityl-benzensulfonsyre, 4-bifenylsulfonsyre, 1-nafthalensulfonsyre, 2-nafthalensulfonsyre, 5-sulfosalicylsyre, p-acetylbenzensulfonsyre, 1,2-ethandisulfonsyre, O-benzendisulfonsyre og chondroitinsvovelsyre, eller i en oppløsning av angitte sulfonsyrer og svovelsyre,

d) SAM-sulfonatet eller sulfonat-sulfatet utfelles ved tilsetning av et organisk oppløsningsmiddel som er fullstendig blandbart

med det oppløsningsmiddel som anvendes i foregående trinn.

De første to trinn ved fremgangsmåten for fremstilling av doble salter med svovelsyre er identiske, mens de efterfølgende trinn kan utføres som følger: c<1>) Oppløsning av det filtrerte bunnfall i en blanding bestående av like volumdeler av et oppløsningsmiddel somdelyi.s er. blandbart med vann slik som methylethylketon, methylisobutylketon, n-butanol eller isobutanol og en vandig oppløsning av lik normalitet av Sn av de ovenfor angitte sulfonsyrer og svovelsyre.

d') Separering av det organiske lag og tilsetning til den vandige oppløsning av et keton eller alkoholisk oppløsningsmiddel som er fullstendig oppløselig i vann.

e') På nytt oppløsning av bunnfallet i en 10 - r 20 %s oppløs-^ ning av den anvendte syre i trinn c') i ett av de alkoholiske opp-løsningsmidler anvendt i trinn c) og behandling av oppløsningen med avfarvende carbon.

f) Tilsetning av et organisk oppløsningsmiddel som er istand til å utfelle det rene SAM-salt i krystallinsk og lett filtrerbar

form.

Ifølge en variant erholdes doble salter ved å underkaste det erholdte enkle salt efter det ovenfor angitte trinn d). følgen-de behandlinger: e') På nytt oppløsning av bunnfallet i en vandig oppløsning av like normaliteter av svovelsyre og den anvendte syre i det foregående trinn c) og behandling av oppløsningen med avfarvende carbon. f) Tilsetning av et organisk oppløsningsmiddel som er istand til å utfelle det rene SAM-salt i krystallinsk og filtrerbar form.

Trinn a) i fremgangsmåten kan utføres på forskjellige må-ter som er like effektive når det gjelder oppnåelse av en konsentrert oppløsning av SAM.

Ifølge en alternativ utførelsesform behandles gjær

(Saccharomyces Cerevisise, Torulopsis utilis, Candida utilis etc.)

anriket med SAM ved tilsetning av methionin under egnede betingelser [Schlenk, Enzymologia 29, 283 (1965)] med ethylacetat og der-efter med svovelsyre med en normalitet mellom 0,1 og 0,5, fortrinnsvis 0,35 N, ved omgivende temperatur for således å bevirke lyse av cellene og overf øring av praktisk talt 100 % av tilstedeværende SAM til oppløsningen.

Fortrinnsvis anvendes mengder av vann og acetat mellom 1/20 og 1/5 av vekten av de fuktige celler, og behandlingen ut-føres i løpet av 15 - 45 minutter, fortrinnsvis i løpet av 30 minutter.

Svovelsyre tilsettes deretter og lysen utføres i løpet av 1 - 2 timer, fortrinnsvis i løpet av 1,5 timer. Det skal bemerkes at lysen av gjærceller utført med en blanding av organisk løsningsmiddel og fortynnet svovelsyre er mer hensiktsmes-sig enn den som normalt utføres med perklorsyre ved omgivende temperatur, eller med maursyre eller eddiksyre ved 60° C og lig-nende, idet den ikke bare finner sted ved omgivende temperatur som er meget fordelaktig med hensyn til stabiliteten av SAM, men fordi den utføres under slike betingelser at løsningen lett kan filtreres fra celleresten, og inneholder ikke noe av de forurensninger som foreligger når de andre lyseringsmidler anvendes, og som er vanskelig å fjerne med de kjente metoder for fremstilling av rent SAM.

Ifølge et annet alternativ utføres trinn (a) ved fremstilling av SAM ved enzymatisk syntese ved virkning av enzymet ATP-methionin-adenosiltransferase (EC 2.4.2.12) på

en inkubasjonsblanding inneholdende adenosiltrifosfat (ATP) og methionin.

Den vesentlige betingelse for industriell utførelse av denne metode er at enzymet er rent og foreligger i en form som lett kan isoleres både fra den opprinnelige inkubasjonsblanding og fra det dannede SAM.

Det er funnet en fremgangsmåte for rensing av enzymet ATP-methionin-adenosiltransferase ved affinitetskroma-tografi plus en kolonnereaksjonsmetode, hvilket gjør det mulig å oppnå de ovenfor angitte mål.

Affinitetskromatografien av det spesifike enzym utføres ved perkolering av en løs-ning inneholdende dette, f.eks. et råekstrakt av gjær eller "Escherichia coli", gjennom en kolonne fyllt med en fast bærer til hvilken en gruppe er covalent bundet som virker som en kon-kurrerende inhibitor for enzymet.

Det er ganske overraskende funnet at et utmerket fyllstoff for en slik rensekolonne består av en aktivert gel av polysaccharider til hvilke L-lysin er blitt covalent bundet.

Affiniteten av det spesifike enzym til lysinresten bundet til den faste matrise bevirker en forsinkelse i eluering av enzymet fra kolonnen, og gjør det således mulig å oppnå en separasjon fra de andre proteiner i en meget ren tilstand.

Imidlertid har separasjonen av enzymet fra eluatet som inneholder dette, for bruk i ^neste enzymatiske syntesetrinn, gitt fullstendig utilfredsstillende resultater fordi dets stabilitet etter at det er separert avtar med tiden, og etter å ha vært anvendt én gang ved syntesen av SAM, ble det i tillegg ødelagt i den etterfølgende rensing av SAM.

Det er funnet at utmerkede resultater oppnåes ved å absorbere eluatet inneholdende det spesifike enzym på en egnet fast bærer og ved å utføre den katalytiske reaksjon mellom methionin og ATP i kolonnen, hvilket fører til dannelse av

SAM.

En egnet fast bærer består av et polysaccharid aktivert med et reagens som er egnet til å binde proteiner til faste bærere, slik som cyanogenbromid.

Ved percolering av en løsning av ATP og methionin i en egnet bufferløsning gjennom kolonnen erholdes det et eluat ved bunnen av kolonnen inneholdende SAM.

Trinn (b) muliggjør en separering av SAM i meget ren tilstand. I sure omgivelser vil den eneste forbindelse som utfelles av picrolinsyre faktisk være SAM, som vist ved tynnskiktskromatografi ifølge Anal. Biochem. 4, 16 - 28 (1971).

Picroloninsyre har således en overraskende selektiv virkning. De tidligere anvendte utfellingsmidler slik som picrinsyre, Reinecke-salt eller borsyre, gir meget urene bunnfall som alltid krever etterfølgende rensing av SAM ved ione-byttekromatografi, en fremgangsmåte som er meget kostbar og vanskelig å utføre industrielt. Det er også vanskelig å oppnå produktet med den nødvendige renhet.

Anvendelse av vandige oppløsninger av picroloninsyre eller oppløsninger av denne syre i de tidligere angitte organiske oppløsningsmidler medfører spesielle problemer, og er en metode som utføres ved omgivende temperaturer.

Trinn (c)_ utføres fortrinnsvis med oppløsninger innehold dende én av de ovenfor angitte sulfonsyrer i konsentrasjoner mellom 0,25 og 1,5 N, fortrinnsvis 1 N, og med ett av de angitte alkoholiske oppløsningsmidler.

Spaltningen av utgangsmaterialet med picroloninsyren av SAM er fullstendig når total o<p>pløsning av det faste materiale opp-nåe s.

Trinn (d) ved fremgangsmåten utføres fortrinnsvis under anvendelse av 4 - 10 volum (i forhold til volumet av den alkoholiske oppløsning) av et oppløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av benzen, methylisobutylketon, methyl eller ethylacetat eller tetra^ hydrofuran.

De enkle SAM-salter som erholdes ifølge foreliggende oppfinnelse kan lagres i tørr tilstand uendelig praktisk talt uten forandring som tidligere angitt.

Fremgangsmåten utelukker vann efter utfelling med picroloninsyre, og sikrer derfor fullstendig fravær av minimale spor av forurensninger som er oppløselige i vann. Doble salter av SAM med svovelsyre og én av de valgte sulfonsyrer ifølge den første variant erholdes fortrinnsvis ved å utføre trinn (c') med vandige oppløs-ninger inneholdende én av de ovenfor angitte sulfonsyrer og svovelsyre i konsentrasjoner begge på mellom 0,05 og 0,2 N, fortrinnsvis 0,1 N, i et organisk oppløsningsmiddel som delvis er blandbart med vann slik som methylethylketon eller n-butanol. Anvendelsen av det organiske oppløsningsmiddel muliggjør at den vandige syreoppløsning kan reduseres og fjerner praktisk tall picroloninsyren. Trinn (d') utføres fortrinnsvis under anvendelse av 4-8 volum (i forhold til den vandige oppløsnings volum) av et oppløsningsmiddel valgt fra gruppen omfattende aceton, methylalkohol, ethylalkohol og propylal-kohol.

Det er også ganske overraskende funnet.at hvis det i trinn (e') anvendes den minimale mengde nødvendige alkohol for å oppløse bunnfallet som stammer fra trinn (d1), separeres det doble salt SAM<+.>HS04~.H2S04.2R-S03H i det etterfølgende utfel-lings trinn (f') •

Hvis imidlertid et volum alkohol lik minst det dob-belte av det nødvendige volum anvendes i trinn (e'), separeres det doble salt SAM+ .HS04~.H2SC>4 .R-SO-jH i det etterfølgende utfellingstrinn (f').

Anvendelse av mellomliggende mengder av denne alkohol fører til dannelse av blandinger av de to salter.

R-SO^H angir en hvilken som helst av de ovenfor angitte sulfonsyrer eller den ekvivalente syre når det gjelder ethandisulfonsyre eller chondroitinsulfonsyre.

Den endelige utfelling av det ene eller det aridre av de nye salter ifølge oppfinnelsen (trinn f) krever anvendelse av et organisk løsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av benzen, toluen, diethylether, diisopropylether, kloroform, aceton, methylethylketon, methylisobutylketon, methyl eller ethylacetat, isoamylalkohol eller tetrahydrofuran.

Som angitt kan de doble salter av SAM som erholdes ifølge foreliggende oppfinnelse lagres uendelig i tørr tilstand, praktisk talt uten forandring.

Utfellingen av doble salter av SAM med svovelsyre og én av de ovenfor angitte sulfonsalter- under anvendelse av den andre variant består av påny oppløsning (trinn e") av saltet erholdt i trinn (d) i en løsning av lik normaliteter, vanligvis mellom 0,05 og 0,2 N og fortrinnsvis 0,1N, av svovelsyre og den anvendte syre i det foregående trinn (c) i én av alkoholene inneholdende 1-4 carbonatomer eller i 2-methoxyethanol eller 2-ethoxyethanol.

Det er også ganske overraskende funnet at hvis det i trinn (e") anvendes den minimale nødvendige mengde av alkohol for å løse bunnfallet som stammer fra trinn (d), utfelles det doble salt SAM<+.>HS04~.H2S04.2R-SO3H (hvor R-S03H angir en hvilken som helst av de sulfonsyrer eller representerer den ekvivalente syre av ethandisulfonsyre eller chondroitinsvovelsyre) i det etterfølgende utfellingstrinn (f").

Hvis imidlertid et volum av methanol lik minst det doble av det nødvendige minimale volum anvendes i trinn (e"), utfelles det doble salt SAM+.HS04".H2S04 R-SO3H i det etter-følgende utfellingstrinn (f"). Anvendelse av mellomliggende mengder alkohol fører til dannelse av blandinger av de to salter.

Den endelige utfelling av det ene eller det andre av de doble salter (trinn f") krever anvendelse av et organisk løs-ningsmiddel valgt fra gruppen bestående av benzen, toluen, diethylether, diisopropylether, kloroform, alkoholer med 4 og 5 carbonatomer, ethyl- og methylacetat, tetrahydrofuran,

aceton, methylethylketon og methylisobutylketon.

De etterfølgende eksempler illustrerer fremstilling

av de nye salter ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

Til 90 kg gjær anriket med SAM (6,88 g)kg) ifølge Schlenk (Enzymologia 29, 283 (1965)) ble tilsatt 11 liter ethylacetat og 11 liter vann ved omgivende temperatur. Etter kraftig omrøring i 30 minutter ble 50 liter 0,35 N svovelsyre tilsatt idet omrøringen ble fortsatt i ytterligere 1,5 timer. Etter filtrering og vasking med vann ble det erholdt 140 liter av en løsning inneholdende 4,40 g/l SAM, lik 00,5 % av det tilstedeværende utgangsmateriale. En løsning av 2,3 kg picroloninsyre i 25 liter methylethylketon ble tilsatt til løsningen under om-røring. Etter henstand over natten ble bunnfallet fraskilt ved sentrifugering og vasket med vann.

Bunnfallet ble oppløst under omrøring ved omgivende temperatur i 6,2 liter av en 1 N løsning av methansulfonsyre i methanol. Etter filtrering av spor av løselige materiale, ble 50 liter aceton tilsatt løsningen. Etter fullstendig bunnfel-ling av det utfelte materiale, ble den overliggende løsning de-kantert fra og det uløselige residuum vasket med litt aceton.

Bunnfallet ble løst i 25 liter av en 0,25 N løsning methansulfonsyre i methanol, avfarvende carbon ble tilsatt og løsningen ble filtrert. 125 liter methylisobutylketon ble tilsatt til filtratet.

1089 g krystallinsk og lett filtrerbart salt utfel-tes, løselig til mere enn 20 % i vann under dannelse av en farveløs løsning. Saltet er bare svakt løselig i vanlige organiske løsningsmidler. Fra tynnskiktskromatografi ifølge Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971) viste produktet seg å være fritt

for enhver forurensning. De analytiske data er oppført i tabell 1 og stemmer overens med en forbindelse av formelen: <C>15<H>23<N>6°5<S-><4><CH>4°3<S->

Den nye forbindelse ble også identifisert ved den enzymatiske metode som er basert på enzymatisk methylering av nicotinamid og guanidineddiksyre med SAM (G.L. Cantoni, J.Biol. Chem. 189, 745 (1951), G. de La Hoba, B.A. Jameison, S.H. Mudd and H.H. Richards, J. Am. Chem. Soc. 81 3975 (1959)).

Ved å gjenta fremgangsmåten men anvende n-dodecansulfonsyre og 1-n-octadecansulfonsyre, ble det erholdt salter med følgende formler: <C>15<H>23<N>6°5<S>' <4C>14<H>26°3<S> °<9><C>15<H>23<N>6°5<S>- <4C>18<H>38°3<S>

hvis analytiske data er oppført i tabell 1.

Eksempel 2

1,15 kg picroloninsyre løst i 10 liter isobutylalko-hol ble tilsatt til 70 liter løsning som stammer fra lysen av gjærceller, erholdt under anvendelse av samme råmateriale og samme metode som beskrevet i eksempel 1.

Etter henstand over natten ble det dannede bunnfall fraskilt ved sentrifugering.

Bunnfallet ble løst ved omgivende temperaturer under omrøring i 3,1 liter av en IN løsning av ethansulfonsyre i ethanol. Etter filtrering av en liten mengde uløselige bestand-deler, ble 25 liter diethylether tilsatt til løsningen. Etter henstand ble blandingen filtrert og det. faste materiale vasket med litt eddik. Det faste materiale ble løst i 12,5 liter av en 0,25N løsning av ethansulfonsyre i ethanol, avfarvende carbon ble tilsatt og blandingen ble filterert. 63 liter benzen bon ble tilsatt og blandingen ble filtrert. 63 liter benzen ble tilsatt til filtratet.

585 g salt ble utfelt og filtrert og tørket. Forbindelsen er løselig i vann til mer enn 20 %, og er svakt løselig i vandige organiske løsningsmidler. Fra tynnskiktskromatografi som beskrevet i eksempel 1 viste forbindelsen seg å være fri for enhver forurensning. De analytiske data er oppført i tabell 1 og stemmer overens med et produkt med formelen: <C>15<H>23<H>6°5<S>- <4><C>2<H>6°3<S->

Den nye forbindelse ble også identifisert ved den enzymatiske metode som er beskrevet i eksempel 1.

Ved å gjenta fremgangsmåten, men anvende 2-bromethansulfonsyre og 2-klorethansulfonsyre, ble det erholdt salter av følgende formler:

<C>15<H>23H6°5S- 4C2H5S03Br og C^H^NgOgS. ^H^Cl

hvis analytiske data er oppført i tabell 1.

Eksempel 3

1,15 kg picroloninsyre løst i 12 liter n-butanol ble tilsatt til 70 liter løsning som stammer fra lysen av gjærceller, erholdt ved den samme lysemetode og med samme^råmateriale som beskrevet i eksempel 1. Etter henstand over natten ble bunnfallet fraskilt ved sentrifugering. Bunnfallet ble løst ved omgivende temperatur under omrøring i 3,1 liter av en IN løsning av D,L-10-kamfersvovelsyre i 1-propanol. 25 liter benzen ble deretter tilsatt. Det fraskilte faste materiale ble løst i 12,5 liter av en 0,25N løsning av kamfersvovelsyre i 1-propanol og etter tilsetning av carbon og filtrering ble 63 liter aceton tilsatt til filtratet.

Det ble erholdt 928 g salt. Forbindelsen er løselig i vann til mere enn 20 % og er svakt løselig i vanlige organiske løsningsmidler. Fra tynnsjiktskromatografi viste forbindelsen seg å være fri for enhver forurensning.

De analytiske data er oppført i tabell 1 og stemmer overens med et produkt av formelen: <C>15<H>23<N>6°5<S>- <4C>10<H>16°4<S>-

Ved å gjenta fremgangsmåten men anvendé d-3-kamfer-10-svovelsyre, ble det erholdt et salt av formel: <C>15<H>23N6°5S' 4C10H15°4SBr' nvis analytiske data er oppført i tabell 1.

Eksempel 4

Rensing av det spesifike enzym

50 ml Sepharose (polysaccharid fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverie) sammenklumpet og suspendert i vann, ble behandlet med cyanogenbromid ifølge kjente metoder for å binde substanser inneholdende aminogrupper til matriser

bestående av polysaccharidgel. Et overskudd av L-lysin ble tilsatt til den således fremstilte gel. Etter omsetningen ble den gjentatte ganger vasket med destillert vann, med en pH 8,5 puf-ferblanding og med en pH 4,5 bufferblanding. Gelen ble deretter anvendt for å pakke en kolonne med en diameter på 1,5 cm og en høyde på 30 cm. En bufferblanding bestående av 0,05M triethanolamin og 0,01 M H2SO4 med pH 8,0 ble ført gjennom kolonnen inntil det ble erholdt fullstendig likevekt. 2 ml gjær-ekstrakt inneholdende det spesifike enzym, erholdt ved sonifi-kering eller homogenisering med tørr, is og eventuelt etter an-rikning med det spesifike enzym, ble fyllt på kolonnen. Kolonnen ble deretter eluert med den samme bufferblanding som ble anvendt for likevekt-behandlingen, og fordelingen av proteinene i eluatet ble fulgt ved ultrafiolett spektrofotometriske målin-ger. Samtidig ble synteseaktiviteten målt i de forskjellige fraksjoner ifølge J.A. Stekol, Methods in Enzymology, vol. 6, s. 566 (1963). De fraksjoner som utviste en relevant synteseaktivitet ble slått sammen og den således erholdte løsning utviste en spesifik aktivitet på minst tyve ganger større enn råekstraktets. Enzymet kan ytterligere konsentreres i denne løsning ved utfelling med salter, med organiske løsningsmidler eller etter andre kjente metoder for konsentrering av protein-løsninger.

Fremstilling av SAM

30 ml sammenklumpet Sepharose-gel ble aktivert med cyanogenbromid eller etter annen kjent metode for å binde proteiner til polysaccharid-gelmatriser. 4 ml av en løsning av det spesifike enzym renses som ovenfor beskrevet og inneholdende 100 mg protein tilsatt til den aktiverte gel. Den

aktiverte gelsuspensjon og enzymløsningen ble omrørt ved 4° C i 18 timer. Harpiksen ble vasket med vann. Vaskevæsken inneholdt ca. 70 % av den totale enzymatiske aktivitet som opprin-nelig var tilstede i løsningen av det spesifike enzym. Ved inkubering av Sepharose fremstilt som ovenfor angitt méd den ovenfor angitte metode for bestemmelse av synteseaktivitet, ble det observert at ca. 20 % av den totale aktivitet er bundet til polysaccharidet.

Sepharose fremstilt som ovenfor angitt ble anvendt for å pakke en kolonne med en diameter på 1,5 cm og en høyde på 20 cm. En løsning inneholdende 0,675 M triethanolamin, 0,150 M magnesiumsulfat, 0,05 M ATP, 0,05 M M-methionin og 0,01 M KC1 ble ført gjennom kolonnen med en hastighet på 5 ml pr. time og ved en temperatur på 25 - 27° C. Eluatet fra kolonnen ble analysert med hensyn til SAM-innhold og viste at omdan-nelsen var 30 %.

Fremstilling av SAM- p- klorbenzensulfonat

103 ml eluat inneholdende 6 g/liter SAM ble surgjort med svovelsyre inntil en pH på 3 ble nådd, og til denne ble tilsatt under omrøring en løsning av 2 - 3 g picroloninsyre i 25 ml methylethylketon.

Etter henstand over natten ble bunnfallet filtrert og vasket med vann. Bunnfallet ble på nytt oppløst i 6,2 ml av en IN løsning av p-klorbenzensulfonsyre i 2-methoxyethanol. 50 ml toluen ble deretter tilsatt. Det fraskilte faste materiale ble løst i 12,5 ml av en 0,25N løsning av p-klorbenzensulfonsyre i 2-methoxyethanol og etter tilsetning av carbon og filtrering,

ble.60 ml kloroform tilsatt til filtratet..

1,43 g salt ble erholdt. Forbindelsen er løselig i vann til mere enn 20 % og bare svakt løselig i vanlige orga-

niske løsningsmidler. Fra tynnskiktskromatografi viste saltet seg å være fri for enhver forurensning.

De analytiske data er anført i tabell 1 og stemmer overens med en forbindelse av formelen:

Ved å gjenta fremgangsmåten, men anvende p-acetylbenzensulfonsyre, o-benzendisulfonsyre, 4-bifenylsulfonsyre, 2-mesitylensulfonsyre og 5-sulfosalicylsyre, ble salter av følgende formler erholdt:

hvis analytiske data er angitt i tabell 1.

Eksempel 5

Bunnfallet erholdt etter tilsetning av picroloninsyre til 70 liter løsning som beskrevet i eksempel 1, ble løst ved omgivende temperatur under omrøring i 3,1 liter av en IN løs-ning av 1,2-ethandisulfonsyre i methanol. 25 liter aceton ble deretter tilsatt. Det fraskilte faste materiale ble løst i 12,5 liter av en 0,25N løsning av 1,2-ethandisulfonsyre i methanol og etter tilsetning av carbon og filtrering ble 60 liter methylisobutylketon tilsatt til filtratet .

546 g salt ble erholdt. Forbindelsen var løselig til mere enn 20 % i vann og var bare svakt løselig i vanlige organiske løsningsmidler. Fra tynnskiktskromatografi viste forbindelsen seg å være fri for enhver forurensning.

De analytiske data er oppført i tabell 1 og stemmer overens med en forbindelse av formelen:

Eksempel 6

Bunnfallet erholdt etter tilsetning av picroloinsyre til 70 liter løsning som beskrevet i eksempel 1, ble løst ved omgivende temperatur under omrøring i 3,1 liter av en IN løs-ning av 2-hydroxyethansulfonsyre i ethanol.

25 liter methylisobutylketon ble tilsatt.

Det fraskilte faste materiale ble løst i 12,5 liter av en 0,25N løsning av 2-hydroxyethansulfonsyre i etanol og etter tilsetning av carbon og filtrering, ble 80 liter tetrahydrofuran tilsatt til filtratet. 632 g salt ble erholdt. Forbindelsen er løselig i vann til mere enn 20 % og bare svakt løselig i vanlige organiske løsningsmidler. Fra tynnskikts-kromatograf i ble forbindelsen funnet å være fri for enhver forurensning.

Den nye forbindelse ble også identifisert ved den enzymatiske metode som er beskrevet i eksempel 1. Ved å gjenta fremgangsmåten men anvende 3-hydroxypropansulfonsyre, ble det erholdt et salt av formelen:

hvis analytiske data er angitt i tabell 1.

Eksempel 7

Bunnfallet erholdt etter tilsetning av picroloninsyre til 70 liter løsning som beskrevet i eksempel 1, ble løst ved omgivende temperatur under omrøring i 3,1 liter av en IN løs-ning av 1-nafthalensulfonsyre i methanol.

25 liter methylethylketon ble deretter tilsatt. Det fraskilte faste materiale ble løst i 12,5 liter av en 0,25N løsning av 1-nafthalensulfonsyre i methanol, og etter tilsetning av carbon og filtrering, ble filtratet tilsatt til 70 liter methylethylketon. 717 g salt ble erholdt. Forbindelsen er løselig i vann til mere enn 20 % og er bare svakt løselig i vanlige organiske løsningsmidler. Fra tynnskiktskromatografi ble forbindelsen funnet å være fri for enhver forurensning.

De analytiske data er oppført i tabell 1 og svarer til en forbindelse av formelen:

Eksempel 8

Bunnfallet erholdt etter tilsetning av picroloninsyre til 70 liter løsning som beskrevet i eksempel 1 ble løst ved omgivende temperatur under omrøring i 3,1 liter av en IN løs-ning av 2-nafhtalensulfonsyre i 2-propanol. 25 liter diisopropylether ble deretter tilsatt. De fraskilte faste materiale ble løst i 12,5 liter av en 0,25N løsning av 2-nafthalensulfonsyre i methanol, og etter tilsetning av carbon og filtrering ble 70 liter ethylacetat tilsatt til filtratet. 710 g salt ble erholdt. Forbindelsen er løse-lig i vann til mere enn 20 % og er bare svakt løselig i vanlige organiske løsningsmidler. Fra tynnskiktskromatografi ble forbindelsen funnet å være fri for enhver forurensning.

De analytiske data er oppført i tabell 1 og svarer til et produkt av formelen:

Eksempel 9

Bunnfallet erholdt etter tilsetning av picroloinsyre til 70 liter løsning som beskrevet i eksempel 1, ble løst ved omgivende temperatur under omrøring i 3,1 liter av en IN løs-ning av benzensulfonsyre i 2-butanol. 25 liter diisopropylether ble deretter tilsatt. Det fraskilte faste materiale ble løst i. 12,5 liter av en 0,25N løsning av benzensulfonsyre_i methanol, og etter tilsetning av carbon og filtrering, ble 65 liter ethylacetat tilsatt til filtratet. 612 g salt ble erholdt. Forbindelsen er løselig i vann til mere enn 20 % og er bare svakt løselig i vanlige organiske løsningsmidler.

Fra tynnskiktskromatografi ble forbindelsen funnet å være fri for enhver forurensning.

De analytiske data er oppført i tabell 1 og stemmer overens med et produkt av formelen:

Forbindelsen ble også identifisert ved den enzymatiske metode som er beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 10

Bunnfallet erholdt etter tilsetning av picroloninsyre til 103 ml løsning som beskrevet i eksempel 4, ble løst ved omgivende temperatur under omrøring i 6,2 ml av en IN løsning av chondroitinsvovelsyre i methanol. 50 ml aceton ble deretter tilsatt. Det fraskilte faste materiale ble løst i- 25 ml av en 0,25N løsning av chondroitinsvovelsyre i methanol, og etter tilsetning av carbon og filtrering, ble 125 ml methylisobutylketon tilsatt til filtratet.

3,27 g salt ble erholdt. Forbindelsen er løselig i vann til mere enn 20 % og er bare svakt løselig i vanlige organiske løsningsmidler. Fra tynnskiktskromatografi ble forbindelsen funnet å være fri for enhver forurensning. De analytiske data er oppført i tabell 1 og stemmer overens med et produkt av formelen:

Eksempel 11

Bunnfallet erholdt etter tilsetning av picroloninsyre til 103 ml løsning som beskrevet i eksempel 4, ble løst ved omgivende temperatur under omrøring i 6,2 ml '.av en IN løsning av cystein i 2-ethoxyethanol. 50 ml dimethylacetat ble deretter tilsatt. Det fraskilte faste materiale ble løst i 25 ml av en 0,25N løsning av cysteinsyre i 2-ethoxyethanol, og etter tilsetning av carbon og filtrering ble 125 ml methylaceatt tilsatt til filtratet. 1,53 g salt ble erholdt. Forbindelsen er løselig i vann til mere enn 20 % og er bare svakt løselig i vanlige organiske løsningsmidler. Fra tynnskiktskromatografi ble forbindelsen funnet å være fri for enhver forurensning.

Eksempel 12

Fremstilling av doble salter av SAM med svovelsyre og methansulfonsyre

103 ml eluat inneholdende 6 g/liter SAM erholdt som be^-skrevet i eksempel 4 ble surgjort med H2S04 inntil en pH på 3 ble nådd, og til denne ble tilsatt under omrøring en løsning av 2,3 g picroloninsyre i 25 ml methylethylketon (løsningsmiddel a).

Etter henstand over natten ble bunnfallet filtrert og vasket med vann. Bunnfallet ble på nytt løst i 18 ml av en 0,1N løsning av H2S04 og methansulfonsyre, og i 18 ml methylethylketon (løsningsmiddel a).

Etter omrøring og henstand ble et organisk lag fraskilt og det vandige lag ristet med litt methylethylketon for å fjerne det siste spor av picroloninsyre. Etter separering av vannlaget, ble avfarvende carbon tilsatt og blandingen filtrert. 16,5 ml vandig farveløs løsning ble erholdt, inneholdende 33,8 g SAM, lik 90 % av det SAM inneholdt i den opprinnelige løsning. Ved tynnskiktskromatografi ble det funnet at løs-ningen inneholdt bare SAM. 16,5 ml av løsningen ble heldt over i 100 ml aceton (løsningsmiddel b). Etter omrøring og henstand ble væsken fraskilt ved dekantering. Det faste materiale ble løst i 6,6 g av en 15 %-ig løsning av methansulfonsyre i methanol (løsningsmiddel c).

Etter tilsetning av avfarvende carbon og filtrering ble løsningen heldt over i 25 ml ethylether (løsningsmiddel d). Det ble filtrert etter henstand og det erholdte godt krystal-linske salt veide 1,2 g og hadde sammensetningen:

Dets analytiske karakteristika er oppført i tabell 2.

Ved å gjenta fremgangsmåten men anvende de sulfonsyrer og løsningsmidler som var angitt i tabell 2, ble det erholdt de doble salter som var oppført i tabell 2 ved de der angitte analytiske karakteristika. Ved å gjenta fremgangsmåten men ansende 3,3 g av en 15 %-ig løsning av methansulfonsyre i methanol, ga det etterfølgende utfellingstrinn med 25 ml ethylether (løsningsmiddel d) 1,05 g salt med sammensetning SAM<+.>HS04~.H2S04.CH3S03H, hvis analytiske karakteristika er anført i tabell 3.

Ved å gjenta fremgangsmåten men anvende de sulfonsyrer og løsningsmidler som er angitt i tabellen ble de i tabell 3 angitte salter erholdt med de der angitte analytiske karakteristika.

Eksempel 13

Fremstilling av doble salter av SAM med svovelsyre og 2- hydroxyethansulfonsyre

Saltet erholdt fra den første utfelning av SAM med 2-hydroxyethansulfonsyre som beskrevet i eksempel 6, ble på nytt oppløst i 20 liter av en løsning av 0,1N svovelsyre og 0,1N 2-hydroxyethansulfonsyre i methanol (løsningsmiddel a). Den ble filtrert etter tilsetning av avfarvende carbon og 100 liter methylisobutylketon (løsningsmiddel b) ble tilsatt til filtratet.: Blandingen ble filtrert etter henstand og 587 g salt med sammensetning SAM+.HS04 .H2S04.2C2Hg04S ble erholdt med de analytiske karakteristika som er oppført i tabell 4.

Ved å gjenta fremgangsmåten men anvende 10 liter av en løsning av 0,1N svovelsyre og 0,1N 2-hydroxyethansulfonsyre i methanol (løsningsmiddel a), ga den etterfølgende utfelning med methylisobutylketon (løsningsmiddel b) 505 g salt med sammensetning: SAM+ .HS04"".H2S04 .C2Hg04S, hvis analytiske karakteristika er angitt i tabell 5. Ved å gjenta fremgangsmåten, men anvende enkle SAM-salter inneholdende de anioner som er oppført i tabell 5 og anvende de i tabell 5 angitte løsnings-midler, ble det erholdt doble salter med analytiske karakteristika som angitt i tabell 5. Ved å gjenta fremgangsmåten men anvende 3,3 g av en 15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i. methanol, ga den etterfølgende utfelning med 25 ml ethylether 1,18 g av saltet SAM<+>.HS04~.H2S04.2CH3HgS03H, som hadde de samme karakteristika som angitt for produktet ifølge eksempel 1.

I noen. år har det vært kjent fra biokjemisk folkning at SAM er den eneste spesifike donator av methylgrupper i levende organismer for de biokjemiske reaksjoner for overføring av CH-j-gruppen, hvilke er fundamentale reaksjoner i den lipide, protéide og glucide metabolisme.

I det etterfølgende er det angitt enkelte av de mest viktige SAM-avhengige transmethyleringsreaksjoner: a) N-transmethylering: adenin, carnitin, carnosin, creatin, 2,6-diaminopyrin, adrenalin, guanin, hordenin, N'-nicotinamid, fosfatidilcolin, ricinin, b) O-transmethylering: N-acetylserotonin, dopamin, epinin, d-adrenalin, 1-adrenalin, ergosterol, 1-noradrenalin,

pectin, ubikinon,

c) S-transmethylering: 2,3-dimercaptopropanol, H^S, methionin, methylmercaptan, S-mercaptopropionsyre, S-mercaptoethanol,

thiopyrimidin, thiouracyl,

d) C-transmethyleing: cytosin, thymin.

Med hensyn til den menneskelige organisme betyr dette

at SAM virker i de følgende metabole prosesser:

biosyntese av cholin, biosyntese av fosfatidylcolin, aktivitet av enzymer som krever SH-grupper, metabolisme av catecholaminer, metabolisme av biogene centroencefaline aminer, metabolisme av serotonin, metabolisme av histamin, metabolisme av vitamin Bl2 og folsyre, metabolisme av creatin, metabolisme av myosin, metabolisme av histoner, metabolisme av RNA, metabolisme av DNA, metabolisme av proteinsubstanser, metabolisme av enkelte hor-moner av cyclopentan-perhydrofenantrenkjerner, - den viktigste av disse er østrogener, metabolisme av triglycerider.

Det har også vært kjent en tid at SAM, når denne demethyleres av methyltransferase-enzymer, overføres til S-adenosilhomocystein (SAO) som er en indirekte donator av hydro-sulfidgrupper og således spiller en viktig rolle i metabolismen av alle forbindelser som krever SH-grupper for å kunne utføre den biologiske aktivitet. Særlig viktig blandt disse er enkelte thioenzymer og sulfurerte aminosyrer.

SAO decarboxyleres i sin tur i organismen, og det decarboxylerte produkt er den prinsipale donator av aminopropylgruppen, hvilken ifølge den ferskeste biokjemiske lære, er uunnværlig for biosyntesen av polyaminer. Prosessen kan kata-lyseres av flere enzymer innbefattet den spesifike aminopropyl-transferase.

Man kan konkludere med at det er kjent at SAM i den menneskelige organisme er nært sammenkoblet med alle biokjemiske reaksjoner av:

A - transmethylering (spesifik giver av CH3~gruppen),

B - transsulfurering (spesifik giver av SH-gruppen),

C - transaminopropylering (spesifik giver av aminopropylgruppen).

Denne kunnskap kunne føre til den konklusjon at SAM ville kunne ha én terapeutisk virkning ved behandling av patologiske tilstander bundet med mangeltilstander i organismen med hensyn til de enkelte av de mange produkter som er angitt ovenfor .

Imidlertid har den store ustabilitet av SAM og mangel på fremgangsmåte til å gjøre den stabil i tilstrekkelig tid under normale omgivende betingelser, forhindret at dette produkt er blitt farmakologisk eller klinisk testet og således forhindret at de er funnet praktisk anvendelse for denne i den menneskelige terapi.

Bare etter fremstilling av de nye SAM-salter ifølge foreliggende oppfinnelse, salter som i praksis er uendelig stabile ved omgivende temperatur, har det vært mulig å utføre en systematisk farmakologisk og klinisk undersøkelse som har ført til opptagelsen av fullstendig overraskende terapeutiske egenskaper for de nye salter både når det gjelder kvalitet og intensitet.

Fra den store mengde farmakologisk og kliniske data som er oppsamlet for dette nye produkt, vil det her bare bli gitt enkelte eksempler tilstrekkelige til klart å angi de vesentlige karakteristika til det nye produkt og dets hoved-anvendelse i den menneskelige terapi. For enkelhets skyld vil det ganske enkelt bli angitt "SAM-salt" for de nye salter ifølge oppfinnelsen på grunn av deres absolutt identiske anvendelse.

I de angitte farmakologiske og kliniske data er det administrerte salt alltid angitt med SAM og mengden av administrert salt er uttrykt i mengde av SAM inneholdt i dette, slik at det er klart at dataene angir identisk til det ene eller det andre salt ifølge oppfinnelsen.

Toksisitet

SAM-saltene ifølge oppfinnelsen har vist seg å være absolutt fri for akutt toksisitet, kronisk toksisitet, lokal intoleranse eller bivirkninger.

DLj.Q i mus er større enn 2,5 g/kg/os og 1,00 g/kg/ip.

Tester over toleranser og toksisitet ble utført på rotter av Wistar- og Strague-Dowley-stammen administrert med 4-8 mg/kg pr. dag produkt i 12 måneder, og etter endt behandling viste de forskjellige organer og systemer ingen patologisk forandring.

Teratogenese-tester ble utført på kaniner og rotter: selv med administrering av massive doser av SAM ca. 10 ganger den maksimale terapeutiske dose, ble det ikke observert noen teratogene virkninger eller noen misdannelser i fosteret eller det ferdig utviklede foster.

Tilsetning av doser opp til 0,05 - 0,10 mg/ml produkt . i levende kultur av human lymfocytes eller leverceller-fra mus bevirket ingen forandring i sprengningsindekser (blasticising index) for de cellulære elementer.

Intravenøs administrering i doser opp til 16 mg/kg fremkalte ingen pyrogene utslag i kaninene.

Venøs administrering i kaniner og katter på 16 mg/kg bevirket ingen forandring i det carotide trykk, hjerte- og respirasjonsfrekvens eller ekg-kurven.

Den lokale toleranse ved intramuskulær injeksjon, selv etter administreringer gjentatt over 180 dager, og ved intravenøs injeksjon i randvenen av den auriculære pavilion i kaniner, er utmerket.

I unge friske mennesker av begge kjønn som ble underkastet administrering ved den hurtige intravenøse metode eller ved phlebolyse av doser av SAM lik 5 - 150 mg (midlere vekt 70 kg)., ble det ved samtidig undersøkelse av det minimale og maksimale trykk og puls og respirasjonsfrekvens ved 1, 5, 15,

20, 30, 60 minutter og ved 2, 3, 6, 8, 10, 12, 24 timer fra endt administrering ikke observert noen variasjon fra normale verdier.

EKG-kurven viste ingen variasjon i PQ-intervallet, i ST-seksjonen, eller ikke noen tilsynekomst av ekstrasistol

eller andre forandringer ved 30", 1, 2, 3, 5, 10 og 20 minutter fra administrering.

I det hemopoetiske system og i lever- og nyrevirksom-het ble det ikke observert noen variasjoner som var statistisk signifikante.fra det normale.

Farmakologi

Det skal gjentas at når det i den etterfølgende beskrivelse tales om administrering av SAM, menes at en hvilken som helst av de enkle eller doble salter ifølge oppfinnelsen er blitt administrert, da deres aktivitet er fullstendig ekvivalent. For å oppnå en enkel referanseparameter, er referansen alltid gjort til SAM-innholdet i de forskjellige salter.

For å bestemme indikativt hvordan SAM fordeles i

14

vevene, ble det fremstilt S-adenosilmethione (methyl C ). Fordelingen av dette produkt i rotter ble undersøkt ved administrering av en dose på 4,2 mg/kg/ev lik 10 uci av radioaktivt produkt. Den spesifike aktivitet til produktet var 58 mCi/m mol. Parallelt med dette ble det foretatt en autoradiografisk under-søkelse på mus.

Resultatene av disse forsøk viste at SAM fordeles

meget hurtig til alt vev.

I den etterfølgende tabell er det oppført data for enkelte av de berørte organer:

Fordeling av SAM i rottevev.

Verdiene er uttrykt i mikrogram/g.

Det ble følgelig fastslått at de nye salter ifølge foreliggende oppfinnelse avgir CH^-gruppen til alt vev som er utstyrt med methyltransferase-aktivitet. Med andre ord er de nye forbindelser ifølge oppfinnelsen istand til valgfritt å lokalisere seg selv i alle organer utstyrt med methyltransferase-systemer.

Dette ble fastslått ved etterfølgende farmakologiske tester. En serie av tester utført på rotter har vist at de nye forbindelser utviser en betydelig beskyttende og legende virkning av leversteatosis ved hyperlipid-hyperproteindiet ifølge Handler, i steatosis ved aku-t alkoholintoksikasjon og ved andre toksiske midler (carbontetraklorid, brombenzen etc.) ved administrering av bare 6 mg/kg/ip, både morfokjemisk og analy-tisk, idet SAM betydelig reduserer akkumulering av lipider ved det hepatocide nivå mens det begunstiger gjenoppbygning av normale nivåer av fosfolipider redusert etter intoksikasjon med ,cci4.

Hepatiske fosfolipider i rotter etter intoksikasjon med CC14 og behandling med SAM.

Verdiene er de gjennomsnittlige + E.S. av 10 verdier for hver gruppe. Ved undersøkelse av den hepatobeskyttende aktivitet ble det anvendt en eksperimentell anordning som fremkaller i rottene såkalt, hepatisk cholesterol-degenerering (Ridout and Coll., Biochem. J. 52, 99, 1952).

I denne metode oppnås ved hjelp av en egnet diet en påfallende økning i det totale hepatiske fett og hepatiske cholesterol i dyrene. Forbindelser som virker i den lipide metabolisme reduserer eller opphever denne økning..

Dyrene ble delt i seks grupper. Den første gruppen ble administrert med en diet som ble variert etter behag. Den annen gruppe ble administrert med Ridout basisdiet (20 g pr. rotte pr. dag), de andre grupper ble administrert med samme diet i de samme doser men anriket med cholesterol i en mengde på 0,2 g/rotte/dag. Behandlingen varte i 3 uker.

Gruppene 4, 5, 6 ble administrert med SAM i de føl-gende doser: 0,4, 0,8, 2 mg/kg/i.p. pr. dag.

Etter 3 uker ble alle dyrene avlivet, leveren fjernet og totalt fett (Best and Coll., Biochem. J. 40, 368, 1966) og cholesterol (Sperry and Brand, J. Biol. Chem. 150, 315, 1943) ble bestemt.

Resultatene viste at de grupper som ble underkastet behandling med SAM i doser på 0,4 - 0,8 mg/kg/ip var bare svakt beskyttet, mens gruppen som ble behandlet med 2 mg/kg/ip var fullstendig beskyttet.

Hepatisk cholesterol og total fett etter endt forsøk

(gjennomsnittlig pr. gruppe)

Andre farmakologiske virkeområder var den anti-inflammatoriske effekt og den analgetiske effekt av SAM.

Av de forskjellige tester skal ■. nevnes de mest klas-siske, nemlig ødem fremkalt av carragenine og av eggehvite som en test for akutt inflammasjon, og granuloma fremkalt fra bomull-pellets og arthritis som en test for kronisk inflammasjon. I alle tilfeller var SAM aktiv både når den ble administrert oralt (dose mellom 8 og 40 mg/kg) og parenteralt (doser mellom 4 og 8 mg/kg) i sammenligning med andre kjente legemidler (Ibuprofen, Indometacina). De analgesiske tester var varme-platetest og strekktesten fremkalt av eddiksyre, og Randel og Selitto-testen utført på rotter. Produktet viste seg også å være aktivt i de tester som er sammenlignet med kjente farmasøy-tiske produkter.

Et ytterligere farmakologisk virkeområde var den mulige virkning av SAM på sømtiden fremkalt av barbiturater.

For dette formål ble det utført et forsøk hvor grupper av mus mottok hexobarbital i en dose på 80 mg/kg/ip ifølge metoden beskrevet av Holten og Larsen (Acta Pharmacol. Toxicol. 1956, 12, 346), en gruppe var kontrollgruppen og den andre gruppe mottok SAM i en dose på 4 mg/kg/ip.

Av de ovenfor angitte data utviser SAM en aktivitet med hensyn til å forlenge søvntiden som fremkalles av hexobarbital.

Kliniske tester

Hvor det i det etterfølgende er angitt administrering av SAM, angir dette administrering av et hvilket som helst av saltene ifølge oppfinnelsen.

Etter de indikasjoner man fikk fra de farmakolgoiske tester, ble de kliniske tester rettet mot sykelige tilstander hvor følgende syntes primært eller sekundært å være forandret:

1 - metabolismen av lipider

2 - metabolisme av proteider og glucider

3 - metabolisme av catecholaminer og biogene aminer

1. Fra tester utført klinisk på flere hundre pasienter ved bruk av doser av SAM varierende over et vidt område, ble det funnet at de nye forbindelser fremkalte et hurtig fall i leverlipidene ved hepatosteatosis av varierende pathogenese, hvilket kunne identifiseres ved biopsiundersøkelse etter endt behandlingssyklus, selv etter 60 dager fra endt behandling.

Administreringen av produktet bevirket også et markert fall i de høye verdier av total cholesterolemia, av hypertri-glyceridemia og en normalisering av forandret &/a-lipoprotein-forhold i pasienter med hyperdislipidemia i ukompensert tilstand .

Denne hypocholesterol-nedsettende og hypolipe-nedsettende virkning ble også fastslått selv i doser på ca. 8 - 1,5 mg administrert 2 - 3ganger pr. dag og var proporsjonal med dosen.

I ren arteriosclerose med.kliniske manifestasjoner av det psyko-påvirkelige område, ved turbemnesis og.sekundære cehtroencéphalics (svekkelse ved arteriosclerotisk encephalo-pathia) og tegn på cerebral hypoxia, har administrering av SAM intramuskulært eller;i alvorlige tilfeller, ved intravenøs injeksjon eller ved sakte phleboclysis, i doser mellom 8 og 16 mg 3 - 4 ganger pr. dag, vist en meget fordelaktig modifisering av symptomatologien.

I særlig rene hypoxydotiske tilstander har mange gjen-vunnet livsfunksjoner meget hurtig og statistisk signifikant.

I post-apoplektiske syndromer ble det funnet en hurtig-ere gjenoppbygning av det kliniske system. 2. Det ble foretatt en klinisk behandling av flere hundre pasienter som var angrepet av: sekundær hypoprotidemias og disprotidemias, vedvarende eller aggresive hepatopathias, precyrrotisk og cyrrotiske tilstander, malabsorpsjonssyndromer, protid-splittende syndromer. Administreringen av doser varierende mellom 20 og 80 mg SAM pr. dag intramuskulært eller intra-venøst eller oralt, alt etter sykdommens tilstand, bevirket en statistisk tydelig økning i den totale protidemia, en økning i albumnivået og en tendens til å normalisere de endrede prosen-tuelle forhold mellom de elektroforetiske fraksjoner til serumet. Denne protein-oppbyggende aktivitet har ofte vært fulgt av en meget tydelig forbedring i den subjektive symptomologi og de generelle objektive tilstander, og ved normalisering ved alle tes.ter på leverfunksjoner. 3. Spesielt overraskende resultater ble oppnådd ved klinisk anvendelse av det nye enzymatiske salt ifølge oppfinnelsen, hvor det forelå svekkede systemer som klart har forbindelse med modifikasjoner i utveksling av biogene aminer, f.eks.:

a) patologiske sytemer med neuropsykiatrisk relevans,

b) Parkinsons sykdom og Parkinsonisme av varierende ezio-pathogeneses, c) Antifologistisk og analgesisk virkning i behandling av osteoarthritis, og analgetisk aktivitet.i visse neurologiske manifestasjoner,

d) forstyrrelser av søvn-rytmen.

Med hensyn til punkt a), har en omfattende klinisk casuistri utført ved undersøkelse av den kliniske adferd av Hamilton og Wittenberg-tester, klart vist at administrering

av doser varierende mellom 8 og 20 mg SAM 3-4 ganger pr. dag i et tidsrom på 5 - 15 dager uten noen annen form for terapi, fremkaller betydelig remisjon av de hovedparametere som taes i betraktning ved diagnosen av depressive former.

Med hensyn til punkt b) vedrørende behandlingen av Parkinsons sykdom og Parkinsonisme, er det funnet at: Administrering av SAM i doser på 4 - 16 mg pr. dag ved intramuskulær eller intravenøs injeksjon, eller oralt, avhengig av sykdommens tilstand, sammen med den vanlige terapi med Levodopa, gir opphav til en statistisk mer betydelig forbedring i akinesia og stivhet i forhold til hva som oppnås hos pasienter behandlet bare med Levodopa.

Gunstige modifikasjoner ble også funnet med Parkinsons tremor, hvilket ikke kan modifiseres ved Levodopa elene.

Administrering av SAM forbedrer betydelig den Levodopa-avhengige psykiske ubelanse, særlig med hensyn til depressive tilstander og psykiske manifestasjoner av irritativ type.

Administrering av SAM i de ovenfor angitte doser blokkerer betydelig bivirkninger av Levodopa i forskjellige organer og systemer, særlig med hensyn til nausea, vomit, nedsatt apetitt, hypotensjon, asthenia, cefalea, hypersudorasjon og insomnia.

Med hensyn til punkt c) har farmakologiske resultater vist at SAM har en betydelig antiflogistisk og analgesisk aktivitet, og har vist seg å være aktiv i alle osteoarthri-tiske former behandlet med doser på 13 mg to ganger pr. dag intramuskulært eller intravenøst, og 13 - 20 mg oralt fire ganger pr. dag.

Etter bare 7 dagers behandling ble de muskulære spasmer, bevegelsesbegrensningen, lokalisert smerte og stivhet influert betydelig i forhold til placebo.

Intet tilfelle av gastrisk pyrosis ble observert i de 90 tilfeller som ble behandlet. Undersøkelse over skjult blod i feces viste ingen modifikasjoner under behandlingen.

Sammenlignet med et ikke-steroid anti-flogistisk legemiddel som vanligvis anvendes i en dobbel blind-undersøk-else, utxiste SAM en terapeutisk effektivitet lik indomethacin.

Den analgesiske aktivitet av SAM ble også undersøkt

i forskjellige pasienter med forskjellige neurologiske tilstander: neuritis, polyneuritis, anthralgia, aciatica, radiocolitis, torticollis.

Den terapeutiske effekt ble oppnådd og var effektiv fra den første dag "med en administrering av en dose på 6 mg to ganger pr. dag ved intramuskulær injeksjon eller 13 - 20

mg 3 - 4 ganger pr. dag oralt. Analoge resultater ble erholdt hos pasienter med tilbakevendende og resistente cephalalgia ved administrering av legemidlet oralt i tyggbare tabletter.

Med hensyn til punkst d), dvs. forstyrrelser i søvn-våkenrytmen, spesielt med hensyn til insomnia, er det nye produkt ifølge oppfinnelsen istand til en dose på 4 - 13 mg oralt betydelig å forbedre de forandrede søvn-våkenforhold ved å fremkalle fysiologisk søvn uten å måtte anvende barbiturater eller andre forbindelser med cortical og centroencefal depres-siv virkning.

Som det fremgår fra det ovenfor angitte åpnes det

nye og vide perspektiver innen den menneskelige terapi. I de anvendelsesområder som allerede er kartlagt er: behandling av hepatopias, hyperdislipidemias, utbredt eller lokal arteriosclerose, psykiatriske manifestasjoner av deprewsiv og neurologisk type, degenerativ arthropathies, neurologiske smerte-månifestasjoner og forstyrrelser av søvn-våken-rytmen, mens mange andre anvendelsesområder fremdeles må undersøkes og kartlegges.

De nye SAM-salter administreres fortrinnsvis intramuskulært eller intravenøst, eller i orale eller sublinguale

tabletter, eller i kapsler.

Den terapeutiske dose av SAM. ligger mellom 2 cg 125 mg pr. dag, avhengig av den spesielle type og sykdomstilstand. Større doser kan anvendes om nødvendig på grunn av at saltene ifølge oppfinnelsen er absolutt frie for toksisitet.

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av sulfonater av S-adenosil-L-methionin av formelen

hvori ■

x = 0,1

n = 1,2

y = 0,5, 1, 1,5, 2,3,4

forutsatt at: når x = 0, er n = 1 og y = 3,4

x =0, er n= 2 og y = 1, 5, 2

x = 1, er n= 1 ogy = 1,2

x = 1, er n = 2 og y = 0,5, 1

og hvori R er radikalet av en sulfonsyre valgt fra gruppen av methansulfonsyre, ethansulfonsyre, 1-n-dodecansulfonsyre, 1- n-octadecansulfonsyre, 2-klorethansulfonsyre, 2-bromethansulfonsyre, 2-hydroxyethansulfonsyre, 3-hydroxypropansulfonsyre, d-, 1-, d,l-10-kamfersulfonsyre, d-, 1-, d,1-3-bromkamfer-10-sulfonsyre, cysteinsyre, benzensulfonsyre, p-klorbenzensulfonsyre, 2- mesityl-benzensulfonsyre, 4_bifenylsulfonsyre, 1-nafthalensulfonsyre, 2-nafthalensulfonsyre, 5-sulfosalicylsyre, p-acetylbenzensulfonsyre, 1,2-ethandisulfonsyre, O-benzendisulfonsyre og chondroitinsvovelsyre, karakterisert ved at a) det fremstilles en konsentrert, vandig løsning av SAM, b) SAM tilstedeværende i den vandige løsning utfelles med en mettet løsning av picroloninsyre i vann eller i et organisk løsningsmiddel som er løselig i vann, c) det således utfelte picrolonat oppløses i en løsning av en sulfonsyre valgt fra gruppen bestående av methansulfonsyre, ethansulfonsyre, 1-n-dodecansulfonsyre, 1-n-octadecansulfonsyre, 2-klorethansulfonsyre, 2-bromethansulfonsyre, 2-hydroxy-ethansulf onsyre , 3-hydroxypropansulfonsyre, d-, 1-, d,l-10-kamfersulf onsyre, d-, l-,( d ,1-3-bromkamf er-lO-sulf onsyre , cysteinsyre, benzensulfonsyre, p-klorbenzensulfonsyre, 2-mesityl-benzensulfonsyre, 4-bifenylsulfonsyre, 1-nafthalensulfonsyre, 2-nafthalensulfonsyre, 5-sulfosalicylsyre, p-acetylbenzensulfonsyre, 1,2-ethandisulfonsyre, O-benzen

disulfonsyre og chondroitinsvovelsyre, eller i en løsning av angitte sulfonsyrer og svovelsyre,. d) SAM-sulfonatet eller sulfonat-sulfatet utfelles ved tilsetning av et organisk løsningsmiddel som er fullstendig blandbart med det løsningsmiddel som anvendes i foregående trinn.