MXPA05000972A - Celulas madres hematopoyeticas y metodo de tratamiento de enfermedades oculares neovasculares con las mismas. - Google Patents

Abstract

Poblaciones de celulas madres hematopoyeticas de linea celular negativa, derivadas de medula osea, de mamiferos, aislada, (HSC Lin-) contienen celulas progenitoras endoteliales (EPC) capaces de formar vasos sanguineos retinianos. Al menos aproximadamente 50 % de las celulas en la poblacion de HSC Lin- aislada incluye marcadores de superficie celular por CD31 y c-kit. Hasta aproximadamente 8 % de las celulas pueden incluir el marcador celular Sca 1, y hasta aproximadamente 4 % de las celulas pueden incluir el marcador Flk-1/KDR. Las poblaciones de HSC Lin- aisladas de la presente invencion son utiles para el tratamiento de enfermedades vasculares oculares. Se proporcionan tambien las poblaciones de HSC Lin- aisladas que han sido transfectadas con genes utiles terapeuticamente, las cuales son utiles para liberar genes al ojo para de terapia genetica basada en celulas.

Description

CELULAS MADRES HEMATOPOYE ICAS Y METODO DE TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES OCULARES NEOVASCULARES CON LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención concierne a células madres hematopoyéticas linea celular negativa, de mamíferos, aisladas (HSC Lin~) derivadas de médula espinal. La invención también concierne al tratamiento de enfermedades vasculares del ojo administrando HSC Lin" y HSC Lin" transfectada en la retina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Degeneración Macular Relacionada con la Edad (ARMD) y Retinopatía Diabética (DR), son las causas que provocan la pérdida visual en naciones industrializadas y es un resultado de la neovascularización retiniana anormal. Puesto que la retina consiste de capas bien definidas de elementos neuronales, gliales y vasculares, trastornos relativamente pequeños tales como los vistos en proliferación vascular o edema puede conducir a pérdida significativa de la función visual. Degeneraciones Retinianas heredadas, tales como Retinitis Pigmentosa (RP) , están también asociadas con anormalidades vasculares, tales como estrechez arteriolar y atrofia vascular. Aunque se ha progresado al identificar los factores que promueven que promueven e inhiben la angiogénesis, no hay ningún tratamiento disponible para tratar específicamente enfermedades vasculares oculares. Por muchos años, de ha sabido que una población de células madres existe en la médula ósea y en la circulación de un adulto normal. Sub-poblaciones diferentes de estas células pueden diferenciar consigo líneas celulares positivas hematopoyéticas (Lin~) o no hematopoyéticas, lineas celulares negativas (Lin") . Además, poblaciones celulares madres hematopoyéticas de líneas celulares negativas (HSC) han mostrado recientemente contener células endoteliales progenitores (EPC) capaces de formar vasos sanguíneos in vi tro e in vivo. Asahara y colaboradores Science, 275, 964-7 (1997) . Estas células pueden participar en angiogénesis postnatal patológica y normal (Ver Lyden y colaboradores Nat . Med. 7, 1194-201 (2001); alka y colaboradores Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 97, 430- 6 (2001)) así como también diferencian en una variedad de tipos celulares no endoteliales incluyendo hepatocitos (ver Lagasse y colaboradores Nat. Med. 6, 1229-34 (2000)), microglia (Ver Priller y colaboradores Nat. Med. 7, 1356-61 (2002)), cardiomiocitos (ver Orlic y colaboradores Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10344-9 (2001)) y epitelio (Ver Lyden y colaboradores Nat . Med. 7, 1194-201 (2001)). Aunque estas células han sido usadas en varios modelos experimentales de angiogénesis, el mecanismo de EPC que se lleva a cabo para neovasculatura no es conocido y no se ha identificado ninguna estrategia que incremente efectivamente el número de células que contribuyen a una vasculatura particular.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención proporciona poblaciones de células madres hematopoyéticas de linea celular positiva (Lin~ HSC) derivadas de médula ósea, las cuales contienen células endoteliales progenitores (EPC; también conocidas como células endoteliales precursoras) que localizan selectivamente a astrocitos retiñíanos activados. Al menos aproximadamente 50 % de las células de las poblaciones de HSC Lin" aisladas de la presente invención tienen marcadores celulares para CD31 y el c-kit. Las EPC's en las poblaciones de HSC de línea celular negativa de la presente invención se incorporan extensivamente en el desarrollo de vasos sanguíneos retinianas y permanecen incorporadas establemente en la neovasculatura del ojo. Las poblaciones de HSC de líneas celulares negativas, aisladas de la presente invención pueden ser usadas para rescatar y estabilizar la vasculatura retiniana degenerante en mamíferos. En una modalidad de poblaciones de HSC Lin" aisladas de la presente invención, las células son transfectadas con un gen útil terapéuticamente. Las células transfectadas pueden seleccionar como objetivo la neovasculatura e inhibir la formación de nuevos vasos sanguíneos sin afectar vasos ya establecidos a través de una forma de terapia genética basada en células. Células de la población de HSC de línea celular negativa, aislada de la presente invención que ha sido transfectada con un gen que codifica a péptidos que inhiben la angiogénesis son útiles para modular el crecimiento de vasos sanguíneos anormales en enfermedades tales como ARMD, DR y ciertas degeneraciones retinianas asociadas con vasculatura anormal . Una ventaja particular de tratamientos oculares con la población de HSC Lin~ aislada de la presente invención es un efecto de recuperación neurotrófico y vasculotrófico observado en ojos tratados intravitrealmente con la HSC Lin". Se conservaron neuronas retinianas y fotoreceptores y se mantuvo la función visual en ojos tratados con la HSC Lin" aislada de la invención. La presente invención también proporciona un método de aislar poblaciones de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa que contienen células progenitoras endoteliales de médula ósea, preferiblemente de médula ósea adulta.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 (a y b) presenta diagramas esquemáticos del desarrollo de retina de ratón, (a) Desarrollo de plexo primario. (b) La segunda fase de la formación de vasos sanguíneos retiñíanos. GLC, capa celular ganglionar; IPL, capa del plexo interior; INL, capa nuclear interna; OPL, capa del plexo exterior; ONL, capa nuclear exterior; RPE, epitelio del pigmento retiniano; ON, nervio óptico; P, periferia. La Figura c expone la caracterización citométrica de flujo de HSC Lin+ y células separadas de HSC Lin" derivadas de médula ósea. Fila superior: Distribución gráfica punteada de células marcadas sin anticuerpo, en las cuales Rl define el área de entrada cuantificable de tinción- PE positiva; R2 indica GFP positiva; Fila media: HSC Lin" (C57B/6) y Línea inferior: células HSC Lin+ ¡C57B/6), cada línea celular marcada con anticuerpos conjugados con PE para Sca-1, c-kit, Flk-l/KDR, CD31. Los datos de Tie-2 se obtuvieron de ratones Tie-2-GFP . Los porcentajes indican el por ciento de células marcadas positivas afuera de la población de HSC Lin" o HSC Lin+. La Figura 2, expone injertos de células HSC Lin" en retina de ratón desarrollada. (a) a cuatro días postinyección (P6), células HSC Lin" eGFP inyectados intravitrealmente se fijaron y diferenciaron en la retina (b) HSC Lin" (ratones B6.129S7-Gtrosa26( teñidos con anticuerpo ß-gal) establecidas por sí mismas delante de la vascul atura teñida con anticuerpo IV de colágeno (el asterisco indica la cresta de la vasculatura) , (c) la mayoría de las células HSB Lin" (eGFP+) a cuatro días postinyección (P6) fueron incapaces de diferenciarse, (d) EC de roedor eGFP1 mesentérica, cuatro días post-inyección (P6) , (e) HSCs Lin" (eGFP ) inyectadas en ojos de ratones adultos, (f) baja amplificación de HSCs Lin" eGFP1 (flechas) en reposo en y que se diferencian en dirección del molde astrocítico pre-existente en el ratón trans-génico GFAP-GFP, (g) mayor amplificación de la asociación entre células Lin" (eGFP) y astrocitos dependientes (flechas) , (h) control transgéncio GFAP-GFP no inyectados, (i) cuatro días post- inyección (P6) , células HSC Lin" eGFP+ migran al y experimentan diferenciación en el área del futuro plexo profundo. La figura de la izquierda captura la actividad de células HSC Lin" en un montaje completo de retina; la figura de la derecha indica la localización de las células Lin" (flechas) en la retina (la parte superior es el vitreo lateral, la parte inferior es la esclerótica lateral), (j) doble mareaje con anticuerpos a-CD31-PE y a-GFP-alexa 488. Siete días después de inyección, las HSCs Lin" (eGFP) inyectadas, rojo), se incorporaron en la vasculatura (CD31).Las flechas delanteras indican las áreas incorporadas, (k) células HSC Lin" eGFP1 forman vasos catorce días post" inyección (P17), (1 y m) inyección intra-cardíaca de rodamina dextrano indica que los vasos están intactos y funcionales tanto en el plexo primario (I) como en el profundo (m) . La Figura 3 (a y b) muestra que células dirigidas a la gliosis (indicada por astrocitos que expresan a GFAP, imagen del lado izquierdo) inducida tanto por láser (a) como mecánicamente (b) indujeron daños en la retina adulta (el asterisco indica el sitio del daño) . Las imágenes del lado derecho son una mayor amplificación, que demuestra la estrecha asociación de las HSCs Lin" y astrocitos. Barra de calibración = 20 uM. La Figura 4, muestra que las células HSC Lin" recuperan la vasculatura del ratón con degeneración retiniana. (a-d) Retinas a 27 días post-inyección (P33) con tinción IV de colágeno; (a) y (b) , retinas inyectadas con células HSC Lin+ (Balb/c) no mostraron diferencia en la vasculatura de ratones FVB normales; (c) y (d) retinas inyectadas con HSCs Lin" (Balb/c) exhibieron una retícula vascular rica análoga a la de un ratón de tipo salvaje; (a) y ¡c), secciones congeladas de retina entera (la parte superior es el vitreo lateral, la inferior es la esclerótica lateral) con tinción de DAPI; (b) y (d) , plexo profundo de la cantidad retiniana entera; (e) gráfica de barras que ilustra el incremento en la vascularidad del plexo vascular profundo formado en las retinas inyectadas con células HSC Lin- (n = 6) . Se cuantificó la medida de la vascularización retiniana profunda calculando la longitud total de los vasos en cada imagen. Se compararon las longitudes totales promedio de vasos/ campo de alta energía (en micrones) para retinas con HSC Lin", HSC Lin+ o control, (f) comparación de la longitud del plexo vascular profundo después de inyección con células HSC Lin" (R, ojo derecho) o HSC Lin* (L, ojo izquierdo) de ratones rd/rd. Se muestran los resultados de seis ratones independientes (cada color representa a cada ratón), (g) y (h) células HSC Lin" (Balb/c) también rescataron la vasculatura de rd/rd cuando se inyectaron en ojos en P15. Se muestran los plexos vasculares profundo e intermedio de retinas inyectadas con células HSC Lin" (g) o HSC Lin* (h) (un mes después de inyección) . La Figura 5, expone fotomicrográficas de tejidos retiñíanos de ratón: (a) capa profunda de la cantidad retiniana completa (ratón rd/rd), cinco días post-inyección (Pll) con HSCs Lin" eGFP* (verde), (b) y (c) vasculatura retiniana P60 de ratones Tie-2-GFP (rd/rd) que recibieron inyección de células Lin" de Balb/c (A) o células HSC Lin- (B) a P6. La vasculatura fue teñida con anticuerpo de CD31 (rojo) y solamente las células endoteliales endógenas presentaron color verde. Las flechas indican los vasos teñidos con CD 31 pero no con GFP. (d) tinción con a-SMA de retinas control e inyectadas con HSC Lin". La Figura 6, muestra que HSC Lin' transfectada en T2-TrpRS inhibe el desarrollo de vasculatura retiniana de ratón, ¡a) Representación esquemática de TrpSS, T2-TrpRS y T2-TrpRS con una secuencia de señal Igk en el terminus amino. (b) retinas inyectadas con células Lin' transíectadas en T2-TrpRS expresan a la proteína de T2-TrpRS in vivo. 1, T2-TrpRS recombinante producido en E. coli; 2, T2-TrpRS recombinante producido en E. coli; 3, T2-TrpR3 recombinante producido en E. coli; 4, retina control; 5, retina inyectada con HSC Lin" + pSecTag2A (vector solamente) ; 6, retina injertada con HSC Lin" + pKLel35 ( Igk-T2-TrpRS en pSecTag) . (a), TrpRS endógeno; (b) T2-TrpRS recombinante; (c) , T2-TrpRS de retina inyectada con HSC Lin") . (c-f) plexos primario (superficial) y secundario (profundo) representativos de retinas inyectadas, siete días post- inyección; (c) y (d) , ojos inyectados con HSC Lin" transíectadas en plásmido vacío desarrolladas normalmente; (e) y (f), la mayoría de los ojos inyectados con HSC Lin~ transfectadas en T2-TrpRS inhibieron la inhibición del plexo profundo; (c) y (e) , plexo primario (superficial); (d) y (f), plexo secundario (profundo) . Débil indicio de vasos observados en F son imágenes de "sangrado- a través de" vasos de la retícula primaria mostrada en (e) . La Figura 7, muestra la secuencia de DNA que codifica a T2-TrpRS marcado con Hise, SEC ID NO: 1, La Figura 8, muestra la secuencia de aminoácidos de T2-TrpRS marcado con Hisc, SEC ID NO: 2, La Figura 9, ilustra fotomicrográficas y electroretinogramas (ERG) de retinas de ratones cuyos ojos fueron inyectados con la HSC Lin" de la presente invención y con HSC Lin (controles) . La Figura 10, expone gráficas estadísticas que muestran una correlación entre la recuperación neuronal (eje y) y la recuperación vascular (eje x) tanto para la capa vascular intermediario (Int.) como para la profunda de ojos de ratón rd/rd tratados con HSC Lin". La Figura 11, expone gráficas estadísticas que no muestran ninguna correlación entre la recuperación neuronal (eje y) y la recuperación vascular (eje x) para ojos de ratón rd/rd que fueron tratados con HSC Lin+. La Figura 12, es una gráfica de barras de la extensión vascular (eje y) en unidades relativas arbitrarias para ojos de ratón rd/rd tratados con la HSC Lin" (barras obscuras) y ojos de ratón rd/rd sin tratar (barras claras) en lo tiempos puntuales de 1 mes (1M), 2 meses Í2M) , y 6 meses (6M) post- inyección. La Figura 13, incluye tres gráficas de barras del número de núcleo en la capa neural externa (ONR) de ratones rd/rd a 1 mes (1M), 2 meses (2M) y 6 meses (6M), post- inyección, y demuestra un incremento significativo en el número de núcleo para ojos tratados con HSC Lin" (barras obscuras) en relación con ojos control tratados con HSC Lin+ (barras claras) . La Figura 14, muestra gráficas del número de núcleos en la capa neural externa para ratones rd/rd individuales, comparando el ojo derecho (R, tratado con HSC Lin") en relación al ojo izquierdo (L, ojo control tratado con HSC Lin*) en los tiempos puntuales (post-inyección) de 1 mes (1M), 2 meses (2M) , y 6 meses (6M); cada linea en una gráfica dada compara los ojos de un ratón individual.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención proporciona una población de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa derivada de médula ósea, aislada que contiene células endoteliales progenitoras . Las poblaciones de HSC Lin" aisladas de la presente invención preferiblemente comprenden HSC en las cuales al menos aproximadamente 50 % de las células contienen antigenos marcadores celulares de c-kit y CD31. En una modalidad preferida, al menos aproximadamente 75 % de las células HSC incluyen el marcador de CD31, más preferiblemente aproximadamente 81 % de las células. En otra modalidad preferida, al menos aproximadamente 65 % de las células incluyen los marcadores celulares de kit-c, más preferiblemente aproximadamente 70 % de las células. En una modalidad particularmente preferida de las poblaciones HSC Lin~ aisladas de la presente invención, aproximadamente 50 ¾ a aproximadamente 85 % de las células incluyen el marcador de CD31, aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 % de las células incluyen el marcador de c-kit, aproximadamente 4 % a aproximadamente 8 % de las células incluyen el marcador de Sca-1, y aproximadamente 2 % a aproximadamente 4 % de las células incluyen el marcador de Flk-l/KDR. Las poblaciones de HSC Lin" aisladas de la presente invención puede comprender también hasta aproximadamente 1 % de células que tienen el marcador antigénico Tie-2. En modalidades preferidas, las poblaciones de HSC Lin" aisladas de la presente invención se derivan de médula ósea de ratón o humana, preferiblemente de médula ósea humana. Las poblaciones de HSC Lin" aisladas de la presente invención localizan selectivamente y se incorporan en la neovasculatura retiniana cuando se inyectan intravitrealmente en el ojo de las especies de mamíferos de las cuales se aislaron las células. Las poblaciones de HSC Lin" aisladas de la presente invención contienen células EPC que se diferencian en células endoteliales y generan estructuras vasculares en la retina. En particular las composiciones de HSC Lin" de la presente invención son útiles para el tratamiento de enfermedades retinianas neovasculares y retinianas vasculares degenerativas, y para la reparación del daño vascular retiniana. La presente invención también proporciona un método de tratar enfermedades oculares en un paciente, que comprenden aislar de la médula ósea del paciente una célula madre hematopoyética de línea celular negativa que incluye células endoteliales progenitoras, e inyectar intravitrealmente las células madres aisladas en un ojo del paciente en un número suficiente para detener la enfermedad. El método de la presente invención puede ser utilizado para tratar enfermedades oculares tales como enfermedades degenerativas retinianas, enfermedades degenerativas vasculares retinianas, retinopatías isquémicas, hemorragias vasculares, fugas vasculares, y cloroidopatias . Ejemplos de dichas enfermedades incluyen degeneración macular relacionada con la edad (ARMD) , retinopatia diabética (DR), histoplasmosis ocular supuesta (POHS), retinopatia de prematuridad (ROP) , anemia por células falciformes, y retinitis pigmentosa, asi como también daños retiñíanos. El número de células madres inyectada en el ojo es suficiente para detener el estado de enfermedad del ojo del paciente. Por ejemplo, el número de células puede ser efectivo para reparar el daño retiniano del ojo del paciente, estabilizar la neovasculatura retiniana, madurar la neovasculatura retiniana, y prevenir o reparar fugas vasculares y hemorragias vasculares. Las células presentes en las poblaciones de HSC Lin~ aisladas de la presente invención pueden ser transfectadas con genes útiles terapéuticamente, tales como genes que codifican a proteínas angiogénicas para uso en terapia genética basada en células, ocular. Las células transfectadas pueden incluir cualquier gen que sea terapéuticamente útil para el tratamiento de trastornos retiñíanos. Preferiblemente, las células transfectadas en las poblaciones de HSC Lin~ de la presente invención incluye un gen que codifica a un péptido, proteína, o fragmento de proteína antiangiogénico tal como TrpRS o fragmentos angiogénicos de los mismos, tales como los fragmentos TI y T2 de éstos, los cuales se describen con detalle en la solicitud de Patente U.S.A. No. de Serie. 10/080,839, de co-propietario provisional, cuya descripción se incorpora a la presente como referencia . La presente invención también proporciona un método de aislar una población de células madres hematopoyéticas de linea celular negativa que contiene células endoteliales progenitoras de médula ósea. El método relaciona las etapas de (a) extraer médula ósea de un mamífero; (b) separar una pluralidad de monocitos de la médula ósea; (c) marcar los monocitos con anticuerpos del panel de línea celular conjugada con biotina para CD45, CD3, Ly-6G, , CD11 y TER-119; y (d) remoción de monocitos que son positivos para CD45, CD3 , Ly-6G, CDll y TER-119 de la pluralidad de monocitos para proporcionar una población de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa que contenga células endoteliales progenitoras. La presente invención también proporciona métodos para tratar enfermedades angiogénicas oculares administrando composiciones de HSC Lin" transíectadas de la presente invención por inyección intravitreal de las células en el ojo. Dichas composiciones de HSC Lin" transfectadas comprende HSC Lin" transfectada con un gen útil terapéuticamente, tal como un gen que codifica al producto genético anti-angiograma . Preferiblemente, al menos aproximadamente 1 x 105 células HSC Lin~ o células HSc Lin transíectadas son administradas por inyección intravitreal en un ojo que sufre de una enfermedad retiniana degenerativa. El número de células a ser inyectadas puede depender de la severidad de la degeneración retiniana, la edad del paciente y otros factores que serán fácilmente obvios para un experto en el arte de tratar enfermedades retinianas. La HSC Lin~ puede ser administrada en una sola dosis o por medio de administración de dosis múltiples durante un periodo de tiempo, como lo determine el médico a cargo del tratamiento . Las poblaciones de HSC Lin~ de la presente invención son útiles para el tratamiento de daños retiñíanos y defectos retiñíanos que involucran una interrupción e o degradación de la vasculatura retiniana. Las poblaciones de HSC Lin~ transíectadas de la presente invención son útiles para la liberación de genes terapéuticos a la retina, particularmente a la vasculatura retiniana. En una modalidad preferida del método de liberación del gen de la presente invención, las células en las poblaciones de HSC Lin" de la presente invención son transíectadas con un gen que codifica a un péptido antiangiogénico tal como el fragmento antiangiogénicc de triptofan RNA sintetasa (TrpRS) . De manera particular se prefieren los fragmentos de TrpRS que incluyen los fragmentos TI y T2 de TrpRS. Las células transíectadas en las composiciones de HSc Lin" que codifican a un péptido antiangiogénico de la presente invención son útiles para el tratamiento de enfermedades retinianas que involucran desarrollo vascular anormal, tal como la Retinopatia Diabética y enfermedades similares. Métodos Ejemplo 1. Aislamiento Celular y enriquecimiento; Preparación de Poblaciones A y B de HSB Lin". Procedimiento General. Todas las evaluaciones in vivo se efectuaron de conformidad con la Guia NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y todos los procedimientos de evaluación fueron aprobados por The Scripps Research Institute (TSRI, La Jolla, CA) Animal Care and Use Committee. Se extrajeron células de médula ósea de ratones adultos B6.129S7-Gtroosa26, Tie-GFP, ACTbEGFP, FVB/NJ (ratones rd/rd) o Balb/cBYJ (The jackson Laboratory, ME) . Los monocitos fueron entonces separados separados por separación de gradiente de densidad usando el gradiente de polisacarosa HISTOPAQUE® (Sigma, St. Louis, MO) y marcados con anticuerpos del panel de linea celular conjugada con biotina ( (CD45, CD3, Ly-6G, CD11, TER-119, Pharmigen, San Diego, CA) para selección de Lin". Las células de línea celular positiva (Lin+) fueron separadas y removidas de HSc Lin" usando un dispositivo de separación magnética ( seleccionador AUTOHACS™, Miltenyi Biotech, Auburn, CA) . La población de HSC Lin" resultante que contenía células progenitoras endoteliales se caracterizó adicionalmente usando un citómetro de flujo FACS1^ Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) usando los siguientes anticuerpos: Sca-l-conj ugado con PE, c-kit, KDR, y CD31 (Pharmigen, San Diego, CA) . Se usaron células de médula ósea Tie-2-GFP para la caracterización de Tie-2. Para cosechar células endoteliales de ratón adulto, se retiró quirúrgicamente tejido mesentérico de ratón ACTbEGFP y se colocó sobre colagenasa (Worthington, Lake ood, NJ) para digerir el tejido, seguido por filtración usando un filtro de 45 um. Se colectó el filtrado y se incubó con el Medio de Crecimiento Endotelial (Clonetics, San Diego, CA) . Las características endoteliales fueron confirmadas por observación de la apriencia morfológica de guijarro, la tinción con CD31 mAb (Pharmigen) y el examen de los cultivos por la formación de estructuras tubulares en matriz MATRIGEL™ (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Población A de HSC Lin". Se extrajeron células de médula ósea de ratones ACTbEGFP por medio del Procedimiento General descrito anteriormente. Las células HSC Lin" se caracterizaron por medio de la citometría de flujo FACS por marcadores antigénicos de superficie celular CD31, c-kit, Sca-1, Flk-1, y Tie-2. Los resultados se muestran en la FIG. le. Aproximadamente 81 % de la HSC Lin- exhibió el marcador CD31, aproximadamente 70.5 % de la HSC Lin" exhibió el marcador de c-kit, aproximadamente 4 % ae las HSC Lin" exhibió el marcador Sca-1, aproximadamente 2.2 ¾ de la HSC Lin" exhibió el marcador Flk-1 y aproximadamente 0.91 % de las células HSC Lin" exhibieron el marcador Tie-2. En contraste, las HSC Lin" que fueron aisladas de estas células de médula ósea tuvieron un perfil de marcador celular significativamente diferente (es decir, CD31: 37.4 ¾ ; c-kit: 20 %; Sca-1: 2.8 ¾; Flk-1: 0.05 ¾. Población B de HSC Lin". Se extrajeron células de médula ósea de ratones BalbC, ACTbEGFP, y C3H por medio del Procedimiento General descrito anteriormente. Las células HSC Lin" fueron analizadas por la presencia de marcadores de superficie celular (Seal, KDR, cKit, CD34, CD31 y varias integrinas ·, ?, a3, 4, aß, ???, av, a>-., ano, ß?, ß?, ß3, ß4, ß.¾ y ß,? . Se muestran los resultados en la Tabla 1.

Tabla 1. Caracterización de la Población de HSC Lin- Marcador Celular Hsc Lin-a 0.10 a 17.57 :s 0.22 a, 89.39 a, 82.47 6 77.70 aL 62.69 aM 35.84 v 33.64 ß! 86.26 ß 49.07 ß , 45.70 ß4 0.68 ß5 9-44 t 11.25 CD31 51.76 CD34 55.83 Flk-1/KDR 2.95 c-kit 74.42 Sca-1 7.54 Ejemplo 2. Administración Intravitreal de Células.

Se creó una fisura en el párpado con una cuchilla fina para exponer el globo ocular de P2 a P6. Las células De la Población A de HSC de linea celular negativa de la presente invención (aproximadamente 105 células en aproximadamente 0.5 µ? a aproximadamente 1 µ? de medio de cultivo celular) se inyectaron entonces intravitrealmente usando agujas de calibre 33 (Hamilton, Reno, NV) . Ejemplo 3. Transfeccion de EPC. HSC Lin" (Población A) fueron transíectadas con DNA que codifica al fragmento T2 de TrpRS también incluyen una marca His6 (SEC ID NO: 1, Figura 7), usando el Reactivo para Transfeccion FuGENE™ (Roche, Indianapolis, IN) de conformidad con el protocolo del fabricante. Las células de una composición de HSC Lin" (aproximadamente 106 células por mi) fueron suspendidas en medio opti-MEM® (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contenia el factor de células madres (PeproTech, Rocky Hill, NJ) . Se añadió entonces una mezcla de DNA (aproximadamente 1 \ig) y reactivo FuGENE (apro imadamente 3 µ?), y las mezclas se incubaron a aproximadamente 37 °C por aproximadamente 18 horas. Después de incubación, las células se lavaron y colectaron. La proporción de transfeccion de este sistema fue de aproximadamente 17 , que fue confirmada por análisis de FACS. Se confirmó la producción de T2 por tinción Western. La secuencia de aminoácidos de T2-TrpRS marcada con His<¡ se muestra como la SEC ID NO: 2, Figura 8. Ejemplo 4. Análisis Confocal e Inmunohistoquimica Se cosecharon retinas a varios tiempos puntuales y se prepararon ya sea para montaje enteras o para seccionamiento por congelación. Para montaje enteras, las retinas se fijaron con paraformaldehido al 4 %, y se bloquearon en suero fetal bovino al 50 % (FBS) y suero normal de cabra al 20 % por una hora a temperatura ambiente. Las retinas fueron procesadas por anticuerpos primarios y fueron detectadas con anticuerpos secundarios. Los anticuerpos primarios usados fueron: anti-Colágeno IV (Chemicon, Temecula, CA, anti-3-gal (Promega, Madison, WI), anti-GFAP (Dako Cytomation, Carpenteria, CA) , anti—a-actina de músculo lisa ( -SMA, Dako Cytomation) . Los anticuerpos secundarios usados fueron conjugados ya sea a marcadores Alexa 488 o 594 fluorescentes (Molecular Probes, Eugene, OR) . Se tomaron las imágenes usando un microscopio Confocal MRC 1024 (Bio-Rad, Hercules, CA) . Se crearon imágenes tridimensionales usando el paquete LASERSHARP® (Bio-Rad) para examinar las tres capas diferentes de desarrollo vascular en el montaje completo de retina. La diferencia en la intensidad de pixeles de GFP entre ratones GFP mejorados (eGFP) y ratones GFAP/wtGFP, diferenciados por microscopía confocal fue utilizada para crear imágenes tridimensionales. Ejemplo 5. Ensayos de Cuantificación de Angiogénesis Retiniana in vivo Por análisis de T2-TrpRS, el plexo primario y profundo fueron reconstruidos de las imágenes tridimensionales. El plexo primario se dividió en dos categorías: desarrollo normal, o progreso vascular detenido. Se construyeron las categorías d e inhibición del desarrollo vascular profundo con base en el porcentaje de inhibición vascular gue incluye el siguiente criterio: inhibición completa de la formación del plexo profundo fue marcada "Completa", el desarrollo vascular normal (incluyendo menos de 25 % de inhibición) fue marcada "Normal" y el remanente marcado "Parcial". Para los datos de recuperación de ratón rd/rd se capturaron cuatro áreas separadas del plexo profundo en cada montaje completo de retina, usando un lente de lOx. La longitud total de la vasculatura se calculó para cada imagen, resumidas y comparadas entre los grupos. Para adquirir información segura, se inyectó HSC Lin~ en un ojo y HSC Lin† en el otro ojo del mismo ratón. De la misma carnada se tomaron retinas control no inyectadas. Ejemplo 6. Modelos de daño Retiniano en Adultos Se crearon modelos de marcas y láser usando ya sea un diodo láser (150 m , 1 segundo, 50 mm) o mecánicamente por punción de La retina con una aguja de calibre 27. Cinco días después del daño, se inyectaron las células usando el método intravitreal . Los ojos fueron cosechados cinco días después . Ejemplo 7. Recuperación Neurotrófico de Regeneración Retiniana Las células madres hematopoyéticas de linea celular derivada de médula ósea adulta (HSC Lin") tienen un efecto de recuperación vasculotrófico y neutrófico en un modelo de degeneración de ratón. Los ojos derechos de ratones de 10 días de edad fueron inyectados intravitrealmente con aproximadamente 0.5 microlitros que contenían aproximadamente 105 células HSC Lin~ de la presente invención y se evaluaron 2 meses después para la presencia de cuenta nuclear de la capa neuronal y vasculatura retiniana. Los ojos izquierdos de los mismos ratones fueron inyectados con aproximadamente el mismo número de células HSC Lin+ como un control, y fueron evaluados de manera similar. Como se muestra en la Figura 9, en los ojos tratados con HSC Lin", la vasculatura retiniana pareció casi normal, la capa nuclear interior casi normal y la capa nuclear externa (ONL) tuvo aproximadamente 3 a aproximadamente 4 capas de núcleos. En contraste, el ojo contra lateral tratado con HSC Lin' tuvo una capa vascular retiniana media marcadamente atrófica, una capa vascular retiniana externa completamente atrófica, la capa nuclear interna estaba marcadamente atrófica y la capa nuclear externa desapareció completamente. Esto se ilustra dramáticamente en el Ratón 3 y el Ratón 5. En el Ratón 1, no hubo efecto de recuperación y esto fue verdadero para aproximadamente 15 % de los ratones inyectados. Cuando se evaluó la función visual con electroretinogramas (ERG) , se observó el restablecimiento de un ERG positivo cuando se observó tanto la recuperación neuronal como vascular (Ratón 3 y 5) . No se observo ERG positivo cuando no hubo recuperación neuronal o vascular (Ratón 1). Esta correlación entre la recuperación neurotrófico y el neuronal de los ojos del ratón rd/rd por las HSC Lin" de la presente invención se ilustra por medio de una gráfica del análisis de regresión mostrada en la Figura 10. Una correlación entre la recuperación neuronal (eje y) y la vascular (eje x) se observó para el tipo de vasculatura intermedia (r = 0.45) y para la vasculatura profunda (r = 0.67) . La Figura 11 muestra la ausencia de cualquier correlación significativa estadísticamente entre la recuperación vascular y el neuronal por medio de HSC Lin". Se cuantificó la recuperación vascular y los datos se presentan en la Figura 12. Los datos para los ratones a 1 mes (1M), 2 meses (2M) , y 6 meses (6 M) , post- inyección en la Figura 12, demuestran que la extensión vascular fue significativamente creciente en ojos tratados con HSC Lin" de la presente invención (barras obscuras) en relación con la extensión vascular en ojos sin tratar del mismo ratón (barras claras) , particularmente a 1 mes y 2 meses, postinyección. El efecto de recuperación neurotrófico fue cuantificado por contenido de núcleos en las capas nucleares externa e interna aproximadamente 2 meses después de inyección de HSC Lin" o HSC Lin' . Los resultados se presentan en las Figuras 13 y 14. Resultados Desarrollo Vascular Retiniana de Roedor; Un Modelo para Angiogenesis Ocular El ojo de ratón proporciona un modelo reconocido para el estudio de desarrollo vascular retiniano de mamífero, tal como el desarrollo vascular retiniano humano. Durante el desarrollo de la vasculatura retiniana de roedor, desarrollo de vasos sanguíneos retiñíanos activadores de isquemia en estrecha asociación con astrocitos . Estos elementos gliales migran sobre el fetus humano en el tercer trimestre, o el roedor neonato, retina de los discos ópticos a lo largo de la capa celular ganglionar y se disemina radialmente. Cuando se desarrolla la vasculatura retiniana de roedor, las células endoteliales utilizan esta molde astrocítico ya establecido para determinar el patrón vascular retiniano (ver la Figura la y b) . La Figura 1 (a y b) exponen diagramas esquemáticos de retina de ratón en desarrollo. La Figura 1 expone el desarrollo del plexo primario (lineas obscuras en el lado suprior izquierdo del diagrama) superpuesto sobre el molde de astrocito (lineas claras) mientras que, la Figura Ib expone la segunda fase de formación de vasos retiñíanos. En las Figuras, GCL representa la capa celular ganglionar, IPN representa la capa del plexo interior; INL representa la capa nuclear interior; OPL, representa la capa del plexo exterior; ONL representa la capa nuclear exterior; RPE, representa el epitelio del pigmento retiniano; ON representa el nervio óptico; y P representa la periferia.

Al nacer la vasculatura retiniana está virtualmente ausente. En el día 14 post-natal (P14) la retina ha desarrollado las capas compleja primaria (superficial) y secundaria (profunda) de los vasos retiñíanos lo que coincide con el principio de la visión. Inicialmente, los vasos peripapilares, como rayos, crecen de manera radial sobre la retícula astrocítica pre- existente hacia la periferia, interconectándose progresivamente por medio de la formación del plexo capilar. Estos vasos crecen como una monocapa en la fibra nerviosa Hasta PIO (Figura Ia) . Entre las ramas colaterales P7-P8 que comienzan a renovarse desde este plexo primario y penetran en la retina a la capa plexiforme externa donde forman el plexo retiniano secundario, o profundo. En P21, la retícula completa sufre remodelamiento extensivo y forma un plexo terciario o intermedio, en la superficie interior de la capa nuclear interior (Figura Ib) . El modelo de retiniano de ratón neonatal es útil para estudiar el papel de HSC durante la angiogénesis ocular por varias razones. En este modelo relevante fisiológicamente existe un gran molde astrocítico antes de la aparición de vasos sanguíneos endógenos, permitiendo una evaluación del papel para seleccionar célula-célula durante un proceso neovascular. Además, este proceso vascular retiniano neonatal reproducible y consistente se conoce por ser activador de hipoxia, en este aspecto, que tiene similaridades con muchas enfermedades retinianas en la cual se sabe que la isquemia desempeña un papel. Enriquecimiento de Células Progenitoras Endoteliales (EPC) Desde Médula Osea Aunque se ha evaluado extensivamente la expresión de marcadores de superficie celular sobre la población de EPC encontrados en preparaciones de HSC, marcadores que únicamente identifican a EPC son aún definidos pobremente. Para enriquecimiento por EPC, células positivas marcadoras de línea celular hematopoyéticas (Lin'), es decir linfocitos B (CD45), linfocitos T (CD3), granulocitos (Ly- 6G) , monocitos (CD11), y eritrocitos (TER-119), fueron consumidas desde células mononucleares de médula ósea. El antigeno de Sca-1 fue usado para enriquecer adicionalmente por EPC. Una comparación de los resultados obtenidos después de inyección intravitreal de números idénticos ya sea de células Sca-1+ Lin" o células Lin", no se detectaron diferencias entre los dos grupos. De hecho, cuando solamente se inyectaron Sca-1" Lin~, se observó mayor incorporación en el desarrollo de vasos sanguíneos. Las HSC Lin" de la presente invención son enriquecidas por EPC con base en ensayos funcionales. Además, poblaciones de HSC Lin+ se comportaron funcionalmente muy diferentemente de las poblaciones HSC I,in". Se evaluaron también epítopes usados comúnmente para identificar EPC para cada fracción (con base en estudios de caracterización in vitro reportados previamente) . Mientras ninguno de estos marcadores estuviera exclusivamente asociado con la fracción Lin", todos fueron crecientes aproximadamente 70 a aproximadamente 1800 % en la HSC Lin", en comparación con la fracción HSC Linf (Figura le) . La Figura 1c ilustra la caracterización de flujo citométrico de células separadas de HSC Lin" y HSC Lin+ derivadas de médula ósea. La flecha superior de la Figura le muestra una distribución en gráfica de puntos de células madres hematopoyéticas de células marcadas sin anticuerpos. Rl define el área de entrada cuantificable de tinción PE positiva; R2 indica GFP positiva. Las gráficas de puntos de HSC Lin- se muestran en la flecha media y las gráficas de puntos de HSC Lin+ se muestran en la flecha inferior. Las células C57B/6 fueron marcadas con los anticuerpos conjugados de PE para Sca-1, c-kit, Flk-l/KDR, CD31. Los datos de Tie-2 se obtuvieron de los ratones Tie-2-GFP. Los porcentajes en las esquinas de las gráficas de puntos indican el por ciento de células marcadas positivas afuera de la población de HSC Lin+ o Lin". De manera interesante, marcadores EPC aceptados como Flk-l/KDR, Tie-2, y Sca-1 fueron expresados pobremente y, por consiguiente no se usaron para fraccionamiento adicional.

Células HSC Lin- Inyectadas Intravitrealmente Contienen EPC que Localizan a los Astrocitos y se Incorporan en la vasculatura Retiniana en Desarrollo Para determinar si HSC Lin" inyectada intravitrealmente puede seleccionar tipos celulares específicos de la retina, utiliza el molde astrocítico y participa en la angiogénesis retiniana, aproximadamente 10" células de una composición de HSC Lin" de la presente invención o células HSC Lin+ de la presente invención (control, aproximadamente 105 células) aisladas de la médula ósea de ratones adultos (GFP o LacZ transgénicos ) fueron inyectados en ojos de ratón el día 2 post-natal (P2) . Cuatro días después de la inyección (P6) , muchas células de la composición de HSC Lin~ de la presente invención, derivadas de ratones GFP o LacZ transgénicos fueron adherentes a la retina y tuvieron la apariencia alargada característica de las células endoteliales (Figura 2a) . La Figura 2 ilustra injertos de células Lin~ en retina de ratón en desarrollo. Como se muestra en la Figura 2a, la post-inyección intravitrealmente de cuatro días (P6) inyectada eGFP + HSC Lin~ se fijó y diferenció sobre la retina. En muchas áreas de las retinas, las células que expresan a GFP fueron dispuestas en un patrón conforme a astrocitos subordinados y los vasos sanguíneos reagrupados. Estas células fluorescentes fueron observadas delante de la retícula vascular en desarrollo, endógena (Figura 2b). Contrariamente, solamente un pequeño número de HSC Lin+ (Figura 2c), o células endoteliales mesentéricas de ratón adulto (Figura 2d) fijadas en la superficie retiniana. A fin de determinar si las células de una composición de HSC Lin~ inyectadas podrían también fijarse a retinas con vasos sanguíneos ya establecidos, se inyectó una composición de HSC Lin" en ojos adultos. De manera interesante, no se observaron células fijas a la retina o incorporadas en vasos sanguíneos retiñíanos normales, ya establecidos (Figura 2e) . Esto indica que las composiciones de HSC Lin" de la presente invención no interrumpe una vasculatura desarrollada normalmente y no iniciará vascularización normal en retinas desarrolladas normalmente . A fin de determinar la relación entre unas composiciones de HSC Lin" inyectadas de la presente invención y astrocitos retiñíanos, se usó un ratón transgénico, el cual expresó a la proteina ácida fibrilaria glial (GFAP, un marcador de astrocitos) y a la proteina verde fluorescente activada con promotor (GFP) . El examen de retinas de estos ratones transgénicos GFAP-GFP inyectados con HSC Lin" de ratones transgénicos de eGFP demostró colocalización del eGFP EPC inyectado y que existen astrocitos (Figura 2f-h, flechas) . Se observaron los procesos de eGFP + HSC Lin" para conformar la retícula astrocítica dependiente (flechas, Figura 2g) . El examen de estos ojos demostraron que las células mercadas, inyectadas solamente fijadas a astrocitos; en retinas de ratón a P6, donde la periferia retiniana no tiene todavía vasos endógenos, se observaron células inyectadas adherentes a astrocitos en estas áreas aín sin vascularizar . Sorprendentemente, se observaron células marcadas, inyectadas en las capas más profundas de la retina en la localización precisa donde se desarrollarán subsecuentemente los vasos retiñíanos normales (Figura 2i, flechas) . Para determinar si HSC Lin~ inyectada de la presente invención se incorporan establemente en la vasculatura retiniana en desarrollo, se examinaron vasos retiñíanos a varios tiempos puntuales. Tan precoces como en P9 (siete días después de inyección) , se incorporaron HSC Lin~ en estructuras CD31~ (Figura 2j) . En P16 (14 días después de inyección) las células ya fueron incorporadas extensivamente en estructuras similares a la vascular retiniana (Figura 2k) . Cuando se inyectó intravascularmente rodamina-dextrano (para identificar vasos sanguíneos retiñíanos funcionales) antes de sacrificar a los animales, la mayoría de las HSC Lin~ se alinearon con vasos libres (Figura 21) . Se observaron dos patrones de distribución de células marcadas: (1) en un patrón, las células fueron intercaladas a lo largo de los vasos entre células endoteliales sin marcar, y (2) los otros patrones mostraron que los vasos estaban compuestos completamente de células marcadas. Las células inyectadas fueron también incorporadas en vasos del plexo vascular profundo (Figura 2m) . Mientras que se ha reportado previamente, la incorporación esporádica de EPC derivada de HSC Lin" en la neovasculatura, este es el primer reporte de retícula vascular que está completamente compuesta de estas células. Esto demuestra que las células d euna población de HSC Lin" derivada de médula ósea de la presente invención inyectada intravitrealmente, puede incorporarse eficientemente en cualquier capa del plexo vascular retiniano conformador. El examen histológico de tejidos no retiñíanos (por ejemplo, cerebro, hígado, corazón, pulmón, médula ósea) no demostraron la presencia de cualquier célula positiva de GFP cuando se examinan hasta 5 o 10 días después de inyección intravitreal . Esto indica que una sub-población de células en la fracción de HSC Lin" localizan selectivamente en los astrocitos retiñíanos y se incorporan establemente en la vasculatura retiniana en desarrollo. Por consiguiente las células tienen características de células endoteliales (asociación con astrocitos retiñíanos, morfología alargada, incorporación estable en vasos libres y no presentes en localizaciones extravasculares) , estas células representan EPC presente en la población de HSC Lin". Los astrocitos seleccionados son del mismo tipo observado en muchos de las retinopatías hipóxicas, es bien sabido que células gliales son un componente prominente de arborescencias neovasculares observadas en DR y otras formas de daños reti íanos. Bajo condiciones de gliosis reactiva y neovascularización inducida por isquemia, astrocitos activados proliferan, producen citoquínas, y sobreregulan GFAP, similar a la observada durante la formación del molde vascular retiniano neonatal en muchas especies de mamíferos incluyendo humanos. Para probar si composiciones de HSC Lin~ de la presente invención seleccionaran astrocitos activados en ojos de ratón adulto cuando no lo hacen en ojos de neonatos, se inyectaron células HSC Lin" en ojos de adulto con retinas dañadas por fotocoagulación (Figura 3a) o la punta de aguja (Figura 3b) . En ambos modelos, se observó una población de células con tinción de GFAP prominente solamente alrededor del sitio dañado (Figura 3a y b) . Células de las composiciones de HSC Lin" inyectadas, se localizaron en el sitio dañado y permanecieron asociadas específicamente asociadas con astrocitos GFAP positivos (Figura 3a y b) . En estos sitios, se observaron también células HSC Lin" migrar en la capa más profunda de la retina a un nivel similar al observado durante la formación neonatal de la vasculatura retiniana profunda (datos no mostrados) . Las porciones de retina sin daño no contuvieron células HSC Lin", idénticas a las observadas cuando se inyectaron HSC Lin" en retinas de adulto sin dañar, normales (Figura 2e) .Estos datos indican que composiciones de HSC Lin" pueden terminar selectivamente en células gliales activadas en retinas de adulto dañadas con gliosis, así como también retinas de neonatos que adolecen de vascularización. HSC Lin- Inyectada Intravitrealmente Puede Recuperar y Estabilizar la Vasculatura Degenerante Por consiguiente, composiciones de HSC Lin" inyectadas intravitrealmente selecciona astrocitos y se incorporan en la vasculatura retiniana normal, estas células también estabilizan vasculatura degenerante en enfermedades isquémicas o degenerativas asociadas con gliosis y degeneración vascular. El ratón rd/rd es un modelo para degeneración retiniana que exhibe degeneración profunda las capas vasculares retinianas y fotoreceptoras en un mes después de nacimiento. La vasculatura retiniana en estos ratones se desarrollan normalmente hasta P16, tiempo en el cual regresa el plexo vascular más profundo; en la mayoría de los ratones los plexos profundo e intermedio han degenerado casi completamente en P3ü. Para determinar si HSC puede rescatar los vasos regresivos, HSC Lin* o Lin" (de ratones Balb/c) fueron inyectados intravitrealmente en ratones rd/rd a P6. En P33, después de inyección con células Lin', los vasos de las capas retinianas más ' profundas estuvieron casi completamente ausentes (Figura 4a y b) . En contraste, la mayoría de las retinas inyectadas con HSC Lin" en P33 tuvieron una vasculatura retiniana casi normal con tres capas vasculares bien formadas, paralelas (Figura 4a y 4d) . La cuantificación de este efecto demostró que la extensión promedio de vasos en el plexo vascular profundo de ojos de rd/rd inyectados con Lin" fue casi tres veces mayor que ojos tratados con células Lin+ o sin tratar (Figura 4e) . De manera sorprendentemente, la inyección de una composición de HSC Lin~ derivadas de médula ósea de ratón (FVB/N) adulto rd/rd también rescató vasculatura retiniana de ratón neonato rd/rd degenerante (Figura 4f) . La degeneración de la vasculatura en ojos de ratón rd/rd observados tan precozmente como 2 - 3 semanas post-natalmente. La inyección de HSC Lin" tan tardía como P15 también dio como resultado la estabilización parcial de la vasculatura degenerante en los ratones rd/rd por al menos un mes (Figura 4g y 4h) . Una composición de HSC Lin" inyectada en ratones rd/rd jóvenes (por ejemplo, P2) también se incorporó en la vasculatura superficial en desarrollo. En Pll, estas células se observaron migrar al nivel del plexo vascular profundo y formar un patrón idéntico al observado en la capa vascular retiniana externa de tipo salvaje (Figura 5a) . A fin de describir más claramente la manera en la cual células de composiciones de HSC Lin" inyectadas se incorporan en, y estabilizan la vasculatura retiniana degenerante, en los ratones rd/rd, una composición de HSC Lin" derivada de ratones Balb/c se inyectaron en ojos de ratón Tie-2-GFP FVB. Los ratones FVB tienen el genotipo rd/rd y porque expresan a la proteina de fusión Tie-2-GFP, todos los vasos sanguíneos endógenos son fluorescentes. Cuando células no marcadas de una composición de HSC Lin" son inyectadas en ojos de Tie-2-GFP FVB neonatos y se incorporan subsecuentemente en la vasculatura en desarrollo, no deberán haber espacios sin marcar en vasos de Tie-2-GFP marcados, endógenos, que corresponde a HSC Lin" no marcadas, incorporadas que fueron inyectadas. Subsecuentemente la tinción con otro marcador vascular (por ejemplo, CD-31) delinea entonces el vaso completo, permitiendo la determinación para saber si células endoteliales no endógenas son parte de la vasculatura. Dos meses después de inyección, se observaron vasos CD31-positivos, Tie-2-GFP negativos en las retinas de ojos inyectados con la composición de HSC Lin" (Figura 5b). De manera interesante, la mayoría de los vasos recuperados contuvieron células Tie-2-GFP positivas (Figura 5c) . La distribución de pericitos, que se determinó por tinción para actina de músculo liso, no cambió por la inyección de HSC Lin", independientemente de si hubo recate vascular (Figura 5d) . Estos datos demuestran claramente que composiciones de HSC Lin" de la presente invención inyectadas intravitrealmente, migran en la retina, participan en la formación de vasos sanguíneos retiñíanos normales, y estabilizan la vasculatura degenerante endógena en un ratón defectuoso genéticamente. Inhibición de Angiogénesis etiniana por medio de Células Transfectadas desde HSC Lin- T.a mayoría de las enfermedades vasculares retinianas involucran proliferación vascular anormal en vez de degeneración. Células transgénicas que terminan en astrocitos pueden usarse para liberar una proteína anti-angiogénica e inhibe la angiogénesis. Las células de composiciones de HSC Lin- fueron transfectadas con T2-triptofanil-tRNA sintetasa (T2-TrpRS) . T2-RrpRS es un fragmento de 43 kD de TrpRS que inhibe potencialmente angiogénesis retiniana (Figura 6a) . En P12, retinas de ojos inyectados con una composición de HSC Lin" transfectada en plásmido control (ningún gen de T2-TrpRS) en P2 tuvo plexo vascular retiniano primario (Figura 6c) y secundario (Figura 6d) normales. Cuando la composición de HSC Lin- transfectada en T2-TrpRS de la presente invención fue inyectada en ojos en P2 y evaluadas 10 días después, la retícula primaria tuvo anormalidades significativas (Figura 6e) y la formación de la vasculatura retiniana profunda fue casi inhibida completamente (Figura 6f ) . Los pocos vasos observados en estos ojos fueron marcadamente atenuados con grandes espacios entre vasos. La extensión de la inhibición por células HSC Lin~ que secretan T2-TrpRS se detalla en la Tabla 2. Se produce y secreta T2-TrpRS por medio de células en la composición de HSC Lin~ in vi tro y después de inyección de estas células transfectadas en el vitreo, se observó un fragmento de 30 kD de T2-TrpRS en la retina (Figura 6b) . Este fragmento de 30 kD fue observado específicamente solamente en retinas observadas con HSC Lin~ transfectada de la presente invención y esta disminución en el peso molecular aparente en comparación con la proteína sintetizada in vitro o recombinate puede ser debido al procesamiento o a la degradación del T2-TrpRS in vivo. Estos datos indican que composiciones de HSC Lin" pueden ser usadas para liberar genes activos funcionalmente, tales como genes que expresan moléculas angiostáticas , en la vasculatura retiniana al terminar en astrocitos activados. Aunque es posible que el efecto angiostático sea debido a actividad mediada por células esto es muy diferente ya que ojos tratados con composiciones de HSC Lin" no transfectadas en 12, idénticas tuvieron vasculatura retiniana normal.

Tabla 2. Inhibición vascular por medio de Células HSC Lin- que Secretan T2-TrpRS Composiciones ele HSC Lirf inyectadas intravitrealmente localizan a astrocitos retiñíanos, se incorporan en vasos, y pueden ser útiles al tratar muchas enfermedades retiñíanos. Aunque la mayoría de las células inyectadas desde composiciones de HSC se adhieren al molde astrocítico, pequeños números migran profundamente en la retina, se dirigen a regiones donde la retícula vascular profunda se desarrollará subsecuentemente. Aunque no se observó ningún astrocito positivo a GFAP en esta área antes de 42 días postnatalmente, esto no hace la regla, excluye la posibilidad de que células gliales negativas a GFAP estén ya presentes para proporcionar una señal para la localización de HSC Lin". Estudios previos han mostrado que muchas enfermedades están asociadas con gliosis reactiva. En D , en particular, células gliales y su matriz extracleular son asociadas con angiogénesis patológica . Por consiguiente, pueden usarse células desde composiciones de HSC Lin" inyectadas específicamente fijadas a células gliales que expresan a GFAP, indistintamente del tipo de daño, composiciones de HSC Lin~ de la presente invención, para localizar lesiones pre-angiogénicas en la retina. Por ejemplo, en retinopatías isquémicas tales como diabetes, la neovascul arización es una respuesta a la hipoxia. Al colocar composiciones de HSC Lin" en sitios de neovascularización patológica, puede ser estabiliza la neovasculatura en desarrollo, evitando anormalidades de neovasculatura tales como hemorragia o edema (las causas de pérdida de la visión asociadas con DR) y pueden aliviar potencialmente la hipoxia que originalmente estimuló la neovascularización. Los vasos sanguíneos anormales pueden ser restaurados a la condición normal. Además, proteínas angiostáticas, tales como T2-TrpRS pueden ser liberadas en sitios de angiogénesis patológica al usar composiciones de HSC Lin" transíectadas y activación inducida por rayos láser de astrocitos. Ya que la fotocoagulación por rayos láser es usada comúnmente en oftalmología cínica, este procedimiento tiene aplicación para muchas enfermedades retinianas. Mientras que dichos procedimientos basados en células han sido explorados en la terapia del cáncer, su uso para enfermedades oculares es más ventajoso, ya que la inyección infraocular hace posible liberar gran número de células directamente en el sitio de la enfermedad. Recuperación Neurotrófico y Vasculotrófico por medio de HSC Lin" Se usó MACS para separar HSC Lin" de médula ósea de ratones FVB /rd/rd) , C3H (rd/rd) , proteínas verde fluorescente mejoradas (eGFP) como se describió anteriormente. HSC Lin- que contenía EPC de estos ratones se inyectaron intravitrealmente en ojos de ratón FVB o C3H en P6. Se colectaron las retinas a varios tiempos puntuales (1 mes, 2 meses, y 6 meses) después de inyección. Se analizó la vasculatura por medio del microscopio confocal de exploración con rayos láser después de tinción con anticuerpos para CD31 e histología retiniana después de tinción nuclear con DAPI . Se usó también el análisis de la expresión genética por microredes de mRNA de retinas en tiempos puntuales variables, para identificar genes involucrados potencialmente en el efecto. Los ojos de ratones rd/rd tuvieron degeneración profunda tanto de la retina neurosensorial como de la vasculatura retiniana en P21. Los ojos de ratones rd/rd tratados con HSC Lin" en P6 mantuvieron una vasculatura retiniana normal por tanto tiempo como 6 meses, tanto en las capas intermedias como profundas, fueron significativamente mejoradas cuando se compararon con los controles en todos los tiempos puntuales (1M, 2M, y 6M) (Ver la Figura 12). Además, se observó que retinas tratadas con HSC Lin~ fueron también más gruesas (1 , ; 1.2 veces, 2M; 1.3 veces, 6M; 1.4 veces) y hubo mayor número de células en la capa nuclear externa (1M; 2.2 veces, 2M; 3.7 veces, 6M; 5.7 veces) en relación a ojos tratados con HSC Lin~ como un control. El análisis genómico en gran escala de retinas "recuperadas" (por ejemplo, HSC Lin~) en comparación con retinas de rd/rd control (sin tratar o no tratadas con Lin") demostraron una sobre-regulación significativa de genes que codifican a HSPs (pequeñas proteínas con choque térmico) y factores de crecimiento específicos que se correlacionan con la recuperación vascular y neural, incluyendo los factores mostrados en la Tabla 3. La HSC Lin~ derivada de médula ósea de la presente invención inducen de manera significativa y reproducible el manetnimiento de una vasculatura normal e incrementan dramáticamente las capas celulares diferentes de las neuronales y fotoreceptoras en ratones rd/rd. Este efecto de recuperación neurotrófico está correlacionado con la sobreregulación significativa de proteínas pequeñas de choque térmico y factores de crecimiento y, asi, proporciona la introducción a procedimientos terapéuticos para trastornos degenerativos retiñíanos intratables corrientemente . Tabla 3.Genes Sobreregulados en Retinas de Ratón Inyectadas con HSC Lin Nombre común Lin (-) CD31 (-) Ratones rd control Tgtp 11.855 0.526 0.664 H-2D (q) 7.091 0.916 0.694 H-K2;H-2K2 4.507 0.705 0.547 Lzp-s 6.514 0.648 0.987 Kcnj 5 4.501 0.855 0.722 EST 2.905 1.000 0.750 Scya8 5.186 0.470 0.996 Lyóa 4.0020 0.962 0.792 Anxal 2.490 0.599 0.510 Pi5klc 3.405 0.944 0.782 EST 3.999 0.502 0.975 MAD 3.763 0.560 0.892 Cxadr 3.977 0.814 1.000 Isgl5 2.218 0.642 0.449 EST 3.512 0.901 0.978 Tabla 3 (Continuación) Nombre común Lin (-) CD31 (-) Ratones rd control Tm4sf1 3.022 0.493 0.697 IgC VH-II 2.644 0.948 0.909 Yyl 2.967 0.854 0.874 EST 2.952 0.869 0.822 EST 2.575 0.486 0.650 Psmb9 3.288 0.492 0.975 EST 2.195 0.873 0.904 H2-Aa 2.627 0.878 0.940 EST 2.697 0.791 0.869 Genes Cristalinos Crybb2 8.726 0.552 0.831 Cryaa 3.995 0.567 1.000 CrygD 2.090 0.740 0.972 Crybal 6.520 0.930 0.603 Crygs 2.892 0.971 0.854 CryC 5.067 1.000 0.826 CrygF 1.942 0.999 0.688 1 Tabla 3 (Continuación) Nombre común No . de Comentarios Genebank Tgtp L36444 Proteina específica de células T H-2D4 (q) X52914 Antigeno d etrasplante H-K2;H-2K2 M27134 Glicoproteína de superficie celular Lzp-s X51547 Lisozima; lisozima F Kcnj 5 U33631 Canal de K+ de netrada de la proteína G EST AA087373 EST Scya8 AB023418 Precursor de MCP-2 Ly6a X04653 Aloantígeno de Ly-6 Anxal AV003419 EST Pi5klc AB006916 Fosfatidilinositoquinasa EST AU042276 EST MAD X83106 Proteína de dimerización de MAX Cxadr U90715 CAR IsglS X56602 Proteína inducible por interferon EST AA790936 EST Tabla 3 (Continuación) Nombre común No . de Cometarios GenBank Tm4sf1 AV087000 EST IgC VH-II X02463 Región variable; cadena pesada de Ig Yyl M74590 Factor de transcripción delta EST AA739246 EST EST AW046243 EST Psm 9 D44456 Subunidad 2 de complejo polipéptido EST AV172782 EST H2-Aa X52643 I-E alfa NON MHC EST AV076889 EST Genes Cristalinos Crybb2 M60559 Beta-B2-cristalino Cryaa J00376 Alfa-A-cristalino CrygD AJ224342 Gama-D-cristalino Crybal AJ239052 Beta-A3/Al-cristalino Crygs AF032995 Gama-S-cristaliño CryC Z22574 Gama-C-cristalino CrygF AJ224343 Gama-F-cristalino Discusión. Se usaron marcadores para células hematopoyéticas de línea celular confiable para seleccionar una población de HSC Lin~ derivadas de médula ósea que contenían EPC. Mientras la sub-población de HSC Lin- derivada de médula ósea que puede servir como EPC no está caracterizada por marcadores de superficie celular usados comúnmente, el comportamiento de estas células en vasculatura retiniana dañada o en desarrollo es completamente diferente que el observado para poblaciones celulares endoteliales adultas o Lin . El subfraccionamiento adicional de HSC usando marcadores tales como Sca-1 indicó que células Scal+ Lin-no mostraron ninguna diferencia substancial del uso de células HSC Lin~ solas. Estas células localizan selectivamente sitios de angiogénesis retiniana y participan en la formación de vasos sanguíneos libres. Las enfermedades degenerativas retinianas heredadas a menudo son acompañadas por pérdida de la vasculatura retiniana. El tratamiento efectivo de dichas enfermedades requiere la restauración de la función así como también del mantenimiento de la arquitectura del tejido complejo. Aunque varios estudios recientes han explorado el uso de la liberación de factores tróficos basada en células o células madres mismas, alguna combinación de ambas puede ser necesaria. Por ejemplo, el uso de terapia de factor de crecimiento para tratar enfermedades retinianas degenerativas dio como resultado sobrecrecimiento irregular de vasos sanguíneos que dan como resultado la interrupción de la arquitectura del tejido retiniano normal. El uso de células madres retinianas o neurales para tratar enfermedades degenerativas retinianas puede reconstituir la función neuronal, pero una vasculatura funcional será también necesaria para mantener la integridad funcional retiniana. La incorporación de células de una composición de HSC Lin~ de la presente invención en los vasos retiñíanos de ratones rd/rd estabilizaron la vasculatura degenerativa sin disruptar la estructura retiniana. Este efecto de recuperación se observó también cuando las células fueron inyectadas en ratones rd/rd a P15. Ya que la degeneración vascular comienza a P16 en ratones rd/rd, esta observación expande la ventana terapéutica para el tratamiento con HSC Lin~ efectivo. Las neuronas retinianas y los fotoreceptores son conservados y la función visual mantenida en ojos inyectados con las HSC Lin~ de la presente invención. Las composiciones de HSC Lin" de -la presente invención contienen una población de EPC que puede promover la angiogénesis por localización de astrocitos reactivos e incorporación en un molde establecido sin disruptar la estructura retiniana. La HSC Lin- de la presente invención también proporciona un sorprendente efecto de recuperación neurotrófico a largo plazo en ojos que sufren de degeneración retiniana. Además, composiciones de HSC Lin" autólogas, modificadas genéticamente que contienen EPC pueden ser trasplantadas en ojos vascularizados anormalmente o isquémicos y pueden incorporarse establemente en nuevos vasos y liberar continuamente moléculas terapéuticas localmente por períodos de tiempo prolongados. Dicha liberación local de genes que expresan a agentes f rmacológicos en dosis significativas fisiológicamente representa un nuevo paradigma para tratar enfermedades oculares intratables.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> The Scripps Research Institute Friedlander , Martin Otani, Atsushi DaSilva, Karen <120> CELULAS MADRES HEMATOPOYE ICAS Y METODO TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES OCULARES NEOVASCULARES CON LAS MISMAS <130> TSRI-900.1 <150> 60/467051 <151> 2003-05-02 <150> 60/398522 <151> 2002-07-25 <160> 2 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 4742 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> DNA que codifica a T2-TrpRS humana marcada His ;400> 1 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgaec gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 cLttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 aogtagtgqg c stcgccct gatagacgcft ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780 agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840 tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020 aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140 tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260 ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320 cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1360 gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440 actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560 caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680 accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860 agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920 accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980 gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640 geatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700 catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760 tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820 ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880 tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940 ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000 aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300 cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360 tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420 tatacatatg agtgcaaaag gcatagacta cgataagctc attgttcggt ttggaagtag 3480 taaaattgac aaagagctaa taaaccgaat agagagagcc accggccaaa gaccacacca 3540 cttcctgcgc agaggcatct tcttctcaca cagagatatg aatcaggttc ttgatgccta 3600 tgaaaataag aagccatttt atctgtacac gggccggggc ccctcttctg aagcaatgca 3660 tgtaggtcac ctcattccat ttattttcac aaagtggctc caggatgtat ttaacgtgcc 3720 cttggtcatc cagatgacgg atgacgagaa gtatctgtgg aaggacctga ccctggacca 3780 ggcctatggc gatgctgttg agaatgccaa ggacatcatc gcctgtggct ttgacatcaa 3840 caagacttLc atattctctg acctggacta catggggatg agctcaggtt tctacaaaaa 3900 tgtggtgaag attcaaaagc atgttacctt caaccaagtg aaaggcattt tcggcttcac 3960 tgacagcgac tgcattggga agatcagttt tcctgccatc caggctgctc cctccttcag 4020 caactcattc ccacagatct tccgagacag gacggatatc cagtgcctta tcccatgtgc 4080 cattgaccag gatccttact ttagaatgac aagggacgtc gcccccagga tcggctatcc 4140 taaaccagcc ctgttgcact ccaccttctt cccagccctg cagggcgccc agaccaaaat 4200 gagtgccagc gacccaaact cctccatctt cctcaccgac acggccaagc agatcaaaac 4260 caaggtcaat aagcatgcgt tttctggagg gagagacacc atcgaggagc acaggcagtt 4320 tgggggcaac tgtgatgtgg acgtgtcttt catgtacctg accttcttcc tcgaggacga 4380 cgacaagctc gagcagatca ggaaggatta caccagcgga gccatgctca ccggtgagct 4440 caagaaggca ctcatagagg ttctgcagcc cttgatcgca gagcaccagg cccggcgcaa 4500 ggaggtcacg gatgagatag tgaaagagtt catgactccc cggaagctgt ccttcgac t 4560 tcagaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa 4620 caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc 4680 ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 4740 at 4742 <210> 2 <211> 392 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> T2-TrpRS humana marcada con His <400> 2 Met Ser Ala Lys Gly lie Asp Tyr Asp Lys Leu lie V l Arg Phe Gl 5 10 15 3er Ser Lys lie Asp Lys Glu Leu lie Asn Arg lie Glu Arg Ala Th 20 25 30 Gly Glr. Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly lie Phe Phe Ser His 35 40 45 Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys P o Phe 50 55 60 Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly 65 70 75 B0 His Leu lie Pro Phe lie Phe Thr Lys rp Leu Gln Asp Val Phe Asn 85 90 9i> Val Pro Leu Val lie Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu p Lys 100 105 110 Asp Leu Thr Leu As Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu As Ala Lys 115 120 125 Asp lie lie Ala Cys Gl Phe Asp lie Asn Lys Thr Phe lie Phe Ser 130 135 140 Asp Leu As Tyr Me Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val 145 150 155 160 Lys lie Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly lie Phe Gly 165 170 175 Phe Thr Asp Ser Asp Cys lie Gly Lys lie Ser Phe Pro Ala lie Gln 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln lie Phe Arg Asp Arg 195 200 205 Thr Asp lie Gln Cys Leu lie Pro Cys Ala lie Asp Gln Asp Pro Tyr 210 215 220 Phe A g Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg lie Gly Tyr Pro Lys Pro 225 230 235 240 Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr 245 250 255 Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser lie Phe Leu Thr Asp Thr 260 265 270 Ala Lys Cln lie Lys Thr Lys Val Asn Lys His Al Phe Ser Gl Gly 275 280 285 Arg As Thr lie Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val 290 295 300 Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys 305 310 315 320 Leu Glu Gln lie Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly 325 330 335 Glu Leu Lys Lys Ala Leu lie Glu Val Leu Gln Pro Leu lie Ala Glu 340 345 350 His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu lie Val Lys Glu Phe 355 360 365 Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala 370 375 380 Leu Glu His His His His His His 385 390

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una población de células madres hematopoyéticas de linea celular negativa derivada de médula ósea, de mamífero, aislada, caracterizada porque comprende células progenitoras endoteliales en las cuales al menos aproximadamente 50 % de las células incluyen los marcadores celulares CD31 y c-kit. 2. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizad aporque al menos aproximadamente 75 % de las células incluyen el marcador celular CD31. 3. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos aproximadamente 65 % de las células incluyen el marcador celular c-kit. . Una población de células madres hematopoyéticas de linea celular negativa derivada de médula ósea, de mamífero, aislada, caracterizada porque comprende células progenitoras endoteliales en las cuales al menos aproximadamente 80 % de las células incluyen el marcador celular CD31 y al menos aproximadamente 70 % de las células incluye el marcador celular c-kit. 5. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las células son células de roedor. 6. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las células son células humanas. 7. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque hasta aproximadamente 8 % de las células también incluyen el marcador celular Sca-1 y hasta aproximadamente 4 % de las células también incluyen el marcador celular Flk-1/KDR. 8. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque hasta aproximadamente 1 % de las células incluyen el marcador celular Tie-2. 9. Una población de células madres hematopoyéticas derivada de médula ósea, de mamífero, aislada, caracterizada porque comprende células endoteliales progenitoras en las cuales aproximadamente 50 ¾ a aproximadamente 85 % de las células incluyen el marcador CD31, aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 ¾ de las células incluyen el marcador c-kit, aproximadamente 4 % a aproximadamente 8 % de las células incluyen el marcador Sca-1, y aproximadamente 2 % a aproximadamente 4 % de las células incluyen el marcador Flk-l/KDR. 10. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque incluye un medio de cultivo celular. 11. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque las células madres son derivadas de médula ósea de mami fero . 12. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque las células madres son derivadas de médula ósea humana. 13. Un método de aislar células madres hematopoyéticas de linea celular negativa, derivadas de médula ósea que incluye células endoteliales progenitoras, que comprende las etapas de : (a) extraer médula ósea de un mamífero; (b) separar una pluralidad de monocitos de la médula ósea; (c) marcar la pluralidad de monocitos con anticuerpos del panel de linea celular conjugada con biotina a CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119; y (d) retirar los monocitos que fueron de línea celular positiva por CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119 de la pluralidad de monocitos para proporcionar una población de células madres hematopoyéticas de linea celular negativa incluyendo células progenitoras endoteliales . 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el mamífero es un mamífero adulto . 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el mamífero es un ratón. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el mamífero es un humano. 17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque al menos aproximadamente 50 % de la población de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa incluyen un marcador celular CD31 y uno c-kit . 18. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la población de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa incluye células progenitoras endoteliales capaces de localizar regiones enriquecidas con células gliales de retinas adultas dañadas. 19. Una población de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa derivadas de médula ósea, de mamífero, aislada caracterizada porque es producida por el método de conformidad con la reivindicación 13. 20. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque al menos aproximadamente 50 % de las células incluyen los marcadores celulares CD31 y c-kit. 21. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque al menos aproximadamente 75 % de las células incluyen el marcador celular CD31. 22. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque al menos aproximadamente 65 % de las células incluye el marcador celular c-kit. 23. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque al menos aproximadamente 80 % de las células incluyen el marcador celular CD31 y al menos 70 % de las células incluyen el marcador celular c-kit. 24. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque hasta aproximadamente 3 % de las células también incluyen el marcador celular Sca-1 y hasta aproximadamente 4 % de las células incluyen el marcador celular Flk-l/KDR. 25. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque hasta 1 % de las células incluyen el marcador celular Tie-2. 26. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque aproximadamente 50 % a aproximadamente 85 % de las células incluyen el marcador CD31, aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 % de las células incluyen el marcador c-kit, aproximadamente 4 % a aproximadamente 8 % de las células incluyen el marcador Sca-1, y aproximadamente 2 % a aproximadamente 4 ¾ de las células incluyen el marcador Flk-l/KDR. 27. La población de células madres aislada de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque las células son células de roedor. 28. La población de células madres aislada de conformidad con la rei indicación 19, caracterizada porque las células son células humanas. 29. Un método de mejorar la neovascularización retiniana en un mamífero caracterizado porque comprende inyectar intravitrealmente la población de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa de conformidad con la reivindicación 1, en el ojo de un mamífero en necesidad de neovascularización retiniana en donde las células son derivadas de médula ósea de la misma especie de mamífero que la especie en cuyo ojo se inyectó la célula . 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el mamífero es un ratón. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el mamífero es un humano. 32. Un método de tratar una enfermedad ocular en un paciente caracterizado porque comprende aislar de la médula ósea del paciente, una población de células madres ematopoyéticas de línea celular negativa que incluye células progenitoras endoteliales e inyectar intravitrealmente las células madres aisladas en un ojo del paciente en un número suficiente para detener la enfermedad. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el número de células madres es efectiva para reparar el daño retiniano del ojo del paciente . 34. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el número de células madres es efectivo para estabilizar la neovasculatura retiniana del ojo del paciente. 35. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el número de células madres es efectivo para madurar la neovasculatura retiniana del ojo del paciente. 36. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la población de células madres hematopoyéticas de linea celular negativa es aislada por: (a) extraer la médula ósea de un mamífero; (b) separar una pluralidad de monocitos de la médula ósea ; (c) marcar la pluralidad de monocitos con anticuerpos del panel de linea celular conjugada con biotina para CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-11 ; y (d) remoción de monocitos que fueron de linea celular positiva por CD45, CD3, Ly- 6G, CDll y TER-119 de la pluralidad de monocitos para proporcionar una población de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa que incluya células endoteliales progenitoras . 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque al menos aproximadamente 50 ¾ de la población aislada de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa incluye los marcadores celulares CD31 y c-kit. 38. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es una enfermedad degenerativa retiniana. 39. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es una enfermedad degenerativa vascular retiniana. 40. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es una retinopatia isquémica . 41. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es una hemorragia vascular . 42. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la enfermedad es una fuga vascular . 43. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es una cloroidopatia . 44. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es degeneración macular relacionada con la edad. 45. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es retinopatia diabética . 46. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es histoplasmosis ocular supuesta. 47. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es retinopatia de prematuridad . 48. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es anemia de células falsiformes . 49. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la enfermedad es retinitis pigmentosa . 50. Una población de células madres hematopoyéticas de linea celular negativa transfectadas, caracterizada porque comprende una población de células madres de conformidad con la reivindicación 1, transfectada con un gen que codifica a un péptido útil terapéuticamente. 51. La población de células madres transfectadas de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque el péptido útil terapéuticamente es un péptido anti-angiogénico . 52. La población de células madres transfectadas de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el péptido anti-angiogénico es un fragmento de proteina. 53. La población de células madres transfectadas de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque el fragmento de proteina es un fragmento anti-angiogénico de TrpRS. 54. La población de células madres transfectadas de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el fragmento de TrpRS es T2-TrpRS. 55. Un método de inhibir la angiogénesis retiniana en el ojo de un paciente en necesidad de inhibición de la angiogénesis retiniana, caracterizado porque comprende inyectar intravitrealmente una población de células madres transíectadas de conformidad con la reivindicación 49 el ojo del paciente. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la población de células madres hematopoyéticas de linea celular negativa transíectadas, es preparada por: (a) extraer la médula ósea de un mamífero; (b) separar una pluralidad de monocitos de la médula ósea; (c) marcar la pluralidad de monocitos con anticuerpos del panel de línea celular conjugada con biotina para CD45, CD3, Ly-6G, CDll y TER-119; y (d) remoción de monocitos que fueron de línea celular positiva por CD45, CD3, Ly-6G, CDll y TER-119 de la pluralidad de monocitos para proporcionar una población de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa que incluya células endoteliales progenitoras . 57. El método de conformidad con la reivindicación 56 caracterizado porque al menos aproximadamente 50 % d ela población aislada de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa incluye los marcadores celulares CD31 y c-kit. 58. Un método de liberar transgenes a la vasculatura retiniana de un paciente, caracterizado porque comprende inyectar intravitrealmente una población de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa transfectadas derivadas de médula ósea en el ojo del paciente, en donde la población de células madres ha sido transfectada con un gen útil terapéuticamente. 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la célula madre hematopoyética de línea celular negativa transfectada es preparada por: (a) extraer la médula ósea de un mamífero; (b) separar una pluralidad de monocitos de la médula ósea; (c) marcar la pluralidad de monocitos con anticuerpos del panel de línea celular conjugada con biotina por CD45, CD3, Ly- 6G, CD11 y TER-119; y (d) remoción de monocitos que fueron de línea celular positiva por CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119 de la pluralidad de monocitos para proporcionar una población de células madres hematopoyéticas de linea celular negativa que incluya células endoteliales progenitoras . 60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque al menos aproximadamente 50 ¾ de la población aislada de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa incluye los marcadores celulares CD31 y c-kit. 61. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el gen es útil para inhibir la neovascularización retiniana. 62. Un método de inducir la recuperación neurotrófico en una retina de un mamífero que sufre de una enfermedad degenerativa retiniana caracterizado porque comprende administrar un número de células que induzcan la recuperación neurotrófico de una población de células madres hematopoyéticas de línea celular negativa, derivada de médula ósea de mamíferos, aislada, que contenga células progenitoras endoteliales a un ojo enfermo del mamífero; en donde al menos aproximadamente 50 % de las células madres incluye marcadores celulares para CD31 y c-kit. 38. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la población de células madres es aislada por: (a) extraer la médula ósea de un mamífero; (b) separar una pluralidad de monocitos de la médula ósea; fe) marcar la pluralidad de monocitos con anticuerpos del panel de línea celular conjugada con biotina para CD45, CD3, Ly- 6G, CD11 y TER-119; y (d) remoción de monocitos que fueron positivos para CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119 de la pluralidad de monocitos para proporcionar una población de células madres hematopoyéticas de linea celular negativa que incluya células endoteliales progenitoras . 64. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el mamífero es un humano. 65. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque las células son administradas por inyección intravitreal .