CN1307300C - 造血干细胞和治疗新生血管性眼部疾病的方法 - Google Patents

Abstract

分离的哺乳动物骨髓衍生的谱系负性造血干细胞群(Lin HSC)包括能形成视网膜血管的内皮祖细胞(EPC)。在分离的Lin HSC群中至少约50%的细胞包括CD31和c-kit的细胞表面标记物。不多于约8%的细胞包括Sca-1细胞标记，不多于约4%的细胞包括Flk-1/KDR标记。本发明的分离的Lin HSC群可用于治疗眼部血管疾病。还提供了已经用有治疗作用的基因转染的分离的Lin HSC群，对于以细胞为基础的基因疗法，该Lin HSC群可用于将基因传递至眼中。

Description

造血干细胞和治疗新生血管性眼部疾病的方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求申请日为2002年7月25日的临时申请No.60/398,522和申请日为2003年5月2日的临时申请No.60/467,051的权益，这两篇专利申请在此通过参考文献引入。

政府利益声明

此处描述的工作的一部分得到了国家癌症研究所授予号为CA92577和国家卫生研究院授予号为EY11254、EY12598和EY125998的支持。联邦政府对该发明拥有确定的权利。

发明领域

本发明涉及从骨髓衍生的分离的哺乳动物谱系负性造血干细胞(Lin-HSC)。本发明还涉及通过将Lin^-HSC和转染的Lin^-HSC施用到视网膜来治疗眼血管疾病。

发明背景

与年龄相关的黄斑退行性改变(ARMD)和糖尿病性视网膜病变(DR)是工业化国家中的人视力丧失的最主要原因，同时还有视网膜新生血管形成异常的原因。因为视网膜由界限清楚的神经元层、神经胶质层和血管元件层组成，相对较小的疾病例如在血管增生或水肿中出现的疾病即可导致视觉功能的显著丧失。遗传性视网膜变性例如色素性视网膜炎(RP)，也与血管异常例如微动脉狭窄和血管性萎缩相关。虽然在鉴别具有促进和抑制血管生成作用的因子方面取得了显著进步，但目前还没有特别有效的治疗眼部血管疾病的治疗方法。

多年以来，已知干细胞种群存在于正常成年人的循环和骨髓中。不同亚种群的干细胞随着造血谱系正性(Lin⁺)或非-造血的、谱系负性(Lin^-)谱系而略有区别。此外，谱系负性造血干细胞(HSC)种群近期显示其包含有能够在体外和体内形成血管的内皮祖细胞(EPC)(Asahara et al.Science 275，964-7(1997))。这些细胞可以参与正常和病理状态引起的血管发生(参见Lyden et al.Nat.Med.7，1194-201(2001)；Kalka et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，3422-7(2000)；和Kocher etal.Nat.Med.7，430-6(2001))，还可以分化为多种非内皮细胞类型包括肝细胞(参见Lagasse et al.Nat.Med.6，1229-34(2000))、小胶质细胞(参见Priller et al.Nat.Med.7，1356-61(2002))、心肌细胞(参见Orlic et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98，10344-9(2001))和上皮细胞(参见Lyden et al.Nat.Med.7，1194-201(2001))。虽然在一些血管发生的实验模型中已经应用了这些细胞，但EPC对于新血管系统的靶向作用机理仍是未知的，而且也没有建立能够有效地增加对特定血管系统有益的细胞数量的策略。

发明概述

本发明提供从骨髓衍生的分离的哺乳动物谱系负性造血干细胞群(Lin^-HSC)，其包括对活性视网膜星形胶质细胞具有选择性靶向作用的内皮祖细胞(EPC；也称作内皮前体细胞)。至少约50％分离的本发明Lin^-HSC群细胞具有CD31和c-kit细胞标记物。

本发明的谱系负性HSC群中的EPC广泛地渗入发育中的视网膜血管，并且还稳定地渗入眼部新血管系统。本发明分离的谱系负性HSC群可用于治疗和稳定正在变性的哺乳动物视网膜血管系统。在本发明的分离的Lin^-HSC群的一个具体的实施例中，细胞被一种治疗上有效的基因转染。转染的细胞对于新血管系统具有选择性的靶向作用，能够在不影响已生成的血管的情况下通过以细胞为基础的基因疗法形式抑制新血管的形成。本发明的分离的谱系负性HSC群细胞，已经被一种编码抑制血管生成的肽的基因转染，有益于调节诸如ARMD、DR和与血管系统异常有关的某些视网膜变性的疾病中的异常血管生长。

使用本发明的分离的Lin^-HSC群治疗眼部疾病的一个特别的优点是对眼睛玻璃体具有血管营养和神经营养拯救作用，用Lin^-HSC玻璃体内治疗眼部观察到了此现象。使用本发明的Lin^-HSC治疗可以保护视网膜神经元和光感受器，维持眼睛的视觉功能。

本发明还提供了一种分离谱系负性造血干细胞群的方法，该谱系造血干细胞群包含源自骨髓尤其是成年人骨髓的内皮祖细胞。

附图的简要描述

图1(a和b)描述了正在发育的小鼠视网膜示意图。(a)初级丛的发育、(b)视网膜血管形成的第二阶段。GCL，神经节细胞层；IPL，内丛层；INL，内核层；OPL，外丛层；ONL，外核层；RPE，视网膜色素上皮；ON，视神经；P，外周。

图1c描述了骨髓衍生的Lin⁺HSC和Lin^-HSC分离的细胞的流动细胞计数特征。最上面一行：非抗体标记细胞的打点图分布，其中R1确定阳性PE-染色的可计量门控区域；R2指示GFP-阳性的；中间一行：Lin^-HSC(C57B/6)细胞；最下面一行：Lin⁺HSC(C57B/6)细胞，每一个细胞系用Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-轭合的抗体进行标记。Tie-2数据得自Tie-2-GFP小鼠。百分数指示阳性-标记的细胞占Lin⁺HSC或Lin^-HSC群总数的百分比。

图2描述了Lin^-HSC细胞移植入发育中的小鼠视网膜中。(a)在注射后四天(P6)时以玻璃体内的方式注入的eGFP⁺Lin^-HSC细胞附着在视网膜上并产生分化；(b)在用胶原IV抗体(星状物代表血管系统的顶部)染色血管系统前，先建立Lin^-HSC(B6.129S7-Gtrosa26小鼠，用β-gal抗体染色)本身；(c)在注射后四天(P6)时大多数Lin⁺HSC细胞(eGFP+)没有产生分化；(d)在注射后四天(P6)时肠系膜的eGFP+鼠EC；(e)将Lin^-HSCs(eGFP+)注射入成年小鼠眼睛；(f)GFAP-GFP转基因小鼠体内eGFP⁺Lin^-HSCs(箭头)的低倍数放大沿着预存的星形细胞模板寻靶并产生分化；(g)Lin^-细胞(eGFP)和下面的星形细胞(箭头)之间的缔合的高倍数放大；(h)非注射的GFAP-GFP转基因对照；(i)注射后四天(P6)，eGFP⁺Lin^-HSC细胞向未来的深丛区域移动，并产生分化。左侧的图形捕捉了在整装视网膜中的Lin^-HSC细胞活性；右侧的图形指示Lin^-细胞(箭头)在视网膜(顶部是玻璃体面，下部是巩膜面)中的位置；(j)使用α-CD31-PE和α-GFP-alexa488抗体进行双重标记。注射后七天，注入的Lin^-HSCs(eGFP，红色)渗入血管系统(CD31)中。箭头指示渗入面积；(k)注射14天后源自血管的eGFP⁺Lin^-HSC细胞(P17)；(l和m)罗丹明-葡聚糖的心脏内注射表明在初级(l)和深丛(m)中血管是完整的和功能健全的。

图3(a和b)显示eGFP⁺Lin^-HSC细胞对于由激光(a)和机械性(b)诱导的成年人视网膜损伤(星号指示受损伤的位置)造成的神经胶质过多(由GFAP表达-星形胶质细胞所指明的，左边的图像)具有靶向性。右边的图像是高倍数放大，表明Lin^-HSCs和星形胶质细胞的紧密关联性。标度条＝20μM。

图4说明Lin^-HSC细胞拯救了视网膜变性的小鼠的血管。将注射后27天的(a-d)视网膜(P33)用胶原IV染色；(a)和(b)，注射了Lin⁺HSC细胞(Balb/c)的视网膜显示血管系统与正常FVB小鼠的没有差异；(c)和(d)注射了Lin^-HSCs(Balb/c)的视网膜显示出丰富的类似于野生型小鼠的血管网状结构；(a)和(c)，整个视网膜的冰冻切片(顶部是玻璃体面，下部是巩膜面)，使用DAPI染色；(b)和(d)，视网膜总量的深丛；(e)条形图说明了在注入了Lin^-HSC细胞的视网膜(n＝6)中形成的深血管丛血管分布的增加。深视网膜血管化作用的程度通过计算每幅图像中血管的全长来确定。对Lin⁺HSC、Lin^-HSC或对照视网膜的血管的平均全长/高功率场(以微米表示)进行比较；(f)比较注入来自rd/rd小鼠的Lin^-HSC(R，右眼)或Lin⁺HSC(L，左眼)细胞后深血管丛的长度。比较六只独立的小鼠，列出结果(一种颜色代表一只小鼠)；(g)和(h)当注射到P15眼睛中时，Lin^-HSC细胞(Balb/c)还拯救了rd/rd-血管系统。列出了注射Lin^-HSC(G)或Lin⁺HSC(H)细胞的视网膜(注射后一个月)的中间体和深血管丛。

图5描述了小鼠视网膜组织的显微照片：(a)使用eGFP⁺Lin^-HSCs(绿色)注射后五天(P11)，视网膜整装切片(rd/rd小鼠)的深层；(b)和(c)在P6时接受了Balb/c Lin^-细胞(A)或Lin⁺HSC细胞(B)注射的Tie-2-GFP(rd/rd)小鼠的P60视网膜血管系统。使用CD31抗体将血管系统染色(红色)，只有内源性上皮细胞出现了绿色。箭头指示使用CD31但没有使用GFP染色的血管；(d)注射了Lin-HSC的视网膜和对照视网膜的α-SIMA染色。

图6显示T2-TrpRS-转染的Lin^-HSCs抑制小鼠视网膜血管系统的发育。(a)在氨基末端带有一个Igk信号序列的人TrpRS、T2-TrpRS和T2-TrpRS的图示；(b)注射了T2-TrpRS转染的Lin^-细胞的视网膜在体内表达T2-TrpRS蛋白。1，在E.coli中产生的重组体T2-TrpRS；2，在E.coli中产生的重组体T2-TrpRS；3，在E.coli中产生的重组体T2-TrpRS；4，对照视网膜；5，注射了Lin^-HSC+pSecTag2A的视网膜(只有载体)；6，注射了Lin^-HSC+pKLe135(在pSecTag中的Igk-T2-TrpRS)的视网膜。(a)，内源性TrpRSb、重组体T2-TrpRSc、注射了Lin^-HSC的T2-TrpRS的视网膜)；(c-f)，注射后7天接受了注射的视网膜的代表性初级(表面的)和中级(深部)丛；(c)和(d)，注射了空质粒-转染的Lin^-HSC的眼睛正常发育；(e)和(f)，大多数接受了T2-TrpRS-转染的Lin^-HSC注射的眼睛显示出深丛抑制作用；(c)和(e)，初级(表面的)丛；(d)和(f)，次级(深部)丛)。在F中观察到的血管的微弱轮廓是在(e)中显示的血管主要网状结构的“血-流”图像。

图7显示了编码His₆-标记的T2-TrpRS、SEQ ID NO：1的DNA序列。

图8显示了His₆-标记的T2-TrpRS、SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

图9说明注射了本发明Lin^-HSC和Lin⁺HSC(对照组)的小鼠眼睛视网膜的显微照片和视网膜电图(ERG)。

图10描述了使用Lin^-HSC处理的rd/rd小鼠眼睛的中间体(Int.)和深血管层显示神经元拯救(y-轴)和血管拯救(x-轴)之间的相关性的统计学曲线。

图11描述了使用Lin⁺HSC处理的rd/rd小鼠眼睛显示在神经元拯救(y-轴)和血管拯救(x-轴)之间无相关性的统计学曲线。

图12是使用Lin^-HSC处理(黑条)的rd/rd小鼠眼睛和未处理(白条)的rd/rd小鼠眼睛在注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)的时间点时以任意相对单位表示的血管长度(y-轴)的条形图。

图13包括3个条形图，它们是注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)时rd/rd小鼠外部神经层(ONR)的细胞核数量，表明使用Lin^-HSC处理(黑条)的眼睛相对于使用Lin⁺HSC处理(亮条)的对照组的细胞核数目有显著增加。

图14描述了个体rd/rd小鼠外部神经层细胞核数目的图，比较了在注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)的时间点时右眼(R，使用Lin^-HSC处理)和左眼(L，使用Lin⁺HSC处理)；图中的每一条线用以比较个体小鼠的眼睛。

优选实施方案的详述

本发明提供了一种分离的、哺乳动物骨髓衍生的谱系负性造血干细胞群，其包括内皮祖细胞。本发明分离的Lin^-HSC群优选包括HSC，其中至少50％的细胞包括CD31和c-kit细胞标记物抗原。在一个优选的实施方案中，至少约70％的HSC细胞包括CD31标记物，更优选约81％的细胞。在另一个优选的实施方案中，至少约65％的细胞包括c-kit细胞标记物，更优选约70％的细胞。

在本发明的分离的Lin^-HSC群的一个特别优选的实施方案中，约50％至约85％的细胞包括CD31标记物，约70％至约75％的细胞包括c-kit标记物，约4％至约8％的细胞包括Sca-1标记物，约2％至约4％的细胞包括Flk-1/KDR标记物。

本发明的分离的Lin^-HSC群还可包含不多于约1％的含有Tie-2抗原标记物的细胞。

在优选的实施方案中，本发明分离的Lin^-HSC群来自于鼠或人的骨髓，优选来自人的骨髓。

当将本发明的分离的Lin^-HSC群以玻璃体内的方式注射入分离的细胞的哺乳动物种的眼睛中时，其选择性地靶向和渗入视网膜的新血管系统中。

本发明的分离的Lin^-HSC群包含EPC细胞，其分化为上皮细胞，并且在视网膜内产生血管结构。具体地说，本发明的Lin^-HSC组合物用于治疗视网膜新生血管性和视网膜血管性变性疾病，可用于修复视网膜血管损伤。

本发明还提供了一种治疗患者眼部疾病的方法，包括从患者骨髓中分离出包含内皮祖细胞的谱系负性造血干细胞群，将能够阻断疾病的足够量的分离的干细胞从玻璃体内注射入患者的眼睛。这种方法可用于治疗眼部疾病诸如视网膜变性疾病、视网膜血管变性疾病、局部缺血性视网膜病变、血管出血、血管渗漏和脉络膜病变。这些疾病的实例包括与年龄相关的黄斑退行性改变(ARMD)、糖尿病性视网膜病(DR)、假性眼组织胞浆菌病(POHS)、早产儿视网膜病(ROP)、镰刀状细胞性贫血和色素性视网膜炎，以及视网膜损伤。

注射入眼睛的干细胞的数量足以阻断患者眼部的疾病状态。例如，细胞数目可有效地修复患者眼部的视网膜损伤，稳定视网膜新生血管系统、使视网膜新生血管系统发育成熟、预防或修复血管渗漏和血管出血。

本发明的分离的Lin^-HSC群中的细胞可被有治疗作用的基因转染，例如在以细胞为基础的对眼睛的基因治疗中使用的编码抗血管生成蛋白的基因。

转染的细胞可以包括任何对于治疗视网膜疾病有用的基因。优选地，本发明的Lin^-HSC群中的转染细胞包括编码抗血管生成肽、蛋白质、或蛋白质片段例如TrpRS、或抗血管生成片段例如T1和T2片段的基因。共同拥有、共同待审的美国专利申请序号10/080,839详细描述了这些内容，该专利申请的内容在此处引用作为参考。

本发明还提供了一种分离包括内皮祖细胞的来自骨髓的谱系负性造血干细胞群的方法。该方法包括以下步骤：(a)采集哺乳动物的骨髓；(b)从该骨髓中分离多数的单核细胞；(c)使用生物素轭合的针对CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的谱系系列抗体标记多数该单核细胞；和(d)从该多数单核细胞中除去对于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119来说是谱系正性的单核细胞，以提供一个包含内皮祖细胞在内的谱系负性造血干细胞群。

本发明还提供治疗眼部血管生成疾病的方法，通过以玻璃体内的方式给眼睛注射本发明的转染的Lin^-HSC组合物。这些转染的Lin^-HSC组合物包括被有治疗作用的基因转染的Lin^-HSC，例如编码抗-血管造影基因产物的基因。

优选地，至少约1×10⁵个Lin^-HSC细胞或转染的Lin^-HSC细胞是通过向有视网膜变性性疾病的眼睛进行玻璃体内注射而使用的。注射细胞的数量可以根据视网膜变性的严重性、患者的年龄以及其他对于治疗视网膜疾病领域的普通技术人员而言显而易见的因素决定。Lin^-HSC可以在一定时间内单剂量给药或多剂量给药，由负责治疗的医生决定。

本发明的Lin^-HSC群用于治疗包括视网膜血管系统障碍或退化的视网膜损伤和视网膜缺损。

本发明的转染Lin^-HSC群可用于递送治疗性基因到达视网膜，特别是到达视网膜血管系统。

在本发明基因递送方法的一个优选的实施方案中，本发明的Lin^-HSC群中的细胞被一个编码抗血管生成肽的基因转染，抗血管生成肽例如抗血管生成的色氨酸RNA合成酶(TrpRS)片段。特别优选的TrpRS片段包括TrpRS的T1和T2片段。本发明的编码抗血管生成肽的Lin^-HSC组合物中的转染细胞用于治疗涉及异常血管发育的视网膜疾病，例如糖尿病性视网膜病以及类似的疾病。

方法

实施例1.细胞的分离和浓缩；Lin^-HSC群A和B的制备

一般程序：所有的体内评价均符合有关保护和使用实验动物的NIH规定，所有的评价操作均由Scripps Research Institute(TSRI，La Jolla，CA)动物保护和使用委员会批准。从B6.129S7-Gtrosa26、Tie-2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(rd/rd小鼠)或Balb/cBYJ成年小鼠(The Jackson Laboratory，ME)中采集骨髓细胞。

接着使用HISTOPAQUE聚合蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)通过密度梯度分离法分离得到单核细胞，单核细胞使用生物素轭合的谱系系列抗体(CD45、CD3、Ly-6G、CD11、TER-119，Pharmingen，San Diego，CA)标记用于Lin^-选择。分离出谱系正性(Lin⁺)细胞，使用一种磁性分离装置(AUTOMACS^TM分离器，Miltenyi Biotech，Aubum，CA)将其从Lin^-HSC中移开。利用一种FACS^TM Calibur流式细胞测定器(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)对得到的包含内皮祖细胞的Lin^-HSC群进行进一步定性，使用的抗体为PE-轭合的-Sca-1、c-kit、KDR和CD31(Pharmingen，San Diego，CA)。Tie-2-GFP骨髓细胞用于表征Tie-2。

为了收集成年鼠的上皮细胞，通过外科手术移除ACTbEGFP小鼠的肠系膜组织，放置在胶原酶中(Worthington，Lakewood，NJ)以消化该组织，然后使用45μm过滤器进行过滤。收集滤过物，使用内皮细胞生长培养基(Clonetics，SanDiego，CA)进行培养。观察形态学鹅卵石样外观、使用CD31mAb(Pharmingen)染色、检查培养物在MATRIGEL^TM基质(Beckton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中管状结构的形成以确定内皮性状。

Lin^-HSC群A：通过上文所述的一般程序从ACTbEGFP小鼠中采集骨髓细胞。通过FACS流式细胞仪表征Lin^-HSC细胞的CD31、c-kit、Sca-1、Flk-1、和Tie-2细胞表面抗原标记。结果显示在图1c中。约81％的Lin^-HSC显示出CD31标记物，约70.5％的Lin^-HSC显示出c-kit标记物，约4％的Lin^-HSC显示出Sca-1标记物，约2.2％的Lin^-HSC显示出Flk-1标记物，约0.91％的Lin^-HSC显示出Tie-2标记物。相反，从这些骨髓细胞中分离的Lin⁺HSC的细胞标记物特性显著不同(也就是，CD31∶37.4％；c-kit∶20％；Sca-1∶2.8％；Flk-∶0.05％)。

Lin^-HSC群B：通过上文所述的一般程序从BalbC、ACTbEGFP和C3H小鼠中采集骨髓细胞。分析Lin^-HSC细胞是否存在细胞表面标记(Scal、KDR、cKit、CD34、CD31和不同的整联蛋白：α1、α2、α3、α4、α5、α6、α_M、α_V、α_X、α_IIb、β1、β4、β3、β4、β5和β7)。结果列于表1中。

表1.Lin^-HSC群B的特征

细胞标记              Lin^-HSC

  α1                  0.10

  α2                  17.57

  α3                  0.22

  α4                  89.39

  α5                  82.47

  α6                  77.70

  αL                  62.69

  αM                  35.84

  αX                  3.98

  αV                  33.64

  αIIb                0.25

  β1                  86.26

  β2                  49.07

  β3                  45.70

  β4                  0.68

  β5                  9.44

  β7                  11.25

  CD31                 51.76

  CD34                 55.83

  Flk-l/KDR            2.95

  c-kit                74.42

  Sca-1                7.54

实施例2.细胞的玻璃体内给药

使用精致的刀片制造出一个眼睑的裂隙，暴露P2至P6眼球。使用一个33-号(Hamilton，Reno，NV)针头的注射器在玻璃体内注射本发明的谱系负性HSC群A(在约0.5μl至约1μl细胞培养基中有大约10⁵个细胞)。

实施例3.EPC转染

依照生产商的说明书利用FuGENE^TM6转染试剂(Roche，Indianapolis，IN)用编码TrpRS的T2片段、也封入了His₆标记的DNA(SEQ ID NO：1，图7)转染Lin-HSC(群A)。将来自Lin^-HSC组合物的细胞(每ml大约10⁶个细胞)悬浮在包含干细胞因子(PeproTech，Rocky Hill，NJ)的opti-MEM培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。加入DNA(约1μg)和FuGENE试剂(约3μl)的混合物，将混合物在37℃下培养约18小时。培养后，洗涤并收集细胞。经由FACS分析确定，系统转染率大约为17％。使用蛋白质印迹法确认T2产物。His6-标记的T2-TrpRS氨基酸序列如SEQ ID NO：2，图8所示。

实施例4.免疫组织化学和共聚焦分析

在不同时间点收集视网膜，将其制备为用于整装或冰冻切片。对于整装切片，使用4％多聚甲醛固定视网膜，在室温下在50％胎牛血清(FBS)和20％正常山羊血清中封闭一小时。利用初级抗体处理视网膜，使用次级抗体对其进行检测。使用的初级抗体是：抗-胶原IV(Chemicon，Temecula，CA，anti-β-gal(Promega，Madison，WI)、抗-GFAP(Dako Cytomation，Carpenteria，CA)、抗-α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，Dako Cytomation)。使用的次级抗体与Alexa488或594荧光标记(分子探针，Eugene，OR)连接。使用MRC1024共聚焦显微镜(Bio-Rad，Hercules，CA)获取图像。利用LASERSHARP软件(Bio-Rad)创造三维图像用于检查整装视网膜中血管发育的三个不同的层面。利用共聚焦显微镜区分出的GFP(eGFP)增强的小鼠和GFAP/wtGFP小鼠之间GFP像素强度的差别来产生三维图像。

实施例5.体内视网膜血管生成定量分析

对于T2-TrpRS分析，从三维图像中重建初级丛和深丛。初级丛被分作两类：正常发育或停止的血管发育。深度血管发育抑制的种类根据血管抑制百分率进行分析，包括下述标准：深丛形成完全抑制被标记为“完全的”，正常的血管发育(包括抑制小于25％)被标记为“正常的”，其余的被标记为“部分的”。对于rd/rd小鼠的拯救数据，使用10x透镜获得每个整装视网膜中深丛的四个分离的区域。计算每幅图像的血管系统的全长、总结并进行组间比较。为了获得准确的信息，将Lin^-HSC注射入一只眼睛中，而将Lin⁺HSC注射入同一只鼠的另一只眼睛中。非-注射的对照视网膜取自同一窝动物。

实施例6.成年人视网膜损伤模型

利用二极管激光器(150mW，1秒，50mm)或用一个27号注射针头机械刺穿视网膜来制造激光和瘢痕模型。在受伤后五天，利用玻璃体内注射方法注射细胞。五天后采集眼睛。

实施例7.视网膜再生的神经营养拯救

成人骨髓衍生的谱系造血干细胞(Lin^-HSC)在视网膜变性小鼠模型中具有血管营养和神经营养拯救作用。在10天龄小鼠的右眼玻璃体内注射约0.5ml包含约10⁵本发明的Lin^-HSC，2个月后评估视网膜血管系统和神经元层核的数量。给同一只鼠的左眼注射大约同样数量的Lin⁺HSC作为对照，进行同样的评估。如图9.所示，在Lin^-HSC处理的眼睛中视网膜血管系统表现为近似正常，内核层近似正常，外核层(ONL)有约3至4层的神经核。相反，相反一侧的Lin⁺HSC处理的眼睛有一个显著地萎缩的中间视网膜血管层，一个完全萎缩的外层视网膜血管层；内核层显著地萎缩，外核层则完全失去。在小鼠3和小鼠5中戏剧性地说明了这一点。在小鼠1中没有产生拯救作用，而且大约15％的注射小鼠均是这种情况。

当利用视网膜电图(ERG)评价视觉功能时，同时观测到正性ERG的恢复和血管、神经元的拯救(小鼠3和5)。没有血管和神经元拯救时(小鼠1)则观测不到正性ERG。图10.所示的回归分析曲线说明了本发明Lin^-HSC产生的rd/rd小鼠血管和神经元拯救之间的相关性。对于中间体血管系统类型(r＝0.45)和深血管系统(r＝0.67)观测到神经元(y-axis)和血管(x-axis)修复之间的相关性。

图11.说明了在Lin⁺HSC产生的血管和神经元拯救之间缺乏任何统计学上的显著相关性。将血管拯救定量化并将数据列于图12.中。图12.显示了在注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)时小鼠的数据，说明使用本发明Lin^-HSC处理的眼睛中的血管长度(黑色柱)与同一只小鼠的没有处理的眼睛中的血管长度(白色柱)相比有显著增加，特别是在注射后1个月和2个月时。在注射Lin^-HSC或Lin⁺HSC约两个月后通过计数内核层和外核层的细胞核数量，对神经营养治疗作用定量化。结果列于图13.和14.中。

结果

鼠视网膜血管发育；眼睛血管生成的模型

小鼠眼睛提供了一种公认的用于研究哺乳动物视网膜血管发育，例如人视网膜血管发育的模型。在鼠视网膜血管系统发育期间，局部缺血-导致的视网膜血管的发育与星形胶质细胞紧密联系。神经胶质成分沿着神经节细胞层从视神经盘移动至妊娠晚期人类胎儿或新生啮齿动物的视网膜上，并呈放射状传播。当鼠类视网膜血管系统发育时，上皮细胞利用已建立的星形细胞模板测定视网膜血管模式(见图1a和b)。图1(a和b)描述了鼠视网膜发育示意图。图1a描述了与星形胶质细胞模板(亮线)重叠的初级丛(图左上方的暗线部分)的发育，图1b描述了视网膜血管形成的第二阶段。在此图中，GCL代表神经节细胞层、IPL代表内部血管网状组织层、INL代表内核层、OPL代表外部血管网状组织层、ONL代表外核层、RPE代表视网膜色素上皮、ON代表视神经，而P代表外周。

出生时，视网膜血管系统事实上是不存在的。在出生后的第14天(P14)视网膜发育出复合的视网膜血管初级(表面的)层和次级(深度)层，与视觉起始相一致。开始时，辐射状视乳头周围血管向着外周神经在预存的星形细胞网状结构之上呈放射状生长，变为通过毛细管丛形成进行性地互相连接。这些血管经过P10(图1a)在神经纤维内作为单细胞层生长。在P7-P8之间，侧副支开始从初级丛萌芽，穿透视网膜至外部丛状层，在那里形成次级或深度视网膜丛。P21，整个网状结构经历了广泛地改造，在内核层的内表面形成第三级或中间体丛(图1b)。

由于若干理由，新生的鼠视网膜血管发生模型可用于研究在眼睛的血管发生期间HSC的作用。在这个生理学相关的模型中，在内源性血管出现之前产生大量的星形细胞模板，在新生血管产生过程中允许对细胞-细胞靶向作用进行评估。此外，已知连贯的、重现性的新生视网膜血管过程是受缺氧驱动的，在这一方面与许多的视网膜疾病相似，其中局部缺血扮演了重要角色。

源自骨髓的内皮祖细胞(EPC)的富集

虽然在HSC制剂中发现的EPC群上已对细胞表面标记表达进行了广泛的评估，但是确定的专一性地鉴别EPC的标记仍然很少。为了富集EPC，造血谱系标记正性细胞(Lin⁺)，即B淋巴细胞(CD45)、T淋巴细胞(CD3)、粒细胞(Ly-6G)、单核细胞(CD11)和红细胞(TER-119)，均从骨髓单核细胞中耗尽了。使用Sca-1抗原进一步富集EPC。在玻璃体内注射相同数量的Lin^-Sca-1⁺细胞或Lin^-细胞后而获得一个对照结果，两组之间没有检测到有任何区别。事实上，当仅注射Lin^-Sca-1⁺细胞时，观察到远大得多的对发育中的血管的渗入。

基于功能性分析富集本发明的Lin^-HSC以获取EPC。此外，Lin⁺HSC群与Lin^-HSC群的功能性表现十分不同。还对通常用于鉴别每一部分的EPC(以之前报告的体外特征研究为基础)的抗原表位进行评估。虽然这些标记中没有一个与Lin^-部分唯一地联系，然而与Lin⁺HSC部分相比较，Lin^-HSC中所有的标记都增高了约70-1800％(图1c)。图1c说明了骨髓衍生的Lin⁺HSC和Lin^-HSC分离的细胞的流动细胞计数特征。图1c的最上面一行显示非抗体标记的细胞的造血干细胞打点图分布。R1确定了阳性PE-染色的可计量门控区域；R2指示了GFP-阳性的。Lin^-HSC的打点图显示于中间行，最下面一行显示了Lin⁺HSC的打点图。将C57B/6细胞用Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-轭合的抗体进行标记。Tie-2数据得自Tie-2-GFP小鼠。打点图角上的百分数指示阳性-标记的细胞占Lin⁺HSC或Lin^-HSC群总数的百分比。有趣的是，公认的EPC标记例如FIk-1/KDR、Tie-2和Sca-1表达很差，因此没有用于进一步的分级。

在玻璃体内注射的HSC Lin^-细胞包含EPC，其对星形胶质细胞具有靶向作用并渗入发育中的视网膜血管系统

为了测定玻璃体内注射的Lin^-HSC是否能够靶向视网膜的特定的细胞类型，利用星型细胞模板并参与视网膜的血管发生，将来自本发明的Lin^-HSC组合物的大约10⁵个细胞或分离自成年(GFP或LacZ转基因)小鼠骨髓的Lin⁺HSC细胞(对照，大约10⁵个细胞)注入出生后2天(P2)的小鼠眼睛中。注射4天后(P6)，得自GFP或LacZ转基因小鼠的本发明Lin^-HSC组合物的许多细胞附着在视网膜上，并且具有上皮细胞的特征性的伸长的外观(图2a)。图2说明了Lin^-细胞移入发育中的小鼠视网膜。如图2a所示，在注射4天后(P6)在玻璃体内注射的eGFP+Lin^-HSC附着在视网膜上，并产生分化。

在视网膜的许多区域，以一定的样式配置表达GFP的细胞，与隐晦的星形细胞相一致并且与血管相似。在内源性、发育中的血管网状结构之前观测到这些荧光细胞(图2b)。相反，只有少量的Lin⁺HSC(图2c)或成年小鼠肠系膜上皮细胞(图2d)附着在视网膜的表面。为了确定来自注射的Lin^-HSC组合物的细胞是否也能够附着在含有已建立的血管的视网膜上，我们向成年小鼠的眼睛中注射Lin^-HSC组合物。有趣的是，没有观察到细胞附着在视网膜上，或渗入已建立的正常视网膜的血管中(图2e)。这表明本发明的Lin^-HSC组合物不能破裂正常发育的血管系统，也不会引发正常发育的视网膜中的异常血管化作用。

为了确定本发明的注射的Lin^-HSC组合物和视网膜星形细胞之间的关系，使用转基因小鼠，其表达胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP，星形细胞的标记物)和启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)。对注射了来自eGFP转基因小鼠的Lin^-HSC的GFAP-GFP转基因小鼠视网膜进行检查，表明注入的eGFP EPC和现存的星形细胞的共定位(图2f-h，箭头)。观察到eGFP+Lin^-HSC的过程与隐晦的星形细胞网状结构相一致(箭头，图2g)。对这些眼睛的检查表明注入的标记的细胞只附着到星形细胞上；在P6小鼠的视网膜中，其中视网膜外周没有内源性血管，观察到注入的细胞附着在这些还没有血管化的区域中的星形细胞上。令人吃惊的是，在视网膜深层中的精确的位置上观察到注入的、标记的细胞，此处正常的视网膜血管接着发育(图2i，箭头)。

为了确定本发明的注射的Lin^-HSC是否稳定地渗入发育中的视网膜血管系统，在随后的几个时间点检测视网膜血管。早在P9(注射后7天)时，Lin^-HSC渗入CD31⁺结构(图2j)中。截止到P16(注射后14天)时，细胞已经广泛地渗入视网膜的血管样结构中(图2k)。当在处死动物前在血管内注射罗丹明-葡聚糖(鉴别功能性视网膜血管)时，大多数Lin^-HSC与伸展的血管排成一线(图21)。观察到标记的细胞分布的两个样式：(1)在一个样式中，细胞沿着未标记的上皮细胞之间的血管散布；(2)另一个样式显示血管完全由标记的细胞组成。注入的细胞也渗入深血管丛的血管中(图2m)。虽然Lin^-HSC-衍生的EPC对新生性血管系统的零星地渗入以前曾有报道，然而这却是首次报道血管网状结构全部由这些细胞组成。这表明来自玻璃体内注射的骨髓衍生的本发明的Lin^-HSC群的细胞能够有效地渗入形成视网膜血管丛的任何一层中。

当至多在玻璃体内注射后5或10天检查时，非-视网膜组织(例如脑、肝、心脏、肺、骨髓)的组织学检查表明不存在任何GFP正性细胞。这说明Lin^-HSC组分中的细胞亚群选择性地靶向视网膜星形细胞，稳定地渗入发育中的视网膜血管系统。既然这些细胞具有很多上皮细胞的特征(与视网膜星形细胞联合、伸长形态、稳定地渗入伸展的血管中并且不出现在血管外位置)，这些细胞代表EPC出现在Lin^-HSC群中。定向的星形细胞与在许多缺氧性视网膜病中观察到的是同一类型；已知神经胶质细胞是在DR或视网膜损伤的其他形式中观察到的新生血管植物体的主要成分。在活性神经胶质增生和局部缺血-诱导的新生血管形成条件下，活性星形细胞增生，产生细胞因子，正调节GFAP，与在许多哺乳动物种包括人的新生视网膜血管模板结构中观察到的相似。

为了测试本发明的Lin^-HSC组合物在成年鼠的眼中是否像其在新生鼠眼中一样对活性星形细胞具有靶向作用，将Lin^-HSC细胞注射入视网膜被光凝固(图3a)或针尖(图3b)损伤的成年鼠眼睛中。在两个模型中，只有在受损伤部位附近观察到明显被GFAP染色的细胞(图3a和b)。来自注入的Lin^-HSC组合物的细胞定位在受损伤部位，保持与GFAP-正性星形细胞的特异性联系(图3a和b)。在这些位置，还观察到Lin^-HSC细胞转移至视网膜的更深层，其水平与在深度视网膜血管系统的新生形成期间观察到的相类似(没有给出数据)。视网膜的未受损部位不包含Lin^-HSC细胞，这与将Lin^-HSC注入正常未受损成年鼠视网膜中时观察到的结果相同(图2e)。这些数据表明Lin^-HSC组合物在具有神经胶质增生的受损伤成年鼠视网膜以及血管化作用的新生视网膜中对活性神经胶质细胞具有选择性的靶向作用。

在玻璃体内注射的Lin^-HSC能够拯救和稳定变性的血管系统

因为在玻璃体内注射的Lin^-HSC组合物对星形胶质细胞具有靶向作用并且能够渗入正常的视网膜血管系统，那么在与神经胶质增生和血管变性相关的局部缺血或变性的视网膜疾病中这些细胞也能够稳定变性的血管系统。出生后一个月的rd/rd小鼠是显示光感受器和视网膜血管层深度变性的视网膜变性模型。在这些小鼠中视网膜血管系统正常发育直到P16，在这一时间点更深的血管丛开始退化；到P30时，绝大多数小鼠的深度和中间丛几乎完全变性。

为了确定HSC是否能够拯救退化的血管，在P6时在rd/rd小鼠玻璃体内注射Lin⁺或Lin^-HSC(来自Balb/c鼠)。到P33时，注射Lin⁺细胞后，最深视网膜层的血管几乎完全不存在(图4a和b)。相反，在P33时大多数Lin^-HSC注射的视网膜具有一个几乎正常的视网膜血管系统，其有三个平行、良好成形的血管层(图4a和4d)。这种作用的定量化表明注射Lin^-的rd/rd小鼠眼睛深血管丛中血管的平均长度几乎是未治疗或Lin⁺细胞治疗的眼睛的三倍(图4e)。令人吃惊的是，注射rd/rd成年小鼠(FVB/N)骨髓衍生的Lin^-HSC组合物也拯救了变性的rd/rd新生小鼠视网膜血管系统(图4f)。在rd/rd小鼠出生后2-3周观察到眼睛血管系统的变性。晚至P15时注射Lin^-HSC也能够部分稳定rd/rd小鼠的变性的血管系统至少一个月(图4g和4h)。

注入幼龄rd/rd小鼠(例如P2)中的Lin^-HSC组合物也可渗入发育中的表面血管系统。至P11时，观察到这些细胞移至深血管丛，并形成与在野生型外部视网膜血管层观察到的相同的图像(图5a)。为了更加清楚地描述来自注射的Lin^-HSC组合物的细胞渗入、稳定和变性rd/rd小鼠的视网膜血管系统的方式，将衍生自Balb/c小鼠的Lin^-HSC组合物注射入Tie-2-GFP FVB小鼠的眼睛中。FVB小鼠具有rd/rd小鼠基因型，因为它们表达融合蛋白Tie-2-GFP，所有的内源性血管都是发荧光的。

当将Lin^-HSC组合物中非标记的细胞注射入新生Tie-2-GFP FVB小鼠的眼睛并随后即渗入发育中的血管系统中时，内源性Tie-2-GFP标记的血管中应当有非标记裂隙，这些裂隙对应于注射的渗入的非标记Lin^-HSC。然后以其他的血管标记(例如CD-31)染色后，描绘全部的血管，允许测定非内源性上皮细胞是否是血管系统的一部分。在注射两个月后，在注射了Lin^-HSC组合物的眼睛视网膜中观察到CD31-阳性、Tie-2-GFP阴性的血管(图5b)。有趣的是，大多数拯救的血管包括Tie-2-GFP阳性细胞(图5c)。不管是否有血管拯救，通过染色平滑肌肌动蛋白测定的周皮细胞的分布不因注射Lin^-HSC而改变(图5d)。这些数据清楚地表明在玻璃体内注射的本发明Lin^-HSC组合物在有遗传性缺陷的小鼠内转移至视网膜，参与正常的视网膜血管的形式，稳定内源性的变性中的血管系统。

由从Lin^-Hsc转染的细胞造成的视网膜血管发生的抑制

大多数视网膜血管疾病涉及异常的血管增殖而不是变性。对星形细胞具有靶向作用的转基因细胞可用于传递抗血管生成蛋白和抑制血管发生。使用T2-色氨酰-tRNA合成酶(T2-TrpRS)对来自Lin^-HSC组合物的细胞进行转染。T2-TrpRS是可有效抑制视网膜血管发生的TrpRS的一个43kD片段(图6a)。关于P12，在P2上注射对照质粒转染的Lin^-HSC组合物(无T2-TrpRS基因)的眼睛视网膜有正常的初级(图6c)和次级(图6d)视网膜血管丛。当将T2-TrpRS转染的本发明的Lin^-HSC组合物注射入P2眼睛中并在10天后进行评价时，主要的网状结构产生显著异常(图6e)并且深视网膜血管系统的形成几乎完全被抑制(图6f)。几乎没有观察到这些眼睛中的血管被血管之间的大裂隙明显减弱。T2-TrpRS-分泌型Lin^-HSC细胞引起的抑制程度列于表2中。

T2-TrpRS由Lin^-HSC组合物中的细胞在体外产生和分泌，在将这些转染的细胞注射入玻璃体内之后，在视网膜中观察到一个30kD的T2-TrpRS片段(图6b)。这种30kD的片段仅在注射转染的本发明Lin^-HSC的视网膜中能够观察到，与重组体或体外合成的蛋白相比，这种表观分子量的降低可能是由于体内T2-TrpRS的加工或降解而引起的。这些数据表明Lin^-HSC组合物可被用于通过活性星形细胞的靶向作用传递功能性的活性基因例如表达血管生成抑制分子的基因，至视网膜的血管系统。虽然观察到的血管生成抑制作用可能是由于细胞介导的活性引起的，但这是很不可能的，因为使用相同的、但是非T2-转染的Lin^-HSC组合物治疗的眼睛具有正常的视网膜血管系统。

              表2.T2-TrpRS-分泌型Lin^-HSC细胞的血管抑制作用

	初级丛		深丛
						受抑制的	正常的	完全的	部分的	正常的
	TsTrpRs(15只眼)	60％(9只眼)	40％(6只眼)	33.3％(5只眼）	60％(9只眼)						6.7％(1只眼)
对照(13只眼)						0％(0只眼)	100％(13只眼)	0％(0只眼)	38.5％(5只眼)	61.5％(8只眼)

在玻璃体内注射的Lin^-HSC组合物定位至视网膜星形细胞、渗入血管，可用于治疗多种视网膜性疾病。虽然注射的HSC组合物中的大多数细胞附着在星形细胞模板上，但是少数细胞移动至视网膜，靶向深血管网状结构随后进行发育所在区域。即使在出生后42天之前，在此区域虽然没有观察到GFAP-阳性星形细胞，但是也不排除GFAP-阴性神经胶质细胞已经存在而为L^-HSC定位提供信号的可能性。以前的研究显示许多疾病与活性神经胶质增生相关。在DR中，尤其是，神经胶质细胞及其细胞外基质与病理学血管发生相关。

既然来自注射的Lin^-HSC组合物中的细胞特异性地附着在表达GFAP的神经胶质细胞上，不管损伤类型是什么，本发明的Lin^-HSC组合物都可用于靶向视网膜中的预一血管生成伤口。例如，在局部缺血性视网膜病如糖尿病中，新生血管形成是一种对于组织缺氧的响应。通过Lin^-HSC组合物对于病理性新生血管形成位置的靶向作用，发育中的新生性血管系统可被稳定用以预防新生性血管系统异常例如出血或水肿(与DR相关的视觉丧失的原因)，还可能减轻本来刺激新生血管形成的组织缺氧。异常的血管可被修复为正常状态。此外，血管生成抑制蛋白如T2-TrpRS可利用转染的Lin^-HSC组合物和激光诱导的星形细胞激活作用而被传递至病理性血管发生的位置。既然激光光凝术在临床眼科学中是常规使用的方法，这种方法可应用于治疗多种视网膜疾病。虽然这种以细胞为基础的方法已经在癌症治疗中进行了研究，但是由于在眼球内注射使将大量细胞传递至疾病部位成为可能，这种方法在治疗眼部疾病中的应用将会带来更大的益处。

使用Lin^-HSC的神经营养性和血管营养性拯救

MACS用于从上文所述的增强的绿色荧光蛋白(eGFP)、C3H(rd/rd)、FVB(rd/rd)小鼠的骨髓中分离Lin^-HSC。将包含来自这些小鼠的EPC的Lin^-HSC以玻璃体内的方式注射入P6 C3H或FVB小鼠的眼睛中。在注射后的不同时间点(1个月、2个月和6个月)收集视网膜。在用CD31抗体染色后利用扫描激光共焦显微镜和在用DAPI核染色后利用视网膜组织学对血管系统进行分析。在不同时间点对视网膜mRNA进行微点阵基因表达分析用于鉴别在此作用中可能涉及的基因。

截止到P21时，rd/rd小鼠眼睛的神经感觉视网膜和视网膜血管系统均产生严重变性。使用Lin^-HSC处理的rd/rd小鼠眼睛在P6时视网膜血管系统仍然正常，并保持长达6个月；在所有的时间点(1M、2M和6M)，与对照组相比较，深层和中间层均有显著改善(见图12)。此外，我们观察到与使用Lin⁺HSC处理的对照眼睛相比较，使用Lin^-HSC处理的视网膜还更厚(1M，1.2-倍；2M，1.3-倍；6M，1.4-倍)，并且在外核层含有更多数量的细胞(1M，2.2-倍；2M，3.7-倍；6M，5.7-倍)。相对于“对照”(未处理的或非-Lin^-处理的)rd/rd小鼠视网膜，对“拯救的”(例如，Lin^-HSC)的大规模的基因组分析表明编码sHSPs(小热休克蛋白)和与血管、神经治疗相关的特定生长因子的基因显著上调，所述生长因子包括列于表3的因子。

本发明的骨髓衍生的Lin^-HSC显著而重复性地诱导了正常血管的维护，在rd/rd小鼠中极大地增加了光感受器和其他的神经细胞层。这种神经营养性拯救作用与小热休克蛋白和生长因子的显著增量调节相关，因此，对于目前尚不能治疗的视网膜变性疾病提供了治疗方法的思路。

表3.在注射Lin^-HSC的小鼠视网膜中增量调节的基因

常用名	Lin(-)	CD31(-)	对照rd小鼠	基因库号	注解
						Tgtp	11.855	0.526	0.664	L38444	T-细胞-特异性蛋白
H-2D4(q)	7.091	0.916	0.694	X52914	移植抗原
						H2-K2；H-2K2	4.507	0.705	0.547	M27134	细胞表面糖蛋白
Lzp-s	6.514	0.648	0.987	X51547	溶菌酶；溶菌酶P
						Kcnj5	4.501	0.855	0.722	U33631	G-蛋白门控的K+通道
EST	2.905	1.000	0.750	AA087373	EST
						Scya8	5.186	0.470	0.996	AB023418	MCP-2前体
Ly6a	4.020	0.962	0.792	X04653	Ly-6同种抗原
						Anxal	2.490	0.599	0.510	AV003419	EST
Pip5klc	3.405	0.944	0.782	AB006916	磷脂酰肌醇激酶
						EST	3.999	0.502	0.975	AU042276	EST
MAD	3.763	0.560	0.892	X83106	MAX二聚蛋白
						Cxadr	3.977	0.814	1.000	U90715	CAR
lsg15	2.218	0.642	0.449	X56602	干扰素诱导蛋白
						EST	3.512	0.901	0.978	AA790936	EST
Tm4sfl	3.022	0.493	0.697	AV087000	EST
						IgG VH-II	2.644	0.948	0.909	X02463	Ig重链；可变区
Yyl	2.967	0.854	0.874	M74590	δ-转录因子
						EST	2.952	0.869	0.822	AA739246	EST
EST	2.575	0.486	0.650	AW046243	EST
						Psmb9	3.288	0.492	0.975	D44456	多肽复合物亚基-2
EST	2.195	0.873	0.904	AV172782	EST
						H2-Aa	2.627	0.878	0.940	X52643	I-EαNON，MHC
EST	2.697	0.791	0.869	AV076889	EST

晶体蛋白基因

Crybb2	8.726	0.552	0.831	M60559	β-B2-晶体蛋白
						Cryaa	3.995	0.567	1.000	J00376	α-A-晶体蛋白
CrygD	2.090	0.740	0.972	AJ224342	γ-D-晶体蛋白
						Crybal	6.520	0.930	0.603	AJ239052	β-A3/A1-晶体蛋白
Crygs	2.892	0.971	0.854	AF032995	γ-S-晶体蛋白
						CrygC	5.067	1.000	0.826	Z22574	γ-C-晶体蛋白
CrygF	1.942	0.999	0.688	AJ224343	γ-F-晶体蛋白

讨论

谱系定型造血细胞的标记用于负性选择包含EPC的骨髓-衍生的Lin^-HSC群。虽然可用作EPC的骨髓-衍生的Lin^-HSC亚群不是由通常使用的细胞表面标记表征的，但发育中或受损伤的视网膜血管系统中这些细胞的行为完全不同于对于Lin⁺和成体上皮细胞群所观察到的结果。使用标记如Sca-1进行的进一步HSC的亚分级表明Lin^-Scal⁺细胞没有显示出与单独使用Lin^-HSC细胞有任何的实质性差别。这些细胞对视网膜血管发生的位置具有选择性的靶向作用，并参与新血管的形成。

遗传性视网膜变性性疾病经常伴随视网膜血管系统的损耗。对这类疾病的有效治疗要求恢复功能与维护复杂的组织结构。虽然最近的一些研究探索了以细胞为基础的营养因子或干细胞自身传递的用途，但二者的某种结合仍可能是必需的。例如，使用生长因子疗法治疗视网膜变性性疾病导致血管不能调节的过度生长，造成了正常视网膜组织结构的严重性破裂。使用神经或视网膜干细胞治疗视网膜变性性疾病可以重建神经元功能，但功能性血管系统对于维持视网膜的功能性完整也是必须的。本发明的Lin^-HSC组合物的细胞对rd/rd小鼠视网膜血管的渗入在不破裂视网膜结构的情况下稳定了变性的血管系统。当向P15rd/rd小鼠中注射细胞时也可观察到这种拯救作用。由于血管变性在P16时开始，这种观察扩展了有效的Lin^-HSC治疗的治疗范围。在注射了本发明Lin^-HSC的眼睛中保护了视网膜神经元和光感受器，维护了视觉功能。

本发明的Lin^-HSC组合物包括EPC群，其可通过对活性星形细胞的靶向作用而促进血管发生、渗入已建立的没有破裂视网膜结构的模板中。本发明Lin^-HSC还提供了一种令人吃惊的对于患有视网膜变性的眼睛具有长期的神经营养性的拯救作用。此外，包含EPC的遗传性修饰的自体固有的Lin^-HSC在长时间内可被移入局部缺血或异常血管化的眼睛中，稳定地渗入新血管中，连续地局部性地递送治疗分子。这种在生理学有意义的剂量范围内表达药理学因子的基因的局部递送代表了一种新的用于治疗目前还不能被治疗的眼部疾病的新范例。

序列表

<110>The Scripps Research Institute

Friedlander，Martin

Otani，Atsushi

DaSilva，Karen

<120>造血干细胞和治疗新生血管性眼部疾病的方法

<130>TSRI-900.1

<150>60/467051

<151>2003-05-02

<150>60/398522

<151>2002-07-25

<160>2

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>4742

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>编码His-标记的人类T₂-TrpRS的DNA

<400>1

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840

tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900

tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960

cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020

aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140

tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200

ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320

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gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500

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caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460

tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520

cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580

gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640

gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700

catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760

tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820

ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880

tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940

ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000

aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060

gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120

tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180

acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240

cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300

cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360

tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420

tatacatatg agtgcaaaag gcatagacta cgataagctc attgttcggt ttggaagtag 3480

taaaattgac aaagagctaa taaaccgaat agagagagcc accggccaaa gaccacacca 3540

cttcctgcgc agaggcatct tcttctcaca cagagatatg aatcaggttc ttgatgccta 3600

tgaaaataag aagccatttt atctgtacac gggccggggc ccctcttctg aagcaatgca 3660

tgtaggtcac ctcattccat ttattttcac aaagtggctc caggatgtat ttaacgtgcc 3720

cttggtcatc cagatgacgg atgacgagaa gtatctgtgg aaggacctga ccctggacca 3780

ggcctatggc gatgctgttg agaatgccaa ggacatcatc gcctgtggct ttgacatcaa 3840

caagactttc atattctctg acctggacta catggggatg agctcaggtt tctacaaaaa 3900

tgtggtgaag attcaaaagc atgttacctt caaccaagtg aaaggcattt tcggcttcac 3960

tgacagcgac tgcattggga agatcagttt tcctgccatc caggctgctc cctccttcag 4020

caactcattc ccacagatct tccgagacag gacggatatc cagtgcctta tcccatgtgc 4080

cattgaccag gatccttact ttagaatgac aagggacgtc gcccccagga tcggctatcc 4140

taaaccagcc ctgttgcact ccaccttctt cccagccctg cagggcgccc agaccaaaat 4200

gagtgccagc gacccaaact cctccatctt cctcaccgac acggccaagc agatcaaaac 4260

caaggtcaat aagcatgcgt tttctggagg gagagacacc atcgaggagc acaggcagtt 4320

tgggggcaac tgtgatgtgg acgtgtcttt catgtacctg accttcttcc tcgaggacga 4380

cgacaagctc gagcagatca ggaaggatta caccagcgga gccatgctca ccggtgagct 4440

caagaaggca ctcatagagg ttctgcagcc cttgatcgca gagcaccagg cccggcgcaa 4500

ggaggtcacg gatgagatag tgaaagagtt catgactccc cggaagctgt ccttcgactt 4560

tcagaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa 4620

caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc 4680

ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 4740

at                                                                4742

<210>2

<211>392

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>His-标记的人类T₂-TrpRS

<400>2

Met Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly

 1               5                  10                  15

Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr

            20                  25                  30

Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His

        35                  40                  45

Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe

    50                  55                  60

Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly

65                  70                  75                  80

His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn

                85                  90                  95

Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys

            100                 105                 110

Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys

        115                 120                 125

Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser

    130                 135                 140

Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val

145                 150                 155                 160

Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly

                165                 170                 175

Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln

            180                 185                 190

Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg

        195                 200                 205

Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr

    210                 215                 220

Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro

225                 230                 235                 240

Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr

                245                 250                 255

Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr

            260                 265                 270

Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly

        275                 280                 285

Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val

    290                 295                 300

Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys

305                 310                 315                 320

Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly

                325                 330                 335

Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu

            340                 345                 350

His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe

        355                 360                 365

Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala

    370                 375                 380

Leu Glu His His His His His His

385                 390

Claims (55)

1.一种包括内皮祖细胞的分离的哺乳动物骨髓衍生的谱系负性造血干细胞群，其中至少约50％的所述细胞包括细胞标记物CD31和c-kit。

2.如权利要求1所述的分离的干细胞群，其中至少约75％的所述细胞包括细胞标记物CD31。

3.如权利要求1所述的分离的干细胞群，其中至少约65％的所述细胞包括细胞标记物c-kit。

4.一种包括内皮祖细胞的分离的哺乳动物骨髓衍生的谱系负性造血干细胞群，其中至少约80％的所述细胞包括CD31细胞标记物，至少约70％的所述细胞包括c-kit细胞标记物。

5.如权利要求1所述的分离的干细胞群，其中所述细胞是鼠细胞。

6.如权利要求1所述的分离的干细胞群，其中所述细胞是人类细胞。

7.如权利要求1所述的分离的干细胞群，其中不多于约8％的所述细胞还包括细胞标记物Sca-1，并且不多于约4％的所述细胞还包括细胞标记物Flk-1/KDR。

8.如权利要求7所述的分离的干细胞群，其中不多于约1％的所述细胞包括Tie-2细胞标记物。

9.如权利要求1所述的分离的干细胞群，其中约50％至约85％的所述细胞包括CD31标记物，约70％至约75％的所述细胞包括c-kit标记物，约4％至约8％的所述细胞包括Sca-1标记物，并且约2％至约4％的所述细胞包括Flk-1/KDR标记物。

10.如权利要求1所述的分离的干细胞群，还包括细胞培养基。

11.如权利要求10所述的分离的干细胞群，其中干细胞衍生自哺乳动物骨髓。

12.如权利要求10所述的分离的干细胞群，其中干细胞衍生自人类骨髓。

13.一种制备权利要求1所述的分离的干细胞群的方法，包括下述步骤：

(a)采集哺乳动物的骨髓；

(b)从该骨髓中分离多数的单核细胞；

(c)使用生物素轭合的针对CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的谱系系列抗体标记多数单核细胞；和

(d)从该多数单核细胞中除去对于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119来说是谱系正性的单核细胞，以提供一个包含内皮祖细胞在内的谱系负性造血干细胞群。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述的哺乳动物是成年哺乳动物。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述的哺乳动物是小鼠。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述的哺乳动物是人类。

17.如权利要求13所述的方法，其中至少约50％的谱系负性造血干细胞群包括CD31和c-kit细胞标记物。

18.如权利要求13所述的方法，其中谱系负性造血干细胞群包括能靶向受损伤的成年视网膜的神经胶质富集区域的内皮祖细胞。

19.权利要求1所述的分离的干细胞群在制备用于增强哺乳动物视网膜新生血管化的药物中的用途，所述药物为玻璃体内注射剂型，其中干细胞衍生自哺乳动物的骨髓，该哺乳动物与需要将细胞注射到眼睛中的哺乳动物的种类相同。

20.如权利要求19所述的用途，其中所述哺乳动物是鼠。

21.如权利要求19所述的用途，其中所述哺乳动物是人类。

22.权利要求1所述的分离的干细胞群在治疗患者眼部疾病的药物中的用途，所述药物为玻璃体内注射剂型。

23.如权利要求22所述的用途，其中干细胞的数量可有效地修复患者眼睛中的视网膜损伤。

24.如权利要求22所述的用途，其中干细胞的数量可有效地稳定患者眼睛的视网膜新生血管系统。

25.如权利要求22所述的用途，其中干细胞的数量可有效地使患者眼睛视网膜新生血管系统发育成熟。

26.如权利要求22所述的用途，其中谱系负性造血干细胞群通过下述方法分离：

(a)采集哺乳动物的骨髓；

(b)从该骨髓中分离多数的单核细胞；

(c)使用生物素轭合的针对CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的谱系系列抗体标记多数单核细胞；和

(d)从该多数单核细胞中除去对于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119来说是谱系正性的单核细胞，以提供一个包含内皮祖细胞在内的谱系负性造血干细胞群。

27.如权利要求26所述的用途，其中至少约50％分离的谱系负性造血干细胞群包括细胞标记物CD31和c-kit。

28.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是视网膜变性疾病。

29.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是视网膜血管变性疾病。

30.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是局部缺血性视网膜病。

31.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是血管出血。

32.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是血管渗漏。

33.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是脉络膜病变。

34.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是与年龄相关的黄斑退行性改变。

35.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是糖尿病性视网膜病。

36.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是假性眼组织胞浆菌病。

37.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是早产儿视网膜病。

38.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是镰刀状细胞性贫血。

39.如权利要求22所述的用途，其中所述疾病是色素性视网膜炎。

40.一种转染的谱系负性造血干细胞群，包括使用编码有治疗作用的肽的基因转染的如权利要求1所述的干细胞群。

41.如权利要求40所述的转染的干细胞群，其中所述的有治疗作用的肽是抗血管生成肽。

42.如权利要求41所述的转染的干细胞群，其中所述的抗血管生成肽是蛋白质片段。

43.如权利要求42所述的转染的干细胞群，其中所述的蛋白质片段是TrpRS的抗血管生成片段。

44.如权利要求43所述的转染的干细胞群，其中所述的TrpRS的片段是T2-TrpRS。

45.权利要求40所述的转染的干细胞群在制备在需要抑制视网膜血管生成的患者眼睛中抑制视网膜血管生成的药物中的用途，所述药物为玻璃体内注射剂型。

46.如权利要求45所述的用途，其中转染的谱系负性造血干细胞群是通过下述步骤制备的：

(a)采集哺乳动物的骨髓；

(b)从该骨髓中分离多数的单核细胞；

(c)使用生物素轭合的针对CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的谱系系列抗体标记多数单核细胞；和

(d)从该多数单核细胞中除去对于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119来说是谱系正性的单核细胞，以提供一个包含内皮祖细胞在内的谱系负性造血干细胞群。

47.如权利要求46所述的用途，其中至少约50％分离的谱系负性造血干细胞群包括细胞标记物CD31和c-kit。

48.权利要求1所述的分离的干细胞群在制备递送转基因至患者的视网膜血管系统的药物的用途，所述药物为玻璃体内注射剂型，其中干细胞群已经用有治疗作用的基因转染。

49.如权利要求48所述的用途，其中转染的谱系负性造血干细胞通过以下步骤制备：

(a)采集哺乳动物的骨髓；

(b)从该骨髓中分离多数的单核细胞；

(c)使用生物素轭合的针对CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的谱系系列抗体标记多数单核细胞；和

(d)从该多数单核细胞中除去对于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119来说是谱系正性的单核细胞，以提供一个包含内皮祖细胞在内的谱系负性造血干细胞群。

50.如权利要求49所述的用途，其中至少约50％分离的谱系负性造血干细胞群包括细胞标记物CD31和c-kit。

51.如权利要求48所述的用途，其中所述的基因可用于抑制视网膜新生血管化。

52.权利要求1所述的分离的干细胞群在制备在患有视网膜变性性疾病的哺乳动物视网膜中诱导神经营养性拯救的药物中的用途，。

53.如权利要求52所述的用途，其中所述的干细胞群是通过下述步骤分离的：

(a)采集哺乳动物的骨髓；

(b)从该骨髓中分离多数的单核细胞；

(c)使用生物素轭合的针对CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的谱系系列抗体标记多数单核细胞；和

(d)从该多数单核细胞中除去对于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119来说是谱系正性的单核细胞，以提供一个包含内皮祖细胞在内的谱系负性造血干细胞群。

54.如权利要求52所述的用途，其中所述哺乳动物是人类。

55.权利要求52所述的用途，其中细胞通过玻璃体内注射方式给药。

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