KR100869914B1 - 혈관 형성 조절에 유용한 트립토파닐-ｔＲＮＡ 신세타제기원 폴리펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명의 트립토파닐-tRNA 신세타제 기원의 분리된 수용성 폴리펩타이드는 혈관 형성 억제에 유용하다. 본 발명은 필수적으로 하기 서열번호 12의 아미노산 잔기 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 혈관 형성을 억제하는 이의 단편에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 폴리펩타이드의 크기는 약 45 kDa이하이다. 또한 본 발명은 폴리펩타이드의 사용 방법을 제공한다.

(서열번호 12)

트립토파닐-tRNA 신세타제 기원 폴리펩타이드, 혈관 형성, 혈관 형성 억제 조성물, VEGF, TrpRS 단편

Description

혈관 형성 조절에 유용한 트립토파닐-ｔＲＮＡ 신세타제 기원 폴리펩타이드{Tryptophanyl-tRNA synthetase derived polypeptides useful for the regulation of angiogenesis}

우선권 주장

본 출원은 2001년 2월 23일자로 출원된 특허 출원 번호 제60/270,951호의 미국 가출원에 대한 우선권을 주장한다.

정부 권한

본 발명은 미연방정부 국립보건원의 승인번호 제GM23562호하에 정부 지원으로 이루어졌고 미연방정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

본 발명은 절두된(truncated) tRNA 신세타제 폴리펩타이드, 당해 절두된 tRNA 신세타제 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 당해 조성물의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.

tRNA 분자의 아미노아실화를 촉매하는 아미노아실-tRNA 신세타제는 해독 과정동안에 유전자 정보를 해독하는데 필수적인 오래된 단백질이다. 고등 진핵세포에서, 9개의 아미노아실-tRNA 신세타제가 3개 이상의 또 다른 폴리펩타이드와 연합하여 거대 분자의 다중 효소 복합체를 형성하고 있다[문헌참조: Mirande et al., Eur. J. Biochem. 147:281-89(1985)]. 진핵세포의 tRNA 신세타제 각각은 tRNA의 원핵 세포 대응물과 밀접하게 연관된 코어 효소 및 코어 효소의 아미노 말단 또는 카복실 말단에 부착된 추가의 도메인으로 구성되어 있다[문헌참조: Mirande, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40:95-142(1991)].

대부분의 경우에, 부착된 도메인은 다중 효소 복합체의 어셈블리에 기여하는 것으로 드러났다. 그러나, 여분의 도메인이 존재하여 신세타제가 다중 효소 복합체에 연합되는 것과의 상호 관련성은 반드시 그런 것은 아니다.

포유동물의 TrpRS 분자는 아미노 말단 부착된 도메인을 갖는다. 정상적인 사람 세포에서, 2개의 형태의 TrpRS가 검출될 수 있다: 전장 분자(서열번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 471)로 이루어진 다수 형태 및 소수 절두된 형태("소형 TrpRS"; 서열번호 3의 아미노산 잔기 1 내지 424). 소수 형태는 전구-mRNA의 선택적 스플라이싱을 통해 아미노 말단 도메인을 결실시켜 제조된다[문헌참조: Tolstrup et al., J. Biol. Chem. 270:397-403(1995)]. 소형 TrpRS의 아미노 말단은 전장 TrpRS 분자의 48번 위치의 "met" 잔기인 것으로 밝혀졌다. 또한, 절두된 TrpRS는 가단백질 분해에 의해 제조될 수 있다[문헌참조: Lemaire et al., Eur. J. Biochem. 51:237-52(1975)]. 예를 들어, 소 TrpRS는 췌장에서 고도로 발현되고 췌장액으로 분비되어[문헌참조: Kisselev, Biochimie 75:1027-39(1993)] 절두된 TrpRS 분자의 생성을 유도한다. 이들 결과는 절두된 TrpRS가 tRNA의 아미노아실화 이외의 기능을 가질 수 있음을 시사한다.

혈관 형성(angiogenesis) 또는 기존 혈관으로부터 새로운 모세관의 증식은 배아 발생, 후속 성장 및 조직 복구에 필수적인 기본 과정이다. 혈관 형성은 혈관 분지의 발달 및 분화 뿐만 아니라 배형성, 체세포 성장, 조직 및 기관 복구 및 재생, 황체 및 자궁내막의 주기적 성장 및 신경계의 발달 및 분화를 포함하는 다양한 기본 생리학적 과정에서 필수 조건이다. 여성 생식 기관에서, 혈관 형성은 이의 발달동안에 난포에서 발생하고 배란에 따른 황체에서 발생하며 태반에서 발생하여 임신을 유도하고 이를 유지한다. 추가로, 혈관 형성은 신체의 복구 과정의 방편으로서 예를 들어, 상처 및 골절 치유 과정에서 발생한다. 혈관 형성은 또한 종양 성장의 요인인데 그 이유는 종양이 성장하기 위해서는 새로운 모세 혈관의 성장을 계속적으로 자극해야만 하기 때문이다. 혈관 형성은 사람 고형 암의 성장에서의 필수 방편이고 비정상적인 혈관 형성이 류마티스 관절염, 건선 및 당뇨 망막증과 관련이 있다[문헌참조: Folkman, J. and Klagsbrun, M., Science 235:442-447(1987)].

여러 인자가 혈관 형성에 관여한다. 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 분자 둘 다는 내피 세포 및 또 다른 세포 유형에 대한 유사분열물질이다. 기능이 불분명하지만 안지오트로핀 및 안지오게닌이 혈관형성을 유도할 수 있다[문헌참조: Folkman, J., Cancer Medicine, pp. 153-170, Lea and Febiger Press(1993)]. 혈관 내피 세포에 대해 매우 선택적인 유사분열물질은 혈관 내피 세포 인자 또는 VEGF이다[문헌참조: Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 13:19-32, (1992)].

파국적 시력 상실을 일으키는 대부분의 질환은 안구 혈관 신생의 결과로서 일어난다. 노인성 황반 변성(ARMD)은 65세 이상의 1200만 내지 1500만의 미국인들이 걸리며, 맥락(망막하의) 혈관 신생의 직접적인 작용으로 이들 중 10 내지 15%의 시력이 상실된다. 65세 미만의 미국인들의 시력 상실의 주요 원인은 당뇨이고 미국에서 1600만명이 당뇨이고 연간 40,000명이 당해 질환의 안구 합병증(흔히, 망막 혈관 신생의 결과이다)을 앓고 있다. 레이져 광 응고가 고위험의 당뇨병 환자의 서브그룹에서 심한 시력 상실을 예방하는데 효과적이지만 전체 10년동안 망막증 발병율은 실질적으로 변하지 않고 있다. ARMD 또는 염증 안구 질환(예: 안구 히스토플라스마증)으로 인한 맥락 혈관 신생을 갖는 환자에게 있어서, 광 응고는 극히 소수를 제외하고는 시력 상실을 예방하는데 비효과적이다. 최근에 개발된 비파괴적 광역학적 치료 요법이 이전에 치료 불가능한 맥락 혈관 신생을 앓는 환자의 시력 상실을 일시적으로 감소시키는데 전망이 있지만 3 - 4 개월 마다 치료되는 환자중 단지 61.4%만이 위약 처리된 그룹의 45.9%에 비해 개선되거나 안정화된 시력을 갖는다.

정상적인 성인에서, 혈관 형성은 세밀하게 조절되고 상처 치유, 임신 및 자궁 주기로 제한된다. 혈관 형성은 염기성 및 산성 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF), 안지오게닌, 형질전환 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)와 같은 특이적 혈관 형성 분자에 의해 개시된다. 혈관 형성은 인터페론-α, 트롬보스폰딘-1, 안지오스타틴 및 엔도스타틴과 같은 억제 분자에 의해 억제될 수 있다. 천연적으로 존재하는 자극제 및 억제제가 균형을 이루어 정상적으로 휴지기의 모세 혈관계를 조절한다. 이러한 균형이 교란되는 경우, 특정 질환 상태로서 모세혈관 내피 세포의 증식, 이동 및 궁극적인 분화를 유도한다.

혈관 형성은 암 및 안구 혈관 신생을 포함하는 다양한 질환에서 중추적 역할을 한다. 다양한 종양의 지속적인 성장 및 전이가 또한 신생 숙주 혈관이 종양 유래 혈관 형성 인자에 응답하여 종양 쪽으로 성장하느냐에 달려 있는 것으로 나타났다. 다양한 자극에 응답하여 신생 혈관 성장은 증식 당뇨 망막증(PDR), ARMD, 신생혈관녹내장, 간질각막염 및 미성숙한 망막증을 포함하는 안구 질환의 대부분에서 주로 발생한다. 이들 질환에서, 조직 손상은 혈관 형성 인자의 분비를 자극하여 모세혈관의 증식을 유도할 수 있다. VEGF가 홍채 혈관 신생 및 혈관 신생 망막증에 주요 역할을 한다. 보고서가 명백하게 안내 VEGF 수준과 허혈 망막증 안구 혈관 신생 사이에 상호 관련이 있음을 보여주지만 FGF가 역할을 수행할 가능성이 있다. 염기성 및 산성 FGF가 정상적인 성인 망막에 존재하는 것으로 공지되어 있지만 검출 가능한 수준이 혈관 신생과 일관성있게 관련이 있는 것은 아니다. 이것은 대부분 FGF가 세포외 매트릭스의 하전된 성분과 매우 강하게 결합한다는 안내 유체의 표준 분석에 의해 검출되는 자유 분산성 형태로 용이하게 수득될 수 없다는 사실에 기인할 수 있다.

혈관 형성 반응에서 최종 공통된 경로는 증식하는 혈관 내피 세포와 세포외 매트릭스간의 인테그린-매개 정보 교환에 관여한다. 인테그린이라고 불리우는 이러한 부류의 접착 수용체는 모든 세포상에 α및 β서브유니트를 갖는 이종이량체로서 발현된다. 이러한 인테그린중 하나인 α_vβ₃가 이러한 부류의 가장 광범위한 구성원이고 내피 세포가 광범위한 세포외 매트릭스 성분과 상호작용할 수 있도록 한다. 이러한 인테그린의 펩타이드 및 항체 길항제가 증식하는 혈관 내피 세포의 아폽토시스를 선택적으로 억제하여 혈관 형성을 억제한다. 혈관 형성의 2개의 사이토킨 의존성 경로가 존재하고 명백한 혈관 세포 인테그린인 α_vβ₃ 및 α_vβ₅에 대한 이의 의존성에 의해 정의될 수 있다. 특히, 염기성 FGF- 및 VEGF- 유도된 혈관 형성이 인테그린 α_vβ₃ 및 α_vβ₅ 각각에 의존하는 것으로 보이는데 이것은 각각의 인테그린의 항체 길항제가 토끼 각막 및 병아리 융모막요막성 막(CAM) 모델에서 이들 혈관 형성 경로중 하나를 차단하기 때문이다. 모든 α_v 인테그린을 차단하는 펩타이드 길항제는 FGF- 및 VEGF-자극된 혈관 형성을 억제한다. 정상적인 사람 안구 혈관은 α_vβ₃ 및 α_vβ₅ 인테그린 중 어느 하나도 갖고 있지 않는 반면에 이들은 활성 신생 혈관 안구 질환을 앓는 환자의 조직에서 혈관상에 선택적으로 나타난다. 단지 α_vβ₃ 이 ARMD를 앓는 환자의 조직에서 계속적으로 관찰되는 반면에 α_vβ₃ 및 α_vβ₅ 둘다는 PDR을 앓는 환자의 조직에 존재한다. 전신 투여된 인테그린의 펩타이드 길항제는 망막 혈관 형성의 마우스 모델에서 새로운 혈관 형성을 차단한다.

따라서, 혈관 형성 억제제는 이들 영양 및 성장 인자의 손상 효과를 차단하여 망막 퇴화를 치료하는 역할을 수행한다. 혈관 형성제는 또한 세포로 혈류를 증 가시켜 망막 퇴화를 지연시킴으로써 목적하는 혈관 형성을 촉진시키는 역할을 갖는다.

발명의 요약

천연에 존재하는 것 보다 짧은 트립토파닐-tRNA 신세타제 유래 폴리펩타이드는 케모킨 활성을 갖고 연구, 진단, 예후 및 치료학적 응용을 위해 유용하다. 한 양태에서, 이들 tRNA 신세타제 유래 폴리펩타이드는 혈관 내피 세포 기능을 조절하는데 유용하고 특히, 혈관 형성, 특히, 안구 혈관 신생을 억제하는데 유용하다.

이들 절두된 트립토파닐-tRNA 신세타제 유래 폴리펩타이드는 아미노 말단이 절두되어 있지만 로스만 폴드 뉴클레오타이드 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이들 폴리펩타이드는 혈관 내피 세포 기능을 조절할 수 있다.

바람직한 절두된 트립토파닐-tRNA 신세타제 유래 폴리펩타이드는 필수적으로 서열번호 1의 아미노산 잔기 94 내지 471로 이루어진 폴리펩타이드 및 이의 혈관 형성 억제 단편, 특히, 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타낸 시그네이쳐(signature) 서열에 의해 괄호로 된 단편을 포함하거나 이들 시그네이쳐 서열의 하나 이상을 포함한다. 하나의 바람직한 양태에서, 절두된 tRNA 신세타제 폴리펩타이드는 포유동물 기원이고 보다 바람직하게는 사람 기원이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 6의 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화 할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 7의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 7의 폴리펩타이드 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호 7의 폴리펩타이드 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화 할 수 있는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드의 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명은 또한, 상기 언급된 트립토파닐-tRNA 신세타제 유래 폴리펩타이드중 하나를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 또 다른 양태는 당해 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명은 추가로, 약제학적으로 적합한 부형제와 함께 절두된 트립토파닐-tRNA 신세타제 유래 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 및 투여 형태를 제공한다. 당해 조성물은 안내, 예를 들어, 유리체내 또는 망막하 및 전신 투여, 예를 들어, 경피적, 점막내, 장관 또는 비경구 투여를 위해 적합하다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 노인성 황반 변성, 당뇨의 안구 합병증, 신생혈관 녹내장, 미성숙 망막증, 각막염, 허혈, 망막증(예: 겸상 혈구), 병리학적 근시, 안구 히스토플라스모증, 군날개, 퓨니테이트 내부 맥락막병증등과 같은 혈관 신생 안구 질환을 적합한 생리학적으로 허용되는 부형제 또는 담체와 함께 혈관 형성 억제량의 폴리펩타이드를 투여하여 치료하는 방법을 제공한다.

도 1은 절두된 형태(서열번호 1의 아미노산 잔기 94 내지 471)내에 포함된 박스로 나타낸 시그네이쳐 서열(서열번호 10 및 서열번호 11)을 갖는 트립토파닐-tRNA 신세타제 폴리펩타이드(서열번호 1)의 아미노산 잔기 서열을 보여준다.

도 2는 마우스 모델에서 망막 혈관 발달을 보여주는 광학현미경 사진이다.

도 3은 하기 실시예 3에서 보고된 데이타를 그래프로 나타낸 것이다.

도 4는 하기 실시예 4에서 보고된 데이타를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5는 마우스 모델에서 망막에서 TrpRS(T2)의 단편의 결합 위치를 설명하는 광학현미경 사진이다.

정의

"절두된 tRNA 신세타제 폴리펩타이드" 는 상응하는 전장 tRNA 신세타제보다 짧은 폴리펩타이드를 의미한다.

"TrpRS"는 트립토파닐-tRNA 신세타제를 의미한다.

"세포 배양물"은 배양 배지 및 배양된 세포 둘다를 포함한다.

"세포 배양물로부터 폴리펩타이드의 분리"라는 문장은 배양 배지로부터 가용성 또는 분비된 폴리펩타이드를 분리시키는 것 뿐만 아니라 배양된 세포로부터 통합 막 단백질을 분리시킴을 포함한다.

"세포 추출물"은 특히, 세포가 제거된 배양 배지를 포함한다. 목적하는 DNA 또는 단백질을 포함하는 세포 추출물은 단백질을 발현하거나 목적하는 DNA를 포함하는 세포로부터 수득된 파쇄 제제 또는 무세포 제제를 의미하는 것으로 이해되어 야 한다.

"플라스미드"는 자발적 자기 복제 염색체외 DNA 분자이고 대문자 및/또는 숫자 앞 및/또는 뒤에 소문자 "p"로 명명된다. 본원에서 출발 플라스미드는 비제한적으로 상업적으로 시판되어 이용 가능하거나 공개된 과정에 따라 유용한 플라스미드로부터 작제될 수 있다. 추가로, 기술된 것과 동등한 플라스미드는 당해 기술 분야에 공지되어 있고 통상적인 기술자에게 명백할 것이다.

DNA의 "분해"는 DNA의 특정 서열에만 작용하는 제한 효소로 DNA를 촉매적으로 절두하는 것을 언급한다. 본원에 사용되는 다양한 제한 효소가 시판되고 있고 이들의 반응 조건, 조인자 및 또 다른 요건은 통상적인 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이 사용된다. 분석 목적을 위해, 전형적으로 플라스미드 또는 DNA 단편 1㎍이 완충액 약 20㎕에서 효소 2유니트와 함께 사용된다. 플라스미드 작제를 위해 DNA 단편을 분리할 목적으로 전형적으로 DNA 5 내지 50㎍을 보다 큰 용량으로 효소 20 내지 250 유니트를 사용하여 분해한다. 특정 제한 효소를 위해 적합한 완충액 및 기질 양은 제조업자가 명시하고 있다. 37℃에서 약 1시간의 배양 시간이 통상적으로 사용되지만 공급업자의 지침에 따라 다양할 수 있다. 분해 후, 반응물을 직접 폴리-아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켜 목적하는 단편을 분리한다. 다양한 DNA 및 RNA 단편에 존재하는 뉴클레오타이드는 본원에서 당해 기술분야에 사용되는 표준 1문자 표기(A, T, C, G, U)로 명명한다.

본 발명을 구현하는 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있고 DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있고 일본쇄는 암호화 쇄이거나 비암호화(안티센스) 쇄일 수 있다. 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열은 서열번호 6에 나타낸 암호화 서열과 동일할 수 있거나 암호화 코드의 중복성 또는 축퇴성의 결과로서 서열번호 7에 나타낸 성숙한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 상이한 암호화 서열일 수 있다.

용어 "폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드"는 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 추가의 암호화 및/또는 비암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

"올리고뉴클레오타이드"는 화학적으로 합성될 수 있는 일본쇄 폴리뉴클레오타이드 또는 2개의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 쇄 중 하나를 언급한다. 상기 합성 올리고뉴클레오타이드는 5'-포스페이트를 갖지 않아 키나제의 존재하에 ATP에 의해 포스페이트를 첨가하지 않고서는 또 다른 올리고뉴클레오타이드에 연결되지 않을 것이다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 탈인산화되지 않은 단편에 연결된다.

"아미노산 잔기"는 폴리펩타이드의 구성 성분인 아미노산을 언급한다. 본원에 기술된 아미노산 잔기는 바람직하게 L-이성체 형태이다. 그러나, D 이성체 형태중의 잔기는 목적하는 기능적 특성이 폴리펩타이드에 보유되는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 대체될 수 있다. NH₂ 는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노 그룹을 언급한다. COOH는 폴리펩타이드의 카복실 말단에 존재하는 유리 카복시 그룹을 언급한다. 문헌[참조: J. Biol. Chem., 243:3552-59(1969)]에 기재되고 37 C.F.R §§1.821 -1.822에 채택된 표준 폴리펩타이드 용어 체계를 준수하여 아미노산 잔기의 약어는 하기의 표 1(상응관계 표)에 나타낸다.

기호
1문자	3문자	아미노산
Y	Tyr	티로신
G	Gly	글라이신
F	Phe	페닐알라닌
M	Met	메티오닌
A	Ala	알라닌
S	Ser	세린
I	Ile	이소류신
L	Leu	류신
T	Thr	트레오닌
V	Val	발린
P	Pro	프롤린
K	Lys	라이신
H	His	히스티딘
Q	Gln	글루타민
E	Glu	글루탐산
Z	Glx	Glu 및/또는 Gln
W	Trp	트립토판
R	Arg	아르기닌
D	Asp	아스파르트산
N	Asn	아스파라긴
B	Asx	Asn 및/또는 Asp
C	Cys	시스테인
X	Xaa	미정 또는 기타

화학식으로 본원에 나타낸 모든 아미노산 잔기는 아미노 말단에서 카복실 말단의 통상적인 방향으로 왼쪽에서 오른쪽의 배향을 갖는다. 추가로, "아미노산 잔기"란 것은 포괄적으로, 표 1에 열거된 아미노산 뿐만 아니라 본원에 참조로서 인용된 37 C.F.R. §§1.821-1.822에서 언급된 바와 같은 변형된 희귀 아미노산을 포함하는 것으로 정의된다. 아미노산 잔기 서열의 처음 또는 말단에 대시(dash) 기호는 펩타이드가 추가 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 NH₂와 같은 아미노 말단 그룹 또는 COOH와 같은 카복실 말단 그룹에 결합됨을 지적한다.

펩타이드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존성 치환은 당해 기술 분 야의 기술자에게 공지되어 있고 일반적으로 치환되어 수득한 분자의 생물학적 활성을 변화시키지 않는다. 당해 기술 분야의 기술자는 일반적으로, 폴리펩타이드의 비필수 영역에서 단일 아미노산 치환이 실질적으로 생물학적 활성을 변화시키지 않는다는 것을 인지하고 있다[문헌참조: Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224].

당해 치환은 바람직하게 하기된 표 2에 제시된 것에 따라 수행한다.

본래의 잔기	보존성 치환
Ala(A)	Gly; Ser
Arg(R)	Lys
Asn(N)	Gln;His
Cys(C)	Ser
Gln(Q)	Asn
Glu(E)	Asp
Gly(G)	Ala;Pro
His(H)	Asn;Gln
Ile(I)	Leu;Val
Leu(L)	Ile;Val
Lys(K)	Arg;Gln;Glu
Met(M)	Leu;Tyr;Ile
Phe(F)	Met;Leu;Tyr
Ser(S)	Thr
Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr
Tyr(Y)	Trp;Phe
Val(V)	Ile;Leu

또한 또 다른 치환이 허용될 수 있고 경험적으로 또는 공지된 보존성 치환에 따라 결정될 수 있다.

"보충 플라스미드"는 세포 게놈의 염색체로의 안정한 통합을 위해 핵산을 팩키징 세포주로 전달하는 플라스미드 벡터를 기술한다.

"전달 플라스미드"는 치료학적 유전자 또는 치료학적 생성물 또는 이의 전구체를 암호화하는 유전자 또는 조절 유전자 또는 생체내에서 또는 세포주(예를 들 어, 팩키징 세포주로 제한되지 않음)로 전달되는 경우 치료 효과를 나타내는 치료학적 바이러스 벡터를 증폭시키는 또 다른 인자를 암호화하는 핵산을 이동시키거나 전달하는 플라스미드 벡터이다.

다양한 벡터가 본원에 기술되어 있다. 예를 들어, 하나의 벡터가 염색체로의 안정을 통합을 위해 특정 핵산 분자를 팩키징 세포주로 전달하는데 사용된다. 이들 유형의 벡터는 일반적으로 보충 플라스미드로서 본원에서 확인된다. 본원에 기술된 추가 유형의 벡터는 치료학적 바이러스 벡터를 증폭시킬 목적으로 세포주에서 또는 세포주(예를 들어, 팩키징 세포주)로 핵산 분자를 이동시키거나 전달한다. 따라서, 이들 벡터는 일반적으로 본원에서 전달 플라스미드로서 언급된다. 본원에 기술된 3번째 유형의 벡터는 치료학적 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 조절 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 이동시키거나 치료를 목적으로 환자의 특정 세포 또는 세포 유형으로 조절 서열을 이동시키는데 사용된다. 이들 벡터는 일반적으로 본원에서 치료학적 바이러스 벡터 또는 재조합 아데노바이러스 벡터 또는 바이러스 Ad-유래 벡터로서 확인되고 치료학적 유전자의 발현을 위해 발현 카세트를 포함하는 바이러스 핵산을 포집하는 바이러스 입자 형태이다.

"DNA 또는 핵산 동족체"는 치료학적 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 같은예비 선택된 보존된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 언급한다. "실질적으로 상동성"이란 용어는 80% 이상. 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 상동성을 나타내거나 상동성 또는 동일성 %가 낮지만 보존된 생물학적 활성 또는 기능을 갖는 것을 의미한다.

"상동성" 및 "동일성"이란 용어는 흔히 상호 혼용되어 사용된다. 이러한 관점에서, 상동성 또는 동일성 정도가 예를 들어, GAP 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교하여 결정될 수 있다. GAP 프로그램은 스미쓰(Smith) 및 워터맨(Waterman)[문헌참조: Adv. Appl. Math. 2:482(1981)]에 의해 고안된 바와 같이 니들맨(Needleman) 및 운슈(Wunsch)[문헌참조: J. Mol. Biol. 48:443(1970)]의 정렬 방법을 사용한다. 간략하게, GAP 프로그램은 유사한 정렬된 기호(즉, 뉴클레오타이드 또는 아미노산)의 수를 2개의 서열중 보다 짧은 서열의 총 수의 기호로 나누어 유사성을 정의한다. GAP 프로그램에 대해 바람직한 불이행 계수는 (1) 문헌[참조: Schwartz and Dayhoff, eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)]에 기술된 바와 같이, 단일체의 비교 매트릭스(동일한 것에 1의 값이 주어지고 동일하지 않은 것에 대해 0의 값이 주어진다) 및 문헌[참조: Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745(1986)]의 가중치 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대해 3.0의 페널티 및 각각의 갭에서 각각의 기호에 대해 추가로 0.10 페널티 및 (3) 말단 갭에 대해서는 페널티 없음을 포함할 수 있다. 임의의 2개의 핵산 분자가 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 뉴클레오타이드 서열을 갖는지의 여부는 예를 들어, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)]에서의 불이행 계수를 사용하는 "FAST A" 프로그램과 같은 공지된 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 생물공학 국립 센터의 정보 데이타베이스의 BLAST 기능을 사용하여 동일성을 결정할 수 있다. 일반적으로, 서열은 고도의 매치가 수득될 수 있도록 정렬된다. "동일성" 자체는 당해 기술분야에서 인지되는 의미이고 공개된 기술을 사용하여 계산될 수 있다[문헌참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D.W., ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey,(1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, (1987); and Gribskov, M. and Devereux, J., eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991)]. 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열간의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법이 존재하고 용어 "동일성"은 당해 기술자에게 널리 공지되어 있다[문헌참조: Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073(1988)]. 2개의 서열간에 동일성 또는 유사성을 결정하는데 공통적으로 사용되는 방법은 문헌[참조: Martin J. Bishop, ed., Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994), and Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073(1988)]에 기재된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 동일성 및 유사성을 측정하기 위한 방법은 컴퓨터 프로그램에 암호화되어 있다. 2개의 서열간의 동일성 및 유사성을 측정하기 위해 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지[문헌참조: Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)], BLASTP, BLASTN, FASTA[문헌참조: Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403(1990)]를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

"동일성"이란 용어는 시험 및 표준 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드간의 비교를 나타낸다. 예를 들어, 시험 폴리펩타이드는 표준 폴리펩타이드와 90% 이상 동일한 임의의 폴리펩타이드로서 정의될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "90% 이상 동일한"이라는 용어는 표준 폴리펩타이드와 비교하여 90 내지 99.99%의 % 상동성을 언급한다. 90% 이상 수준의 동일성은 예시 목적을 위해 추정하면서 100개의 아미노산 길이의 시험 및 표준 폴리뉴클레오타이드를 비교한다는 사실을 암시한다. 시험 폴리펩타이드내 10%(즉, 100개중 10개) 이하의 아미노산이 표준 폴리펩타이드의 아미노산과 상이하다. 시험 폴리뉴클레오타이드와 표준 폴리뉴클레오타이드를 유사하게 비교할 수 있다. 당해 차이점은 아미노산 서열의 전체 길이에 무작위로 분포된 점 돌연변이로서 나타나거나 이들은 최대 허용 범위(예를 들어, 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)) 이하의 다양한 길이에서 하나 이상의 위치에 집중될 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환 또는 결실로서 정의된다.

"유전자 치료" 및 "유전학적 치료"라는 용어는 치료가 요구되는 장애 또는 증상을 앓는 포유동물, 특히 사람의 특정 세포, 표적 세포에 이종성 DNA를 전달함을 언급한다. DNA는 이종성 DNA가 발현되고 이에 의해 암호화된 치료학적 생성물이 제조될 수 있는 방식으로 선택된 표적 세포에 도입된다. 또한, 이종성 DNA는 몇몇 방식에서 치료학적 생성물을 암호화하는 DNA의 발현을 매개할 수 있고 이것은 몇몇 방식으로 직간접적으로 치료학적 생성물의 발현을 매개하는 펩타이드 또는 RNA와 같은 생성물을 암호화할 수 있다. 유전학적 치료는 또한, 유전자 생성물을 암호화하는 핵산이 결손 유전자를 대체하거나 당해 핵산이 도입되어지는 포유동물 또는 세포에 의해 생산되는 유전자 산물을 보충하도록 사용될 수 있다. 도입된 핵산은 정상적으로 포유동물 숙주에서 생산되지 않거나 치료학적으로 유용한 시점에 치료학적 유효량으로 생산되지 않는 치료학적 화합물(예를 들어, 성장인자 억제제) 또는 종양 괴사 인자 또는 이의 억제제(예를 들어, 이에 대한 수용체)를 암호화할 수 있다. 치료학적 생성물을 암호화하는 이종성 DNA는 관련 숙주의 세포로 도입하기 전에 변형되어 생성물 또는 이의 발현을 증진시키거나 변화시킬 수 있다.

"이종성 DNA"는 발현되는 세포에 의해 생체내에서 생성되지 않는 RNA 및 단백질을 암호화하는 DNA이거나 전사, 해독 또는 기타 조절성 생화학 과정에 영향을 주어 내인성 DNA의 발현을 변화시키는 매개체를 매개하거나 이를 암호화하는 DNA이다. 이종성 DNA는 또한 외래 DNA로서 언급될 수 있다. 당해 기술 분야의 기술자가 세포에 이종성이거나 외래 물질인 것으로 인지하거나 여기는 임의의 DNA가 이종성 DNA에 포함된다. 이종성 DNA의 예는 추적 마커 단백질(약제 내성을 부여하는 단백질)을 암호화하는 DNA, 치료학적으로 효과적인 물질(예를 들어, 항암제, 효소 및 호르몬)을 암호화하는 DNA 및 기타 유형의 단백질(예를 들어, 항체)을 암호화하는 DNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이종성 DNA에 의해 암호화된 항체는 이종성 DNA가 도입된 세포 표면상에 분비되거나 발현될 수 있다. 따라서, "이종성 DNA" 또는 "외래 DNA"는 상응하는 야생형 아데노바이러스에서 발견되는 대응 DNA 분자와 같이 정확한 배향 및 위치에 존재하지 않는 DNA 분자를 언급한다. 또한 또 다른 유기체 또는 종(즉, 외인성) 또는 또 다른 Ad 혈청형 기원의 DNA 분자를 언급 할 수 있다.

"치료학적으로 효과적인 DNA 생성물"은 이종성 DNA에 의해 암호화되는 생성물로서 숙주로 DNA가 도입되는 즉시, 증상 또는 선천성 또는 후천성 질환의 발병을 효과적으로 완화시키거나 제거하는 생성물 또는 당해 질환을 치료하는 생성물이다. 전형적으로, 목적하는 이종성 DNA를 암호화하는 DNA는 플라스미드 벡터로 클로닝되고 통상적인 방법, 예를 들어, 칼슘-포스페이트 매개 DNA 흡수 또는 미세주사에 의해 생산자 세포(예를 들어, 팩키징 세포)로 도입된다. 생산자 세포에서 증폭시킨 후, 이종성 DNA를 포함하는 벡터는 선택된 표적 세포에 도입된다.

"발현 또는 전달 벡터"는 외래 또는 이종성 DNA가 적합한 숙주 세포에서 발현을 위해 삽입될 수 있는 임의의 플라스미드 또는 바이러스를 언급하고 즉, DNA에 의해 암호화된 단백질 또는 폴리펩타이드는 숙주 세포계에서 합성된다. 하나 이상의 단백질을 암호화하는 DNA 절편(유전자)의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 언급된다. 또한 역전사 효소를 사용하여 mRNA로부터 제조되는 cDNA(상보성 DNA)의 클로닝을 허용하는 벡터가 포함된다.

"유전자"는 이의 뉴클레오타이드 서열이 RNA 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자이다. 유전자는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 유전자는 암호화 영역에 선행하거나 뒤에 있는 영역(리더 및 트레일러) 뿐만 아니라 각각의 암호화 절편(엑손)사이에 삽입되어 있는 서열(인트론)을 포함할 수 있다.

핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 기타 생분자와 관련하여 "분리된"이란 용어는 핵산 또는 폴리펩타이드가 유전학적 환경으로부터 분리되어 폴리펩타이드 또는 핵 산이 수득되었음을 의미한다. 이것은 또한 천연 상태로부터 변형된 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 용어가 본원에 사용된 바와 같이, 생존 동물에 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "분리된"이 아니고 이의 천연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "분리된"이다. 따라서, 재조합 숙주 세포내에서 생성되고/되거나 포함되는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 분리된 것으로서 간주된다. 또한, "분리된 폴리펩타이드" 또는 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 재조합 숙주 세포 또는 천연 공급원으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 예를 들어, 재조합적으로 생성된 화합물은 실질적으로 문헌[참조: Smith and Johnson, Gene 67:31-40(1988)]에 기재된 1단계 방법에 의해 정제될 수 있다. "분리된" 및 "정제된"이란 용어는 흔히 상호 혼용되어 사용된다. 당해 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있고 당해 벡터 또는 조성물이 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 분리된 것이다.

"분리된 폴리뉴클레오타이드"는 유기체에 천연적으로 존재하는 게놈에서 목적하는 핵산을 암호화하는 유전자의 양쪽에 바로 존재하는 유전자(임의의 경우)의 암호화 서열이 없음을 의미한다. 분리된 DNA는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고 게놈 DNA, cDNA, 재조합 하이브리드 DNA 또는 합성 DNA일 수 있다. 천연 DNA 서열과 동일할 수 있거나 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 첨가 또는 치환에 의해 당해 서열과 상이할 수 있다.

생물학적 세포 또는 숙주로부터 제조된 제제를 언급하는 바와 같이 "분리된" 또는 "정제된"은 목적하는 DNA 또는 단백질의 조 추출물을 포함하는 당해 DNA 또는 단백질을 포함하는 임의의 세포 추출물을 의미한다. 예를 들어, 단백질의 경우에, 정제된 제제는 별개의 기술 또는 일련의 제조 기술 또는 생화학적 기술에 따라 수득될 수 있고 목적하는 DNA 또는 단백질은 이들 제제중에 다양한 순도로 존재할 수 있다. 당해 과정은 예를 들어, 황산암모늄 분획, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 밀도 구배 원심분리 및 전기영동을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

"실질적으로 순수한" 또는 "분리된" DNA 또는 단백질의 제제는 당해 DNA 또는 단백질이 통상적으로 천연에서 연합되어 있는 천연적으로 존재하는 물질로부터 분리된 제제임을 의미한다. "필수적으로 순수한"이란 용어는 목적하는 DNA 또는 단백질을 95% 이상 포함하는 "고도로"로 정제된 제제를 의미하는 것으로 이해되어야만 한다.

"팩키징 세포주"는 결실 유전자 생성물 또는 이의 등가물을 제공하는 세포주이다.

"아데노바이러스 바이러스성 입자"는 바이러스의 구조적 또는 기능적 최소 단위이다. 바이러스는 단일 입자, 입자의 스톡 또는 바이러스 게놈을 언급할 수 있다. 아데노바이러스(Ad) 입자는 비교적 복잡하고 다양한 하부 구조로 분리될 수 있다.

"전사 후 조절 요소(PRE)"는 스플라이싱되지 않는, 즉 인트론이 없는 바이러 스 또는 세포 전령 RNA에서 발견되는 조절 요소이다. 이의 예는 사람 간염 바이러스, 우드척 간염 바이러스, TK 유전자 및 마우스 히스톤 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. PRE는 폴리 A 서열 앞에 이종성 DNA 서열 뒤에 위치할 수 있다.

"슈도타이핑"은 변형된 캡시드 단백질 또는 벡터 그 자체의 혈청형과는 상이한 혈청형 기원의 캡시드 단백질을 갖는 아데노바이러스 벡터의 제조를 기술한다. 한 예는 Ad37 섬유 단백질을 포함하는 아데노바이러스 5 벡터 입자의 제조이다. 이것은 상이한 섬유 단백질을 발현하는 팩키징 세포주에서 아데노바이러스 벡터를 제조하여 성취될 수 있다.

"본원에서 목적하는 프로모터"는 유도성이거나 항상성일 수 있다. 유도성 프로모터는 추가의 분자가 존재하는 경우만이 전사를 개시하고 항상성 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 임의의 추가의 분자를 요구하지 않는다. 조절성 또는 유도성 프로모터는 또한 RNA 폴리머라제 결합율 또는 결합 정도 및 개시율 또는 개시 정도가 외부 자극에 의해 조절되는 프로모터로서 기술될 수 있다. 당해 자극은 다양한 화합물 또는 조성물, 광, 열, 스트레스 및 화학적 에너지 공급원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유도성, 억제성 및 억압성 프로모터는 조절성 프로모터로서 간주된다. 본원에서 바람직한 프로모터는 안구 세포, 특히, 광수용체 세포에서 선택적으로 발현되는 프로모터이다.

"수용체"는 또 다른 분자와 특이적으로 결합하는 생물학적으로 활성인 분자를 언급한다. "수용체 단백질"이라는 용어는 보다 특이적으로 특이적 수용체의 단백질 특성을 지적하는데 사용될 수 있다.

"재조합"은 유전자 가공 결과로서 형성된 임의의 소산물을 언급한다. 이것은 또한 팩키징 세포에서 플라스미드의 재조합에 의해 형성된 바이러스를 기술하는데 사용될 수 있다.

"형질전환 유전자" 또는 치료학적 핵산 분자"는 RNA 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 및 RNA 분자를 포함한다. 당해 분자는 "고유" 또는 천연 유래 서열일 수 있다. 이들은 또한 쳔연적으로 또는 재조합적으로 유래된 "비-고유" 또는 "외래" 기원일 수 있다. 본원에서 용어 "치료학적 핵산 분자"와 상호 혼용되어 사용될 수 있는 용어 "형질전환 유전자"는 흔히 바이러스 벡터에 의해 전달되고 숙주 세포로 형질도입되는 이종성 또는 외래(외인성) 유전자를 기술하는데 사용된다. 치료학적 뉴클레오타이드 핵산 분자는 안티센스 서열 또는 안티센스 서열로 전사될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 치료학적 뉴클레오타이드 서열(또는 형질전환 유전자) 모두는 당해 치료학적 서열이 전달된 세포 또는 세포 핵에서 목적하는 효과를 나타내도록 작용하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 치료학적 핵산 분자는 작용성 단백질을 생산할 수 없는 세포로 전달될 작용성 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함할 수 있다.

"안구의 유리체"는 안구의 렌즈 후면의 공간을 채우는 물질(즉, 유리체액 또는 유리체)을 언급한다.

"프로모터 영역"은 작동적으로 연결된 DNA의 전사를 조절하는 유전자의 DNA의 일부를 언급한다. 프로모터 영역은 RNA 폴리머라제 인식, 결합 및 전사 개시를 위해 충분한 특정 서열의 DNA를 포함한다. 프로모터 영역의 당해 부위는 프로모터 로서 언급된다. 추가로, 프로모터 영역은 RNA 폴리머라제의 당해 인식, 결합 및 전사 개시 활성을 조절하는 서열을 포함한다. 이들 서열은 시스 작용일 수 있거나 트랜스 작용 인자에 응답할 수 있다. 조절 특성에 의존하여 프로모터는 항상성이거나 조절될 수 있다.

"작동적으로 연결된"은 서열 또는 절편이 일본쇄 또는 이본쇄 형태이든지 간에 하나의 절편 조절 발현 또는 복제를 조절하거나 또 다른 절편을 조절하기 위해 한 조각의 DNA에 공유적으로 결합되어 있음을 의미한다. 그러나 2개의 절편이 반드시 연속적이지는 않다.

"팩키지"는 유리, 플라스틱(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리카보네이트), 종이, 박편과 같은 고형 매트릭스 또는 고정된 범위 내에서 본 발명의 폴리펩타이드, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 유지할 수 있는 물질을 언급한다. 따라서, 예를 들어, 팩키지는 의도된 폴리펩타이드의 밀리그람의 양을 함유하는데 사용되는 유리 바이엘일 수 있거나 의도된 폴리펩타이드 또는 항체의 마이크로그람의 양이 작동적으로 고정되어(즉, 연결된) 항체 또는 항원 각각에 면역학적으로 결합될 수 있도록 하는 미세역가 플레이트일 수 있다.

"사용을 위한 지침"은 전형적으로 시약 농도 또는, 예를 들어, 시약의 상대적 양 및 혼합될 샘플, 시약/샘플 혼합물의 유지 시간, 온도 및 완충액 조건등과 같은 하나 이상의 분석 방법 계수를 기술하는 중요한 표현을 포함한다.

본 발명에서의 "진단 시스템"은 또한 표지를 포함하거나 본 발명의 폴리펩타이드 또는 항체 분자를 포함하는 면역복합체의 형성에 대한 신호를 전달할 수 있는 지시 수단을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "복합체"는 항체-항원 또는 수용체-리간드 반응과 같은 특이적 결합 반응의 생성물을 언급한다. 복합체의 예는 면역반응 생성물이다.

다양한 문법적인 형태로 "표지" 및 "지시 수단"은 직간접적으로 검출 가능한 시그날을 생성하는데 관여하여 복합체의 존재를 지시하는 단일 원자 및 분자를 언급한다. 임의의 표지 또는 지시 수단은 발현된 단백질, 폴리펩타이드 또는 본 발명의 항체 또는 모노클로날 항체 조성물의 일부이거나 별도로 사용되는 항체 분자에 연결되거나 이에 혼입될 수 있고 이들 원자 또는 분자는 단독으로 또는 추가의 시약과 연계하여 사용될 수 있다. 당해 표지 자체는 임상적 진단 화학에서 널리 공지된 것이고 이들이 신규 단백질 방법 및/또는 시스템과 함께 사용되는 경우만이 본 발명의 일부를 구성한다.

검토

서열번호 1의 아미노산 잔기 94 내지 471로서 도 1에 나타낸 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 12) 뿐만 아니라 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 6의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 본 발명의 일부를 구성한다. 당해 폴리펩타이드의 변이체 뿐만 아니라 본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드의 변이체를 포함한다. 포함된 폴리뉴클레오타이드 변이체는 폴리뉴클레오타이드의 천연적으로 존재하는 대립형질 변이체 또는 폴리뉴클레오타이드의 비 천연적으로 존재하는 변이체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 7, 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 동일한 폴리펩타이드 및 서열번호 6의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 변이체가 서열번호 7 및 서열번호 12의 폴리펩타이드의 혈관 형성 억제 단편, 유도체 또는 유사체를 암호화하는 당해 폴리뉴클레오타이드의 변이체를 포함한다. 당해 뉴클레오타이드 변이체는 결실 변이체, 치환 변이체 및 부가 또는 삽입 변이체를 포함한다.

상기 지적된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6에 나타낸 암호화 서열의 천연적으로 존재하는 대립형질 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 대립형질 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실 또는 부가되었지만 암호화된 폴리펩타이드의 기능이 실질적으로 변화하지 않은 폴리뉴클레오타이드의 반복 형태이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 T1은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 His₆ 태그된 폴리펩타이드 둘다를 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 T2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 His₆ 태그된 폴리펩타이드 둘 다를 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 TrpRS는 서열번호 1의 잔기 1 내지 471의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 His₆ 태그된 폴리펩타이드 둘다를 언급한다.

본 발명은 또한 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열이 동일한 판독 프 레임에서 숙주 세포로부터 폴리펩타이드의 발현 및 분비를 도와주는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 세로부터 폴리펩타이드의 수송을 조절하기 위한 분비 서열로서 작용하는 리더 서열에 융합될 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩타이드는 전구단백질이고 숙주 세포에 의해 절단되어 성숙한 형태의 폴리펩타이드를 형성하는 리더 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 성숙한 단백질 및 추가의 5' 아미노산 잔기를 갖는 전구단백질을 암호화할 수 있다. 프로서열을 갖는 성숙한 단백질은 프로단백질이고 단백질의 불활성 형태이다. 일단 프로서열이 절단되는 즉시 성숙한 단백질은 활성이 된다.

따라서, 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 성숙한 단백질 또는 프로서열을 갖는 단백질 또는 프로서열 및 전구서열(리더 서열) 둘다를 갖는 단백질을 암호화 할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 또한 프레임내에 마커 서열과 융합되어 본 발명의 폴리펩타이드가 정제될 수 있도록 하는 암호화 서열을 가질 수 있다. 마커 서열은 세균 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙한 폴리펩타이드의 정제를 위해 제공되는 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나 예를 들어, 마커 서열은 포유동물 숙주, 예를 들어, COS-7 세포가 사용되는 경우 혈구응집소(HA) 태그일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 혈구응집소 단백질 기원의 에피토프에 상응한다[문헌참조: Wilson, I., et al., Cell, 37:767(1984)].

본 발명은 추가로 서열간에 50% 이상 및 바람직하게는 70% 이상의 동일성이 존재하는 경우, 상기된 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 엄중 조건하에서 상기된 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화 하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "엄중 조건"은 서열간에 95% 이상 및 바람직하게는 97% 이상의 동일성이 존재하는 경우만이 하이브리드화가 일어남을 의미한다. 바람직한 양태에서 상기된 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 생물학적 작용 또는 활성을 보유한 폴리펩타이드를 암호화한다.

서열번호 7, 서열번호 12의 폴리펩타이드 또는 서열번호 6의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 언급하는 경우, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 당해 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 혈관 형성 억제(즉, 혈관 형성을 억제하는) 기능 또는 활성을 보유한 폴리펩타이드 부위를 의미한다. 따라서, "유사체"는 프로단백질의 일부가 절단되어 혈관 형성 억제 활성의 성숙한 폴리펩타이드가 생성됨으로써 활성화될 수 있는 프로단백질을 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드, 천연 폴리펩타이드 또는 합성 폴리펩타이드, 바람직하게는 재조합 폴리펩타이드일 수 있다.

서열번호 7, 서열번호 12의 폴리펩타이드 또는 서열번호 6의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 혈관 형성 억제 단편, 유도체 또는 유사체가 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존성 또는 비 보존성 아미노산 잔기(바람직하게는 보존성 아미노산 잔기)로 치환되고 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 암호화된 것이거나 아닐 수 있거나 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 그룹을 포함하는 것이거나 (iii) 폴리펩타이드가 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 또 다른 화합물과 융합되는 것이거나 (iv) 추가의 아미노산이 리더 또는 분비 서열 또는 폴리펩타이드 또는 프로단백질 서열의 정제를 위해 사용되는 서열과 같은 폴리펩타이드에 융합되는 것일 수 있다. 당해 단편, 유도체 및 유사체는 본원의 교시로부터 당해 기술 분야의 범위내에 포함되는 것으로 간주된다.

본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 분리된 형태로 제공되고 바람직하게는 균일하게 정제된다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 일반적으로 본 발명의 벡터로 가공된 숙주 세포 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩타이드의 제법을 포함한다.

숙주 세포는 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터로 유전학적으로 가공(형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염)된다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 입자 및 파아지등의 형태일 수 있다. 가공된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키고 형질전환체를 선별하거나 tRNA 신세타제 폴리펩타이드 유전자를 증폭시키는데 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에 배양될 수 있다. 온도 및 pH등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 사용된 조건이고 당해 기술 분야의 통상적인 기술자에게 명백할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 기술에 의해 상응하는 폴리펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 서열은 다양한 발현 비히클, 특히, 폴리펩타이드 발현용 벡터 또는 플라스미드중 어느 하나에 포함될 수 있다. 당해 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, 예를 들어, SV40의 유도체, 세균 플라스미드, 파아지 DNA, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파아지 DNA의 조합체 기원의 벡터, 바이러스 DNA(예를 들어, 우두, 아데노바이러스, 수두 바이러스 및 슈도랍비)를 포함한다. 바람직한 벡터는 pET20b이다. 그러나, 임의의 또 다른 플라스미드 또는 벡터가 숙주에서 복제가능하고 생존가능한한 사용될 수 있다.

상기된 바와 같이, 적절한 DNA 서열이 다양한 방법에 의해 벡터로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위로 삽입될 수 있다. 당해 방법 및 기타 방법이 당해 기술 분야의 범주내에 속하는 것으로 간주된다.

발현 벡터내 DNA 서열은 적절한 발현 조절 서열(프로모터) 등에 작동적으로 연결되어 mRNA 합성을 지시한다. 당해 프로모터의 대표적인 예는 LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜리 lac 또는 trp 프로모터, 파아지 람다 P_L 프로모터 및 원핵세포 또는 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스내 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 프로모터를 포함한다. 발현 벡터는 또한 해독 개시 및 전사 종결을 위한 리보솜 결합 부위를 포함한다. 벡터는 또한 발현을 증폭시키는데 적합한 서열을 포함할 수 있다.

추가로, 발현 벡터는 바람직하게 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위해 표현형 특성을 제공하는 유전자(예를 들어, 진핵 세포 배양의 경우 디하이드로포레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성 또는 이 콜리에서의 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성)를 포함한다.

상기된 바와 같이 본원의 적절한 DNA 서열 뿐만 아니라 적절한 프로모터 또는 조절 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 적절한 숙주를 형질전환시킴으로써 단백질을 발현시킬 수 있다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 세균 세포(예를 들어, 이. 콜리(E. coli), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 진균 세포(예를 들어, 효모), 곤충 세포(예를 들어, 초파리 및 Sf9), 동물세포(예를 들어, CHO, COS 또는 보웨스 흑색종) 및 식물 세포등을 포함한다. 적절한 숙주의 선별은 본원의 교시로부터 당해 기술 분야의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.

보다 특히, 본 발명은 또한 상기 광범위하게 기술된 바와 같이, 하나 이상의 서열을 포함하는 재조합 작제물을 포함한다. 작제물은 본 발명의 서열이 정배향 또는 역배향으로 삽입되는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 당해 양태의 바람직한 측면에서, 작제물은 추가로 예를 들어, 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당해 기술 분야의 기술자에게 공지되어 있고 시판되고 있다. 예를 들어, 하기의 벡터가 제공된다: 세균[pQE70, pQE-9(퀴아겐), pBs, 파아지스크립트, PsiX174, p블루스크립트 SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a(스트라타진), pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, PRIT5(파마시아)], 진핵 세포[pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG(스트라타진), pSVK3, pBPV, PMSG, pSVL(파마시아) 및 pET20B]. 하나의 바람직한 양태에서, 벡터는 pET20B이다. 그러나, 임의의 또 다른 플라스미드 또는 벡터가 이들이 숙주에서 복제가능하고 생존가능한한 사용될 수 있다.

프로모터 영역은 선별 가능한 마커를 갖는 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 기타 벡터를 사용하여 임의의 목적하는 유전자로부터 선별될 수 있다. 2개의 적절한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특히 명명된 세균 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P_R, PL 및 trp를 포함한다. 진핵 세포 프로모터는 CMV 이미디어트 어얼리(immediate early), HSV 티미딘 키나제, 어얼리 SV40 및 레이트(late) SV40, 레트로바이러스 기원의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I를 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선별은 당해 기술분야에 통상적인 기술 범위내에 있다.

추가의 양태에서, 본 발명은 상기된 작제물을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 고등 진핵 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 또는 하등 진핵 새포(예를 들어, 효모 세포)일 수 있거나 숙주 세포는 원핵 세포(예를 들어, 세균 세포)일 수 있다. 작제물의 숙주 세포로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 형질감염 또는 전기천공에 의해 수행될 수 있다[문헌참조: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, 1986].

숙주 세포내 작제물은 재조합 서열에 의해 암호화된 유전자 생성물을 생산하기 위한 통상적인 방식으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 통 상적인 펩타이드 합성기로 합성적으로 제조될 수 있다.

단백질은 적절한 프로모터의 조절하에 포유동물 세포, 효모, 세균 또는 기타 세포에서 발현될 수 있다. 무세포 해독 시스템은 또한 본 발명의 DNA 작제물 기원의 RNA를 사용하여 당해 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 원색 세포 및 진핵 세포 숙주와 함께 사용되는 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Sambrook. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에 기술되어 있다.

고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터로 삽입함에 의해 증진된다. 인핸서는 일반적으로 약 10 내지 약 300개 염기쌍의 DNA의 시스 작용 요소로서 프로모터에 작용하여 이의 전사를 증진시킨다. 이의 예는 복제 오리진(100 내지 270개 염기쌍)의 후반부상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 어얼리 프로모터 인핸서, 복제 오리진의 후반부상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 오리진, 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 선별 마커, 예를 들어, 이. 콜리 및 에스. 세레비지애 TRP1 유전자와 같은 앰피실린 내성 유전자 및 고도로 발현되는 유전자 기원의 프로모터를 포함하여 하부 구조 서열의 전사를 지시한다. 당해 프로모터는 무엇보다 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제 또는 열 쇼크 단백질과 같은 해당과정 효소를 암호화하는 오페론으로부터 유도될 수 있다. 이종성 구조 서열은 적당한 상으로 해독 개시 및 종결 서열 및 바람직하게는 해독된 단백질을 세포 주변 공간 또는 세포외 배지로 분비시킬 수 있는 리더 서열과 함께 어셈블리된다. 임의로, 이종성 서열은 예를 들어, 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제와 같은 목적하는 특성을 부여하는 N-말단 동정 펩타이드를 암호화할 수 있다.

적합한 숙주 균주를 형질전환시키고 숙주 균주를 적당한 세포 밀도로 성장시킨 후 선별된 프로모터를 적절한 수단(온도 전이 또는 화학적 유도)으로 탈억제하고 세포를 추가의 기간동안 배양한다.

통상적으로 세포는 원심분리로 수거하고 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파쇄하고 수득한 조 추출물을 추가의 정제를 위해 수득한다.

단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 해동-동결 반복, 초음파, 기계적 파쇄 또는 세포 용해제의 사용에 의해 파쇄될 수 있다.

다양한 포유동물 세포 배양 시스템이 또한 재조합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예는 문헌[참조: Gluzman, Cell, 23:175(1981)]에 기재된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주 및 양립 가능한 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예를 들어, C127, 3T3, CHO, Hela 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 오리진, 적합한 프로모터 및 인핸서 및 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 플랭킹 비전사 서열을 포함한다. SV40 바이러스 게놈 기원의 DNA 서열, 예를 들어, SV40 오리진, 어얼리 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여 요구되는 비전사 유전학적 요소를 제공할 수 있다.

폴리펩타이드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제된다. 정제 동안에 저농도의 칼슘 이온(약 0.1 내지 5mM)이 존재하는 것이 바람직하다[문헌참조: Price, et al., J. Biol. Chem., 244:917(1969)]. 단백질의 리폴딩 단계는 필요한 경우 성숙한 단백질의 구조 형성을 완수하는데 사용될 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계를 위해 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 천연적으로 정제된 생성물 또는 화학적 합성 과정의 생성물 또는 원핵세포 또는 진핵세포 숙주(예를 들어, 세균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포의 배양)로부터 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 생산 과정에서 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 포유동물 또는 기타 진핵 세포 탄수화물로 당화될 수 있거나 비 당화될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 당해 기술 분야에 공지된 수단에 의해 안정성을 개선시키고 이의 효능을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, L-아미노산은 D- 아미노산으로 대체될 수 있고 아미노 말단은 아세틸화되거나 카복실 말단 변형(예를 들어, 에틸아민 캡핑)될 수 있다[문헌참조: Dawson, D.W., et al., Mol. Pharmacol., 55:332-338(1999)].

본 발명의 폴리펩타이드는 또한 생체내 당해 폴리펩타이드의 발현에 의해 본 발명에 따라 유전자 치료요법으로서 사용될 수 있다.

본원에 교시된 바와 같이 유전자 치료를 위해 사용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아, 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 바람직하게 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스를 포함한다. 바람직하게, 레트로바이러스 벡터는 쥐 또는 조류 레트로바이러스의 유도체이거나 렌티바이러스성 벡터이다. 바람직한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스성 벡터이다. 단일 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스의 예는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMuLV), 하비 쥐 사코마 바이러스(HaMuSV), 쥐 포유동물 종양 바이러스(MuMTV), SIV, BIV, HIV 및 라우스 사코마 바이러스(RSV)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다수의 추가의 레트로바이러스 벡터가 다중 유전자를 도입할 수 있다. 이들 벡터 모두는 형질도입된 세포가 동정되고 제조될 수 있도록 선별 마커를 위한 유전자를 전달하거나 도입할 수 있다. 특정 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드를 암호화하는 또 다른 유전자와 함께 목적하는 아연 핑커 유래 DNA 결합 폴리펩타이드 서열을 바이러스 벡터로 삽입시킴에 의해 벡터가 표적 특이적이 되도록한다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들어, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 삽입시킴에 의해 표적 특이적이 될 수 있다. 바람직한 표적화는 레트로바이러스 벡터를 표적화하는 항체를 사용하여 수행된다. 당해 기술 분야의 기술자는 이러한 사실을 인지하고 있거나 레트로바이러스 게놈에 삽입되어 아연 핑거 뉴클레오타이드 결합 단백질 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적 전달을 허용할 수 있는 특이적 폴리뉴클레오타이드 서열을 과도한 실험 없이 용이하게 확인할 수 있다.

재조합 레트로바이러스는 결손되어 있기 때문에, 이들이 감염성 벡터 입자를 생산하기 위해서는 또 다른 도움이 필요하다. 이러한 원조는 예를 들어, LTR내에 조절 서열의 통제하에 모든 레트로바이러스의 구조 유전자를 암호화하는 플라스미드를 포함하는 헬퍼 세포주를 사용함에 의해 제공될 수 있다. 이들 플라스미드는 팩키징 기작이 포집을 위해 RNA 전사체를 인지할 수 있도록 하는 뉴클레오타이드 서열이 결실되어 있다. 팩키징 시그날이 결실된 헬퍼 세포주는 예를 들어, Ψ2, PA317 및 PA12를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 세포주는 어떠한 게놈도 팩키징되지 않기 때문에 속이 빈 비리온을 생산한다. 레트로바이러스 벡터가 팩키징 시그날이 온전한 세포로 도입되지만 구조 유전자가 목적하는 기타 유전자로 대체되는 경우, 벡터는 팩키징될 수 있고 벡터 비리온이 생산된다. 상기 방법에 의해 생산되는 벡터 비리온은 조직 세포주(예를 들어, NIH 3T3 세포)를 감염시켜 대량의 키메라 레트로바이러스 비리온을 생산하는데 사용될 수 있다.

아연 핑거 유래 DNA 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 또 다른 표적화된 전달 시스템은 콜로이드 분산 시스템이다. 콜로이드 분산 시스템은 거대 분자 복합체, 나노캅셀, 미소구, 비드 및 지질계 시스템(수중유 에멀젼, 마이셀, 혼합 마이셀 및 리포좀)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 콜로이드 시스템은 리포좀이다. 리포좀은 전달 비히클로서 시험관내 및 생체내에서 유용한 인공 막 비히클이다. 크기가 0.2 내지 4.0㎛ 범위인 거대한 단일층 비히클(LUV)은 다수의 거대 분자를 포함하는 상당한 비율의 수성 완충액을 포집할 수 있다. RNA, DNA 및 온전한 비리온이 수성인 내부에 포집될 수 있고 생물학적으로 활성인 형태로 세포로 전달될 수 있다[문헌참조: Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77(1981)]. 포유 동물 세포에 추가로, 리포좀은 식물, 효모 및 세균 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 전달을 위해 사용되어 왔다. 리포좀이 효율적인 유전자 전달 비히클이 되기 위해서는 하기의 특징이 충족되어야만 한다: (1) 이들의 생물학적 활성을 손상시키지 않으면서 고효율로 목적하는 유전자의 포집, (2) 비 표적 세포에 비해 표적 세포로의 우선적이고 실질적인 결합, (3) 비히클의 수성 내용물을 고효율로 표적 세포 세포질로의 전달 및 (4) 유전학적 정보의 정확하고 효과적인 발현[문헌참조: Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, (1988)].

리포좀의 조성은 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 배합된 인지질, 특히 고상 전이 온도 인지질의 배합물이다. 또 다른 인지질 또는 기타 지질이 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 의존한다.

리포좀 생산에 유용한 지질의 예는 포스파티딜 화합물(예를 들어, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로사이드 및 갱글리오사이드)을 포함한다. 특히, 디아실포스파티딜글리세롤이 유용하고 여기서 지질 잔기는 탄소수 14 내지 18이고 특히, 탄소수 16 내지 18이고 포화되어 있다. 예시적인 인지질은 계란 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 포함한다.

리포좀의 표적화는 해부학적 및 역학적 인자에 따라 분류되었다. 해부학적 분류는 선택 능력 수준, 예를 들어, 기관 특이성, 세포 특이성 및 세포기관 특이성을 기준으로 한 것이다. 역학적 표적화는 이것이 수동 또는 능동이냐를 기준으로 구분될 수 있다. 수동 표적화는 동모양모세혈관을 포함하는 기관에서 망상 내피세포계(RES)의 세포에 분포되는 리포좀의 고유 성향을 사용한다. 한편, 능동 표적화는 리포좀을 모노클로날 항체, 슈가, 당지질 또는 단백질과 같은 특정 리간드에 커플링시키거나 리포좀의 조성물 또는 크기를 변화시켜 천연적으로 존재하는 국소 부위를 제외한 기관 및 세포 유형으로 표적화될 수 있도록 리포좀을 변화시킴을 포함한다.

표적화된 전달 시스템의 표면은 다양한 방법으로 변형될 수 있다. 리포좀 표적화된 전달 시스템의 경우에, 지질 그룹은 리포좀의 지질층으로 혼입되어 리포좀 이중층과 안정하게 연합되어 표적화 리간드를 유지할 수 있다. 다양한 연결 그룹이 지질 쇄가 표적화 리간드에 결합되도록 사용될 수 있다.

일반적으로, 표적화된 전달 시스템의 표면에 결합한 화합물은 표적화된 전달 시스템이 목적하는 세포상에 정착되도록 하는 리간드 및 수용체이다. 리간드는 수용체와 같은 또 다른 화합물에 결합할 임의의 목적하는 화합물일 수 있다.

일반적으로, 특이적 작동인자 분자에 결합하는 표면 막 단백질을 수용체로서 언급한다. 본 발명에서, 항체가 바람직한 수용체이다. 항체는 리포좀을 특이적 세포 표면 리간드에 표적되도록 하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양 연합 항원(TAA)으로서 언급되는, 종양 세포상에서 특이적으로 발현되는 특정 항원을, 항체 아연 핑거 뉴클레오타이드 결합 단백질 함유 리포좀을 직접적으로 악성 종양에 표적화시킬 목적으로 사용할 수 있다. 아연 핑거 뉴클레오타이드 결합 단백질 유전 자 생성물은 작용하는 세포 유형 각각을 구분할 수 없기때문에 표적화된 전달 시스템은 비특이적 리포좀을 무작위로 주사하는 것 보다 상당한 개선책을 제공한다. 다수의 방법을 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체중 하나를 리포좀 이중층에 공유적으로 부착시킨다. 항체 표적화된 리포좀은 모노클로날 또는 폴리클로날 또는 이들이 효율적으로 표적 세포상의 항원성 에피토프상에 결합하는 한 Fab 또는 F(ab')₂와 같은 단편을 포함할 수 있다. 리포좀은 또한 호르몬 또는 기타 혈청 인자에 대한 수용체를 발현하는 세포에 표적화될 수 있다.

핵산 분자를 표적 세포에 도입하는데 적합한 다중 바이러스 및 비 바이러스 방법이 당해 기술분야의 기술자에게 유용하다. 원종양 세포의 유전자 조작은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 세포의 유전학적 변형은 유전자 치료 분야에 널리 공지된 하나 이상의 기술을 사용하여 성취될 수 있다[문헌참조: Mulligan, R.C. Human Gene Therapy, 5(4):543-563(1993)]. 바이러스 형질도입 방법은 표적 세포를 감염시키기 위해, 시알릴트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질의 발현을 유도하거나 억제하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 바이러스의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 적합한 DNA 바이러스는 아데노바이러스(Ad), 아데노 연합 바이러스(AAV), 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스 또는 폴리오 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 적합한 RNA 바이러스는 레트로바이러스 또는 신드비스 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 몇몇 당해 DNA 및 RNA 바이러스가 존재함을 당해 기술분야의 기술자는 이해할 것이다.

아데노바이러스 벡터는 동물 모델에서 진핵 세포 유전자 발현의 연구 및 백신 개발을 위해 유전자를 진핵 세포로 전달하는데 유용하다. Ad 매개 유전자 치료법은 낭성섬유증 막관통 전도 조절 인자(CFTR)유전자를 폐로 전달하기 위해 사람에 적용될 수 있다. 재조합 Ad의 생체내 상이한 조직으로의 투여를 위한 경로는 예를 들어, 기관내 적하, 근육내 주사, 말초 정맥내 주사 및 뇌로의 정위적 접종을 포함한다. 이어서, 아데노바이러스 벡터는 광범위하게 당해 기술 분야의 기술자에게 유용하고 본 발명에 사용하기에 적합하다.

아데노-연합 바이러스(AAV)는 최근에 유전자 치료에서 잠재력있게 적용되는 유전자 전달 시스템으로서 도입되었다. 야생형 AAV는 고수준의 감염능력, 광범위 숙주 범위 및 숙주 세포 게놈으로의 통합에 있어서의 특이성을 나타내는 것으로 보고되었다. 헤르페스 심플렉스 바이러스형 1(HSV-1)은 벡터 시스템으로서, 특히, 이의 향신경성 성질때문에 신경계에 사용하는데 적합하다. 폭스바이러스 계열의 우두 바이러스는 또한 발현 벡터로서 개발되었다. 상기된 벡터 각각은 당해 기술 분야의 기술자에게 광범위하게 유용하고 본 발명에 사용하는데 적합하다.

레트로바이러스 벡터는 대부분의 표적 세포에 감염되어 세포 게놈내로 통합될 수 있다. 레트로바이러스는 기타 바이러스 보다 비교적 일찍이 유전자 전달 벡터로서 개발되었고 아데노신 데아미나제(ADA)의 cDNA를 사람 백혈구에 표적시키고 형질도입시키는 유전자에 있어서 성공적으로 사용되었다. 바람직한 레트로바이러스는 렌티바이러스를 포함한다. 바람직한 양태에서, 레트로바이러스는 HIV, BIV 및 SIV로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

유전자 치료에 사용되거나 제안되었던 "비 바이러스" 전달 기술은 DNA-리간드 복합체, 아데노바이러스-리간드-DNA 복합체, DNA의 직접 주사, CaPO₄ 침전, 유전자 건 기술, 전기천공, 리포좀 및 지질감염을 포함한다. 이들 방법은 당해 기술 분야의 기술자에게 유용하고 본 발명에 사용하기에 적합하다. 또 다른 적합한 방법은 당해 기술 분야의 기술자에게 유용하고 본 발명은 형질감염에 유용한 방법을 사용하여 성취될 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 당해 여러 방법이 당해 분야의 기술자에 의해 사용되어왔고 다양한 성공을 거두었다. 지질감염은 분리된 DNA 분자를 리포좀 입자내에 포집시키고 리포좀 입자를 표적 세포의 세포막에 접촉시켜 성취될 수 있다. 리포좀은 자가 어셈블링하며 포스파티딜 세린 또는 포스파티딜 콜린과 같은 양쪽성 분자로 이루어진 지질층이, 지질 이중층이 소수성 내부를 포위하는 방식으로 주변 배지의 일부를 포집하는 콜로이드성 입자이다. 단일층 또는 다중층 리포좀은 내부가 목적하는 화학 물질, 약물 또는 본 발명의 경우에 분리된 DNA 분자를 포함하도록 작제될 수 있다.

세포는 생체내, 생체외 또는 시험관내에 형질감염될 수 있다. 세포는 모세포로부터 분리된 원세포 또는 원세포 기원의 세포주로서 형질감염될 수 있고 세포가 궁극적으로 투여되는 환자에게 근본적으로 자가 세포가 아니다. 생체외 또는 시험관내 형질감염 후에, 세포는 숙주로 이식될 수 있다.

표적 세포내에서 본 발명의 핵산을 전사하기 위해, 표적 세포에서 유전자를 발현시킬 수 있는 전사 조절 영역이 사용된다. 전사 조절 영역은 프로모터, 인핸서, 사일런서 또는 리프레서 요소를 포함할 수 있고 기능적으로 본 발명의 핵산과 연합된다. 바람직하게, 전사 조절 영역은 표적 세포에서 고수준의 유전자 발현을 유도한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 전사 조절 영역은 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 이미디어트-어얼리 인핸서/프로모터, SV40 어얼리 인핸서/프로모터, JC 폴이오마바이러스 프로모터, 알부민 프로모터, PGK 및 CMV 인핸서와 커플링된 α-액틴 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터는 당해 기술 분야의 기술자에게 광범위하게 유용한 표준 재조합 기술을 사용하여 작제될 수 있다. 당해 기술은 일반적으로 분자생물학 문헌[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), D. Goeddel, ed., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology series, Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1991), and Innis, et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 기재되어 있다.

생체내에서 본 발명의 폴리펩타이드 또는 핵산의 표적 세포로의 투여는 당해 기술 분야의 기술자에게 널리 공지된 다양한 기술중 어느 하나를 사용하여 성취될 수 있다.

본 발명의 벡터는 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬반트 및 비히클을 포함하는 투여 단위 제제로 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 분무, 직장으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "비경구적"이라는 용 어는 피하내, 정맥내, 근육내, 흉골내, 주입 기술 또는 복막내 투여를 포함한다. 약물의 직장 투여용 좌제는 실온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체여서 직장에서 녹아 약물을 방출하는 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 비자극성 부형제와 약물을 혼합하여 제조될 수 있다.

본 발명의 벡터 및/또는 본 발명의 조성물을 사용하여 장애 또는 질환을 치료하기 위한 투여 용법은 질환의 유형, 연령, 체중, 성별, 환자의 의학적 상태, 중증도, 투여 경로 및 사용되는 특정 화합물을 포함하는 다양한 인자를 기준으로 한다. 따라서, 투여 용법은 광범위하게 다양할 수 있지만 통상적으로 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명의 약제학적 활성 화합물은 제약의 통상적인 방법에 따라 가공되어 사람 및 기타 포유동물을 포함하는 환자에게 투여하기 위한 의학 조성물 또는 제제가 제조될 수 있다. 경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 예를 들어, 액체, 안구용 삽입물, 캅셀, 정제 및 현탁제 형태일 수 있다. 약제학적 조성물은 바람직하게 소정양의 활성제를 포함하는 투여 단위 형태로 제조된다. 예를 들어, 이들은 약 10³ 내지 10¹⁵개 바이러스 입자, 바람직하게는 약 10⁶ 내지 10¹²개 바이러스 입자에 이르는 벡터의 양을 포함할 수 있다. 사람 또는 기타 포유동물용으로 적합한 하루 투여량은 환자의 상태 및 기타 인자에 따라 광범위하게 다양할 수 있지만 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 식염수, 덱스트로스 또는 물과 같은 적합한 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 활성제를 조성물로서 주사하여 투여될 수 있다.

본 발명의 핵산 및/또는 벡터는 유일한 활성 약제로서 투여될 수 있지만 이들은 또한 본 발명의 하나 이상의 벡터 또는 기타 제제와 배합하여 사용될 수 있다. 배합물로서 투여되는 경우, 치료제는 동시에 또는 상이한 시점에서 별도의 조성물로서 제형화될 수 있거나 치료제는 단일 조성물일 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 적합한 약제학적 담체와 배합하여 사용될 수 있다. 당해 조성물은 치료학적 유효량의 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 당해 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 배합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 제제는 투여 형태에 적합해야만 한다.

본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 컨테이너를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 당해 컨테이너에는 약제 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 관할하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 주지사항이 부착되어 있고 당해 주지사항은 사람 투여용으로서 제조 기관에게 이의 사용 또는 판매를 허가한다는 내용을 보여준다. 추가로, 본 발명의 폴리펩타이드는 또 다른 치료 화합물과 연계하여 사용될 수 있다.

약제학적 조성물은 통상적인 방식, 예를 들어, 안구내, 안약 및 전신 경로로 투여될 수 있다. 환자에게 투여되는 tRNA 신세타제 유래 폴리펩타이드의 양 및 투여 용법은 다수의 인자, 예를 들어, 투여 방식, 치료될 상태의 특성, 치료될 환자의 체중 및 주치의의 판단에 의존한다. 일반적으로, 폴리펩타이드는 체중(kg)당 약 10㎍의 치료학적 유효량으로 투여된다. 바람직하게 투여량은 투여 횟수, 투여 경로 및 증상등을 고려하여 체중 kg당 하루에 약 10㎍ 내지 약 1mg이다.

혈관 형성 억제 trpRS 치료 요법을 사용하여 내인성 및 외인성 혈관 형성 인자의 혈관 형성 활성을 방해하고, 혈관 형성 및 혈관 신생은 고형 종양 성장에 필수 단계이기 때문에 고형 종양의 추가의 성장을 차단하여 심지어 고형 종양을 퇴화시킬 수 있다. 당해 치료법을 또한 사용하여 비정상적인 혈관 형성을 특징으로 하는 류마티스 관절염, 건선 및 당뇨 망막증을 치료할 수 있다.

특정 수용체를 발현하는 세포로 치료학적 유전자 생성물을 전달하기 위해 치료학적 유효량 및 유효 농도의 재조합 아데노바이러스 전달 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다. 특히, 안구의 광수용체 세포가 관심이 되고 있다. 광수용체와 접촉시키는 임의의 수단으로 투여될 수 있다. 광수용체 세포에 근접하기 위해, 바람직한 투여 방식은 망막하 주사 또는 유리체내 주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

재조합 바이러스 조성물은 또한 안구의 전방 또는 후방으로, 바람직하게는 유리체강으로, 예를 들면, 콜라겐 스폰지를 포함하는 생분해성 지지체에 흡착된 서방성 제제로서 또는 리포좀으로서 이식하기 위해 제형화될 수 있다. 서방성 제제는 다중 용량 투여를 위해 제형화 될 수 있고 선별된 시간 동안에(예를 들어, 1개월 이상 내지 약 1년) 여러 용량으로 투여된다. 따라서, 예를 들어, 리포좀은 약 2회 내지 약 5회 또는 그 이상으로 단일 용량이 한 주사기에 투여될 수 있도록 제조될 수 있다.

벡터는 약 0.05ml 내지 0.15ml, 바람직하게는 약 0.05 내지 0.1ml의 용적으로 안구내, 바람직하게는 유리체내 투여용으로서 안구학적으로 허용되는 담체로 제형화된다.

조성물은 안구내 투여시 충분한 양의 바이러스 입자를 약 50 내지 150㎕의 용적으로 광 수용체로 전달하는 활성제의 양을 포함하는 밀봉된 멸균 바이알로서 제공될 수 있는데 당해 용적은 약 10⁷개 이상, 보다 바람직하게는 약 10⁸개 이상의 플라크 형성 유니트를 포함하게 된다. 따라서 전형적으로, 바이알은 약 0.15ml의 조성물을 포함한다.

당해 조성물을 제조하기 위해, 바이러스 입자는 안구학적으로 적합한 허용되는 담체로 희석되거나 바이러스 입자는 이와 함께 농축되거나 혼합될 수 있다. 수득한 혼합물은 액제, 좌제 또는 에멀젼일 수 있다. 추가로, 바이러스 입자는 조성물중에 유일한 약제학적 활성 성분으로서 제형화될 수 있거나 치료될 특정 장애에 대한 기타 활성제와 배합될 수 있다.

안구내 주사 또는 안구 적가에 의한 투여를 위해 허용되는 담체는 생리학적 식염수, 인산 완충 식염수(PBS), 균염 용액(BSS), 링거 락테이트 용액 및 증점제 및 용해제(예를 들어, 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜 및 이의 혼합물)를 포함하는 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 리포좀성 좌제는 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 적합할 수 있다. 이들은 당해 기술 분야의 기술자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 적합한 안구학적으로 허용되는 담체는 공지되어 있다. 안구용의 용액 또는 혼합물은 적합한 염과 함께 0.01% 내지 10%의 등장액(pH 5 내지 7)으로서 제형화될 수 있다[문헌참조: 안구 자극 용액 및 국소용 용액의 전형적인 조성물을 기술하는 미국 특허 제5,116,868호]. pH가 약 7.4로 조정된 당해 용액은 예를 들어, 90 내지 100mM의 염화나트륨, 4 내지 6mM의 이염기성 인산칼륨, 4 내지 6mM의 이염기성 인산나트륨, 8 내지 12mM의 나트륨 시트레이트, 0.5 내지 1.5mM의 염화마그네슘, 1.5 내지 2.5mM의 염화칼슘, 15 내지 25mM의 나트륨 아세테이트, 10 내지 20mM의 나트륨 D,L-β-하이드록시부티레이트 및 5 내지 5.5mM의 글루코스를 포함한다.

조성물은 시간 방출 제제 또는 제피제와 같이, 체내로부터 신속하게 제거되지 않도록 활성제를 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 당해 담체는 미세캅셀화된 전달 시스템 및 생분해성 생물양립성 중합체(예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산) 및 직접적으로 안구의 전방 또는 후방 또는 유리체강내에 직접적으로 삽입될 수 있는 또 다른 유형의 이식체와 같은 조절된 방출 제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 조성물은 또한 펠렛(예를 들어, ELVAX^R 펠렛(에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 수지, 듀퐁))으로 투여될 수 있다.

조직 표적화된 리포좀을 포함하는 리포좀 좌제는 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 적합할 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제제는 당해 기술 분야의 기술자에게 공지된 방법으로 제조될 수 있다[문헌참조: Kimm et al. Bioch. Bioph. Acta 728:339-398(1983); Assil et al. Arch Ophtalmol. 105:400(1987); 및 미국 특허 제4,522,811호]. 바이러스 입자는 리포좀 시스템의 수성상으로 포집될 수 있다.

활성 물질 또는 제제는 또한 목적하는 작용에 손상을 주지 않는 기타 활성 물질 또는 목적하는 작용을 증강시키거나 또 다른 작용을 갖는 물질과 혼합될 수 있고 이것은 고분자량의 약 3백만 분획의 나트륨 하이알루로네이트의 용액인 하이알루론산(상표명 HEALON^R(Pharmacia, Inc)하에 시판됨)(문헌참조: 미국 특허 제5,292,362호, 제5,282,851호, 제5,273,056호, 제5,229,127호, 제4,517,295호 및 제4,328,803호) 및 상표명 VISCOAT^R(Alcon Surgical, Inc.)로부터 시판되는 수지[예를 들어, 1H, 1H, 2H, 2H-헵타데카플루오로데실메타크릴레이트(미국 특허 제5,278,126호, 제5,273,751호 및 제5,214,080호)와 같은 불소 함유 (메트)아크릴레이트] 및 상표명 ORCOLON^R(Optical Radiation Corporation)(문헌참조: 미국 특허 제5,273,056호)하에 시판되는 수지 및 메틸셀룰로스, 메틸 하이알루로네이트, 폴리아크릴아미드 및 폴리메타크릴아미드(문헌참조: 미국 특허 제5,273,751호)와같은 유리체 물질을 포함한다. 유리체 물질은 일반적으로 접합체 물질의 약 0.5 내지 5.0중량%, 바람직하게는 1 내지 3중량%의 양으로 존재하여 처리된 조직을 피복하여 이를 보호하는 기능을 한다. 조성물은 또한 염료(예를 들어, 메틸렌 블루) 또는 기타 불활성 염료를 포함하여 조성물이 안구로 주사되는 경우 가시화될 수 있다. 추가의 활성제가 포함될 수 있다.

조성물은 앰푸울, 1회용 주사기 또는 유리, 플라스틱 또는 기타 적합한 재료로 이루어진 다중 또는 단일 용량 바이알에 밀봉될 수 있다. 당해 밀봉된 조성물은 키트로 제공될 수 있다. 특히, 바이알, 앰푸울 또는 기타 컨테이너, 바람직하게는 충분양의 조성물을 갖는 1회용 바이알(약 0.100ml의 조성물을 전달) 및 1회용 바늘, 바람직하게는 자가 밀봉 25-33 게이지 바늘 또는 보다 소형을 포함하는 키트가 본원에 제공된다.

최종적으로, 조성물은 팩키지 물질, 전형적으로, 바이알, 본 발명의 폴리펩타이드를 함유하는 안구학적으로 허용되는 조성물 및 조성물의 치료학적 용도를 표시하는 표지를 포함하는 제품으로서 팩키지된다.

본원의 방법을 수행하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 유리체 주사를 위해 적합한 정확하게 눈금이 매겨진 주사기 또는 또 다른 정확하게 눈금이 매겨진 전달장치와 함께 1회 용량 투여를 위해 충분한 조성물 및 하나 이상의 바늘(예를 들어, 자가 밀봉 25 내지 33게이지 또는 보다 소형의 바늘, 바람직하게는 33게이지 또는 보다 소형의 바늘)을 갖는 하나 이상의 컨테이너(예를 들어, 밀봉된 바이알)를 포함한다.

조성물은 바람직하게 안구내 주사로 투여되지만 충분한 양의 화합물이 유리체강과 접촉할 수 있는 경우 또 다른 투여 방법도 효과적일 수 있다. 안구내 주사는 유리체 주사, 수성 액체 주사 또는 안구 외부층으로의 주사(예를 들어, 결막하 주사 또는 장부하 주사) 또는 각막으로 국소 투여(침투 제제가 사용되는 경우)에 의해 성취될 수 있다.

임의의 특정 환자를 위해, 특이적 투여 용법이 개인의 필요성 및 재조합 바이러스의 투여를 수행하고 감독하는 개인의 직업적 판단에 따라 시간이 경과하면서 조정되어야만 한다. 본원에 제시된 농도 및 양의 범위는 단지 예시적인 것이고 청구된 방법의 범위 또는 이의 실시 범위를 제한하는 것으로 사료되지 말아야 한다.

하기의 실시예는 본 발명의 특정 양태 및 이의 다양한 용도를 설명하고 있 다. 이들은 단지 설명과 예시하기 위한 목적으로 제공된 것이지 여기에 제한되는 것이 아니다.

실시예 1. 내독소 부재 재조합 TrpRS의 제조

내독소 부재 재조합 사람 TrpRS는 다음과 같이 제조한다. 전장 TrpRS(서열번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 471)을 암호화하는 플라스미드 또는 근본적으로 서열번호 1(즉, 전장 TrpRS의 잔기 94 내지 471)의 잔기 94 내지 471로 이루어진 절두된 TrpRRS(이후부터 T2로서 언급됨(서열번호 12))를 암호화하는 플라스미드 및 근본적으로 서열번호 1의 잔기 71 내지 471로 이루어진 제2 절두된 TrpRS(이후부터 T1으로서 언급됨(서열번호 13))을 암호화하는 플라스미드를 제조한다. 또한 각각의 플라스미드는 6개의 히스티딘 잔기(예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 잔기 472 내지 484)를 포함하는 C 말단 태그 및 개시 메티오닌 잔기를 암호화하고 있다. His₆ 태그 T1은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 반면에 His₆ 태그 T2는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는다.

상기 플라스미드를 이. 콜리 균주 BL 21(DE3)(Novagen, Madison, WI)에 도입한다. 또한 6개의 히스티딘 잔기의 C 말단 태그를 암호화하는 사람 성숙한 EMAPII를 사용하기 위해 유사하게 제조한다. 재조합 TrpRS의 과발현은 세포를 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드로 4시간동안 처리하여 유도한다. 이어서, 세포를 용해시키고 제조업자의 제안된 프로토콜에 따라 상등액으로부터 분리된 단백질을 HISㆍBIND^R 니켈 친화성 칼럼(Novagen)상에서 정제한다. 정제 후, TrpRS 단백질을 1μM ZnSO₄ 을 포함하는 인산 완충 식염수(PBS)와 함께 항온처리함에 이어서 유리 Zn²⁺을 제거한다[문헌참조: Kisselev et al., Eur. J. Biochem. 120:511-17(1981)].

내독소를 트리톤 X-114를 사용한 상 분리에 의해 단백질 샘플로부터 제거한다[문헌참조: Liu et al., Clin. Biochem. 30:455-63(1997)]. E-TOXATE^R 겔-응고 분석(Sigma, St. Louis, MO)을 사용하여 mL당 내독소 0.01 유니트 이하의 내독소가 단백질 샘플중에 포함되어 있음을 측정한다. 단백질 농도를 표준으로서 소 혈청 알부민(BSA)를 사용하는 브래드포드 분석법(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 측정한다.

실시예 2. PMN 엘라스타제에 의한 사람 TrpRS의 절두

PMN 엘라스타제에 의한 사람 전장 TrpRS의 절두을 조사한다. TrpRS를 0, 15, 30 또는 60분동안 1:3000의 프로테아제: 단백질의 비로 PBS(pH 7.4)중에서 PMN 엘라스타제로 처리한다. 절두 후, 샘플을 12.5%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 분석한다. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 3428 내지 4738에 의해 암호화된 약 53kDa의 전장 TrpRS을 PMN 엘라스타제로 절두하여 약 46kDa의 다수 단편(서열번호 5, C 말단 히스티딘 태그를 갖는 T1) 및 약 43kDa의 소수 단편(서열번호 7, C 말단 히스티딘 태그를 갖는 T2)을 생성한다.

재조합 TrpRS 단백질의 카복실 말단 His₆-태그에 대해 지시된 항체와 함께 웨스턴 블롯 분석을 하여 양 단편이 이의 카복실 말단에 His₆ -태그를 소유하고 있음을 밝힌다. 이어서, 2개의 TrpRS 단편의 아미노 말단을 절두한다. TrpRS 단편의 아미노 말단 서열을 ABI 모델 494 서열 분석기를 사용하는 에드만(Edman) 분해법으로 결정한다. 이들 단편을 서열 분석하여 아미노 말단 서열이 S-N-H-G-P(서열번호 8) 및 S-A-K-G-I(서열번호 9)인 것으로 밝혀졌고 이것은 다수 및 소수 TrpRS 단편의 아미노 말단 잔기가 각각 전장 TrpRS의 71번 및 94번에 위치하고 있음을 시사한다. 이들 사람 TrpRS 작제물을 도 1에 요약한다. 시그네이쳐 서열 -HVGH-(서열번호 10) 및 -KMSAS-(서열번호 11)을 박스로 나타낸다.

다수 및 소수 TrpRS 단편의 혈관 형성 활성을 혈관 형성 분석으로 분석한다. 각각 C-말단 히스티딘 태그(서열번호 1의 아미노산 잔기 472 내지 484)를 갖는 다수 및 소수 TrpRS 단편(서열번호 5 및 서열번호 7)의 재조합 형태를 이들 분석에 사용한다. 2개의 TrpRS 단편은 혈관 형성을 억제할 수 있다.

실시예 3. Trp-RS의 절두된 단편이 망막 혈관형성에 대해 강한 혈관 형성 억제 효과를 나타낸다

트립토파닐-rRNA 신세타제(TrpR, 53kd, 서열번호 1)로부터 유래된 절두된 형태의 혈관 형성 억제 활성을 출생후 마우스 망막 혈관 형성 모델[문헌참조: Friedlander et al. Abstracts 709-B84 and 714-B89, IOVS41(4):138-139(March 15, 2000)]에서 조사하고 출생후 망막 혈관 형성이 마우에서 단계적으로 진행됨을 보고한다. 본 발명은 상기 단계적 망막 혈관 형성을 사용하여 혈관 형성 억제를 분석하는 방법을 제공한다.

내독소 부재 재조합 소형-TrpRS(히스티딘 태그 TrpRS의 48kDa 스플라이스 변이체; 서열번호 3) 및 T2(히스티딘 태그 TrpRS의 43kDa의 절두 산물, 서열번호 7)를 재조합 단백질로서 제조한다. 이들 단백질을 출생후 7일 또는 8일의 신생 Balb/C 마우스의 유리체에 주사하고 망막을 P12 또는 P13상에서 수거한다. 콜라겐 IV 항체 및 플루오레신 접합된 2차 항체를 사용하여 망막 전 탑재 제제에서 혈관을 가시화한다. 혈관 형성 억제 활성을 심외부 혈관총의 형성에 대한 주사된 단백질의 효과를 기준으로 공초점 현미경으로 조사하여 평가한다. 유리체내 주사 및 망막 분리를 해부 현미경(SMZ 645, Nikon, Japan)으로 수행한다. 눈꺼플 틈새를 출생후 7일(P7)된 마우스에 날카로운 칼날로 만들어 T2(5pmol) 또는 TrpRS(5pmol) 주사용 글로브에 노출시킨다. 샘플(0.5㎕)을 32 게이지 바늘(Hamilton Company, Reno, NY)을 장착한 주사기로 주사한다. 적도 및 각막 가장자리 사이에 주사하고 주사동안에 바늘 끝의 위치를 직접적인 가시화로 모니터하여 이것이 유리체강에 있는지 결정한다. 주사바늘 유도된 렌즈 또는 망막 손상을 갖는 안구는 연구에서 배제한다. 주사 후, 눈꺼플을 재위치시켜 틈새를 폐쇄한다.

생후 12일째에 동물을 마취시키고 눈에서 세포핵을 제거한다. 4% 파라포름알데하이드(PFA)중에서 10분 후에, 각막, 렌즈, 공막 및 유리체를 윤부 절두하여 절개한다. 분리된 망막을 빙상에서 10분동안 메탄올중에 적셔 염색시킴에 이어서 빙상에서 1시간동안 PBS중의 20% 정상의 염소 혈청(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)을 사용하여 50% 태아 소 혈청(Gibco, Grand Island, NY)중에서 차단한다. 망막을 4℃에서 18시간동안 차단 완충액중에서 1:200으로 희석된 토끼 항-마우스 콜라겐 IV 항체(Chemicon, Temecula, CA)로 염색시켜 혈관을 특이적으로 가시화한다. ALEXA FLUOR^R 594-접합된 염소 항-토끼 IgG 항체(Molecular Probes, Eugene, OR)(차단 완충액에서 1:200 희석)를 4℃에서 2시간동안 망막과 함께 항온처리한다. 망막을 느린 색조 탑재 배지 M(Molecular Probes, Eugene, OR)과 함께 탑재한다.

혈관 형성 억제 활성을 P8 및 P12 사이에 형성되는 심외부 망막 혈관 층(제2층)에서 혈관형성 정도를 근거로 평가한다. 내부 혈관 네트워크의 외관(제1층)을 정상적인 발달 및 독성의 징후로서 평가한다. 본 실시예에서 사용되는 단백질 작제물의 어떠한 것도 제1층상에 어떠한 역효과를 나타내지 않는다.

도 2는 마우스 망막의 제2 심연 네트워크의 혈관 형성을 억제하는 T2의 능력을 광학현미경으로 나타낸 것이다. 도 2에서 A줄은 TrpRS에 노출된 망막의 혈관 네트워크를 보여주고 B줄은 소형-TrpRS상에 노출된 망막의 혈관 네트워크를 나타내며 C줄은 본 발명의 폴리펩타이드 T2에 노출된 망막의 혈관 네트워크를 나타낸다. 제1(왼편) 칼럼은 제1 피상적 네트워크를 나타내고 제2 칼럼은 제2 심연 네트워크를 나타낸다. 도 2에서 명백해진 바와 같이, 폴리펩타이드의 어떠한 것도 제1 피상적 네트워크에 영향을 주지 않는 반면에 T2만이 제2 심연 네트워크의 혈관 형성을 상당히 억제한다.

대부분의 PBS 처리된 안구는 정상적인 망막 혈관 발달을 나타내지만 외부 혈관층의 완전한 억제는 처리된 안구의 약 8.2%(n=73)에서 관찰된다. 외부 네트워크의 완전한 억제는 소형-TrpRS(0.5mg/ml)로 처리된 안구(n = 75)중 28%에서 관찰된다. 보다 소형인 절두된 형태(T2)는 용량 의존 양상으로 혈관 형성의 보다 강력한 억제제이다. 14.3%가 0.1 mg/ml의 T2(n = 14)로 처리한 후 완전히 억제되고 0.25mg/ml(n = 20)으로 처리한 후에 40%가 억제되고 0.5mg/ml(n = 53)로 처리후에는 69.8%가 완전히 억제된다. 0.5mg/ml의 처리에 대한 데이타는 도 3에 그래프로 나타낸다. 마우스 망막의 추출물은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석된 바와 같이 사람 소형-TrpRS와 동일한 겉보기 분자량 및 면역반응성을 갖는 단백질을 포함한다. 전장 마우스 및 사람 TrpRS는 약 88%의 아미노산 동일성을 공유하고 475 및 471개의 아미노산을 각각 포함한다. 절두된 형태의 TrpRS, 특히 T2는 망막 혈관 발달에 강력한 혈관 형성 억제 효과를 나타낸다.

실시예 4. 마트리겔 혈관 형성 분석

마우스 마트리겔 혈관 형성 분석을 사용하여 문헌[참조: Brooks et al. Methods Mol. Biol., 129:257-269(1999) and Eliceiri et al. Mol. Cell, 4:915-924(1999)]에 기재된 방법에 따라 T2(서열번호 7)의 혈관 형성 억제 활성을 조사한다. 하기의 변법을 사용하여 기술된 바와 같이 수행한다. 흉선 없는 웨이 마우스의 정맥내로 20nM VEGF를 포함하는 400㎕의 성장 인자 고갈된 마트리겔[Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ]을 이식한다. T2의 혈관 형성 억제 활성을 마트리겔 플러그에 2.5μM T2를 포함시켜 초기에 시험한다. 플러그에 다양한 농도의 T2를 포함시켜 효능을 측정한다. 5일째에, 마우스의 피하내로 플루오레신 표지된 내피 결합 렉틴[Griffonia(Bandeiraea)Simplicifolia I], 이소렉틴 B4(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 주사하고 마트리겔 플러스를 절개한다. 각 플러그의 플루오레신 함량을 RIPA 완충액(10mM 인산나트륨, pH 7.4, 150mM 염화나트륨, 1% Nonidet P-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트)중에서 플러그를 분쇄한 후 분광학적 분석에 의해 정량한다.

실시예 5. 망막내의 T2 결합의 국소화

망막으로 주사된 T2의 흡수 및 국소화를 평가하기 위해, 플루오레신 표지된(ALEXA^R 488, Molecular Probes, Inc., EugeneOR) T2를 생후 7일째(P7)에 안구의 유리체에 주사한다. 글로브를 P8 및 P12상에서 수거하고 15분동안 4% PFA에 고정시킨다. 망막을 추가로 절개하여 인접한 비 망막 조직을 제거하고 4℃에서 밤새 4% PFA중에 방치함에 이어서 빙상에서 배지(TISSUE-TEK^R O.C.T., Sakura FineTechnical Co., Japan)에 침지시킨다. 초냉동 박절기 절단물(10마이크론)을 PBS로 재수화시키고 PBS중에서 5% BSA, 2% 정상 염소 혈청으로 차단한다. 혈관을 상기된 바와 같이 항-마우스 콜라겐 IV 항체로 가시화한다. DAPI 핵 염료를 포함하는 VECTASHIELD^R (Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 사용하여 조직을 덮개 슬립과 함께 탑재한다.

또한, 염색되지 않은 망막 절편을 4℃에서 밤새 차단 완충액중에서 200nM 플루오레신 표지된 전장 TrpRS 또는 플루오레신-표지된 T2와 함께 항온처리한다. 절편을 PBS에서 각각 5분동안 6회 세척함에 이어서 핵의 가시화를 위해 5분동안 1㎍/ml의 DAPI와 함께 항온처리한다. 표지화되지 않은 T2를 사용한 예비 차단은 플루오레신 표지된 T2를 항온처리하기 전에 1μM의 표지화되지 않은 T2로 4℃에서 8시간동안 수행한다. 멀티포톤 BioRad MRC1024 공초점 현미경으로 망막을 조사한다. 3-D 혈관 이미지를 공초점 보조 소프트웨어(BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 일련의 Z-시리즈의 이미지로부터 생성한다.

마우스 마트리겔 플러그 분석에서 T2의 혈관 형성 억제 효능.

본 발명자는 아미노아실화 활성이 상실되었지만, 이것이 혈관 형성 억제 활성을 갖는지의 여부를 결정하기 위해 T2(서열번호 7)를 조사하였다. 마우스 마트리겔 분석을 사용하여 생체내 T2의 혈관 형성 억제 활성을 조사한다. VEGF₁₆₅ 는 마우스 마트리겔 플러그로의 혈관의 발달을 유도한다. T2를 VEGF₁₆₅와 함께 마트리겔에 첨가하는 경우, 혈관 형성은 용량 의존 방식으로 차단되었고 IC₅₀은 도 4에 나타낸 바와 같이 1.7nM이다.

플루오레신 표지된 T2가 망막 혈관에 국소화된다

T2(서열번호 7)의 안구내 국소화를 가시화하기 위해, 본 발명자는 생후 7일째에 정맥내 주사후 플루오레신 표지된 T2의 분포를 조사하였다. 망막을 다음 날에 분리하고 절개하여 공초점 현미경으로 조사한다. 주사된 단백질의 분포는 혈관에 제한되어 있다. 이러한 국소화는 플루오레신-표지된 항 콜라겐 IV 항체(ALEXA^R594)로 표지된 T2 처리된 안구를 동시 염색시켜 확인한다(데이타는 나타내지 않음). 플루오레신 표지된 T2(P12)를 주사한지 5일 후에 표지된 T2의 녹색 형광도는 여전히 가시적이다(도 5A). 이들 망막에서, 어떠한 부수적인 혈관 층도 P12에서 관찰되지 않고 이것은 플루오레신 표지된 T2가 표지되지 않은 T2에 필적할 만한 혈관 형성 억제 활성을 보유하고 있음을 지적한다. 플루오레신 표지된 전장 TrpRS을 P7에 주사한 망막은 P12에서 제2 혈관층을 생성하지만 어떠한 혈관 염색도 관찰되지 않는다(도 5B). 도 5에서, 플루오레신 표지된 단백질은 녹색이고 콜라겐 표지된 혈관은 적색이고 핵은 청색이다.

추가로, 표지된 T2의 결합 성질을 평가하기 위해, 정상적인 신생 망막의 횡단 절단된 슬라이스를 플루오레신 표지된 T2로 염색시킨다. 이들 조건하에서, 플루오레신 표지된 T2는 혈관에만 결합한다(도 5C). 표지되지 않은 T2와 함께 예비 항온처리시킴에 의해 결합이 차단됨으로 결합은 특이적이다(데이타는 나타내지 않음). 플루오레신 표지된 전장 TrpRS를 망막에 적용하는 경우 어떠한 망막 혈관 염색도 관찰되지 않았고(도 5D) 이것은 전장 효소의 혈관 형성 억제 활성의 부재와 일치한다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 플루오레신 표지된 T2는 혈관 형성을 억제하고 망막 혈관에 국소화된다. 플루오레신 표지된 T2(도 5A) 또는 전장 TrpRS(도 5B)는 생후 7일(P7)에 유리체내로 0.5㎕ 주사한다. 망막을 P8에 수거하고 항-콜라겐 IV 항체 및 DAPI 핵 염료로 염색시켰을 때, 표지된 T2(도 5A에서 혈관을 지적하는 상단 화살표)는 1차 피상적 네트워크(1°)내 혈관으로 국소화되었다. 2차 심연 네트워크가 완전히 부재임이 주지된다(2°). 플루오레신 표지된 전장 TrpRS(도 5B에서 화살표)를 주사한 안구에는 1차(1°) 및 2차(2°) 혈관 층이 존재하고, 어떠한 표지도 관찰되지 않는다.

별도의 실험에서, P15 망막의 동결된 절편을 플루오레신 표지된 T2(도 5C) 또는 플루오레신 표지된 전장 TrpRS(도 5D)로 염색시키고 공초점 스캐닝 레이저 현미경으로 이미지화한다. 표지된 T2는 선택적으로 혈관으로 국소화되고 도 5C에서 표지 "2°" 바로 밑에 제1차 및 제2차 망막 혈관 층을 침투하는 명녹색 혈관으로서 출현한다. 어떠한 염색도 전장 TrpRS에 대해서는 관찰되지 않는다(도 5D).

전장 TrpRS는 특유의 NH₂ 말단 도메인을 포함하고 혈액 형성 억제 활성이 없다. 당해 전체 도메인의 일부 또는 전부를 제거하여 혈관 형성 억제 활성을 갖는 단백질을 밝힌다. T2의 혈관 억제 활성에 관여하는 구조는 코어 로스만 폴드 뉴클레오타이드 결합 도메인내에 포함되어 있는 것으로 보인다. 선택적 스플라이싱 또는 단백질분해에 의해 결실될 수 있는 NH₂ 말단 도메인은 전장 TrpRS에서는 접근 불가능한, 혈관 형성 억제 활성에 필요한 결합 부위를 노출시켜 TrpRS의 혈관 형성 억제 활성을 조절할 수 있다.

마우스 마트리겔 모델에서 VEGF 유도된 혈관 형성은 신생 망막에서 생리학적 혈관 형성과 마찬가지로 T2에 의해 완전히 억제된다. 흥미롭게도, 시험관내 및 CAM 및 마트리겔 모델에서 TrpRS 단편중 가장 강한 혈관 형성 억제 효과가 VEGF 자극된 혈관 형성 과정에서 관찰된다. 신생 마우스 망막 혈관 형성 결과는 VEGF 자극된 혈관 형성과 TrpRS 단편의 혈관 형성 억제 활성간에 관련이 있음과 일맥 상통한다. 당해 시스템내 망막 혈관 형성은 VEGF에 의해 유도될 수 있다. 추가로, 망막 모델에서 관찰되는 억제는 새롭게 발달하는 혈관에 대해 특이적이다. (주사시에) 이미 존재하는 1차 혈관층은 처리에 의해 변화되지 않는다. T2의 혈관 형성 억제 활성에 대한 기작이 공지되어 있지 않지만 망막 내피 혈관계로의 T2의 특이적 국소화 및 새롭게 발달하는 혈관에 대한 T2의 효과는 T2가 성장하거나 이동하는 세포상에 발현되는 내피 세포 수용체를 통해 작용할 수 있음을 시사한다. T2 혈관 형성 활성 메카니즘의 추가의 이해는 관련된 세포 수용체의 확인을 요구한다.

인터페론-γ자극시 혈관 형성 억제 소형 TrpRS를 생성하는 다양한 세포 유형은 또한 IP-10과 같은 혈관 형성 억제 인자를 생성한다. 따라서, 이들 결과는 정상적인 생리학적으로 관련이 있는 혈관 형성 경로에서 TrpRS의 역할에 대한 가능성을 증가시킨다. 또 다른 편재하는 세포 단백질-프로-EMAPII(p43)는 본원에서 TrpRS에 대해 보고된 것과 유사하지만 겉보기에는 관련이 없는 2개의 역할을 갖고 있다. 프로-EMAPII는 포유동물 아미노아실 tRNA 신세타제의 다중 신세타제 복합체와 연합하여 단백질 해독을 돕는다. 이것은 EMAPII로서 가공되고 분비되며 폐 발달동안에 혈관 형성 억제 매개체로서의 EMAPII의 역할이 제안되었다.

따라서, T2는 정상이거나 병리학적 상태하에 관찰되는 생리학적 관련 혈관 형성 리모델링에 사용될 수 있다. 정상적인 혈관 형성에서, T2는 중추 망막의 중심와무혈관부위와 같은 몇몇 기관에서 존재하는 생리학적으로 중요한 무혈관 영역의 설정을 도울 수 있다. 병리학적 혈관 형성은 전장 TrpRS의 절두가 억제되는 경우에 발생하여 혈관을 과증식시킨다.

안구 질환에서, 혈관 신생은 파국적 시력 손실을 유발할 수 있다. 이들 환자는 혈관 형성을 치료학적으로 억제시켜 대단한 수혜를 잠재적으로 받을 수 있다. 혈관 내피 성장 인자는 망막에서 혈관 신생과 황반 부종과 관련되어 있지만 또 다른 혈관 형성 자극이 또한 망막 혈관 형성에 역할을 수행하는 것으로 사료된다. 본 발명자는 VEGF-자극 혈관 형성과 TrpRS 단편의 강한 혈관 형성 억제 활성 사이에 연관성을 관찰하여 이들 분자가 저산소증 및 또 다른 증식성 망막증의 치료에 유용할 수 있도록 하였다. 본 발명의 T2가 작용하는 바와 같이(도 5) 그 당시에 혈관 형성을 70% 완전히 억제하는 혈관 형성 억제제에 대해 문헌에 보고된 적이 없다. TrpRS 단편의 또 다른 잇점은 이들이 천연에 존재함으로써 잠재적으로 비 면역원성이고 혈관 형성 억제성이라는 것이다. 따라서, 이들 분자는 표적화된 세포 또는 바이러스 벡터 기본 치료를 통해 전달될 수 있다. 신생 혈관 안구 질환을 갖는 많은 환자들은 전신 허혈 질환과 관련이 있기 때문에 유전학적으로 가공된 세포 또는 바이러스 벡터를 직접 안구에 투입하여 국소적 혈관 형성 억제 치료를 하는 것이 요망된다.

혈관 형성 망막증의 치료 뿐만 아니라, 본 발명의 TrpRS 단편, 특히 T2 및 혈관 형성을 억제하는 이의 단편은 또한 종양의 혈관 형성을 차단함으로써 고형 종양 성장을 억제할 수 있다. 본 발명의 TrpRS 단편은 VEGF 유도된 증식 및 시험관내 내피 세포의 화학주성을 차단하고 따라서 원치않는 내피 세포 증식 및 혈관 형성과 관련된 임의의 질병을 치료하는데 유용하다.

<110> The Scripps Research Institute <120> Tryptophanyl-tRNA Synthetase Derived Polypeptides Useful For The Regulation of Angiogenesis <130> 5-1998-061838-8 <150> US 60/270,951 <151> 2001-02-23 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant human trpRS <400> 1 Met Pro Asn Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Glu Leu Phe Asn Ser Ile 1 5 10 15 Ala Thr Gln Gly Glu Leu Val Arg Ser Leu Lys Ala Gly Asn Ala Ser 20 25 30 Lys Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Lys Met Leu Val Ser Leu Lys Met 35 40 45 Ser Tyr Lys Ala Ala Ala Gly Glu Asp Tyr Lys Ala Asp Cys Pro Pro 50 55 60 Gly Asn Pro Ala Pro Thr Ser Asn His Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ala 65 70 75 80 Glu Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln Thr Ser Ser Ala Lys 85 90 95 Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser Ser Lys Ile 100 105 110 Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly Gln Arg Pro 115 120 125 His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg Asp Met Asn 130 135 140 Gln Val 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125 Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly 130 135 140 Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile 145 150 155 160 Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser 165 170 175 Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn 180 185 190 Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys 195 200 205 Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe 210 215 220 Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys 225 230 235 240 Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro 245 250 255 Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro 260 265 270 Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser 275 280 285 Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn 290 295 300 Lys His Ala Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln 305 310 315 320 Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe 325 330 335 Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr 340 345 350 Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val 355 360 365 Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr 370 375 380 Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp 385 390 395 400 Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 405 410 415 <210> 6 <211> 4742 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage Product T2 of recombinant human TrpRS <221> CDS <222> (3428)...(4603) <400> 6 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780 agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840 tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020 aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140 tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260 ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320 cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380 gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440 actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560 caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680 accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860 agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920 accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980 gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700 catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760 tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820 ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880 tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940 ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000 aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300 cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360 tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420 tatacat atg agt gca aaa ggc ata gac tac gat aag ctc att gtt cgg 3469 Met Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg 1 5 10 ttt gga agt agt aaa att gac aaa gag cta ata aac cga ata gag aga 3517 Phe Gly Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg 15 20 25 30 gcc acc ggc caa aga cca cac cac ttc ctg cgc aga ggc atc ttc ttc 3565 Ala Thr Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe 35 40 45 tca cac aga gat atg aat cag gtt ctt gat gcc tat gaa aat aag aag 3613 Ser His Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys 50 55 60 cca ttt tat ctg tac acg ggc cgg ggc ccc tct tct gaa gca atg cat 3661 Pro Phe Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His 65 70 75 gta ggt cac ctc att cca ttt att ttc aca aag tgg ctc cag gat gta 3709 Val Gly His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val 80 85 90 ttt aac gtg ccc ttg gtc atc cag atg acg gat gac gag aag tat ctg 3757 Phe Asn Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu 95 100 105 110 tgg aag gac ctg acc ctg gac cag gcc tat ggc gat gct gtt gag aat 3805 Trp Lys Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn 115 120 125 gcc aag gac atc atc gcc tgt ggc ttt gac atc aac aag act ttc ata 3853 Ala Lys Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile 130 135 140 ttc tct gac ctg gac tac atg ggg atg agc tca ggt ttc tac aaa aat 3901 Phe Ser Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn 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Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala 370 375 380 gcc gca ctc gag cac cac cac cac cac cac tgagatccgg ctgctaacaa 4623 Ala Ala Leu Glu His His His His His His 385 390 agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct 4683 tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 4742 <210> 7 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage Product T2 of recombinant human TrpRS <400> 7 Met Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly 1 5 10 15 Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr 20 25 30 Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His 35 40 45 Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe 50 55 60 Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly 65 70 75 80 His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn 85 90 95 Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys 100 105 110 Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys 115 120 125 Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser 130 135 140 Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val 145 150 155 160 Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly 165 170 175 Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg 195 200 205 Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr 210 215 220 Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro 225 230 235 240 Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr 245 250 255 Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr 260 265 270 Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly 275 280 285 Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val 290 295 300 Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys 305 310 315 320 Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly 325 330 335 Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu 340 345 350 His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe 355 360 365 Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala 370 375 380 Leu Glu His His His His His His 385 390 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Asn His Gly Pro 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Ala Lys Gly Ile 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 His Val Gly His 1 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Lys Met Ser Ala Ser 1 5 <210> 12 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser 1 5 10 15 Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly 20 25 30 Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg 35 40 45 Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr 50 55 60 Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met 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Gly Arg 275 280 285 Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp 290 295 300 Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu 305 310 315 320 Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu 325 330 335 Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu His 340 345 350 Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe Met 355 360 365 Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln 370 375 <210> 13 <211> 401 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Asn His Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ala Glu Glu Asp Phe Val Asp 1 5 10 15 Pro Trp Thr Val Gln Thr Ser Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys 20 25 30 Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn 35 40 45 Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg 50 55 60 Gly Ile Phe Phe Ser His Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr 65 70 75 80 Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser 85 90 95 Glu Ala Met His Val Gly His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp 100 105 110 Leu Gln Asp Val Phe Asn Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp 115 120 125 Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp 130 135 140 Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn 145 150 155 160 Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly 165 170 175 Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln 180 185 190 Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile 195 200 205 Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro 210 215 220 Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala 225 230 235 240 Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg 245 250 255 Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala 260 265 270 Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser 275 280 285 Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys 290 295 300 His Ala Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe 305 310 315 320 Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe 325 330 335 Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser 340 345 350 Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu 355 360 365 Gln Pro Leu Ile Ala Glu His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp 370 375 380 Glu Ile Val Lys Glu Phe Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe 385 390 395 400 Gln

Claims (28)

1. 하기 서열번호 12의 아미노산 잔기 서열로 이루어지고 크기가 45kDa 이하인 분리된 수용성 폴리펩타이드.

   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 서열번호 7의 아미노산 잔기 서열을 갖는 분리된 폴리펩타이드.
7. 제1항 또는 제6항의 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
8. 제7항에 따른 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
9. 제8항에 따른 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
10. 제1항 또는 제6항에 따른 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 숙주 세포.
11. 서열번호 7 또는 서열번호 12의 아미노산 잔기 서열로 이루어진 안구 혈관 신생 억제량의 수용성 폴리펩타이드를 포함하는, 안구 혈관 신생을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
12. 제11항에 있어서, 매일 투여하기 위한 약제학적 조성물.
13. 제11항에 있어서, 1주일 간격으로 투여하기 위한 약제학적 조성물.
14. 제11항에 있어서, 1개월마다 투여하기 위한 약제학적 조성물.
15. 제11항에 있어서, 분기별로 투여하기 위한 약제학적 조성물.
16. 제11항에 있어서, 반년마다 투여하기 위한 약제학적 조성물.
17. 제11항에 있어서, 폴리펩타이드 20 내지 100㎍을 함유하는, 매일 투여하기 위한 약제학적 조성물.
18. 제11항에 있어서, 폴리펩타이드 2 내지 9mg을 함유하는, 분기별로 투여하기 위한 약제학적 조성물.
19. 제11항에 있어서, 유리체내 전달에 의해 투여하기 위한 약제학적 조성물.
20. 제11항에 있어서, 안구내 전달에 의해 투여하기 위한 약제학적 조성물.
21. 제11항에 있어서, 서방성 전달 장치로 투여하기 위한 약제학적 조성물.
22. 제11항에 있어서, 유전자 치료요법에 의해 투여하기 위한 약제학적 조성물.
23. 제11항에 있어서, 세포 기반 안구 전달에 의해 투여하기 위한 약제학적 조성물.
24. 서열번호 7 또는 서열번호 12의 아미노산 잔기 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 약리학적으로 허용되는 수성 부형제 1ml당 0.1mg 내지 0.5mg의 농도로 포함하는, 주사용 혈관 형성 억제 조성물.
25. 삭제
26. 삭제
27. 적합한 밀봉된 컨테이너에 팩키징된, 1회 이상 투여 용량으로서 충분한 양의 제1항에 따른 폴리펩타이드, 유리체내 주사를 위해 적합한 약 33게이지 이하의 하나 이상의 자가 밀봉 주사 바늘 및 하나 이상의 정확하게 눈금 매겨진 주사기를 포함하는, 안구 혈관 신생 억제용 키트.
28. 제27항에 있어서, 조성, 투여 방법 및 정부 방침에 의해 요구될 수 있는 임의의 요구되는 안전성 및 효능에 관한 정보를 기재한 인쇄된 정보 자료를 추가로 포함하는 키트.

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