MXPA97005961A

MXPA97005961A - Polimerasa de adn termoestable, modificada

Info

Publication number: MXPA97005961A
Application number: MXPA/A/1997/005961A
Authority: MX
Inventors: Harrow Gelfand David; Vivian Kalman Lisa; Lawrence Reichert Fred
Original assignee: F Hoffmannla Roche Ag
Priority date: 1996-08-06
Filing date: 1997-08-05
Publication date: 1998-02-01

Abstract

La presente invención se refiere a enzimas ADN polimerasa que comprenden la secuencia aminoácido SerGlnIleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO:1), en donde"Xaa"en posición 4 de esta secuencia es cualquier residuo aminoácido pero no un residuoácido glutámico (Glu), preferiblemente un residuo glicina y"Xaa"en posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (Ile). Las ADN polimerasas termoestables de la invención tienen la eficiencia aumentada para incorporar nucleótidos no convencionales, tales como ribonucléotidos, en productos de ADN y son ventajosos en muchas aplicaciones de síntesis in vitro. Tales enzimas son particularmenteútiles para usar en protocolos de secuenciación deácido nucleico y proporcionar nuevos medios para el análisis de la secuencia de ADN con ventajas decosto y eficiencia. También se reivindicanácidos nucleicos que codifican dichas polimerasas, vectores y células huésped que comprenden talácido nucleico, asícomo las composiciones para usar en una reacción de secuenciación, los equipos y métodos para la secuenciación que incluyen tales polimerasas.

Description

'• POLÍMERASA DE ADN TERMOESTABLE, MODIFICADA " Campo de La Invención La presente invención se refiere a ADN polimerasas rerr.cescables que tienen mayor eficiencia para incorporar trifosfatos ribonucleósidos . La invención proporciona métodos y medios para aislar tales polimerasas. Las enzimas de la invención son útiles para muchas aplicaciones y en particular para aplicaciones de secuencias de ácido nucleico. De este modo, ia invenciór. cambien proporciona métodos para análisis de secuencias de ácido nucleico.

Antecedentes de La Invención Secuenciar ADN generalmente involucra la generación de cuatro poblaciones de fragmentos de ADN de hebra simple que tienen un término definido y un término variable. El término variable en general termina en bases nucleótidas específicas (guanina (G) , adenina (A) , timidina (T) , o citosina (C) ) . Los cuatro grupos diferentes de fragmentos se separa cada uno en base a su longitud. ?n tal procedimiento se usa un gel de poliacrilamida de alta resolución. Cada banda en tal gel corresponde a un nucleótido específico en la secuencia de ADN, identificando así las posiciones en la secuencia. Un método de secuenciación de ADN usado frecuentemente es el método de secuenciación dideoxi o terminación de cadena, que involucra la síntesis enzimática de una hebra de ADN (Sanger ££_ai., 197 , Proc- Nati. Acad. Sci. 74:5463). En REP: 25337 general se corren cuatro síntesis separadas, cada reacción es originada para terminar en una base específica (G, A, T, o C) vía incorporación de un nucleótido de terminación de cadena apropiado, tal como un dideoxinucleótido. Los productos de reacción es fácil interpretarlos dado que cada banda corresponde únicamente a alguno de G, A, T, o C. En el método de terminación de cadena dideoxi un cebador corto de hebra sencilla es usado como molde de hebra simple. El cebador crece en su extremo 3' por la incorporación de deoxinucleótidos (dNTPs) hasta que se incorpora un dideoxinucleótido (ddNTP) . Cuando se incorpora un ddNTP, cesa la elongación en esa base. Sin embargo, para asegurar la replicación fiel de ADN, las ADN polimerasas tienen un sesgo muy fuerte para la incorporación de sus substratos normales, p. ej. dNTPs, y contra la incorporación de nucleótidos análogos, referidos como nucledtidos análogos no convencionales. En el caso de la síntesis de ADN, los ribonucleótidos (rNTPs) se consideran nucleótidos no convencionales, como ddNTPs, rNTPs, porque, no son el substrato normal in vivo de una ADN polimerasa. En la célula esta propiedad disminuye la incorporación de bases anormales tal como deoxinosina trifosfato (dITP) o rNTPs en una hebra de ADN en crecimiento. Dos metodologías de secuenciación automatizadas usadas frecuentemerce son coloración del cebador y coloración de la secuencia terminadora. Estos métodos son adecuados para usar con medios con marca fluorescente. Aun-que la secuenciación también puede hacerse usando medios con marca radioactiva, se prefiere en aumento la secuenciación basada en fluorescencia. Brevemente, en la secuenciación de coloración del cebador, es usado un cebador marcado fluorescentemente en combinación con dd TPs sin marca. El procedimiento requiere cuatro reacciones de síntesis y hasta cuatro bandas en un gel para cada molde a ser secuenciado (una correspondiente a cada una de las bases específicas de los productos de terminación) . Siguiendo la extensión del cebador, las mezclas de reacción de secuenciación de dideoxinucleótidos incorporados a los productos de terminación son analizados rutinariamente por electroforesis en un gel de secuenciación de ADN. Siguiendo la separación por electroforesis, los productos marcados fluorescentemente son exitados con un láser en la parte inferior del gel y la fluorescencia es detectada con un monitor apropiado. En sistemas automatizados, un detector examina el fondo del gel durante la electroforesis, para detectar cualquier medio de marca «que haya sido empleado, mientras que las mezclas de reacción pasan a través de la matriz de gel {Smith et al .. 1986, Nature 321:674-679). En una modificación de este método, se marcan cuatro cebadores cada uno con un marcador fluorescente diferente. Después de que las cuatro reacciones de secuenciación se completan, las mezclas de reacción se combinan y las mezclas de reacción combinadas se someten a análisis en gel en una banda simple, por medio del cual se detectan individualmente las diferentes marcas fluorescentes (una correspondiendo a cada una de las cuatro diferentes bases específicas de los productos de terminación) . Alternativamente, se emplean los métodos de secuenciación de colora- .ón del terminador. En este método, se usa una ADN polimerasa para incorporar dNTPs y ddNTPs marcado fluorescentemente en el extremo que crece de un cebador de ADN (Lee et al-, 1992, 2Q.2471) . Este proceso ofrece la ventaja de que no tiene que sintetizar cebadores marcados con tinte. Además, las reacciones de terminador coloreado son mas convenientes en que las cuatro reacciones pueden presentarse en el mismo tubo. Las ADN polimerasas termoestables modificadas que tienen discriminación reducida contra dd TPs han sido descritas (ver Solicitud de Patente Europea, Publicación No. EP-A-655,506 y Solicitud de Patente U.S. No. dé Serie 08/448,223). Un ejemplo de ADN polimerasa termoestable modificada es la mutada de la ADN polimerasa de T. aquaticus que tiene un residuo tirosina en la posición 667 (en vez de un residuo fenilalanina), p. ej . es una forma mutada llamada F667Y de ADN polimerasa Taq. AmpliTaq*FS, producido por Hoffman-LaRoche y comercializado por Perkin Elmer, reduce la cantidad de dd-NTP requerido para secuenciacidn eficiente de ácido nucleico de un receptor de cientos a miles de veces. Am?liTaq*FS es una forma mutada de la ADN polimerasa de T. aquaticus que tiene la mutación F667Y y adicionalmente un residuo ácido aspártico en la posición 46 (en vez de un residuo glicina; mutación G46D) . Hay una necesidad de ADN polimerasas termoestables que permitan métodos de síntesis alternativos de ácido nucleico para exactitud y costo efectivo de análisis de secuencias de ADN de ácido nucleico. Podrían ser deseables los métodos basados en fluorescencia que no requieren el uso de dideoxinucleótidos. La presente invención trata estas necesidades .

Breve DeBcripci?n de la Invención La presente invención proporciona enzimas ADN polimerasa termoestable dependiente de molde que incluyen el fragmento de secuencia de aminoácidos SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NC:l), en la que "Xaa" en posición 4 de esta secuencia es cualquier residuo aminoácido pero no un residuo ácido glutámico (Glu) y "Xaa" en posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (lie) . Como se representa en la carta de codificación particular para acinoácidos este fragmento de secuencia puede ser representado como S Q I X L R V/I, en donde "X" en posición 4 de esta secuencia es cualquier residuo aminoácido pero no un residuo ácido glutámico. Las enzimas ADN polimerasa termoescables que tienen una secuencia de aminoácido que contiene dicha secuencia característica, en donde HX" en posición 4 de esta secuencia característica no es un residuo ácido glutámico, tiene discriminación reducida contra la incorporación de ribonucleótidos en comparación a polimerasas termoestables previamente conocidas. En una hebra de ADN creciendo los ribonucleótidos son nucleótidos no convencionales. Así, en un primer aspecto, las nuevas enzimas de la invención incorporan análogos de base no convencional, tal como ribonucleótidos, en una hebra de ADN creciendo, varios órdenes de magnitud mas eficientemente que las enzimas sintetizadoras termoestables de ADN identificadas previamente. Los genes que codifican estas enzimas se proporcionan también en la presente invención, tanto como vectores de expresión recombinante y células huésped que contienen tales vectores. Con tales células huésped transformadas se puede proporcionar grandes cantidades de enzimas polimerasa termoestable purificada. Por la presente invención se identifica una región o secuencia característica en la secuencia de aminoácido de las ADN polimerasas termoestables que aumenta la eficiencia de la habilidad de la polimerasa para incorporar ribonucleótidos mientras que retienen la habilidad para incorporar fielmente deoxirribonucleótidos . Alteraciones en esta región, p. ej . uno o mas aminoácidos cambiados (p. ej . introducido por mutagénesis específica de sitio) proporciona una enzima polimerasa termoestable que es capaz de sintetizar un ARN o un ARN/ADN quimérico o hebra híbrida en un molde de ADN. En otro aspecto, la invención provee métodos y composiciones mejoradas para determinar la secuencia de un ácido nucleico blanco, en donde la necesidad para ddNTPs terminador de cadena es eliminada. Por medio de los métodos mejorados proporcionados aquí, se incorporan ribonucleótidos (rNTPs) productos de extensión de cebador. Debido a que las enzimas tema incorporan exacta y eficientemente rNTPs o dNTPs, las reacciones de secuenciación pueden utilizar mezclas de ambos nucleótidos. Siguiendo la extensión del cebador, nuevamente productos ?e oligonucleótidos sintetizados pueden ser insertados en l s rNTPs incorporados por métodos conocidos en el arte, p. ej. hidrólisis, de este modo proveen una población de fragmentos adecuados para fraccionamiento y análisis de seuencia por medios convencionales, tal como electroforesie en gel . Estos métodos utilizan las nuevas enzimas polirerasa termoestables proporcionadas aquí. Así, en este ¿specto la invención proporciona enzimas ADN polimerasa termoestables que se caracterizan en que la polimerasa contiene el fragmento crítico SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID J»O:1), en donde "Xaa" en posición 4 puede ser cualquier residuo aminoácido pero no un residuo ácido glutámico (Glu) y "Xaa" en posición 7 es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (lie) . En otro aspecto de la invención, las polimerasas modificadas descritas aquí proporcionan medios para la incorporación de ribonucleótidos o análogos que contienen un grupo hidroxil, u otra substitución, en la posición 2' que, en comparación, está ausente en los deoxirribonucleótidos convencionales. Estos nucleótidos pueden ser marcados diferencialmente, proporcionando alternativas al uso convencional de dideoxinucleótidos para aplicaciones de secuenciación de ADN. Las enzimas mutantes polimerasa termoestable de la invención se caracterizan por la habilidad para incorporar mas eficientemente nucleótidos no convencionales, particularmente ribonucleótidos, que las enzimas tipo silvestre correspondientes. En una modalidad preferida de la invención, el nucleótido no convencional a ser incorporado podría ser una base análoga terminadora de cadena, tal como 2 ' -hidroxi-3' deoxi ATP (cordicepin trifosfato) un "riboterminador" análogo de ATP, o un nucleótido no terminador de cadena tal como rNTP. En otro aspecto de la invención, se proporcionan enzimas mutantes polimerasa termoestable que se caracterizan por la habilidad de incorporar mas eficientemente nucleótidos no convencionales, que las enzimas tipo silvestre correspondientes. Así, en este aspecto de la invención se suministran enzimas recombinantes ADN polimerasa termoestables que se caracterizan cada una en que (a) en su forma nativa la polimerasa contiene la secuencia de aminoácido SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), en donde "Xaa" en posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (lie) ; (b) la secuencia aminoácido es mutada en la enzima recombinante, preferiblemente en posición 4 de esta secuencia así que el residuo ácido glutámico en posición 4 es otro residuo aminoácido, preferiblemente un residuo glicina; y (c) la enzima recombinante ha reducido la discriminación contra la incorporación de ribonucleótidos y ribonucleótidos análogos en comparación a la forma nativa de dicha enzima. En otro aspecto de la invención la polimerasa de la invención proporciona un medio conveniente de productos de amplificación de fragmentos y productos de extensión de cebado. Tales productos fragmentados podrían ser útiles en metodologías basadas en hibridización y una variedad de estrategias de detección de secuencia. Las enzimas de la presente invención y los genes que las codifican pueden usarse para suministrar composiciones para uso en reacciones de secuenciación de ADN que comprende una mezcla de nucleótidos convencionales y al menos un ribonucleótido o ribonucledtido análogo. En una modalidad preferida de la invención el nucleótido no convencional es un ribonucleótido, y la concentración de ribonucleótido es menor que la concentración del correspondiente deoxirribonucleótido, p. ej . , la relación rNTPrdNTP es 1:1 o menor. Las enzimas de la invención también son adecuadas para la comercialización en formatos de equipo, tales equipos podrían incluir también cualquiera de los siguientes elementos adicionales necesarios para una reacción de secuenciar-' ón de ácido nucleico, tal como p. ej . d-NTPs, rNTPs, amortiguadores y/o cebadores.

Descripción Detallada ?e la Invención La presente invención proporciona enzimas modificadas mejoradas ADN polimerasa termoestables, las composiciones y los equipos se definen en el apéndice de reivindicaciones. Las enzimas de la invención incorporan mas eficientemente nucleósidos trifosfato no convencionales que la polimerasa previamente conocida o las correspondientes enzimas polimerasa tipo silvestre de donde se derivan estas nuevas polimerasaß. También se proporcionan las secuencias de ADN que codifican estas enzimas modificadas, vectores para expresar las enzimas modificadas, y las células transferidas con tales vectores. Laß enzimas de la invención permiten la práctica de nuevos métodos de secuenciación de ADN que son ventajosos sobre los procedimientos de secuenciación de ADN conocidos del arte anterior. Para facilitar el entendimiento de la invención, a continuación se definen un número de términos. El término "convencional" cuando se refieren a bases de ácidos nucleicos, nucleósidos trifosfatos, o nucleótidos se refiere a aquellos que ocurren naturalmente en el polinucleótido que se está describiendo (p. ej . , para ADN hay dATP, dGTP, dCTP y dTTP) . Adicionalmente, c7dGTP y dITP se utilizan frecuentemente en lugar de dGTP (aunque se incorporen con eficiencia mas baja) en reacciones de síntesis in vitro. tal como secuenciación. Colectivamente estos podrían ser referidos como deoxirribonucleósidos trifosfatos (dNTPs) . El término "sistema de expresión" se refiere a secuencias de ADN que contienen una secuencia de codificación deseada y secuencias de control en ligandos operables, así que los huéspedes transformados con estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Para efectuar la transformación, el sistema de expresión podría ser incluido en un vector, sin embargo, el ADN relevante podría ser integrado en el cromosoma del huésped. El término "gen" se refiere a una secuencia de ADN «que contiene secuencias de control y codificación necesarias para la producción de un polipéptido bioactivo recuperable o precursor. El polipéptido puede ser codificado por una secuencia de gen completa o por cual«quier porción de la secuencia codificante tanto que se mantiene la actividad enzimática. El término "célula(s) huésped(es)" se refiere a células procarióticas y de organismos eucarióticos tales como bacterias, levaduras, y actinomicetos, y células individuales de plantas superiores o animales cuando están creciendo en cultivo de células. Como se usa aquí, el término "mezcla de reacción de secuenciación de ADN" se refiere a una mezcla de reacción que contiene elementos necesarios para una reacción de secuenciación de ADN. Así, una mezcla de reacción de secuenciación de ADN es adecuada para usar en un método de secuenciación de ADN para determinar la secuencia de ácido nucleico de un receptor, aunque la mezcla de reacción podría ser incompleta inicialmente, tal que la iniciación de la reacción de secuenciación es controlada por el usuario. De esta forma, la reacción podría ser iniciada una vez que un elemento final, tal como la enzima, se adiciona, para proporcionar una mezcla de reacción completa de secuenciación de ADN. Típicamente, una reacción de secuenciación de ADN contendrá un amortiguador, adecuado para la actividad de polimerización, nucleósidos trifosfatos y por lo menos un nucleótido no convencional . La mezcla de reacción también podría contener un cebador adecuado para la extensión en un receptor de una enzima polimerasa, una polimerasa y un ácido nucleico receptor. El cebador o uno de los nucleótidos es marcado en general con un medio detectable tal como un marcado fluorescente. En general, la reacción es una mezcla que comprende cuatro nucleótidos convencionales y por lo menos un nucleótido no convencional. En una modalidad preferida de la invención, la polimerasa es una ADN polimerasa termoestable y el nucleótido no convencional es un ribonucleótido. El término "oligonucleótido" como se usa aquí es definido como una molécula que contiene dos o mas deoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente mas de tres, y usualmente mas de diez. El tamaño exacto de un oligonucledtido dependerá de muchos factores, incluyendo la función fundamental o uso del oligonucleótido. Los oligonucleótidos pueden ser preparados por cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, clonación y restricción de secuencias apropiadas y síntesis química dirigida por un método tal como el método fosfotriéster de Narang et al - . 1979, Meth . Enzvmol . £1:90-99; el método dietilfosforamidita de Beaucage fi£_al., 1981, J. Am- Chem. Soc- 103:3185-3191: métodos de síntesis automatizados; o el método de soporte sólido de la Patente U.S. No. 4,458,066.

El término cebador como se usa aquí se refiere a un oligonucleótido, ya sea natural o sintético, que es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en que se inicia la extensión del cebador. Un cebador es de preferencia una hebra simple de oligodeoxirribonucleótido. La longitud apropiada del cebador depende del uso destinado del cebador pero típicamente es del rango de 15 a 35 nucleótidos. Moléculas pequeñas de cebador en general requieren temperaturas mas frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde pero debe ser suficientemente complementario para hibridizar con un molde al ocurrir la elongación del cebador. Un cebador puede ser marcado, si se desea, por incorporación de una marca detectable por medios de espectroscopia, fotoquímico, bioquímico, inmunoquímico, o químico. Por ejemplo, las marcas útiles incluyen "P, tintes fluorescentes, reactivos de compactación de electrón, enzimas (como las usadas comúnmente en ?LISAs) , biotina, o haptenos y proteínas para los que se dispone de antisera y anticuerpos monoclonales . El término "polimerasa termoestable", se refiere a una enzima que es estable al calor, es resistente al calor y mantiene actividad suficiente, para efectuar subsecuentes reacciones de extensión de cebador cuándo es sometida a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble hebra. Como se usa aquí, una polimerasa termoestable es adecuada para usar en una reacción de temperatura cíclica tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Para una polimerasa termoestable, la actividad enzimática se refiere a la catálisis de la combinación de los nucleótidos en la forma adecuada para formar productos de extensión del cebador que son complementarios a un molde de hebra de ácido nucleico. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización del ácido nucleico dependerá, p. ej . , en la concentración de sal del amortiguador y la composición y longitud de los ácidos nucleicos que son desnaturalizados, pero típicamente en el rango de aproximadamente 90°C a 105°C, preferiblemente 90°C a 100ßC, durante un tiempo que depende principalmente en la temperatura y longitud del ácido nucleico, típicamente de unos pocos segundos hasta cuatro minutos . El término "no convencional" o "modificado" cuando se refiere a una base de ácido nucleico, nucleósido trifosfato o nucledtido, incluyen modificación, derivaciones, o análogos de bases convencionales, o nucleótidos que ocurren naturalmente en ADN. Mas particularmente, como se usa aquí, los nucleótidos no convencionales se modifican en la posición 21 del azúcar ribosa en comparación a los dNTPs convencionales. Así, para ARN los nucleótidos que ocurren naturalmente son ribonucleótidos (p. ej . , ATP, GTP, CTP, UTP colectivamente rNTPs) , debido a que estos nucleótidos tienen un grupo hidroxilo en la posición 2' del azúcar, la que, en comparación está ausente en dNTPs, como se usa aquí, los ribonucleótidos son nucleótidos no convencionales. Los análogos de ribonucleótidos que contienen sustituciones en la posición 2', tales como análogos substituidos 2* -fluoro- o 2' -amino-, están en el alcance de la invención. Adicionalmente, los análogos de ribonucleótidos podrían estar modificados en la posición 3', por ejemplo, por reemplazo del grupo hidroxilo normal por un grupo hidrógeno (3' deoxi) , que provee un terminador análogo de ribonucleótido. Tales nucleótidos se incluyen también en el alcance del término "nucleótidos no convencionales". Dado que el ADN está compuesto convencionalmente de dNTPs, la incorporación de un rNTP podría ser no convencional y así un rNTP podría ser una base no convencional. Consecuentemente, en una modalidad preferida de la invención, para los métodos de extensión de cebador de ADN que incluyen métodos de secuenciación de ADN, los productos de ácido nucleico contienen nucleótidos convencionales y no convencionales, y predominantemente contienen nucleótidos convencionales como son dNTPs.

Las bases no convencionales podrían ser marcadas fluorescentemente con, por ejemplo, fluoresceína o rodamina; marcados no fluorescentemente con, por ejemplo biotina; marcados isotópicamer e con, por ejemplo, "P, 33P, o 3!S o no marcados . Para facilitar mas el entendimiento de la invención, enzimas específicas ADN polimerasa estable son referidas en toda la especificación para ejemplificar la invención; sin embargo, estas referencias no intentan limitar el alcance de la invención. En una modalidad preferida las enzimas termoestables de la invención se utilizan en una variedad de métodos de secuenciación de ácido nucleico, aun cuando las nuevas polimerasas termoestables descritas aquí podrían ser usadas para cualquier propósito en que tal actividad enzimática es necesaria o deseada. La enzima también puede ser usada en reacciones de amplificación tales como PCR. Las polimerasas termoestables de la invención se caracterizan en que cada una contiene el fragmento crítico SerGlnlleXaaLeuArgXaa {SEQ ID NO:l), en donde "Xaa" en posición 4 de esta secuencia es cualquier residuo aminoácido pero no un residuo ácido glutámico (Glu) y "Xaa" en posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (lie) . Los genes que codifican polimerasas termoestables que tienen un residuo ácido glutámico en la posición 4 de dicho fragmento pueden ser modificados como se describe aquí para proporcionar enzimas modificadas polimerasa adecuadas. Dichas enzimas modificadas polimerasa termoestables se caracterizan en que en comparación a las correspondientes enzimas nativas o tipo silvestre, tienen una modificación en el fragmento secuencia de aminoácido SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID N0:2) , en donde "Xaa" en posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (He), p. ej . dicho fragmento ha sido modificado por reemplazo del residuo ácido glutámico en la posición 4 por otro residuo aminoácido. El fragmento crítico de una ADN polimerasa termoestable proporcionado por la presente inv-,--ción es mostrado abajo usando la carta particular de codificación de aminoácido (Lehninger, Biochemistry, New York, New York, Worth Publishers Inc., 1970, página 67) .

(SEQ ID N0:1) SerGlnlleXaaLeuArgXaa, en donde "Xaa" en posición 4 es cualquier residuo aminoácido pero no un residuo ácido glutámico (Glu) y "Xaa" en posición 7 es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (He) . Ambos, secuencias de genes codificantes y proteínas que contienen esta secuencia crítica de aminoácido, en donde Xaa en posición 4 no es un residuo ácido glutámico (Glu) , proporcionan una polimerasa que tiene disminuida la discriminación contra rNTPs, y están en el alcance de la invención. En el fragmento crítico, podrían hacerse modificaciones adicionales con respecto a otros residuos aminoácido en este fragmento crítico, preferiblemente con respecto a un residuo aminoácido seleccionado del grupo de glutamina (Glu o Q) , leucina "fLeu o L) , o arginina (Arg o R) . La presente invención es adecuada para preparar enzimas ADN polimerasa termoestables con propiedades ventajosas por modificaciones particulares de la secuencia del gen que codifica una ADN polimerasa termoestable. En una modalidad preferida de la invención, la secuencia del gen y la enzima codificada se derivan de una especie del género Thermus . aunque se incluyen eubacterias no Thermus en el alcance de la invención como se describe abajo en detalle. Análogamente, en vista de la naturaleza altamente conservada del ahora identificado fragmento crítico, nuevas ADN polimerasas termoestables podrían ser identificadas basadas en su homología, por ejemplo, Taq polimerasa. Tales polimerasa termoestables están en el alcance de la presente invención, todo el tiempo que su secuencia de aminoácido contenga el fragmento S Q I X L R V/I, en donde X es un residuo aminoácido pero no residuo ácido glutámico y que la secuencia aminoácido despliegue al menos aproximadamente 39%, de preferencia al menos aproximadamente 60%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 80% de homología en general (secuencia idéntica) en comparación a la secuencia de aminoácido de la Taq polimerasa nativa. La secuencia completa de dicha Taq polimerasa es proporcionada en WO 89/06691 y accesible bajo acceso No. P90556 en el banco de datos de secuencias de la patente GENESEQ o bajo acceso No. M26480 en el banco de datos de secuencias EMBL y bajo el no. de acceso A33530 en el banco de datos se secuencia de PIR.

Ejemplarmente las ADN polimerasas termoestables de la presente invención son derivados recombinantes de las polimerasa nativas de los organismos listados en la tabla 1 de abajo. La tabla 1 indica la secuencia particular del fragmento crítico y la posición del residuo "X" para cada una de estas polimerasas nativas. Debido a que cada ADN polimerasa termoestable es única, la posición del aminoácido del fragmento crítico es distinto para cada enzima. Para las polimerasa listadas abajo, el residuo aminoácido en la posición "X" del fragmento crítico S Q I X L R V/I ÍS ácido glutámico. Las polimerasas preferidas de la presente invención tienen un peso molecular en el rango de 85' 000 a 105' 000, mas preferentemente entre 90 '000 a 95*000. La secuencia de aminoácido de estas polimerasas consiste de aproximadamente 750 a 950 residuos aminoácido, preferible entre 800 a 850 residuos aminoácido. Las polimerasas de la presente invención podrían consistir también de aproximadamente 540 o mas aminoácidos y contener al menos el dominio de la polimerasa y una porción que corresponde al dominio de la- exonucieasa 3' a 5' (la polimerasa resultante podría tener actividad exonucieasa 3' a 5' o no) y posibles partes del dominio de la exonucieasa 5' a 3', que es contenido en el primer tercio de la secuencia aminoácido de muchas enzimas polimerasa termoestable completas. Para las ADN polimerasas termoestables no mostradas en la tabla 1, identificar el ácido glutámico apropiado por modificación es simple una vez que el fragmento crítico o fragmento consenso en la secuencia aminoácido es identificado. Sin hacer caso de la posición exacta en una ADN polimerasa termoestable, el reemplazo del residuo ácido glutámico (Glu) por otro residuo aminoácido en el fragmento secuencia SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO:2) , en donde "Xaa" en posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (He) del dominio de la polimerasa sirve para suministrar polimerasas termoestables «que tienen la habilidad de incorporar eficientemente nucleótidos no convencionales. En una modalidad preferida, el ácido glutámico es reemplazado por un aminoácido que tiene un grupo polar R sin carga tal como glicina, serina, cisteína, treonina o por un aminoácido que tiene un pequeño grupo no polar R tal como p. ej . alanina. En una mayoría de la modalidad preferida, el residuo ácido glutíimico es reemplazado por un residuo glicina (G) . Los pro ramas de alineamiento de la secuencia de aminoácido y ácido nucleico son disponibles fácilmente de Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin. Dado el fragmento particular identificado aquí, estos programas, incluyen, por ejemplo, "GAP", "BESTFIT" y "PILEUP", sirven para asistir en la identificación «.--; la región exacta de la secuencia a ser modificada. Como es evidente en la tabla 1 de abajo hay esencialmente dos formas del fragmento de secuencia conservado SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2) en el dominio de la polimerasa de las enzimas ADN polimerasa termoestables de organismos termofílicos. El fra-gmento secuencia SerGlnlleGluLeuArgVal (SEQ ID NO:3) está presente en las polimerasas termoestables nativas de la especie Thermus tal como p. ej . de Thermus aquaticus. Thermus caldofilus. Thermus thermoghilus, Thermus Elavus y de Thermus filiformis así como de las especies Thermus spsl7 y Z05. El fra>gmento secuencia SerGlnlleGluLeuArgVal (SEQ ID NO: 3) también está presente en el dominio de otras enzimas ADN polimerasa termoestable nativas, e. ej . de Thermosipho africanus y de varias cepas de BacillUS tales como Bacillus caldotenax y Sacillus stearothermophilus . El fragmento secuencia SerGlnlleGluLeuArglleu {SEQ ID NO:4) está presente p. ej . en las polimerasas termoestables nativas de Thermotosa marítima. Thermotosa neapolitana y Anaerocellum thermophilum.

Tafcla- .

Or anismo Fragmento consenso Posición del aminoácido AíiÓQ QlutPiCQ S Q I X R V/I Ti-enns aquatie s ¡Taq! S Q I S L R V 615 Theraus cal ofilus (Tea) S Q I E L R V 617 The: ?s theraophihs (Tth) S Q I S L R V 617 T err.us flavus (Tfl) s g I S L R V 616 TtaS U forats (Tfi) S Q I 3 L R V 613 especie The us sps!7 S Q I B R V 613 especie Tiierais ZOS S Q I S L R V 617 Theraotcaa -narit ma (Tina) s g I E L R I 678 Ttei-aQHga awpgUtaH <Tnel s : s L R i 678 Ti-sras ipl-o africamis af) S Q I S L R V 677 Acaaracell a theraophi m (Ath) S Q I E L R I 632 3a?;l;ug cal- e as (Bca) s g I E L R V 659 ?i>;; : S 5»KQtl-«aQP-IÍl)18 (Bstl s g : s L R v 658, 661 o 736* dependiendo de la secuencia de aminoácido seleccionada La secuencia completa de ácido nucleico y aminoácido para cada polimerasa de Taq, Tth, Z05, spsl7, Tma y Taf ha sido publicada en la Patente U.S. No. 5,466,591 y se incorporan aquí por referencia. Las secuencias de la ADN polimerasa de Tea, Tfl, Tne, Ath, Bca y Bst han sido publicadas como sigue: Tea en el banco de datos de secuencias de EMBL bajo acceso No. U62584 (ver también Kwon, 1997, Mol . Cells 7 (2) :264-27l) : Tfl en Akhmetzjanov y Va hitov, 1992, Nucleic Acids Research 20(21) :5839; Tne en WO 97/09451 y WO 96/41014; Ath en el banco de datos de secuencias bajo acceso No. X98575 (para detalles en la cepa Ath ver Rainey et al .. 1993, J. Bacteriol. 175(15) .-4772-2779; Bst en Uemori ej_al., 1993, J. Biochem. 113:401-410 y bajo el banco de datos de secuencias EMBL acceso No. U23149 (ver también Phang et al., 1995, Gene 163:65-68) . Las secuencias aminoácido de la polimerasa de Bst «que contienen un E en el fragmento crítico en la posición 658 también se proporcionan la Patente Japonesa publicación JP 05/304 964 A, Patente Europea publicación No. EP-A-699, 760, v Aliotta et al .. 1996. Genet. Anal. 12:185-195: la secuencia también es disponible del banco de datos de secuencias EMBL bajo acceso No. U33536. La secuencia como se publicó en Gene 163:65-68 (1995), contiene el "E" del fragmento crítico en el residuo número 661. Bca en Uemori e al • . 1993, J, BJQChem- 113:401-410 y bajo el banco de datos de secuencias EMBL acceso No. D12982. La ADN polimerasa termoestable del Thermug filiformis (ver FEMS Microbiol. Lett. 22:149-153. 1994; también disponible del Depósito ATCC No. 43280) puede ser recuperada usando los métodos proporcionados en la Patente U.S. No. 4,889,818, así como basado en la información de la secuencia proporcionada en la tabla 1. Cada una de las secuencias y publicaciones anteriores se incorporan aquí por referencia. La homología de la secuencia (secuencia idéntica) entre la secuencia de aminoácido de la forma nativa de la Taq polimerasa como se proporciona en WO 89/06691 y la Tfl polimerasa mencionada arriba es 87.4%. Las homologías correspondientes con respecto a la Tth polimerasa es 87.4%, con respecto a la Tea polimerasa es 86.6%, con respecto a la Tea polimerasa es 86.6%, con respecto a la Bst polimerasa (acceso No. U23194) es 42.0%, con respecto a la Bca polimerasa es 42.6% y con respecto a la Ath polimerasa es 39.7%. Como demuestra la tabla 1, el fragmento crítico es conservado remareadámente entre las ADN polimerasas termoestables. Donde "X" es un residuo ácido glutámico, la alteración del gen que codifica la polimerasa proporciona la enzima de la invención, que incorpora fácilmente rNTPs en comparación a, por ejemplo, Taq polimerasa en donde el fragmento crítico no está modificado. Consecuentemente, la invención se refiere a una clase de enzimas que también incluyen, por ejemplo, la ADN polimerasa termoestable, y que corresponden al gen y vectores de expresión de Thermus oshimai (Williams et al-, 1996, int , , Sys . Bacteriol , (2) :403-408) ; Thermus SilvatlUS Y ThermUS CÍl iafQPhilUS (Tenreiro et al .. 1995, Res. Microbiol. 146 (4) -.315-324) . Thermus brockianus (Munster, 1986, Gen. Microbiol. 132:1677) y Thermus rufrer, Loginov =£ — ai- , 1984 , mt . j . -?yñr Bacteriol. 34:498-499; también disponibles del Depósito ATCC No. 35948. Adicionalmente, la invención incluye, por ejomplo, las formas modificadas de las ADN polimerasas termoestables, y que corresponden al gen y vectores de expresión de Thermotosa elfü (Ravot =£ ai., 1995, Int. J. ff?fft , Bacteriol. 45:312: también disponible del Depósito DSM No. 9442) y Thermotosa ther arum (Windberger et al .. 1992, int . J. Syst. Bacteriol. 42:327: también disponible del Depósito DSM No. 5069) . Cada una de las secuencias y publicaciones anteriores se incorporan a«quí por referencia. En una modalidad preferida de la invención, el fragmento crítico a ser modificado es en la secuencia aminoácido LeuAspTyrSerGlnlleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ ID NO: 5) . Así, un aspecto de la invención involucra la generación de mutantes de ADN polimerasa termoestable desplegando eminentemente la eficiencia aumentada para incorporar nucleótidos no convencionales en un molde de manera dependiente. En una modalidad particularmente preferida , la secuencia de la polimerasa contiene LeuAspTyrSerGlnlleGlyLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ ID NO: 6) . Tales ADN polimerasas termoestables son particulaemente adecuadas en procesos tales como secuenciación de ADN, ADN en síntesis de ARN dirigida, y síntesis in vitro de ADN substituido de rNTP.

La producción de ADN polimerasas termoestables con eficiencia aumentada para incorporar bases no convencionales podría ser realizado por procesos tales como mutagénesis dirigida. Ver, por ejemplo, Sambrook et a\ . r Molecular Clonins: A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor, 1989, second edition, Chapter 15.51, "Oligonucleotide-Mediated Mutagenesis", que es incorporado aquí por referencia. Por ejemplo, una mutación de "A" a "G" en la segunda posición del codón que codifica ácido glutámico en el residuo 615 en la secuencia del gen de la ADN polimerasa de Thermus aqua ieug (Taq) (ver SEQ ID NO: 7) resulta en mas que un incremento de 50 veces en la eficiencia de la incorporación de nucleótidos no convencionales, como se definen aquí, mientras que se retiene la habilidad de la enzima para mediar PCR en la presencia de nucleótidos convencionales, p. ej . , dTPs. En la Taq ADN polimerasa esta mutación particular resulta en un cambio de aminoácido de E (ácido glutámico) a G (glicina) . Aunque este cambio particular de aminoácido altera significativamente la habilidad de la enzima para incorporar nucleótidos no convencionales, se espera que el reemplazo del residuo ácido glutámico por cualquier otro residuo aminoácido tal como p. ej . por un residuo serina, cisteína, treonina, alanina, valina o leucina tiene el mismo efecto. Otras substituciones de aminoácido que reemplazan E615 son las mismas del alcance de la invención, no obstante E615G representa una modalidad preferida. Así, un aspecto crítico de la invención es que el cuarto residuo aminoácido en el fragmento de SEQ ID N0:1 no es un residuo ácido glutámico. La mutagénesis dirigida también puede ser realizada por mutagénesis dirigida del cebador específico. Esta técnica es ahora estándar en el arte y se dirige usando un cebador de oligonucleótido sintético complementario para un fago de ADN de hebra simple para ser mutagenizado excepto por un error limitado que representa la mutación deseada. Brevemente, el oligonucleótido es usado como un cebador para dirigir la síntesis de una hebra complementaria al plásmido o fago y el ADN de hebra doble resultante es transformado en un fago que soporta la bacteria huésped. La bacteria resultante puede ser probada por, por ejemplo, análisis de secuencia de ADN o prueba de hibridización para identificar las placas que portan la secuencia deseada del gen mutado. Alternativamente, pueden emplearse métodos "PCR recombinantes" que se describen en PCR Protocols. San Diego, Academic Press, Innins ££_al-editors, 1990, Capitulo 22, titulado "PCR Recombinante" por Higuchi, páginas 177-183. Como se demostró en la tabla l, el ácido glutámico en el fragmento crítico de Taq polimerasa es conservado en otras ADN polimerasas termoestables pero podría ser localizado en una posición diferente pero cercana en la secuencia de aminoácido. Una mutación del ácido glutámico conservado en SEQ ID NO: 2 -de las ADN polimerasas termoestables de las especies de Thermus y las ADN polimerasas relacionadas de las especies Thermotosa. t-hgrm.QSiphP y Anaerocellum. tendrán un efecto aumentado similar en la habilidad de la polimerasa para incorporar eficientemente nucleótidos no convencionales en comparación a la Taq polimerasa que comprende la SEQ ID N0:2. Las mutaciones en el residuo ácido glutámico en el fragmento crítico en otras ADN polimerasas termoestables pueden ser realizadas utilizando los principios y técnicas usadas para mutagénesis dirigida. Hay varias secuencias presentadas para la ADN polimerasa de Bacillus St arother ophilus en el Gene Bank, o SwissProt/PIR databases . Estas secuencias están altamente relacionadas, pero algo diferentes una de la otra, pero cada una contiene el fragmento de secuencia crítico idéntico SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2) , en donde "Xaa" en posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (lie) , aun«que en diferentes posiciones en la secuencia. Basada en la secuencia de aminoácido y ácido nucleico públicamente disponible para ADN polimerasas termoestables como se describen aquí, también es posible construir, por medio de metodologías recombinantes convencionales, polimerasas quiméricas que se forman de dominios derivados de diferentes ADN polimerasas termoestables. Las Patentes U.S.

Nos. 5,466,591 y 5,374,553 describen métodos para intercambiar varios segmentos funcionales de polimerasas termoestables, tal como el dominio de la exonucieasa 51 a 3', el dominio de la exonucieasa 3 ' a 5 ' y el dominio de la polimerasa para proporcionar nuevas enzimas. Las enzimas polimerasa termoestable quiméricas preferidas contienen un dominio exonucieasa de 5 ' a 3 ' , un dominio exonucieasa 3 ' a 5' y un dominio polimerasa, por medio del cual un dominio es derivado de una diferente polimerasa y por lo cual el dominio polimerasa contiene el fra«gmento de secuencia crítico SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO.-l), en donde "Xaa" en posición 4 de esta secuencia es cualquier residuo aminoácido pero no un residuo ácido glutámico (Glu) y "Xaa" en posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (lie) . Ejemplos para tales moléculas quiméricas son enzimas quiméricas Taq/Tma que están compuestas como se especifica en la tabla 2. Como se indica en esta tabla el dominio de la polimerasa de estas enzimas quiméricas Taq/Tma contiene la mutación en el fragmento crítico especificado arriba. labial El plásmido pCl ha sido depositado bajo el Tratado de Budapest con el ATCC de Julio 17 de 1996 y acceso No. 98107. El plásmido pCl contiene un gen que codifica una ADN polimerasa termoestable que está mutada en el codón que codifica el residuo ácido glutámico en la posición 615 de la secuencia de aminoácido de la Taq polimerasa nativa, resultando en una forma mutada de la Taq polimerasa que tiene un residuo glicina en la posición 615 (E615G Taq polimerasa mutada) . Este depósito provee medios alternativos para proporcionar ADN polimerasa termoestables que tienen una eficiencia aumentada para incorporar análogos de nucleótidos no convencionales. El Ejemplo I ilustra el uso de sitios flanqueados de restricción adecuados para subclonar la mutación E615G para crear otras enzimas ADN polimerasa termoestables . Debido a que la secuencia completa del gen para numerosas ADN polimerasas termoestables se conoce , otros medios para introducir una mutación en el codón que codifica E615, tal como restricción por digestión y reemplazo de fragmento, o por mutagénesis de sitio específico in vitro. se disponen fácilmente para aquellas prácticas del arte basadas en la información de secuencias del fragmento crítico proporcionado aquí . El gen modificado o fragmento de gen preparado para mutagénesis de sitio específico puede ser recuperada del plásmido o fago, por medios convencionales y ligada en un vector de expresión para subsecuente cultivo y purificación de la enzima resultante. Numerosos vectores de clonación y expresión, incluyendo sistemas mamarios y bacterianos, son adecuados para practicar la invención, y se describen en por ejemplo, Sambrook et al .. Molecular l0Pínq: A abQratQiy Ma ual, second edition, Cold Spring Harbor, 1989. Por conveniencia, la presente invención es ejemplificada utilizando la lambda derivada del promotor PL (Shimatake g£ al., 1981, Nature 292:128) . El uso de este promotor es descrito específicamente en las Patentes U.S. Nos. 4,711,845 y 5,079,352.

Las ADN polimerasas termoestables de la presente invención se purifican en general de organismos tales como p. ej . E. coli que ha sido transformada con un vector de expresión ligado operablemente a un gen que codifica una polimerasa tipo silvestre o una ADN polimerasa modificada. Un ejemplo de un microorganismo huésped adecuado es la cepa E. fiflli DG116 descrita por Lawyer ej_al., 1993, PCR Methods and Applications 2:275-287. esta cepa es también disponible de la American Type Culture Collection bajo acceso No. ATCC 53601. Los métodos de purificación de la polimerasa termoestable también se describen en, por ejemplo, Lawyer et al .. 1993, PCR Methods and Applications 2:275-287. Aquellas prácticas del arte reconocerán que las ADN polimerasas termoestables con eficiencia aumentada para incorporar nucleótidos no convencionales se preparan mas fácilmente usando métodos de tecnología de ADN recombinante. Cuando uno desea producir una de las enzimas de la presente invención, o un derivado u homólogo de las enzimas, la producción de una forma recombinante de la enzima involucra típicamente la construcción de un vector de expresión, la transformación de una célula huésped con el vector, y cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones tales que ocurra la expresión. Los medios para preparar vectores de expresión, transformación y cultivo de células huésped son bien conocidos en el arte y se describen en detalle en, por ejemplo, Sambrook e _al. , 1989, =upx . La presente invención proporciona ADN polimerasas termoestables adecuadas para usar con ribonucleósidos trifosfatos para numerosas aplicaciones incluyendo, amplificación de ácido nucleico, métodos de detección y secuenciación de ADN. El uso de ribonucleótidos en secuenciación evita el alto costo de terminadores de cadena análogos, tales como ddNTPs e importantemente, facilita la preparación de nuevos productos de amplificación adecuados no solo para análisis de secuencia de ADN sino también otro tipo de análisis tal como electroforesis o hibridización sin la necesidad de conducir subsecuentemente reacciones de secuenciación de ADN. La pirofosfatasa ha sido mostrada para aumentar los resultados de secuenciación usando polimerasas mesofílicas y ADN polimerasa termoestable por medio de la disminución de la cantidad de pirofosforólisis como productos de extensión acumulados. En verdad, los métodos anteriores de ciclo de secuenciación requieren que la enzima adicional se incluya en la reacción de secuenciación. Sin embargo, un aspecto muy útil y ventajoso de la presente invención es que la pirofosfatasa no es requerida para secuenciación de ADN. Así, el uso de las nuevas enzimas proporcionadas aquí elimina la necesidad para el gasto adicional de adicionar una segunda enzima en la mezcla de reacción de secuenciación.

Mediante la utilización de las enzimas de la presente invención, la amplificación y las reacciones de secuenciación se combinan, lo que ahorra tiempo y materiales, así como simplifica el análisis total. Estas ventajas, y otras, son disponibles principalmente porque la incorporación de nucleótidos convencionales así como ribonucleótidos y análogos de ribonucleótidos en un producto de extensión de cebador proporciona una hebra quimérica de ARN/ADN que es susceptible a hidrólisis del ARN. El tratamiento no afecta la estructura de ADN y suministra una población de fragmentos de ácido nucleico cada que terminan en la posición donde un ribonucleótido fue insertado en lugar del d TP correspondiente. La hidrólisis es realizada fácilmente por varios medios incluyendo pero sin limitar a álcali (p. ej . por tratamiento con NaOH, p. ej . en una concentración final de 0.2M como se muestra después en el Ejemplo VI), tratamiento de calor o enzimático con una RNasa (Vogel =fc al., editors, ipformatíonal Macromolecular, New York, Academic Press, 1963, Capitulo por Berg =£_al- , titulado "The Synthesis of Mixed Polynucleotides Containing Ribo- adn Deoxiribonucleotide by Purified Preparation of DNA Polymerase from B. coli». páginas 467-483) . En una modalidad preferida, la presente invención proporciona composiciones nuevas y mejoradas particularmente útiles para métodos de secuenciación de ADN. Las nuevas enzimas descritas aquí son ventajosas en métodos de secuenciacidn de ácido nucleico usando terminadores coloreados o cebadores coloreados, así como otros métodos de secuenciación. Como se describió previamente, los métodos de terminación de cadena requieren en general extensión de cebador dependiente de molde en la presencia de nucleótidos terminadores de cadena, resultando en una distribución de fragmentos parciales «que se separan subsecuentemente por tamaño. La secuenciación estándar de dideoxi utiliza dideoxinucleósidos trifosfatos para terminación de cadena y una ADN polimerasa tal como el fragmento Klenow de B. coli Pol I (ver Sanger ej _al., supi-a-)- Así, el procedimiento básico de secuenciación de dideoxi involucra (i) alinear un cebador de oligonucleótido a un molde; (ii) extensión del cebador con ADN polimerasa en cuatro reacciones separadas, cada una contiene un nucleótido marcado, o un cebador marcado, una mezcla de dNTPs sin marca, y un ddNTP terminador de cadena; (iii) resolución de los cuatro grupos de productos de reacción por medio de, por ejemplo, electroforesis de alta resolución en gel desnaturalizador de poliacrilamida/urea, separación capilar o por otros medios de resolución; y (iv) producción de una imagen autorradiográfica del gel que puede ser examinada para inferir la secuencia. Alternativamente, los métodos de espectrometría de masas o métodos basados en hibridización, usando cebadores o nucleótidos marcados fluorescentemente, pueden ser usados para derivar la información de secuencia de ADN. La disponibilidad de polimerasas termorresistentes, tales como Taq polimerasa, han resultado en métodos mejorados para secuenciación (ver Patente U.S. No. 5,075,216) y las modificaciones aquí referidas como "ciclo de secuenciacidn" . ?n el ciclo de secuenciación, los ciclos de calentamiento y enfriamiento se repiten seguidos de numerosos productos de extensión para ser generados de cada molécula receptora (Murray, 1989, Nuceic hO± S Research 12:8889). Esta amplificación asimétrica de secuencias receptoras complementarias a la secuencia molde, en la presencia de terminadores de cadena dideoxi, producen una familia de productos de extensión de todos los tamaños posibles. Después de la desnaturalización del producto de reacción de extensión del molde de ADN, se presentan múltiples ciclos de alineación del cebador y extensión del cebador en presencia de terminadores dideoxi. Las polimerasa ADN termoestables tienen varias ventajas en el ciclo de secuenciación: toleran las temperaturas de alineación estringentes que se requieren para hibridización específica del cebador para ácidos nucleicos receptores así como toleran múltiples ciclos de alta temperatura de desnaturalización que se presentan en cada ciclo, p. ej . , 90-95°C. Por esta razón, se han incluido varias formas de la ADN polimerasa AmpliTaq* en los equipos Taq de ciclo de secuenciación comercializados por Perkin Elmer, Norwalk, CT. Aun así, la propiedad de la Taq ADN polimerasa, para discriminar contra la incorporación de nucleótidos no convencionales, tales como ddNTPs, presenta un problema cuando se usa para el ciclo de secuenciación, donde los ddNTPs o ddNTPs marcados fluorescentemente deben incorporarse como terminadores de cadena. En general, previo a la presente invención, la secuenciacidn de ADN con ADN polimerasas termoestables requerían una mezcla de nucleótidos terminadores de cadena, en general dideoxinucleótidos, a altas concentraciones, para asegurar que podría generarse una población de productos de extensión representando toda posible longitud de fragmento sobre una distancia de varios cientos de bases. Frecuentemente, para dirigir este problema costoso, los protocolos utilizaban concentraciones muy bajas de dNTPs convencionales, haciendo las reacciones ineficientes. Estas mezclas de reacción, que tienen una baja concentración de dNTP y una alta concentración de ddNTP, crean un ambiente en donde la polimerasa termoestable es envenenada esencialmente por substratos de nucleótido. Aún con el advenimiento de enzimas modificadas, tal como la AmpliTaq* ADN polimerasa FS que permite aumentar la concentración de dNTPs a niveles óptimos mayores, la enzima anterior aún cuenta con la presencia de ddNTPs costosos para la secuenciación de ADN. En contraste, la presente invención proporciona enzimas que no solamente permiten aumentar la concentración de dNTPs, sino evitar el uso de ddNTPs costosos usando en su lugar rNTPs para la incorporación en la hebra en crecimiento. La habilidad de las nuevas enzimas para efectuar eficientemente la substitución parcial de ribonucleótidos facilita la generación de secuenciación escalonada de ADN en la ausencia de una reacción separada para incorporar un nucleótido terminal. La elección de análogos de nucleótidos no convencionales adecuados para usarlos en los métodos de secuenciación de ADN fueron dictados previamente por la habilidad de la ADN polimerasa para incorporar dichos análogos. Desafortunadamente dichos análogos de nucleótido son más caros. Por ejemplo el costo de ddNTPs es aproximadamente 25X mas grande que el costo de rNTPs o dNTPs. Debido a que las ADN polimerasas termoestables anteriores eran incapaces de incorporar eficientemente rNTPs en un molde de forma dirigida en una hebra de ADN en crecimiento, tales ribonucleótidos que son disponibles fácilmente y baratos, no eran una opción para usar en la secuenciación de ADN con una ADN polimerasa termoestable. La presente invención elimina la necesidad de ddNTPs en reacciones de secuenciación de ADN. Así, en un aspecto de la invención se provee de métodos para el análisis de secuenciación de ADN que son significativamente menos caros que los anteriores métodos de terminación de cadena.

La presencia de manganeso en una reacción de extensión de cebador puede influenciar la habilidad de una polimerasa para insertar exactamente el nucleótido de base apareada correctamente. El manganeso puede usarse para forzar el apareo de bases incorrecto o para facilitar la discriminación contra la inserción de un análogo de nucleótido. El manganeso ha sido utilizado por los investigadores para inducir mutagénesis en la replicación de ADN o procedimientos de amplificación. Así, el manganeso puede afectar la fidelidad de una reacción de polimerización, así como el rendimiento de una reacción. La secuencia resultante podría ser incorrecta o, en un método de secuenciación de ADN, la información resultante podría ser ambigua. Los métodos presentes no requieren que se incluya manganeso como el catión divalente en la mezcla de reacción de secuenciación para forzar a la polimerasa a insertar un nucleótido no convencional. En contraste a las anteriores ADN polimerasas, la presente invención identifica el fragmento crítico en el dominio de la polimerasa para controlar la habilidad de la enzima para discriminar entre nucleótidos 2 ' substituidos y no substituidos sin la necesidad de manganeso. Las enzimas de la presente invención no requieren altas concentraciones de análogos de bases no convencionales para la secuenciación. Antes de la presente invención los análogos de bases no convencionales y las bases convencionales correspondientes estaban presentes en general en una relación (p. ej . , ddATP:dATP) del rango aproximado 1.3:1 a 24:1 para métodos de secuenciación de ADN de terminación de cadena (ver también Patente U.S. No. 5,075,216 de Innis et al.).En comparación, las polimerasas termoestables proporcionadas por la presente invención permiten reducir la relación de análogos de base no convencional a bases convencionales de un ciento a varios miles de veces. Una relación rNTP:dNTP de 1:1 o menor, en combinación con las nuevas enzimas proporcionadas aquí, es suficiente para el análisis de secuencia de ADN. En una modalidad preferida de la invención, la relación rNTP:dNTP se reduce a menos de 1:8. La relación de nucleótido 2* substituido del correspondiente dNTP natural podría ser tan baja como 1:80 o 1:200, dependiendo en particular del diseño experimental y la longitud deseada de los fragmentos.

Así, debido a que las enzimas presentes incorporan fácilmente nucleótidos no convencionales, tales como nucleótidos 2' substituidos, no es necesario forzar la incorporación de rNTP usando una alta concentración de rNTP y una concentración limitada del dNTP correspondiente. De acuerdo a, los métodos presentes es posible el uso de concentraciones óptimas de dNTPs en combinación con bajas cantidades de rNTPs.

Cuando las enzimas polimerasas modificadas de acuerdo con la presente invención se usan en un método de secuenciacidn adecuado, tal como p. ej . secuenciacidn de cebador coloreado, se obtienen buenos resultados de la secuenciación de ADN con una concentración de dNTP en el rango de 50-500 µM. Preferiblemente la concentración de dNTP está entre 100-300 µM. En estos rangos el rNTP correspondiente podría estar presente en aproximadamente la misma concentración del dNTP, o menor. Preferiblemente el rNTP está presente en aproximadamente 0.1 µM - 100 µM, mas preferible el rNTP está presente en aproximadamente 2.5 µM a 25 µM. La concentración adecuada de rNTPs para usar con las presentes enzimas modificadas puede determinarse fácilmente por titulación y experimentos de optimización para aquellas prácticas ordinarias del arte. La cantidad necesaria de rNTP o análogos será afectada por el tipo de experimento y podría ser influenciada por el tamaño del receptor y la pureza así como la selección del amortiguador y las especies particulares de enzimas. La relación de rNTP:dNTP determinará la frecuencia con que se inserta rNTPs en el oligonucleótido en crecimiento. Debido a que la hidrólisis sucederá en cada rNTP incorporado, la relación de rNTP:dNTP puede ajustarse para proporcionar el uso con flexibilidad para aumentar o disminuir el tamaño de los fragmentos resultantes. Como es bien entendido, el ADN es un polímero sintetizado de dNTPs. Cada deoxinucleósido trifosfato comprende un azúcar ribosa que contiene un grupo hidroxilo en la posición 3' un hidrógeno en la posición 2'. Los ribonucleótidos también contienen un grupo hidroxilo en la porción 3' del azúcar. Sin embargo, los rNTPs se distinguen de los dNTPs en la posición 2* del azúcar, donde un segundo grupo hidroxilo reemplaza el átomo de hidrógeno. En el presente contexto, los rNTPs ejemplifican la habilidad de las enzimas de la presente invención para incorporar exactamente nucleótidos 2' substituidos. Sin embargo, los compuestos de la invención no se limitan al uso de nucleótidos no convencionales que son ribonucleótidos. La modificación de la secuencia de la polimerasa termoestable en el dominio crítico identificado aquí permite la incorporación dirigida del molde de nucleótidos alternativos 2' substituidos, tales como 2'-hidroxilo, 3 ' -deoxi nucleótidos y nucleótidos 2 '-fluoro o amino substituidos. Como se describe en los ejemplos de aquí, la incorporación de 3' -deoxi, 2 '-hidroxi ATP, referido aquí como cordicepina trifosfato, se facilita por la presencia de una segunda mutación en la polimerasa termoestable que reduce la discriminación contra la incorporación de un nucleótido que contiene un deoxi en la posición 3' de la ribosa. Tales enzimas han sido previamente descritas por ejemplo en EP-A-655506 y en U.S. Serie No. 08/448,223, presentada el 23 de mayo de 1995, que se incorporan aquí por referencia. El Depósito ATCC No. 69820, depositado bajo el Tratado de Budapest el 10 de mayo de 1995, proporciona el gen que codifica una ADN polimerasa termoestable modificada de Thermus aquaticus que tiene discriminación reducida contra la incorporación de análogos tales como ddNTPs. Los dideoxinucleótidos tienen una posición 3 ' substituida en comparación a los dNTPs convencionales. Así, en combinación con la presente invención, la doble mutación, ejemplificada aquí por una Taq polimerasa mutante E615G, F667Y, proporciona un medio para utilizar los análogos de nucleótidos que se sustituyen en las posiciones 31 y 2' de la ribosa, en comparación a los dNTPs (ver ejemplos III y V) . Una aplicación particular de la invención es un método de secuenciación de rNTP, en donde el cebador secuenciado es marcado detectablemente con un marcador fluorescente o radioactivo distinguible. A diferencia de ddNTPs, la incorporación de un rNTP modificado no resulta en un evento de terminación de cadena. La reacción de secuenciación de ADN comprende rNTPs y DNTPs en combinación con una enzima de la invención, que produce una mezcla de productos de extensión de cebador substituidos aleatoriamente susceptibles de dividir la ligadura 3' -5' fosfodiéster entre un ribo- y un deoxirribonucledtido adyacente. Después de la extensión del cebador en, por ejemplo, amplificación PCR o ciclo de secuenciacidn, y antes de la resolución de los productos de extensión del cebador, por medio, por ejemplo, de electroforesis en gel, la mezcla de reacción es tratada con álcali, calor, una ribonucleasa u otro medio para hidrolizar los productos de extensión en cada ocurrencia de un ribonucled ido. Para cada producto de extensión de cebador marcado, solo la mayoría de los fragmentos 5', que es el producto inmediato de extensión del cebador marcado, es detectable en un gel de secuenciacidn. Para un receptor dado, el análisis del gel de secuenciacidn resultante proporciona una secuenciacidn escalonada, p. ej . , las señales identificableß en las bandas correspondientes de G, A, T, y C para la secuencia de ácido nucleico del receptor. La secuenciacidn escalonada resultante proporciona la misma información si el método utiliza ddNTPs por medios convencionales, o rNTPs y laß nuevas polimerasas termoestables descritas aquí. Así, para uso de la presente invención, no se requiere mucho ddNTPs para la secuenciacidn de ADN (ver ejemplo VI) . Bn un método de secuenciacidn alternativo, se emplean ribonucledtidos terminadores de cadena. En esta modalidad de la invencidn, nucledtidoß 2' -hidroxi, 3 '-deoxi, tal como cordicepina trifosfato, se utilizan como terminadores. Estos análogos de rTP pueden marcarse fluorescentemente y utilizarse para secuenciación de ADN. Lee et al- (supra) han descrito el uso de ddNTPs terminadores coloreados. EP-A-655,506 y U.S. Serie No. 08/448,223, presentada el 23 de mayo de 1995 describen las enzimas modificadas para usar con ddNTPs. Una ADN polimerasa termoestable que comprende la modificación presente en AmpliTaq*ADN polimerasa FS (ver arriba) y las especificadas en SEQ ID NO:l, en donde X no es un ácido glutámico (E) , como se describe aquí, pueden ser usadas para incorporar eficientemente los análogos de rNTP marcados en una reacción de secuenciacidn de terminación de cadena. Este proceso podría estar automatizado y no requerir síntesis de cebadores marcados con tinta. Además, debido a que las reacciones de terminador coloreado permiten la realización de las cuatro reacciones en el mismo tubo, son mas convenientes que los métodos de cebador coloreado. Los nucleótidos 2 '-hidroxi, 3' -deoxi pueden ser sintetizados de nucleótidos 31 comercialmente disponibles (3'dA, 3'dC, 3'dG y 3'dT, p. ej. disponibles en Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO) y la adición de un 5* trifosfato como se describe en Ludwig, Biophosphates and Their Synthesis Structur .

Metafeqlism and Activity/ editors, Bruzik and Stec, Amsterdam, Elsevier Science Publishers, 1987, páginas 201-204. En adicidn a la utilidad de las enzimas de la presente invención en nuevos métodos de secuenciación, las enzimas modificadas descritas aquí son útiles en un número de aplicaciones de biología molecular. En una modalidad, la enzima modificada es usada en una mezcla de reacción de amplificación que comprende nucledtidos convencionales y no convencionales, por ejemplo, dNTPs y al menos un rNTPs con marca detectable, las marcas que incluyen, por ejemplo, marcas fluorescentes o radioisótopos. La síntesis dirigida del molde de una hebra complementaria proporciona un producto de ADN que contiene ribonucleósidos monofosfatos en varias posiciones a lo largo de su longitud. El tratamiento de calor y/o álcali hidroliza el producto de extensión de ácido nucleico en cada ribonucleótido. Así, se proporciona una familia de segmentos de ADN en donde cada fragmento contiene un medio marcado en su extremo 3' . El tamaño de los fragmentos del ácido nucleico resultante puede ser modificado por el ajuste de la relación y la cantidad de rNTP incluido en la reacción. La amplificación de un receptor usando rNTPs y las presentes enzimas proporciona numerosas ventajas que dependen de la aplicación particular. En el método descrito arriba que usa un rNTP marcado, la familia resultante de fragmentos está marcada con igual intensidad: una marca por fragmento de oligonucled ido. Procedimientos tales como la detección de ácido nucleico utilizando un arreglo de prueba de oligonucledtido fijado a un circuito de silicdn, requiere óptimamente que el receptor amplificado se fragmente aleatoriamente en un rango fijo reproducible de tamaño para limitar la formación de estructuras secundarias para co -rolar la cinética de hibridización. Además, para detectar la hibridización en un arreglo de miles de pruebas en un circuito, podría ser preferible que los fragmentos de ácido nucleico sean marcados con igual intensidad. La presente invencidn proporciona un medio para producir familias de fragmentos que se encuentran en este estándar, y de este modo facilitan el uso de formatos de detección alternativos tal como los métodos basados en circuitos descritos por, por ejemplo, Cronin fí£_al. , 1996, Human Mutation 7:24 -2?? - En otra modalidad el uso de un cebador marcado y un cebador sin marca en una reacción de amplificación que contiene una polimerasa termoestable de la invención y rNTPs y dNTPs proporcionan un medio de amplificación y reacciones de secuenciacidn que se presentan simultáneamente. Este método requiere que se lleven a cabo cuatro reacciones de amplificación separadas, una para cada rTP. sí, por ejemplo, porque la enzima de la invención es adecuada para la amplificación del receptor por, por ejemplo, PCR, u otro medio de amplificación, el producto resultante, si está presente, pueden detectarse por métodos convencionales tales como electroforesis en gel o prueba de hibridización usando una porción del producto de reacción. Estos métodos de detección no resultarán en la hidrólisis de los ribonucledtidos incorporados, y las hebras quiméricas de ARN/ADN se comportarán como se espera para un producto convencional de amplificación de ácido nucleico. Si es detectado un producto deseado, una porción remanente de la misma mezcla de reacción puede tratarse con álcali y analizarse por electroforesis en gel para determinar la secuencia del ácido nucleico. Asi, si-guiendo la detección del producto, es innecesaria una reacción de secuenciación subsecuente. Bste procedimiento simplificado ahorra tiempo y materiales y provee aumento en la exactitud por medio de la remoción de pasoß: el producto detectado es el producto secuenciado. También podría ser usado un procedimiento similar con cuatro rNTPs marcados y un cebador biotinilatado. Después de la amplificación, el producto es dividido con álcali y los productos asociados al primer se retiran por reacción con cuentas recubiertas de estrepavidina. Los productos capturados se analizan subsecuentemente en un gel de secuenciacidn. Esta modificación permite hacer la reacción de secuenciacidn en un tubo, eliminando así la necesidad de cuatro amplificaciones por separado. Bn otro aspecto de la invencidn, las enzimas descritas aquí son útiles para preparar ARN a partir de un molde de ADN o para hacer ADN substituido por esterilización de medio alcalino sin el uso de agentes de esterilización convencionales tales como uracilo-N-glicosilasa (UNG) , como se des<~ -ibe en la publicación de Patente Internacional No. WO 92/01814. En una modalidad ejemplificada, la polimerasa termoestable también contiene una mutación en el dominio de la exonucieasa 5' -3' que sirve para atenuar gratamente esta actividad exonucieasa. Las formas modificadas de Taq polimerasa se describen en la patente U.S. No. 5,466,591. En una modalidad de la invención, el coddn que codifica el residuo glicina (G) en el aminoácido de posición 46 ha sido reemplazado con un codón que codifica ácido aspártico (D) . La enzima resultante tiene utilidad aumentada en el ciclo de reacciones de secuenciación debido a la disminución de la actividad exonucieasa 5" -3' y es un antecedente preferido para usar con la presente invención. El dominio polimerasa de la secuencia aminoácido y la actividad polimerasa no se afectan por la presencia del mutante (G46D) en comparación con la enzima tipo silvestre. En una modalidad comercial de la invencidn, equipos para secuenciacidn de ácido nucleico que contienen una polimerasa termoestable de acuerdo con la presente invención representan una modalidad comercial de la invención. Tales equipos incluyen típicamente reactivos adicionales para secuenciación de ADN tales como p. ej . rNTPs, dNTPS, y amortiguadores apropiados. Donde rNTPs no están marcados, también se incluye un cebador marcado. Los ejemplos siguientes se ofrecen como forma de ilustración solamente y por ningún medio se intenta limitar el alcance de la invención reivindicada. eemplo i Bxpreaidn de un Gen Modificado Tas Polim-e-raaa qu ti«»tm Diacriminación Reducida Contra m?cle6tidoa No Coaveacionalea La porción aminoácido C-terminal de la Taq polimerasa codifica el dominio del sitio activo de la polimerasa (Lawyer Qt al.. 1993, PCR MethQdS and AppligatiQUS 2:275-287, que se incorpora aquí por referencia) . Un fragmento de ADN «que contiene esta región fue aislado del gen Taq completo y mutagenizado por amplificación PCR en presencia de manganeso (Leung et al .. 1989, Te hnique 1(1) : 11-15) . Para este ejemplo todas las enzimas de restricción se compraron en New Englands Biolabs, Beverly, MA. Los fragmentos mutagenizados fueron digeridos con Patl y Bglll y clonados en un plásmido de expresión Tag, aquí el plásmido pLKl02, que ha sido digerido con PstI y Bglll . El plásmido pLK102 es una forma modificada del plásmido Tag de expresión pSYC1578 (Lawyer a£ al- , supra) . El fragmento HÍJQ£lI/E£aR localizado en 3' de la región de codificación de la polimerasa fue borrado para crear el plásmido pLKlOl. Un fragmento Pstl-BglI de un par de bases 898 fue borrado subsecuentemente de pLKlOl y reemplazado por un oligonucleótido dúplex corto Pstl-EcgRV-Bglll para crear el plásmido pLK102. De esta forma, este corte remueve el par de bases 900 del extremo 3 ' del gel Taq ADN pol y lo reemplaza con una pieza corta de ADN. Los plásmidos de expresión resultante fueron transformados en la cepa E. coli N1624 (descrita por Gottesman, 1973, J. Mol. Biol- 77:531: también disponible en E. coli Genetic Stock Center en la Universidad de Yale, bajo No. de cepa CGSC #5066) y los transformantes resultantes fueron cribados por la habilidad para incorporar eficientemente rNTPs en comparación con la enzima tipo silvestre. Usando este procedimiento, se identificó la mutante Cl que tiene la habilidad para incorporar más eficientemente rNTPs. Para determinar cual porción del gen Taq polimerasa era responsable del fenotipo alterado, el plásmido Taq de expresión mutagenizado, llamado pCl, aislado de la mutante Cl, fue digerido con varias enzimas de restricción y los fragmentos de restricción resultantes fueron subclonados en el gen de la Taq ADN polimerasa tipo silvestre de pLKlOl, reemplazando los fragmentos de restricción no mutagenizados. El análisis de los subclones resultantes indican que la mutación responsable del fenotipo era contenida en un fragmento de restricción par de bases 265 Nhel a BamHl. El análisis de la secuencia de ADN se desarrolló en esta región de pCl usando el ABI PRISM" Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit con AmpliTaq* ADN polimerasa FS de Applied Biosystems, Foster City, CA, y el Applied Biosystems Model 373A DNA Sequencing System. El análisis de la secuencia identificó dos mutaciones sin sentido en el gen de la Taq polimerasa entre los sitios ffligl y BamHI. Una mutación en el aminoácido posición 615 provocó el reemplazo de un residuo ácido glutámico (E) por un residuo glicina (G) y otra mutación en la posición 653 reemplazó un residuo alanina (A) con una treonina (T) . La numeración se inició en el codón que codifica el primer residuo metionina de la proteína madura, como en la Patente U.S. No. 5,079,352. La mutación B615G fue causada por un cambio de GAG a GGG en el codón 615. La mutación A653T fue causada por un cambio GCC a ACC en el codón 653. El plásmido Cl en la cepa huésped B. coli N1624 fue depositado bajo el Tratado de Budapest en el ATCC el 17 de julio de 1996 y acceso No. 98107. Los dos puntos de mutación fueron analizados separadamente mediante la subclonación de cada separación en un gen Taq polimerasa tipo silvestre, usando PCR recombinante (Innis fit-al- editors, PCR Protocols. San Diego, Academic Press, 1990, Capítulo 22, titulado "Recombinant PCR", Higuchi, páginas 177-183) . Los productos de expresión resultante se analizaron para determinar si E615G o A653T o ambas mutaciones eran responsables del ribonucledtido de fenotipo incorporado. Los resultados de este experimento indicaron que la mutación E615G fue la única responsable del fenotipo mutante. Para más análisis y cuantificación de la eficiencia de incorporación de análogos de nucíedtido, el fragmento del par de bases 265 BamHl-ffiíel PCR «que contiene en E615G fue clonado en un vector Taq de expresión, pRDA3-2. El vector de expresión pRDA3-2 contiene el gen Taq completo operablemente ligado al promotor PL del fago lambda. Bl dominio exonucieasa del gen Taq en este vector contiene una mutación puntual en el codón que codifica glicina, residuo aminoácido 46, que reduce la actividad exonucieasa 5 '-3'. Sin embargo, la secuencia del gen en el dominio de la polimerasa del sector de expresión pRDA3-2 es idéntica a la secuencia del gen Taq tipo silvestre. El plásmido RDA3-2 es descrito completamente en la Patente U.S. No. 5,466,591, que se incorpora aquí por referencia, en donde el plásmido es referido como "clon 3-2". El plásmido pRDA3-2 fue digerido con BamHl y Nhel y el fragmento de la base apareada 265 se ligó al vector por medios convencionales. El plásmido resultante, pLK108, fue transformado en la cepa de E. coli DG116 (Lawyer et al .. 1993, si?O?A, también disponible en American Type Culture Collection bajo ATCC No. 53606) . El plásmido pLKl08 codifica una ADN polimerasa termoestable aquí referida como G46D, E615G Taq. Se creó una mutante G46D, E615G, F667Y Taq, por combinación de las mutaciones E615G y F667Y mediante PCR recombinante en un fragmento BamHl-NheI. Este fragmento se clonó en el plásmido P-RDA3-2 para crear el plásmido pLK109. La proteína ADN polimerasa termoestable de los plásmidos pLK108 y pLK109 fueron purificados de acuerdo al método descrito por Lawyer ££ a ., 1993, supr . aunque se omitieron los pasos de cromatografía. Se confirmó la secuencia de los injertos por análisis de la secuencia del ADN. Se detectó una mutación adicional en el injerto de pLKlOß; sin embargo esta mutación no cambia la secuencia aminoácido de la proteína. Siguiendo la purificación parcial, la actividad de la enzima modificada se determinó por el ensayo de actividad descrito en Lawyer at_al.. 1989, J. Biol- Chem. 264:6427-6437, que se incorpora aquí por referencia. La actividad de la enzima modificada se calculó como sigue: una unidad de enzima corresponde a 10 nmoles de producto sintetizado en 30 minutos. La actividad de la ADN polimerasa de la enzima tipo silvestre es linealmente proporcional a la concentración de enzima hasta 80-100 pmoles de dCMP incorporado (enzima diluida a 0.12-0.15 unidades por reacción). La actividad de E615G, G46D y las mutantes E615G, F667Y, G46D es linealmente proporcional a las concentraciones de enzima hasta 0.25-3 pmoles de dCMP incorporado (enzima diluida de 6x10"* a 5xi0-"3 unidades por reacción) . Esta preparación de enzima fue utilizada en las reacciones de incorporación y secuenciación descritas en los Ejemplos III-V. Para los Ejemplos II y VI la enzima se purificó como se describe en Lawyer et al. (supra) .

Ejemplo II Ensayo para Comparar la eficiencia de Incorporaei?n La habilidad relativa de G46D y G46D,E615G Taq para incorporar rNTPs se determinó midiendo la cantidad de [a-3,P] rNTP que cada enzima podría incorporar limitando la concentración de enzima en un molde de ADN de esperma de salmón activado. Para medir la incorporación de rATP, se preparó una mezcla de reacción tal que las concentraciones finales en 50 µl de reacción fueran: 12.5 µg de ADN de esperma de salmón activado, preparado como se describe abajo, 200 µM de cada dCTP, dGTP y dTTP (Perkin Elmer, Norwalk, CT) , 100 µM [a-"P]rATP, 1 mM ß rpercaptoetanol, 25 mM N-tris [hidroximetil] -3-amino-propanesulfónico ácido (TAPS) pH 9.5, 20 ßC, 50 M KCl y 2.25 mM MgCl, . Mezclas de ensayos similares se prepararon para medir la incorporación de rCTP, rGTP y rUTP. En cada caso, el rNTP fue radiomarcado y presente en 100 µM y los tres restantes dNTPs (dATP, dGTP y dTTP para rCTP, dATP, dCTP y dTTP para rGTP y dATP, dCTP y dGTP para rUTP) estuvieron presentes en 200 µM cada uno. Como un estándar, la incorporación del [a-3JP]dNTP correspondiente por cada enzima también fue medido. La mezcla de ensayos para estos ensayos fue similar al ensayo de incorporación de rNTP de arriba excepto que cada [a-3JP] rNTP fue reemplazado con 100 µM del [a-3JP]dNTp correspondiente. El ADN de esperma de salmón crudo, 1 g/1, de Worthington Biochemical, (Freehold, NJ) fue activado por incubación en 10 mM Tris-HCl, pH 7.2, 5 mM MgCl,, a 2°C-8ßC durante 96 horas. Fueron adicionados entonces EDTA y NaCl a 12.5 mM y 0.1 M, respectivamente. El ADN fue entonces extraído con fenol/cloroformo y entonces se precipitó con etanol y se resuspendid en 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5. La preparación del ADN activado fue entonces dializada contra el mismo amortiguador. Se colocaron alícuotas de cuarenta y cinco microlitros de cada mezcla de reacción en cinco tubos de 0.5 mi (p. ej. Eppendorf) para cada uno de los nucledtidos precursores marcados en 5'-. Así, cada uno de G46D Taq y G46D,E615G Taq se ensayaron por duplicado con un tubo remanente para un control negativo. La reacción de polimerización en dos tubos de cada mezcla de ensayo se iniciaron con 5 µl de G46D Taq polimerasa (0.02 unidades) o G46D,E615G Taq (0.002 unidades) . Como un control para el nivel de respaldo, se adicionaron 5µl de dilución amortiguadora de enzima además de la enzima a la reacción de control negativa. Cada reacción se agitó en vdrtex brevemente y se incubó durante 10 minutos a 75ßC. Las reacciones se detuvieron por adición de 10 µl 60 mM EDTA y se guardaron en hielo. Para cada muestra, se diluyeron alícuotas de 50 µl de los 60 µl de reacción con l mi 2 mM EDTA, 50 µg/ml de ADN cortado de esperma de salmón. El ADN se precipitó con OCA usando procedimientos estándar y se colectó en discos filtro GF/C (Whatman, Kente, England) . La cantidad de nucledtido o ribonucledtido marcado [a-"P] incorporado se cuantificd por medio de espectrometría de cintilacidn líquida y se calculó entonces el número de pmoles incorporados. El número de pmoles de cada rNTP incorporado por cada enzima se normalizó al número de pmoles incorporados del [a-3*P]«dNTP correspondiente por cada enzima. Los datos resultantes se muestran abajo.

Relación de Incorporación de dMTP para G46D v G46D.B6igfl taff 2nziaa pMoles incorporados (porciento) dAT? rAT? dCTP rCT? dGTP rG7P dTTP rüTP G46D 27.74 0.052 34.6 3.75 36.94 0.133 28.79 0 (100») (0.18*) (100*) (0.22*) (100*) (0.36*) (100*1 (0) G46D,H61 0.67 1,41 2.32 5.33 3.27 5.96 0.688 0.545 5G ¡100*) (219*) (100*) (189*) (100*) (181*) (100*1 (79*1 Los resultados indican que G46D,E615G incorpor-an ribonucleótidos mas de 500 veces mas eficientemente que lo que puede G46D (p. ej . para rGTP 181:0.36 » 502 veces, para rCTP 189:0.22 = 859 veces y para rATP 210:0.18 « 1166 veces mas eficiente) . Así, una mutación sin sentido en el gen polimerasa en el codón 615, proporciona un nuevo fenotipo: una ADN polimerasa termoestable capaz de incorporar eficientemente ribonucledtidos en adición a deoxirribonucleótidos .

Ejemplo III Bnaayo para Comparar la Eficiencia de Incorporación de 3'deQXi ATP (Cordicepina) La habilidad relativa de G46D; G46D,E615G; G46D, E615G, F667Y y G46D,F667Y Taq para incorporar 3 ' -deoxi adenosina 5 ' -trifosfato (cordicepina trifosfato) se determinó midiendo la cantidad de [o.-32P] cordicepina trifosfato que cada enzima podría incorporar limitando la concentración de enzima en un molde de ADN de esperma de salmón activado. Para medir la incorporación de [a-33P] cordicepina trifosfato, el ensayo estuvo compuesto tal que las concentraciones finales en 50 µl de reacción fueran: 12.5 µg de ADN de espepr..-? de salmón activado, 200 µM de cada dCTP, dGTP y dTTP, 50 µM dATP (Perkin Elmer), 50 µM [a-3JP] -3 'dATP/3 ' dATP (New England Nuclear, Sigma) , 1 mM S mercaptoetanol, 25 mM N-tris [hidroximetil] -3 -amino-propanesulfónico ácido (TAPS) pH 9.5, 20 °C, 55 mM KCl y 2.25 mM MgCl, . Se colocaron alícuotas de cuarenta y cinco microlitros de cada mezcla de reacción en nueve tubos de 0.5 mi, así, cada reacción será hecha con G46D; G46D,E615G; G46D,E615G,F667Y y G46D, F667Y Taq por duplicado con un tubo remanente para un control sin enzima. La reacción de polimerización en dos tubos de ensayo se iniciaron con 5 µl (0.058 unidades) de G46D Taq polimerasa. Lo mismo fue hecho para G46D,E615G Taq (0.0025 unidades), G46D,E615G,F667Y Taq (0.0034 unidades) o G46D,F667Y Taq (0.083 unidades). Como un control para el nivel de respaldo, el tubo remanente fue iniciado con dilución amorti«guadora de enzima además de la enzima. Cada reacción se agitó en vórtex brevemente y se incubó durante 10 minutos a 75°C. Las reacciones se detuvieron por adición de 10 µl 60 mM EDTA y se guardaron en hielo. Para cada muestra, se diluyeron alícuotas de 50 µl de los 60 µl de reacción con l mi 2 mM EDTA, 50 µg/ml de ADN cortado de esperma de salmón. El ADN se precipitó con TCA usando procedimientos estándar y se colectó en discos filtro GF/C (Whatman, Kente, England) . La cantidad de nucleótido marcado [a-3JP] incorporado se cuantifico por medio de espectrometría de cintilacidn lí-quida y se calculó entonces el número de pmoles incorporados . El número de pmoles de [a-"P] cordicepin trifosfato incorporado por cada enzima se dividió por cada enzima usada en el ensayo para dar los pmoles incorporados por unidad de enzima. Una tabla de estos datos se muestran abajo.

Incorporación de ftt-"Pl cordiceoin por G46D; Q46D.g61SG: G46D.B615G.F667Y v G46D.P667Y Taq Enzima tunóles Tnco-nporadoa por unidad r-A enzima G46D 0.221 G46D,E615G 1.56 G46D,E615G,F667Y 893.6 G46D,F667Y 0.74 Estos resultados indican «que las mutaciones E615G y F667Y se requieren para la incorporación eficiente de la molécula de cordicepina en el ADN.

Bifig-plQ IY Secuenciaci?n d« ADN por División Alcalina Uaando G46D.B615G Taq ADN Polimerasa Este ejemplo demuestra la aplicación de la polimerasa modificada de la invención para secuenciación por división alcalina, utilizando ADN parcialmente sustituido por rNTP. La relación de rNTP a dNTP en las mezclas de reacción estuvo entre 1:80 y 1:8. Las reacciones de extensión de cebador se realizaron en un amortiguador que consistía de 50 M Bicina (N, N-bis (2-hidroxi-etil) glicina; pH 8.3), 25 mM KOAc, y 2.5 mM MgCl,. Se realizaron cuatro reacciones individuales, una para cada uno de los cuatro rNTPs. Cada reacción (50 µl) contenía 200 µM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Perkin-Elmer) y 0.09 pmoles de molde de ADN M13rapl8 de hebra sencilla (Perkin-Elmer) alineados a la marca DG48 5'-["P] (Lawyer et al.. 1993, PCR Methoda and Applications 2: 27 -287). Las reacciones también contenían 2.5, 2.5, 2.5 o 25 µM rATP, rCTP, rGTP o rUTP, respectivamente. Cada una de las cuatro reacciones se inició por la adición de 7 unidades de G46D E615G Taq ADN polimerasa y se incubó a 75°C durante 10 minutos. Las reacciones se detuvieron por adición de 10 µl 60 mM EDTA y se colocaron en hielo. Veinte µl de cada reacción se adicionaron a 80 µl de 50 mM Bicina (pH 8.3), 25 mM KOAc, y 2.5 mM MgCl,. Los productos de división se produjeron por la adición de 7 µl de ÍN NaOH y se incubaron durante 15 minutos a 98ßC. Las reacciones se neutralizaron por la adición de 7 µl de ÍN HCl. Cada reacción fue precipitada por la adición de 312 µl 95% etanol y 10 µl 3M acetato de sodio (pH 4.8) . Las reacciones se microcentrifugaron durante 15 minutos para colectar el precipitado, el sobrenadante se removió, los pellets se lavaron con 500 µl 70% etanol y se secaron. Cada pellet se resuspendió en 5 µl de 0.5X Stop Buffer (disponible en Perkin Elmer, Norwalk CT que contiene 95% de formamida, 20 mM EDTA y 0.05% azul de bromofenol) , calentado a 98ßC durante 3 minutos, y directamente cargado en un gel de pre-electroforesis secuenciador de ADN 6% poliacrilamida/8 M urea y electroforesis. El gel se secó y expuso a película de rayos X. La película resultante reveló una clara secuenciación escalonada que proporcionó en exceso 100 bases de secuencia correcta.

Ejemplo v Sprnienciaci?n de ADN Usando G46D.B615G-F667Y Taq ADM Polimeraaa y 3' deoxi Nucleótidoa Trifoafatoa Este ejemplo demuestra la aplicación de la polimerasa modificada, G46D,E615G, F667Y Taq para secuenciacidn de ADN usando 3* deoxi nucleótidos trifosfatos. Este experimento se desarrolló usando 3 'deoxi ATP; sin embargo, también podría extenderse a usarse con los otros nucledtidos 3 'deoxi. Las reacciones de extensión de cebador se realizaron en un amortiguador que consistía de 50 mM Bicina (pH 8.3), 25 mM KOAc, y 2.5 mM MgCl,. Cada reacción (50 µl) contenía 200 µM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Perkin-Elmer) y 0.09 pmoles de molde de ADN M13n.pl8 de hebra sencilla (Perkin-Elmer) alineados en la marca DG48 5'-["P] (Lawyer fit J- -, 1993, PCR Methods and Applica iona 2:275-287) . Las reacciones también contenían 0, 0.1, 0.25, 0.5, l o d µM 3* deoxi ATP.

Cada una de las reacciones se inicid por la adición de 7 unidades de G46D,E615G, F667Y Taq ADN polimerasa y sé incubó a 75°C durante 10 minutos. Las reacciones se detuvieron por adición de 10 µl 60 mM EDTA y se colocaron en hielo. Treinta µl de cada reacción se precipitaron con etanol y se resuspendieron en Stop Buffer, se calentaron a 98°C durante 3 minutos, y directamente cargadas en un gel de pre-electroforesis secuenciador de ADN 6% poliacrilamida/8 M urea y electroforesis. El gel se secó y expuso a película de rayos X. Las bandas que contenían las reacciones hechas en presencia de cordicepina contenían claramente terminación escalonada discernible. Las líneas conteniendo la mayoría de cordicepina, p. ej . 5 µM, mostraron una terminación escalonada en la que, en promedio, las bandas fueron mas cortas en longitud que las bandas en las que los niveles de cordicepina fueron menores . La banda que contiene la reacción hecha en ausencia de cordicepina, mostró el producto mayormente completo y sin terminación escalonada. Bstos resultados indican «que la enzima mut.ante es capaz de incorporar cordicepina y la incorporación de esta molécula en un producto de extensión de cebador causa la terminación. Este método podría también ser usado para crear una secuenciacidn escalonada de ADN, con 3 'deoxi CTP, 3 'deoxi GTP y 3 'deoxi UTP también.

Bj«ampio VT Saeuenciaei?n PCR de Primer Coloreado con G46D B615G Taq ADN Polimerasa Bste ejemplo demuestra la aplicación de la polimerasa modificada de la invención para secuenciacidn de cebador coloreado, utilizando ribonucleósidos trifosfatos (rNTPs) en PCR y una relación de rNTP:dNTP de no mas de 1:30. Se realizan cuatro reacciones individuales, una para cada rNTPs. Las reacciones de secuenciación PCR se desarrollan en un amortiguador que consiste de 25 mM Tris-HCl (pH 9), 5.0 mM MgCl, y 10% glicerol (v/v) . Cada reacción también contenía 500 µM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP {Perkin Elmer) , 5x10* copy/µl molde linearizado del plásmido pBSM13+ (Stratagene) con endonucleasa de restricción Xpml, y 0.05 unidades/µl G46D E615G Taq ADN Polimerasa. Las reacciones Ribo-ATP (10 µl) contenían 2.5 µM ATP (Pharmacia Biotech), 0.1 µM JOB M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer), y 0.1 µM cebador ASC46 (5' -CGCCATTCGCCATTCAG) . Las reacciones Ribo-CTP (10 µM) tenían 2.5 µM CTP (Pharmacia Biotech), 0.1 µM FAM Mi3 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer), y 0.1 µM cebador ASC46. Las reacciones Ribo-GTP (20 µl) contenían 2.5 µM GTP (Pharmacia Biotech) , 0.1 µM TAMRA M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) , y 0.1 µM cebador ASC46. Laß reacc ones Ribo-uTP (20 µM) contenían 16 µM UTP (Pharmacia Biotech), 0.1 µM ROX M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer), y 0.1 µM cebador ASC46.

Cada una de las cuatro reacciones fueron puestas en un precalentador de ciclo térmico (75°C) Perkin Elmer GeneA-mp* PCR System 9600 y sometido a 30 ciclos de 95°C durante 10 segundos, 55° durante 10 segundos, 1 minuto para subir a 65°C, y 65ßc durante 5 minutos. Las reacciones rATP y rCTP generaron cada una 6x10" copias del producto amplificado de 300 pares de bases marcados con tinte, y las reacciones rGTP y rUTP generaron cada una 1.2xl012 copias del producto amplificado de 300 pares de bases marcados con tinte. Para determinar la secuencia de ADN de lo productos PCR amplificados sin requerir una reacción de secuenciación de ADN enzimática separada, las reacciones se combinaron, trataron con base y calentaron, neutralizaron, y precipitaron como si«gue. Cuatro µl de cada una de las reacciones ATP y CTP y 8 µl de cada una de las reacciones GTP y UTP fueron combinados. Se adicionaron dos microlitros de 0.25 M EDTA (pH 8.0) (10 mM final), 10 µl 1 M NaOH (200mM final), y 14 µl H,0 a la reacción combinada «que entonces se incubó a 95°C durante 5 minutos en un GeneAmp" PCR System 9600 de ciclo térmico y se neutralizó con 10 µl 1 M HCl. La reacción combinada entonces se precipitó por la adición de 150 µl 95% etanol seguido por una incubación a 4°C durante 15 minutos. Entonces se centrifugó durante 15 minutos a 4ßC para colectar el precipitado, y el sobrenadante se removió por aspiración. El pellet se lavó con 300 µl 70% etanol, se microcentrifugó durante 5 minutos, el sobrenadante se retiró por aspiración, y el pellet se secó. El pellet fue resuspendido en 6 µl formamida 50 mg/ml Azul dextrán (en 25 mM EDTA) 5:1 (v/v) y se calentó a 90°C durante 3 minutos Uno y medio µl del pellet resuspendido se cargó directamente en un gel secuenciador de pre-electroforesis 5% Long Ranger (FMC BioProducts) , 6 M urea. Entonces se corrió la electroforesis y se analizó en un Perkin Elmer ABI Prism™ 377 DNA Sequencer de acuerdo a las instrucciones del constructor. Una base automatizada llamada por el software de Perkin Elmer ABI Prismt" Sequencing Analysis resultó en una exactitud mayor de 99% para la determinación de secuencias de ADN del producto amplificado PCR de 300 bases apareadas.

LISTADO DB SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENE-RAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: F. Hoffmann-La Roche Ltd (B) CALLE: Grenzacherstrasse 124 (C) CIUDAD: Basel (D) ESTADO: BS (?) PAÍS: Switzerland (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : CH-4070 (G) TELEFONO: (0) 61 688 24 03 (H) TELEFAX: (0) 61 688 13 95 (I) TELEX: 962292/965512 hlr ch (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: ADN polimerasa termoestable modificada. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 8 (iv) FORMA LEÍBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO MEDIO: Floppy disk (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 60/023,376 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-AGO-1996 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACION: 4 (D) OTRA INFORMACIÓN: /marca * Xaa /nota = "en donde Xaa es cualquier aminoácido pero no Glu" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACION: 7 (D) OTRA INFORMACIÓN: /marca » Xaa /nota « "en donde Xaa es lie o Val" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:1 Ser Gln lie Xaa Leu Arg Xaa i 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACION: 7 (D) OTRA INFORMACIÓN: /marca * Xaa /nota = "en donde Xaa es lie o Val" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2 Ser Gln lie Glu Leu Arg Xaa l 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3 Ser Gln lie Glu Leu Arg Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4 Ser Gln lie Glu Leu Arg lie 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5: Leu Asp Tyr Ser Gln He Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6: Leu Asp Tyr Ser Gln He Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2626 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Thermus aquaticus (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 121..2616 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: AAGC7CAGAT CTACCTGCCT GAGGGCGTCC GGTTCCAGCT GGCCCTTCCC GAGGGGGAGA GGGAGGCGTT TCTAAAAGCC CT CAGGACG CTACCCGGGG GCGGGTGGTG GAAGGGTAAC 12 ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG GGC CGG GTC CTC CTG Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 GTG GAC GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC CAC GCC CTG AAG GGC Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 CTC ACC ACC AGC CC-G GGG GAG CCG GTG CAG GCG GTC TAC GGC TTC GCC Leu Thr Tl-.r Ser Arg Giy Glu Pro Val GIn Ala Val Tyr Gly Phe Ala 40 45 AAG AGC CTC CTC AAG GCC CTC AAG GAG GAC GGG GAC GCG GTG ATC GTG Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Aso Ala Val lie Val 50 55 60 GTC TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GGG GGG Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 TAC AAG GCG GGC CGG GCC CCC ACG CCG GAG GAC TTT CCC CGG CAA CTC Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 GCC CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC CTG GGG CTG GCG CGC CTC GAG Ala Leu lie Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 GTC CCG GGC TAC GAG GCG GAC GAC GTC CTG GCC AGC CTG GCC AAG AAG Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 GCG GAA AAG GAG GGC TAC GAG GTC CGC ATC CTC ACC GCC GAC AAA GAC Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg He Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 CTT TAC CAG CTC CTT TCC GAC CGC ATC CAC GTC CTC CAC CCC GAG GGG Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg He His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 TAC CTC ATC ACC CCG GCC TGG CTT TGG GAA AAG TAC GGC CTG AGG CCC Tyr Leu He Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 GAC CAG TGG GCC GAC TAC CGG GCC CTG ACC GGG GAC GAG TCC GAC AAC ASD Gln Tro Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 135 190 CTT CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACG GCG AGG AAG CTT CTG Leu Pro Giy Val Lys Gly He Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 135 200 205 GAG GAG TGG GGG AGC CTG GAA GCC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG CTG Glu Glu Tro Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 AAG CCC GCC ATC CGG GAG AAG ATC CTG GCC CAC ATG GAC GAT CTG AAG Lys Pro Ala He Arg Glu Lys lie Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 CTC TCC TGG GAC CTG GCC AAG GTG CGC ACC GAC CTG CCC CTG GAG GTG Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 GAC TTC GCC AAA AGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG AGG CTT AGG GCC TTT Aso ? e Ala Lys Arg Arg Giu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 CTG GAG AGG CTT GAG TTT GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC GGC CTT CTG Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 GAA AGC CCC AAG GCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC CCG CCG GAA GGG Giu Ser Pro Lys Ala Leu Giu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 GCC TTC GTG GGC TTT GTG CTT TCC CGC AAG GAG CCC ATG TGG GCC GAT Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 CTT CTG GCC CTG GCC GCC GCC AGG GGG GGC CGG GTC CAC CGG GCC CCC Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 GAG CCT TAT AAA GCC CTC AGG GAC CTG AAG GAG GCG CGG GGG CTT CTC Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 GCC AAA GAC CTG AGC GTT CTG GCC CTG AGG GAA GGC CTT GGC CTC CCG Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 CCC GGC GAC GAC CCC ATG CTC CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCT TCC AAC Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 ACC ACC CCC GAG GGG GTG GCC CGG CGC TAC GGC GGG GAG TGG ACG GAG Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 335 390 395 400 GAG GCG GGG GAG CGG GCC GCC CTT TCC GAG AGG CTC TTC GCC AAC CTG Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 TGG GGG AGG CTT GAG GGG GAG GAG AGG CTC CTT TGG CTT TAC CGG GAG Tro Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 GTG GAG AGG CCC CTT TCC GCT GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC ACG GGG Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 GTG CGC CTG GAC GTG GCC TAT CTC AGG GCC TTG TCC CTG GAG GTG GCC Val Arg Leu Aso Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 GAG GAG ATC GCC CGC CTC GAG GCC GAG GTC TTC CGC CTG GCC GGC CAC Glu Glu He Ala Arg Leu Glu Ala Giu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 ' 470 475 480 CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTC CTC TTT GAC Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gin Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 C-AG CTA GGG CTT ZCZ GCC ATC GGC AAG ACG GAG AAG ACC GGC AAG CGC Glu Leu Gly Leu Pro Ala He Gly Lys Thr Giu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 TCC ACC AGC GCC GCC GTC CTG GAG GCC CTC CGC GAG GCC CAC CCC ATC Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro He 515 520 525 GTG GAG AAG ATC CTG CAG TAC CGG GAG CTC ACC AAG CTG AAG AGC ACC Val Giu Lys He Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 TAC ATT GAC CCC TTG CCG GAC CTC ATC CAC CCC AGG ACG GGC CGC CTC Tyr He Asp Pro Leu Pro Asp Leu He His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC ACG GGC AGG CTA AGT AGC His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 TCC GAT CCC AAC CTC CAG AAC ATC CCC GTC CGC ACC CCG CTT GGG CAG Ser A=p Pro Asn Leu Gin Asn He Pro Val Arg Thr Pro Leu Giy Gin 580 585 590 AGG ATC CGC CGG GCC TTC ATC GCC GAG GAG GGG TGG CTA TTG GTG GCC Arg He Arg Arg Ala Phe He Ala Glu Giu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 CTG GAC TAT AGC CAG ATA GGG CTC AGG GTG CTG GCC CAC CTC TCC GGC Leu ASD Tyr Ser Gln He Giy Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 61*0 615 620 GAC GAG AAC CTG ATC CGG GTC TTC CAG GAG GGG CGG GAC ATC CAC ACG Asp Glu Asn Leu He Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp He His Thr 625 630 635 640 GAG ACC GCC AGC TGG ATG TTC GGC GTC CCC CGG GAG GCC GTG GAC CCC Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 CTG ATG CGC CGG GCG GCC AAG ACC ATC AAC TTC GGG GTC CTC TAC GGC Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr He Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 ATG TCG GCC CAC CGC CTC TCC CAG GAG CTA GCC ATC CCT TAC GAG GAG Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gin Giu Leu Ala He Pro Tyr Glu Glu 675 630 635 GZZ CAG GCC TTC ATT GAG CGC TAC TTT CAG AGC TTC CCC AAG GTG CGG Ala Gin Ala Phe He Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 630 695 700 GCC TGG ATT GAG AAG ACC CTG GAG GAG GGC AGG AGG CGG GGG TAC GTG 2 Ala Tro He Glu Lys Thr Leu Giu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 GAG ACC CTC TTC GGC CGC CGC CGC TAC GTG CCA GAC CTA GAG GCC CGG 2 Giu Thr Leu Phe Giy Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 GTG AAG AGC GTG CGG GAG GCG GCC GAG CGC ATG GCC TTC AAC ATG CCC 2 Val Lys Ser OOal Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTG GCT ATG GTG AAG CTC 2 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 TTC CCC AGG CTG GAG GAA ATG GGG GCC AGG ATG CTC CTT CAG GTC CAC 2 Phe Pro Arg Leu Glu Giu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 GAC GAG CTG GTC CTC GAG GCC CCA AAA GAG AGG GCG GAG GCC GTG GCC 2 ASD Giu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 735 790 795 800 CGG CTG GCC AAG GAG GTC ATG GAG GGG GTG TAT CCC CTG GCC GTG CCC 2 Arg Leu Ala Lys Giu Va_ Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATA GGG GAG GAC TGG CTC TCC GCC AAG GAG 2 Leu Glu Val Glu Val Gly He Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 TGATACCACC 2 (2 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 832 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8: Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 ? 15 Val Asp Giy His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Giy Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val He Val 50 55 60 Val Phe Aso Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 " 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85' 90 95 Ala Leu He Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu ICO 105 110 Val Pro Gly 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Leu Leu Ser Asp Arg He His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu He Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Aso Gin Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 130 135 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly He Giy Glu Lys Thr Ala Arg Ly: Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Giy Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala He Arg Glu Lys He Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Giu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Giy Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Giu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys ASD Leu Ser Val Leu Ala L«=u Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Giy Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Giu Giy Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 335 - 390 395 400 Glu Ala Giy Giu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405- 410 415 Tro Gly Arg Leu Giu Giy Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Giu Glu He Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 455 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gin Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 435 490 495 Glu Leu Giy Leu Pro Ala He Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Giu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro He 515 520 525 Val Glu Lys He Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr He Asp Pro Leu Pro Asp Leu He His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn He Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg He Arg Arg Ala Phe He Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln He Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Aso Glu Asn Leu He Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp He His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr He Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala He Pro Tyr Glu Glu 575 680 685 Ala Gln Ala Phe He Giu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 630 695 700 Ala Trp He Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lvs Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 al Gin Giy Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu '5b '60 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Giy Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Aso Glu Leu Val Leu Giu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 735 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Giy Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Giu Val Gly He Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830

Claims

Reiviadicaciopea

1. Una enzima ADN polimerasa termoestable que comprende la secuencia aminoácido SerGlnlleXaaLeuArgXaa (S?Q ID N0:l), caracterizada porque "Xaa" en posición 4 de esta secuencia es cualquier residuo aminoácido pero no un residuo ácido glutámico (Glu) y "Xaa" en posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (He) .

2. La enzima ADN polimerasa termoestable de la reivindicación 1, caracterizada porque es un derivado recombinante de una ADN polimerasa termoestable que se presenta naturalmente, en donde dicha ADN polimerasa termoestable que se presenta naturalmente comprende el fragmento de secuencia aminoácido SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO:2), en donde "Xaa" en la posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (He) .

3. La enzima ADN polimerasa termoestable de la reivindicación 2, caracterizada porque despliega discriminación reducida contra la incorporación de un nucledtido no convencional en comparación a dicha ADN polimerasa termoestable que se presenta naturalmente.

4. La ADN polimerasa termoestable de la reivindicación 3, caracterizada porque además la habilidad de dicha polimerasa para incorporar un nucledtido no convencional, relativo a la habilidad de dicha forma nativa correspondiente de la polimerasa para incorporar dicho nucledtido no convencional, es incrementada por lo menos 20 veces.

5. La ADN polimerasa termoestable como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicha polimerasa tiene actividad suficiente para usarla en una reacción de secuenciación de ADN que comprende un nucleótido no convencional, que es preferiblemente un ribonucleósido trifosfato y un nucleótido convencional correspondiente en una relación de 1:1 o menos.

6. La ADN polimerasa termoestable como se reivindica en cualquiera de laß reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicha polimerasa tiene actividad suficiente para usarla en una reacción de secuenciación de ADN que comprende un nucleótido no convencional que es un ribonucleósido trifosfato presente en una concentración de menos de aproximadamente 100 µM y un nucleótido convencional que está presente en una concentración de mas de aproximadamente 100 µM.

7. La enzima ADN polimerasa termoestable de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizada porque es un derivado recombinante de una enzima ADN polimerasa termoestable «que se presenta naturalmente en un organismo seleccionado del grupo que consiste de Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species spsl7, Thermus thermophilus, Thermotoga marítima, Thermotoga neopolitana, Ther osipho africanus, Anaerocellum thermophilum, Bacillus caldotenax, y Bacillus stearothermophilus .

8. La enzima ADN polimerasa termoestable de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizada porque es un derivado recombinante de una ADN polimerasa de especies Thermus termoestable que se presenta naturalmente, preferiblemente de la ADN polimerasa Taq o una polimerasa homologa de la misma, mas preferentemente de una ADN polimerasa termoestable que comprende la secuencia aminoácido LeuAspTyrSerGlnlleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ ID NO: 5) .

9. La enzima ADN polimerasa termoestable de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque tiene al menos aproximadamente 39%, preferiblemente al menos aproximadamente 60%, mas preferible aproximadamente 80% de homología de secuencia a la secuencia aminoácido de Taq ADN polimerasa (SBQ ID NO: 7) .

10. Una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque codifica una enzima ADN polimerasa termoestable como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico, caracterizado porque codifica una enzima ADN polimerasa termoestable como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Una célula huésped que comprende una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque codifica una enzima ADN polimerasa termoestable como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Un método para preparar una enzima ADN polimerasa termoestable, caracterizado porque comprende: (a) cultivo de una célula huésped de la reivindicación 12 bajo condiciones que promueven la expresión de la enzima ADN polimerasa termoestable; y (b) aislamiento de enzima ADN polimerasa termoestable de la célula huésped o del medio de cultivo.

14. Una enzima ADN polimerasa termoestable preparada por el método como se reivindica en la reivindicación 13.

15. Uso de una enzima ADN polimerasa termoestable como se reivindica en cualquiera 'de las reivindicaciones 1 a 9 en una amplificación de ácido nucleico o reacción de secuenciacidn.

16. Una composición para usar en una reacción de secuenciacidn de ADN que comprende; un molde de ácido nucleico, un cebador de oligonucledtido complementario para dicho molde, una ADN polimerasa termoestable como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, una mezcla de dNTPs convencionales, y al menos un nucledtido no convencional, caracterizada porque la relación de dicho nucleótido no convencional a dicho nucleótido convencional correspondiente es 1:1 o menor .

17. La composición de la reivindicación 16, caracterizada porque dicho nucleótido no convencional es un ribonucledtido, por lo cual dicho ribonucleótido esta presente preferiblemente en una concentración de menos de aproximadamente 100 µM y el nucledtido convencional correspondiente está presente en una concentración de mas de aproximadamente 100 µM.

18. La composición de la reivindicación ' 17, caracterizada porque además dicho nucleótido no convencional no está marcado.

19. Un método para secuenciar un ácido nucleico receptor, caracterizado porque el método comprende los pasos de: (a) proporcionar un nucleótido no convencional y un nucleótido convencional correspondiente en una reacción de secuenciación de ADN, en donde dichos nucleótidos no convencional y convencional correspondiente están presentes en una relación menor de aproximadamente 1:1; (b) tratamiento de la reacción del paso (a) en presencia de una ADN polimerasa termoestable como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 bajo condiciones de extensión de cebador para proporcionar productos de extensión de cebador que contienen dichos nucleótidos no convencionales; (c) tratamiento de los productos de la extensión de cebadorr del paso (b) bajo condiciones para hidrolizar dichos productos de extensión de cebador; (d) resolución de los productos de reacción del paso (c) ; y (e) determinación de la secuencia del ácido nucleico receptor.

20. El método para secuenciación de la reivindicación 19, caracterizado porque dicho nucleótido no convencional es un ribonucleótido, que está presente preferiblemente en una concentración de aproximadamente 0.1 µM - 100 µM.

21. El método para secuenciación de la reivindicación 19, caracterizado porque dicho nucleótido convencional está presente en una concentración de aproximadamente 50 µM - 500 µM.

22. Un equipo para secuenciar un ácido nucleico que comprende una ADN polimerasa termoestable como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y además opcionalmente reactivos útiles en tal procedimiento de secuenciacidn tal como p. ej . uno o mas cebadores de oligonucledtido, una mezcla de dNTPs convencionales, y al menos un nucleótido no convencional, caracterizado porque la relación de dicho nucledtido no convencional a dicho nucledtido convencional correspondiente es preferiblemente menor de uno. de la Invencidn La invencidn proporciona enzimas ADN polimerasa que comprenden la secuencia aminoácido SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SBQ ID NO:l), en donde "Xaa" en posición 4 de esta secuencia es cualquier residuo aminoácido pero no un residuo ácido glutámico (Glu) , preferiblemente un residuo glicina y "Xaa" en posición 7 de esta secuencia es un residuo valina (Val) o un residuo isoleucina (He) . Las ADN polimerasas termoestables de la invencidn tienen la eficiencia aumentada para incorporar nucledtidos no convencionales, tales co o ribonucleótidos, en productos de ADN y son ventajosos en muchas aplicaciones de síntesis in vitro. Tales enzimas son particularmente útiles para usar en protocolos de secuenciacidn de ácido nucleico y proporcionar nuevos medios para el análisis de la secuencia de ADN con ventajas de costo y eficiencia. También se reivindican ácidos nucleicos que codifican dichas polimerasas, vectores y células huésped que comprenden tal ácido nucleico, así como las composiciones para usar en una reacción de secuenciación, los equipos y métodos para la secuenciación que incluyen tales polimerasas.