MXPA05010563A - Sales de los inhibidores triciclicos de las poli(adp-ribosa) polimerasas. - Google Patents

Abstract

Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la formula siguiente son inhibidores de la poli(ADP-ribosil)transferasa (abreviadamente en ingles PARP), y son utiles como agentes terapeuticos en el tratamiento de canceres y en el alivio de los efectos de accidente cerebrovascular, traumatismo craneal, y enfermedad neurodegenerativa; los compuestos de la invencion se pueden usar como agentes terapeuticos contra el cancer, por ejemplo en combinacion con agentes citotoxicos y/o radiacion.

Description

SALES DE LOS INHIBIDORES TRICICLICOS DE LAS POLI(ADP-RIBOSA) POLIMERASAS CAMPO DE LA INVENCION La invención se .refiere a las sales de 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-113,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona, un compuesto que inhibe las poli(ADP-ribosa) polimerasas, por lo tanto, retrasando la reparación del daño a las hebras de ADN, y a los procedimientos de preparación de dichos compuestos. La invención también se refiere al uso de dichos compuestos en las composiciones farmacéuticas y tratamientos terapéuticos útiles para la potenciación de terapias anticáncer y la inhibición de neurotoxicidad consecuencia de un accidente cerebrovascular, traumatismo craneal, y enfermedades neurodegenerativas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las poli(ADP-ribosa) polimerasas (abreviadamente en inglés PARP), las enzimas nucleares encontradas en casi todas las células eucarióticas, catalizan la transferencia de las unidades ADP-ribosa desde el dinucleótido de nicotinamida adenina (abreviadamente en inglés NAD+) a las proteínas aceptoras nucleares, y son responsables de la formación de los polímeros de homo-ADP-ribosa lineales y ramificados unidos a proteínas. La activación de la PARP y la formación resultante de la poli(ADP-ribosa) se puede inducir mediante las roturas de hebras de ADN después de la exposición a quimioterapia, radiación ionizante, radicales libres de oxígeno, u óxido nítrico (abreviadamente NO). Debido a que este proceso de transferencia celular de ADP-ribosa se asocia con la reparación de la rotura de hebras de ADN en respuesta al daño de ADN producido por radioterapia o quimioterapia, puede contribuir a la resistencia que a menudo desarrolla diversos tipos de terapias de cáncer. Por consiguiente, la inhibición de la PARP puede retrasar la reparación de ADN intracelular y potenciar los efectos antitumorales de la terapia de cáncer. De hecho, los datos in vitro e in vivo muestran que muchos inhibidores de la PARP potencian los efectos de la radiación ionizante o fármacos citotóxicos tales como los agentes metilantes de ADN. Por lo tanto, los inhibidores de la enzima PARP son útiles como agentes quimioterapéuticos contra el cáncer. Además, se ha mostrado que la inhibición de la PARP promueve la resistencia a la lesión cerebral después de accidente cerebrovascular (Endres y col, "Ischemic Brain Injury is Mediated by the activation of Poly(ADP-Ribose)Polimerase", J. Cerebral Blood Flow Metab. 17: 1143-1151 (1997); Zhang, "PARP Inhibition Results in Substancial Neuroprotection in Cerebral Ischemia", Cambridge Healthtech Institute's Conference on Acute Neuronal Injury: New Therapeutic Opportunities, 18-24 de septiembre de 1998, Las Vegas, Nevada). Se cree que la activación de la PARP por la lesión de ADN juega un papel en la muerte celular consecuencia de un accidente cerebrovascular, traumatismo craneal, y enfermedades neurodegenerativas. El ADN se daña por cantidades excesivas de NO producido cuando la enzima NO sintasa se activa como resultado de una serie de acontecimientos iniciados por la liberación del neurotransmisor glutamato desde terminales nerviosos despolarizados (Cosi y col., "Poly(ADP-Ribose) Polymerase Revisited: A new Role for an Oíd Enzyme: PARP involvement in Neurodegeneration and PARP Inhibitors as Possible Neuroprotective Agents," Ann, N. Y. Acad. Sci., 366-379). Se cree que la muerte celular se produce como resultado del agotamiento de energía a medida que se consume NAD+ mediante la reacción catalizada por la enzima PARP. Por lo tanto, los inhibidores de la enzima PARP son inhibidores útiles de la neurotoxicidad consecuencia de un accidente cerebrovascular, traumatismo craneal, y enfermedades neurodegenerativas. Además, la inhibición de la PARP debe ser un enfoque útil para el tratamiento de afecciones o enfermedades asociadas a envejecimiento celular, tal como envejecimiento de la piel, mediante el papel de la PARP en la señalización del daño de ADN. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n° 5,589,483, que describe un procedimiento para ampliar la durabilidad y capacidad proliferativa de las células comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la PARP a las células en condiciones tales que está inhibida la actividad de la PARP. Por lo tanto, los inhibidores de la enzima PARP son agentes terapéuticos útiles para el envejecimiento de la piel. En otra aplicación adicional, la inhibición de la PARP se explora a nivel clínico para prevenir el desarrollo de diabetes mellitus insulinodependiente en individuos susceptibles (Saldeen y col., "Nicotinamide-induced apoptosis in insulin producing cells in associated with cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase," Mol. Cellular Endocrino!. (1998), 139: 99-107). Por lo tanto los inhibidores de la PARP deben ser útiles como agentes terapéuticos de prevención de diabetes. La inhibición de la PARP también es un enfoque para tratar afecciones inflamatorias tal como artritis (Szabo y col., "Protective effect of an inhibitor of poly(ADP-ribose) synthetase in collagen-induced arthritis," Portland Press Proc. (1998), 15: 280-281 ; Szabo "Role of Poly(ADP-ribose) Synthetase in Inflammation," Eur. J. Biochem. (1998), 350 (1 ): 1-19; Szabo y col., "Protection Against Peroxynitrite-induced Fibroblast Injury and Arthritis Development by Inhibition of Poly(ADP-ribose) Synthetase," Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos (1998), 95 (7): 3867-72). Por lo tanto, los inhibidores de la PARP son útiles como agentes terapéuticos para afecciones inflamatorias. La inhibición de la PARP tiene utilidad para protección contra isquemia miocárdica y lesión por reperfusión (Zingarelli y col, "Protection against myocardial isquemia and reperfusion injury by 3-aminobenzamide, an inhibitor of poly (ADP-ribose) synthetase," Cardiovascular Research (1997), 36: 205-215). Por lo tanto, los inhibidores de la PARP son útiles en la terapia de enfermedades cardiovasculares. La familia PARP de las enzimas es amplia. Recientemente se ha mostrado que las tankirasas, que se unen a la proteína telomérica TRF-1 , un regulador negativo del mantenimiento de la longitud del telómero, tienen un dominio catalítico que es notablemente homólogo a la PARP y se han mostrado que tienen actividad PARP in vitro. Se ha propuesto que la función del telómero en las células humanas está regulada por la poli(ADP-ribosil)ac¡ón. Los inhibidores de la PARP tienen utilidad como herramientas para estudiar esta función. Además, como consecuencia de la regulación de la actividad telomerasa por la tankirasa, los inhibidores de la PARP deben tener utilidad como agentes para regulación de la durabilidad celular, por ejemplo, para uso en terapia contra el cáncer para acortar la durabilidad de células tumorales inmortales, o como agentes terapéuticos antienvejecimiento, ya que la longitud del telómero se cree que está asociada al envejecimiento celular. Se conocen los inhibidores competitivos de la PARP. Por ejemplo, Banasik y col., ("Specific Inhibitors of PoIy(ADP-Ribose) Synthetase and Mono(ADP-Ribosyl)transferase", J. Biol. Chem. (1992) 267: 1559-1575) examinó la actividad inhibidora de la PARP de 132 compuestos, los más eficaces de los cuales eran 4-amino-1 ,8-naftalimida, 6(5H)-fenantridona, 2-nitro-6(5H)-fenentridona, y ,5-dihidroxiisoquinoIina. Griffin y col, describieron la actividad inhibidora de la PARP para una serie de compuestos de benzamida (patente de Estados Unidos n° 5,756,510; véase también "Novel Potent Inhibitors of the DNA Repair Enzyme poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)," Anti-Cancer Drug Design (1995), 10: 507-514) y los compuestos de quinazolinona (publicación internacional nD WO 98/33802). Suto y col., describieron la inhibición de la PARP por una serie de compuestos de dihidroisoquinolina ("Dyhidroisoquinolines: The Desing and Synthesis of a New Series of Potent Inhibitors of Poly (ADP-ribose) Polymerase, "Anti-Cancer Drug Design (191 ), 7:107- 17). Griffin y col., has descrito otros inhibidores de la PARP de la clase de quinozalina ("Resistance-Modifying Agents. 5. Synthesis and Biological Properties of Quinazoline Inhibitors of the DNA Repair Enzyme Poly (ADP-ribose) Polymerase (PARP)," J. Med. Chem., ASAP Artículo 10. 1021/jm980273t S0022-2623(98)00273-8; fecha de publicación en la Web: 1 de diciembre de 1998). No obstante, todavía existe una necesidad de compuestos hidrosolubles, de moléculas pequeñas que sean inhibidores potentes de la PARP, especialmente los que tienen las propiedades físicas y químicas deseables para aplicaciones farmacéuticas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a las sales de 8-fluoro-2-(4-met¡laminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidro-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona, que funcionan como inhibidores potentes de la poli(ADP-ribosil)transferasa (abreviadamente en inglés PARP), tienen solubilidades en agua apreciables y son útiles como agentes terapéuticos, especialmente en el tratamiento de cánceres y la mejora de los efectos de accidente cerebrovascular, traumatismo craneal, y enfermedad neurodegenerativa. Como agentes terapéuticos contra el cáncer, ios compuestos de la invención se pueden usar en combinación con agentes citotóxicos que dañan el ADN, por ejemplo, topotecan, irenotecan o temozolamida, y/o radiación. En particular la presente invención se refiere a la sal fosfato de 8-fluoro-2-(4-metilaminometiIfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona, que tiene la fórmula (i): La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas comprendiendo una cantidad eficaz inhibidora de la PARP de una sal fosfato de un compuesto de fórmula I junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo. La presente invención también refiere a un procedimiento de inhibición de la actividad de la enzima PARP in vivo, comprendiendo poner en contacto la enzima con una cantidad eficaz de una sal hidrosoluble, preferiblemente un fosfato, sal de un compuesto de fórmula (I). Estas sales hidrosolubles de la invención son inhibidores potentes de la PARP y tienen preferiblemente una actividad inhibidora de la PARP correspondiente a un valor de ¡ de 100 µ? o menos en el ensayo de inhibidores de la enzima PARP. Además la presente invención se refiere a un procedimiento de potenciación de la citotoxicidad de un fármaco citotóxico o radiación ionizante, comprendiendo poner en contacto las células con una cantad eficaz de una sal hidrosoluble preferiblemente una sal fosfato de un compuesto de fórmula (I), en combinación de un fármaco citotóxico o radiación ionizante. Las sales farmacéuticamente aceptables de la invención preferiblemente tienen una actividad de potenciación de citotoxicidad correspondiente a un valor de FP50 de al menos 1 en el ensayo de potenciación de citotoxicidad. La invención también proporciona intervenciones terapéuticas apropiadas en estados patológicos o de lesiones donde la actividad de la PARP es perjudicial para un paciente comprendiendo los procedimientos terapéuticos la inhibición de la actividad de la enzima PARP en el tejido relevante del paciente mediante la administración de una sal fosfato de fórmula (I). En dicho procedimiento de intervención terapéutico proporcionado por la presente invención, la eficacia de un fármaco citotóxico o radioterapia administrada a un mamífero en el curso de un tratamiento terapéutico se mejora mediante la administración al mamífero en necesidad de tratamiento de una cantidad eficaz inhibidora de la PARP de una sal fosfato de fórmula (I), junto con la administración del fármaco citotóxico o radioterapia. Otro procedimiento de intervención terapéutico proporcionado por la presente invención es para retrasar el comienzo del envejecimiento celular asociado al envejecimiento de la piel en un mamífero, comprendiendo la administración a los fibroblastos en el mamífero de una cantidad eficaz inhibidora de la PARP de una sal fosfato de fórmula (I). Todavía otro procedimiento de intervención proporcionado por la presente invención es un procedimiento para reducir la neurotoxicidad consecuencia de un accidente cerebrovascular, traumatismo craneal, y enfermedades neurodegenerativas en un mamífero mediante la administración al mamífero de una cantidad eficaz de una sal fosfato de fórmula (I). Los compuestos de la presente invención proporcionan un enfoque terapéutico para el tratamiento de afecciones inflamatorias, comprendiendo la administración de una cantidad eficaz de una sal fosfato de fórmula (I), a un mamífero en necesidad de tratamiento. Otro procedimiento de intervención terapéutico proporcionado por la presente invención es un procedimiento terapéutico cardiovascular para proteger contra isquemia miocárdica y lesiones por reperfusión en un mamífero, comprendiendo la administración al mamífero de una cantidad eficaz de una sal fosfato de fórmula (I).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Y MODALIDADES PREFERIDAS Agentes inhibidores de la PARP La síntesis de 8-fluoro-2-(4-met!laminometilfenil)-1 , 3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd)indol-6-ona, se describió en la Patente de Estados Unidos n° 6,495,541 incorporada en esta memoria descriptiva, los términos "comprendiendo " e "incluyendo" se usa en esta memoria descriptiva en su sentido amplio, no limitante. El término "halógeno" representa cloro, flúor, bromo o yodo. El término "halo" representa cloro, fluoro, bromo o yodo. En el caso de compuestos, sales, o solvatos que son sólidos, los expertos en la técnica entienden que los compuestos, sales, y solvatos de la invención pueden existir en diferentes formas cristalinas o polimórficas, todas las cuales se pretende que estén dentro del alcance de la presente invención y fórmulas especificadas. En algunos casos, los compuestos de la invención tendrán centros quirales. Cuando están presentes los centros quirales, los compuestos la invención pueden existir en forma de estereoisómeros individuales, racematos, y/o mezclas de enantiómeros y/o diastereómeros. Todos estos estereoisómeros individuales, racematos y mezclas de los mismos se pretende que estén dentro del alcance amplio de las fórmulas genéricas estructurales (salvo que se indique lo contrario). Sin embargo, preferiblemente, los compuestos de la invención se usan esencialmente en formas ópticamente puras (como entienden generalmente ios expertos en la técnica, un compuesto ópticamente puro es uno que es enantioméricamente puro). Preferiblemente, los compuestos de la invención son al menos 90% del isómero individual deseado (80% de exceso de exceso enantiomérico), más preferiblemente al menos 95% (90% de e. e.) incluso más preferiblemente al menos 97.5% (95% de e. e.), y lo más preferido al menos 99% (98% de e. e.). En algunos casos, los compuestos se pueden producir en formas tautoméricas. En tales casos, se pretende que ambos tautómeros estén comprendidos por las fórmulas estructurales.

Procedimientos y composiciones farmacéuticas La invención se refiere a un procedimiento de inhibición de la actividad de la enzima PARP, comprendiendo poner en contacto la enzima con una cantidad eficaz de una sal hidrosoluble de fórmula (I), por ejemplo una sal fosfato de fórmula (I), o un solvato de la sal hidrosoluble del mismo. Por ejemplo, la actividad de la PARP se puede inhibidor en el tejido del mamífero mediante la administración de una sal hidrosoluble de fórmula (I), por ejemplo, una sal fosfato, o solvato de dichas sales de la misma. "Tratando" o "tratamiento" pretende significar mitigando o aliviando una lesión o una afección patológica en un mamífero, tal como un ser humano (por ejemplo, un paciente), que se media mediante la inhibición de la actividad de la PARP, tal como mediante potenciación de terapias anticáncer o inhibición de la neurotoxicidad consecuencia de un accidente cerebrovascular, traumatismo craneal, y enfermedades neurodegenerativas. Los tipos de tratamiento incluyen: (a) como un uso profiláctico en un mamífero, particularmente cuando se encuentra que el mamífero está predispuesto a tener ia afección patológica pero todavía no se ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibición de la afección patológica; y/o (c) alivio, total o parcial, de la afección patológica. Un procedimiento de tratamiento implica la mejora de la eficacia de un fármaco citotóxico o radioterapia administrada a un mamífero en el curso de un tratamiento terapéutico, comprendiendo la administración al mamífero de una cantidad eficaz de una sal fosfato de fórmula 1 junto con la administración del fármaco citotóxico (por ejemplo, topotecan o irenotecan) o radioterapia. Las sales fosfatos inhibidoras de la PARP de fórmula 1 se pueden también usar ventajosamente en un procedimiento para reducir la neurotoxicidad consecuencia de un accidente cerebrovascular, traumatismo craneal, y enfermedades neurodegenerativas en un mamífero mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de sales fosfatos de fórmula 1 al mamífero. Las sales inhibidoras de la PARP de la invención también se pueden usar en un procedimiento para retrasar el comienzo del envejecimiento celular asociado al envejecimiento de la piel en un ser humano, comprendiendo la administración a los fibroblastos en el ser humano de una cantidad eficaz inhibidora de la PARP de las sales fosfatos de fórmula 1. Además, las sales fosfatos de fórmula 1 también se pueden usar en un procedimiento para ayudar a prevenir el desarrollo de diabetes mellitus insulinodependiente en un individuo susceptible, comprendiendo la administración a un mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de la sal. Adicionalmente, las sales fosfatos de fórmula 1 también se pueden emplear en un procedimiento para tratar una afección inflamatoria en un mamífero, comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la sal al mamífero. Además, los agentes también se pueden usar en un procedimiento para tratar una enfermedad cardiovascular en un mamífero, comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la PARP de una sal fosfato de fórmula 1. A medida que el conocimiento relativo a las funciones terapéuticas de los inhibidores de la PARP progresa en la técnica, se harán evidentes otras utilidades de las sales inhibidoras de la PARP de la invención. La actividad de los compuestos de la invención como inhibidores de la actividad de la PARP se puede medir mediante cualquiera de los procedimientos adecuados conocidos o disponibles en la técnica, incluyendo mediante ensayos in vivo e in vitro. Un ejemplo de un ensayo adecuado para las mediciones de actividad es el ensayo de inhibición de la enzima PARP descrita en la patente de Estados Unidos No. 6,495,541 incorporada en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad para todos los propósitos. La administración de las sales fosfatos o glucuronatos de fórmula 1 se puede realizar según cualquiera de las formas aceptadas de administración disponibles en la técnica. Los ejemplos ilustrativos de las formas adecuadas de administración incluyen administración oral, nasal, parenteral, tópica, transdérmica, intravenosa y rectal. Las vías de administración oral e intravenosa son vías de administración preferidas. Las sales fosfato de fórmula (I), o un solvato farmacéuticamente aceptable de las mismas se pueden administrar en forma de una composición farmacéutica en cualquier forma farmacéutica reconocible por los expertos en la técnica como adecuadas. Las formas farmacéuticamente adecuadas incluyen formulaciones sólidas, semisólidas, líquidas, o liofilizadas, tales como comprimidos, polvos, cápsulas, supositorios, suspensiones, liposomas, y aerosoles. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden también incluir excipientes, diluyentes, portadores y vehículos adecuados, así como otros agentes farmacéuticamente activos (incluyendo otros agentes inhibidores de la PARP), dependiendo del uso pretendido. Los procedimientos aceptables de preparación de formas farmacéuticamente adecuadas de las composiciones farmacéuticas se conocen o se pueden determinar de manera rutinaria por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las preparaciones farmacéuticas se pueden preparar siguiendo las técnicas convencionales del químico farmacéutico implicando las etapas tales como mezcla, granulación, y compresión cuando sea necesario en formas de comprimidos, o mezclando, llenando, y disolviendo los ingredientes según sea apropiado para proporcionar los productos deseados para administración oral, parenteral, tópica, intravaginal, intranasal, intrabronquial, intraocular, ¡ntraaural, y/o rectal.

Los vehículos, diluyentes, portadores, o excipientes sólidos o líquidos farmacéuticamente aceptables se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas. Los vehículos sólidos ilustrativos incluyen almidón, lactosa, sulfato de calcio dihidrato, térra alba, sacarosa, talco, gelatina, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, y ácido esteárico. Los vehículos líquidos ilustrativos incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, solución salina, y agua. El vehículo o diluyente puede incluir un material adecuado de liberación prolongada, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera. Cuando se usa un vehículo líquido la preparación puede estar en forma de un jarabe, elixir, emulsión, cápsula blanda de gelatina, líquido inyectable estéril, (por ejemplo, solución), o una suspensión líquida no acuosa o acuosa. Una dosis de la composición farmacéutica contiene al menos una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la PARP (es decir, una sal fosfato de fórmula (I), o un solvato de la misma), y preferiblemente contiene una o más unidades de dosificación farmacéutica. La dosis seleccionada se puede administrar a un mamífero, por ejemplo, un paciente humano, en necesidad de tratamiento de una afección mediada mediante inhibición de la actividad de la PARP, mediante cualquier procedimiento conocido o adecuado de administración de la dosis, incluyendo: tópicamente, por ejemplo, en forma de una pomada o crema; oralmente; rectalmente, por ejemplo, en forma de un supositorio; parenteralmente mediante inyección; o de manera continua mediante infusión intravaginal, intranasal, intrabronquial, intraaural, o infraocular. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" pretende significar la cantidad de un agente que, cuando se administra a un mamífero en necesidad del mismo, es suficiente para efectuar tratamiento de una lesión o afección patológica mediada mediante la inhibición de la actividad de la PARP, tal como para potenciación de terapias anti-cáncer e inhibición de neurotoxicidad consecuencia de un accidente cerebrovascular, traumatismo craneal, y enfermedades neurodegenerativas. La cantidad de un compuesto proporcionado de la invención que será terapéuticamente eficaz variará dependiendo de factores tales como el compuesto particular, la afección patológica y la gravedad de la misma, la identidad del mamífero en necesidad del mismo, dicha cantidad la pueden determinar de manera rutinaria los técnicos. Se apreciará que las dosificaciones actuales de los reales inhibidores de la PARP usados en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se seleccionarán según el complejo particular que se está usando, la composición particular formulada, la forma de administración y el sitio particular, y el hospedador y afección que se está tratando. Las dosificaciones óptimas para un conjunto dado de afecciones se pueden determinar por los expertos en la técnica usando ensayos de determinación de dosificación convencionales. Para la administración oral, por ejemplo, se puede emplear una dosis que está entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal, con cursos de tratamiento repetidos a intervalos apropiados.

Procedimiento de síntesis Además la presente invención se refiere a procedimientos de síntesis de los agentes inhibitorios de la PARP mediante procedimientos tales como los expuestos más adelante para los compuestos ejemplares de la invención. En los siguientes ejemplos, las estructuras de los compuestos se confirmaron mediante uno o más de los siguientes: espectroscopia por resonancia magnética de protones, espectroscopia infrarroja, microanálisis elemental, espectrometría de masas, cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alta resolución, y punto de fusión. Los microanálisis elementales se realizaron por Atlantic Microlab Inc. (Norcross, GA) o Laboratorios Galbraith (Nashville, TN), y proporcionó los resultados de los elementos establecidos dentro de ± 0.4% de los valores teóricos. La cromatografía en columna ultrarrápida se realizó usando gel de sílice 60 (Merck art 9385). La cromatografía en capa fina analítica (abreviadamente en inglés TLC) se realizó usando láminas prerrevestidas de Sílice 60 F254 (Merck Art 5719). Los puntos de fusión (abreviadamente p.f.) se determinaron en un aparato MelTemp y están sin corregir. Todas las reacciones se realizaron en matraces tapados herméticamente con septum en una presión ligeramente positiva de argón, salvo que se indique lo contrario. Todos los disolventes comercialmente eran de calidad reactivo o mejor y se usaron como se suministraban. En esta memoria descriptiva se pueden usar las siguientes abreviaturas: Et20, (éter dietílico); DMF (?,?-dimetilformamida); DMSO (dimetilsulfóxido); MeOH (Metanol); EtOH (Etanol); EtOAc (acetato de etilo); THF (tetrahidrofurano); Ac (acetilo); Me (metilo); Et (etilo); y Ph (fenilo). Los protocolos de las reacciones generales descritos más adelante se pueden usar para preparar los compuestos de la invención y ensayar la solubilidad en agua de las sales. Solubilidades en agua de formas de sales diferentes Ensayo de solubilidad en agua Pesar aproximadamente 1.0 mg de 8-fluoro-2-(4-metiiam¡nometilfenii)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona (base libre) en un vial de centelleo, y después añadir 2.0 mi de agua Milli Q. La suspensión de la muestra se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La suspensión se transfirió a un vial eppendorf y se centrífugo a 14000 rpm durante 8 minutos. Después la solución sobrenadante se ensayó mediante HPLC. Pesar aproximadamente 5.0 mg de fosfato de 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona o cualquier otra sal de fórmula 1 en un vial de centellero, y después añadir 1.0 mi de agua Milli Q. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y después se centrifugó a 14000/min durante 8 minutos. El sobrenadante se diluyó 10 veces mediante agua Milli Q. Después la solución final se ensayó mediante HPLC.

Preparación patrón: Pesar exactamente 2.5 - 3.0 mg del patrón de referencia AG014447 en un matraz volumétrico de 10 mi, y después llevar hasta volumen con MeOH. Mezclar completamente.

Condiciones de HPLC Tampón: tampón fosfato amónico 25 Mm (pH 2.5) Modificador orgánico: Acetonitrilo (abreviadamente ACN) Longitud de onda: 210 nm Columna: Waters Symmetry C18, 4.6 x 150 mm, dµ?t?; Caudal: LO mL/minuto Volumen de inyección: 5 µL· Tiempo de realización: 24 minutos Temperatura de columna: ambiente Gradiente: Tiempo % de tampón ACN (%) 0 90 10 15 60 40 20 60 40 20.1 90 10 24 90 10 Cálculos La solubilidad de la muestra se calculó mediante la ecuación siguiente: S = A/As x Cs x D en la que A es el área del pico de la muestra; As es el área del pico del patrón; Cs es la concentración de la solución patrón; D es el factor de dilución.

ESQUEMA 1 DE SINTESIS GENERAL H H En el esquema 1 , la amina 1 se trata con diversos ácidos en metanol. La sal resultante se liofilizó y se purificó posteriormente mediante recristalización, si fuera necesario.

EJEMPLOS EJEMPLO A Mesiíato de 8-fluoro-2-(4-metHaminomet¡lfenil)-1 ,3,4,5- tetrahidroazepinof5,4,3-cdlindol-6-ona 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrah¡droazep¡no[5,4,3-cd]indol-6-ona (259 mg, 0.801 mmoles) se disolvió parcialmente en metanol (5 mi) y después se trató con ácido metanosulfónico (solución metanólica 1.0 M, 0.801 mL). Se disolvió completamente la amina calentando suavemente la solución y usando una cantidad adicional de metanol ( 0 mL). La solución se filtró a través de algodón para separar todas las partículas. La solución se concentró parcialmente a vacío. Se añadió 1 mL de agua desionízada y se evaporó completamente el metanol a vacío. El producto se liofilizó para proporcionar 326 mg (97%) en forma de un sólido amarillo claro. Anal. (C20H22FN3CM -2H20) C, H, N.

EJEMPLO B Clorhidrato de 8-fluoro-2-(4-metilaminometílfenil)-1.3,4,5- tetrahidroazepinof5,4,3-cdlindol-6-ona H De una manera similar a la descrita para el ejemplo A, 8-fluoro-2- (4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona (30 mg, 0.093 mmoles) y HCI (solución acuosa 0.10 M, 0.90 mL) se usaron para producir clorhidrato de 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]¡ndol-6-ona, 33 mg (99%) en forma de un sólido amarillo claro. Anal. (Ci9H19FN3OCI · 0.3H2O) C, H, N.

EJEMPLO C Acetato de 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5- tetrahidroazepinof5,4,3-cd1indol-6-ona H De una manera similar a la descrita para el Ejemplo A, 8-fluoro- 2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indo!-6-ona (30.8 mg, 0.0952 mmoles) y ácido acético (solución metanólica 1.0 M, 0.952 mL) se usaron para producir acetato de 8-fluoro-2-(4-metilaminomet¡Ifenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona, 36.1 mg (99%) en forma de un sólido amarillo claro. Anal. (C21H22FN3O3 · 1.5H20) C, H, N.

EJEMPLO D Gluconato de 8-fluoro-2-f4-met¡laminometilfenil)-1, 3,4,5 tetrahidroazepinor5,4,3-cd1¡ndol-6-ona De una manera similar a la descrita para el Ejemplo A, 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazep¡no[5,4,3-cd]indol-6-ona (30.2 mg, 0.0934 mmoles) y ácido glucónico (solución acuosa 2.55 M, 0.0366 mL) se usaron para producir gluconato de 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona, 47.5 mg (98%) en forma de un sólido amarillo claro. Ana). (C25H3oFN3Og · 1.9H20) C, H, N.

EJEMPLO E Tartrato de 8-fluoro-2-(4-metHaminomet¡lfenil)-1 ,3,4,5- tetrahidroazepinor5,4,3-ccnindol-6-ona De una manera similar a la descrita para el Ejemplo A, 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-teíra idroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona (30.0 mg, 0.0928 mmoles) y ácido L-tartárico (solución metanólica 1.0 M, 0.0928 mL) se usaron para producir tartrato de 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona, 42.7 mg (97%) en forma de un sólido amarillo claro. Anal. (C23H24FN3O7 · L8H2O) C, H, N.

EJEMPLO F Glucuronato de 8-fluoro-2-(4-metilaminornetilfenil)-1 ,3,4,5- tetrahidroazep¡nor5,4,3-cd1indol-6-ona De una manera similar a la descrita para el Ejemplo A, 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5)4,3-cd]indol-6-ona (30.0 mg, 0.0928 mmoles) y ácido glucurónico (solución acuosa 0.5 M, 0.186 mL) se usaron para producir glucuronato de 8-fiuoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona, 47.9 mg (100%) en forma de un sólido amarillo claro. Anal. (C25H28 N308 - 1.9H20) C, H, N.

EJEMPLO G Fosfato de 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 , 3,4,5- tetrahidroazepinor5,4,3-cd1indol-6-ona De una manera similar a la descrita para el ejemplo A, 8-fluoro-2- (4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona (42.0 mg, 0.130 mmoles) y ácido fosfórico (solución acuosa 0.5 M, 0.260 mi) se usaron para producir fosfato de 8-fIuoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazep¡no[5,4,3-cd]indol-6-ona después de liofilización y recristalización en 0.5: 6.5: 3 de H2O: metanol: CH2CI2 para proporcionar 32.2 mg (58%) en forma de un sólido amarillo claro. Anal. (C19H2iFN305P-1.9H20) C, H, N.

Ensayo de inhibición de la enzima PARP Las actividades inhibidoras de la enzima PARP de los compuestos de la invención se ensayaron como lo han descrito Simonin y col., (J. Biol. Chem. (1993), 268: 8529 - 8535) y Marsischky y col. (J. Biol. Chem. (1995), 270: 3247 - 3254) con pequeñas modificaciones como sigue. Las muestras de (50 µ?) conteniendo proteína de PARP purificada 20 nM, 10 µ?/ml de ADN de timo de ternera activada por ADNasa l-(sigma), NAD+ 500 µ?, [32P]NAD+ 0.5 µ??, DMSO al 2%, y diversas concentraciones de los compuestos de ensayo se incubaron en un tampón de muestra (Tris 50 mM pH 8.0, MgCI2 10 mM, tris(carboxietil)fosfina HCI 1 mM) a 25°C durante 5 minutos. En estas condiciones, la velocidad de reacción era lineal durante tiempos de hasta 10 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición a las muestras de un volumen igual de ácido tricloroacético al 40% enfriado con hielo, que después se incubaron en hielo durante 15 minutos. Después las muestras se transfirieron a un aparato de microfiltración Bio-Dot (BioRad), se filtraron a través de papel de filtro de fibra de vidrio Whatman GF/C, se lavaron 3 veces con 150 µ\- de tampón de lavado (ácido tricloroacético al 5%, pirofosfato inorgánico al 1%), y se secaron. La incorporación de [32P]ADP-Ribosa en el material ¡nsoluble en ácido se cuantificó usando un dispositivo Phosphorlmager (Molecular Dynamics) y software ImageQuant. Las constantes de inhibición (K¡) se calcularon mediante análisis de regresión no lineal usando la ecuación de velocidad para inhibición competitiva (Segel, Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis oí Rapid Equilibríum and Steady-State Enzyme Systems, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York (1975), 100 -125). En el caso de inhibidores de unión estrecha, se usó enzima 5 nM y la reacción se incubó a 25°C durante 25 minutos. Los valores de K¡ para los inhibidores de unión estrecha se calcularon usando la ecuación descrita por Sculley y col., (Biochim. Biophys. Acta ( 986), 874:44 - 53).

Ensayo de potenciación de citotoxicidad: Las células A549 (ATCC, Rockville, MD) se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocilios (marca Falcon, Fisher Scientific, Pittsburg, PA) 16 a 24 horas antes de la manipulación experimental. Después de las células se trataron con un compuesto de ensayo (o una combinación de los compuestos de ensayo si estaban indicados) durante bien 3 días o 5 días, a una concentración de 0.4 µ?t?. Al final de los tratamientos, el número de células relativo se determinó bien mediante un ensayo de MTT o un ensayo de SRB. Para el ensayo de MTT, 0.2 µ?/µ? de MTT bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, Sigma Chemical Co., San Luis, MO) se añadió a cada pocilio de una placa, y la placa se incubó en un incubador de cultivo celular durante 4 horas. Se solubilizó ei MTT metabolizado en cada pocilio en 150 µ? de DMSO (Sigma Chemical Co.) con agitación y se cuantificó con un lector de placas Wailac 1420 Victor (EG&G Wailac, Gaithersburg, MD) a 540 nm. Para el ensayo de SRB, las células se fijaron con ácido tricloroacético al 10% (Sigma Chemical Co.) durante una hora a 4°C. Después de un lavado prolongado, las células fijadas se tiñeron durante 30 minutos con sulforrodamina B al 0.4% (SRB, Sigma Chemical Co.) en ácido acético al 1 % (Sigma Chemical Co.). La SRB no unida se retiró por lavado con ácido acético al 1 %. Después los cultivos se secaron al aire, y el tinte unido se solubilizó con Tris base no tamponado 10 mM (Sigma Chemical Co) con agitación. El tinte unido se midió fotométricamente con el lector de placas Wailac Victor a 5 5 nm. La relación del valor de la DO (densidad óptica) de un cultivo tratado con el compuesto al valor de la DO de un cultivo pseudo-tratado, expresado en porcentaje, se usó para cuantificar la citotoxicidad de un compuesto. La concentración a la que un compuesto produce 50% de citotoxicidad se denomina CI50. Para cuantificar la potenciación de la toxicidad de topotecan o temozolamida mediante los compuestos de ensayo, se usa un parámetro adimensional FP50 y se define como la relación del valor de la Cl50 de topotecan o temozolamida solos al valor de CI50 de topotecan o temozolamida en combinación con un compuesto de ensayo. Para los compuestos de la invención, los valores de FP50 se determinaron mediante ensayo con topotecan. Las constantes de inhibición (valores K¡) y los parámetros de potenciación de citotoxicidad (valores FP50) determinados para los compuestos ejemplares de la invención se presentan en el cuadro 1 más adelante. Si existen dos valores de K¡ para un solo compuesto, significa que la K¡ del compuesto se ensayó dos veces.

CUADRO 1 Inhibición de la enzima PARP v potenciación de la toxicidad Aunque la invención se ha descrito mediante la referencia a modalidades preferidas y ejemplos específicos, los expertos en la técnica reconocerán que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones sin salirse del espíritu y alcance de la invención. Así, se sobreentiende que la invención no está limitada por la descripción detallada anteriormente, sino como se define por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes. Todas las patentes de Estados Unidos, patentes extranjeras, solicitudes de patentes publicadas, y otras referencias citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en este documento como referencia en su totalidad.

Claims (8)

NOVEDAD PE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una sal fosfato de 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 , 3,4,5-tetrah¡droazep¡no[5,4,3-cd]indol-6-ona.

2. - Una composición farmacéutica del compuesto de la reivindicación 1 , adecuada para administración oral que comprende una dosis farmacéuticamente eficaz del compuesto de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

3. - Una composición farmacéutica del compuesto de la reivindicación 1 , adecuada para administración inyectable que comprende una dosis farmacéuticamente eficaz del compuesto de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

4.- Una combinación para quimioterapia de una dosis farmacéuticamente eficaz de fosfato de 8-fluoro-2-(4-metilaminometilfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidroazepino[5,4,3-cd]indol-6-ona y un agente quimioterapéutico seleccionado de irenotecan, temozolamida y dacarbazina.

5.- La combinación para quimioterapia de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el agente quimioterapéutico es irenotecan.

6. - La combinación para quimioterapia de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el agente quimioterapéutico es temozolamida.

7. - La combinación para quimioterapia de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el agente quimioterapéutico es dacarbazina.

8. - El uso del compuesto de la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para mejorar la eficacia de un fármaco citotóxico o radioterapia en un mamífero. 9 - El uso del compuesto definido en la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para proteger contra una lesión consecuencia de una isquemia de miocardio o reperfusión en un mamífero. 10. - El uso del compuesto definido en la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para reducir la neurotoxicidad consecuencia de un accidente cerebrovascular, un traumatismo craneal, o una enfermedad neurodegenerativa en un mamífero. 11. - El uso del compuesto definido en la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para retrasar el comienzo de envejecimiento celular asociado al envejecimiento de la piel en un mamífero. 12.- El uso del compuesto definido en la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para prevenir el comienzo de diabetes insulinodependiente en un mamífero.