MXPA97001979A - Inhibicion de infeccion por rotavirus humano - Google Patents

Abstract

Un producto nutricional enteral que comprende ya sea k-caseína bovina o k-caseína humana a una concentración mayor que la encontradaen leche humana o bovina y suficiente para inhibir la infección de células de mamífero por el rotavirus humano.

Description

INHIBICIÓN DE INFECCIÓN POR ROTAVIRUS HUMANO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención Esta invención se refiere a una proteína secretora, kapa caseína («-caseína) , que inhibe la unión de rotavirus humano (HRV) con células de mamífero. Descripción de la Invención El rotavirus humano es el agente viral más importante que causa gastroenteritis en niños que viven tanto en países en desarrollo como desarrollados (Yolken y colaboradores, "Human Milk Mucin Inhibits Rotavirus Replication and Prevents Experimental Gastroenteritis" (Mucina de leche humana inhibe la replicación del rotavirus y evita la gastroenteritis experimental) , Journal of Clinical Investigation 90, 1984-1991, 1992) . Los rotavirus también causan diarrea en cuneros y en guarderías, entre viajeros, en adultos que tienen contacto con niños, y en pacientes con sistema inmunológico comprometido. La alimentación al pecho proporciona alguna protección contra infecciones entéricas por patógenos cuando se comparan lactantes alimentados al pecho con bebés alimentados con biberón. Los estudios de niños que viven en países en desarrollo y desarrollados han mostrado que los lactantes alimentados al pecho tienen menos episodios de gastroenteritis que los lactantes alimentados con biberón. La almentación al pecho también puede disminuir la severidad de la diarrea y el vómito asociado con las enfermedades entéricas. Sin embargo, la alimentación al pecho no proporciona la protección total contra la infección y la infección por rotavirus se ha observado en lactantes alimentados al pecho. No se ha encontrado un solo factor como enteramente responsable para el efecto protector de la alimentación al pecho. Se cree que los anticuerpos juegan un papel, sin embargo, el nivel de anticuerpo anti-rotavirus en la leche humana no se correlaciona con el grado de protección presentado por la leche. Esto sugiere que factores que no son inmunoglobulina contribuyen al efecto protector de la leche materna, y se han llevado a cabo investigaciones para identificar estos factores. Yolken y colaboradores reportan una sustancia natural no inmunoglobulina, la mucina de la leche, que inhibe la replicación del rotavirus. La mucina es una glucoproteína que contiene ácido siálico. En este reporte, Yolken y colaboradores demuestran que la mucina y los componentes de la mucina encontrados en la leche humana muestran actividad anti-rotaviral. Usando componentes de mucina de leche purificados en una prueba de enlace de fase sólida, Yolken y colaboradores primero mostraron el enlace de la mucina con células de riñon de mono verde africano (MA-104) infectadas con cepas de rotavirus humanas y de simio. Usando técnicas de cultivo de tejido luego mostraron que una fracción de leche humana, posteriormente identificada como complejo de mucina de leche humana inhibió la replicación del rotavirus. Esto se demostró además mostrando que esta fracción se enlazó específicamente con células infectadas con rotavirus . Cuando la fracción activa fue desialilada mediante hidrólisis química, hubo una disminución sustancial en enlace con las células de rotavirus infectadas. Esto indica que en el sistema antiviral reportado aquí el ácido siálico es necesario para la actividad anti-rotaviral . Yolken y colaboradores no encontraron evidencia de actividad inhibitoria de rotavirus en las fracciones lípidas de la leche. Yolken y colaboradores también demostraron la eficacia de componentes de la leche que contienen mucina para prevenir gastroenteritis experimental por rotavirus en ratones lactantes . La WO 94/ 09651 (Newburg y colaboradores, "Anti-Diarrheic Product and Method of Treating Rotavirus-Associated Infection" [Producto antidiarreico y método para tratar infección asociada por rotavirus] ) describe un producto que contiene un agente antidiarreico, como el complejo de mucina de la leche y sus componentes, que pueden enlazar rotavirus, y un método para inhibir la infección por rotavirus en células de mamíferos exponiéndolas a estos agentes. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número: 5,147,853 (Dosako y colaboradores, "Infection Protectant" (Protector de la Infección) ) describe un método para evitar la adhesión de E. coli a células epiteliales humanas tratándolas con K -caseína, una proteína conjugada de ácido siálico derivada de la leche de vaca. La prevalencia de la infección por rotavirus en los grupos en riesgo, especialmente lactantes y niños, y la seriedad de sus efectos respalda la necesidad de un tratamiento efectivo. Es de particular importancia desarrollar métodos para prevenir y tratar infección por rotavirus, que no tengan efectos secundarios adversos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente invención se describe que una proteína secretora, /-caseína, que se puede purificar a partir de leche humana o bovina, o fabricar en forma recombinante usando ADNc, inhibe la unión de rotavirus humano con células de mamífero. En una prueba, se obtuvo 60-70 por ciento de inhibición de enlace de rotavirus humano cuando las células se trataron ya sea con K -caseína humana o bovina. La «-caseína, que es un producto de las mamas se cree que no tiene efectos secundarios adversos, se puede usar para la prevención y tratamiento de infección por rotavirus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra el método de preparación de rotavirus humano etiquetado con yodo radioactivo. La Figura 2 es una gráfica que muestra la extensión de inhibición del enlace por rotavirus humano con células MA-104 por «-caseínas humanas y bovinas. La Figura 3 muestra la inhibición dependiente de la dosis de rotavirus humano con células MA-104 mediante «-caseína humana. La Figura 4 muestra que la «-caseína humana retuvo su capacidad de inhibir el enlace por rotavirus humano con células MA-104 después de ser tratada con neuraminidasa, fucosidasa o ambas . La Figura 5 muestra que la «-caseína bovina retuvo su capacidad para inhibir el enlace por rotavirus humano con células MA-104 después de ser tratado con neuraminidasa. La Figura 6 muestra el efecto de digestión por Pronase® sobre la capacidad de la «-caseína bovina para inhibir el enlace por rotavirus humano con células MA-104. La Figura 7 muestra la neutralización dependiente de la dosis de rotavirus humano medido por la capacidad de «-caseína bovina para inhibir la infección de células MA-104. La Figura 8 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos de la «-caseína humana. La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos que tiene la actividad biológica de la «-caseína humana.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención resulta de un esfuerzo de investigación dirigido hacia mejorar los métodos para evitar tratar infecciones entéricas causadas por rotavirus en mamíferos, especialmente en humanos. La invención demuestra la efectividad de la «-caseína para inhibir la unión de rotavirus humano (HVR) con células de simio, y mediante esto evitar que el virus entre a las células y cause infección. El agente de esta invención, la «-caseína, es particularmente útil en el tratamiento de lactantes y niños ya que es un constituyente normal de la leche humana y está presente en la dieta humana en la leche bovina. Es, así, improbable que cause reacciones tóxicas o alérgicas en sujetos tratados. La «-caseína bovina está presente en la leche bovina a una concentración de aproximadamente 3.3 gramos/litro. Se puede añadir a preparaciones de alimentos y estar disponible tanto para adultos y niños en riesgo para la infección por rotavirus con poco, si lo hay, riesgo de reacción inmunológica. Lo que se describe en esta solicitud es un método para prevenir o retardar el brote de, o tratar una infección de, una célula de mamífero causada por rotavirus humano que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un agente seleccionado del grupo que consiste en «-caseína humana no hidrolizada natural o recombinante, y «-caseína bovina no hidrolizada natural o recombinante. También se describe un método para evitar o retardar el brote de, o tratar, la infección por rotavirus de las células de un mamífero que comprende administrar al mamífero una composición nutritiva enteral que comprende una cantidad efectiva antiinfección rotaviral de un agente seleccionado del grupo que consiste en «-caseína humana no hidrolizada natural o recombinante, y «-caseína bovina no hidrolizada natural o recombinante a una concentración que exceda la encontrada en la leche humana o bovina. Ahora se proporcionan ejemplos específicos para describir los métodos de preparación de la «-caseína y las dos pruebas empleadas para medir la inhibición de la capacidad de enlace del rotavirus humano HRV por «-caseína humana y bovina. Los ejemplos se proporcionan con fines únicamente de ilustración y no pretenden ser limitantes.

Ejemplo l: Preparación de «-caseína de leche humana Se descongeló aproximadamente 0.5 litro de leche humana congelada, se centrifugó a 15,000 x g durante l hora a 4°C y la nata, que es la capa superior, se retiró. Se homogeneizó el sobrenadante y los granulos y el pH del material resultante se ajustó a 4.3 mediante la adición de ácido clorhídrico. Se añadió cloruro de calcio a la concentración final de 60 mM. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y las caseínas precipitadas se recuperaron entonces mediante centrifugación a 18,000 x g durante 90 minutos a 4°C. Los granulos de caseína se disolvieron entonces en aproximadamente 90 mililitros de 6 M de urea y 20 mM de etanolamina a un pH de 9.5 y se extrajeron tres veces con 4 volúmenes de hexano para reducir más el contenido de grasa. La fase acuosa se dializó tres veces contra 4 litros de agua usando una membrana cortada de peso molecular de 12,000 y se liofilizó. Esta caseína cruda (el rendimiento fue de aproximadamente 2-3 gramos/litro) se disolvió en 6M de urea, 20 mM de ácido n-2-hidroxietilpeperazina-n' -2-etansulfónico (HEPES) (Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo) con 0.5 por ciento (volumen/volumen) 2-mercaptoetanol (2-ME) a un pH de 7.5 y se agitó a 4°C durante l hora. Esta solución fue cromatografiada en una columna Macroprep-S® de 2.6 x 13 centímetros (Bio-Rad, Hercules, CA) y se equilibró en el mismo regulador excepto porque se usó 0.1 por ciento (volumen/volumen) de 2-mercaptoetanol . El regulador de lavado fue 6M de urea, 20 mM de ácido n-2-hidroxietilpeperazina-n' -2-etansulfónico y 0.1 por ciento (volumen/volumen) de 2-mercaptoetanol a pH 7.5. El eluyente se monitoreó a una longitud de onda de 280 MM. La elución del material ligado se llevó a cabo mediante la aplicación de un gradiente lineal de O a 0.3 M de cloruro de sodio en 100 minutos a una velocidad de flujo de 2 mililitros/minuto. Se recolectaron fracciones de 7 mililitros y se detectó «-caseína ya sea por comparación con «-caseína humana obtenida de SYMBICOM AB, Suecia, usada como estándar en electroforesis de gel de poliacrilamida sulfato dodecilo de sodio (SDS-PAGE) o mediante análisis de mancha inmunológica. Las fracciones que contienen «-caseína se reunieron y dializaron tres veces en 4 litros de agua como se describió anteriormente seguido por liofilización. Este material se disolvió en 6 M de urea, 20 mM de ácido n-2-hidroxietilpeperazina-n' -2-etansulfónico y 0.5 por ciento (volumen/volumen) 2 -mercaptoetanol a pH 7.0 a una concentración de aproximadamente 10 miligramos/mililitro a 4°C y se cargó en la misma columna. La columna se lavó con 6 M de urea, 20 mM de ácido n-2-hidroxietilpeperazina-n' -2-etansulfónico y 0.1 por ciento (volumen/volumen) 2-mercaptoetanol a pH 7.0 y luego se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 06 M de cloruro de sodio en 140 minutos a una velocidad de flujo de 2 mililitros/minuto. Las fracciones que contenían el mayor pico da 280 MM se reunieron, dializaron como anteriormente y luego se liofilizaron. El material se estimó tener más del 90 por ciento de pureza.

Ejemplo 2: Fuente de «-caseína bovina La «-caseína bovina se compró en Sigma (catálogo #C0406) y tuvo una pureza mayor de 80 por ciento.

Ejemplo 3: Procedimiento para la prueba de inhibición de enlace celular con rotavirus humano Células MA-104 de riñon de mono verde africano (American Type Culture Collection, MD) se cultivaron en charolas de cultivo de tejido de 24 pozos al 100 por ciento de confluencia. El uso de células MA-104 se describe en Kitamoto y colaboradores, "Comparative Growth of Different Rotavirus Strains in Differentiated Cells" (Crecimiento comparativo de diferentes cepas de rotavirus en células diferenciadas) , Virology 184: 729-737 (1991). Experimentos reportados por Kitamoto y colaboradores muestran que los rotavirus humanos, incluyendo la cepa Wa, crecen y producen antígenos en células MA-104. Las células se lavaron dos veces con medio de Hank (Sigma) y se fijaron con 1 por ciento de paraformaldehído en solución salina regulada de fosfato (PBS) a temperatura ambiente durante 15 minutos. Esto se siguió por tres lavados con solución salina tris-regulada (TBS) . Las soluciones de inhibidores potenciales en solución salina tris-regulada conteniendo 5 miligramos/mililitro de la albúmina de suero bovino (BSA) se añadieron a los pozos antes de la adición de suspensiones de rotavirus humano (HRV) etiquetado con 125I . El virus radioetiquetado se preparó como se describió en la Figura 1. Las placas se incubaron 90 minutos a 37°C y se lavaron tres veces con solución salina tris-regulada. Las células se lisaron añadiendo 0.2 por ciento de hidróxido de sodio y 2 por ciento de solución SDS . Las cuentas por minuto (cpm) en los lisados se determinaron en un contador de centilación y usaron como indicadores de rotavirus humano enlazado con célula.

Ejemplo 4: Determinación de la inhibición de enlace de rotavirus humano cepa Wa con células MA-104 por kapa-caseínas humana y bovina En un experimento mostrado en la Figura 2, se probaron cinco agentes para ver su potencial inhibitorio a una concentración de l miligramo/mililitro. La «-caseína humana inhibió el enlace de rotavirus humano, cepa Wa, con las células MA-104 en más del 70 por ciento y la «-caseína bovina (Sigma) inhibió el enlace en más del 60 por ciento comparada con las células de control que no recibieron ningún agente inhibitorio potencial después de haberse expuesto al rotavirus humano. La beta-caseína bovina (Sigma) y la beta-caseína humana (Symbicom AB, Suecia) presentaron mucha menos capacidad para inhibir el enlace de rotavirus humano, cepa Wa. La beta-caseína bovina mostró el 45 por ciento de inhibición y la beta-caseína humana mostró el 25 por ciento de inhibición. La mucina submaxilar bovina (Sigma) se probó en el mismo experimento y mostró 50 por ciento de inhibición, sin embargo, posterior experimentación mostró que esta inhibición no fue dependiente a la dosis y, por lo tanto, no específica. Esto se ilustra en la Figura 3. Por el contrario, se mostró que la «-caseína humana fue dependiente de la dosis en el mismo experimento .

Ejemplo 5: Inhibición de Infección por rotavirus humano mediante «-caseína humana o bovina - efecto del ácido siálico En otro experimento usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, se trató la «-caseína humana con neuraminidasa para remover el ácido siálico de las cadenas glicanas de las moléculas de proteína. **Como se ilustra en la Figura 4 la «-caseína humana desialilada mostró actividad similar en la prueba de inhibición de rotavirus con la «-caseína humana intacta. Esto indica que en este experimento los residuos de ácido siálico no se requieren para el efecto inhibitorio de la «-caseína humana. La «-caseína humana intacta y desialilada se trató con fucosidasa. Ambos agentes tratados retuvieron su actividad inhibitoria, lo cual se indica en la Figura 4. Esto muestra que bajo las condiciones de esta prueba los residuos de fucosa en la «-caseína humana no se requieren para actividad inhibitoria contra el rotavirus humano . Cuando se trató la «-caseína bovina con neuraminidasa para remover ácidos siálicos, la «-caseína bovina desialilada resultante fue altamente activa en esta prueba, como se muestra en la Figura 5. Se concluye que los residuos de ácido siálico en «-caseína bovina tampoco se requieren para su actividad contra el HRV.

Ejemplo 6: Inhibición de la infección de rotavirus humano mediante «-caseína bovina - Efecto de hidrólisis Se digirió «-caseína en 100 veces exceso con una proteasa, Pronase® (Calbiochem, la Jolla, CA) , durante 16 horas a 37°C en 0.1 M de regulador tris a pH 8.0. La Figura 6 muestra que la actividad dependiente de la dosis contra el rotavirus humano de la proteína hidrolizada fue significativo en esta prueba. La dosis en este experimento se determinó por las cantidades molares de hexosa presente en las cadenas glicanas de la «-caseína bovina. Aunque se requirieron 7-8 veces más de la «-caseína bovina hidrolizada que de la «-caseína bovina natural para alcanzar el mismo grado de inhibición, la actividad inhibitoria contra el rotavirus humano se retuvo en la proteína hidrolizada bajo las condiciones de esta prueba.

Ejemplo 7: Inhibición de la infección por rotavirus humano - Método de la segunda prueba - Células MA-104 y Cepa Wa de rotavirus humano Se realizó otro conjunto de experimentos para medir la capacidad de la «-caseína para inhibir la infección de células por rotavirus humano. El procedimiento de prueba empleado fue como sigue. Células MA-194 de riñon de mono verde africano cuyo uso en pruebas de rotavirus se describen en Kitamoto y colaboradores, "Comparative Growth of Different Rotavirus Strains in Differentiated Cells" (Crecimiento comparativo de diferentes cepas de rotavirus en células diferenciadas) , Virology 184: 729-737 (1991), se obtuvieron en BioWhittaker, Inc. (Walkersville, MD) . Los experimentos reportados por Kitamoto y colaboradores muestran que los rotavirus humanos, incluyendo la cepa Wa, crecen y producen antígeno en células MA-104. Las células se cultivaron en Medio Eagle basal (BME) (BioWhittaker) complementado con 10 por ciento de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT) y 2 mM L-glutamina (BioWhittaker) . Las células se subcultivaron de manera rutinaria en matraces de 75 centímetros cuadrados usando tripsina-EDTA (0.25 por ciento de tripsina, 1 Mm EDTA) (BioWhittaker) para descarte de células. Se trataron las charolas de prueba con 1 µg/pozo de fibronectina {Sigma) para ayudar a la adhesión de células al sustrato del cultivo y para asegurar su posterior unión durante los pasos de lavado de la prueba de neutralización del virus. La fibronectina, solubilizada en agua destilada, se surtió a cada pozo y se incubó durante 1-3 horas a temperatura ambiente para permitir que se pegara a los pozos de plástico. Antes de dosificar las células en los pozos de la charola de pruebas, se aspiró la fibronectina residual. Las células se sembraron en charolas de 96 pozos a una densidad de 10,000 células por pozo con medio de cultivo mantenido a 37°C en un incubador al 5 por ciento de C02 durante 3-4 días proporcionando una monocapa confluente para los estudios de neutralización del virus. La cepa Wa serotipo 1 de rotavirus humano se obtuvo de la Dra. Linda J. Saif (Ohio Agricultural Research and Development Center) y fue adquirido originalmente del Dr. R. Wyatt (National Institutes of Allergy and Infectious Diseases) . El caldo de virus usado en estos estudios fue una cosecha viral de pasaje 5. Antes de usarlo en estas pruebas, el rotavirus humano fue activado con 10 Ul/mililitro de tripsina por cada 1 mililitro de rotavirus humano y se incubó durante 30 minutos a 36°C. El virus se diluyó con medio BME complementado con 2 mM de glutamina, 50 µg/mililitro de sulfato de gentamicina (BioWhittaker) y 1 por ciento de solución de penicilina-estreptomicina (Sigma) para alcanzar una dilución de 1:250, que es dos veces la concentración final deseada de virus .

Ejemplo 8: Inhibición de infección por rotavirus humano - Método de la segunda prueba - Neutralización del virus Se mezclaron e incubaron previamente volúmenes iguales de agente de prueba y retrovirus humanos activados por tripsina durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que el agente de prueba se enlazara al virus . Durante el período de incubación previa del agente de prueba - retrovirus humano, las placas que contenían células MA-104 se lavaron 3 veces con 15 µl de medio diluyente (150 µl/pozo/lavada) después de lo cual se añadieron otros 50 µl de medio diluyente a cada pozo. Las placas de .MA-104 se incubaron entonces a 37°C en 5 por ciento de C02 hasta que terminó el período de incubación previa para el rotavirus humano + el agente de prueba. Una muestra de control de 100 µl de la muestra de rotavirus humano + agente de prueba se pipeteó en los pozos apropiados y se mezcló con 50 µl de medio diluyente. Las placas se incubaron durante 12-14 horas adicionales a 37°C para permitir que el virus se propagara dentro de las células. Un tiempo de incubación más largo resultaría en la infección de las células MA-104 por virus de progenie, lo cual no es deseable. Se incluyeron en cada prueba tres tipos de pozos de control (1) pozos que contenían células MA-104, rotavirus humano, pero no agente de prueba, (2) pozos que contenían células MA-104, rotavirus humano, y anticuerpos para rotavirus humano, que se conocen como inhibidores de rotavirus humano y (3) pozos que contenían células MA-104, pero sin virus. Cada concentración de agente de prueba o anticuerpo se probó por triplicado. Después del período de incubación, las placas de prueba se lavaron dos veces con solución salina regulada de fosfato de Dulbecco (PBS) (BioWhittaker) 150 µl de etanol al 70 por ciento frío se añadió a cada pozo y se removieron 95 µl para evitar que el aire secara la monocapa de células . Se añadió (190 µl) de etanol absoluto frío a la capa de alcohol al 70 por ciento y se mecieron las placas y se refrigeraron durante la noche. Se removió entonces el alcohol y se añadieron 150 µl de solución salina regulada de fosfato que contenía 0.05 por ciento de albúmina de huevo de pollo (PBS-CEA) (Sigma) a cada placa para bloquear sitios de enlace no específicos . Para teñir las placas, se removió el PBS-CEA y se añadieron 200 µl de IgG anti-rotavirus a cada pozo a una dilución de 1:2500. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS-CEA y 200 µl de peroxidasa conjugada con IgG anti-bovina (Cappel Organon Teknika, Durham, NC) se añadió a cada pozo a una dilución de 1:2000. las placas se cubrieron e incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ellas entonces se lavaron tres veces con PBS-CEA y se añadieron 100 µl de sustrato de diaminobenzidina (Sigma) a cada pozo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron dos veces con PBS-CEA y luego se lavaron con agua destilada.

Ejemplo 9: Inhibición de infección de rotavirus humano por capa-caseína bovina- Método de la segunda prueba - Contar células infectadas. Las platos que se han preparado de acuerdo con el método de los ejemplos 7 y 8 se rehidratan mediante la adición de 150-200 µl de agua destilada por pozo antes del examen microscópico. Las platos se examinaron con un microscopio de luz a 100 por ciento de ampliación. Las células teñidas de oscuro y que contenían regiones citoplásmicas granulares y café característico se contaron como células infectadas por virus. Se obtuvo una cuenta representativa de células infectadas para cada pozo contando todas las células teñidas dentro de un área uniforme que representó aproximadamente 20 por ciento del área de superficie de cada pozo. Los pozos de control, a los cuales no se les añadió virus, se examinaron para asegurar que no tenían células infectadas. Los resultados se reportaron como porcentaje de inhibición obtenida comparando el número promedio de células infectadas en la población que había sido tratada con el agente de prueba + rotavirus humano con el número promedio de células infectadas en la población que había sido expuesta al virus solo. Los resultados se muestran en la Figura 7. La «-caseína bovina, el agente de prueba, el rotavirus humano neutralizado de una manera dependiente de la dosis. Concentraciones crecientes de «-caseína bovina dieron como resultado niveles correspondientemente reducidos de infección hasta una concentración de 1.6 mg/ml donde la infección fue inhibida en casi el 90 por ciento y solamente el 10 por ciento de las células se infectaron.

Ejemplo 10: Inhibición de infección de rotavirus humano por Kapa-caseína bovina- Método de la segunda prueba - Efecto de la hidrólisis La «-caseína bovina fue digerida con Pronase® (Calbiochem, una proteasa, por 4 horas ó 20 horas y en las concentraciones indicadas en las Tablas 1 y 2, que muestran experimentos ejecutados en días diferentes. Las placas se incubaron a 37°C de acuerdo con el método del Ejemplo 8, y se tiñeron y contaron de acuerdo con el método del Ejemplo 9 para determinar por ciento de inhibición. Los resultados de los experimentos realizados en días diferentes mostrados en las Tablas 1 y 2 indican que la hidrólisis de la «-caseína bovina con la proteasa eliminó la inhibición de la infección de células MA-104 por rotavirus humano. La «-caseína bovina no digerida mostró entre el 86 por ciento y el 93 por ciento de inhibición de la unión viral con las células Wa. La «-caseína bovina hidrolizada mostró ya sea no inhibición o inhibición muy ligera en esta prueba. La Pronase® sola, sin la adición de «-caseína a los platos, dio como resultado cantidades variables de inhibición que no se relacionaron con la dosis. En esta prueba, la «-caseína bovina con Pronase® o la Pronase® sola se hirvieron después del período de digestión para desnaturalizar la proteína y abolir su actividad. Por lo tanto, toda la inhibición del rotavirus humano que se observó se puede atribuir a la acción de la «-caseína bovina y no a la Pronase®. En la prueba descrita en el Ejemplo 6, la Pronase® no se hirvió suficientemente después del período inicial de digestión. Los resultados de esa prueba mostraron que la hidrólisis no abolió la inhibición. Es probable que en ese caso la proteasa no se inactivo completamente y la inhibición observada se puede atribuir a Pronase® residual más que a la «-caseína bovina hidrolizada.

Tabla 1 INHIBICIÓN DE INFECCIÓN POR ROTAVIRUS HUMANO POR CAPA-CASEINA BOVINA: EFECTO DE HIDRÓLISIS Tabla l (continuación) hidrolizada, y proteasa (Pronase®) sola. 2 «-caseína bovina Tabla 2 INHIBICIÓN DE INFECCIÓN POR ROTAVIRUS HUMANO MEDIANTE KAPA CASEÍNA BOVINA: EFECTO DE HIDRÓLISIS (Pronase®) sola Ejemplo 11: Utilidad y administración de kapa-caseína La «-caseína humana se puede extraer de la leche humana o puede obtenerse mediante métodos de ADN recombinante y clonación en células procarióticas y eucarióticas o a partir de mamíferos transgénicos usando la secuencia de ADN y el sistema de expresión de Hansson y colaboradores. La «-caseína bovina se puede extraer de leche bovina donde está presente a una concentración de aproximadamente 3.3 gramos/litro. Una secuencia de ADN que codifica la «-caseína proteína de leche humana se describe en la Publicación del TCP No. WO 93/15196 (Hansson y colaboradores, "DNA Encoding Kappa- Casein, Process for Obtaining the Protein and Use Thereof" [ADN que codifica kapa-caseína, proceso para obtener la proteína y uso de la misma] ) que se incorpora en la presente mediante referencia con el propósito de mostrar un método de construir un sistema de expresión para una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene la actividad biológica de la «-caseína humana. La secuencia de ADN se muestra en la Figura 8 (SEQ ID NO: 1:) y la secuencia de aminoácidos del polipéptido al cual codifica se muestra en la Figura 9 (SEQ ID NO: 2:). El polipéptido codificado se determinó tener la actividad antimicrobiana o actividad opioide de la «-caseína humana. La secuencia de ADN mostrada puede usarse en la producción de «-caseína humana recombinante usando ya sea un sistema procariótico o uno eucariótico, o se puede usar para producir mamíferos no humanos transgénicos . La «-caseína humana recombinante se puede usar como un constituyente de fórmula para lactantes para mejorar el valor nutritivo y biológico de la fórmula o, como en el caso de la presente invención, proporcionar protección contra infección entérica por rotavirus humano. La secuencia de ADN descrita por Hansson y colaboradores se determinó de una clona de ADNc aislada de una biblioteca de ADNc de glándula mamaria humana. La construcción del sistema de expresión y su caracterización biológica empleó métodos de ADN recombinante estándar. El procedimiento usado fue el siguiente: bacterias E. coli Y1090 se cultivaron en platos LB (Luria-Bertoni) que contenían 50 µg de carbenicilina. Una sola colonia se aisló y cultivó durante la noche en un plato LB que contenía 0.2 por ciento de maltosa y 10 mM MgS04. Luego se mezclaron 0.4 mililitros del cultivo con fagos de biblioteca diluidos y se permitió la adsorción durante 15 minutos a 37°C. El cultivo infectado se mezcló con 7 mililitros de agarosa suave (0.75 por ciento de agarosa en LB y 10 mM MgS04) . La mezcla de agarosa suave se vertió en platos de LB de 150 milímetros. Los platos se incubaron a 42 °C durante aproximadamente 3.5 horas hasta que las placas fueron visibles. Después de esto, cada plato se cubrió con una membrana (DuPont NEN®, Pantalla de placa de colonia) previamente saturada en 10 mM IPTG (Isopropil-6-D-tiogalactosida) , y se incubó durante la noche a 37°C. Las posiciones de las membranas se indicaron antes de que las membranas se removieran. Las membranas se lavaron en TTBS (Solución salina tris regulada (TBS que contenía 0.05 por ciento Tween 20) ) , y se incubaron en TTBS conteniendo 20 por ciento FCS y antisuero de «-caseína el cual se había cultivado en conejos, purificado, y diluido en 1:25 durante 2 horas a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron dos veces durante 5 minutos en TTBS a temperatura ambiente. Se añadió IgG anticonejo de cabra biotinilada en TBS (50 mM Tris-HCL pH 7.9, 150 mM NaCl) y las membranas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente . Las membranas se lavaron de nuevo con TTBS dos veces durante 5 minutos a temperatura ambiente. El conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina biotinilada en TTBS se añadió seguida de una incubación durante l hora a temperatura ambiente . Las membranas se lavaron entonces cuatro veces en TTBS durante 5 minutos y se enjuagaron tres veces en un regulador que contenía 50 mM Tris-HCl pH 9.8, 3 mM MgCl2, 50 µg/ml XP (5-bromo-4-cloro-3-indoilfosfato) y 100 µg/mililitro de NBT (Nitroblue tetrasolio grado III) . Aproximadamente se identificaron 100 placas positivas. Las placas aisladas se purificaron por dilución y se repitió el análisis. Se preparó el ADN de fago y las preparaciones de ADN se digirieron con EcoRI . El ADN digerido se separó mediante electroforesis de agarosa y se clonaron varios fragmentos de EcoRI en EcoRI digerido y se trataron en fosfatasa alcalina los plásmidos pUC18 y posteriormente se transformaron en E. coli TG2. Los transformantes se seleccionaron en platos que contenían 50 µg/mililitro de carbenicilina, 40 µg/mililitro de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indoil-ß-D-galactosida) y 1 mM IPtc (Isopropil-/3-d-tiogalactosida) . ADN de plásmido se analizó a partir de varios transformantes. Un transformante que aloja un plásmido que contiene el fragmento de ADNc de longitud completa que codifica la «-caseína humana se designó pS 270. El ADN del plásmido pS 70 se sometió a análisis de endonucleasa de restricción. La secuencia completa de nucleótido de ambas cadenas de la región que codifica la «-caseína se determinó usando un juego de secuenciamiento T7 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) en templados de doble cadena como se describe por el vendedor. Oligonucleótidos específicos complementarios al pUC 18 o secuencias de «-caseína se usaron como cebadores para reacciones de secuenciamiento. La secuencia de nucleótidos contenía un cuadro de lectura abierto suficiente para codificar la secuencia de aminoácidos entera de una proteína precursora de «-caseína que consistía en 162 aminoácidos y un péptido de señal de 20 aminoácidos. El ADN del plásmido, designado pS 270 se depositó en la colección de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D.3300 Braunschweig, Alemania y se identifica por el número de acceso #DSM 6878, La «-caseína purificada humana o bovina o sus derivados se pueden administrar enteralmente en forma de una unidad de dosis mucosa oral o con un tubo de alimentación, por ejemplo nasoyeyunal o yeyunal . En uso oral, la «-caseína deberá estar entre 2 por ciento y 50 por ciento en peso de la preparación. En preparaciones farmacéuticas, la «-caseína deberá mezclarse con un vehículo sólido pulverulento como la lactosa, sorbitol, almidón, o gelatina y prensada en forma de tabletas. También se pueden preparar dosis de múltiples-unidad. Las tabletas y granulos se pueden recubrir con sustancias como polímeros que cambien la velocidad de disolución en el tracto gastrointestinal. Ejemplos de recubrimientos incluyen polímeros aniónicos que tienen un pKa de arriba de 5.5. Las preparaciones líquidas de «-caseína humana o bovina se pueden preparar como 0.2 por ciento en peso del compuesto activo y glicerol . La dosis diaria del compuesto activo variará con la ruta de administración. El descubrimiento descrito en la presente de la actividad antiviral de la proteína secretora de la leche, «-caseína, hace factible el uso del agente en fórmula para lactantes, en sustancias farmacéuticas útiles para la prevención y el tratamiento de infección rotaviral en todos los grupos en riesgo, como suplemento nutricional para pacientes que sufren terapia por antibióticos, y como un ingrediente en otros productos nutritivos entérales bioactivos. Esta lista quiere ser sugestiva y no deberá interpretarse como limitante de los usos potenciales de la «-caseína.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Abbott Laboratories (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: "Inhibición de Infección por Rotavirus Humano" (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Donald O. Nickey ROSS Products División Abbott Laboratories (B) CALLE: 625 Cleveland Avenue (C) CIUDAD: Columbus (D) ESTADO: Ohio (E) PAÍS: Estados Unidos de Norteamérica (F) CÓDIGO POSTAL: 43215 (V) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO MEDIO: Disco flexible, 8.9 cm, 1.44 Mb almacenaje (B) COMPUTADORA: IBM compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS Versión 6.21 (D) SOFTWARE: WordPerfect Versión 6.0a (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/308,882 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 -septiembre-1994 (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/308,883 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-septiembre-1994 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 614-624-3774 (B) TELEFAX: 614-624-3074 (C) TELEX: Ninguno (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID. NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 857 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADNc (A) DESCRIPCIÓN: kapa- caseína de leche humana (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FUENTE ORIGINAL: Humana (A) ORGANISMO: Homo sapiens (B) CEPA: (C) INDIVIDUAL/AISLADA: (D) ESTADO DE DESARROLLO: Adulto (E) HAPLOTIPO: (F) TIPO DE TEJIDO: Glándula mamaria (G) TIPO DE CÉLULA: (H) LINEA CELULAR: ( I ) ORGANELO : (vii) FUENTE INMEDIATA: Glándula mamaria humana (A) BIBLIOTECA: (B) CLONA: (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: (B) POSICIÓN EN EL MAPA: (C) UNIDADES: (ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 45...593 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: Secuenciamiento de ADN y análisis de restricción (D) OTRA INFORMACIÓN: El producto codificado de la SEQ ID NO: 1: de nucleótido es la proteína de la leche humana, kapa caseína, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. (x) INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: L. Hansson, y colaboradores (B) TITULO: ADN que codifica Kapa-caseína, Proceso para obtener la proteína y uso de la misma (C) PUBLICACIÓN PERIÓDICA: (D) VOLUMEN: (E) NUMERO: (F) PAGINAS: (G) FECHA: (H) NUMERO DE DOCUMENTO : PCT/W093 /15196 ( I ) FECHA DE PRESENTACIÓN : 25 - ENERO- 1993 ( J) FECHA DE PUBLICACIÓN : 05 -AGOSTO- 1993 ( K) RESIDUOS RELEVANTES : (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ . ID . NO : 1 : GAATTCCGAG AGAAGACCTG ACTGGCACGA GGAAAGGTGC AATA ATG AAG AGT TTT 56 Meí Lys Ser Phe 1 CTT CTA GTT GTC AAT GCC CTG GCA TTA ACC CTG CCT TTT TTG GCT GTG 104 Leu Leu Val Val Asn Ala Leu Ala Leu Thr Leu Pro Phe Leu Ala Val 5 10 15 20 GAG GTT CAÁ AAC CAG AAA CAÁ CCA GCA TGC CAT GAG AAT GAT GAA AGA 152 Glu Val Gln Asn Gln Lys Gln Pro Ala Cys His Glu Asn Asp Glu Arg 25 30 35 CCA TTC TAT CAG AAA ACÁ GCT CCA TAT GTC CCA ATG 'I Al 1 AT G'I G CCA 200 Pro Phe Tyr Gln Lys Thr Ala Pro Tyr Val Pro Met Tyr Tyr Val Pro 40 45 ' 50 AAT AGC TAT CCT TAT TAT GGA ACC AAT TTG TAC CAÁ CGT AGA CCA GCT 248 Asn Ser Tyr Pro Tyr Tyr Gly Thr Asn Leu Tyr Gln Arg Arg Pro Ala 55 60 65 ATA GCA ATT AAT AAT CCA TAT GTG CCT CGC ACÁ TAT TAT GCA AAC CCA 296 De Ala He Asn Asn Pro Tyr Val Pro Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Pro 70 75 80 GCT GTA GTT AGG CCA CAT GCC CAÁ ATT CCT CAG CGG CAÁ TAC CTG CCA 344 Ala Val Val Arg Pro His Ala Gln He Pro Gln Arg Gln Tyr Leu Pro 85 90 95 100 AAT AGC CAC CCA CCC ACT GTG GTA CGT CGC CCA AAC CTG CAT CCA TCA 392 Asn Ser His Pro Pro Thr Val Val Arg Arg Pro Asn Leu His Pro Ser 105 110 115 TTT ATT GCC ATC CCC CCA AAG AAA ATT CAG GAT AAA ATA ATC ATC CCT 440 Phe He Ala lie Pro Pro Lys Lys lie Gln Asp Lys He He He Pro 120 125 130 ACC ATC AAT ACC ATT GCT ACT GTT GAA CCT ACÁ CCA GCT CCT GCC ACT 488 Thr He Asn Thr He Ala Thr Val Glu Pro Thr Pro Ala Pro Ala Thr 135 140 145 GAA CCA ACG GTG GAC AGT GTA GTC ACT CCA GAA GCT TTT TCA GAG TCC 536 Glu Pro Thr Val Asp Ser Val Val Thr Pro Glu Ala Phe Ser Glu Ser 150 155 160 ATC ATC ACG AGC ACC CCT GAG ACÁ ACC ACÁ GTT GCA GTT ACT CCA CCT 584 He He Thr Ser Thr Pro Glu Thr Thr Thr Val Ala Val Thr Pro Pro 165 170 175 180 ACG GCA TAAAAACACC AAGGAAATAT CAAAGAACAC AACGCAGGAC TTGCTGAAAC 640 Thr Ala CAAATTACTA CTTCACACTC TCCTTCAGCC ATTTGTCTGC CTTCAGTCAA CAGAAAATGT700 GATTTTCACA GATTCAGCTC TTCTCTCCTT ACATTTTACA TTCATGCCAC ATTCAATATT 760 TTGATTCTTG CACAATAAAG CCAACTGATT GCAAAAAAAA .AAAAAAAAAA .AAAAAAAAAA 820 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CGAATTC 857 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID. NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 182 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (C) TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA : Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA : Proteína (A) DESCRIPCIÓN: (iii) HIPOTÉTICO: (iv) ANTI-SENTIDO: (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: (B) CEPA: (C) INDIVIDUAL/AISLADA: (D) ESTADO DE DESARROLLO: (E) HAPLOTIPO: (F) TIPO DE TEJIDO: (G) TIPO DE CÉLULA: (H) LINEA CELULAR: ( I ) ORGANELO : (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: (B) CLONA: (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA : (A) CROMOSOMA/SEGMENTO : (B) POSICIÓN EN EL MAPA : (C) UNIDADES: (ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOMBRE/CLAVE: (B) LOCALIZACION: (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: (D) OTRA INFORMACIÓN: (x) INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: L. Hansson, y colaboradores (B) TITULO: ADN que codifica Kapa- caseína, Proceso para obtener la proteína y uso de la misma (C) PUBLICACIÓN PERIÓDICA: (D) VOLUMEN: (E) NUMERO: (F) PAGINAS: (G) FECHA: (H) NUMERO DE DOCUMENTO: PCT/W093/15196 (I) FECHA DE PRESENTACIÓN: 25 -ENERO- 1993 (J) FECHA DE PUBLICACIÓN: 05-AGOSTO-1993 (K) RESIDUOS RELEVANTES: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO: 2: Met Lys Ser Phe Leu Leu Val Val Asn AJa Leu Ala Leu Thr Leu Pro 3 5 10 15 Phe Leu Ala Val Glu Val Gln Asn Gln Lys Gln Pro AJa Cys His Gin 20 25 30 Asn Asp Glu Arg Pro Phe Tyr Gln Lys Thr Ala Pro Tyr Val Pro Met 40 45 Tyr Tyr Val Pro Asn Ser Tyr Pro Tyr T)t Gly Thr Asn Leu Tyr Gln 50 55 60 Arg Arg Pro Ala He Ala He Asn Asn Pro Tyr Val Pro Arg Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asn Pro Ala Val Val Arg Pro His Ala Gln He Pro Gln Arg 85 90 95 Gln Tyr Leu Pro Asn Ser His Pro Pro Thr VaJ Val Aig Arg Pro Asn 100 105 1 10 Leu His Pro Ser Phe He Ala He Pro Pro Lys Lys He Gln Asp Lys 115 120 125 He He Ue Pro Thr He Asn Thr He AJa Thr Val Glu Pro Thr Pro 130 135 140 AJa Pro AJa Thr Glu Pro Thr Val Asp Ser VaJ VaJ T r Pro Glu AJa 145 150 155 160 Phe Ser Glu Ser He JJe Thr Ser THr Pro Glu Thr Thr Thr VaJ Ala 165 170 175 Val Thr Pro Pro Thr Ala 180

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un producto nutricional enteral que comprende una cantidad anti-infección rotaviral efectiva de un agente seleccionado del grupo que consiste en kapa-caseína humana no hidrolizada natural o recombinante y kapa-caseína bovina no hidrolizada natural o recombinante a una concentración que excede a la encontrada en la leche humana o bovina.

2. El producto de la reivindicación l, en donde el producto nutricional enteral es fórmula para lactantes.

3. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente seleccionado del grupo que consiste en kapa-caseína humana no hidrolizada natural o recombinante y kapa-caseína bovina no hidrolizada natural o recombinante para el tratamiento terapéutico o profiláctico de infecciones del tracto gastrointestinal causado por el rotavirus humano.

4. Un método para evitar o retardar el brote de, o tratar, una infección de una célula de mamífero causada por el rotavirus humano que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un agente seleccionado del grupo que consiste en kapa-caseína humana no hidrolizada natural o recombinante y kapa-caseína bovina no hidrolizada natural o recombinante .

5. Un método de evitar o retardar el brote de, o tratar, gastroenteritis infantil que comprende tratar un lactante o niño en riesgo o afligido con la enfermedad de acuerdo con el método de la reivindicación 4.

6. El método de la reivindicación 4, donde el sujeto es un paciente inmunodeficiente. BtgTTM j Un producto nutricional enteral que comprende ya sea «-caseína bovina o «-caseína humana a una concentración mayor que la encontrada en leche humana o bovina y suficiente para inhibir la infección de células de mamífero por el rotavirus humano . * * * * *