KR101095287B1 - 조혈 줄기세포 및 이를 분리하는 방법 - Google Patents

Abstract

골수 유래의 분리된 포유동물 계통 음성 조혈 줄기세포 집단(Lin^- HSC)은 망막의 혈관을 형성할 수 있는 내피 전구세포(EPC)를 함유한다. 분리된 Lin HSC 집단내의 약 50% 이상의 세포는 CD31 및 c-kit에 대한 세포 표면 마커를 포함한다. 상기 세포의 약 8% 이하는 Sca-1 세포 마커를 포함할 수 있으며, 상기 세포의 약 4% 이하는 Flk-1/KDR 마커를 포함할 수 있다. 본 발명의 분리된 Lin HSC 집단은 안구의 혈관 질환을 치료하는데 유용하다. 치료학적으로 유용한 유전자로 형질감염된 분리된 Lin HSC 집단이 또한 제공되며, 이는 세포계 유전자 치료요법을 위해 유전자를 안구로 전달하는데 유용하다.

골수 유래의 분리된 포유동물 계통 음성 조혈 줄기세포(Lin- HSC), 내피 전구세포, 망막 변성 질환, CD31, c-kit, 신경영양성 구제 효과, 혈관영양성 구제 효과

Description

조혈 줄기세포 및 이를 분리하는 방법{Hematopoietic stem cells and methods of isolating them}

관련 출원의 상호참조

본 출원은 2002년 7월 25일자로 출원된 가특허 출원 제60/398,522호 및 2003년 5월 2일자로 출원된 가특허출원 제60/467,051호의 권리를 청구하며, 이들 둘다는 본원에서 참조로 인용된다.

정부 권리의 언급

본원에서 기술된 연구의 일부는 미국국립암연구소(National Cancer Institute)로부터 허가 번호 CA92577 및 미국국립보건연구소(National Institute of Health)로부터 허가 번호 EY11254, EY12598 및 EY125998에 의해 뒷받침된다. 미연방정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.

발명의 분야

본 발명은 골수로부터 유래된 분리된 포유동물 계통(lineage) 음성 조혈 줄 기세포(Lin^-HSC)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 Lin^-HSC 및 형질감염된 Lin^- HSC를 안구의 망막에 투여함으로써 안구의 혈관 질환을 치료하는 것에 관한 것이다.

발명의 배경

노화 관련 황반변성(ARMD) 및 당뇨병성 망막병증(DR)은 선진국에서 시력 상실의 주된 원인이며 비정상적 망막 신생혈관형성의 결과로서 발생한다. 망막은 신경, 아교 및 혈관 요소의 뚜렷한 층으로 이루어지기 때문에, 혈관 증식 또는 부종에서 보여지는 바와 같은 비교적 적은 교란이라도 현저한 시각기능 상실을 유도할 수 있다. 망막 색소 변성증(RP)과 같은 유전적 망막 변성도 또한 세동맥 수축 및 혈관 위축과 같은 혈관 비정상성과 연관된다. 혈관신생(angiogenesis)을 촉진하고 억제하는 인자들을 동정하는데 있어서 상당한 진전이 이루어지긴 하였으나, 현재 안구 혈관 질환을 특별히 치료하기 위한 치료법은 없다.

다년간, 줄기세포 집단이 정상 성인 순환계 및 골수에 존재한다는 것은 공지되어 왔다. 이러한 세포들의 상이한 아집단은 조혈 계통 양성(Lin⁺) 또는 비-조혈 계통 음성(Lin^-) 계통을 따라서 분화할 수 있다. 게다가, 계통 음성 조혈 줄기세포(HSC) 집단은 최근에 시험관내 및 생체내에서 혈관을 형성할 수 있는 내피 전구세포(EPC)를 함유하는 것으로 나타났다[참조: Asahara et al. Science 275, 964-7 (1997)]. 이들 세포는 정상적인 및 병리학적 출산후 혈관신생에 참여할 수 있을뿐만 아니라[참조: Lyden et al. Nat. Med. 7, 1194-201 (2001); Kalka et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97,3422-7 (2000); and Kocher et al. Nat. MED. 7,430-6 (2001)], 간세포[참조: Lagasse et al. Nat. MED. 6,1229-34 (2000)], 미세아교세포[참조: Priller et al. Nat. MED. 7,1356-61 (2002)], 심근세포[참조: Orilac et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98,10344-9 (2001)] 및 상피[참조: Lyden et al. Nat. Med. 7,1194-201 (2001)]를 포함하는 각종 비-내피세포형으로 분화될 수 있다. 이들 세포가 혈관신생의 몇가지 실험 모델에서 사용되어왔다 해도, 신생혈관계를 표적으로 하는 EPC의 기작은 공지되어 있지 않으며, 특정 혈관계에 기여하는 세포의 수를 효과적으로 증가시킬 전략은 확인되지 않았다.

발명의 요약

본 발명은 활성화된 망막 성상교세포를 선택적으로 표적화하는 내피 전구세포(EPC; 내피 전구체 세포로도 공지되어 있음)를 함유하는, 골수로부터 유래된 분리된 포유동물 계통 음성 조혈 줄기세포 집단(Lin^- HSC)을 제공한다. 본 발명의 분리된 Lin^- HSC 집단 중 약 50% 이상의 세포가 CD31 및 c-kit에 대한 세포 마커를 갖는다.

본 발명의 계통 음성 HSC 집단내의 EPC는 발달중인 망막 혈관내로 다량으로 혼입되어 안구의 신생혈관계로 혼입된 상태로 안정하게 유지된다. 본 발명의 분리된 계통 음성 HSC 집단은 포유동물의 변성 망막 혈관계를 구제하여 안정화시키는데 사용할 수 있다. 본 발명의 분리된 Lin^- HSC 집단의 한 양태에서, 세포는 치료학적 으로 유용한 유전자로 형질감염된다. 이러한 형질감염된 세포는 신생혈관계를 선택적으로 표적화하여, 세포계 유전자 치료요법 형태를 통해 이미 확립된 혈관에 영향을 주지 않으면서 새로운 혈관 형성을 억제할 수 있다. 혈관신생을 억제하는 펩타이드를 암호화하는 유전자로 형질감염된, 본 발명의 분리된 계통 음성 HSC 집단의 세포는 ARMD, DR 및 비정상적 혈관계와 관련되는 특정의 망막 변성과 같은 질환에서 비정상적 혈관 성장을 조절하는데 유용하다.

본 발명의 분리된 Lin^- HSC 집단을 이용한 안구 치료법의 특별한 잇점은 Lin^- HSC로 유리체내로 치료된 안구에서 관찰되는 혈관영양성 및 신경영양성 구제 효과이다. 본 발명의 분리된 Lin^- HSC로 치료된 안구에서는 망막 신경세포 및 광수용체가 보존되고 시각기능이 유지된다.

본 발명은 또한 골수, 바람직하게는 성체 골수로부터의 내피 전구세포를 함유하는 계통 음성 조혈 줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.

도면의 간단한 설명

도 1(1a 및 1b)는 발달중인 마우스 망막의 도면을 도시한 것이다. 도 1a 1차 혈관총의 발달. 도 1b: 제2 망막 혈관 형성기. GCL, 신경절 세포 층; IPL, 내부 혈관총 층; INL, 내부 핵 층; OPL, 외부 혈관총 층; ONL, 외부 핵 층; RPE, 망막 색소 상피; ON, 시신경; P, 주변부.

도 1c는 골수 유래의 Lin⁺ HSC 및 Lin^- HSC로 분리된 세포의 유세포분석법 특성화를 도시한 것이다. 최상단 줄: 비-항체 표지된 세포의 점도표(여기서, R1은 양성 PE-염색의 정량가능한-개폐 면적을 의미하고, R2는 GFP-양성을 나타낸다); 중간 줄: Lin^- HSC(C57B/6) 및 하단 줄: Lin⁺ HSC(C57B/6) 세포, 각각의 세포주는 Sca-1, c-kit, Flk-1/KDR, CD31에 대한 PE-접합된 항체로 표지된다. Tie-2 데이타는 Tie-2-GFP 마우스로부터 수득되었다. %는 전체 Lin^- HSC 또는 Lin⁺ HSC 집단 중 양성-표지된 세포의 %를 나타낸다.

도 2는 발달중인 마우스 망막내로의 Lin^- HSC 세포의 이식을 도시한 것이다. 도 2a: 주사(P6) 후 4일째에, 유리체내로 주사된 eGFP⁺ Lin^- HSC 세포는 망막에 부착하여 분화한다. 도 2b: Lin^- HSC(B6.129S7-Gtrosa26 마우스, β-gal 항체로 염색됨)는 그 자체를 콜라겐 IV 항체로 염색된 혈관계의 전방부에 확립시킨다(*는 혈관계의 끝부분을 나타낸다). 도 2c: 주사(P6) 후 4일째에서 대부분의 Lin⁺ HSC 세포(eGFP⁺)는 분화되지 못하였다. 도 2d: 주사(P6) 후 4일째의 장간막 eGFP⁺ 쥐 EC. 도 2e: 성체 마우스 안구에 주사된 Lin^- HSC(eGFP⁺). 도 2f: GFAP-GFP 유전자전이된 (transgenic) 마우스에서 기존의 성상교세포 주형으로 이동하여 이를 따라서 분화되는 eGFP⁺ Lin^- HSC(eGFP⁺)의 저배율상. 도 2g: Lin^- 세포(eGFP)와 기저 성상교세포 사이의 연합(화살표)의 고배율상. 도 2h: 주사되지 않은 GFAP-GFP 유전자전이된 대조군. 도 2i: 주사(P6) 후 4일째, eGFP⁺ Lin^-HSC 세포는 보다 심층의 혈관총 영역으로 이동하여 여기서 분화된다. 좌측 도면은 전조직 표본 안구에서의 Lin^- HSC 세포 활성을 포착한 것이고, 우측 도면은 망막내 Lin^- 세포의 위치(화살표)를 나타낸 것이다(상단은 유리체 측면이고, 하단은 공막 측면이다). 도 2j: α-CD31-PE 및 α-GFP-알렉사 488 항체에 의한 이중 표지화. 주사한지 7일 후, 주사된 Lin^- HSC(eGFP, 적색)는 혈관계(CD31)내로 혼입되었다. 화살촉은 혼입된 영역을 나타낸다. 도 2k: eGFP⁺ Lin^- HSC 세포는 주사 후 14일째(P17)에 혈관을 형성한다. 도 2l 및 2m: 로다민-덱스트란의 심장내 주사는 혈관이 1차 혈관총(l) 및 심재성 혈관총(m) 둘다에서 온전하며 기능적임을 나타낸다.

도 3(a 및 b)는 eGFP⁺ Lin^- HSC 세포가 레이저(a) 및 기계적(b) 유도된 손상(*는 손상된 부위를 나타낸다)에 의해 유도된 신경아교증(GFAP를 발현하는 성상교세포로 나타남, 가장 좌측 영상)으로 이동됨을 도시한 것이다. 가장 우측의 영상은 Lin^- HSC와 성상교세포의 밀접한 연합을 나타내는 고배율상이다. 눈금 막대 =20μM.

도 4는 Lin^- HSC 세포가 망막 변성 마우스의 혈관계를 구제함을 나타낸다. 도 4a 내지 4d: 콜라겐 IV로 염색한, 주사 후 27일째(P33)의 망막; 도 4a 및 4b, Lin⁺ HSC 세포가 주사된 망막(Balb/c)은 정상 FVB 마우스와 차이가 없는 것으로 보인다; 도 4c 및 4d: Lin^- HSC가 주사된 망막(Balb/c)은 야생형 마우스와 유사한 풍부한 혈관 네트워크를 나타냈다; 도 4a 및 4c: DAPI로 염색한 전체 망막의 동결된 절편(상단은 유리체 측면이고, 하단은 공막 측면이다); 도 4b 및 4d: 망막 전조직 표본의 심재성 혈관총; 도 4e: Lin^- HSC 세포-주사된 망막(n=6)에 형성된 심재성 혈관총의 혈관분포정도의 증가를 예시하는 막대 그래프. 심재성 망막의 혈관화 범위는 각 영상내의 혈관의 총 길이를 계산함으로써 정량하였다. Lin^- HSC, Lin⁺ HSC 또는 대조군 망막의 혈관의 평균 총 길이/고배율 시야(마이크론 단위)를 비교하였다. 도 4f: rd/rd 마우스로부터의 Lin^- HSC(R, 우측 안구) 세포 또는 Lin⁺ HSC(L, 우측 안구) 세포를 주사한 후 심재성 혈관총 길이의 비교. 6마리의 독립적 마우스의 결과를 제시한다(각 색상은 각 마우스를 나타낸다). 도 4g 및 4h: Lin^- HSC 세포는 또한(Balb/c) P15 안구에 주사된 경우 rd/rd-혈관계를 구제하였다. Lin^- HSC(G) 또는 Lin⁺ HSC(H) 세포가 주사된 망막의 (주사한지 한달 후) 중재성 및 심재성 혈관총을 제시한다.

도 5는 마우스 망막 조직의 현미경사진을 도시한 것이다: 도 5a eGFP⁺ Lin^-HSC(녹색)를 주사한 후 5일째(P11)에서 망막 전조직 표본(rd/rd 마우스)의 심층. 도 5b 및 5c: P6에서 Balb/c Lin^- 세포(A) 또는 Lin⁺ HSC 세포(B)가 주사된 Tie-2-GFP (rd/rd) 마우스의 P60 망막 혈관계. 혈관계는 CD31 항체(적색)로 염색하였으며 내인성 내피 세포만이 녹색을 나타냈다. 화살표는 GFP가 아닌 CD31로 염색된 혈관을 나타낸다. 도 5d: Lin^- HSC 주사된 망막 및 대조군 망막의 α-SMA 염색.

도 6은 T2-TrpRS-형질감염된 Lin^- HSC가 마우스 망막 혈관계의 발달을 억제함을 도시한 것이다. 도 6a: 아미노 말단에 Igk 시그날 서열을 갖는 사람 TrpRS, T2-TrpRS 및 T2-TrpRS의 도식적 설명. 도 6b: T2-TrpRS 형질감염된 Lin^- 세포가 주사된 망막은 생체내에서 T2-TrpRS 단백질을 발현한다. 1, 이. 콜라이에서 생산된 재조합 T2-TrpRS; 2, 이. 콜라이에서 생산된 재조합 T2-TrpRS; 3, 이. 콜라이에서 생산된 재조합 T2-TrpRS; 4, 대조군 망막; 5, Lin^- HSC + pSecTag2A(벡터 단독)가 주사된 망막; 6, Lin^- HSC + pKLe135(pSecTag 내의 Igk-T2-TrpRS)가 주사된 망막. 도 6a; 내인성 TrpRS b; 재조합 T2-TrpRS c; Lin^- HSC가 주사된 망막의 T2-TrpRS. 도 6c 내지 6f: 주사 후 7일째의 주사된 망막의 대표적인 1차(표재성) 및 2차(심재성) 혈관총; 도 6c 및 6d: 공(空) 플라스미드-형질감염된 Lin^- HSC가 주사된 안구는 정상적으로 발달하였다; 도 6e 및 6f: 대다수의 T2-TrpRS-형질감염된 Lin^- HSC가 주사된 안구는 심재성 혈관총의 억제를 나타냈다; 도 6c 및 6e: 1차(표재성) 혈관총; 도 6d 및 6f: 2차(심재성) 혈관총. F에서 관찰된 혈관의 희미한 외곽선은 도 6e에 도시한 1차 혈관 네트워크의 "출혈" 영상이다.

도 7a 및 7b는 His₆-태그된 T2-TrpRS의 DNA 서열(서열 1)을 도시한 것이다.

도 8은 His₆-태그된 T2-TrpRS의 아미노산 서열(서열 2)를 도시한 것이다.

도 9는 안구에 본 발명의 Lin^- HSC 및 Lin⁺ HSC(대조군)이 주사된 마우스의 망막의 현미경사진과 망막전위도(ERG)를 예시한 것이다.

도 10은 Lin^- HSC로 처리된 rd/rd 마우스 안구의 중재성(Int.) 및 심재성 혈관 층 둘다에 대한 신경 구제(y-축) 및 혈관 구제(x-축) 간의 상관관계를 보여주는 통계학적 플롯을 도시한 것이다.

도 11은 Lin⁺ HSC로 처리된 rd/rd 마우스 안구에 대한 신경 구제(y-축) 및 혈관 구제(x-축) 간에는 상관관계가 없음을 보여주는 통계학적 플롯을 도시한 것이다.

도 12는 주사 후 1개월(1M), 2개월(2M) 및 6개월(6M)의 시점에서, Lin^- HSC로 처리된 rd/rd 마우스 안구(검은색 막대) 및 미처리된 rd/rd 마우스 안구(흰색 막대)에 대한 임의 상대 단위의 혈관 길이(y-축)의 막대 그래프이다.

도 13은 주사 후 1개월(1M), 2개월(2M) 및 6개월(6M)의 시점에서 rd/rd 마우스의 외부 신경세포 층(ONR) 내의 핵의 수에 대한 3개의 막대 그래프를 포함하며, Lin⁺ HSC로 처리된 대조군 안구(흰색 막대)에 비해서 Lin^- HSC로 처리된 안구(검은색 막대)의 경우에 핵의 수가 현저하게 증가했음을 입증한다.

도 14는 (주사 후) 1개월(1M), 2개월(2M) 및 6개월(6M)의 시점에서 우측 안구(R, Lin^- HSC로 처리됨)를 좌측 안구(L, Lin⁺ HSC로 처리된 대조군 안구)에 대해 비교하는, 개개의 rd/rd 마우스에 대한 외부신경 층 내의 핵의 수에 대한 플롯을 도시한 것으로, 소정의 플롯에서 각각의 선은 개개의 마우스의 안구를 비교한다.

바람직한 양태의 상세한 설명

본 발명은 내피 전구세포를 함유하는 분리된 포유동물 골수 유래의 계통 음성 조혈 줄기세포 집단을 제공한다. 본 발명의 분리된 Lin^- HSC 집단은 바람직하게는 약 50% 이상의 세포가 CD31 및 c-kit 세포 마커 항원을 함유하는 HSC를 포함한다. 바람직한 양태에서, 약 75% 이상의 HSC 세포, 보다 바람직하게는 약 81%의 HSC 세포가 CD31 마커를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 약 65% 이상의 세포, 보다 바람직하게는 약 70%의 세포가 c-kit를 포함한다.

본 발명의 분리된 Lin^- HSC 집단의 특히 바람지한 양태에서, 약 50% 내지 약 85%의 세포가 CD31 마커를 포함하며, 약 70% 내지 약 75%의 세포가 c-kit 마커를 포함하며, 약 4% 내지 약 8%의 세포가 Sca-1 마커를 포함하며, 약 2% 내지 약 4%의 세포가 Flk-1/KDR 마커를 포함한다.

본 발명의 분리된 Lin^- HSC 집단은 또한 Tie-2 항원 마커를 갖는 세포를 약 1% 이하로 포함할 수 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 분리된 Lin^- HSC 집단은 마우스 또는 사람 골수, 바람직하게는 사람 골수로부터 유래된다.

본 발명의 분리된 Lin^- HSC 집단은 이들 세포가 분리되어진 포유동물 종의 안구에 유리체내로 주사된 경우 망막의 신생혈관계를 선택적으로 표적화하여 여기에 혼입된다.

본 발명의 분리된 Lin^- HSC 집단은 망막내에서 내피 세포로 분화하여 혈관 구조를 생성시킨다. 특히, 본 발명의 Lin^- HSC 조성물은 망막 신생혈관 질환 및 망막 혈관 변성 질환의 치료와 망막 혈관 손상의 복구에 유용하다.

본 발명은 또한, 환자의 골수로부터 내피 전구세포를 포함하는 계통 음성 조혈 줄기세포를 분리하는 단계 및 상기 분리된 줄기세포를 안구 질환을 정지시키기에 충분한 수로 상기 환자의 안구에 유리체내로 주사하는 단계를 포함하는, 안구 질환의 치료방법을 제공한다. 본 방법을 사용하여 망막 변성 질환, 망막 혈관 변성 질환, 허혈성 망막병증, 혈관 출혈, 혈관 누출 및 맥락막병증과 같은 안구 질환을 치료할 수 있다. 이러한 질환의 예에는 노화 관련 황반변성(ARMD), 당뇨병성 망막병증(DR), 추정된 안구 히소트플라스마증(POHS), 미숙아 망막병증(ROP), 겸상적혈구 빈혈증 및 망막색소변성 뿐만 아니라 망막 손상이 포함된다.

안구내로 주사된 줄기 세포의 수는 환자의 안구의 질병 상태를 정지시키기에 충분하다. 예를 들어, 세포의 수는 환자의 안구의 망막 손상을 복구시키고 망막 신생혈관계를 안정화시키고 망막 신생혈관계를 성숙시키고 혈관 누출 및 혈관 출혈을 예방 또는 복구하기에 효과적일 수 있다.

본 발명의 분리된 Lin^- HSC 집단 내에 존재하는 세포는 치료학적으로 유용한 유전자, 예를 들어, 안구의 세포계 유전자 치료요법에서 사용하기 위한 항-혈관신생 단백질을 암호화하는 유전자로 형질감염시킬 수 있다.

형질감염된 세포는 망막 질환 치료용의 치료학적으로 유용한 어떠한 유전자라도 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 Lin^- HSC 집단 내의 형질감염된 세포는 공유된, 동시 계류중인 미국 특허원 제10/080,839호[이의 내용은 본원에서 참조로 인용된다]에 상세히 기재되어 있는 TrpRS 또는 이의 항-혈관신생 단편(예: T1 및 이의 T2 단편)과 같은 항-혈관신생 펩타이드, 단백질 또는 단백질 단편을 암호화하는 유전자를 포함한다.

본 발명은 또한 골수로부터 내피 전구세포를 함유하는 계통 음성 조혈 줄기세포 집단을 분리하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 포유동물로부터 골수를 추출하는 단계; (b) 상기 골수로부터 다수의 단핵구를 분리하는 단계; (c) 단핵구를 CD45, CD3, Ly-6G, CD11 및 TER-119에 대한 바이오틴-접합된 계통 패널 항체로 표지하는 단계; 및 (d) 다수의 단핵구로부터 CD45, CD3, Ly-6G, CD11 및 TER-119에 대해 계통 양성 단핵구를 제거하여, 내피 전구세포를 함유하는 계통 음성 조혈 줄 기세포 집단을 제공하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 형질감염된 Lin^- HSC 조성물을 안구에 세포의 유리체내로 주사하여 투여함으로써 안구 혈관신생 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 형질감염된 Lin^- HSC 조성물은 항-혈관신생 유전자 산물을 암호화하는 유전자와 같은 치료학적으로 유용한 유전자로 형질감염된 Lin^- HSC를 포함한다.

바람직하게는, 약 1×10⁵개 이상의 Lin^- HSC 세포 또는 형질감염된 Lin^- HSC 세포는 망막 변성 질환에 걸린 안구에 유리체내로 주사함으로써 투여한다. 주사될 세포의 수는 망막 변성의 중증도, 환자의 연령 및 망막 질환의 치료에 있어 당해 분야의 숙련가가 용이하게 인지할 수 있는 기타 요인에 따라 좌우될 것이다. Lin^- HSC는 치료 담당 주치의에 의해 결정되는 바와 같이 시간에 걸쳐 1회 투여량 또는 다회 투여량 투여에 의해 투여할 수 있다.

본 발명의 Lin^- HSC 집단은 망막 혈관계의 방해 또는 분해가 관련되는 망막 손상 및 망막 결함의 치료에 유용하다.

본 발명의 형질감염된 Lin^- HSC 집단은 망막, 특히 망막 혈관계로 치료학적 유전자를 전달하기에 유용하다.

본 발명의 유전자 전달방법의 바람직한 양태에서, 본 발명의 Lin^- HSC 집단내의 세포들은 트립토판 RNA 신타제(TrpRs)의 항-혈관신생 단편과 같은 항-혈관신 생 펩타이드를 암호화하는 유전자로 형질감염시킨다. TrpRS의 특히 바람직한 단편에는 TrpRS의 T1 및 T2 단편이 포함된다. 본 발명의 항-혈관신생 펩타이드를 암호화하는 Lin^- HSC 조성물 내의 형질감염된 세포는 비정상적 혈관 발달이 관련되는 망막 질환, 예를 들어, 당뇨병성 망막병증 및 유사 질환의 치료에 유용하다.

방법

실시예 1. 세포 분리 및 농축; Lin ^- HSC 집단 A 및 B의 제조

일반적 과정. 모든 생체내 평가는 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 지침에 따라서 수행하였고, 모든 평가 과정은 더 스크립스 리서치 인스티튜트(The Scripps Research Institute, TSRI, La Jolla, CA) 실험동물관리위원회(Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 골수 세포를 B6.129S7-Gtrosa26, Tie-2GFP, ACTbEGFP, FVB/NJ(rd/rd 마우스) 또는 Balb/cBYJ 성체 마우스(공급원: The Jackson Laboratory, ME)로부터 추출하였다.

이어서, 단핵구를 HISTOPAQUE^R 폴리슈크로스 구배(제조원: Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 밀도 구배 분리에 의해 분리하고, Lin^- 선별을 위해 바이오틴 접합된 계통 패널 항체(CD45, CD3, Ly-6G, CD11, TER-119, 제조원: Pharmingen, San Diego, CA)로 표지하였다. 계통 양성(Lin⁺) 세포를 자기 분리 장치 (AUTOMACS^TM 분리기, 제조원: Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 사용하여 Lin^- HSC로부터 분리하여 제거하였다. 내피 전구세포를 함유하는, 수득된 Lin^- HSC 집단을 다음 항체들을 사용한 FACS^TM Calibur 유세포분석기(제조원: Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 추가로 특성을 규명하였다: PE-접합된-Sca-1, c-kit, KDR 및 CD31(제조원: Pharmingen, San Diego, CA). Tie-2-GFP 골수 세포를 Tie-2의 특성규명을 위해 사용하였다.

성체 마우스 내피세포를 수거하기 위해, 장간막 조직을 외과술에 의해 ACTbEGFP 마우스로부터 떼어내어 콜라게나제(제조원: Worthington, Lakewood, NJ) 속에 놓아서, 이 조직을 분해시킨 다음, 45㎛ 필터를 사용하여 여과하였다. 유동물을 수집하고 내피 증식 배지(제조원: Clonetics, San Diego, CA)와 함께 항온처리하였다. 내피의 특성을, 형태상 조약돌 모양의 외관을 관찰하고 CD31 mAb (Pharmingen)으로 염색하고 MATRIGEL^TM 매트릭스(제조원: Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 내의 관상 구조의 형성에 대해 배양물을 검사함으로써 확인하였다.

Lin^- HSC 집단 A. 골수 세포를 상기 언급한 일반적 과정에 의해 ACTbEGFP 마우스로부터 추출하였다. Lin^- HSC 세포를 CD31, c-kit, Sca-1, Flk-1 및 Tie-2 세포 표면 항원 마커에 대한 FACS 유세포분석법으로 특성을 규명하였다. 결과는 도 1c에 제시한다. 약 81%의 Lin^- HSC가 CD31 마커를 나타냈으며, 약 70.5%의 Lin^- HSC가 c-kit 마커를 나타냈으며, 약 4%의 Lin^- HSC가 Sca-1 마커를 나타냈고, 약 2.2%의 Lin^- HSC가 Flk-1 마커를 나타냈으며, 약 0.91%의 Lin^- HSC 세포가 Tie-2 마커를 나타냈다. 대조적으로, 이들 골수 세포로부터 분리된 Lin⁺ HSC는 유의적으로 상이한 세포 마커 프로필을 지녔다(즉, CD31: 37.4%; c-kit: 20%; Sca-1: 2.8%; Flk-1: 0.05%)

Lin^- HSC 집단 B. 골수 세포를 상기한 일반적 과정에 의해 BalbC, ACTbEGFP 및 C3H 마우스로부터 추출하였다. Lin^- HSC 세포를 세포 표면 마커(Sca-1, KDR, c-kit, CD34, CD31 및 각종 인테그린: α1, α2, α3, α4, α5, α6, α_M, α_V, α_X , α_IIb, β₁, β₂, β₃, β₄, β₅ 및 β₇)의 존재에 대해 분석하였다. 결과는 하기 표 1에 제시한다.

실시예 2. 세포의 유리체내 투여

예리한 칼을 이용하여 눈꺼풀에 틈을 생성시켜 P2 내지 P6 안구를 노출시켰다. 이어서, 본 발명의 계통 음성 HSC 집단(새포 배양 배지 약 0.5㎕ 내지 약 1㎕ 중의 약 10⁵개 세포)을 33-게이지(Hamilton, Reno, NV) 바늘의 주사기를 사용하여 유리체내로 주사하였다.

실시예 3. EPC 형질감염

Lin^- HSC(집단 A)를 제조업자의 프로토콜에 따라서 FuGENE^TM 6 형질감염 시약(제조원: Roche, Indianapolis, IN)을 사용하여, His₆ 태그를 포함한 TrpRS의 T2 단편을 암호화하는 DNA(서열 1, 도 7a 및 7b)로 형질감염시켰다. Lin^- HSC 조성물(ml당 약 10⁶개 세포)로부터의 세포를 줄기세포 인자(PeproTech, Rocky Hill, NJ)를 함유하는 opti-MEM^R 배지(제조원: Invitrogen, Carlsbad, CA) 속에 현탁시켰다. 이어서, DNA (약 1㎍)와 FuGENE 시약(약 3㎍) 혼합물을 첨가하고, 혼합물을 약 37℃에서 18시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 세척하고 수집하였다. 당해 시스템의 형질감염율은 약 17%였으며 이는 FACS 분석으로 확인하였다. T2 생산을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. His₆-태그된 T2-TrpRS의 아미노산 서열은 서열 2(도 8)로서 제시한다.

실시예 4. 면역조직화학 및 공초점 분석

망막을 다양한 시점에서 수거하고 전조직 표본 제작 또는 동결 절편 제작을 위해 준비하였다. 전조직 표본의 경우, 망막을 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 실온에서 1시간 동안 50% 태아 송아지 혈청(FBS) 및 20% 표준 염소 혈청 속에서 차단하였다. 망막을 1차 항차에 대해 처리하고 2차 항체로 검출하였다. 사용된 1차 항체는 항-콜라겐 IV(Chemicon, Temecula, CA), 항-β-gal(Promega, Madison, WI), 항-GFAP(Dako Cytomation, Carpenteria, CA), 항-α-평활근 액틴(α-SMA, Dako Cytomation)이었다. 사용된 2차 항체는 알렉사 88 또는 594 형광 마커(Molecular Probes, Eugene, OR)에 접합시켰다. MRC 1024 공초점 현미경(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 영상을 포착하였다. LASERSHARP^R 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 3차원 영상을 생성시켜 망막의 전조직 표본내에서의 3가지의 상이한 혈관 발달 층을 검사하였다. 공초점 현미경검사법으로 구별되는, 증가된 GFP(eGFP) 마우스 및 GFAP/wtGFP 마우스 사이의 GFP 픽셀 강도의 차이를 사용하여 3D 영상을 생성시켰다.

실시예 5. 시험관내 망막 혈관신생 정량 검정

T2-TrpRS 분석을 위해, 1차 혈관총 및 심재성 혈관총을 3차원 영상으로부터 재구성하였다. 1차 혈관총은 2개의 부류로 나뉘었다: 정상적 발달 또는 정지된 혈관 진행. 심재성 혈관 발달의 억제의 부류는 다음 기준을 포함하여 혈관억제율(%)에 기초하여 구성하였다: 심층 혈관총 형성의 완전한 억제는 "완전한"으로 표시하고, 정상 혈관 발달(25% 미만의 억제를 포함)은 "정상"으로 표시하고, 나머지는 "부분적"으로 표시하였다. rd/rd 마우스 구조 데이타의 경우, 각 망막의 전조직 표본내의 4개의 개별적인 심재성 혈관총 영역을 10x 렌즈를 이용하여 포착하였다. 혈관계의 총 길이를 각 영상에 대해 계산하고 요약하여 그룹들 간에 비교하였다. 정확한 정보를 수득하기 위해, Lin^- HSC를 한쪽 안구에 주사하고, Lin⁺ HSC를 동일한 마우스의 다른쪽 안구에 주사하였다. 주사되지 않은 대조군 망막은 동일한 동 복자 마우스로부터 채취하였다.

실시예 6. 성체 망막 손상 모델

레이저 및 흉터 모델을 다이오드 레이저(150mW, 1초, 50nm)을 이용하여 생성시키거나, 27게이지 바늘로 망막에 구멍을 뚫어서 기계적으로 생성시켰다. 손상 5일 후, 세포를 유리체내 방법을 사용하여 주사하였다. 5일 후에 안구를 수거하였다.

실시예 7. 망막 재생의 신경영양성 구제

성체 골수 유래의 계통 음성 조혈 줄기세포(Lin^- HSC)는 마우스 망막 변성 모델에서 혈관영양성 및 신경영양성 구제 효과를 갖는다. 10일령 마우스의 우측 안구에 약 10⁵개의 본 발명의 Lin^- HSC를 함유하는 약 0.5㎕를 주사하고, 2개월 후에 망막 혈관계의 존재 및 신경세포 층의 핵 계수에 대해 평가하였다. 동일한 마우스의 좌측 안구에 거의 동일한 수의 Lin⁺ HSC를 대조군으로서 주사하고 유사하게 평가하였다. 도 9에 제시한 바와 같이, Lin^- HSC 처리된 안구에서 망막 혈관계는 거의 정상으로 보이며, 내부 핵 층도 거의 정상으로 보이고, 외부 핵 층(ONL)은 약 3개 내지 4개의 핵 층을 지녔다. 대조적으로, 반대쪽의 Lin⁺ HSC 처리된 안구는 현저하게 위축된 중재성 망막 혈관 층, 완전히 수축된 외부 망막 혈관 층을 지녔으며, 내부 핵 층은 현저하게 수축되었고, 외부 핵 층은 완전히 소멸되었다. 이는 마우스 3 및 마우스 5에서 극적으로 예시되었다. 마우스 1에서는 구제 효과가 없 었으며 이는 주사된 마우스의 약 15%에서도 마찬가지였다.

시각기능을 망막전위도(ERG)로 평가한 경우, 양성 ERG의 복구는 혈관 구제 및 신경 구제가 둘다 관찰되었을 때(마우스 3 및 5) 관찰되었다. 혈관 구제 또는 신경 구제가 없었을 때(마우스 1)에는 양성 ERG가 관찰되지 않았다. 이러한 본 발명의 Lin^- HSC에 의한 혈관 및 신경영양성 구제 간의 상관관계는 도 10에 제시한 회귀분석 도표로 예시된다. 신경 회복(y축) 및 혈관 회복(x축) 간의 상관관계는 중재성 혈관계 유형(r=0.45) 및 심재성 혈관계(r=0.67)에서 관찰되었다.

도 11은 Lin⁺ HSC에 의한 혈관 및 신경 구제 간에는 통계학적으로 유의적인 어떠한 상관관계도 없음을 도시한 것이다. 혈관 구제를 정량하고 데이타를 도 12에 제시한다. 도 12에 제시한, 주사 후 1개월(1M), 2개월(2M) 및 6개월(6M)째에서의 마우스에 대한 데이타는, 혈관 길이가, 특히 주사 후 1개월 및 2개월째에서 동일한 마우스로부터의 미처리된 안구에서의 혈관 길이(흰색 막대)와 비교하여 본 발명의 Lin^- HSC로 처리된 안구(검정 막대)에서 유의적으로 증가되었음을 입증한다. 신경영양성 구제 효과는 Lin^- HSC 또는 Lin⁺ HSC를 주사한 후 약 2개월째에서 내부 및 외부 핵 층 내의 핵을 계수함으로써 정량하였다. 결과는 도 13 및 14에 제시한다.

결과

쥐 망막의 혈관 발달; 안구 혈관신생 모델

마우스 안구는 포유동물 망막의 혈관 발달, 예를 들어, 사람 망막의 혈관 발달 연구용으로 인정된 모델을 제공한다. 쥐 망막 혈관계의 발달 동안, 허혈로 유도된 망막의 혈관은 성상교세포와 밀접하게 연합되어 발달한다. 이러한 아교세포 요소는 시신경원반으로부터 신경절 세포 층을 따라서 임신 제3기의 태아 또는 신생아 설치류 망막상으로 이동하여 급속하에 확산된다. 쥐의 망막 혈관이 발달함에 따라 내피 세포는 이러한 이미 확립된 성상교세포 주형을 이용하여 망막의 혈관 패턴을 결정한다(도 1a 및 1b 참조). 도 1(a 및 b)는 발달중인 마우스 망막의 도면을 도시한 것이다. 도 1a는 성상교세포 주형(흐린 선)에 겹쳐놓여진 1차 혈관총(도면의 상단 좌측에 있는 진한 선)의 발달을 도시한 것이며, 도 1b는 제2 망막 혈관 형성기를 도시한 것이다. 도면에서, GCL은 신경절 세포 층을 의미하고, IPL은 내부 혈관총 층을 의미하며, INL은 내부 핵 층을 의미하고; OPL은 외부 혈관총 층을 의미하며; ONL은 외부 핵 층을 의미하고; RPE는 망막 색소 상피를 의미하며; ON은 시신경을 의미하고; P는 주변부를 의미한다.

출생시 망막 혈관계는 사실상 존재하지 않는다. 생후 14일(P14)까지 망막은 시력의 생김과 동시에 망막 혈관의 발달된 복합적인 1차(표재성) 및 2차(심재성) 층을 갖는다. 먼저, 스포크 형상의 말초혈관이 기존의 성상교세포 네트워크 상에서 주변부를 향햐여 급속히 성장하여 모세 혈관총 형성과 점차적으로 연결된다. 이들 혈관은 P10 후에 신경 섬유내에서 단층으로서 성장한다(도 1a). P7 내지 P8에 곁가지가 이러한 1차 혈관총으로부터 뻗어나와 망막을 통과하여 외부 혈관총 층내로 침투하고, 여기서 2차 또는 심재성 망막 혈관총을 형성한다. P21까지 전체 네트워크는 집중적으로 리모델링되고 3차 또는 중재성 혈관총이 내부 핵 층의 내부 표면에서 형성된다(도 1b).

신생아 마우스 망막 혈관신생 모델은 몇가지 이유로 안구 혈관신생 동안의 HSC의 역활을 연구하는데 유용하다. 이러한 생리학적으로 관련된 모델에서, 내인성 혈관이 출연하기 전에 거대 성상교세포 주형이 존재함으로써 신생혈관 과정 동안 세포-세포 표적화에 대한 역활을 평가할 수 있게 한다. 또한, 이와 같은 일관되고 재생가능한 신생아 망막의 혈관 과정은 저산소증에 의해 유도되는 것으로 공지되어 있는데, 이러한 점에서 허혈이 관여한다고 공지된 다수의 망막 질환과 유사성을 갖는다.

골수로부터 내피 전구세포(EPC)의 농축

세포 표면 마커 발현이 HSC 제제 중에서 발견된 EPC 집단에 대해 널리 평가되었다 해도, 독특하게 EPC를 동정하는 마커는 여전히 거의 정의되지 않고 있다. EPC를 농축시키기 위해, 조혈 계통 마커 양성 세포(Lin⁺), 즉 B 림프구(CD45), T 림프구(CD3), 과립구(Ly-6G), 단핵구(CD11) 및 적혈구(TER-119)를 골수 단핵 세포로부터 고갈시켰다. Sca-1 항원을 사용하여 EPC를 추가로 농축시켰다. 동일한 개수의 Lin^- HSC Sca-1⁺ 또는 Lin^- 세포를 유리체내로 주사한 후 수득된 결과를 비교한 결과, 두 그룹 간에 차이는 검출되지 않았다. 사실상, Lin^- Sca-1^- 세포가 주사된 경우에만, 발달중인 혈관내로 훨씬 다량이 혼입되는 것으로 관찰되었다.

기능성 검정에 기초하여, 본 발명의 Lin^- HSC에는 EPC가 농축되어 있다. 추가로, Lin⁺ HSC 집단은 기능면에서 Lin^- HSC 집단과 상당히 다르게 행동한다. 각 분획(이미 보고된 시험관내 특성규명 연구에 기초함)에 대해 EPC를 동정하기 위해 통상적으로 사용되는 에피토프를 또한 평가하였다. 이들 마커 중 어떠한 것도 Lin^- 분획과 광범위하게 연관되지 않았지만, 모두, Lin⁺ HSC 분획과 비교하여 Lin^- HSC에서 약 70 내지 약 1800% 증가되었다(도 1c). 도 1c는 골수 유래의 Lin⁺ HSC 및 Lin^- HSC 분리된 세포의 유세포분석법에 의한 특성 규명을 예시한 것이다. 도 1c의 최상단 줄은 항체로 표지되지 않은 세포의 조혈 줄기세포 점도표 분포를 도시한 것이다. R1은 양성 PE-염색의 정량가능한-개폐 면적을 나타내고; R2는 GFP-양성을 나타낸다. Lin^- HSC의 점도표는 중간 줄에 제시되어 있으며 Lin⁺ HSC의 점도표는 하단 줄에 제시되어 있다. C57B/6 세포를 Sca-1, c-kit, Flk-1/KDR, CD31에 대한 PE-접합된 항체로 표지하였다. Tie-2 데이타는 Tie-2-GFP 마우스로부터 입수하였다. 점도표의 모퉁이의 백분율은 전체 Lin^- 또는 Lin⁺ HSC 집단 중 양성-표지된 세포의 %를 나타낸다. 흥미롭게도, Flk-1/KDR, Tie-2 및 Sca-1와 같은 채택된 EPC 마커는 불량하게 발현되었으므로 추가의 분획화용으로 사용되지 못했다.

유리체내 주사된 HSC Lin ^- 세포는 성상교세포를 표적화하고 발달중인 망막의 혈관계 내로 혼입되는 EPC를 함유한다.

유리체내로 주사된 Lin^- HSC가 망막의 특정 세포형을 표적화하고 성상교세포 주형을 사용하고 망막 혈관신생에 참여할 수 있는지를 결정하기 위해, 성체(GFP 또는 LacZ 유전자전이된) 마우스의 골수로부터 분리된, 본 발명의 Lin^- HSC 조성물로부터의 약 10⁵개 세포 또는 Lin⁺ HSC(대조군, 약 10⁵개 세포)를 생후 2일(P2)의 마우스 안구에 주사하였다. 주사 후 4일째(P6)에, GFP 또는 LacZ 유전자전이된 마우스로부터 유래된 본 발명의 Lin^- HSC 조성물로부터의 다수의 세포들은 망막에 부착되었고 내피 세포의 특징적인 연장된 외관을 지녔다(도 2a). 도 2는 발달중인 마우스 망막내로의 Lin^- 세포의 이식을 예시한 것이다. 도 2a에 제시한 바와 같이, 주사 후 4일째(P6)에 유리체내로 주사된 eGFP⁺ Lin^- HSC는 망막상에 부착되어 분화한다.

망막의 많은 영역에서 GFP를 발현하는 세포는 기저 성상교세포 및 유사한 혈관에 부합되는 패턴으로 배열되었다. 이러한 형광 세포는 내인성의 발달중인 혈관 네트워크의 전방부에서 관찰되었다(도 2b). 대조적으로, 단지 소수의 Lin⁺ HSC(도 2c) 또는 성체 마우스 장간막 내피 세포(도 2d)만이 망막 표면에 부착되었다. 주사된 Lin^- HSC 조성물로부터의 세포가 이미 확립된 혈관을 갖는 망막에도 부착할 수 있는지를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 Lin^- HSC 조성물을 성체 안구에 주사하였 다. 흥미롭게도, 어떠한 세포도 망막에 부착되거나, 확립된 정상 망막 혈관내로 혼입되는 것으로 관찰되지 않았다(도 2e). 이는 본 발명의 Lin^- HSC 조성물이 정상적으로 발달된 혈관계를 붕괴시키지 않거나 정상적으로 발달된 망막에서 비정상적 혈관화를 개시하지 않을 것임을 나타낸다.

본 발명의 주사된 Lin^- HSC 조성물과 망막 성상교세포 간의 관련성을 결정하기 위해, 아교 섬유상 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein(GFAP, 성상교세포의 마커) 및 프로모터-유도된 녹색 형광 단백질(GFP)를 발현한 유전자전이된 마우스를 사용하였다. eGFP 유전자전이된 마우스로부터의 Lin^- HSC가 주사된 이러한 GFAP-GFP 유전자전이된 마우스의 망막 검사는 주사된 eGFP EPC와 기존의 성상교세포의 공동 국재화를 입증하였다(도 2f 내지 2h, 화살표). eGFP+Lin^- HSC의 과정은 기저 성상교세포 네트워크에 부합되는 것으로 관찰되었다(화살표, 도 2g). 이러한 안구 검사로, 주사된 표지된 세포만이 성상교세포에 부착되었음이 입증되었으며, 망막 주변부가 아직 내인성 혈관을 갖지 않는 P6 마우스 망막에서, 주사된 세포는 이러한 아직 혈관화되지 않은 영역내의 성상교세포에 부착된 것으로 관찰되었다. 놀랍게도, 주사된 표지된 세포는 망막의 보다 심층에서, 이후에 정상적 망막 혈관이 발달될 정확한 위치(도 2i, 화살표)에서 관찰되었다.

본 발명의 주사된 Lin^- HSC가 발달중인 망막 혈관계내로 안정하게 혼입되는지를 결정하기 위해서, 이후의 몇가지 시점에서 망막 혈관을 검사하였다. P9(주사한지 7일 후)만큼 이른 시점에서, Lin^- HSC는 CD31⁺ 구조내로 혼입되었다(도 2j). P16(주사한지 14일 후)까지, 세포는 이미 망막의 혈관 형상 구조내로 광범위하게 혼입되었다(도 2k). 동물을 희생시키기 전에 (기능적 망막 혈관을 확인하기 위해) 로다민-덱스트란을 정맥내로 주사한 경우, 다수의 Lin^- HSC는 모(母) 혈관관 함께 정렬되었다(도 2l). 다음의 2가지 패턴의 표지된 세포 분포가 관찰되었다: (1) 한가지 패턴에서 세포는 표지되지 않은 내피 세포들 간에서 혈관을 따라 산재되었으며, (2) 다른 패턴은 혈관이 전적으로 표지된 세포만으로 이루어졌음을 나타냈다. 주사된 세포는 또한 심재성 혈관총의 혈관내로도 혼입되었다(도 2m). 신생혈관계내로 Lin^- HSC 유래의 EPC가 산발적으로 혼입된다는 것은 이미 보고된 바 있으나, 혈관 네트워크가 전적으로 이러한 세포만으로 이루어진다는 것은 최초의 보고이다. 이는 유리체내로 주사된 본 발명의 골수 유래의 Lin^- HSC 집단의 세포가 형성중인 망막 혈관총의 어떠한 층내로도 효율적으로 혼입될 수 있음을 입증한다.

비-망막 조직(예: 뇌, 간, 심장, 폐, 골수)의 조직학적 검사로는, 유리체내 주사한지 5일 또는 10일 후까지 검사한 경우에 어떠한 GFP 양성 세포의 존재도 입증하지 못했다. 이는 Lin^- HSC 분획내 세포 아집단이 망막 성상교세포를 선택적으로 표적화하여 발달중인 망막 혈관계내로 안정하게 혼입됨을 나타낸다. 이들 세포가 (망막 성상교세포와 연합됨, 연장된 형태, 모 세포내로의 안정한 혼입 및 세포외 위치에 존재하지 않음) 내피 세포의 많은 특징을 지니기 때문에, 이들 세포는 Lin^- HSC 집단내에 존재하는 EPC를 대표한다. 표적화된 성상교세포는 다수의 저산소증 망막병증에서 관찰된 동일한 유형의 것이며, 아교세포가 DR 및 기타 유형의 망막 손상에서 관찰된 신생혈관 엽상체의 주된 성분임은 익히 공지되어 있다. 반응성 신경아교증 및 허혈-유도된 신생혈관형성의 조건하에, 활성화된 성상교세포는, 사람을 포함한 다수의 포유동물 종에서 신생아 망막 혈관 주형 형성 동안 관찰된 바와 동일하게, 증식하고 사이토킨을 생성하여 GFAP를 상향조절한다.

본 발명의 Lin^- HSC 조성물이 신생아 마우스 안구에서와 같이 성체 마우스 안구에서도 활성화된 성상교세포를 표적화할 수 있는지를 시험하기 위해서, Lin^- HSC 세포를 광응고술(도 3a) 또는 바늘 첨단(도 3b)에 의해 망막이 손상된 성체 안구에 주사하였다. 모델 둘다에서, 현저하게 GFAP로 염색된 세포 집단은 손상 부위 주면에서만 관찰되었다(도 3a 및 3b). 주사된 Lin^- HSC 조성물로부터의 세포는 손상된 부위로 국재화되고 GFAP-양성 성상교세포와 특이적으로 연합된 상태를 유지하였다(도 3a 및 3b). 이들 부위에서, Lin^- HSC 세포는 신생아의 심재성 망막 혈관계 형성 동안 관찰된 수준과 유사한 수준으로 망막의 심층내로 이동한 것으로도 관찰되었다(데이타는 제시하지 않음). 망막의 손상되지 않은 부분은, Lin^- HSC를 정상의 손상되지 않은 성체 망막에 주사한 경우에 관찰된 바와 동일하게 Lin^- HSC 세포를 함유하지 않았다(도 2e). 이러한 데이타는 Lin^- HSC 조성물이 신경아교증을 앓는 손상된 성체 망막뿐만 아니라 혈관화중인 신생아 망막에서도 활성화된 아교세포를 선택적으로 표적화할 수 있음을 나타낸다.

유리체내로 주사된 Lin ^- HSC는 변성 혈관계를 구제하고 안정화시킬 수 있다.

유리체내로 주사된 Lin^- HSC 조성물이 성상교세포를 표적화하고 정상적인 망막 혈관계로 혼입되기 때문에, Lin^- HSC 세포는 또한 신경아교증 및 혈관 변성과 관련된 허혈성 또는 변성 망막 질환에서 변성 혈관계를 안정화시킨다. rd/rd 마우스는 출생 후 1개월까지 광수용체 및 망막 혈관 층의 심각한 변성을 나타내는 망막 변성 모델이다. 이러한 마우스의 망막 혈관계는 P16까지 정상적으로 발달하며, 이 시점에서 보다 심재성 혈관총은 퇴화되며, 대부분의 마우스에서 심재성 및 중재성 혈관총은 P30까지 거의 완전하게 변성되었다.

HSC가 퇴화중인 혈관을 구제할 수 있는지를 결정하기 위해서, Lin⁺ HSC 또는 Lin^- HSC(Balb/c 마우스 유래)를 P6에서 rd/rd 마우스에 유리체내로 주사하였다. P33까지, Lin⁺ HSC를 주사한 후, 망막의 가장 심층의 혈관은 거의 완전히 존재하지 않았다(도 4a 및 4b). 대조적으로, Lin^- HSC가 주사된 대부분의 망막은 P33까지 3개의 대등한, 잘 형성된 혈관 층을 갖는 거의 정상적인 망막 혈관계를 지녔다(도 4a 및 4d). 이러한 효과의 정량화는, Lin^- HSC가 주사된 rd/rd 안구의 심재성 혈관총 내 혈관의 평균 길이가, 미처리되었거나 Lin⁺ HSC가 주사된 안구보다 거의 3배 더 길다는 것을 입증하였다(도 4e). 놀랍게도, rd/rd 성체 마우스(FVB/N) 골수로부터 유래된 Lin^- HSC 조성물의 주사는 변성중인 rd/rd 신생아 마우스 망막 혈관계도 구제하였다(도 4f). rd/rd 마우스 안구내의 혈관계의 변성은 출생 후 2주 내지 3주만큼 이른 시점에서 관찰되었다. P15만큼 늦은 시점에서 Lin^- HSC를 주사해도 1개월 이상 동안 rd/rd 마우스에서 변성 혈관계가 부분적으로 안정화되었다(도 4g 및 4h).

보다 어린(예를 들어, P2) rd/rd 마우스에게 주사된 Lin^- HSC 조성물도 발달중인 표재성 혈관계내로 혼입되었다. P11까지, 이들 세포는 심재성 혈관총의 수준으로 이동하여 야생형 외부 망막 혈관 층에서 관찰된 패턴과 동일한 패턴을 형성하였다(도 5a). 주사된 Lin^- HSC 조성물로부터의 세포가 rd/rd 마우스에서 발달중인 망막 혈관계내로 혼입되어 이를 안정화시키는 방식을 보다 명확히 기술하기 위해서, Balb/c 마우스로부터 유래된 Lin^- HSC 조성물을 Tie-2-GFP FVB 마우스 안구에 주사하였다. FVB 마우스는 rd/rd 유전형을 가지며, 융합 단백질 Tie-2-GFP를 발현하기 때문에 모든 내인성 혈관이 형광을 발한다.

표지되지 않은, Lin^- HSC 조성물로부터의 세포가 신생아의 Tie-2-GFP FVB 안구에 주사되고 이어서 발달중인 혈관계내로 혼입된 경우, 내인성의 Tie-2-GFP 표지 된 혈관들에는 주사되어 혼입된 표지되지 않은 Lin^- HSC에 상응하는 표지되지 않은 갭(gap)이 있어야 한다. 이어서, 다른 혈관 마커(예: CD-31)로의 후속적 염색은 전체 혈관의 윤곽을 잡도록하여, 비-내인성 내피 혈관이 혈관계의 일부인지를 결정할 수 있도록 하였다. 주사한지 2개월 후, Lin^- HSC 조성물이 주사된 안구의 망막에서 CD-31 양성이면서 Tie-2-GFP 음성인 혈관이 관찰되었다(도 5b). 흥미롭게도, 대다수의 구제된 혈관은 Tie-2-GFP 양성 세포를 함유하였다(도 5c). 평활근 액틴 염색으로 측정된 혈관주위세포의 분포는, 혈관 구제가 있었는지에 관계없이, Lin^- HSC 주사에 의해 변화되지 않았다(도 5d). 이러한 데이타는, 유리체내로 주사된 본 발명의 Lin^- HSC 조성물이 유전적 결손 마우스의 망막내로 이동하고 정상적인 망막 혈관의 형성에 참여하여 내인성 변성 혈관계를 안정시킴을 명백히 입증한다.

Lin ^- HSC로부터 형질감염된 세포에 의한 망막 혈관신생의 억제

대다수의 망막 혈관 질환에는 혈관 변성보다는 오히려 비정상적 혈관 증식이 관여한다. 성상교세포로 표적화되는 유전자전이된 세포를 사용하여 항-혈관신생 단백질을 전달하고 혈관신생을 억제할 수 있다. Lin^- HSC 조성물로부터의 세포를 T2-트립토파닐-tRNA 신테타제(T2-TrpRS)로 형질감염시켰다. T2-TrpRS는 잠재적으로 망막의 혈관신생을 억제하는 TrpRS의 43kD 단편이다(도 6a). P12에서, P2에서 대조군 플라스미드-형질감염된 Lin^- HSC 조성물(T2-TrpRS 유전자를 함유하지 않음)이 주사된 안구의 망막은 정상적인 1차(도 6c) 및 2차(도 6d) 망막 혈관총을 지녔다. T2-TrpRS 형질감염된 본 발명의 Lin^- HSC 조성물을 P2 안구에 주사하고 10일 후에 평가한 경우, 1차 네트워크는 현저한 비정상성(도 6e)을 가졌으며 심재성 망막 혈관의 형성은 거의 완전히 억제되었다(도 6f). 이들 안구에서 관찰된 소수의 혈관은 혈관 사이의 갭이 커짐에 따라 현저하게 감쇠되었다. T2-TrpRS를 분비하는 Lin^- HSC 세포에 의한 억제 범위는 하기 표 2에 상세히 기재한다.

T2-TrpRS는 시험관내에서 Lin^- HSC 조성물 내의 세포에 의해 생산되고 분비되며, 이들 형질감염된 세포를 유리체내로 주사한 후, 망막내에서 T2-TrpRS의 30kD 단편(도 6b)가 관찰되었다. 이러한 30kD 단편은 특히, 본 발명의 형질감염된 Lin^- HSC가 주사된 망막에서만 관찰되며, 재조합 또는 시험관내-합성된 단백질에 비해서 이렇게 외관적 분자량이 감소된 것은 생체내의 T2-TrpRS의 프로세싱 또는 분해 때문일 수 있다. 이들 데이타는 Lin^- HSC를 사용하여, 혈관신생억제성 분자를 발현하는 유전자와 같은 기능적 활성 유전자를 활성화된 성상교세포로 표적화함으로써 망막 혈관계로 전달할 수 있음을 나타낸다. 관찰된 혈관생성억제 효과가 세포 매개성 활성으로 인한 것일 가능성이 있지만, 동일하지만 T2로 형질감염되지 않은 Lin^- HSC 조성물로 처리된 안구가 정상 망막 혈관계를 가졌기 때문에 이는 거의 불가능하다.

T2-TrpRS를 분비하는 Lin^- HSC 세포에 의한 혈관 억제

	1차 혈관총	심재성 혈관총
	억제됨 정상	완전한 부분적 정상
TsTrpRS (15개의 안구)	60% 40% (9개 안구) (6개 안구)	33.3% 60% 6.7% (5개 안구) (9개 안구) (1개 안구)
대조군 (13개의 안구)	0% 100% (0개 안구) (13개 안구)	0% 38.5% 61.5% (0개 안구) (5개 안구) (8개 안구)

유리체내로 주사된 Lin^- HSC 조성물은 망막 성상교세포로 국재화되어 혈관내로 혼입되었으며, 다수의 망막 질환의 치료시에 유용할 수 있다. 주사된 HSC 조성물로부터의 대부분의 세포가 성상교세포 주형에 부착되나, 소수는 망막내로 깊숙이 이동하여, 후속적으로 심재성 혈관 네트워크가 발달될 영역으로 이동한다. 출생후 42일 전에 상기 영역에서 GFAP-양성 성상교세포가 관찰되지 않았다 해도, 이는 GFAP-음성 아교세포가 이미 존재하여 Lin^- HSC 국재화에 대한 시그날을 제공할 수 있다는 가능성을 배제하지는 않는다. 이전의 연구는 다수의 질환이 반응성 아교증과 관련됨을 제시하였다. DR에서, 특히 아교세포 및 이의 세포외 매트릭스는 병리학적 혈관신생과 관련된다.

주사된 Lin^- HSC 조성물로부터의 세포가 특이적으로 GFAP-발현 아교세포에 부착되었기 때문에, 손상의 유형에 관계없이, 본 발명의 Lin^- HSC 조성물을 망막내의 혈관신생전 병소를 표적화하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 당뇨병과 같은 허혈성 망막병증에서, 신생혈관형성은 저산소증에 대한 반응이다. Lin^- HSC 조성물을 병리학적 신생혈관형성 부위로 표적화함으로써 신생혈관계를 안정시켜 출혈 또는 부종(DR과 관련된 시력 상실의 원인)과 같은 신생혈관계의 비정상성을 예방할 수 있고, 처음에 신생혈관형성을 자극한 저산소증을 잠재적으로 경감시킬 수 있다. 비정상적 혈관은 정상 상태로 회복될 수 있다. 게다가, T2-TrpRS와 같은 혈관신생억제성 단백질을 형질감염된 Lin^- HSC 조성물 및 성상교세포의 레이저-유도된 활성화를 사용하여 병리학적 혈관신생 부위로 전달할 수 있다. 레이저 광응고술은 임상 안과학에서 통상적으로 사용되기 때문에, 이러한 접근법은 다수의 망막 질환용으로 적용된다. 이러한 세포계 접근법은 암 치료요법에서 조사되어 왔으며, 안구 질환에 대한 이의 사용은 보다 유리한데, 이는 안내 주사로 수많은 세포를 질환 부위로 직접 전달할 수 있기 때문이다.

Lin ^- HSC에 의한 신경영양성 및 혈관영양성 구제

상기한 바와 같은 증가된 녹색 형광 단백질(eGFP), C3H(rd/rd), FVB (rd/rd) 마우스의 골수로부터 Lin^- HSC를 분리시키기 위해 MACS를 사용하였다. 이들 마우스로부터의 EPC를 함유하는 Lin^- HSC를 P6 C3H 또는 FVB 마우스 안구에 유리체내로 주사하였다. 주사 후 다양한 시점(1개월, 2개월 및 6개월)에서 안구를 수집하였다. CD31에 대한 항체로 염색한 후의 공초점 레이저 주사현미경 및 DAPI로 핵 염색 후의 망막 조직학에 의해 혈관계를 검사하였다. 또한, 다양한 시점에서의 망막으로 부터의 mRNA의 마이크로어레이 유전자 발현(microarray gene expression) 분석을 사용하여 당해 효과에 잠재적으로 관여하는 유전자를 확인하였다.

rd/rd 마우스의 안구는 P21까지 감각신경 망막 및 망막 혈관계 둘다가 심각하게 변성되어 있었다. P6에서 Lin^- HSC로 처리된 rd/rd 마우스의 안구는 6개월 동안 정상적인 망막 혈관계를 유지하였으며, 심층 및 중간층은 둘다 대조군과 비교하여 모든 시점(1개월, 2개월 및 6개월)에서 현저하게 개선되었다(도 12 참조). 또한, 본 발명자들은 또한 Lin^- HSC로 처리된 망막이 대조군으로서 Lin⁺ HSC로 처리된 안구에 비해서 보다 두꺼웠으며(1개월: 1.2배, 2개월: 1.3배, 6개월; 1.4배) 외부 핵 층에 다수의 세포(1개월: 2.2배, 2개월: 3.7배, 6개월: 5.7배)를 가졌음을 관찰하였다. 대조군(미처리되거나 Lin^- HSC로 처리되지 않음) rd/rd 망막과 비교한 "구제된"(예: Lin^- HSC) rd/rd 망막의 대규모 게놈 분석으로 sHSP(소형 열충격 단백질; small heat shock protein), 및 표 3에 제시한 인자들을 포함하는 혈관 및 신경 구제와 상관관계가 있는 특이적 성장 인자를 암호화하는 유전자의 현저한 상향 조절이 입증되었다.

본 발명의 골수 유래의 Lin^- HSC는 rd/rd 마우스에서 정상 혈관계의 유지를 현저하고 재현가능하게 유도하고 광수용체 및 기타 신경 세포 층을 급격하게 증가시킨다. 이러한 신경영양성 구제 효과는 소형 열충격 단백질 및 성장 인자의 현저한 상향 조절과 상관관계가 있으므로, 현재로서는 치료불가능한 망막 변성 질환의 치료학적 접근법에 관한 식견을 제공한다.

논의

계통-관련 조혈 세포에 대한 마커를 사용하여, EPC를 함유하는 골수 유래의 Lin^- HSC의 집단을 음성적으로 선별하였다. EPC로서 사용할 수 있는 골수 유래의 Lin^- HSC의 아집단은 통상적으로 사용되는 세포 표면 마커에 의해서는 특성이 규명되지 않지만, 발달중인 또는 손상된 망막 혈관계에서의 이들 세포의 성향은 Lin⁺ 또는 성체 내피 세포 집단에서 관찰된 성향과는 전적으로 상이하다. Sca-1과 같은 마커를 사용한 HSC의 추가의 아분획화(subfractionation)는 Lin- Scal⁺ 세포가 Lin^- HSC 세포 단독의 사용과는 어떠한 유의적 차이도 보여주지 않았음을 나타낸다. 이들 세포는 망막 혈관신생 부위로 선택적으로 표적화되어 모 혈관의 형성에 참여한다.

유전적 망막 변성 질환은 흔히 망막 혈관계의 손실을 동반한다. 이러한 질환의 효과적 치료는 기능 회복뿐만 아니라 복합적 조직 구조의 유지를 필요로 한다. 최근의 몇몇 연구는 영양성 인자의 세포계 전달 또는 줄기세포 자체의 사용을 조사하여 왔으며 이들 둘다의 몇가지 조합이 필수적일 수 있다. 예를 들어, 망막 변성 질환을 치료하기 위한 성장인자 치료요법의 사용은 혈관의 과성장을 조절하지 못하여 정상 망막 조직 구조의 심각한 붕괴를 초래한다. 망막 변성 질환을 치료하기 위한 신경 또는 망막 줄기세포의 사용은 신경 기능을 재구성할 수 있으나, 기능성 혈관계는 망막의 기능적 완전성을 유지하는 것도 필수적일 수 있다. 본 발명의 Lin^- HSC 조성물로부터의 세포를 rd/rd 마우스의 망막 혈관내로 혼입시키는 것은 망막 구조를 붕괴시키지 않으면서 변성 혈관계를 안정화시켰다. 이러한 구제 효과는 상기 세포를 P15 rd/rd 마우스에게 투여한 경우에도 관찰되었다. 혈관 변성이 rd/rd 마우스에서 P16에서 시작하기 때문에, 이러한 관찰 결과는 효과적인 Lin^- HSC 치료에 대한 치료 범위를 확장시킨다. 본 발명의 Lin^- HSC가 주사된 안구에서 망막 신경세포 및 광수용체가 보존되며 시각기능이 유지된다.

본 발명의 Lin^- HSC 조성물은 반응성 성상아교세포를 표적화함으로써 혈관신생을 촉진할 수 있으며, 망막 구조를 붕괴시키지 않으면서, 확립된 주형내로 혼입될 수 있는 EPC 집단을 함유한다. 본 발명의 Lin^- HSC는 또한 망막 변성을 앓는 안구에서 놀랄만한 장기간의 신경영양성 구제 효과를 제공한다. 또한, EPC를 함유하는, 유전적으로 변형된 자가 Lin^- HSC 조성물은 허혈성 또는 비정상적으로 혈관화된 안구에 이식될 수 있으며 신생 혈관내로 안정하게 혼입되어 장시간 동안 국소적으로 치료학적 분자를 연속적으로 전달할 수 있다. 약리학적 제제를 생리학적으로 의미있는 용량으로 발현하는 유전자의 국소 전달은 현재는 치료불가능한 안구 질환을 치료하기 위한 신규한 패러다임을 대표한다.

<110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE <120> Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith <130> 5-1998-061838-8 <150> 60/398,522 <151> 2002-07-25 <150> 60/467,051 <151> 2003-05-02 <160> 2 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 4742 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding His-tagged human T2-TrpRS <400> 1 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780 agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840 tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020 aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140 tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260 ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320 cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380 gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440 actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560 caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680 accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860 agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920 accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980 gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700 catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760 tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820 ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880 tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940 ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000 aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300 cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360 tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420 tatacatatg agtgcaaaag gcatagacta cgataagctc attgttcggt ttggaagtag 3480 taaaattgac aaagagctaa taaaccgaat agagagagcc accggccaaa gaccacacca 3540 cttcctgcgc agaggcatct tcttctcaca cagagatatg aatcaggttc ttgatgccta 3600 tgaaaataag aagccatttt atctgtacac gggccggggc ccctcttctg aagcaatgca 3660 tgtaggtcac ctcattccat ttattttcac aaagtggctc caggatgtat ttaacgtgcc 3720 cttggtcatc cagatgacgg atgacgagaa gtatctgtgg aaggacctga ccctggacca 3780 ggcctatggc gatgctgttg agaatgccaa ggacatcatc gcctgtggct ttgacatcaa 3840 caagactttc atattctctg acctggacta catggggatg agctcaggtt tctacaaaaa 3900 tgtggtgaag attcaaaagc atgttacctt caaccaagtg aaaggcattt tcggcttcac 3960 tgacagcgac tgcattggga agatcagttt tcctgccatc caggctgctc cctccttcag 4020 caactcattc ccacagatct tccgagacag gacggatatc cagtgcctta tcccatgtgc 4080 cattgaccag gatccttact ttagaatgac aagggacgtc gcccccagga tcggctatcc 4140 taaaccagcc ctgttgcact ccaccttctt cccagccctg cagggcgccc agaccaaaat 4200 gagtgccagc gacccaaact cctccatctt cctcaccgac acggccaagc agatcaaaac 4260 caaggtcaat aagcatgcgt tttctggagg gagagacacc atcgaggagc acaggcagtt 4320 tgggggcaac tgtgatgtgg acgtgtcttt catgtacctg accttcttcc tcgaggacga 4380 cgacaagctc gagcagatca ggaaggatta caccagcgga gccatgctca ccggtgagct 4440 caagaaggca ctcatagagg ttctgcagcc cttgatcgca gagcaccagg cccggcgcaa 4500 ggaggtcacg gatgagatag tgaaagagtt catgactccc cggaagctgt ccttcgactt 4560 tcagaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa 4620 caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc 4680 ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 4740 at 4742 <210> 2 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tagged human T2-TrpRS <400> 2 Met Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly 1 5 10 15 Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr 20 25 30 Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His 35 40 45 Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe 50 55 60 Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly 65 70 75 80 His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn 85 90 95 Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys 100 105 110 Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys 115 120 125 Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser 130 135 140 Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val 145 150 155 160 Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly 165 170 175 Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg 195 200 205 Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr 210 215 220 Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro 225 230 235 240 Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr 245 250 255 Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr 260 265 270 Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly 275 280 285 Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val 290 295 300 Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys 305 310 315 320 Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly 325 330 335 Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu 340 345 350 His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe 355 360 365 Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala 370 375 380 Leu Glu His His His His His His 385 390

Claims (65)

1. 50% 내지 85%의 세포가 세포 마커 CD31을 발현하고 70% 내지 75%의 세포가 세포 마커 c-kit를 발현하며 0% 초과 내지 1%의 세포가 마커 Tie-2를 발현하는 내피 전구세포를 포함하는 분리된 포유동물 골수 유래의 계통(lineage) 음성 조혈 줄기세포 집단으로서, 상기 포유동물 골수 유래의 계통 음성 조혈 줄기세포 집단이

   (a) 포유동물의 분리된 골수로부터 다수의 단핵구를 분리하는 단계;

   (b) 다수의 단핵구를 CD45, CD3, Ly-6G, CD11 및 TER-119로 이루어진 세포 마커에 대한 바이오틴-접합된 계통 패널 항체로 표지하는 단계; 및

   (c) 다수의 단핵구로부터 상기 항체에 대해 계통 양성인 단핵구를 제거하여내피 전구세포를 포함하는 계통 음성 조혈 줄기세포 집단을 제공하는 단계에 의해 분리되는, 분리된 조혈 줄기세포 집단.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 세포가 쥐 세포인 분리된 줄기세포 집단.
6. 제1항에 있어서, 세포가 사람 세포인 분리된 줄기세포 집단.
7. 삭제
8. 삭제
9. 50% 내지 85%의 세포가 CD31 마커를 발현하고, 70% 내지 75%의 세포가 c-kit 마커를 발현하며, 4% 내지 8%의 세포가 Sca-1 마커를 발현하고, 2% 내지 4%의 세포가 Flk-1/KDR 마커를 발현하는 내피 전구세포를 포함하는, 분리된 포유동물 골수 유래의 조혈 줄기세포 집단.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 제1항에 있어서, 계통 음성 조혈 줄기세포 집단이, 손상된 성체 망막의 아교세포가 풍부한 부위를 표적화할 수 있는 내피 전구세포를 포함하는 분리된 줄기 세포 집단.
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 삭제
43. 삭제
44. 삭제
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. T2-트립토파닐-tRNA 신테타제 (T2-TrpRS)를 암호화하는 유전자로 형질감염된 제1항에 따른 줄기세포 집단으로 이루어진 형질감염된 계통 음성 조혈 줄기세포 집단.
51. 삭제
52. 삭제
53. 삭제
54. 삭제
55. 삭제
56. 삭제
57. 삭제
58. 삭제
59. 삭제
60. 삭제
61. 삭제
62. 삭제
63. 삭제
64. 삭제
65. 삭제

Images