Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych sulfonianów S-adenozylo-L-metioniny oraz mieszanych soli S-adenozylo-L-metioniny z organicznymi kwasami sulfonowymi i kwasem siarkowym. Doklad¬ niej, wynalazek dotyczy nowych, wykazujacych znaczna trwalosc soli S-adenozylo-L-metioniny (SAM), ekono¬ micznego sposobu wytwarzania tych soli na skale przemyslowa. Nowe zwiazki stosuje sie jako skladnik aktywny preparatów farmaceutycznych.SAM jest produktem pochodzenia naturalnego, znajdowanym w organizmach zywych od bakterii do roslin, od organizmów jednokomórkowych do wyzszych ssaków, wlacznie z czlowiekiem. Strukture tego zwiazku opisuje przedstawiony na rysunku wzór, w którym X~ oznacza anion.W zywych organizmach SAM powstaje wcytoplazmie w wyniku procesu enzymatycznego z udzialem S-adenozylometloninosyntetazy lub S-adenozylotransferazy, z metioniny i substancji odzywczych lub ATP, który stanowi rezerwe energii w kazdej zywej komórce.SAM odgrywa zasadnicza role w wielu biologicznych reakcjach enzymatycznej transmetylacji. Dzieki tej wlasciwosci jest waznym odczynnikiem biochemicznym. SAM jest jednak nietrwaly w temperaturze pokojowej, a jego wytwarzanie jest pracochlonne i trudne do wykonania na skale przemyslowa.W ostatnich latach prace nad stabilizacja SAM do stopnia umozliwiajacego uzycie tego odczynnika w badaniach biologicznych koncentrowaly sie nad wytwarzaniem soli trwalych w normalnych warunkach temperatury i wilgotnosci. Otrzymano chlorek i siarczan SAM, lecz sole te moga byc stosowane jedynie jako odczynniki biochemiczne i jedynie w ciagu krótkiego czasu po wytworzeniu, poniewaz w stanie suchym ich trwalosc w niskiej temperaturze jest ograniczona. Sposoby wytwarzania tych soli nadaja sie do stosowania na mala skale lecz nie moga byc stosowane na skale przemyslowa.2 94 268 Nieoczekiwanie znaleziono nowe sole SAM o nieograniczonej trwalosci w czasie, w temperaturze do 45°C.Sole te mozna ekonomicznie i z duza. wydajnoscia wytwarzac na skale przemyslowa. Sole te nieoczekiwanie wykazaly silne dzialanie lecznicze w wielu dziedzinach medycyny czlowieka, czesto bez widocznej korelacji.Nowe sole wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sa podwójnymi solami SAM z kwasami sulfonowymi, odpowiadajacymi wzorowi SAM*4RS03 H, w którym RS03H oznacza jeden z nastepujacych kwasów: metanosul- fonowy CH3S03H, etanosulfonowy C2H5S03H, n*dodekanosulfonowy C12H25S03H, 1-oktadekanosulfonowy Ci8H37S03H, 2-chJoroetanosulfortowy CIC2H4S03H, 2 notulfonowy HOC2 H4S03 H, 3-hydroksypropanosulfonowy HOC3 HS -S03 H, d,1 -10-kamforosulfonowy Ci0H17OSO3H,d-, !• ld,1-3-bfomokamforo-10-sulfonowy C10H16Br0SO3H i cysternowy C3H6NS03H.Wynalazek dotyczy równiez sposobu wytwarzania soli o ogólnym wzorze SAM-3RS03H, w którym RSO3H oznacza jeden z nastepujacych kwasów: benzenosulfonowy C4H5S03H, p-chlorobenzenosulfonowy CIC*H4S09H, 2-mezytylobenzenosutfonowy (CH3)3C#H2SOaH,4-dwufenylosulfonowy C12H10SO3H, 1-nafta- lenosutfonowy C10H7SO3H, 2-naftalenotulfonowy C1()H7S03H, 5-sulfosalicylowy C7Hs03S03H, p-acetylo- benrenowjlfonowy C, H7OS03 H, soli SAM z kwasem 1,2-etanodwusulfonowym o wzorze SAM*2C2 H4 (S03 H)2, soli SAM i kwasem o-benzenodwusulfonowym o wzorze SAM*1r5C4H4(S03H)2 i soli SAM z kwasem chondro- itinoslarkowym o wzorze SAMl4CMH21 N014S.„ Przedmiotem wynalazku jest równiez sposób wytwarzania podwójnych soli SAM z kwasem siarkowym i jednym z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych o wzorze SAtf-HSOJ •H1804'RS03H lub SAM+'HS04*H2S04-2RS03H, w których to wzorach RS03H oznacza jeden z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych lub równowaznik kwasu etanodwusulfonowego, o-benzenodwusul- fonowego tub chondroltinosiarkowego.Wysokim osiagnieciem technicznym jest trwalosc powyzszych nowych soli w 45°C, w stanie suchym. We wszystkich solach wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, w powyzszych warunkach, zawartosc SAM nie ulega zmianie wciagu 360 dni. W dwóch najtrwalszych z dotychczas znanych soli SAM, chlorku i siarczanie, po uplywie 30 dni utrzymywania w temperaturze 45°C wstanie suchym zawartosc SAM wynosi odpowiednio 20 i 50%. Po uplywie 60 dni w chlorku SAM ulega calkowitemu rozkladowi, a w siarczanie pozostaje jedynie 5% ilosci poczatkowej.Sposób wedlug wynalazku obejmuje zasadniczo nastepujace etapy: a) wytwarzanie roztworu o wysokiej zawartosci SAM, b) wytracenie SAM z przesaczonego roztworu wodnego za pomoca nasyconego roztworu wodnego kwasu pikrylonowego lub za pomoca roztworu tego kwasu w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, np. w alkoholu metylowym, etylowym, propylowym, izopropylowym, n-butylowym lub izobutylowym, acetonie, lub w ketonie metyloetylowyrn, metyloizobutylowym, octanie etylu, czterowodorofuranie, 2-metoksyetanolu, 2-etyloksyetanolu, dioksanie lub dwumetyloformamidzie, c) rozpuszczenie odsaczonego SAM w roztworze jednego z wyzej wymienionych kwasów w alkoholu, jak metanol, etanol, propanol-1, propanol-, butano 1-1, butanol-, ll.rz.butanol, 2-metoksyetanol lub 2-etoksyetanol; d) dodanie do roztworu organicznego rozpuszczalnika mieszajacego sie z uzytym alkoholem, takiego jak benzen, toluen, eter dwuetyIowy, eter dwuizopropylowy, aceton, keton mety loetyIowy, keton metyfoizobuty Io¬ wy, octan etylu lub metylu, czterowodorofuran lub chloroform, e) oddzielenie organicznej cieczy i rozpuszczenie osadu w roztworze kwasu zastosowanego w etapie c) w Jednym z alkoholi uzytych w etapie c) i zadanie roztworu weglem odbarwiajacym, f) dodanie do roztworu organicznego rozpuszczalnika zdolnego wytracic czysta sól SAM w postaci dobrze wyksztalconych i latwych do odsaczenia krysztalów, wybranego sposród wykazanych w punkcie d).Pierwsze dwa etapy sposobu wytwarzania podwójnych soli z kwasem siarkowym sa identyczne, natomiast nastepne mozna wykonac nastepujaco: c') rozpuscic odsaczony osad w mieszaninie jednakowych czesci objetosciowych rozpuszczalnika czescio¬ wo mieszajacego sie z woda, jak keton metyloetyIowy, keton metyloizobutylowy, n-butanol lub izobutanol i wodnego roztworu równowaznych ilosci jednego z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych i kwasu siarkowe¬ go, d') oddzielic warstwe organiczna, a do wodnego roztworu dodac ketonu lub alkoholu calkowicie rozpuszczalnego w wodzie, e') rozpuscic osad w 10-20% roztworze kwasu uzytego w etapie c') w jednym z alkoholi z etapu c')i zadac roztwór weglem odbarwiajacym, f) dodac organicznego rozpuszczalnika zdolnego wytracic czysta sól SAM w postaci dobrze wyksztalco¬ nych i latwych do odsaczenia krysztalów.Ponadto podwójna sól otrzymuje sie z pojedynczej soli otrzymanej w etapie d) w wyniku: c") rozpuszczania osadu w wodnym roztworze równowaznych ilosci kwasu siarkowego i kwasu uzytego94268 3 w operacji c), a nastepnie zadania roztworu weglem odbarwiajacym, f") dodania organicznego rozpuszczalnika zdolnego wytracic czysta sól SAM w postaci dobrze wyksztalco¬ nych i latwych do odsaczenia krysztalów.Otrzymywanie stezonego roztworu SAM mozna przeprowadzic róznymi, jednakowo skutecznymi sposoba¬ mi. Wedlug jednego z nich, drozdze (Saecharomyces cerevisiae, Torulopais utilis, Candida utilis itp) wzbogacone w SAM dodatkiem metioniny w odpowiednich warunkach (Schlenk, Enzymologia 29, 283 /1965/) zadaje sie octanem etylu, a nastepnie 0,1—0,5, korzystnie 0,35 n kwasem siarkowym, w temperaturze pokojowej, w celu wywolania rozpadu komórki i przejscia do roztworu praktycznie 100% obecnego SAM. Korzystna ilosc wody i octanu etylu wynosi 0,05—0,20 wagi wilgotnych komórek i zabieg korzystnie prowadzi sie w czasie 15-45, a zwlaszcza 30 minut.Nastepnie dodaje sie kwasu siarkowego i prowadzi lize wciagu 1—2, korzystnie 1,5 godziny. Nalezy podkreslic, ze liza komórek drozdzowych prowadzona mieszanina organicznego rozpuszczalnika i rozcienczonego kwasu siarkowego jest znacznie korzystniejsza od zwykle prowadzonej za pomoca kwasu nadchlorowego w temperaturze pokojowej lub kwasu mrówkowego lub octowego w60°C i podobnych operacji, poniewaz nie tylko prowadzi sie ja w temperaturze pokojowej, korzystnie wplywajacej na trwalosc SAM, lecz równiez w warunkach zapewniajacych latwe odsaczenie roztworu pd pozostalosci komórek. Roztwór nie zawiera zanieczyszczen, zwykle obecnych w przypadku uzycia innego czynnika rozkladajacego komórke, a trudnych do usuniecia w znanych sposobach wytwarzania czystego SAM.Alternatywnie, etap a) przeprowadza sie wytwarzajac SAM w drodze enzymatycznej syntezy, dzialajac ATP-metionino-adenozylotransferaza (E.C. 2.4.2.12) na mieszanine inkubacyjna zawierajaca adenozylotrójfosfo- ran (ATP) i metionine. Warunkiem zasadniczym przeprowadzania tego etapu na skale przemyslowa jest czystosc enzymu i to, by byl on w postaci latwo dajacej sie wyodrebnic zarówno z poczatkowej mieszaniny inkubacyjnej jak i z mieszaniny zawierajacej wyprodukowany SAM.Oczyszczanie ATP-metioninó-adenozylotransferazy przeprowadza sie korzystnie na drodze chromatografii przez powinowactwo i reakcji kolumnowej. Chromatografia przez powinowactwo polega na przepuszczeniu roztworu zawierajacego enzym, np. surowego ekstraktu drozdzy lub Escherichia coli przez kolumne wypelniona nosnikiem z kowalencyjnie zwiazana grupa dzialajaca jako konkurencyjny inhibitor enzymu. Nieoczekiwanie stwierdzono, ze doskonalym wypelniaczem kolumny oczyszczajacej jest aktywowany zel polisacharydowy z kowalencyjnie zwiazana L-lizyna. Powinowactwo enzymu do L-lizyny zwiazanej ze stala matryca powoduje opóznienie jego elucji i umozliwia oddzielenie go w bardzo czystej postaci od innych bialek.Wydzielenie enzymu z eluatu, w celu zastosowania go w nastepnym etapie enzymatycznej syntezy, nie daj6 zadowalajacych wyników, poniewaz po wydzieleniu enzym jest nietrwaly, a ponadto, jednokrotnie uzyty do syntezy SAM ulega niszczeniu podczas jego wyodrebniania.Doskonale wyniki uzyskano absorbujac enzym z eluatu na odpowiednim stalym nosniku i przeprowadzajac reakcje miedzy metionina a ATP, prowadzaca do wytworzenia SAM, w kolumnie. Odpowiednim nosnikiem jest polisacharyd aktywowany odczynnikiem wiazacym bialka ze stalym nosnikiem, np. bromek cyjanu. Przepusz¬ czajac przez kolumne zbuforowany roztwór ATP i metioniny otrzymuje sie wyciek zawierajacy SAM.W etapie b) otrzymuje sie SAM o wysokim stopniu czystosci. Jak wykazuje chromatografia cienkowarstwo¬ wa wedlug Anal. Biochem. 4, 16—28/1971/, w srodowisku kwasnym jedynym zwiazkiem wytracanym przez kwas pikrolonowy jest SAM. Dzialanie kwasu pikrolonowego jest wyjatkowo selektywne. Inne, stosowane dotychczas czynniki wytracajace, takie jak kwas pikrynowy, sól Reineckego lub kwas borowy daja produkty wymagajace dalszego oczyszczenia w drodze kolumnowej chromatografii jonowymiennej, która jest procesem kosztownym i trudnym do realizacji na skale przemyslowa. Trudno równiez na tej drodze otrzymac produkt o wymaganym stopniu czystosci.Zastosowanie wodnych roztworów kwasu pikrylonowego lub roztworów tego kwasu w wyzej podanych rozpuszczalnikach organicznych nie przedstawia problemu, a operacje przeprowadza sie w temperaturze pokojo¬ wej. Etapc) korzystnie przeprowadza sie z roztworami wyzej wymienionych kwasów sulfonowych w jednym z wyzej wymienionych alkoholi, o stezeniu 0,25—1,5, korzystnie 1 n. Rozklad kompleksu SAM z kwasem pikrolonowym jest calkowity, na co wskazuje calkowite rozpuszczenie osadu.Etapd) przeprowadza sie korzystnie stosujac 4—10 objetosci (w odniesieniu do objetosci alkoholowego roztworu) rozpuszczalnika wybranego z grupy obejmujacej benzen, toluen, eter dwuety Iowy, eter dwuizopropy¬ lowy, aceton, keton metyloizobutyIowy, octan metylu, octan etylu lub czterowodorofuran.Etap e) i f) stanowia koncowe etapy wytwarzania pozadanej soli SAM. W etapie e) produkt z etapu d) rozpuszcza sie w 0,1—0,5, korzystnie 0,2 n roztworze kwasu zastosowanego w etapie c) w rozpuszczalniku wybranym sposród alkoholi o 1—4 atomach wegla, 2-metoksyetanolu i 2-etoksyetanolu.Kolejny etap f) korzystnie przeprowadza sie stosujac 4—8 objetosci (w odniesieniu do objetosci alkoholo-4 94 268 wego roztworu) organicznego rozpuszczalnika wybranego z grupy obejmujacej benzen, toluen, eter dwuetyIowy, eter dwuizopropylowy, aceton, keton metyloetyIowy, keton metyloizobutyIowy, octan metylu, octan etylu, czterowodorofuran i chloroform.Proste sole SAM, otrzymane sposobem wedlug wynalazku, przechowywane w stanie suchym nie ulegaja praktycznie zadnym zmianom. Sposób wedlug wynalazku wyklucza obecnosc wody we wszystkich operacjach po wytraceniu kwasem pikrolonowym, a tym samym wyklucza calkowity brak nawet sladowych zanieczyszczen rozpuszczalnych w wodzie. Podwójne sole SAM z kwasem siarkowym i jednym z kwasów sulfonowych, wybra¬ nych sposród wymienionych w pierwszym wariancie, korzystnie otrzymuje sie stosujac wodne roztwory równowaznych ilosci jednego z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych i kwasu siarkowego, oba w stezeniu 0,05-0,2, korzystnie 0,1 n i organiczny rozpuszczalnik czesciowo mieszajacy sie z woda, taki jak keton metyloetylowy lub n-butanol. Zastosowanie organicznego rozpuszczalnika umozliwia znaczne ograniczenie objetosci wodnego roztworu kwasu i praktycznie calkowicie usuwa kwas pikrolenowy. Etapd') korzystnie przeprowadza sie stosujac 4—8 objetosci (w odniesieniu, do objetosci roztworu wodnego) rozpuszczalnika wybranego z grupy obejmujacej aceton, alkohol metylowy, alkohol etylowy i alkohol propylowy.Równiez nieoczekiwanie stwierdzono, ze jezeli w etapie e') zastosuje sie minimalna ilosc alkoholu do rozpuszczenia osadu z etapu d'), to w nastepnym etapie wytracania V) wytraci sie podwójna sól SAM+,HS04"'H2 - S04-2RS03H.Jezeli natomiast w etapie e') zastosuje sie alkokol w ilosci równej co najmniej dwukrotnej objetosci miiimalnej, to w nastepnym etapie wytracania f) wytraci sie podwójna sól SAM+*HS04"H2S04^2RS03H.Zastosowanie posrednich ilosci alkoholu prowadzi do powstania mieszaniny obu soli.RS03H oznacza jeden z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych lub równowaznik kwasu, w przypadku kwasu etanodwusulfonowego lub chondroitinosulfonowego.Koncowe wytracanie nowej soli wedlug wynalazku (etapf) wymaga uzycia organicznego rozpuszczalnika wybranego z grupy obejmujacej benzen, toluen, eter dwuetylowy, eter dwuizopropylowy, chloroform, aceton, keton metyloetylowy, keton metyloizobutyIowy, octan metylu, octan etylu, alkohol izoamylowy lub czterowo- dorofuran.Jak stwierdzono, podwójne sole SAM, otrzymane sposobem wedlug wynalazku, w stanie suchym moga byc przechowywane nieograniczenie dlugo, nie ulegajac praktycznie zadnym zmianom.Wytwarzanie podwójnych soli SAM z kwasem siarkowym i jednym z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych wedlug wariantu drugiego polega na rozpuszczeniu (etap e") (soli otrzymanej w etapie d) w roztworze równowaznych ilosci kwasu siarkowego i kwasu zastosowanego w etapie c), oba w stezeniu 0,05-0,2, korzystnie 0,1 n, w alkoholu o 1-4 atomach wegla, 2-metoksyetanolu lub 2-etoksyetanolu.Równiez nieoczekiwanie stwierdzono, ze jezeli w etapie e') zastosuje sie minimalna ilosc alkoholu do rozpuszczenia osadu z etapu d), to w nastepnym etapie f") wytraci sie podwójna sól o wzorze SAM*'HS04lH3S04*2R803H, w którym RSO3H oznacza kwas sulfonowy lub w przypadku kwasu etanodwu¬ sulfonowego lub chondroitinosiarkowego, równowaznik tego kwasu.Jezeli jednak w etapie e") stosuje sie metanol w ilosci równej co najmniej dwukrotnej objetosci minimalnej, to w nastepnym etapie f") wytraca sie podwójna sól SAM* •HS04'H2S04*RS03H. Zastosowanie alkoholu w ilosci posredniej prowadzi do mieszaniny obydwu soli.Koncowe wytracanie podwójnej soli (etapf") wymaga uzycia organicznego rozpuszczalnika, wybranego z grupy obejmujacej benzen, toluen, eter dwuetylowy, eter dwuizopropylowy, chloroform, alkohole o 4 lub atomach wegla, octan metylu, octan etylu, czterowodorofuran, aceton, keton metyloetylowy i keton metylo- izobutylowy.Biochemiczne badania ostatnich lat wykazaly, ze SAM jest jedynym specyficznym donorem rodników metylowych w zywych organizmach w biochemicznych reakcjach przenoszenia tych rodników. Reakcje te sa reakcjami podstawowymi w przemianie tluszczów, bialek i cukrów. Przykladowo, w wyniku zaleznej od SAM transmetylacji powstaja nastepujace zwiazki: a) w wyniku IM-transmetylacji: adenina, karnityna, karnozyna, kreatyna, 2,6-dwuaminopuryna, adrenalina, guanina, hordenina, N'-nikotynamid, fosfatodllkolina i rycynina; b) w wyniku O-transmetylacji: N-acetyloserotanina, dopamina, epinina, d-adrenalina, 1 -adrenalina, ergo- rterol, 1-noradrenalina, pektyna, ubichinon; c) w wyniku S-transmetylacji: 2,3-dwumerkaptopropanol, H2S, metionina, metylomerkaptan, kwas S-mer- kaptopropionowy, tiopirymidyna i tiouracyl; d) w wyniku C-transmetylacji:cytozyna i tymina.Oznacza to, zwlaszcza w odniesieniu do organizmu ludzkiego, ze SAM jest czynny w nastepujacych procesach: w biosyntezie choliny, w biosyntezie fosfatydy lokoliny, w czynnosci enzymów wymagajacych94 268 5 grup SH, w metabolizmie katecholamin, biogenicznych centroencefalicznych amin, serotoniny, histaminy, wita¬ miny B12 i kwasu foliowego, kreatyniny, myozyny, histonów, RNA,DNA, substancji bialkowych, niektórych hormonów o rdzeniu cyklopentanoperhydrofenantrenowym, z których najwazniejsze sa estrogeny, jak równiez w metabolizmie trójglicerydów. Wiadomo równiez, ze SAM demetylowany enzymami transmetylujacymi prze¬ ksztalca sie w S-adenozylohomocysteine (SAO), która jest bezposrednim donorem grup wodorosiarczkowych i ma decydujace znaczenie w metabolizmie wszystkich zwiazków, których aktywnosc biologiczna wymaga grupSH. Sposród nfch szczególnie wazne sa pewne tioenzymy i aminokwasy zawierajace w czasteczce atom siarki.SAO ulega 2 kolei w organizmie dekarboksylacja a produkt zdekarboksylowany jest glównym donorem grupy aminopropylowej, nieodzownym, wedlug najnowszej wiedzy biochemicznej, w biosyntezie poliamin.Proces ten jett katalizowany róznymi enzymami, wlaczajac specyficzna aminopropylotransferaze.Podsumowujac mozna stwierdzic, ze SAM jest w organizmie ludzkim scisle zwiazany ze wszystkimi biochemicznymi reakcjami trensmetylacji (specyficzne przekazywanie grupy CH3), transsulfuracji (specyficzne przekazywanie grupy SH) i transaminopropylowania (specyficzne przekazywanie grupy aminopropylowej). Suma powyzszej wiedzy naprowadza na mysl, ze SAM moze miec lecznicza czynnosc w patologicznych stanach zwiazanych zbraklem lub innego typu ograniczeniem dostepnosci w organizmie niektórych z wielu wyzej wymienionych produktów.Nletrwalosc SAM i brak sposobu nadania temu zwiazkowi trwalosci w normalnych warunkach otoczenia w wystarczajaco dlugim czasie spowodowal, ze nie przeprowadzono z nim badan farmakologicznych i klinicz¬ nych i hit wprowadzono go do lecznictwa. Po otrzymaniu nowych soli SAM, sposobem wedlug wynalazku, wykazujacych w temperaturze pokojowej praktycznie nieograniczona trwalosc, stalo sie mozliwe przeprowadze¬ nie systematycznych badan farmakologicznych i klinicznych. W ich wyniku stwierdzono lecznicze wlasciwosci nowych soli zaskakujace jakoscia i intensywnoscia.Sposród ogromnej ilosci zebranych danych farmakologicznych i klinicznych, dotyczacych nowego produk¬ tu, ponizej podano niektóre, ilustrujace zasadnicze wlasciwosci i glówne zastosowania wleczeniu ludzi. Dla uproszczenia, wszystkie nowe sole, otrzymywane sposobem wedlug wynalazku, objeto wspólna nazwa „sól SAM", poniewaz zastosowania tych zwiazków sa absolutnie identyczne. Dane farmakologiczne i kliniczne podano w przeliczeniu na zawarty w soli SAM.Toksyctnosc. Sole SAM, otrzymywane sposobem wedlug wynalazku w ogóle nie wykazuja toksycznosci ostrej i przewleklej, jak równiez nietolerancji miejscowej I efektów wtórnych. LD50 wynosi u myszy ponad 2,5 g/kg przy wprowadzaniu doustnym i ponad 1,00 g/kg przy wprowadzaniu dootrzewnowym.Próby tolerancji i przewleklej toksycznosci przeprowadzono na szczurach rasy Wistar i Sprague-Dowley, podajac im wciagu 12 miesiecy 4—8 mg produktu dziennie. Po zakonczeniu próby nie stwierdzono patologicz¬ nych zmian badanych organów. Badanie teratogennosci przeprowadzono na królikach i szczurach. Stwierdzono, ze wprowadzanie SAM w dawkach mniej wiecej dziesieciokrotnie przekraczajacych najwyzsze dawki lecznicze nie wywoluje czynnosci teratogennej, a zarówno embriony jak i plody nie wykazuja zadnych znieksztalcen.Dodatek produktu do kultur limfocytów ludzkich i komórek watrobowych myszy, w dawkach do 0,06—0,10 mg/ml, nie powoduje zmian wspólczynnika rozpadu elementów komórkowych.Wprowadzenie dozylne w dawkach do 16 mg/kg nie wywoluje w królika objawów pirogennosci. Taka sama dawka wprowadzana dozylnie nie wywoluje u królika i kota zmian cisnienia w tetnicy szyjnej jak równiez zmian czestotliwosci oddechu i pulsu i zapisu elektrokardiograficznego.Miejscowa tolerancja przy injekcjach dozylnych, przy wprowadzaniu powtarzanym wciagu 180 dni, jak równiez przy wprowadzaniu do skrajnych zyl usznych królika, jest doskonala.U ludzi, mlodych, zdrowych ochotników obojga plci o sredniej wadze 70 kg, którym podawano SAM w dawkach 5—150 mg, szybka injekcja lub wlewem dozylnym, nie stwierdzono zmian minimalnego i maksymal¬ nego cisnienia oraz czestotliwosci pulsu i oddechu w 1, 5, 15, 20, 30 i 60 minut oraz 2, 3, 6,8,10,12 i 24 godzin po zakonczeniu zabiegu. Zapis elektrokardiograficzny nie wykazal zmian w interwale PQ, sekcji ST, jak równiez objawów skurczu przedwczesnego lub innych zmian w 30 sekund i 1, 2, 3, 5, 10 i 20 minut po wprowadzeniu zwiazku. W aparacie krwiotwórczym i w pracy watroby i nerek nie stwierdzono statystycznie znaczacych odchylen od normy.Farmakologia. Wyniki uzyskane przy wprowadzaniu prostych lub podwójnych soli SAM przeliczono, jak uprzednio wspomniano, na zawarty w nich SAM.Dla zbadania rozkladu SAM w tkankach sporzadzono S-adenozylometionine z C14 w rodniku metylowym.Rozklad powyzszego produktu w tkankach szczura badano wprowadzajac zwierzeciu dozylnie dawke 4,2 mg/kg, odpowiadajaca okolo 10juci produktu radioaktywnego. Aktywnosc wlasciwa produktu wynosila 58 mCi/milimol. Równolegle przeprowadzono badania autoradiograficzne na myszy. Wyniki obu badan wykazuja6 94 268 bardzo szybkie przejscie SAM do wszystkich tkanek, W ponizszej tablicy przedstawiono niektóre dane dotyczace rozkladu SAM w tkankach szczura.Tablica lc Stezenie SAM w tkankach szczura jug/g Tkanka Watroba Gruczoly nadnercza Sledziona Przysadka Podwigorze Kora Otocze , ' 1,7 1.9 1,3 2,3 0,3 0,25 7,5 1 h 3,0 3,4 1,2 2,5 0,65 0,45 2,1 4h .5 4,8 3,5 8,0 1.0 0,75 2,3 8h ,6 4,5 2,6 4,5 1.3 8,5 2,0 24 h ,7 4,4 2,8 4,2 1.3 9,4 1,1 Z uzyskanych danych wynika, ze nowe sole, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, przekazuja grupe CH8 wszystkim tkankom posiadajacym aktywnosc metylotransferazowa. Mówiac inaczej, produkty te maja zdolnosc wybiórczego umiejscawiania sie we wszystkich narzadach wyposazonych w uklady metylotransferazo¬ wa.Powyzszy wniosek zostal potwierdzony dalszymi badaniami farmakologicznymi. W serii prób na szczurach wykazano, ze nowe zwiazki wywieraja znaczne dzialanie ochronne i rozpuszczajace przy otluszczeniu watroby wywolanym dieta o nadmiarze tluszczów i bialek wedlug Handlera, jak równiez przy otluszczeniu watroby spowodowanym ostrym zatruciem alkoholem i innymi czynnikami toksycznymi, jak czterochlorek wegla, bromobenzen Itp., przy dootrzewnowym wprowadzaniu w dawce zaledwie 6 mg/kg. Zarówno z punktu widzenia morfohistochemicznego jak i analitycznego, SAM znacznie zmniejsza akumulacje tluszczów w watrobie w przypadkach chorobowych i przyspiesza doprowadzenie ich do normalnego poziomu po obnizeniu wywola¬ nym zatruciem CCI4. W ponizszej tablicy przedstawiono poziom fosfolipidów w watrobie szczura po intoksykacji CCI4 i podaniu SAM, Tab I i ca II Poziom fosfolipidów w watrobie szczura po intoksykacji CCI4 i podaniu SAM Zabieg Sumaryczna zawartosc fosfolipidów (mg/g) Roztwórfizjologiczny 30,57±1,18 CCU 18,87±1,06 CCI4 + SAM 16 mg/kg dootrzewnowo 27,20±1,25 CCI4 + SAM 150 mg/kg dootrzewnowo 20,87±0,42 CCL4 + Ad + Met 15 mg/kg dootrzewnowo 19,9 ±0,92 I II UI I ¦ ¦ ¦ I I II ¦I \ ', i I I III Podane w tablicy wartosci sa srednimi z dziesieciu dla kazdej grupy.W badaniach czynnosci ochrony watroby wywolywano doswiadczalnie u szczurów tzw. cholesterolowa degeneracje watroby (Ridout i inni, Blochem. J, 52,99,1952). W sposobie tym za pomoca specjalnej diety wywoluje sie znaczny wzrost zawartosci w watrobie tluszczów i cholesterolu. Zwiazki czynne w metabolizmie tluszczów obnizaja lub likwiduja ten wzrost.Zwierzeta podzielono na 6 grup. Grupie pierwszej podawano dowolnie zmieniana diete. Grupie drugiej podawano podstawowa diete Ridouta (20 g na szczura dziennie), a pozostalym grupom te sama diete wzbogacona w cholesterol do 0,2 g na szczura dziennie. Diete podawano wciagu trzech tygodni. Zwierzetom w grupach 4, 5 i 6 podawano SAM w dawkach 0,4,0,8 i 2 mg/kg dootrzewnowo.94 268 7 Po uplywie trzech tygodni zwierzeta usmiercono, pobrano z nich watroby i oznaczono sumaryczna zawartosc tluszczów (Best i ColL, Biochem. J. 40,368,1966) i cholesterolu (Sperry i Brand, J. Biol. Chem., 150,315,1943). Wyniki oznaczen wykazaly slaba ochrone zwierzat, którym podawano SAM w dawce 0,4—0,8 mg/kg i pelna ochrone zwierzat otrzymujacych SAM w dawce 2 mg/kg Tablica III Zawartosc cholesterolu i sumy tluszczów w watrobie po zakonczeniu próby (wartosci srednie w grupie) Grupa Waga swiezej Suma tluszczów Cholesterol 1 2 3 4 6 watroby (g) 18 16 17- 16 16 g 1.41 1,93 3,84. 3,70 3,5 2,0 % 9,4 ,6 24,0 21,6 21,9 12,5 g 40 68 92 90 67 61 % 2,6 3,7 ,7 ,2 4,1 3,8 I_i Sposród innych wlasciwosci farmakologicznych SAM zbadano równiez dzialanie przeciwzapalne i usmie¬ rzajace. Ostry stan zapalny z obrzekiem wywolywano karagenem i bialkiem jaja. Dzialanie przy przewleklym stanie zapalnym obserwowano przy zarniniaku wywolanym bawelna i zapaleniu stawów wywolanym adjuwan- tem. We wszystkich przypadkach SAM wykazal aktywnosc, zarówno wprowadzany doustnie (dawki 8^40 mg/kg) jak i pozajelitowo (dawki 4—8 mg/kg), porównywalna z aktywnoscia innych srodków (Ibuprofen — Indometacyna). Wlasciwosci usmierzajace badano w próbach goracej plyty i z kwasem octowym oraz w próbie Randala i Selito na szczurze. Czynnosc usmierzajaca SAM okazala sie porównywalna z czynnoscia znanych srodków.Zbadano równiez oddzialywanie SAM na czas snu wywolanego uzyciem barbituranów. Badania przeprowa¬ dzono sposobem Holtena i Larsena (Acta Pharmacol. Toxicol., 1956,12, 246), na grupie myszy, którym podano heksobarbital w dawce 80 mg/kg, dootrzewnowo, lacznie z SAM w dawce 4 mg/kg, dootrzewnowe Grupie kontrolnej podano jedynie heksobarbital. Wyniki przedstawiono w ponizszej tablicy.Tablica IV Wplyw SAM na czas snu wywolanego heksobarbitalem Czas snu (minut) Kontrola 24,4±2,7 SAM 4 mg/kg dootrzewnowo 41,2±5,8 Jak wynika z powyzszych danych, SAM przedluza sen wywolany heksobarbitalem.Badania kliniczne. Przez wprowadzanie SAM rozumie sie wprowadzanie soli otrzymanej sposobem wedlug wynalazku. Na podstawie informacji uzyskanych w badaniach farmakologicznych, badania kliniczne ukierunko¬ wano na stany chorobowe objawiajace sie pierwotnym lub wtórnym zaklóceniem metabolizmu tluszczów, metabolizmu bialek i cukrów oraz metabolizmu katecholamin i amin biogennych.Z prób przeprowadzonych klinicznie na setkach pacjentów, przy zastosowaniu SAM w mieszczacych sie w szerokim przedziale dawkach wynika, ze nowe zwiazki powoduja szybki spadek poziomu tluszczów przy otluszczeniach watroby wywolanych róznymi czynnikami chorobowymi, wykrywalny badaniami bioptycznymi po zakonczeniu cyklu leczenia i po uplywie dalszych 60 dni.Podawanie produktu powoduje równiez znaczne obnizenie wysokich wartosci calkowitej cholesterolem ii, hipertrójglicerydemii i normalizuje zmieniony stosunek j3/a lipoproteidów u pacjentów z hiperdyslipidemia w sta-6 94 268 nie niezrównowazonym. Czynnosc obnizania poziomu cholesterolu i tluszczów wystepuje równiez przy dawkach 8—1,5 mg wprowadzanych 2—3 razy dziennie i jest proporcjonalna do dawki.W przypadku miazdzycy z klinicznymi objawami w sferze psychiczno-uczuciowej z zaburzeniami pamieci i wtórna centroencefalia (uszkodzenia wskutek arteriosklerotycznej encefalopatii) i objawami niedotlenienia mózgu, wprowadzanie SAM droga domiesniowa lub, w powazniejszych przypadkach, injekcja lub wlewem dozylnym, w dawkach 8—16 mg 3—4 razy dziennie, powodowalo korzystne zmiany objawów. Szczególnie przy niedotlenieniu mózgu obserwowano szybkie i statystycznie znaczace przywracanie czynnosci kojarzenia. W sta¬ nach poapoplektycznych obserwowano zwiekszenie szybkosci poprawy stanów klinicznych.Klinicznemu leczeniu za' pomoca SAM poddano setki pacjentów dotknietych wtórna hipoprotidemia I dysprotklemla, uporczywa i agresywna chroniczna hepatopatia, stanami cyrrotycznymi i przedcyrrotycznymi, zaburzeniami wchlaniania i rozdzialu bialek. Wprowadzanie SAM w dawkach dziennych 20-80 mg, droga domiesniowa, dozylna lub doustna, w zaleznosci od ciezkosci przypadku, powodowalo statystycznie znaczacy wzrost calkowitej prottdemii, wzrost poziomu albumin i tendencje do normalizacji zmienionego procentowego stosunku elektroforetyczrtych frakcji osocza. Powyzszej czynnosci anabolizowania bialek czesto towarzyszyla poprawa symptomologii i kondycji pacjentów oraz normalizacja prób watrobowych.Szczególnie zaskakujace wyniki uzyskano stosujac nowe enzymatyczne sole, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, w przypadkach chorobowych zwiazanych z zaburzeniami wymiany biogennych amin, jak przyklado¬ wo: a) patologiczne objawy o podlozu neuropsychiatrycznym, b) choroba Parkinsona i parkinsonizm o róznej etiopatogenezle, c) zapalanie kostnostawowe i pewne objawy neurologiczne (czynnosc przeciwzapalna i usmie¬ rzajaca) oraz d) zaburzenia rytmu snu i czuwania.Odnosnie punktu a)( obszerna kazuistyka kliniczna, przeprowadzona przez badanie zachowali klinicznych i prób Hamiltona i Wittenberga wykazaly, ze podawanie SAM w dawkach 8—20 mg 3—4 razy dziennie w ciagu -16 dni powoduje, przy wylaczeniu innych form terapii, znaczne zmniejszenie wartosci glównych parametrów branych pod uwage w diagnozie postaci depresyjnych.Odnosnie punktu b), dotyczacego leczenia choroby Parkinsona i parkinsonizmu, stwierdzono, ze podawanie SAM w dawkach 4—16 mg dziennie, droga injekcji domiesniowych lub dozylnych lub doustnie, zaleznie od ciezkosci przypadku, lacznie ze zwyczajowa terapia Levodopa, daje statystycznie lepsza poprawe w bezruchu i sztywnosci, w porównaniu z obserwowana u pacjentów leczonych jedynie za pomoca Levodopa. Korzystne zmiany obserwuje sie równiez w stopniu drzenia parkinsonistycznego, jakich nie mozna osiagnac stosujac jedynie Levodopa.Wprowadzanie SAM ma wyrazny wplyw na zmniejszenie zaburzen psychicznych zaleznych od Levodopa, szczególnie w odniesieniu do stanów depresyjnych i objawów psychicznych typu podraznienia.Podawanie SAM w wyzej podanych dawkach w znacznym stopniu blokuje ciag ubocznych oddzialywan Levodopa na rózna narzady i funkcje, a zwlaszcza mdlosci, wymioty, brak apetytu, obnizenie cisnienia, astenie, nadpotllwosc, bezsennosc i migrene.Odnosnie punktu c), SAM, który, jak to wykazaly badana farmakologiczne, ma silne wlasciwosci przeciwzapalna i usmierzajace, wykazuje czynnosc we wszelkich postaciach artretyzmu, w dawkach 13 mg dwa razy dziennie przy injekcji domiesniowej lub dozylnej i 13—20 mg cztery razy dziennie przy wprowadzaniu doustnym.W porównaniu ze srodkiem obojetnym, SAM zmniejszal skurcze miesniowe, ograniczenia ruchliwosci, miejscowy ból i sztywnosc, w sposób statystycznie znaczacy, juz po 7 dniach podawania.W 90 obserwowanych przypadkach nie stwierdzono zgagi zoladkowej. Podawanie SAM nie powodowalo pojawiania sie krwi w odchodach.W porównaniu z nlesterokJowymi lekami przeciwzapalnymi, SAM wykazuje skutecznosc równa skutecznos¬ ci indometacyny.Czynnosc antalgiczna SAM badano w przypadkach róznych schorzen neurologicznych: neuritis, polyneuri- tis, anthralgia, sciatica, radiocolitis, torticollis. Efekt leczniczy byl widoczny juz pierwszego dnia podawania SAM w dawce 6 mg dwa razy dziennie w przypadku injekcji domiesniowej lub 13-20 mg 3-4 razy dziennie przy podawaniu doustnym. Analogiczne wyniki uzyskano u pacjentów z cephalalgia nawrotowa i oporna, przy wprowadzaniu leku doustnie w tabletkach.Odnosnie punktu d), tj. zaburzen rytmu snu i czuwania, a zwlaszcza bezsennosci, nowy produkt otrzymy¬ wany sposobem wedlug wynalazku w doustnej dawce 4—13 mg znacznie poprawia stosunek czasu snu do czasu czuwania, wywolujac fizjologiczny sen bez uzycia barbituranów lub innych substancji o dzialaniu depresyjnym na kore i mózg centralny.Z wyzej przedstawionych danych wynikaja liczne i nieoczekiwane perspektywy zastosowan nowego leku w medycynie. Juz obecnie wiadomo, ze moze on byc stosowany w schorzeniach watroby, hiperdyslipidemiach,94 268 9 ogólnej lub miejscowej miazdzycy tetnic, objawach psychiatrycznych typu depresyjnego i neurologicznego, artropatii degeneratywnej.Nowe sole SAM korzystnie podaje sie w drodze injekcji domiesniowej lub dozylnej lub doustnie, w postaci tabletek doustnych lub podjezykowych lub w kapsulkach.Sposród innych form farmaceutycznych mozna wymienic; plyny do zazywania doustnego, ciecze do wkraplan doocznych i krople do nosa, ciecze do rozpylania i aerozole, ciecze i mascie do zastosowan miejsco¬ wych, w których skladnik czynny jest rozcienczony dopuszczalnym w farmacji rozpuszczalnikiem („Tecnologia Farmaceutica", tom II, Silva no Casadio, wydanie drugie, wydawca Cisalpino—Goliardica, Mediolan 1972).W podsumowaniu mozna stwierdzic, ze lecznicze dawki SAM wynosza 2—125 mg dziennie, w zaleznosci od rodzaju i nasilenia schorzenia. Z uwagi na calkowity brak toksycznosci soli otrzymywanych sposobem wedlug wynalazku mozliwe jest stosowanie ich w wiekszych dawkach.Przyklad I. Do 90 kg drozdzy wzbogaconych w SAM (6,88 g/kg) wedlug Schlenka (Enzymologia 29, 283, 1965) dodaje sie, w temperaturze pokojowej, 11 litrów octanu etylu i 11 litrów wody. Po energicznym mieszaniu wciagu 30 minut dodaje sie 50 litrów, 0,35 n kwasu siarkowego i kontynuuje mieszanie wciagu dalszych 1,5 godzin. Po przesaczeniu i przemyciu woda otrzymuje sie 140 litrów roztworu o zawartosci 4,40 g SAM W litrza, co odpowiada 99,5% zawartosci tego zwiazku w materiale wyjsciowym. Do powyzszego roztworu dodaje sie, mieszajac, roztwór 2,3 kg kwasu pikrolonowego w 25 litrach ketonu metyloety Iowego. Po uplywie 16 godzin odwirowuje sie wytracony osad i przemywa go woda.Mieszajac, rozpuszcza sie powyzszy material w temperaturze pokojowej w 6,2 litrach 1 n roztworu kwasu metanosulfonowego w metanolu. Po odsaczeniu sladowych ilosci nierozpuszczalnego materialu do roztworu dodaje sie 50 litrów acetonu. Po opadnieciu osadu zdekantowuje sie roztwór, a sam osad przemywa mala objetoscia acetonu, Osad rozpuszcza sie w 25 litrach 0,25 n roztworu kwasu metanosulfonowego w metanolu, do roztworu dodaje wegla odbarwiajacego i calosc przesacza. Do przesaczu dodaje sie 125 litrów ketonu metyloizobutylo- wego.Wytraca sie 1089 g krystalicznej i latwej do saczenia soli, która rozpuszcza sie w wodzie z utworzeniem bezbarwnego roztworu o stezeniu powyzej 20%. W zwyklych rozpuszczalnikach organicznych sól jest jedynie nieznacznie rozpuszczalna. Chromatografia cienkowarstwowa wedlug Anal. Biochem. 4,16—28 (1971) wykazuje, ze produkt jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi 0 wzorze Ct fiH23N605S* 4 CH403S.Nowy zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, opartym na enzymatycznym metylo- waniu nikotynamidu i kwasu guanidynooctowego, zachodzacym przy udziale SAM (G. L. Cantoni, J. Biol.Chem. 189, 745, 1951 oraz G. De La Hoba, B. A. Jameison, S. H. Mudd i H. H. Richards, J. Am. Chem. Soc. 81, - 3975, 1959).Postepujac w wyzej opisany sposób, z tym, ze kwas metanosulfonowy zastepuje sie kwasem n-dodekano- sulfonowym lub kwasem n-oktadekanosulfonowym, otrzymuje sie odpowiednio zwiazki o wzorze Ci$H23N6OsS#4C14H3603S i Ct 5H23N605S#4C18H3g03S. Dane analityczne tych zwiazków przedstawiono w tablicy V» Przyklad II. Do 70 litrów roztworu powstalego w wyniku lizy komórek drozdzowych, przeprowa¬ dzonej sposobem opisanym w przykladzie I i przy uzyciu tego samego co w przykladzie I surowca, dodaje sie 1,15 kg kwasu pikrolonowego rozpuszczonego w 10 litrach alkoholu izobutylowego. Po uplywie 16 godzin odwirowuje sie wytracony osad, a nastepnie rozpuszcza go, mieszajac, w temperaturze pokojowej, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu etanosulfo nowego w etanolu. Po odsaczeniu malej ilosci nierozpuszczalnego materialu, do roztworu dodaje sie 25 litrów eteru dwuetylowego. Po pewnym czasie mieszanine przesacza sie, a osad przemywa mala objetoscia eteru. Nastepnie osad rozpuszcza sie w 12,5 litrach 0,25 n roztworu kwasu eta nosulfo nowego w etanolu, dodaje wegla odbarwiajacego i calosc przesacza. Do przesaczu dodaje sie 63 litry benzenu.Wytraca sie 585 g soli, która odsacza sie i suszy. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia ponad %, nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa, przeprowadzona jak w przykladzie I, wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze Cx 5 H2 3 N605 S* 4C2 H6 03 S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Postepujac w wyzej opisany sposób, z tym, ze kwas etanosulfonowy zastepuje sie kwasem 2-bromoetano- sulfonowym lub kwasem 2-chloroetanosulfonowym, otrzymuje sie odpowiednio zwiazku o wzorze Cx 5 H2 3 N605 • 4C2H5S03Br i C! 5H23N605S-4C2H5S03CI. Dane analityczne tych zwiazków przedstawiono w tablicy V.Przyklad III. Do 70 litrów roztworu powstalego w wyniku lizy komórek drozdzowych, przeprowa¬ dzonej sposobem opisanym w przykladzie I i przy uzyciu tego samego co w przykladzie I surowca, dodaje sie10 94 268 1,15 kg kwasu pikrolonowego rozpuszczonego w 12 litrach n-butanolu. Po uplywie 16 godzin odwirowuje sie wytracony osad, a nastepnie rozpuszcza go, mieszajac, w temperaturze pokojowej, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu d,1-10-kamforosulfonowego w propano Iu-1. Nastepnie dodaje sie 25 litrów benzenu. Wytracony osad rozpuszcza sie w 0,25 n roztworze kwasu kamforosulfonowego w propanolu-1 (12,5 litrów), do roztworu dodaje wegla i przesacza calosc, a do przesaczu dodaje 63 litry acetonu.Otrzymuje sie 928 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia ponad 20%, nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ie zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze C15H23N6O5S*4C10Hi6O4S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie L Postepujac w wyzej opisany sposób, z tym, ze kwas d,1-10-kamforosulfonowy zastepuje sie kwasem d-3-bromo-10-kamforosulfonowym otrzymuje sie zwiazek o wzorze C15H23N605S'4CioHi504*£fer!'Dane analityczne tego zwiazku przedstawiono w tablicy V.Przyklad IV. Oczyszczanie enzymu.Zawiesine 50 g Sepharose (polisacharyd produkcji Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Szwecja) zadaje sie bromkiem cyjanu, znanym sposobem sporzadzagia polisacharydowego zelu obsadzonego grupami aminowymi.W nastepnym etapie obróbki dodaje sie do zefu nadmiaru L-lizyny. Po zakonczeniu reakcji zel przemywa sie kolejno destylowana woda, mieszanina buforowa o pH 6,6 I mieszanina buforowa o pH 4,5. Tak przygotowanym zelem zaladowuje sie kolumne o srednicy 1,5 cm i wysokosci 30 cm. Przez kolumne przepuszcza sie mieszanine buforowa 0,05 m trójetanoloaminy i 0,01 m H2S04 do calkowitego jej zrównowazenia. Na kolumne naklada sie 2 ml ekstraktu z drozdzy zawierajacego enzym i ewentualnie wzbogaconego w ten enzym, otrzymanego w drodze sonifikacji lub homogenizacji suchym lodem. Kolumne eluuje sie ta sama mieszanina buforowa, która równowazono ja. Rozklad bialek w wycieku bada sie pomiarami spektrofotometrycznymi w nadfiolecie.Równoczesnie oznacza sie aktywnosc syntetazy we frakcjach sposobem J. A. Stekola, Methods In EnzymoJogy, tom 6, strona 566 (1963). Frakcje wykazujace czynnosc *yntet*zowa laczy sie, otriymujao roztwór o aktywnosci wlasciwej co najmniej dwudziestokrotnie wyzszej od aktywnosci wlasciwej surowego ekstraktu. Enzym mozna dalej zatezyc przez wytracenie solami lub rozpuszczalnikami organicznymi lub Innymi znanymi sposobami zatezanla roztworów bialek.Otrzymywanie SAM. 30 ml zelu Sepharose aktywuje sie bromkiem cyjanu tub innym znanym sposobem aktywacji w ceki zwiazania z polisacharydowa matryca bialek. Do aktywowanego zefu dodaje sie 4 ml roztworu enzymu oczyszczonego w wyzej opisany sposób, w których zawarte jest okolo 100 mg bialka. Zawiesine aktywowanego zelu i roztwór enzymu miesza sie wciagu 18godzin w4°C. Zywice przemywa sle woda.Popluczyny zawieraja okolo 70% enzymatycznej aktywnosci zawartej poczatkowo w roztworze enzymu.Inkubacja spreparowanego w wyzej opisany sposób zelu Sepharose, wyzej opisanym sposobem oznaczania aktywnosci syntetazowej, wykazuje, ze z zelem zwiazane jest okolo 20% aktywnosci.Spreparowanym zelem napelnia sie kolumne o srednicy 1,5 om i wysokosci 20 cm. Przez kolumne przepuszcza sie z szybkoscia 5 ml na godzine, w temperaturze 25-27°C, roztwór 0,675 m trójetanoloaminy, 0,160 m siarczanu magnezu, 0,05 ATP, 0,05 m metioniny i 0,01 m KCI.Oznaczenie w wycieku z kolumny SAM wykazuje 30% wydajnosc konwersji.Otrzymywanie p-chiorobenzeno*ulfonianu SAM. 103 ml eluatu o stezeniu SAM 6 g w litrze zakwasza sie kwasem siarkowym do pH 3, a nastepnie mieszajac dodaje do niego roztwór 2-3 g kwasu pikrokmowego w 25, ml ketonu mety loety(owego. Po uplywie 16 godzin odsacza sie osad I przemywa go woda, po czym rozpuszcza w 6,2 ml 1 n roztworu kwasu p-chlorobenzenosulfonowego w 2-metoksyetanolu. Do roztworu dodaje sie 50 ml toluenu. Wytracony osad rozpuszcza sie w 12,5 ml 0,25 n roztworu kwasu p-chlorobenzenosurfonowego w 2-metoksyetanolu, do roztworu dodaje wegla i calosc przesacza, a do przesaczu dodaje 60 ml chloroformu.Otrzymuje sie 1,43 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do steisoi* pttwyzef 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach OfganfcziTyttft. Chromatograf!* cfsnfcowarstwowa wykazuje, ze zwiazek wolny jest od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tabttey ¥, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze C! 5 H23 N605S*3C«H5CI03S. - & Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzto t.Postepujac w wyzej opisany sposób, z tym, ze kwas p-chforobenzenosulfonowy zastepuje sie kwasem p-acetylobenzenosulfonowym, c benzenodwusulfonowym, 4-dwufenylosulfonowym, 2-mezytylenosulfonowym lub 5-sulfosalicylowym otrzymuje sie odpowiednio zwiazki o wzorze Ci 5 H23N605S,r3C8H804S, %H23N605S-1rDX^ : 3GjtytQ4$. Dane analityczne tych zwiazków przedstawiono w tablicy V.94 268 11 Przyklad V. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 70 litrów roztworu jak w przykla¬ dzie I rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu 1,2-etanodwusulfo- nowego w metanolu. Do roztworu dodaje sie 25 litrów acetonu, a wytracony osad rozpuszcza w 12,5 litrach 0,25 n roztworu kwasu 1,2-etanodwusulfonowego w metanolu. Roztwór saczy sie z dodatkiem wegla, a do przesaczu dodaje 60 litrów ketonu metyloizobutylowego.Otrzymuje sie 546 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze Cx s H2 3 N6 05 S' 2C2 H6 06 S2.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad VI. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 70 litrów roztworu jak w przykladzie I rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w3,l litrach 1 n roztworu kwasu 2-hydro- ksyetanosulfonowego w etanolu. Do roztworu dodaje sie 25 litrów ketonu metyloizobutylowego, a wytracony osad rozpuszcza w 12,5 litrach 0,25 n roztworu kwasu 2-hydroksyetanosulfonowego w etanolu, do roztworu dodaje wegla i przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 80 litrów czterowodorofuranu.Otrzymuje sie 632 g. soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowio wzorze Ci 5H23N605S#4C2H$04S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Postepujac w wyzej opisany sposób, z tym, ze kwas 2-hydroksyetanosulfonowy zastepuje sie kwasem 3-propanosulfonowym, otrzymuje sie zwiazek o wzorze Cls H23 N<0SS,4C3H804S. Dane analityczne tego zwiazku przedstawiono w tab I icy V.Przyklad VII. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 70 litrów roztworu jak w przykladzie I rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu 1 -naftale- nosuffonowego w metanolu. Do roztworu dodaje sie 25 litrów ketonu metyioetylowego, a wytracony osad rozpuszcza w 12,5 litrach 0,25 n roztworu kwasu 1-naftalenosulfonowego w metanolu, do roztworu dodaje wegla I przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 70 litrów ketonu mety Ioety Iowego.Otrzymuje sie 717 g. soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi© wzorze Ci 5 H2 3 N605S*3Ci o H803S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad VIII. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 70 litrów roztworu jak w przykladzie I rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu 2-naftale- noturfonowego w propanolu-2. Do roztworu dodaje sie 25 litrów eteru dwuizopropylowego, a wytracony osad rozpuszcza w 12,5 litrach 0r25 n roztworu kwasu 2-naftalenosulfonowego w metanolu, do roztworu dodaje wegla i przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 70 litrów octanu etylu.Otrzymuje sie 71 Og soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze C! s H2 3 N6OsS-3C! o H803S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad IX. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 70 litrów roztworu jak w przykladzie I rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej mieszajac, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu benzeno- sulfonowego wbutanolu-2. Do roztworu dodaje sie 25 litrów eteru dwuizopropylowego, a wytracony osad rozpuszcza w 12,5 litrach 0,25 n roztworu kwasu benzenosulfonowego w metanolu, do roztworu dodaje wegla i przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 65 litrów octanu etylu.Otrzymuje sie 612 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze Cx 5H23N605S*3C6H603S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad X. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 103 ml roztworu jak w przykla¬ dzie IV rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w 6,2 ml 1 n roztworu kwasu chondroitinosiarko- wego w metanolu. Do roztworu dodaje sie 50 ml acetonu, a wytracony osad rozpuszcza w 25 ml 0,25 n roztworu12 94 268 kwasu chondroitinosiarkowego w metanolu, do roztworu dodaje wegla i przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 125 ml ketonu metyloizobutylowego.Otrzymuje sie 3,27 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze Ct 5H23N605S»4C14H2i NOi4S<' Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad XI. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 103 ml roztworu jak w przykla¬ dzie IV rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w 6,2 ml In roztworu kwasu cysteinowego w 2-etoksyetanolu. Do roztworu dodaje sie 50 ml octanu metylu, a wytracony osad rozpuszcza w 25 ml 0,25 n roztworu kwasu cysteinowego w 2-etoksyetanolu, do roztworu dodaje wegla i przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 125 ml octanu metylu.Otrzymuje sie 1,53 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze Ci 5 H2 3 N6 05S" 4C3 H7 N05 S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad XI I. Wytwarzanie podwójnej soli SAM z kwasem siarkowym i metanosulfonowym. 103 ml eluatu o zawartosci SAM 6g w litrze, otrzymanego jak w przykladzie IV, zakwasza sie H2S04 do pH 3 i mieszajac dodaje do niego 2,3 g kwasu pikrolonowego, rozpuszczonego w 25 ml ketonu metyloetylowego (rozpuszczalnika).Po uplywie 18 godzin osad odsacza sie i przemywa woda, a nastepnie rozpuszcza sie w 18 ml 0,1 n roztworu H2S04iO,1n CH3S03H I 18ml ketonu metyloetylowego (rozpuszczalnika). Calosc miesza sie, a nastepnie pozostawia do opadniecia osadu, po czym oddziela sie warstwe organiczna, a warstwe wodna wytrzasa z mala objetoscia ketonu metyloetylowego, w celu usuniecia sladów kwasu pikrolonowego. Po oddzieleniu warstwy wodnej dodaje sie wegla odbarwiajacego i calosc przesacza. Otrzymuje sie 16,5 ml bezbarwnego wodnego roztworu zawierajacego 33,8 g SAM, czyli 90% SAM zawartego w roztworze wyjsciowym.Analiza metoda chromatografii cienkowarstwowej wykazuje, ze roztwór zawiera jedynie SAM. 16,5 ml roztworu wylewa sie do 100 ml acetonu (rozpuszczalnik b). Calosc miesza sie, a nastepnie odstawia do opadniecia osadu. Ciecz zdekantowuje sie, a osad rozpuszcza w6,6g 15% roztworu kwasu meta nosulfonowego w metanolu (rozpuszczalnik c)< Po dodaniu wegla odbarwiajacego i przesaczeniu, roztwór wylewa sie do 25 ml eteru etylowego (rozpusz¬ czalnik d). Po pewnym czasie odsacza sie krystaliczna sól o skladzie SAM+-HS04#H2S04"2CH3S03H (1,2 g).Analityczna charakterystyke soli przedstawiono w tablicy VI.W identyczny sposób, stosujac kwasy sulfonowe i rozpuszczalniki podane w tablicy VI, otrzymuje sie podwójne sole o analitycznej charakterystyce przedstawionej w tejze tablicy.Stosujac jedynie 3,3 g 16% roztworu kwasu metanosulfonowego w metanolu i wytracajac w nastepnym etapie osad za pomoca 25 ml eteru etylowego (rozpuszczalnik d), otrzymuje sie 1,05 g soli o skladzie SAM*-HS04"*H2SQ4*CH3S03H, Analityczna charakterystyke tej soli przedstawiono w tablicy VII.W identyczny sposób, stosujac kwasy sulfonowe i rozpuszczalniki podane w tablicy VI I, otrzymuje sie podwójne sole o analitycznej charakterystyce przedstawionej w tejze tablicy.Przy k Lad Xlii. Wytwarzanie podwójnej soli SAM z kwasem siarkowym i 2-hydroksyetanosulfdno- wym.Sól otrzymana w pieryvszym wytraceniu SAM kwasem 2-hydroksyetanosulfonowym jak w przykladzie VI rozpuszcza sie w 20 litrach 0,1 n kwasu siarkowego i 0,1 n kwasu 2-hydroksyetanosulfonowego w metanolu (rozpuszczalnika). Po dodaniu wegla odbarwiajacego roztwór przesacza sie, a do przesaczu dodaje 100 litrów ketonu metyloizobutylowego (rozpuszczalnik b). Po pewnym czasie odsacza sie wytracony osad, otrzymujac 587 g soli o skladzie SAM** HS04*H2S04*2C2HÓ04S. Analityczna charakterystyke tej soli przedstawiono w tablicy VIII.W identyczny sposób, lecz stosujac 10 litrów metanolowego (rozpuszczalnika) 0,1 n kwasu siarkowego i 0,1 n kwasu 2-hydroksyetanosulfonowego i przeprowadzajac nastepne wytracanie za pomoca ketonu metyloizo¬ butylowego (rozpuszczalnik b) otrzymuje sie sól o skladzie SAM+*HS04*H2S04'C2H604S (505 g). Analityczna charakterystyke tej soli przedstawiono w tablicy IX.Równiez w identyczny sposób, lecz stosujac 3,3 g 15% roztworu kwasu p-toluenosulfonowego w metanolu i przeprowadzajac nastepne wytracanie za pomoca 25 ml eteru etylowego otrzymuje sie 1,18 g soli o skladzie SAM**HS04*H2S04-2CH3C6H4S03H,otakiej samej charakterystyce, jaka ma produkt z przykladu I.94 268 13 <¦ * <¦ CO CO CO CO CO C/l t- r t» \o »© no dodood « * <* « o • z z z z z z C4 * *4 m e» * rt ro c< X X X X X X r* «q irt w -h io O O iS C? c5* O (0 c c .2 $ c c ^ o 5 S S S Sr 5* ó 2 2 O TB 5 £ £ r) cn ob -ó ^ c .2 E Ifo nso c aft CI ^- c .2 'c ilfo 3 o c enze _Q C O ^ to 3 ¦o O c (U N c (U .a ó94 260 17 X — ~ X \Cf ^ 03 **- £ |E "tu 8 U ^ a N o cc N X CU u _ -O (U ? 1 .2 'E S fc I o er £ 03 CD LO 8- 0 28 1 if o J3 c § a S! — — J2 • J2 — o 8 8£ 2 8 £ tu a o a tu ±* a E a E E cN cN cN E ~ c E -O O N • eton etanol tu c . i loety keton mety izobutanol obutanol N etanol _7 eton opano etanol etanol anol tu S. E £ 03 o o " £• £ 5 £• 2 o 5 2 _Q — — _Q loizoi loety loety loizo keton mety keton mety keton mety keton mety n-butanol etanol E izobutanol t» eton iton m eton y w O tu -^ tu i .•H _Q loizoi ta nol keton mety metanol 2-metoksye c (U L. e = 1 f i o o o -O O § i |.§ I §S c 03 L» k. O L. W j-i £ £! _c .p tu u u 13 ii) ^ ^ _ 8 8 € «u 0^7: &§ g O w tu .W CN E I I f i i.f cp a .Q cu tu c E CN C CU CD CN CD O v mi/)t/istnin*-^^-^-vmi/C/} «n v ^ ^ ^ ^ ^- WWWWWWWWWWWWW <*C/)t/)C/)C/DC/) Noododdooodo°*ddddddd ZZZZZZZZZZZ cZZZZZZZ o o X X o o V© 10 f*« * «n c< «*» en n C .2 'E c o 3 £ XXXXXXXXXXXXXXXXXXX ^^•cstncl^HMn^^c<«o^t*-NMc»r<^ 0000000000000000000 c tu c 'E tu O II C "» O .2 2 *£ .2 r- E t r- c tu oni H- 3 Ul O C tu ¦l-J 8 E O zan 0 JB{ t/l O c O Li "O c 0 .2 'c ifc .2 D C o ° 8 1 S 3 c o 2 .o c O CD L- 4- O 3 &3 c fonia dodekanosul c tu c 0 usulf ( 2-etanodw ,—* fonian VI izeno acetylober CL lan su Ifosalicy LO UBIUO s- D ta nos hydro ksye CN c tu a nosulfoni « c c «J .2 1 i - i 8 8 c-S g .2 ® O £ o o O t^- CN 3 fc o g 2- ó ro 2 O tu » 1 C £ 00 CN &) "Ó c 2 c c c .2 'c o ±= o .2 53 ifc c d D O £ ni I § s iS £ n 1u n <5 5l«94 268 O O O cn • E X Z—D i cvi X O I CN X co O O ! I CN X u I X o I X o I X o I z—o —o Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 10 zl PL PL PL PL PL