PT1935976E

PT1935976E - Células do tipo mielóide transfectadas para o tratamento de retinopatia da prematuridade e doenças relacionadas

Info

Publication number: PT1935976E
Application number: PT07021593T
Authority: PT
Inventors: Martin Friedlander; Eyal Banin; Edith Aguilar
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 2005-02-24
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2012-05-15
Also published as: EP1935976A1; AU2006216473B2; EP1853244B1; DK1935976T3; WO2006091895A2; EP1853244A4; CA2599172A1; CN101356268A; ES2427966T3; JP5173442B2; ES2382357T3; WO2006091895A3; EP1853244A2; ATE545697T1; EP1935976B1; RU2007135220A; AU2006216473A1; PL1935976T3; JP2008536804A; US20080317721A1

Description

ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Células do tipo mielóide transfectadas para o tratamento de retinopatia da prematuridade e doenças relacionadas"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório de patente U.S. com o número de série 60/656 122, apresentado a 24 de Fevereiro de 2005.

DECLARAÇÃO DE INTERESSES GOVERNAMENTAIS

Parte do trabalho aqui descrito foi apoiada pelos projectos subsidiados com os números EY11254 e EY12598 do National Eye Institute do National Institutes of Health. O governo dos Estados Unidos tem determinados direitos sobre este invento.

CAMPO DO INVENTO O campo técnico do invento refere-se ao tratamento de doenças retinopáticas. Mais especificamente refere-se ao tratamento de doenças retinopáticas tais como retinopatia da prematuridade por administração de células tal como aqui especificadas no olho de um mamífero que sofra ou que esteja em risco de desenvolver tais doenças.

ANTECEDENTES DO INVENTO

As doenças vasculares da retina incluindo retinopatia diabética, degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) exsudativa, retinopatia da prematuridade (ROP) e oclusão vascular, são causas principais de insuficiência visual e cegueira. Este grupo de doenças é o foco de investigação intensiva com o objectivo de identificar novas modalidades de tratamento que ajudarão a evitar ou modificar a neovascularização ocular patológica. Por exemplo, a DMRI afecta 12-15 milhões de americanos com mais de 65 anos e provoca perda de visão em 10-15% destes como efeito directo de neovascularização coroidal (sub-retiniana) . A causa principal de perda de visão nos americanos com menos de 65 anos é a diabetes; 16 milhões de indivíduos nos Estados Unidos são 2 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ diabéticos e 40 000 por ano sofrem de complicações oculares da doença muitas vezes em resultado de neovascularização retiniana. Apesar da fotocoagulação por laser ser eficaz a evitar perda de visão grave em subgrupos de doentes diabéticos de alto risco, a incidência global da retinopatia ao longo de 10 anos permanece substancialmente inalterável. Para doentes com neovascularização coroidal devida a DMRI ou doença inflamatória do olho tal como histoplasmose ocular a fotocoagulação, salvo algumas excepções, é ineficaz para evitar perda de visão. Apesar de terem sido desenvolvidas recentemente, as terapias fotodinâmicas não destrutivas são promissoras na redução temporária da perda individual em doentes com neovascularização coroidal que não era previamente tratável, com apenas 61,4% de doentes tratados de 3 em 3 ou de 4 em 4 meses a apresentaram visão melhorada ou estável comparativamente com 45,9% do grupo tratado com placebo. A degeneração macular relacionada com a idade e a retinopatia diabética são as principais causas de perda de visão nas nações industrializadas e fazem-no em resultado de neovascularização retiniana anómala. Dado que a retina consiste de camadas bem definidas de elementos neuronais, gliais e vasculares, perturbações relativamente pequenas tal como as observadas em proliferação vascular ou edema podem levar a perda significativa de função visual. As degenerescências retinianas hereditárias, tal como retinite pigmentosa (RP), estão também associadas a anomalias vasculares tal como estreitamento arteriolar e atrofia vascular. Apesar de ter sido feito um progresso significativo na identificação de factores que promovem e inibem angiogénese, não está presentemente disponível qualquer tratamento para tratar especificamente doença vascular ocular.

As degenerescências retinianas hereditárias afectam 1 em 3500 indivíduos e caracterizam-se por cegueira nocturna progressiva, perda de campo de visão, atrofia do nervo óptico, atenuação arteriolar, permeabilidade vascular alterada e perda de visão central que progride muitas vezes para cegueira completa (Heckenlively, J. R., editor, 1988; Retinitis Pigmentosa, Philadelphia: JB Lippincott Co.) . A análise genética molecular destas doenças identificou mutações em mais de 110 genes diferentes e que são responsáveis por apenas uma 3 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ percentagem relativamente pequena dos indivíduos afectados conhecidos (Humphries et al., 1992, Science 256:804—808; Farrar et al. 2002, EMBO J. 21:857-864.). Muitas destas mutações estão associadas a componentes enzimáticas e estruturais da maquinaria de foto-transdução incluindo rodopsina, cGMP fosfodiesterase, periferina de rds e RPE65. Apesar destas observações ainda não há tratamentos eficazes para abrandar ou inverter a progressão destas doenças degenerativas retinianas. Avanços recentes em terapia génica lavaram à reversão bem-sucedida de fenótipos rds (Ali et al. 2000, Nat. Genet. 25:306-310) e rd (Takahashi et al. 1999, J. Virol. 73:7812-7816) em ratinhos e do fenótipo RPE65 em cães (Acland et al. 2001, Nat. Genet. 28:92-95) quando se entrega o transgene de tipo selvagem aos foto-receptores ou ao epitélio pigmentoso retiniano (RPE) em animais com uma mutação específica. A angiogénese é o processo pelo qual se formam novos vasos sanguíneos. Em resposta a sinais químicos específicos os capilares germinam a partir de vasos existentes aumentando eventualmente de tamanho tal como necessário pelo organismo. Inicialmente as células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos dividem-se numa direcção ortogonal relativamente ao vaso existente formando um gérmen sólido. As células endoteliais adjacentes formam então vacúolos grandes e as células rearranjam-se de modo a que os vacúolos se orientem cauda-a-cauda e eventualmente se combinem para formar o lúmen de um novo capilar (formação de tubo). A angiogénese é estimulada por várias doenças tais como a resposta a um ferimento e acompanha virtualmente todo o crescimento de tecido nos organismos vertebrados tais como mamíferos. A angiogénese também desempenha um papel em determinados estados de doença tais como retinopatia diabética e determinados cancros. O crescimento de tumores, por exemplo, necessita de crescimento de vasos sanguíneos para proporcionar oxigénio e nutrientes ao tecido de tumor em crescimento. A angiogénese pode ser parada ou inibida por interferência com os sinais químicos que estimulam o processo angiogénico. Por exemplo, as células endoteliais angiogénicas produzem proteases para digerir a lâmina basal que rodeia os vasos 4 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ sanguíneos desimpedindo assim um caminho para o novo capilar. A inibição destas proteases ou a sua formação pode evitar a formação de novos vasos. Igualmente, as células endoteliais proliferam em resposta a sinais químicos. Os sinais de proliferação particularmente importantes incluem as famílias de proteínas de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e de factor de crescimento de fibroblastos (FGF). Demonstrou-se que o VEGF estava envolvido na vascularização de determinados tumores. A interferência com estes processos de sinalização de proliferação pode também inibir angiogénese. A angiogénese envolve vários factores. Tanto as moléculas de factor de crescimento de fibroblastos ácido como básico são mitogénios para células endoteliais e outros tipos de células. Um mitogénio altamente selectivo para células endoteliais vasculares é o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF).

No adulto normal a angiogénese está fortemente regulada e limita-se a cicatrização de feridas, gravidez e ciclo uterino. A angiogénese é desencadeada por moléculas angiogénicas específicas tais como factor de crescimento de fibroblastos (FGF) básico e ácido, VEGF, angiogenina, factor de crescimento por transformação (TGF), factor α de necrose de tumor (TNF-a) e factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). A angiogénese pode ser suprimida por moléculas inibidoras tais como interferão-α, tromboespondina-1, angiostatina e endostatina. 0 equilíbrio entre estes estimulantes e inibidores de ocorrência natural controla a vasculatura capilar, normalmente quiescente. Quando este equilíbrio é alterado, tal como em determinados estados de doença as células endoteliais vasculares são induzidas a proliferar, migrar e em última análise, diferenciar. A angiogénese desempenha um papel central em várias doenças incluindo cancro e neovascularização ocular. Demonstrou-se igualmente que o crescimento sustentado e a metástase de vários tumores dependem do crescimento de novos vasos sanguíneos do hospedeiro para o tumor em resposta a factores angiogénicos derivados do tumor. A proliferação de novos vasos sanguíneos em resposta a vários estímulos é a constatação dominante na maioria das doenças do olho e que 5 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ cegam incluindo retinopatia diabética proliferativa, DMRI, glaucoma rubeótico, queratite intersticial e retinopatia da prematuridade. Nestas doenças, o dano dos tecidos pode estimular a libertação de factores angiogénicos que resultam em proliferação capilar. 0 VEGF desempenha um papel dominante na neovascularização da iris e em retinopatias neovasculares. Existem relatos que demonstram uma correlação clara entre os niveis intra-oculares de VEGF e a neovascularização ocular retinopática isquémica na qual o FGF desempenha provavelmente um papel. Sabe-se que as FGF básica e ácida estão presentes na retina adulta normal apesar dos niveis detectáveis não serem consistentemente correlacionados com neovascularização. Tal pode ficar a dever-se maioritariamente ao facto de FGF se ligar muito fortemente a componentes carregadas da matriz extracelular e poder não estar facilmente disponível numa forma de difusão livre, que seria detectada por ensaios padrão de fluidos intra-oculares.

Uma via comum final na resposta angiogénica envolve troca de informação mediada por integrina entre uma célula endotelial vascular em proliferação e a matriz extracelular. Esta classe de receptores de adesão denominada integrinas é expressa como heterodímeros com uma subunidade α e β em todas as células. Uma dessas integrinas, ανβ3, é o membro mais promíscuo desta família e permite que as células endoteliais interajam com uma grande variedade de componentes da matriz extracelular. Os péptidos e anticorpos antagonistas desta integrina inibem angiogénese por indução selectiva de apoptose das células endoteliais vasculares em proliferação. Existem duas vias de angiogénese dependentes de citoquinas e podem definir-se pela sua dependência de diferentes integrinas celulares vasculares, ανβ3 e ανβ5· Especificamente, a angiogénese induzida por FGF básico e por VEGF depende da integrina ανβ3 e ανβ5, respectivamente, dado que os antagonistas de anticorpo de cada integrina bloqueiam selectivamente uma destas vias angiogénicas nos modelos de córnea de coelho e de membrana corioalantóica (CAM) de pinto. Os péptidos antagonistas que bloqueiam todas as integrinas cxv inibem angiogénese estimulada por FGF e por VEGF. Enquanto os vasos sanguíneos oculares humanos normais não apresentam qualquer das integrinas, as integrinas ανβ3 e ανβ5 são apresentadas selectivamente nos vasos sanguíneos em tecidos de 6 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

doentes com doença neovascular do olho activa. Enquanto apenas ανβ3 foi observada consistentemente em tecidos de doentes com DMRI, tanto ανβ3 como ανβδ estavam presentes em tecidos de doentes com retinopatia diabética proliferativa. A administração sistémica de antagonistas peptidicos de integrinas bloqueou a formação de novos vasos sanguíneos num modelo de ratinho de vasculogénese retiniana. 0 ensaio de tratamentos potenciais para doenças neovasculares retinianas tem sido grandemente facilitado pelo desenvolvimento de modelos de retinopatia induzida por oxigénio (OIR) em várias espécies animais, incluindo gatinho, cachorro beagle, rato e ratinho. Em cada um destes modelos a exposição de animais recém-nascidos a hiperóxia (ou a hiperóxia alternando com hipóxia) desencadeia regressão ou atraso de desenvolvimento vascular retiniano seguido de angiogénese anómala após regresso aos níveis de oxigénio normais. Estes modelos espelham os eventos que ocorrem durante a retinopatia da prematuridade (ROP), uma doença que envolve neovascularização patológica e que pode afectar bebés prematuros.

Ao longo da última década o modelo de ratinho de OIR tornou-se o modelo mais comum para estudar angiogénese anómala associada a retinopatias induzidas por oxigénio. 0 padrão de anomalias vasculares neste modelo difere ligeiramente do observado em ROP; no ratinho a retina central posterior torna-se avascular após exposição a hiperóxia enquanto em bebés humanos a periferia é avascular. Apesar de tudo este é um modelo bem aceite para estudo dos mecanismos de doença e tratamento potencial de retinopatia induzida por hipóxia e as alterações vasculares são muito consistentes, reprodutíveis e quantificáveis. Nos últimos anos, a utilização deste modelo tem sido estendida ao estudo geral de vasculopatias isquémicas e intervenções anti-angiogénicas relacionadas e utiliza-se agora extensamente em ambientes de investigação básica e aplicada. 0 método historicamente comum para quantificar a resposta neovascular proliferativa no modelo OIR de ratinho baseia-se na contagem do número de células associadas a novos vasos que se estendem a partir da retina para o vítreo ("núcleos da 7 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ membrana limitante pré-interna (ILM)"). Tal efectua-se em cortes sagitais habitualmente em regiões perto (mas não incluindo) o disco óptico. 0 método é muito intensivo do ponto de vista de mão-de-obra, tempo e está repleto de dificuldades incluindo a necessidade de diferenciação de células dos vasos anómalos a partir dos vasos hialóides no vítreo. Dado que de um modo geral apenas se avaliam um em cada 30 cortes da série, uma grande parte do tecido não é quantificado introduzindo potencialmente grandes erros de amostragem. Além disso, como os olhos completos são imediatamente cortados, não se efectua uma avaliação no mesmo olho de outro parâmetro importante deste modelo, nomeadamente a extensão de obliteração vascular e a taxa de revascularização retiniana que ocorre concomitantemente com a formação de tufos neovasculares anómalos. Este parâmetro é melhor avaliado em preparações de montagens de retina completa.

Sabe-se há muito anos que existe uma população de células estaminais em circulação e na medula óssea de adulto normal. As diferentes subpopulações destas células podem diferenciar-se em linhagens de linhagem hematopoiética positiva (Lin+) ou de linhagem hematopoiética negativa (Lin~) . Além disso, provou-se recentemente que a população de células estaminais hematopoiéticas (HSC) negativas para linhagem contém células progenitoras endoteliais (EPC) capazes de formar vasos sanguíneos in vitro e in vivo (consultar Asahara et al. 1997, Science 275: 964-7). Estas células podem participar em angiogénese pós-natal normal e patológica (consultar Lyden et al. 2001 Nat. Med. 7, 1194-201; Kalka et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 97:3422-7; e Kocher et al. 2001, Nat. Med. 7: 430-6) assim como podem diferenciar em vários tipos de células não endoteliais incluindo hepatócitos (consultar Lagasse et al. 2000, Nat. Med. 6:1229-34), células microgliais (consultar Priller et al. 2002 Nat. Med. 7:1356-61), cardiomiócitos (consultar Orlic et al. 2001, Proc. Natl. Acad Sei. U. S. A. 98:10344-9) e de epitélio (consultar Lyden et al. 2001, Nat. Med. 7:1194-1201). Apesar destas células terem sido utilizadas em vários modelos experimentais de angiogénese, o mecanismo para EPC ter como alvo a neovasculatura não é conhecido e não foi identificada qualquer estratégia que leve a uma aumento eficaz do número de células que contribuem para uma vasculatura específica. 8 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

As células estaminais hematopoiéticas da medula óssea são actualmente o único tipo de células estaminais utilizadas habitualmente para aplicações terapêuticas. As HSC da medula óssea têm sido utilizadas em transplantes há mais de 40 anos. Presentemente estão a ser investigados métodos avançados para recolher células estaminais purificadas para desenvolver terapias para tratamento de leucemia, linfoma e doenças sanguíneas hereditárias. Têm-se investigado aplicações clínicas de células estaminais em humanos para o tratamento de diabetes e cancro avançado dos rins em números limitados de doentes humanos. W02004/010959 revela a utilização de células estaminais hematopoiéticas negativas para linhagem (HSC Lin”) derivadas de medula óssea e transfectadas com fragmentos angiostáticos de TrpRS para preparar medicação contra retinopatia.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento proporciona a utilização de células na preparação de uma composição farmacêutica para tratar um mamífero em risco de desenvolver ou sofrer de uma doença retinopática, nomeadamente uma retinopatia da prematuridade, em que: (a) as células estão numa população de células de medula óssea isolada, negativas para linhagem, vasculotrópica e de tipo mielóide na qual as células expressam os antigénios CD44 e CDllb; (b) as células foram transfectadas com um ácido nucleico que codifica um fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetase (Trp-RS); (c) a composição farmacêutica é para administração das referidas células à retina do mamífero numa quantidade eficaz para promover revascularização fisiológica de áreas danificadas da retina e para melhorar danos da retina provocados pela doença.

Preferentemente o mamífero é um doente humano. Numa concretização preferida as células compreendem células estaminais hematopoiéticas e células progenitoras endoteliais. 9 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Preferentemente as células são autólogas ao mamífero individual a ser tratado. Preferentemente a composição farmacêutica é para administração das células por injecção intra-ocular. Numa concretização preferida, a composição farmacêutica é para administração das células a um mamífero que sofra de retinopatia da prematuridade (ROP) , tal como um bebé humano, durante os estágios precoces da doença. Noutra concretização preferida, a composição farmacêutica é para administração das células a um mamífero em risco de desenvolver ROP ou uma doença retinopática relacionada, como um agente profiláctico antes da manifestação dos sintomas da doença ou antes da exposição de um bebé a hiperóxia.

Os resultados do modelo de retinopatia induzida por oxigénio (OIR) de ROP indicam que o tratamento aqui descrito promove cura e recuperação vascular na retina de um mamífero que sofre de doença retinopática. Além disso, o tratamento promove recuperação de neurónios visuais devido a efeitos neurotróficos das células. De forma benéfica, as células utilizadas de acordo com o invento incorporam-se na vasculatura da retina e diferenciam-se em células endoteliais, enquanto simultaneamente se incorporam na rede neuronal e melhoram a degeneração de células neuronais tal como as células cone da retina. As células incluem células que têm como alvo selectivo astrócitos retinianos activados quando são injectadas no olho de forma intravítrea e permanecem estavelmente incorporadas na neovasculatura e na rede neuronal do olho.

Uma vantagem específica dos tratamentos oculares aqui descritos é o efeito de salvamento vasculotrófico e neurotrófico observado nos olhos tratados de forma intravítrea com as células utilizadas de acordo com o invento. Os neurónios e os foto-receptores da retina, especialmente os cones, são conservados e pode manter-se nalguma medida a função visual em olhos tratados com as células.

Preferentemente, a retina doente a ser tratada de acordo com o invento inclui astrócitos activados. Tal pode conseguir-se por tratamento precoce do olho com as células utilizadas de acordo com o invento quando existe uma gliose associada ou por 10 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ utilização de um laser para estimular proliferação local de astrócitos activados.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS ESQUEMAS

Nos ESQUEMAS: A figura 1 representa diagramas esquemáticos de retina de ratinho em desenvolvimento. (a) Desenvolvimento de plexo primário, (b) Segunda fase de formação de vasos retinianos. GCL, camada de células de gânglios; IPL, camada do plexo interno; INL, camada nuclear interna; OPL, camada do plexo externo; ONL, camada nuclear externa; RPE, epitélio pigmentar da retina; ON, nervo óptico; P, periferia. O painel (c) representa a caracterização por citometria de fluxo das células separadas HSC Lin+ e HSC Lin“ derivadas de medula óssea. Linha superior: gráfico de pontos da distribuição de células não marcadas com anticorpo na qual RI define a área quantificável limitada com coloração PE positiva; R2 indica positiva para GFP; Linha do meio: células HSC Lin“ (C57B/6) e Linha inferior: células HSC Lin+ (C57B/6), sendo cada linha celular marcada com os anticorpos conjugados com PE para Sca-1, c-kit, Flk-l/KDR, CD31. Obteve-se dados para Tie-2 de ratinhos Tie-2-GFP. As percentagens indicam a percentagem de células marcadas positivamente de entre a população HSC Lin’ ou HSC Lin+ total. A figura 2 representa enxerto de HSC Lin“ em retina de ratinho em desenvolvimento. (a) aos quatro dias após a injecção (P6), as células HSC Lin’ eGFP+ injectadas de forma intravitrea ligam-se e diferenciam-se na retina, (b) HSC Lin“ (ratinhos B6.129S7-Gtrosa26, coradas com anticorpo β-gal) estabelecem-se à frente da vasculatura corada com anticorpo de colagénio IV (o asterisco indica a extremidade da vasculatura) . (c) A maioria das células HSC Lin+ (eGFP+) aos quatro dias após injecção (P6) foi incapaz de se diferenciar, (d) Células EC mesentéricas eGFP+ murinas quatro dias após a injecção (P6) . (e) HSC Lin’ (eGFP+) injectadas em olhos de ratinho adulto, (f) Baixa ampliação de HSC Lin’ eGFP+ (setas) dirigindo-se e diferenciando-se ao longo de um molde pré-existente de astrócitos no ratinho transgénico GFAP-GFP. (g) Maior ampliação da associação entre células Lin’ (eGFP) e o 11 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ astrócito subjacente (setas). (h) Controlo transgénico GFAP- GFP não injectado. (i) Quatro dias após injecção (P6), as HSC Lin” eGFP+ migram para a área do futuro plexo profundo e ai sofrem diferenciação. A figura da esquerda capta actividade HSC Lin” numa montagem de retina completa; a figura da direita indica a localização das células Lin” (setas) na retina (o topo é o lado do vitreo, em baixo o lado da esclera) . (j) Marcação dupla com anticorpos cx-CD31-PE e a-GFP-alexa 488 . Sete dias após a injecção, as HSC Lin” (eGFP, vermelho) injectadas foram incorporadas na vasculatura (CD31). As pontas das setas indicam as áreas incorporadas, (k) As células HSC Lin" eGFP+ formam vasos catorze dias após a injecção (P17). (1 e m) A injecção intracardiaca de rodamina-dextrano indica que os vasos estão intactos e funcionais tanto no plexo primário (I) como no plexo profundo (m). A figura 3 mostra que as células HSC Lin" eGFP+ se dirigem para gliose (indicada por astrócitos que expressam GFAP, imagem da extrema esquerda) provocada por lesões induzidas por laser (a) ou mecanicamente (b) na retina adulta (o asterisco indica o local da lesão). As imagens da extrema direita são uma ampliação maior demonstrando a forte associação entre HSC Lin- e os astrócitos. Escala = 20μΜ. A figura 4 mostra que as células HSC Lin" salvam a vasculatura da degeneração retiniana do ratinho, (a-d) Retinas aos 27 dias após injecção (P33) com coloração de colagénio IV; (a) e (b) , as retinas injectadas com células HSC Lin+ (Balb/c) não apresentaram qualquer diferença relativamente à vasculatura de ratinhos FVB normais; (c) e (d) as retinas injectadas com células HSC Lin" (Balb/c) apresentaram uma rede vascular rica análoga ao ratinho de tipo selvagem; (a) e (c) , secções congeladas de retina completa (o topo é o lado do vitreo, em baixo o lado da esclera) com coloração DAPI; (b) e (d) , plexo profundo de uma montagem de retina completa; (e) gráfico de barras ilustrativo do aumento de vasculatura do plexo vascular profundo formado em retinas injectadas com células HSC Lin” (n=6). A extensão de vascularização retiniana profunda foi quantificada por cálculo do comprimento total dos vasos presentes em cada imagem. Comparou-se o comprimento total médio de vasos/campo com potência elevada (em micra) para retinas HSC Lin”, HSC Lin+ ou de controlo, (f) Comparação 12 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ do comprimento do plexo vascular profundo após injecção com células HSC Lin" (R, olho direito) ou HSC Lin+ (L, olho esquerdo) de ratinho rd/rd. Apresentam-se os resultados de seis ratinhos independentes (cada cor representa um ratinho independente) . (g) e (h) as células HSC Lin“ (Balb/c) também salvaram a vasculatura rd/rd quando injectadas em olhos P15. Apresentam-se o plexo vascular intermédio e profundo de retinas injectadas com células HSC Lin" (G) ou HSC Lin+ (H) (um mês após a injecção). A figura 5 apresenta microfotografias de tecido retiniano de ratinho: (a) camada profunda de montagem de retina completa (ratinho rd/rd) cinco dias após injecção (Pll) com HSC Lin" eGFP+ visiveis (cinzento). (b) e (c) vasculatura retiniana P60 de ratinhos (rd/rd) Tie-2-GFP que receberam injecção de células Balb/c Lin" (b) ou células HSC Lin+ (c) a P6. Apenas se visualizam células endoteliais endógenas (coradas com GFP) nos painéis da esquerda e (b) e (c). Os painéis do meio de (b) e (c) estão corados com anticorpo CD31; as setas indicam os vasos corados com CD31 mas não com GFP, os painéis da direita de (b) e (c) apresentam coloração com GFP e com CD31. (d) coloração com α-SMA de retina injectada com HSC Lin" (painel da esquerda) e de controlo (painel da direita). A figura 6 mostra que HSC Lin" transfectadas com T2-TrpRS inibem o desenvolvimento de vasculatura retiniana de ratinho, (a) Representação esquemática de TrpRS, T2-TrpRS e T2-TrpRS humanas com uma sequência de sinalização Igk no terminal amino. (b) retinas injectadas com HSC Lin" e transfectadas com T2-TrpRS expressam proteina T2-TrpRS in vivo. (1) T2-TrpRS recombinante produzida em E. coli; (2) T2-TrpRS recombinante produzida em E. coli; (3) T2-TrpRS recombinante produzida em E. coli; (4) retina de controlo; (5) retina injectada com HSC Lin" + pSecTag2A (apenas vector); (6) retina injectada com HSC Lin" + pKLel35 (Igk-T2-TrpRS em pSecTag) . (A) TrpRS endógena. (B) T2-TrpRS recombinante. (C) T2-TrpRS de retina injectada com HSC Lin". (c-f) Plexos representativos primário (superficial) e secundário (profundo) de retinas injectadas sete dias após injecção; (c) e (d) Olhos injectados com HSC Lin" transfectadas com plasmideo vazio desenvolveram-se normalmente; (e) e (f) a maioria dos olhos injectados com HSC Lin" transfectadas com T2-TrpRS apresentaram inibição do plexo 13 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ profundo; (c) e (e) do plexo primário (superficial); (d) e (f) do plexo secundário (profundo). Os contornos ténues dos vasos observados em (f) são imagens com "efeito de borrão" dos vasos da rede primária apresentados em (e). A figura 7 apresenta a sequência de ADN que codifica T2-TrpRS com cauda His6, SEQ ID NO: 1. A figura 8 apresenta a sequência de aminoácidos de T2-TrpRS com cauda His6, SEQ ID NO:2. A figura 9 ilustra microfotografias e electro-retinogramas (ERG) de retinas de ratinhos cujos olhos foram injectados com HSC Lin” e com HSC Lin+ (controlos) . A figura 10 são representações gráficas estatísticas apresentando uma correlação entre salvamento neuronal (eixo dos yy) e salvamento vascular (eixo dos xx) para as camadas vasculares intermediária (Int.) e profunda de olhos de ratinho rd/rd tratados com HSC Lin“. A figura 11 são representações gráficas estatísticas demonstrando ausência de correlação entre salvamento neuronal (eixo dos yy) e salvamento vascular (eixo dos xx) para olhos de ratinho rd/rd tratados com HSC Lin+. A figura 12 é um gráfico de barras de comprimento vascular (eixo dos yy) em unidades arbitrárias relativas para olhos de ratinhos rd/rd tratados com HSC Lin“ (barras escuras) e olhos de ratinhos rd/rd não tratados (barras claras) aos pontos temporais de 1 mês (1M), 2 meses (2M) e 6 meses (6M) após inj ecção. A figura 13 inclui três gráficos de barras do número de núcleos na camada neuronal externa (ONR) de ratinhos rd/rd 1 mês (1M), 2 meses (2M) e 6 meses (6M) após injecção e demonstra um aumento significativo do número de núcleos para olhos tratados com HSC Lin“ (barras escuras) relativamente a olhos de controlo tratados com HSC Lin+ (barras claras). A figura 14 mostra representações gráficas do número de núcleos na camada neuronal externa para ratinhos rd/rd 14 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ individuais, comparando ο olho direito (R, tratado com HSC Lin”) relativamente ao olho esquerdo (L, olho de controlo tratado com HSC Lin+) aos pontos temporais (após injecção) de 1 mês (1M), 2 meses (2M) e 6 meses (6M); cada traçado em determinada representação gráfica compara os olhos de um ratinho especifico. A figura 15 mostra a vasculatura retiniana e as alterações de células neurais em ratinhos rdl/rdl (C3H/HeJ, painéis da esquerda) ou ratinhos de tipo selvagem (C57BL/6, painéis da direita). Apresentam-se a vasculatura retiniana dos plexos vasculares intermédio (painéis do topo) ou profundo (painéis do meio) em montagens de retina completa (vermelho: colagénio IV, verde: CD31) e secções (vermelho: DAPI, verde: CD31, painéis inferiores) das mesmas retinas (P: dia pós-natal). (GCL: camada de células de gânglios, INL: camada nuclear interna, ONL: camada nuclear exterior). A figura 16 mostra que a injecção de HSC Lin” salva de degeneração células neurais de ratinhos rdl/rdl. (A, B e C), vasculatura retiniana de plexo intermédio (Int.) ou profundo e secções de olho injectado com HSC Lin” (painéis da direita) e olho injectado com célula de controlo contralateral (CD31”) (painéis da esquerda) a P30 (A) , P60 (B) e P180 (C) . (D) , comprimento total médio de vasculatura (+ ou - erro padrão da média) em retinas injectadas com HSC Lin” ou com células de controlo (CD31”) a P30 (esquerda, n=10), P60 (meio, n=10) e P180 (direita, n=6). Apresentam-se separadamente os dados para Pl exo vascular intermédio (Int.) e profundo (eixo dos yy: comprimento relativo da vasculatura) . (E) , números médios de núcleos celulares na ONL a P30 (esquerda, n=10), P60 (meio, n=10) ou P180 (direita, n=6) de retinas injectadas com células de controlo (CD31”) ou HSC Lin” (eixo dos yy: número relativo de núcleos celulares na ONL) . (F) , Correlações lineares entre o comprimento da vasculatura (eixo dos xx) e o número de núcleos celulares na ONL (eixo dos yy) a P30 (esquerda) , P60 (meio) e P180 (direita) de retinas injectadas com HSC Lin” ou com células de controlo. A figura 17 demonstra que a função retiniana é salva por injecção de HSC Lin”. Utilizaram-se registos electro-retinográficos (ERG) para medir a função de retinas injectadas com HSC Lin” ou com células de controlo (CD31”) . (A e B), Casos representativos de retinas salvas e 15 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ não salvas 2 meses após injecção. Apresenta-se a secção da retina de olho direito injectado com HSC Lin” (A) e olho esquerdo injectado com células de controlo CD31” (B) do mesmo animal (verde: vasculatura corada com CD31, vermelho: núcleos corados com DAPI) . (C) Resultados de ERG do mesmo animal apresentado em (A) e (B). A figura 18 mostra que uma população de células de medula óssea humana pode salvar retinas em degeneração em ratinho rdl (A-C) . Também se observa salvamento noutro modelo de degeneração da retina, rdlO (D-K) . A, HSC Lin” humanas (h Lin” HSC) marcadas com corante verde podem diferenciar em células vasculares retinianas após injecção intravitrea em ratinhos C3SnSmn.CBll-Prkdc SCID. (B e C) , vasculatura retiniana (painéis da esquerda; superior: plexo intermédio, inferior: plexo profundo) e células neurais (painel da direita) em olho injectado com HSC Lin” h (B) ou olho de controlo contralateral (C) 1,5 meses após injecção. (D-K), Salvamento de ratinhos rdlO por HSC Lin” (injectadas a P6) . Apresentam-se retinas representativas a P21 (D: HSC Lin”, H: células de controlo), P30 (E: HSC Lin”, I: células de controlo), P60 (F: HSC Lin”, J: células de controlo) e P105 (G: HSC Lin”, K: células de controlo) (os olhos tratados e de controlo são do mesmo animal a cada ponto temporal). Corou-se a vasculatura da retina (a imagem superior em cada painel é o plexo intermédio; a imagem média em cada painel é o plexo profundo) com CD31 (verde) e colagénio IV (vermelho). A imagem inferior de cada painel apresenta uma secção transversal feita da mesma retina (vermelho: DAPI, verde: CD31). A figura 19 demonstra que cristalino aA é regulada positivamente em células da camada nuclear externa salvas após tratamento com HSC Lin” mas não em olhos contralaterais tratados com células de controlo. Painel esquerdo; controlo de IgG em retina salva, Painel médio; cristalino aA em retina salva, Painel da direita; cristalino aA em retina não salva. A figura 20 inclui tabelas de genes que são regulados positivamente em retinas murinas que foram tratadas com HSC Lin”. (A) Genes cuja expressão é aumentada 3 vezes em retinas de ratinho tratadas com HSC Lin” murinas. (B) Genes do cristalino que são regulados positivamente em retinas de 16 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ ratinho tratadas com HSC Lin” murinas. (C) Genes cuja expressão é aumentada 2 vezes em retinas de ratinho tratadas com HSC Lin” humanas. (D) Genes para factores neurotróficos ou factores de crescimento cuja expressão é regulada positivamente em retinas de ratinho tratadas com HSC Lin” humanas. A figura 21 ilustra a distribuição dos antigénios de superfície CD31 e integrina cx6 em populações HSC Lin” humanas positivas para CD133 (DC133+) e negativas para CD133 (CD133”) . Os painéis da esquerda mostram representações gráficas de citometria de fluxo. Os painéis central e da direita são histogramas que mostram o nível de expressão de anticorpo específico na população de células. O eixo dos yy representa o número de eventos e o eixo dos xx mostra a intensidade do sinal. Um histograma a cheio desviado para a direita do histograma traçado (controlo) representa um sinal de fluorescência aumentado e expressão do anticorpo acima do valor de linha de base. A figura 22 ilustra desenvolvimento pós-natal da retina em ratinhos C57/B16 de tipo selvagem criados em níveis de oxigénio normais (normóxia) aos dias pós-natais PO até P30. A figura 23 ilustra um modelo de retinopatia induzida pelo oxigénio em ratinhos C57/B16 criados em niveis de oxigénio elevados (hiperóxia; 75% de oxigénio) entre P7 e P12 seguido de normóxia em P12-P17. A figura 24 demonstra salvamento vascular por tratamento com as populações HSC Lin” no modelo de retinopatia induzida por oxigénio (OIR). A figura 25 mostra que os foto-receptores salvos na camada nuclear externa (ONL) de ratinho rdl após injecção intravítreo of HSC Lin” são predominantemente cones. Uma pequena percentagem dos foto-receptores na retina do ratinho de tipo selvagem (painel superior) eram cones tal como evidenciado pela expressão da opsina de cone vermelho/verde (A) enquanto a maioria das células da ONL eram positivas para rodopsina específica de bastonetes (B) . A vasculatura da retina autofluoresce com soro pré-imunitário (C) mas as camadas 17 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ nucleares foram completamente negativas para coloração com opsinas específicas de bastonetes ou de cone. As retinas de ratinho rd/rd (painéis inferiores) apresentaram uma camada nuclear interna diminuída e uma ONL quase completamente atrófica, sendo ambas negativas para opsina de cone (D) ou opsina de bastonete (painel G) . Os olhos tratados com HSC CD31” de controlo são idênticos para retinas rd/rd não injectadas, sem qualquer coloração para opsina de cone (E) ou de bastonete (H) . Os olhos contralaterais tratados com HSC Lin” apresentaram uma ONL vincadamente reduzida mas claramente presente, que é predominantemente constituída por cones, tal como evidenciado por imunorreactividade positiva para opsina de cone vermelho/verde (F). Observaram-se igualmente um pequeno número de bastonetes (I). A figura 26 mostra uma representação gráfica de caracterização de citometria de fluxo de populações de células estaminais negativas para linhagem e positivas para linhagem (representações gráficas à esquerda em cima e à esquerda em baixo, respectivamente) mostrando percentagens de células que expressam o antigénio CD44 (pontos experimentais a vermelho); assim como representações gráficas de populações de células negativas para CD31 e positivas para CD31 (representações gráficas à direita em cima e à direita em baixo, respectivamente) mostrando percentagens de células que expressam o antigénio CD44 (pontos experimentais a vermelho). A figura 27 mostra representações gráficas de caracterização de citometria de fluxo de uma população de células negativas para linhagem que expressam um nível significativo de antigénio CD44 (representações da esquerda) e uma subpopulação de células de medula óssea que não expressam um nível significativo do antigénio CD44 (representações da direita) que ilustra as percentagens relativas de células que expressam vários outros antigénios de superfície celular. A figura 28 mostra imagens de microfotografias de uma retina de ratinho injectada intravítreo com células da população de células MLBM isoladas preferidas (painel da esquerda) comparativamente com uma retina de ratinho injectada intravítreo com células CD4410. 18 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ A figura 29 mostra imagens de microfotografias de retinas de olhos injectados com células da população de células MLBM (CD44hl) e com células CD4410. A figura 30 apresenta gráficos de barras que demonstram os efeitos benéficos da população de células MLBM para melhorar a angiogénese patogénica e promover a revascularização fisiológica benéfica de retinas de ratinho no modelo de retinopatia induzida por oxigénio de retinopatia da prematuridade. O gráfico em cima compara a área de tufo neovascular pré-retiniano com retina de controlo (primeira barra), retina tratada com células CD4410 (barra do meio) e retinas tratadas com células da população de células MLBM (barra da direita) . O gráfico inferior compara a área de obliteração vascular para retina de controlo (primeira barra), retina tratada com células CD4410 (barra do meio) e retinas tratadas com células da população de células MLBM (barra da direita). A figura 31 é uma imagem de microfotografia que demonstra que assim que as células da população de células MLBM se incorporam na vasculatura da retina, as células expressam factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) tal como indicado pela coloração verde das células na parte inferior da imagem. A figura 32 mostra imagens de microfotografias que demonstram que as células da população de células MLBM CDllb+ têm como alvo selectivo a vasculatura da retina. A figura 33 mostra imagens de microfotografias que demonstram que as células de medula óssea CD44~ CDllb” não têm como alvo selectivo a vasculatura da retina. A figura 34 mostra a sequência de residuos de aminoácidos do fragmento T2 de TrpRS (SEQ ID NO: 3) e da sua variação T2-TrpRS-GD (SEQ ID NO: 4). A figura 35 mostra a sequência de resíduos de aminoácidos de mini-TrpRS (SEQ ID NO: 5). 19 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ A figura 36 mostra a sequência de resíduos de aminoácidos de Tl-TrpRS (SEQ ID NO: 6) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS A medula óssea inclui células estaminais hematopoiéticas que são capazes de se desenvolver em vários tipos de células sanguíneas e.g., células B, células T, granulócitos, plaquetas e eritrócitos. Os antigénios superficiais de linhagem são um grupo de proteínas da superfície celular que são marcadores de linhagens de células sanguíneas maduras incluindo CD2, CD3, CD11, CDlla, Mac-1 (CDllb:CD18), CD14, CD16, CD19, CD24, CD33, CD36, CD38, CD45, CD45RA, Ly-6G murinas, TER-119 murinas, CD56, CD64, CD68, CD86 (B7.2), CD66b, antigénio DR de leucócitos humanos (HLA-DR) e CD235a (glicoforina A). As células estaminais hematopoiéticas isoladas que não expressam níveis significativos de um "antigénio de superfície de linhagem" (Lin) nas suas superfícies celulares são aqui referidas como células estaminais hematopoiéticas de "linhagem negativa" ou "Lin”" i.e., HSC Lin”. As células estaminais hematopoiéticas humanas expressam geralmente outros antigénios de superfície tais como CD31, CD34, CD117 (c-kit) e/ou CD133. As células estaminais hematopoiéticas murinas expressam geralmente outros antigénios de superfície tais como CD34, CD117 (c-kit), Thy-1 e/ou Sca-1.

As células de medula óssea incluem uma subpopulação de células que expressam o antigénio CD44 (i.e., o receptor de ácido hialurónico) e CDllb (integrina aM) . Pode isolar-se de medula óssea uma população de tipo mielóide de células de medula óssea enriquecida em células que expressam CD44 e CDllb por tratamento das células de medula óssea com um anticorpo contra o antigénio CD44 (anti-CD44) e/ou um anticorpo contra o antigénio CDllb (anti-CDllb) e seguidamente seleccionar células que reagem imunologicamente com o anticorpo. 0 anticorpo pode ser então removido das células por métodos que são bem conhecidos na especialidade. As células podem ser seleccionadas, por exemplo, utilizando citometria de fluxo, utilizando anticorpos a revestir pérolas ou ligados a estas seguido por filtração ou outros métodos de separação que são bem conhecidos na especialidade. A maioria das células seleccionadas são negativas para linhagem e expressam tanto o 20 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ antigénio CD44 como ο antigénio CDllb, independentemente do anticorpo utilizado no isolamento.

As células estaminais são tipicamente identificadas pela distribuição de antigénios à superfície das células (para uma discussão detalhada consultar Stem Cells: Scientific Progress and Future Directions, um relatório efectuado pela divisão de política científica do National Institutes of Health, Junho de 2001, Apêndice E: Stem Cell Markers, que é aqui incorporado por referência na medida da sua pertinência). Aproximadamente 75% das células estaminais hematopoiéticas negativas para linhagem isoladas de medula óssea são também positivas para CD44. Numa concretização preferida, a maioria das células da população de células MLBM são células estaminais hematopoiéticas negativas para linhagem (i.e., HSC CD44+ Lin“) .

Tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, a expressão "adulta" em referência à medula óssea e a células de medula óssea inclui medula óssea isolada após o nascimento, i.e., de indivíduos jovens e adultos em contraste com embriões. Assim, a expressão "mamífero adulto" refere-se tanto a mamíferos jovens (pós-natais) como a mamíferos completamente maduros em contraste com um embrião ou um indivíduo pré-natal.

As populações HSC Lin“ contendo células progenitoras endoteliais (EPC) são particularmente úteis. As populações HSC Lin” isoladas compreendem preferentemente células mamíferas nas quais pelo menos cerca de 20% das células expressam o antigénio de superfície CD31, que está geralmente presente em células endoteliais. Noutra concretização, pelo menos cerca de 50% das células expressam CD31, mais preferentemente pelo menos cerca de 65%, com a maior preferência pelo menos cerca de 75%. Preferentemente pelo menos cerca de 50% das células de populações HSC Lin“ expressam de preferência o antigénio integrina αβ.

Numa população HSC Lin’ murina preferida, pelo menos cerca de 50% das células expressam antigénio CD31 e pelo menos cerca de 50% das células expressam o antigénio CD117 (c-kit). Preferentemente pelo menos cerca de 75% das células HSC Lin’ expressam o antigénio de superfície CD31, com maior preferência cerca de 81% das células. Noutra concretização 21 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ murina preferida, pelo menos cerca de 65% das células expressam o antigénio de superfície CD117, com maior preferência cerca de 70% das células. Uma concretização particularmente preferida é uma população de HSC Lin" na qual cerca de 50% a cerca de 85% das células expressam o antigénio de superfície CD31 e cerca de 70% a cerca de 75% das células expressam o antigénio de superfície CD117.

Numa população HSC Lin’ humana preferida as células são negativas para CD133, pelo menos cerca de 50% das células expressam o antigénio de superfície CD31 e pelo menos cerca de 50% das células expressam o antigénio integrina cx6. Ainda outra concretização preferida é a população HSC Lin’ humana na qual as células são positivas para CD133, nas quais pelo menos cerca de 30% das células expressam o antigénio de superfície CD31 e menos de cerca de 30% das células expressam o antigénio integrina cx6.

As populações HSC Lin’ isoladas têm como alvo selectivo astrócitos e incorporam-se na neovasculatura retiniana quando injectadas de modo intravítreo no olho da espécie mamífera, tal como um ratinho ou um humano, do qual as células foram isoladas.

As populações isoladas de células MLBM também têm como alvo selectivo astrócitos e incorporam-se na neovasculatura retiniana quando injectadas de modo intravítreo no olho da espécie mamífera, tal como um ratinho ou um humano, do qual as células foram isoladas.

As populações isoladas de células MLBM incluem células que se diferenciam em células endoteliais e geram estruturas vasculares no interior da retina. Nomeadamente, as populações de células MLBM são úteis para o tratamento de doenças degenerativas neovasculares retinianas e vasculares retinianas e para a reparação de lesões vasculares retinianas. As populações de células MLBM também promovem salvamento neuronal na retina e promovem regulação positiva de genes anti-apoptóticos. As populações de células MLBM são especialmente úteis para tratar defeitos retinianos nos olhos de mamíferos neonatais, tal como mamíferos que sofram de retinopatia induzida por oxigénio ou retinopatia da prematuridade. 22 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ Ο número de células injectadas no olho é suficiente para parar o estado de doença do olho. Por exemplo, a quantidade de células injectadas pode ser eficaz para reparar danos retinianos do olho, estabilizar a neovasculatura retiniana, amadurecer a neovasculatura retiniana e evitar ou reparar derrame vascular e hemorragia vascular.

Os fragmentos anti-angiogénicos (i.e., angiostáticos) de TrpRS são, e.g., os fragmentos TI e T2 de TrpRS, que se descrevem detalhadamente no pedido de patente U.S. com co-titularidade e co-pendente com o n° de série 10/080 839. As células transfectadas utilizadas de acordo com o presente invento são úteis para o tratamento de doenças retinianas envolvendo desenvolvimento vascular anómalo tal como retinopatia diabética e doenças afins. De preferência as populações de células são de células humanas.

As células transfectadas podem incluir um gene que codifique operacionalmente um agente neurotrófico tal como factor de crescimento de nervos, neurotrofina-3, neurotrofina-4, neurotrofina-5, factor neurotrófico ciliar, factor neurotrófico derivado de epitélio pigmentado retiniano, factor de crescimento do tipo insulina, factor neurotrófico derivado de linha celular glial, factor neurotrófico derivado de cérebro e semelhantes. Tais células neurotroficas são úteis para promover salvamento neuronal em doenças degenerativas neuronais retinianas tais como glaucoma e retinite pigmentosa, no tratamento de lesões dos nervos retinianos e semelhantes. Relatou-se que os implantes de factor neurotrófico ciliar são úteis para o tratamento de retinite pigmentosa (consultar Kirby et al. 2001, Mol Ther. 3(2):241-8/ Farrar et al. 2002, EMBO Journal 21:857-864). Relatou-se que o factor neurotrófico derivado de cérebro modula os genes associados a crescimento em gânglios retinianos lesionados (consultar Fournier, et al., 1997, J. Neurosci. Res. 47:561-572). Relatou-se que o factor neurotrófico derivado de linha celular glial atrasa a degeneração de foto-receptores em retinite pigmentosa (consultar McGee et al. 2001, Mol Ther. 4(6):622-9).

De preferência, pelo menos cerca de 1 x 105 células são administradas por injecção intravitreo a um olho de mamífero 23 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ que sofra de uma doença degenerativa retiniana. A quantidade de células a injectar pode depender da gravidade da degeneração retiniana, da idade do mamifero e de outros factores que serão facilmente perceptiveis pelo perito na especialidade de tratamento de doenças retinianas. As células podem ser administradas numa dose única ou por administração de doses múltiplas ao longo de um periodo de tempo, tal como determinado pelo médico assistente responsável pelo tratamento.

Resultados do modelo OIR de ROP indicam que uma vantagem particular é um efeito de salvamento vasculotrófico e neurotrófico observado em olhos tratados intravitreo com células de populações de células estaminais hematopoiéticas negativas para linhagem. Os neurónios e foto-receptores da retina, especialmente os cones, são preservados e pode manter-se alguma medida da função visual em olhos tratados com células de populações de células estaminais hematopoiéticas negativas para linhagem. 0 tratamento com inibidores da angiogénese não bloqueou os efeitos terapêuticos de populações de células estaminais hematopoiéticas negativas para linhagem. Observaram-se células do tipo macrófago conjuntamente com os vasos sanguineos salvos, sugerindo uma possivel ligação entre células imunitárias e células de medula óssea negativas para linhagem na actividade vasculotrófica das células negativas para linhagem. A injecção de anticorpos contra CD18 entre P7 e P17, para reduzir o extravasamento de macrófagos dos vasos sanguineos não bloqueou contudo os efeitos de salvamento das células estaminais hematopoiéticas negativas para linhagem.

Podem injectar-se células antes do inicio da doença ou nos seus estágios precoces para proteger a retina de danos que se produziriam de outro modo se o olho fosse deixado sem tratamento. Tal tratamento profiláctico é especialmente desejável nos casos em que se sabe que o mamifero a ser tratado está em risco de desenvolver retinopatia da prematuridade, retinopatia induzida por oxigénio ou outras doenças retinopáticas. Os tratamentos profilácticos são especialmente eficazes dado que a presença das populações de células negativas para linhagem no olho diminui de facto a gravidade dos danos vasculares da retina e pode parar a doença antes de ocorrerem danos, contrariamente à simples promoção da 24 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ recuperação após danos. Por exemplo no modelo OIR, ratinhos injectados com HSC Lin“ entre P3 e P7 antes de exposição hiperóxica sofrem menos danos retinianos e recuperam mais rapidamente do que ratinhos injectados após exposição hiperóxica. Além disso, os ratinhos que foram tratados durante exposição hiperóxica também demonstraram recuperação acelerada.

Desenvolvimento vascular da retina murina.

Modelo para angiogénese ocular. 0 olho de ratinho proporciona um modelo reconhecido para o estudo de desenvolvimento vascular da retina de mamífero tal como desenvolvimento vascular da retina humana. Durante o desenvolvimento da vasculatura retiniana murina os vasos sanguíneos retinianos dirigidos por isquemia desenvolvem-se em associação próxima com os astrócitos. Estes elementos gliais migram no feto humano de terceiro trimestre ou no roedor neonatal, para a retina a partir do disco óptico ao longo da camada celular ganglionar e espalham-se radialmente. À medida que a vasculatura retiniana murina se desenvolve, as células endoteliais utilizam este molde astrocítico já estabelecido para determinar o padrão vascular retiniano (consultar a figura 1 (a e b) ) . A figura 1 (a e b) apresenta diagramas esquemáticos de retina de ratinho em desenvolvimento. 0 painel (a) apresenta o desenvolvimento do plexo primário (linhas a escuro à esquerda em cima no diagrama) sobreposto em cima do molde de astrócitos (linhas claras) enquanto (b) representa a segunda fase da formação de vasos retinianos. Na figura 1, GCL significa camada de células ganglionares; IPL significa camada de plexo interno; INL significa camada nuclear interna; OPL significa camada de plexo externo; ONL significa camada nuclear externa; RPE significa epitélio de pigmento retiniano; ON significa nervo óptico; e P significa periferia.

No nascimento a vasculatura retiniana está virtualmente ausente. Ao dia pós-natal 14 (P14) a retina desenvolveu camadas complexas primária (superficial) e secundária (profunda) de vasos retinianos ao mesmo tempo que a visão começa. Inicialmente crescem radialmente vasos peripapilares radiais ao longo da rede de astrócitos preexistente e em direcção à periferia, tornando-se progressivamente 25 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ interligados pela formação do plexo capilar. Estes vasos crescem em monocamada no interior das fibras nervosas até PIO (figura 1 (a) ) . Entre P7-P8 começam a despontar ramificações colaterais deste plexo primário e penetram na retina para a camada plexiforme externa onde formam o plexo retiniano secundário ou profundo. A P21, toda a rede sofre uma extensa remodelação e forma-se um plexo terciário ou intermédio na superfície interna da camada nuclear interna (figura 1 (b)). 0 modelo de angiogénese retiniana de ratinho neonatal é útil para estudar o papel de HSC durante angiogénese ocular por várias razões. Neste modelo fisiologicamente relevante existe um grande molde de astrócitos antes do aparecimento de vasos sanguíneos endógenos, permitindo uma avaliação do papel do alvo célula-célula durante um processo neovascular. Além disso, sabe-se que este processo vascular retiniano neonatal consistente e reprodutível é dirigido por hipóxia, apresentando neste aspecto semelhanças com muitas doenças retinianas nas quais se sabe que a isquemia desempenha um papel.

Enriquecimento de células progenitoras endoteliais (EPC) a partir de medula óssea.

Apesar da expressão de marcadores da superfície celular ter sido extensamente analisada na população EPC presente em preparações de HSC, os marcadores que identificam EPC de forma única estão ainda mal definidos. Para enriquecer em EPC, empobreceram-se células mononucleares de medula óssea de ratinho em células positivas para marcador de linhagem hematopoiética (Lin+) , i.e., linfócitos B (CD45), linfócitos T (CD3), granulócitos (Ly-6G), monócitos (CD11) e eritrócitos (TER-119). Utilizou-se antigénio Sca-1 para enriquecer adicionalmente em EPC. Uma comparação dos resultados obtidos após injecção intravítreo de números idênticos de células Lin" Sca-1+ ou células Lin”, não detectou qualquer diferença entre os dois grupos. De facto, quando se injectaram apenas células Lin“Sca-l“, observou-se uma muito maior incorporação em vasos sanguíneos em desenvolvimento.

As populações HSC Lin" estão enriquecidas em EPC com base em ensaios funcionais. Além disso, as populações HSC Lin+ 26 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ comportam-se funcionalmente de forma bastante diferente das populações HSC Lin". Foram também avaliados os epitopos normalmente utilizados para identificar EPC para cada fracção (com base em estudos de caracterização in vitro previamente relatados). Apesar de nenhum destes marcadores estar exclusivamente associado com a fracção Lin” aumentaram todos cerca de 70 a cerca de 1800% em HSC Lin”, comparativamente com a fracção HSC Lin+ (figura 1 (c) ) . A figura 1, painel (c) ilustra a caracterização por citometria de fluxo das células separadas derivadas de medula óssea HSC Lin+ e HSC Lin”. O painel (c) da linha superior apresenta uma distribuição em gráfico de pontos de células estaminais hematopoiéticas não marcadas com anticorpo. RI define a área limitada quantificável para coloração positiva para PE; R2 indica positiva para GFP. Apresentam-se na linha do meio gráficos de pontos de HSC Lin” e apresentam-se na linha de baixo gráficos de pontos de HSC Lin+. Marcaram-se as células C57B/6 com os anticorpos para Sca-1, c-kit, Flk-l/KDR, CD31, conjugados com PE. Obtiveram-se os dados Tie-2 a partir de ratinhos Tie-2-GFP. As percentagens nos cantos das representações de pontos indicam a percentagem de células marcadas positivamente relativamente às populações HSC Lin” ou Lin+. Curiosamente, os marcadores aceites de EPC tal como Flk-l/KDR, Tie-2 e Sca-1 foram fracamente expressos e assim não puderam ser utilizados para fraccionação adicional.

Podem isolar-se HSC Lin” por (a) extracção de medula óssea de um mamifero adulto; (b) separação de vários monócitos da medula óssea; (c) marcação dos monócitos com anticorpos de painel de linhagem conjugados com biotina contra um ou mais antigénios de superfície de linhagem, preferentemente antigénios de superfície de linhagem seleccionados do grupo que consiste de CD2, CD3, CD4, CD11, CDlla, Mac-1, CD 14, CD16, CD19, CD2 4, CD33, CD36, CD38, CD45, Ly-6G (murino), TER-119 (murino), CD45RA, CD56, CD64, CD68, CD86 (B7.2), CD66b, antigénio de leucócitos humanos DR (HLA-DR) e CD235a (glicoforina A) ; (d) remoção de monócitos que são positivos para os referidos um ou mais antigénios de superfície de linhagem dos vários monócitos; e (e) recuperação da sua população de células estaminais hematopoiéticas negativas para linhagem. 27 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Quando se isolam HSC Lin- de medula óssea de humano adulto, marcam-se preferentemente os monócitos com anticorpos de painel de linhagem conjugados com biotina contra antigénios de superfície CD2, CD3, CD4, CDlla, Mac-1, CD14, CD16, CD19, CD33, CD38, CD45RA, CD64, CD68, CD86 (B7.2) e CD235a. Quando se isolam HSC Lin“ de medula óssea de murino adulto marcam-se preferentemente os monócitos com anticorpos de painel de linhagem conjugados com biotina contra antigénios de superfície CD3, CD11, CD45, Ly-6G, e TER-119.

As células HSC Lin- injectadas intravitreo contêm EPC que têm como alvo astrócitos e que se incorporam na vasculatura da retina em desenvolvimento. A fim de determinar se células HSC Lin- injectadas intravitreo podem ter como alvo tipos específicos de células da retina, utilizar o molde de astrócitos e participar em angiogénese retiniana, injectaram-se aproximadamente 105 células de uma composição HSC Lin- ou células HSC Lin+ (controlo, cerca de 105 células) isoladas da medula óssea de ratinhos adultos (GFP ou transgénicos LacZ) em olhos de ratinho pós-natal de dia 2 (P2) . Quatro dias após a injecção (P 6), muitas células da composição HSC Lin- derivadas de ratinhos transgénicos GFP ou LacZ estavam aderentes à retina e tinham a aparência alongada característica das células endoteliais (figura 2 (a) ) . A figura 2 ilustra o enxerto de células Lin- na retina de ratinho em desenvolvimento. Tal como apresentado na figura 2, painel (a), quatro dias após injecção (P6) HSC Lin- eGFP+ injectadas intravitreo, ligam-se à retina e diferenciam-se nesta.

Em muitas regiões das retinas as células que expressam GFP encontram-se organizadas num padrão em conformidade com astrócitos subjacentes e semelhante a vasos sanguíneos. Estas células fluorescentes observaram-se à frente da rede vascular endógena em desenvolvimento (figura 2 (b)). Contrariamente, apenas se observou um pequeno número de HSC Lin+ (figura 2 (c) ) ou de células endoteliais mesentéricas de ratinho adulto (figura 2 (d)) ligadas à superfície retiniana. De modo a determinar se células de uma população injectada com HSC Lin-se poderiam também ligar a retinas com vasos já estabelecidos, injectou-se uma composição HSC Lin- em olhos adultos. Foi 28 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ interessante constatar ausência de observação de células ligadas a retina ou incorporadas em vasos sanguíneos retinianos estabelecidos normais (figura 2 (e)). Tal indica que as composições HSC Lin“ não prejudicam uma vasculatura que se desenvolveu normalmente e não iniciarão vascularização anómala em retinas que se desenvolveram normalmente. A fim de determinar a relação entre composições HSC Lin“ injectadas e astrócitos retinianos, utilizou-se um ratinho transgénico que expressa proteína glial fibrilar ácida (GFAP, um marcador de astrócitos) e proteína fluorescente verde (GFP) dirigida por promotor. A análise de retinas destes ratinhos transgénicos GFAP-GFP injectadas com HSC Lin” de ratinhos transgénicos eGFP demonstrou co-localização das EPC eGFP injectadas e astrócitos existentes (figura 2 (f-h), setas).

Observaram-se processos de HSC Lin" eGFP+ em conformidade com a rede de astrócitos subjacente (setas, figura 2 (g) ) . A análise desses olhos demonstrou que as células marcadas injectadas apenas se ligaram a astrócitos; em retinas de ratinho P6, nas quais a periferia retiniana ainda não apresenta vasos endógenos, observaram-se células injectadas aderentes a astrócitos nessas áreas ainda não vascularizadas. Surpreendentemente observaram-se células marcadas injectadas nas camadas mais profundas da retina na localização exacta na qual se desenvolverão subsequentemente vasos retinianos normais (figura 2 (i), setas). A fim de determinar se HSC Lin" injectadas eram incorporadas de forma estável na vasculatura retiniana em desenvolvimento, analisaram-se vasos retinianos a diferentes pontos temporais posteriores. Logo a P9 (sete dias após injecção), HSC Lin- incorporaram-se em estruturas CD31+ (figura 2 (j)) . A P16 (14 dias após injecção), as células estavam já extensamente incorporadas em estruturas retinianas do tipo vascular (figura 2 (k) ) . Quando se injectou rodamina- dextrano intravascularmente (para identificar vasos sanguíneos retinianos funcionais) antes de sacrificar os animais, a maioria das HSC Lin" estavam alinhadas com vasos patentes (figura 2 (1)). Observaram-se dois padrões de distribuições celulares marcadas: (1) num padrão, as células estavam intercaladas ao longo dos vasos com células endoteliais não marcadas; e (2) o outro padrão mostrou que os vasos eram 29 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ compostos inteiramente de células marcadas. As células injectadas foram também incorporadas nos vasos do plexo vascular profundo (figura 2 (m) ) . Apesar da incorporação esporádica de EPC derivadas de HSC Lin” na neovasculatura ter sido anteriormente descrita, este é o primeiro relato que menciona que as redes vasculares são inteiramente compostas destas células. Tal demonstra que células de uma população de HSC Lin” derivadas de medula óssea injectadas intravitreo, podem incorporar-se eficazmente em qualquer camada do plexo vascular retiniano em formação. 0 exame histológico de tecidos não retinianos (e.g., cérebro, figado, coração, pulmão, medula óssea) não demonstrou a presença de quaisquer células positivas para GFP quando estes foram analisados 5 ou 10 dias após injecção intravitreo. Tal indica que uma subpopulação de células no interior da fracção HSC Lin” tem como alvo selectivo astrócitos retinianos e incorpora-se de forma estável na vasculatura retiniana em desenvolvimento. Dado que estas células têm muitas caracteristicas de células endoteliais (associação com astrócitos retinianos, morfologia alongada, incorporação estável em vasos patentes e ausência em localizações extravasculares) estas células representam EPC presentes na população HSC Lin”. Os astrócitos alvo são do mesmo tipo observado em muitas das retinopatias de hipóxia. É bem conhecido que as células gliais são uma componente principal de aglomerados frondosos de tufos neovasculares observados em DR e outras formas de lesão retiniana. Em condições de gliose reactiva e neovascularização induzida por isquemia, os astrócitos activados proliferam, produzem citoquinas e regulam GFAP positivamente de forma semelhante à observada durante a formação de molde vascular retiniano neonatal em muitas espécies de mamíferos incluindo humanos.

As populações HSC Lin” terão como alvo astrócitos activados em olhos de ratinho adulto assim como em olhos neonatais, injectaram-se células HSC Lin” em olhos adultos com retinas lesionadas por fotocoagulação (figura 3 (a) ) ou pela ponta de uma agulha (figura 3 (b) ) . Em ambos os modelos, observou-se uma população de células com coloração GFAP prominente apenas à volta do local da lesão (figura 3 (a e b) ) . As células de composições HSC Lin” injectadas 30 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ localizaram-se no local da lesão e permaneceram especificamente associadas com astrócitos positivos para GFAP (figura 3 (a e b) ) . Nestes locais, observou-se igualmente a migração de células HSC Lin” para a camada mais profunda da retina a um nivel semelhante ao observado durante formação neonatal da vasculatura retiniana profunda. As partes não lesionadas da retina não continham quaisquer células HSC Lin”, de forma idêntica ao observado quando se injectaram HSC Lin” em retinas adultas normais e não lesionadas (figura 2 (e)).

Estes dados indicam que composições HSC Lin” podem ter como alvo selectivo células gliais activadas em retinas adultas lesionadas com gliose assim como em retinas neonatais em processo de vascularização. HSC Lin” injectadas intravitreo podem salvar e estabilizar vasculatura em degeneração.

Dado que as composições de HSC Lin” injectadas intravitreo têm como alvo astrócitos e incorporam-se na vasculatura retiniana, estas células também estabilizam a vasculatura em degeneração em doenças retinianas isquémicas ou degenerativas associadas a gliose e degeneração vascular. O ratinho rd/rd é um modelo para degeneração retiniana que apresenta degeneração profunda do foto-receptor e camadas vasculares retinianas um mês após o nascimento. A vasculatura retiniana nestes ratinhos desenvolve-se normalmente até PI 6, altura em que o plexo vascular profundo entra em regressão; na maioria dos ratinhos os plexos profundo e intermédio degeneraram quase completamente em P30.

Para determinar se HSC podem salvar os vasos em regressão, in j ectaram-se HSC Lin+ ou HSC Lin” (de ratinhos Balb/c) em ratinhos rd/rd intravitreo em P6. Em P33, após injecção com células Lin+, os vasos da camada retiniana mais profunda estavam quase completamente ausentes (figura 4 (a e b) ) . Contrariamente, a maioria das retinas injectadas com HSC Lin” em P33 tinham uma vasculatura retiniana quase normal com três camadas vasculares paralelas bem formadas (figura 4 (a e d) ) . A quantificação deste efeito demonstrou que o comprimento médio dos vasos no plexo vascular profundo em olhos rd/rd injectados com Lin” era quase três vezes maior do que o dos olhos não tratados ou tratados com células Lin+ (figura 4 31 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ (e)) . Surpreendentemente, a injecção de uma composição HSC Lin” derivada de medula óssea de ratinho adulto rd/rd (FVB/N) também salvou a vasculatura retiniana em degeneração de ratinho rd/rd neonatal (figura 4 (f)). A degeneração da vasculatura em olhos de ratinho rd/rd observa-se logo às 2-3 semanas pós-natal. A injecção de HSC Lin” mesmo tardiamente em P15 também resultou em estabilização parcial da vasculatura em degeneração nos ratinhos rd/rd durante pelo menos um mês (figura 4 (g e h)).

Uma composição HSC Lin” injectada em ratinhos rd/rd mais novos (e.g., P2) também se incorporou na vasculatura superficial em desenvolvimento. Em Pll, verificou-se que estas células migram para o nivel do plexo vascular profundo e formam um padrão idêntico ao verificado na camada vascular externa de tipo selvagem (figura 5 (a) ) . De modo a descrever mais claramente a forma pela qual as células das composições HSC Lin” injectadas se incorporam e estabilizam a vasculatura retiniana em degeneração nos ratinhos rd/rd, injectou-se uma composição HSC Lin” derivada de ratinhos Balb/c nos olhos de ratinhos Tie-2-GFP FVB. Os ratinhos FVB têm genótipo rd/rd e, dado que expressam a proteína de fusão Tie-2-GFP, todos os vasos sanguíneos endógenos são fluorescentes.

Quando se injectam células não marcadas de uma composição HSC Lin” em olhos Tie-2-GFP FVB neonatais e são subsequentemente incorporadas na vasculatura em desenvolvimento, devem existir falhas não marcadas nos vasos endógenos marcados com Tie-2-GFP que correspondem a HSC Lin” não marcadas incorporadas que foram injectadas. A coloração subsequente com outro marcador vascular (e.g., CD-31) delineia assim o vaso completo permitindo determinar se as células endoteliais não endógenas fazem parte da vasculatura. Dois meses após injecção, observaram-se vasos positivos para CD31 e negativos para Tie-2-GFP nas retinas de olhos injectados com composição HSC Lin” (figura 5 (b) ) . Curiosamente, a maioria dos vasos salvos continha células positivas para Tie-2-GFP (figura 5 (c) ) . A distribuição de pericitos, tal como determinada por coloração para actina de músculo-liso, não se alterou com a injecção de HSC Lin”, independentemente de ocorrer salvamento vascular (figura 5 (d)). Estes dados demonstram claramente que as células HSC Lin- injectadas 32 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ intravítreo migram para a retina, participam na formação de vasos sanguíneos retinianos normais e estabilizam a vasculatura em degeneração endógena num ratinho deficiente geneticamente.

Inibição de angiogénese de retina por células transfectadas de HSC Lin”. A maioria das doenças vasculares retinianas envolve proliferação vascular anómala em vez de degeneração. Podem utilizar-se células transgénicas que têm como alvo astrócitos para entregar uma proteína anti-angiogénica e inibir angiogénese. Transfectaram-se células de composições HSC Lin” com T2-triptofanil-ARNt sintetase (T2-TrpRS). T2-TrpRS é um fragmento de 43 kD de TrpRS que inibe potentemente a angiogénese retiniana (figura 6 (a) e figura 34) . Em P12, as retinas de olhos injectados com uma composição HSC Lin” transfectada com plasmídeo de controlo (sem o gene T2-TrpRS) em P2 tinham plexos vasculares retinianos primários (figura 6 (c) ) e secundários (figura 6 (d)) normais. Quando se injectou a composição HSC Lin” transfectada com T2-TrpRS em olhos em P2 e se avaliaram 10 dias mais tarde, a rede primária não tinha anomalias significativas (figura 6 (e)) e a formação da vasculatura retiniana profunda tinha sido quase completamente inibida (figura 6 (f) ) . Os poucos vasos observados nestes olhos estavam acentuadamente atenuados com grandes falhas entre vasos. A extensão de inibição por HSC Lin” que excretam T2-TrpRS apresenta-se detalhadamente na tabela 1. T2-TrpRS é produzida e excretada por células na composição HSC Lin” in vitro e, após injecção destas células transfectadas no vítreo, observa-se um fragmento de 30 kD de T2-TrpRS na retina (figura 6 (b)). Este fragmento de 30 kD foi observado especificamente apenas em retinas injectadas com HSC Lin” transfectadas e esta diminuição do peso molecular aparente comparativamente à proteína recombinante ou sintetizada in vitro pode ser devida a processamento ou degradação da T2-TrpRS in vivo. Estes dados indicam que as composições HSC Lin” podem ser utilizadas para entregar à vasculatura retiniana genes activos funcionalmente, tais como genes que expressam moléculas angiostáticas, devido a terem como alvo astrócitos activados. Embora seja possível que o 33 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ efeito angiostático observado seja devido a actividade mediada por célula, tal é muito pouco provável dado que os olhos tratados com composições de HSC Lin” idênticas, mas não transfectadas com T2, tinham vasculatura retiniana normal.

Tabela 1. Inibição vascular por HSC Lin” que excretam T2-TrpRS

Plexo primário Plexo profundo Inibido Normal Completo Parcial Normal T2-TrpRS 60% 40% 33,3% 60% 6,7% (15 olhos) (9 olhos) (6 olhos) (5 olhos) (9 olhos) (1 olho) Controlo 0% 100% 0% 38,5% 61,5% (13 olhos) (0 olhos) (13 olhos) (0 olhos) (5 olhos) (8 olhos)

As populações HSC Lin” injectadas intravítreo localizam-se em astrócitos retinianos, incorporam-se nos vasos e podem ser úteis para tratar muitas doenças retinianas. Embora a maioria das células das composições HSC injectadas adiram ao molde astrocitico, uma pequena quantidade migra para a retina profunda, alojando-se em regiões onde se desenvolverá subsequentemente a rede vascular profunda. Embora não sejam detectados astrócitos positivos para GFAP nesta área antes dos 42 dias pós-natal, tal não elimina a possibilidade das células gliais negativas para GFAP estarem já presentes para proporcionarem um sinal para localização de HSC Lin”. Estudos anteriores demonstraram que muitas doenças estão associadas a gliose reactiva. Em particular, em DR as células gliais e as suas matrizes extracelulares estão associadas a angiogénese patológica.

Dado que as células das composições injectadas de HSC Lin” aderem especificamente a células gliais que expressam GFAP, independentemente do tipo de lesão, as composições HSC Lin” podem ser utilizadas para terem como alvo lesões pré-angiogénicas na retina. Por exemplo, nas retinopatias isquémicas, tais como diabetes, a neovascularização é uma resposta a hipóxia. Dirigindo as composições de HSC Lin” a alvos que são locais de neovascularização patológica, pode estabilizar-se a neovasculatura em desenvolvimento, evitando anomalias da neovasculatura tais como hemorragia ou edema (as causas de perda de visão associadas a DR) e potencialmente 34 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ podem aliviar a hipóxia que estimulou originalmente a neovascularização. Os vasos sanguíneos anómalos podem retornar à sua condição normal. Além disso, podem entregar-se proteínas angiostáticas, tais como T2-TrpRS (SEQ ID NO: 3 na figura 34), T2-TrpRS-GD (SEQ ID NO: 4 na figura 34), mini-TrpRS (SEQ ID NO: 5 na figura 35) e Tl-TrpRS (SEQ ID NO: 6 na figura 36) a locais de angiogénese patológica utilizando composições de HSC Lin“ transfectadas e activação de astrócitos induzida por laser. Os fragmentos angiostáticos preferidos de TrpRS incluem T2-TrpRS e T2-TrpRS-GD. Dado que a fotocoagulação por laser é utilizada vulgarmente em oftalmologia clínica, esta abordagem tem aplicação em muitas doenças retinianas. Embora tais abordagens baseadas em células tenham sido exploradas em terapia de cancro, a sua utilização em doenças oculares é mais vantajosa, dado que a injecção intra-ocular possibilita a entrega de números elevados de células directamente ao local da doença.

Salvamento neurotrófico e vasculotrófico por HSC Lin”.

Utilizou-se MACS para separar HSC Lin’ de medula óssea de ratinhos com proteína verde fluorescente melhorada (eGFP), C3H {rd/rd), FVB {rd/rd), tal como descrito anteriormente. Injectaram-se intravítreo HSC Lin“ contendo EPC destes ratinhos em olhos de ratinhos C3H ou FVB em P6. Recolheram-se as retinas em vários pontos temporais (1 mês, 2 meses e 6 meses) após injecção. Analisou-se a vasculatura por microscopia confocal por varrimento de laser após coloração com anticorpos para CD31 e por histologia retiniana após coloração nuclear com DAPI. Também se utilizou análise de expressão génica em micromatriz de ARNm de retinas em vários pontos temporais para identificar genes potencialmente envolvidos no efeito.

Os olhos de ratinhos rd/rd apresentavam degeneração profunda tanto da retina neuro-sensorial, como da vasculatura retiniana em P21. Os olhos de ratinhos rd/rd tratados com HSC Lin“ em P6 mantiveram uma vasculatura retiniana normal durante pelo menos 6 meses; tanto a camada profunda, como a camada intermédia apresentaram melhoras significativas comparativamente aos controlos em todos os pontos temporais (1M, 2M e 6M) (consultar figura 12) . Além disso, verificámos 35 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ que as retinas tratadas com HSC Lin" também eram mais espessas (1M; 1,2 vezes, 2M; 1,3 vezes, 6M; 1,4 vezes) e apresentavam um maior número de células na camada nuclear externa (1M; 2,2 vezes, 2M; 3,7 vezes, 6M; 5,7 vezes) relativamente a olhos tratados com HSC Lin+ como um controlo. A análise genómica em grande escala de retinas rd/rd "salvas" (e.g., HSC Lin") comparativamente ao controlo (não tratadas ou tratadas mas não com Lin-) demonstrou uma regulação positiva significativa de genes que codificam sHSP (proteínas de choque térmicas pequenas) e factores de crescimento específicos que se correlacionaram com salvamento vascular e neural, incluindo genes que codificam as proteínas apresentadas na figura 20, painéis A e B. A medula óssea derivada de populações HSC Lin" induziu manutenção de uma vasculatura normal significativa e reprodutivelmente e aumentou drasticamente a camada de foto-receptor e outras camadas de células neuronais no ratinho rd/rd. Este efeito de salvamento neurotrófico correlacionou com uma regulação positiva significativa de proteínas de choque térmicas pequenas e de factores de crescimento e proporciona evidências para abordagens terapêuticas para as doenças degenerativas retinianas que não são tratáveis actualmente.

As retinas de ratinhos rdl/rdl apresentam degeneração vascular e neuronal profunda. O desenvolvimento normal pós-natal vascular retiniano e neuronal em ratinhos foi descrito detalhadamente e é análogo às alterações verificadas no terceiro trimestre no feto humano (Dorrell et al., 2002, Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 43:3500-3510) . Os ratinhos homozigóticos para o gene rdl partilham muitas características da degeneração retiniana humana (Frasson et al., 1999, Nat. Med. 5:1183-1187) e apresentam perda rápida de foto-receptor (PR) acompanhada por atrofia vascular grave, em resultado de uma mutação no gene que codifica cGMP fosfodiesterase de PR (Bowes et al. 1990, Nature 347:677-680). Para analisar a vasculatura durante o desenvolvimento retiniano e a sua degeneração subsequente, utilizaram-se anticorpos contra colagénio IV (CIV), uma proteína de matriz extracelular (ECM) de vasculatura madura, e 36 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ CD31 (PECAM-1), um marcador para células endoteliais (figura 15) . As retinas de rdl/rdl (C3H/HeJ) desenvolveram-se normalmente até aproximadamente o dia 8 pós-natal (P) 8, quando iniciou a degeneração da camada nuclear externa (ONL) contendo o foto-receptor. A ONL degenerou rapidamente e as células morreram por apoptose, de modo que apenas permaneceu uma única camada de núcleos em P20. A coloração dupla de retinas inteiras montadas com anticorpos para CIV e CD31 revelou detalhes da degeneração vascular em ratinhos rdl/rdl semelhante à descrita por outros (Blanks et al., 1986, J Comp. Neurol. 254:543-553). As camadas vasculares retinianas primária e profunda pareceram desenvolver-se normalmente até P12, após o qual ocorre uma perda rápida de células endoteliais, tal como evidenciado pela ausência de coloração com CD31. Encontravam-se presentes células endoteliais positivas para CD31 numa distribuição normal até P12, mas seguidamente desapareceram rapidamente. Curiosamente, a coloração positiva para CIV permaneceu presente ao longo dos pontos temporais analisados, sugerindo que os vasos e ECM associada formaram-se normalmente, mas após P13 apenas permaneceu a matriz, já que não se detectaram quaisquer células positivas para CD31 (figura 15, painéis do meio). 0 plexo vascular intermédio também degenera após P21, mas a progressão é mais lenta do que a verificada no plexo profundo (figura 15, painel superior). Apresentam-se as camadas de células vasculares retinianas e neurais de um ratinho normal para comparação com o ratinho rdl/rdl (painéis da direita, figura 15).

Efeito neuroprotector de HSC Lin“ derivadas de medula óssea em ratinhos rdl/rdl.

As HSC Lin“ injectadas intravitreo incorporam-se na vasculatura retiniana endógena em todos os três plexos vasculares e evitam a degeneração dos vasos. Curiosamente, virtualmente nunca se detectam as células injectadas na camada nuclear externa. Estas células incorporam-se nos vasos retinianos em formação ou detectam-se em zonas muito próximas desses vasos. Injectaram-se intravitreo HSC Lin” murinas (de C3H/HeJ) em olhos de ratinhos C3H/HeJ (rdl/rdl) em P6, imediatamente antes do inicio da degeneração. Em P30, os olhos injectados com células de controlo (CD31“) apresentaram o 37 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ fenótipo rdl/rdl típico, i.e., degeneração praticamente completa do plexo vascular profundo e detectaram-se ONL em todas as retinas analisadas. Os olhos injectados com HSC Lin” mantiveram plexos vasculares intermédios e profundos com aspecto normal. Surpreendentemente, verificaram-se significativamente mais células na camada internuclear (INL) e ONL de olhos injectados com HSC Lin” do que em olhos injectados com células de controlo (figura 16 (A)). Este efeito de salvamento de HSC Lin” pode ser observado aos 2 meses (figura 16 (B) ) e até 6 meses após injecção (figura 16 (C)). As diferenças na vasculatura dos plexos intermédio e profundo de olhos injectados com HSC Lin”, bem como das células neuronais contendo INL e ONL, foram significativas em todos os pontos temporais medidos quando se compararam olhos salvos e olhos não salvos (figura 16 (Be C) ) . Este efeito foi quantificado por medição do comprimento total da vasculatura (figura 16 (D) ) e contando o número de núcleos de células positivos para DAPI verificadas na ONL (figura 16 (E)). Aplicou-se uma análise de regressão linear simples aos dados em todos os pontos temporais.

Verificou-se uma correlação estatisticamente significativa entre salvamento vascular e salvamento neuronal (e.g., espessura de ONL) a P30 (p <0,024) e P60 (p <0,034) nos olhos injectados com HSC Lin” (figura 16 (F) ) . A correlação permaneceu elevada, embora não significativa estatisticamente (p< 0,14) a P180 quando se compararam retinas injectadas com HSC Lin” com retinas injectadas com células de controlo (figura 16 (F) ) . Contrariamente, as retinas injectadas com células de controlo não apresentaram qualquer correlação significativa entre a conservação da vasculatura e ONL em qualquer ponto temporal (figura 16 (F)). Estes dados demonstram que a injecção intravítreo de HSC Lin” resulta em salvamento vascular retiniano e neuronal concomitante em retinas de ratinhos rdl/rdl. Não se observaram células injectadas na ONL ou em qualquer local salvo no interior dos vasos sanguineos retinianos ou nas suas vizinhanças próximas.

Salvamento funcional de retinas rd/rd injectadas com HSC Lin”.

Efectuaram-se electro-retinogramas (ERG) em ratinhos, 2 meses após injecção de células de controlo ou HSC Lin” 38 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ murinas (figura 17). Efectuou-se análise imuno-histoquimica e microscópica a cada olho após registo do ERG para confirmar que tinha ocorrido salvamento vascular e neuronal. Os registos de ERG representativos de olhos tratados, salvos e de controlo, não salvos, mostram que nos olhos salvos, o sinal subtraído digitalmente (olhos tratados menos não tratados) produziu um sinal claramente detectável com uma amplitude da ordem de 8-10 microvolts (figura 17). Nitidamente, os sinais de ambos os olhos são gravemente anómalos. No entanto, conseguiram-se registar ERG consistentes e detectáveis a partir dos olhos tratados com HSC Lin”. Em todos os casos, o ERG do olho de controlo não foi detectável. As amplitudes dos sinais em olhos salvos foram consideravelmente inferiores à normal, mas observaram-se consistentemente sinais sempre que ocorreu salvamento histológico e foram da ordem de grandeza de estudos de salvamento baseados em genes, relatados por outros. Globalmente, estes resultados demonstram algum grau de salvamento funcional nos olhos tratados com HSC Lin”.

Os tipos de células retinianas rd/rd salvas são predominantemente cones.

Analisaram-se imuno-histoquimicamente retinas salvas e não salvas com anticorpos específicos para opsina de bastonetes ou de cones. Analisaram-se os mesmos olhos utilizados para os registos de ERG apresentados na figura 17 para opsina de bastonete ou de cone. Em retinas de ratinho de tipo selvagem, menos do que cerca de 5% dos f oto-receptores presentes são cones (Soucy et al. 1998, Neuron 21: 481-493) e os padrões de coloração imuno-histoquimica observados para opsina de cone vermelho/verde, tal como apresentado na figura 25 (A), ou para rodopsina de bastonete, tal como apresentado na figura 25 (B), são consistentes com esta percentagem de células de cone. Quando se coraram retinas de tipo selvagem com IgG pré-imunitário, não se verificou qualquer coloração em nenhuma parte das retinas neuro-sensoriais, excepto a auto-fluorescência dos vasos sanguíneos (figura 25 (C)). Dois meses após nascimento, as retinas de ratinhos rd/rd não injectadas tinham essencialmente uma camada nuclear externa atrófica que não apresenta qualquer coloração com anticorpos para opsina de cone vermelho verde (figura 25 (D)) ou rodopsina (figura 25 (G) ) . Os olhos injectados com controlo, HSC CD31” 39 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ também não coraram positivamente para a presença de opsina de cone (figura 25 (E))) ou bastonete (figura 25 (H)).

Contrariamente, olhos contralaterais injectados com HSC Lin” tinham cerca de 3 a cerca de 8 linhas de núcleos numa camada nuclear externa preservada; a maioria destas células foram positivas para opsina de cone (figura 25 (F) ) com aproximadamente 1-3% positivas para opsina de bastonete (figura 25 (I)). Notavelmente, tal é praticamente o inverso do que é usualmente verificado na retina normal de ratinho, que é dominada por bastonetes. Estes dados demonstram que a injecção de HSC Lin” conserva cones durante períodos de tempo longos durante os quais normalmente degenerariam. HSC Lin” derivadas de medula óssea humana (hBM) também salvaram retinas em degeneração. HSC Lin” isoladas de medula óssea humana comportam-se de modo semelhante a HSC Lin” murinas. Recolheu-se medula óssea de dadores humanos e extraíram-se HSC Lin+, produzindo uma população de HSC Lin” humanas (hHSC Lin”) . Estas células foram marcadas ex-vivo com corante fluorescente e injectadas em olhos de ratinhos C3SnSmn.CBll-Prkdc SCID. As hHSC Lin” injectadas migraram e tiveram como alvo locais de angiogénese retiniana de um modo idêntico ao verificado quando se injectaram HSC Lin” murinas (figura 18 (A)). Além de terem como alvo a parte vascular, as HSC Lin” humanas também proporcionaram um efeito de salvamento robusto nas camadas celulares vascular e neuronal dos ratinhos rdl/rdl (figura 18 (B e C) ) . Esta observação confirma a presença de células na medula óssea humana que têm como alvo a vasculatura retiniana e que podem prevenir a degeneração retiniana. HSC Lin” têm efeitos vasculares e neurotróficos nos ratinhos rdl0/rdl0. 0 ratinho rdl/rdl é o modelo mais vastamente utilizado e melhor caracterizado para degeneração retiniana (Chang et al. 2002, Vision Res. 42:517-525), mas a degeneração é muito rápida e neste facto é diferente da evolução usual mais lenta observada na doença humana. Nesta estirpe, a degeneração de células foto-receptoras inicia-se à volta de P8, uma altura em que a vasculatura retiniana ainda está em expansão rápida 40 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ (figura 15) . A degeneração subsequente da vasculatura retiniana profunda ocorre ainda quando o plexo intermédio está em formação e assim as retinas de ratinhos rdl/rdl nunca se desenvolvem completamente, contrariamente ao verificado na maioria dos humanos com esta doença. Utilizou-se um modelo de ratinho rdlO, que tem um decurso de degeneração mais lento e se assemelha mais à doença degenerativa retiniana humana, para investigar salvamento vascular mediado por HSC Lin”. No ratinho rdlO, a degeneração das células de foto-receptor inicia-se cerca de P21 e a degeneração vascular tem inicio pouco tempo depois.

Dado que o desenvolvimento neuro-sensorial retiniano normal está praticamente completo em P21, verifica-se que a degeneração tem inicio após finalização da diferenciação da retina e deste modo é mais semelhante à degeneração retiniana humana do que o modelo de ratinho rdl/rdl. Injectaram-se HSC Lin” ou células de controlo de ratinhos rdlO em olhos em P6 e avaliaram-se as retinas em vários pontos temporais. Em P21, as retinas de olhos injectados com HSC Lin” e com células de controlo pareciam normais com desenvolvimento completo de todas as camadas vasculares e desenvolvimento normal da INL e ONL (figura 18 (D e H)). Aproximadamente a P21 começou degeneração retiniana que progrediu com a idade. A P30, as retinas injectadas com células de controlo apresentavam degeneração vascular e neuronal grave (figura 18 (I)), enquanto as retinas injectadas com HSC Lin" mantinham camadas vasculares e células foto-receptores praticamente normais (figura 18 (E) ) . A diferença entre os olhos salvos e não salvos foi mais pronunciada nos pontos temporais posteriores (comparar a figura 18 (F e G) com 18 (J e K) ) . Nos olhos tratados de controlo, verificou-se claramente a progressão da degeneração vascular por coloração imuno-histoquímica para CD31 e colagénio IV (figura 18 (I-K)) . Os olhos tratados de controlo foram praticamente completamente negativos para CD31, enquanto permaneciam evidentes "rastros" vasculares positivos para colagénio IV, indicando que tinha ocorrido regressão vascular e não formação vascular incompleta. Contrariamente, os olhos tratados com HSC Lin” apresentavam vasos positivos para CD31 e para colagénio IV que pareciam muito semelhantes aos olhos normais de tipo selvagem (comparar figura 18 (F e I) ) · 41 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Análise de expressão génica de retinas de ratinho rd/rd após tratamento com HSC Lin“.

Utilizou-se genómica em larga escala (análise de micromatriz) para analisar retinas salvas e não salvas para identificar possíveis mediadores de salvamento neurotrófico. A expressão génica em retinas de ratinho rdl/rdl tratadas com HSC Lin“ foi comparada com retinas não injectadas, bem como com retinas injectadas com células de controlo (CD31~) . Estas comparações foram todas feitas em triplicado. Para serem considerados presentes, exigiu-se que os genes tivessem niveis de expressão pelo menos 2 vezes superiores aos niveis de base em todos as três réplicas. Os genes que estavam regulados positivamente 3 vezes em retinas protegidas com HSC Lin" comparativamente a retinas de ratinho rd/rd injectadas com células de controlo e não injectadas apresentam-se na figura 20, painéis A e B. Calcularam-se os niveis do coeficiente de variância (COV) para os genes expressos por divisão do desvio padrão pelo nivel de expressão médio de cada réplica de ARNc. Além disso, calculou-se a correlação entre os niveis de expressão e a variância do ruido por correlação da média e do desvio padrão (DP) . Obteve-se uma correlação entre o nivel de expressão génica e o desvio padrão para cada gene, permitindo a determinação de niveis de ruido e de limiares fiáveis de nivel de expressão. Globalmente, os dados encontravam-se dentro de limites aceitáveis (Tu et al. 2002, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99: 14031-14036). Os genes que são discutidos individualmente em seguida apresentam niveis de expressão acima destes niveis de expressão criticos. Também se determinaram valores de "teste t" emparelhados para os genes discutidos. Em todos os casos, os valores de p são razoáveis (próximos ou inferiores a 0,05), o que demonstra a semelhança entre as réplicas e as prováveis diferenças significativas entre os diferentes grupos de ensaio. Muitos dos genes significativamente regulados positivamente, incluindo MAD e Ying Yang-1 (YY-1) (Austen et al. 1997, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 224: 123-130), codificam proteinas que funcionam envolvendo a protecção de células relativamente a apoptose. Vários genes de cristalino, que apresentam homologia de sequência e funções semelhantes a proteinas de choque térmico conhecidas envolvidas na protecção de células contra stress, 42 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ também foram regulados positivamente por tratamento com HSC Lin’. A expressão de α-cristalino foi localizada na ONL por análise imuno-histoquimica (figura 19). A figura 19 mostra que o cristalino aA está regulado positivamente em células da camada nuclear externa salvas após tratamento com HSC Lin’ mas não em olhos contralaterais tratados com células de controlo. 0 painel esquerdo apresenta coloração IgG (controlo) na retina salva. 0 painel central apresenta cristalino aA numa retina salva. 0 painel da direita apresenta cristalino aA em retina não salva.

Hibridou-se ARN mensageiro de retinas de ratinho rdl/rdl salvas com HSC Lin’ humanas com chips de micromatriz Affymetrix U133A especificas para humanos. Após análise em condições rigorosas, encontraram-se vários genes cuja expressão de ARNm foi especifica para humano, acima da linha de base, e significativamente superior nas retina salvas com HSC Lin’ comparativamente a retinas salvas com HSC Lin’ murinas e com as retinas não salvas injectadas com células de controlo humanas (figura 20, painel C) . CD6, uma molécula de adesão celular expressa na superfície de células estaminais hematopoiéticas CD34+ primitivas e recentemente diferenciadas, e interferão alfa 13, outro gene expresso por células estaminais hematopoiéticas, foram encontrados pela técnica de bioinformática de micromatriz, validando o protocolo de avaliação. Além disso, vários factores de crescimento e factores neurotróficos foram expressos acima do nível de base para amostras de retina de ratinho salvas com HSC Lin’ humanas (figura 20, painel D).

Utilizaram-se marcadores de células hematopoiéticas para células específicas de linhagem para seleccionar negativamente uma população de HSC Lin“ derivada de medula óssea contendo EPC. Embora a subpopulação de HSC Lin“ derivada de medula óssea possa servir como EPC, não sendo caracterizada pelos marcadores de superfície celular mais vulgarmente utilizados, o comportamento destas células no desenvolvimento ou lesão da vasculatura retiniana é completamente diferente do observado para populações celulares Lin+ ou células endoteliais adultas. Estas células são selectivas para alvos de locais de angiogénese retiniana e participam na formação de vasos sanguíneos patentes. 43 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ da retina são da vasculatura doenças requer manutenção da vários estudos

As doenças hereditárias degenerativas frequentemente acompanhadas por perda retiniana. 0 tratamento eficaz de tais restabelecimento da função, bem como arquitectura de tecido complexa. Embora recentes tenham explorado a utilização de entrega de factores tróficos baseada em células ou das próprias células estaminais, pode ser necessária uma combinação de ambas. Por exemplo, a utilização de terapia com factor de crescimento para tratar doença degenerativa retiniana resultou em sobre-crescimento desregulado de vasos sanguíneos resultando numa ruptura grave da arquitectura de tecido retiniano normal. A utilização de células estaminais neurais ou retinianas para tratar doença degenerativa retiniana pode reconstituir a função neuronal, mas será também necessária uma vasculatura funcional para manter a integridade funcional retiniana. A incorporação de células de uma população HSC Lin” nos vasos retinianos de ratinhos rd/rd estabilizou a vasculatura degenerativa sem romper a estrutura retiniana. Este efeito de salvamento também foi observado quando as células foram injectadas em ratinhos rd/rd em P15. Dado que a degeneração vascular inicia-se em P16 em ratinhos rd/rd, esta observação expande a janela terapêutica para tratamento eficaz com HSC Lin”. Os neurões e foto-receptores retinianos são conservados e mantém-se a função visual em olhos injectados com as células HSC Lin”. HSC Lin” derivadas de medula óssea adulta exercem efeitos vasculares e neurotróficos profundos quando injectadas intravitreo em ratinhos com doença degenerativa retiniana. Este efeito de salvamento persiste até 6 meses após o tratamento e é mais eficaz quando as HSC Lin” são injectadas antes de degeneração retiniana completa (até 16 dias após o nascimento em ratinhos que normalmente apresentariam degeneração retiniana completa 30 dias após nascimento). Este salvamento é observado em dois modelos de ratinhos de degeneração retiniana e notavelmente pode ser conseguido com HSC derivadas de medula óssea humana adulta quando o recebedor é um roedor imunodeficiente com degeneração retiniana (e.g., o ratinho SCID) ou quando o dador é um ratinho com degeneração retiniana. Vários relatos recentes descreveram um salvamento 44 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ fenotípico parcial em ratinhos ou cães com degeneração retiniana após salvamento génico baseado em virus com o gene de tipo selvagem (Ali et al. 2000, Nat Genet 25:306-310; Takahashi et al. 1999, J. Virol. 73:7812-7816; Acland et al. 2001, Nat. Genet. 28:92-95.), mas o presente invento é o primeiro efeito terapêutico baseado em células genérico conseguido por salvamento vascular. Assim, a utilidade potencial de tal abordagem no tratamento de um grupo de doenças (e.g., retinite pigmentosa) com mais de 100 mutações associadas conhecidas é mais prática do que criar terapias génicas individuais para tratar cada mutação conhecida. A base molecular precisa do efeito de salvamento neurotrófico permanece desconhecida, mas apenas se observa quando ocorre estabilização/salvamento vascular concomitante. A presença de células estaminais injectadas não é por si só suficiente para gerar um salvamento neurotrófico e a clara ausência de neurónios derivados de células estaminais na camada nuclear externa elimina a possibilidade de as células injectadas serem transformadas em foto-receptores. Os dados obtidos por análise de expressão génica em micromatriz demonstrou uma regulação positiva significativa dos genes que se sabe terem efeitos anti-apoptóticos. Dado que a maior parte da morte neuronal observada em degeneração retiniana é por apoptose, tal protecção pode ser um grande benefício terapêutico no prolongamento da vida dos foto-receptores e outros neurões críticos para a função visual nestas doenças. C-myc é um factor de transcrição que participa em apoptose por regulação positiva de vários factores que induzem apoptose a jusante. A expressão de C-myc aumentou 4,5 vezes em ratinhos rd/rd relativamente a tipo selvagem, indicando o envolvimento potencial na degeneração do foto-receptor observada no ratinho rdl/rdl. Sabe-se que Madl e YY-1, dois genes que são drasticamente regulados positivamente em retinas protegidas com HSC Lin“ (figura 20, painel A), suprimem a actividade de c-myc, inibindo assim a apoptose induzida por c-myc. Também se demonstrou que a sobrexpressão de Madl suprime a activação de caspase-8 induzida por Fas, outro componente crítico da via apoptótica. A regulação positiva destas duas moléculas pode desempenhar um papel na protecção da retina de degeneração vascular e neural através de prevenção do início de apoptose que normalmente leva a degeneração em ratinhos rd/rd. 45 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Outro conjunto de genes que foram muito regulados positivamente em retinas protegidas com HSC Lin” inclui membros da familia de cristalino (figura 20, painel B) . De modo semelhante às proteínas de choque térmico e outras proteínas induzidas por stress, os cristalinos podem ser activados por stress retiniano e proporcionam um efeito protector contra apoptose. A expressão anomalamente baixa de cristalino αΆ está correlacionada com perda de foto-receptor num modelo de rato de distrofia retiniana e uma análise proteómica recente da retina no ratinho rd/rd demonstrou indução de regulação positiva de cristalino em resposta a degeneração retiniana. Com base nos nossos dados de micromatriz de retinas de ratinho rd/rd salvas com EPC, a regulação positiva de cristalinos parece desempenhar um papel chave na neuroprotecção retiniana mediada por EPC. É provável que genes tais como c-myc, Madl, Yx-1 e os cristalinos sejam mediadores a jusante do salvamento neuronal. Os agentes neurotróficos podem regular a expressão de genes anti-apoptóticos, embora a nossa análise de micromatriz de retinas salvas com células estaminais de ratinho não ter demonstrado indução de níveis aumentados de factores neurotróficos conhecidos. Por outro lado, a análise de salvamento mediada por células estaminais derivadas de medula óssea humana com chips específicos para humano demonstrou aumentos pequenos mas significativos da expressão de múltiplos genes de factor de crescimento.

Os genes regulados positivamente incluem vários membros da família de factor de crescimento de fibroblastos e otoferlina. As mutações no gene de otoferlina estão associadas a doenças genéticas que levam a surdez devido a neuropatia auditiva. É possível que a produção de otoferlina por HSC Lin“ injectadas contribua também para a prevenção de neuropatia retiniana. Historicamente tem-se assumido desde há muito tempo que as alterações vasculares verificadas em doentes e animais com degeneração retiniana são secundárias a menores requisitos metabólicos à medida que os foto-receptores morrem. Os presentes dados indicam que, pelo menos para ratinhos com degeneração retiniana hereditária, a conservação da vasculatura normal pode também ajudar a manter as componentes 46 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ da camada nuclear externa. Relatos recentes na literatura corroboram o conceito que a vasculatura especifica de tecido tem efeitos tróficos que vão além do esperado pelo simples fornecimento vascular de "nutrientes". Por exemplo, podem induzir-se células endoteliais de figado para produzir factores de crescimento, após activação de VEGFR1, críticos para regeneração e manutenção de hepatócitos quando ocorrem danos hepáticos (LeCouter et al. 2003, Science 299:890-893).

Interacções indicativas semelhantes entre células endoteliais vasculares e células parenquimais hepáticas adjacentes estão alegadamente envolvidas em organogénese do fígado, bem antes da formação de vasos sanguíneos funcionais. A vasculatura retiniana endógena em indivíduos com degeneração retiniana pode não facilitar um salvamento tão drástico, mas caso esta vasculatura esteja suportada por progenitores endoteliais derivados de populações de células estaminais hematopoiéticas de medula óssea, estas podem tornar a vasculatura mais resistente a degeneração e ao mesmo tempo facilitar a sobrevivência neuronal, bem como vascular retiniana. Em humanos com degeneração retiniana, o atraso do início de degeneração retiniana completa pode proporcionar anos de visão adicionais. Os animais tratados com HSC Lin“ apresentavam conservação significativa de uma ERG, que pode ser suficiente para manter a visão.

Clinicamente, é largamente considerado que pode ocorrer uma perda substancial de foto-receptores e outros neurónios e mesmo assim manter visão funcional. Num determinado ponto, atinge-se o limiar crítico e perde-se a visão. Dado que praticamente todas as degenerações retinianas humanas hereditárias têm início precoce mas lento, um indivíduo com degeneração retiniana pode ser identificado e tratado intravítreo com um enxerto de células estaminais de medula óssea autólogas para atrasar a degeneração retiniana e a perda de visão concomitante. Para melhorar a especificidade ao alvo e a incorporação de células é desejável a presença de astrócitos activados (Otani et al. 2002, Nat. Med. 8: 1004- 1010); tal pode ser conseguido por tratamento precoce quando existe gliose associada ou por utilização de um laser para estimular a proliferação local de astrócitos activados. Opcionalmente pode utilizar-se transfecção ex vivo das células 47 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ estaminais com uma ou mais substâncias neurotróficas antes de injecção intra-ocular, para melhorar o efeito de salvamento. Esta abordagem pode ser aplicada ao tratamento de outras doenças degenerativas neuronais visuais, tal como glaucoma, no qual ocorre degeneração de células de gânglios retinianos.

As populações HSC Lin” de medula óssea adulta contêm uma população de EPC que pode promover angiogénese tendo como alvo astrócitos reactivos e incorporando-se num molde estabelecido sem romper a estrutura retiniana. As HSC Lin’ também proporcionam um efeito de salvamento neurotrófico a longo prazo em olhos que sofrem de degeneração retiniana. Além disso, as composições de HSC Lin” autólogas, modificadas geneticamente, contendo EPC podem ser transplantadas para olhos isquémicos ou com vascularização anómala e podem incorporar-se estavelmente em novos vasos e camadas neuronais e entregar continuamente moléculas terapêuticas localmente durante períodos de tempo prolongados. Tal entrega local de genes que expressam agentes farmacológicos em doses significativas fisiologicamente representa um novo paradigma para tratar doenças oculares actualmente intratáveis.

Os foto-receptores na retina normal de ratinho, por exemplo, são predominantemente bastonetes, mas a camada nuclear externa observada após salvamento com HSC Lin” continha predominantemente cones. A maioria das degenerações retinianas humanas hereditárias ocorrem em resultado principalmente de defeitos específicos de bastonetes e pensa-se que a perda de cones é secundária à disfunção dos bastonetes, que está provavelmente relacionada com a perda de algum factor trófico expresso pelos bastonetes.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Isolamento e enriquecimento de células; Preparação de populações A e B de HSC Lin” murinas.

Procedimento geral. Todas as avaliações in vivo foram efectuadas de acordo com o Guia NIH para cuidado e utilização de animais de laboratório e todos os procedimentos de avaliação foram aprovados pelo Comité de cuidados e utilização de animais do The Scripps Research Institute (TSRI, La Jolla, 48 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ CA) . As células de medula óssea foram extraídas de ratinhos B6.129S7-Gtrosa26, Tie-2GFP, ACTbEGFP, FVB/NJ (ratinhos rd/rd) ou ratinhos adultos Balb/cBYJ (The Jackson Laboratory, ME).

Separaram-se então monócitos através de separação por gradiente de densidade utilizando o gradiente de poli-sacarose HISTOPAQUE® (Sigma, St. Louis, MO) e marcaram-se com anticorpos de painel de linhagem conjugados com biotina (CD45, CD3, Ly-6G, CDll, TER-119, Pharmingen, San Diego, CA) para selecção Lin” em ratinhos. Separaram-se as células positivas para linhagem (Lin+) e removeram-se de HSC Lin” utilizando um dispositivo de separação magnética (separador AUTOMACS™, Miltenyi Biotech, Auburn, CA) . A população HSC Lin” resultante, contendo células endoteliais de progenitor, foi caracterizada adicionalmente utilizando um citómetro de fluxo FACS™ Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) utilizando os seguintes anticorpos: Sca-1 conjugado a PE, c-kit, KDR e CD31 (Pharmingen, San Diego, CA) . Utilizaram-se células de medula óssea Tie-2-GFP para a caracterização de Tie-2.

Para recolher células endoteliais de ratinho adulto, removeu-se cirurgicamente tecido mesentérico de ratinho ACTbEGFP e colocou-se em colagenase (Worthington, Lakewood, NJ) para digerir o tecido, seguido por filtração utilizando um filtro de 45 ym. Recolheu-se o filtrado e incubou-se com meio de crescimento endotelial (Clonetics, San Diego, CA). As características endoteliais foram confirmadas por observação do aparecimento de mosaico morfológico, por coloração com CD31 mAb (Pharmingen) e por análise de culturas para a formação de estruturas do tipo tubular em matriz MATRIGEL™ (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

População A de HSC Lin" murinas. Extraíram-se células de medula óssea de ratinhos ACTbEGFP através do procedimento geral descrito anteriormente. Caracterizaram-se as células HSC Lin" por citometria de fluxo FACS para os marcadores de antigénio de superfície celular CD31, c-kit, Sca-1, Flk-1 e Tie-2. Os resultados apresentam-se na figura 1 (c) . Cerca de 81% das HSC Lin- apresentaram o marcador CD31, cerca de 70,5% das HSC Lin” apresentaram o marcador c-kit, cerca de 4% das HSC Lin” apresentaram o marcador Sca-1, cerca de 2,2% das HSC 49 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Lin“ apresentaram ο marcador Flk-1 e cerca de 0,91% das HSC Lin“ apresentaram o marcador Tie-2. Contrariamente, as HSC Lin+ que foram isoladas destas células de medula óssea apresentaram um perfil de marcadores de células significativamente diferente (i.e., CD31: 37,4%; c-kit: 20%;

Sca-1: 2,8%; Flk-: 0,05%) .

População B de HSC Lin" murinas. Extraíram-se células de medula óssea de ratinhos Balb/C, ACTbEGFP e C3H através do procedimento geral descrito anteriormente. Analisaram-se as células HSC Lin“ para a presença de marcadores de superfície celular (Sca-1, Flk-l/KDR, c-kit (CD117), CD34, CD31 e várias integrinas: αΐ, α2, α3, oí4, oí5, a6, aL, oím, av, oíx, anb, βι, $2, β3, β4, β5 e βν) . Os resultados apresentam-se na tabela 2. 50 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Tabela 2. Caracterização da população B de HSC Lin”.

Marcador celular HSC Lin ai 0,10 cx2 17,57 cx3 0,22 0(4 89, 39 0(5 82,47 0(6 77,70 oíL 62, 69 oíM 35, 84 oíX 3, 98 oíV 33, 64 odlb 0,25 βΐ 86,26 β2 49, 07 β3 45,70 β4 0, 68 β5 9, 44 β7 11,25 CD31 51,76 CD34 55, 83 Flk-1/KDR 2, 95 c-kit (CD117) 74,42 Sca-1 7,54

Exemplo 2. Administração intravitreo de células num modelo murino.

Criou-se uma fissura de pálpebra na pálpebra de um ratinho com uma lâmina fina para expor o globo ocular em P2 a P6. Seguidamente injectou-se população A de HSC negativas para linhagem (aproximadamente 105 células em cerca de 0,5 μΐ a cerca de 1 μΐ de meio de cultura celular) intravitreo utilizando uma seringa com agulha de calibre 33 (Hamilton, Reno, NV).

Exemplo 3. Transfecção de EPC.

Transfectaram-se HSC Lin“ murinas (população A) com ADN (SEQ ID NO: 1, figura 7) que codifica o fragmento T2 de TrpRS (SEQ ID NO: 3) também contendo uma cauda His6 utilizando reagentes de transfecção FuGENE™6 (Roche, Indianapolis, IN) de 51 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ acordo com ο protocolo do fabricante. Suspenderam-se células HSC Lin" (cerca de 106 células por ml) em meio opti-MEM® (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo factor de células estaminais (PeproTech, Rocky Hill, NJ). Seguidamente adicionou-se mistura de ADN (cerca de 1 yg) e reagente FuGENE (cerca de 3 μΐ) e incubaram-se as misturas a cerca de 37 °C durante cerca de 18 horas. Após incubação lavaram-se as células e recolheram-se. A taxa de transfecção deste sistema foi de aproximadamente 17%, tal como confirmado por análise FACS. Confirmou-se a produção de T2-TrpRS por transferência "western". A sequência de aminoácidos de T2-TrpRS com cauda His6 apresenta-se como SEQ ID NO: 2, figura 8.

Exemplo 4. Imuno-histoquímica e análise confocal.

Recolheram-se retinas de ratinho em vários pontos temporais e prepararam-se por montagem completa ou por seccionamento congeladas. Para as montagens completas, fixaram-se as retinas com paraformaldeido a 4% e bloquearam-se em soro bovino fetal (FBS) a 50% e soro normal de cabra a 20%, durante uma hora à temperatura ambiente. As retinas foram processadas com anticorpos primários e detectaram-se com anticorpos secundários. Os anticorpos primários utilizados foram: anti-colagénio IV (Chemicon, Temecula, CA, anti-p-gal (Promega, Madison, WI), anti-GFAP (Dako Cytomation,

Carpenteria, CA) , anti-actina α de músculo liso (α-SMA, Dako Cytomation). Os anticorpos secundários foram conjugados com os marcadores fluorescentes Alexa 488 ou 594 (Molecular Probes, Eugene, OR) . As imagens foram obtidas utilizando um microscópio confocal MRC 1024 (Bio-Rad, Hercules, CA) . Criaram-se imagens tridimensionais utilizando o utilitário LASERSHARP® (Bio-Rad) para analisar as três diferentes camadas de desenvolvimento vascular na montagem de retina completa. A diferença de intensidade de pixéis GFP entre ratinhos com GFP melhorado (eGFP) e ratinhos GFAP/wtGFP, distinguida por microscopia confocal, foi utilizada para criar imagens tridimensionais. 52 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Exemplo 5. Ensaio de quantificação de angiogénese retiniana in vivo em ratinhos.

Para análise de T2-TrpRS, reconstruiu-se o plexo primário e profundo a partir das imagens tridimensionais de retinas de ratinho. Dividiu-se o plexo primário em duas categorias: desenvolvimento normal ou progressão vascular parada. As categorias de inibição de desenvolvimento vascular profundo foram criadas com base na percentagem de inibição vascular, incluindo os seguintes critérios: a inibição completa da formação de plexo profundo foi classificada "completa", desenvolvimento vascular normal (incluindo menos de 25% de inibição) foi classificada "normal" e as restantes foram classificadas "parcial". Para os dados de salvamento de ratinho rd/rd, capturaram-se quatro áreas independentes do plexo profundo em cada montagem de retina completa utilizando uma lente lOx. Calculou-se o comprimento total da vasculatura para cada imagem, resumiu-se e comparou-se entre os grupos. Para obter informação precisa, injectaram-se HSC Lin“ num olho e HSC Lin+ no outro olho do mesmo ratinho. As retinas de controlo não injectadas foram obtidas da mesma ninhada.

Exemplo 6. Modelos murinos de lesão da retina adulta.

Criaram-se modelos com laser e cicatrizes utilizando um laser de diodo (150 mW, 1 segundo, 50 mm) ou mecanicamente através de perfuração da retina do ratinho com uma agulha de calibre 27. Cinco dias após a lesão, injectaram-se as células utilizando o método intravitreo. Recolheram-se os olhos dos ratinhos cinco dias mais tarde.

Exemplo 7. Salvamento neurotrófico de regeneração da retina.

As células estaminais hematopoiéticas negativas para linhagem derivadas de medula óssea de murino adulto (HSC Lin”) têm um efeito de salvamento vasculotrófico e neurotrófico num modelo de ratinho de degeneração retiniana. Injectaram-se de modo intravitreo os olhos direitos de ratinhos de 10 dias de idade com cerca de 0,5 microlitros contendo cerca de 105 HSC Lin“ e avaliaram-se 2 meses mais tarde para a presença de vasculatura retiniana e contagem nuclear de camada neuronal. Injectaram-se os olhos esquerdos dos mesmos ratinhos com cerca do mesmo número de HSC Lin+ como um controlo e foram avaliados 53 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ de forma análoga. Tal como apresentado na figura 9, nos olhos tratados com HSC Lin", a vasculatura retiniana parecia praticamente normal, a camada nuclear interna estava praticamente normal e a camada nuclear externa (ONL) tinha cerca de 3 a cerca de 4 camadas de núcleos. Contrariamente, o olho contralateral tratado com HSC Lin+ tinha uma camada vascular retiniana média marcadamente atrófica, uma camada vascular retiniana externa completamente atrófica; a camada nuclear interna estava marcadamente atrófica e a camada nuclear externa tinha desaparecido completamente. Tal foi ilustrado drasticamente no ratinho 3 e no ratinho 5. No ratinho 1, não ocorreu qualquer efeito de salvamento e tal verificou-se para aproximadamente 15% dos ratinhos injectados.

Quando se avaliou a função visual com electro-retinogramas (ERG), o restabelecimento de um ERG positivo verificou-se nos casos em que se observou salvamento vascular e neuronal (ratinhos 3 e 5) . Não se verificou um ERG positivo nos casos em que não ocorreu salvamento vascular, nem neuronal (ratinho 1). Esta correlação entre salvamento vascular e neurotrófico dos olhos de ratinhos rd/rd por HSC Lin" encontra-se ilustrado por um gráfico de regressão linear apresentado na figura 10. Verificou-se uma correlação entre recuperação neuronal (eixo dos y) e vascular (eixo dos x) para 0 tipo de vasculatura intermédia (r=0,45) e para a vasculatura profunda (r=0,67). A figura 11 apresenta a ausência de qualquer correlação significativa estatisticamente entre salvamento vascular e neuronal por HSC Lin+. Quantificou-se o salvamento vascular e os dados apresentam-se na figura 12. Os dados para ratinhos 1 mês (1 M), 2 meses (2 M) e 6 meses (6 M) após injecção, apresentados na figura 12, demonstram que o comprimento vascular aumentou significativamente em olhos tratados com HSC Lin" (barras escuras) relativamente ao comprimento vascular em olhos não tratados do mesmo ratinho (barras claras), particularmente 1 mês e 2 meses após injecção. Quantificou-se o efeito de salvamento neurotrófico por contagem de núcleos nas camadas nucleares interna e externa cerca de dois meses após injecção de HSC Lin" ou HSC Lin+. Os resultados apresentam-se nas figuras 13 e 14. 54 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Exemplo 8. População de HSC Lin" humana.

Extraíram-se células da medula óssea de voluntários humanos adultos saudáveis através do procedimento geral descrito anteriormente. Separaram-se então os monócitos através de separação por gradiente de densidade utilizando gradiente de polissacarose HISTOPAQUE® (Sigma, St. Louis, MO). Para isolar a população HSC Lin“ das células mononucleares de medula óssea humana utilizaram-se os seguintes anticorpos de painel de linhagem conjugados a biotina com o sistema de separação magnética (separador AUTOMACS™, Miltenyi Biotech, Auburn, CA) : CD2, CD3, CD4, CDlla, Mac-1, CD14, CD16, CD19, CD33, CD38, CD45RA, CD64, CD68, CD86, CD235a (Pharmingen).

Separou-se adicionalmente a população HSC Lin" humana em duas subpopulações com base na expressão de CD133. As células foram marcadas com anticorpos CD133 conjugados a biotina e separadas nas subpopulações positiva para CD133 e negativa para CD133.

Exemplo 9. Administração intravitreo de células humanas e murinas em modelos murinos para degeneração retiniana.

Utilizaram-se estirpes de ratinho C3H/HeJ, C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID e rdlO como modelos de degeneração retiniana. Os ratinhos C3H/HeJ e C3SnSmn.CBll-Prkdc SCID (The Jackson Laboratory, Maine) foram homozigóticos para a mutação de degeneração retiniana 1 (rdl), uma mutação que causa inicio precoce de degeneração retiniana grave. A mutação está localizada no exão 7 do gene Pdeób que codifica a subunidade β de cGMP fosfodiesterase de foto-receptor de bastonete. Verificou-se a existência da mutação neste gene em doentes humanos com retinite pigmentosa (RP) autossómica recessiva. Os ratinhos C3SnSmn.CBll-Prkdc SCID também são homozigóticos para a mutação espontânea de deficiência imunitária combinada grave (Prkdc SCID) e foram utilizados para as experiências de transferência de células humanas. A degeneração retiniana em ratinhos rdlO é causada por uma mutação no exão 13 do gene Pde6b. Tal é também um modelo de RP clinicamente relevante com inicio tardio e degeneração retiniana menos grave do que rdl/rdl. Todas as avaliações foram efectuadas de acordo com o Guia NIH para cuidado e utilização de animais de laboratório e 55 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ todos os procedimentos foram aprovados pelo Comité para o cuidado e utilização de animais de The Scripps Research Institute.

Criou-se uma fissura na pálpebra numa pálpebra de um ratinho com uma lâmina fina para expor o globo ocular em P2 a P6. Foram então injectadas células HSC negativas para linhagem para a população murina A ou população humana C (aproximadamente 105 células em cerca de 0,5 μΐ a cerca de 1 μΐ de meio de cultura de células) no olho do ratinho de modo intravitreo utilizando uma seringa com agulha de calibre 33 (Hamilton, Reno, NV). Para visualizar as células humanas injectadas, marcaram-se as células com corante (Cell tracker green CMFDA, Molecular Probes) antes de injecção.

Recolheram-se as retinas a vários pontos temporais e fixaram-se com paraformaldeido (PFA) a 4% e metanol seguido por bloqueamento em FBS a 50%/NGS a 20% durante uma hora à temperatura ambiente. Para corar a vasculatura retiniana, incubaram-se as retinas com anticorpos anti-CD31 (Pharmingen) e anti-colagénio IV (Chemicon) seguido por anticorpos secundários conjugados a Alexa 488 ou 594 (Molecular Probes, Eugene, Oregon). Achataram-se as retinas com quatro incisões de relaxamento radiais para obter uma preparação de montagem completa. Obtiveram-se imagens da vasculatura no plexo vascular intermédio ou profundo (consultar Dorrell et al. 2002 Invest Ophthalmol. Vis. Sei. 43:3500-3510) utilizando um microscópio confocal Radiance MP2100 e o utilitário LASERSHARP® (Biorad, Hercules, Califórnia). Para quantificação da vasculatura, seleccionaram-se quatro campos independentes (900 pm x 900 pm) aleatoriamente da parte média da camada vascular intermédia ou profunda e mediu-se o comprimento total da vasculatura utilizando o utilitário de análise LASERPIX® (Biorad). Utilizaram-se para análise adicional o comprimento total destes quatro campos no mesmo plexo.

Re-embeberam-se as montagens de retinas achatadas para seccionamento criostático. Colocaram-se as retinas em PFA a 4% durante a noite seguido por incubação em sacarose a 20%. Embeberam-se as retinas em composto de temperatura óptima de corte (OCT: Tissue-Tek; Sakura FineTech, Torrance, CA). Re-hidrataram-se secções criostáticas (10 pm) em PBS contendo o 56 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ corante nuclear DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) . Obtiveram-se imagens de núcleos corados com DAPI de três áreas diferentes (280 ym de largura, amostragem não condicionada) numa única secção que continha a cabeça do nervo óptico e a retina periférica completa por microscopia confocal. Os números de núcleos localizadas na ONL dos três campos independentes numa secção foram contados e somados para análise. Efectuou-se análise por regressão linear simples para analisar a relação entre o comprimento da vasculatura no plexo profundo e o número de núcleos de células na ONL.

Após adaptação ao escuro durante a noite, anestesiaram-se ratinhos por injecção intraperitoneal de cetamina a 15 yg/gm e xilazina a 7 yg/gm. Registaram-se os electro-retinogramas (ERG) da superfície da córnea de cada olho após dilatação da pupila (sulfato de atropina a 1%) utilizando um eléctrodo para a córnea de ansa de ouro conjuntamente com um eléctrodo de referência na boca e uma ligação à terra na cauda. Produziram-se estímulos com um estimulador fótico Grass (PS33 Plus, Grass Instruments, Quincy, MA) afixado ao exterior de uma cúpula altamente reflectiva Ganzfeld. Registaram-se as respostas dos bastonetes com impulsos de luz de comprimentos de onda curtos (Wratten 47A; Xmax = 47 0 nm) ao longo de uma gama de intensidades até ao máximo permitido pelo estimulador fótico (0, 668 cd-s/m2) . Amplificaram-se os sinais de resposta (amplificador CP511 AC, Grass Instruments), digitalizaram-se (PCI-1200, National Instruments, Austin, TX) e analisaram-se por computador. Cada ratinho foi utilizado como o seu próprio controlo interno com ERG registados tanto nos olhos tratados, como nos não tratados. Fez-se a média até 100 varrimentos para os sinais mais fracos. Subtraíram-se digitalmente as médias das respostas do olho não tratado às respostas do olho tratado e esta diferença no sinal foi utilizada para o índice de salvamento funcional.

Utilizou-se análise de micromatriz para avaliar a expressão génica dos alvos de HSC Lin”. Injectaram-se ratinhos rd/rd em P6 com HSC Lin” ou HSC CD31”. Dissecaram-se as retinas destes ratinhos 40 dias após injecção em meio isento de ARNase (o salvamento da vasculatura retiniana e da camada de foto-receptor é óbvia neste ponto temporal após injecção). Analisou-se um quadrante de cada retina por montagem completa 57 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ para assegurar que se atingiu direcção normal de HSC ao alvo, bem como protecção da vasculatura e neural. Purificou-se ARN de retinas com injecções bem-sucedidas utilizando um protocolo de isolamento de ARN de TRIzol (Life Technologies, Rockville, MD), fenol/clorofórmio. Hibridou-se o ARN com chips Affymetrix Mu74Av2 e analisou-se a expressão génica com utilitário GENESPRING® (SiliconGenetics, Redwood City, CA). Injectaram-se de modo intravitreo HSC humanos ou de ratinho purificados em ratinhos em P6. Em P45 dissecaram-se as retinas e recolheram-se conjuntamente em fracções de 1) retinas de ratinho salvas injectadas com HSC humanas, 2) retinas de ratinho não salvas injectadas com HSC humanas e 3) retinas de ratinho salvas injectadas com HSC de ratinho para purificação de ARN e hibridação com chips U133A Affymetrix específicos para humano. Utilizou-se o utilitário GENESPRING® para identificar genes que foram expressos acima do nível de base e com expressão superior nas retinas salvas com HSC humanas. Os perfis de expressão sonda-par para cada um destes genes foram então analisados individualmente e comparados com um modelo de experiências com micromatriz U133A humana normal utilizando dChip para determinar hibridação específica da espécie humana e para eliminar falsos positivos devido a hibridação entre espécies. A figura 21 ilustra os dados de citometria de fluxo comparando a expressão de antigénios de superfície CD31 e integrina alfa 6 em populações de HSC Lin” humanas positivas para CD133 (CD133+) e negativas para CD133 (CD133”) . Os painéis à esquerda apresentam gráficos de pontos de citometria de fluxo. Os painéis centrais e da direita são histogramas mostrando o nível de expressão de anticorpo específico na população celular. 0 eixo dos Y representa o número de eventos e o eixo dos X apresenta a intensidade do sinal. Os histogramas contornados são anticorpos de controlo de isotipo IgG que mostram o nível de coloração de base não específica. Os histogramas a cheio apresentam o nível de expressão de anticorpo específico na população celular. Um histograma a cheio desviado para a direita do histograma contornado (de controlo) representa um sinal de fluorescência aumentado e expressão do anticorpo acima do nível de base. A comparação da posição dos picos dos histogramas a cheio entre as duas populações celulares representa a diferença na expressão de 58 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ proteína nas células. Por exemplo, CD31 é expresso acima do nível de base tanto em células CD133+, como CD133”; no entanto, existem mais células que expressam níveis baixos de CD31 na população de células CD133+ do que na população CD133" . A partir destes dados é evidente que a expressão de CD31 varia entre as duas populações e que a expressão de integrina alfa 6 está largamente limitada a células na população Lin” e assim pode ser utilizada como um marcador de células com função de salvamento vascular e neurotrófico.

Quando se injectou de modo intravítreo a subpopulação de HSC Lin- positiva para CD133 e negativa para CD133 nos olhos de ratinhos SCID neonatais, verificou-se que a maior extensão de incorporação na vasculatura em desenvolvimento foi da subpopulação negativa para CD133, que expressa ambos os antigénios de superfície CD31 e integrina a6 (consultar figura 21, em baixo) . A subpopulação positiva para CD133, que não expressa CD31 nem integrina a6 (figura 21, em cima), parece ter como alvo locais de neovascularização periférica dirigida por isquemia, mas não quando injectadas em olhos que estão em processo de angiogénese.

Analisaram-se imuno-histoquimicamente as retinas salvas e não salvas com anticorpos específicos para opsina de bastonetes e de cones. Analisaram-se para opsina de bastonetes ou de cones os mesmos olhos utilizados para os registos de ERG apresentados na figura 17. Nas retinas de ratinho de tipo selvagem, menos de 5% dos foto-receptores presentes são cones (Soucy et al. 1998, Neuron 21: 481-493) e os padrões de coloração imuno-histoquímica observados com opsina de cone vermelho/verde, tal como apresentado na figura 25 (A) ou rodopsina de bastonetes, tal como apresentado na figura 25 (B) , foram consistentes com esta percentagem de células de cone. Os anticorpos específicos para rodopsina de bastonete (rho4D2) foram proporcionados pelo Dr. Robert Molday da University of British Columbia e utilizados tal como descrito anteriormente (Hicks et al. 1986, Exp. Eye Res. 42: 55-71). Os anticorpos de coelho específicos para opsina vermelho/verde de cones foram adquiridos a Chemicon (AB5405) e utilizados de acordo com as instruções do fabricante. 59 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Exemplo 10. Administração intravitreo de células murlnas em modelos murinos para degeneração da retina induzida por oxigénio.

Expuseram-se ratinhos C57B16 de tipo selvagem recém-nascidos a hiperóxia (75% de oxigénio) entre os dias P7 a P12 pós-natal num modelo de degeneração retiniana induzida por oxigénio (OIR). A figura 22 ilustra desenvolvimento vascular pós-natal normal em 16 ratinhos C57B de PO a P30. Em PO só se detectam vasos superficiais que germinam em torno do disco óptico. Durante os dias seguintes, a rede superficial primária estende-se para a periferia, chegando à periferia longínqua no dia PIO. Entre P7 e P12 desenvolve-se o plexo secundário (profundo) . Em P17, encontra-se presente uma rede de vasos extensa superficial e profunda (figura 22, figura inserida). Nos dias seguintes, ocorre remodelação conjuntamente com desenvolvimento da camada de vasos terciária (intermédia) até se atingir a estrutura de adulto aproximadamente a P21.

Contrariamente, no modelo OIR aqui descrito, após exposição a 75% de oxigénio em P7-P12, a sequência normal de eventos encontra-se seriamente interrompida (figura 23) . Injectaram-se intravitreo populações HSC Lin” murinas de adulto em P3 num olho de um ratinho que foi subsequentemente sujeito a OIR, o outro olho foi injectado com PBS ou células negativas para CD31 como um controlo. A figura 24 ilustra que as populações HSC Lin” podem reverter os efeitos degenerativos de niveis elevados de oxigénio no desenvolvimento da retina de ratinho. Verificou-se uma vasculatura retiniana superficial e profunda completamente desenvolvida em P17 nos olhos tratados, enquanto os olhos de controlo apresentam grandes áreas avasculares virtualmente sem vasos profundos (figura 24). Observaram-se aproximadamente 100 olhos de ratinhos no modelo OIR. Verificou-se vascularização normal em 58% dos olhos tratados com as populações HSC Lin”, comparativamente a 12% dos olhos de controlo tratados com células CD31” e 3% dos olhos de controlo tratados com PBS.

Exemplo 11. Isolamento de células da medula óssea do tipo mielóide de medula óssea murina por selecção com CD44. 60 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Extraíram-se células de medula óssea de ratinhos adultos (The Jackson Laboratory, ME) . As medulas ósseas completas foram tratadas com um anticorpo CD44 murino e utilizou-se citometria de fluxo para isolar células que expressam CD44 da medula óssea. As células foram separadas do anticorpo e armazenadas numa solução tampão para utilização futura. Foi também isolada uma população de células que não expressam CD44 significativamente (CD44l0BM) .

Exemplo 12. Isolamento de células da medula óssea do tipo mielóide de medula óssea murina por selecção com CD44.

Seleccionaram-se também positivamente células da medula óssea utilizando um anticorpo para CDllb em vez de CD44, tal como descrito no exemplo 11. Isolou-se uma população celular de medula óssea do tipo mielóide que era CD44hl e CDllb+, que tinha características de actividade semelhantes à população CD44hl isolada no exemplo 11 utilizando CD44. Isolou-se também uma população CD4410 CDllb”, que se verificou ser inactiva.

Exemplo 13. Caracterização das populações celulares MLBM.

Embora o papel de CD44 neste contexto não seja claro, é possível que este receptor medeie sobrevivência celular, migração celular e/ou diferenciação celular no vítreo rico em ácido hialurónico após injecção de células no olho. Encontravam-se presentes populações distintas de células CD44hl (i.e., MLBM) e CD4410 na medula óssea de ratinho não fraccionada. A população celular MLBM representa 76% da população Lin” utilizada nos exemplos anteriores, enquanto apenas cerca de 37% e 4%, respectivamente, de populações celulares Lin+ e CD31”/CD34”/CDllb” de medula óssea expressaram CD44 (figura 26). Assim, existe uma excelente correlação entre a expressão de CD44 e as actividades vasculotrófica e neurotrófica verificadas nestas três populações, i.e. as células Lin” foram as mais eficazes enquanto as células CD31” /CD34”/CDllb” foram consistentemente as menos eficazes. Utilizando um painel de anticorpos específicos de linhagem, determinou-se que a maioria das células CD44hl tem características mielóides fortes (figura 27). De igual forma, praticamente todas as células de medula óssea CD44hl são também CDllb+ (figura 27). 61 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

As MLBM seleccionadas positivamente utilizando o anticorpo CDllb no exemplo 12 (CD44hl CDllb+) tiveram resultados de actividade semelhantes aos obtidos com MLBM isoladas utilizando selecção com anticorpo CD44 nas experiências de direcção a alvos vasculares.

As caracteristicas de antigénios de superfície celular da população celular MLBM do exemplo 12 e das células CD4410 CDllb"1" isoladas no exemplo 12 apresentam-se na seguinte tabela 3. Na tabela 3, um maior número de sinais positivos (+) indica uma expressão relativamente maior do antigénio. Um sinal negativo (-) indica que não se detectou qualquer expressão.

Tabela 3

Antigénio CD44hi/CDllb+ CD44lo/CDllb" CDlla +++ + CD31 + ++ CD34 + - alfa 6 + + - KDR + - Sca-1 + + c-Kit + - CD115 + - CD45R/B220 + ++ TER119 - +++ Ly6G&C (GR-1) +++ - Ly6G +++ -

Exemplo 14. Efeitos vasculotrófico e neurotrófico da população celular MLBM. A população celular MLBM do exemplo 11 manteve as propriedades das células Lin” em termos de terem alvos vasculares e efeitos vasculotrófico e neurotrófico, enquanto as células CD44l0BM apresentaram nenhuma ou pouca actividade. A actividade de terem alvos vasculares foi demonstrada por injecção intravítreo de células de uma população celular MLBM GFP+ em ratinhos no dia 7 pós-natal (P7) e analisando as retinas em P14. Após marcação dos vasos sanguíneos com isolectina GS, verificou-se que as células GFP+ têm como alvo 62 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ a vasculatura retiniana e assumem uma localização perivascular, sem evidência de incorporação. Estes eventos foram comuns quando se utilizaram MLBM, mas pouco frequentes ou ausentes nos olhos tratados com CD44l0BM (figura 28). A actividade vasculotrófica e neurotrófica da população celular MLBM do exemplo 11 foi avaliada utilizando um modelo de ratinho de degeneração retiniana, tal como descrito anteriormente para HSC Lin”. 0 ratinho rdl/rdl apresenta propriedades caracteristicas de doença degenerativa retiniana incluindo morte de foto-receptores e atrofia da vasculatura retiniana profunda. Tal como descrito anteriormente, as células de medula óssea HSC Lin“ conservam a vasculatura retiniana profunda e salvam parcialmente os foto-receptores. A população celular MLBM efectua a mesma função (figura 29). 0 modelo de retinopatia induzida por oxigénio partilha caracteristicas com a retinopatia da prematuridade. A patologia associada com este modelo é significativamente diminuída quando os olhos são tratados com células da população celular MLBM. Os efeitos das células da população celular MLBM neste modelo foram semelhantes aos verificados utilizando as HSC Lin’ descritas anteriormente. Os olhos tratados com células da população celular MLBM apresentaram uma redução significativa dos dois parâmetros utilizados para quantificar o grau de patologia neste modelo: área de obliteração vascular, área de tufo neovascular. Contrariamente, os olhos tratados com células CD44l0BM não mostraram qualquer melhoria relativamente aos olhos tratados com veículo (figura 30).

Além de terem como alvo a vasculatura retiniana, as células da população celular MLBM diferenciam para células do tipo macrófago (F4/80 + ), penetram na retina e assumem uma posição praticamente oposta ao epitélio pigmentado retiniano (RPE) . Esta localização facilita os efeitos de salvamento vascular e de foto-receptor verificados para as células da população celular MLBM. Além disso, uma vez num local próximo de RPE, as células da população celular MLBM produzem factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), tal como demonstrado por injecção de células de uma população celular MLBM derivada de um ratinho VEGF-GFP, na qual é expressa 63 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ proteína fluorescente verde (GFP) por activação do gene VEGF (figura 31) . Assim, as células da população celular MLBM parecem estar num factor de VEGF "activado". As células introduzidas da população celular MLBM parecem recrutar células endógenas do mesmo tipo, dado que se detectaram ambas as células GFP+ (introduzidas) e GFP” (endógenas) na região RPE. Esta localização foi verificada em ratinhos de tipo selvagem durante desenvolvimento vascular retiniano normal em retinas salvas no ratinho rdl/rdl no modelo de retinopatia induzida por oxigénio.

Verificaram-se resultados semelhantes de alvo vascular para a população celular MLBM do exemplo 12. A figura 32 demonstra que as células P20, CD44hl CDllb+ do exemplo 12 (verde) tiveram como alvo especifico a vasculatura (vermelho) quando injectadas em P2, de um modo semelhante à população CD44-high do exemplo 11. A figura 33 mostra que CD4410 CDllb” do exemplo 12 não tem como alvo especifico a vasculatura. A população celular MLBM proporciona um tratamento eficaz e versátil para retinopatia isquémica e doenças oculares semelhantes. Assim, as células são facilmente isoladas a partir de medula óssea autóloga, minimizando assim a imunogenicidade potencial frequentemente observada em terapias baseadas em células. 0 acompanhamento a longo prazo (até seis meses) revelou apenas rosetas ocasionalmente e a conservação histológica da retina neural em olhos injectados com células negativas para linhagem. Além disso, a população celular MLBM pode ser transfectada com genes úteis para entregar genes funcionais à retina.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE

<120> MÉTODO PARA 0 TRATAMENTO DE RETINOPATIA DE PREMATURIDADE E DOENÇAS RETINOPÁTICAS RELACIONADAS

<130> 18-216 TI

<140> EP <141> 2006-02-24 <150> 60/656 122 <151> 2005-02-24 64 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ < 16 Ο > 6 <17Ο> FastSEQ para Windows versão 4.0

<210> 1 <211> 4742 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> T2 TrpRS com cauda His6 <400> 1 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg ttttgattta taagggattt tgccgatttc acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tccgctcatg agacaataac cctgataaat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt agtgggttac atcgaactgg atctcaacag agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg gacggggagt caggcaacta tggatgaacg actgattaag cattggtaac tgtcagacca aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta caaaatccct taàcgtgagt tttcgttcca aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg accgctacca gcggtggttt gtttgccgga aactggcttc agcagagcgc agataccaaa ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg accggataag gcgcagcggt cgggctgaac gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc cacgagggãg cttccãgggg gaaãcgcctg cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600 tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660 aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720 cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780 agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840 ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900 tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960 tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020 caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080 accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140 attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200 ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260 taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320 taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380 aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440 agtttactca tatatacttt agattgattt 1500 ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560 ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620 cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680 tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740 tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800 tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860 tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920 ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980 acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040 ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100 gt&tctttãt agtcctgtcg ggtttcgccã 2160 ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220 ggecttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280 65 65 at <210> 2 <211> 392 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> T2 TrpRS com cauda H <400> 2 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacága tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg agtgcaaaag gcatagacta cgataagctc attgttcggt ttggaagtag taaaattgac aaagagctaa taaaccgaat agagagagcc accggccáaa gaccacacca cttcctgcgc agaggcatct tcttctcaca cagagatatg aatcaggttc ttgatgccta tgaaaataag aagccatttt atctgtacac gggccggggc ccctcttctg aagcaatgca tgtaggtcac ctcattccat ttattttcac aaagtggctc caggatgtat ttaacgtgcc cttggtcatc cagatgacgg atgacgagaa gtatctgtgg aaggacctga ccctggacca ggcctatggc gatgctgttg agaatgccaa ggacatcatc gcctgtggct ttgacatcaa caagactttc atattctctg acctggacta catggggatg agctcaggtt tctacaaaaa tgtggtgaag attcaaaagc atgttacctt caaccaagtg aaaggcattt tcggcttcac tgacagcgac tgcattggga agatcagttt tcctgccatc caggctgctc cctccttcag caactcattc ccacagatct tccgagacag gacggatatc cagtgcctta tcccatgtgc cattgaccag gatccttact ttagaatgac aagggacgtc gcccccagga tcggctatcc taaaccagcc ctgttgcact ccaccttctt cccagccctg cagggcgccc agaccaaaat gagtgccagc gacccaaact cctccatctt cctcaccgac acggccaagc agatcaaaac caaggtcaat aagcatgcgt tttctggagg gagagacacc atcgaggagc acaggcagtt tgggggcaac tgtgatgtgg acgtgtcttt catgtacctg accttcttcc tcgaggacga cgacaagctc gagcagatca ggaaggatta caccagcgga gccatgctca ccggtgagct caagaaggca ctcatagagg ttctgcagcc cttgatcgca gagcaccagg cccggcgcaa ggaggtcacg gatgagatag tgaaagagtt catgactccc cggaagctgt ccttcgactt tcagaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4742

Met Ser Ala Lys Gly ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Vai Arg Phe Gly 1 5 Glu Ile 10 15 Ser Ser Lys Ile Asp Lys Leu Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr 20 25 30 61 y Gin Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His 35 40 Ala 45 Arg Asp Met Asn Gl n vai Leu Asp Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe 50 55 60 Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His vai Gly 65 70 phe Thr 75 80 His Leu Ile Pro Phe ile Lys Trp Leu Gin Asp Vai Phe Asn 8S Thr 90 95 vai Pro Leu Vai 1 ΛΠ Ile Gin Met Asp 105 Asp Glu Lys Tyr Leu 11Π Trp Lys Asp Leu Thr 1UU Leu Asp Gin Ala Tyr Gly Asp Ala vai Glu 11U Asn Ala Lys 115 120 125 66 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ

Asp Ile Ile Ala cys Gly Phe Asp ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe ser 130 135 140 ASP Leu ASP Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn val Val 145 Ile Gin 150 155 160 Lys Lys Hi S vai Thr Phe Asn Gin Val Lys Gly ile Phe Gly Phe Thr 165 170 175 ASP Ser ASp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile. Gin Ala 180 185 190 Ala pro ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gl n ile Phe Arg Asp Arg 195 Gin 200 205 Thr Asp ile cys Leu' Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gin Asp pro Tyr 210 215 220 Phe Arg Met Thr Arg Asp Vai Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro 225 230 235 240 Ala Leu Leu HiS Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gin Gly Ala Gin Thr 245 250 255 Lys Met ser Ala Ser ASp Pro Asn Ser Ser ile Phe Leu Thr Asp Thr 260 265 270 Ala Lys Gin Ile Lys Thr Lys vai Asn Lys His Ala phe Ser Gly Gly 275 280 285 Arg ASP Thr Ile Glu Glu His Arg Gin Phe Gly Gly Asn Cys Asp val Asp vai Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu jvU Glu Asp ASp Asp Lys 305 Glu 310 315 320 Leu Gin Ile Arg JTC Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys ) Ala Leu ile Glu val Leu Gin Pro Leu Ile 3 3 3 Ala Glu 340 345 350 His Gin Ala Arg Arg Lys Glu val •jcn Thr Asp Glu Ile val qec Lys Gl u Phe Met Thr J J J Pro Arg Lys Leu Ser jvU Phe Asp phe Gin Lys 30 j Leu Ala Ala Ala 370 375 380 Leu Glu Hi s His His His His His 385 390

<210> 3 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Ser Ala Lys Gly lie Asp Tyr Asp Lys Leu ile vai Arg Phe Gly Ser 1 5 10 15

Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly 20 25 30

Gin Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly ile Phe Phe ser His Arg 35 40 45

Asp Met Asn Gin vai Leu Asf) Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr 50 55 60

Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Vai Gly His 65 70 75 80

Leu ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gin Asp vai Phe Asn vai 85 90 95

Pro Leu Vai ile Gin Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp 100 105 110

Leu Thr Leu Asp Gin Ala Tyr Ser Tyr Ala vai Glu Asn Ala Lys Asp 115 120 125 ile ile Ala cys Gly Phe Asp ile Asn Lys Thr Phe ile Phe ser Asp 130 135 140

Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn vai vai Lys 145 150 155 160 ile Gin Lys His vai Thr Phe Asn Gin vai Lys Gly Ile Phe Gly Phe 165 170 175

Thr Asp ser Asp cys ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gin Ala 180 185 190

Ala Pro Ser phe Ser Asn Ser Phe Pro Gin ile Phe Arg Asp Arg Thr 195 200 205 67 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ ASP lie Gin Cys Leu lie Pro cys Ala ile Asp Gin ASp Pro Tyr Phe 210 215 220 Arg Met Thr Arg Asp Vai Ala Pro Arg ile Gly Tyr pro Lys Pro Ala 225 230 235 240 Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gin Gly Ala Gin Thr Lys 245 250 255 Met Ser Ala Ser ASP pro Asn Ser ser lie phe Leu Thr Asp Thr Ala 260 265 270 Lys Gin lie 275 ile Lys Thr Lys vai Asn 280 Gin Lys His Ala Phe Ser 285 Cys Gly Gly Arg ASP Thr Glu Glu HÍS Arg Phe Gly Gly Asn Asp val Asp 290 295 300 Vai Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu ASp Asp ASP Lys Leu 305 310 315 320 Glu Gin ile Arg Lys ASp Tyr Thr ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu 325 330 335 Leu Lys Lys Ala Leu lie Glu val Leu Gin Pro Leu Ile Ala Glu HÍ S 340 345 val 350 Gin Ala Arg 355 Arg Arg Lys Glu vai Thr 360 Asp Asp Glu Ile Lys 365 Glu Phe Met Thr Pro Lys Leu Ser Phe Phe Gin 370 375

<210> 4 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 > 4 sér Ala Lys Gly ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile val Arg Phe Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr 20 25 phe 30 His Gin Arg Pro HiS His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe ser Arg 35 40 45 Phe Asp Met Asn Gin val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Tyr 50 55 Ala 60 HÍS val Gly HiS Leu Tyr Thr Gly Arg Gly pro Ser Ser Glu Met 65 70 75 Phe 80 Leu Ile pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gin Asp val Asn val 85 90 95 Pro Leu val ile Gin Met Thr A5p Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp 100 105 Glu 110 Leu Thr Leu 115 Ala Asp Gin Ala Tyr Gly 120 ile Asp Ala Val Asn 125 Ala Lys Asp Ile Ile Cys Gly Phe Asp Asn Lys Thr Phe 12. J ile Phe ser ASP 130 135 140 val val Leu ASP Tyr Met Gly Met ser ser Gly phe Tyr Lys Asn Lys 145 150 155 Gly Dl 160 ile Gin Lys HÍ S val 165 Thr Phe Asn Gin val 170 Lys Ile phe Phe Thr Asp Ser ASp Cys Ile Gly Lys ile ser Phe Pro Ala Ile Gin Ala 180 185 Ile Phe 190 Thr Ala Pro sér phe Ser Asn ser Phe Pro Gin Arg Asp Arg 195 200 Gin 205 Phe Asp ile Gin Cys Leu Ile ΡΓΟ cys Ala ile Asp Asp Pro Tyr 210 215 Gly 220 Ala Arg Met Thr Arg Asp val Ala Pro Arg ile Tyr Pro Lys Pro 225 230 235 Gin Thr 240 Leu Leu His ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gin Gly Ala Lys 245 250 255 Ala Mét ser Ala ser Asp Pro Asn ser ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr 260 265 Ala Phe 270 Gly Lys Gin lie Lys Thr Lys val Asn Lys His ser dy Arg 275 280 285 val Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gin phe Gly Gly Asn cys Asp Asp 290 295 300 68 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe 305 310 Glu Gin ile Arg Lys Asp Tyr Thr 325 Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu val 340 Gin Ala Arg Arg Lys Glu val Thr 355 360 Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp 370 375

Phe Leu Glu ASp Asp ASp Lys Leu Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu 330 335 Leu Gin Pro Leu ile Ala Glu His 345 350 Asp Glu ile val Lys Glu Phe Met Phe Gin <210> 5 <211> 423 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Tyr Lys Ala Ala ς Ala Gly Glu Gly Asn pro Ala 20 j Pro Thr Ser Asn Glu Glu Asp 35 ASP Phe val Asp Pro Trp 40 Ile Gly ile 50 Tyr Asp Lys Leu 55 Asp Lys 65 Glu Leu Ile Asn 70 Arg Ile His His Phe Leu Arg 85 Ala Arg Gly Ile Gin val Leu Asp 100 Tyr Glu Asn Gly Arg Gly 115 pro Ser Ser Glu Ala 120 Phe ile 130 Phe Thr Lys Trp Leu 135 Gin ile Gin 145 Met Thr Asp Asp 150 Glu Lys Asp Gin Ala Tyr ser 165 Tyr Ala val Cys Gly Phe Asp 180 Ser Ile Asn Lys Thr Met Gly Met 195 Thr ser Gly Phe Tyr 200 Lys His val 210 Phe Asn Gin val 215 Asp Cys 225 Ile Gly Lys Ile 230 Ser Phe Phe Ser Asn Ser Phe 245 Pro Gin Ile Cys Leu ile Pro 260 Ala Cys Ala ile ASP Arg Asp val 275 Pro Arg Ile Gly 280 Ser Thr 290 Phe Phe Pro Ala Leu 295 Gin Ser Asp 305 Pro Asn ser ser 310 Ile Phe Lys Thr Lys val Asn 325 Gin Lys His Ala Glu Glu HIS Arg 340 Phe Gly Gly Met Tyr Leu 355 Thr Phe Phe Leu Glu 360 4Γ” 3*0 ASp Tyr Thr Ser Gly 375 Ala Ala Leu 385 ile Glu val Leu 390 Gin pro Arg Lys Glu val Thr 405 Asp Glu ile Lys Leu Ser Phe 420 Asp Phe Gin

Asp Tyr Lys Ala Asp cys Pro pro 10 15 His Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ala 25 30 Thr val Gin Thr Ser Ser Ala Lys 45 val Arg Phe Gly Ser Ser Lys Ile Glu Arg Ala vU Thr Gly Gin Arg Pro 75 80 Phe Phe ser HÍS Arg Asp Met Asn 90 95 Lys Lys pro Phe Tyr Leu Tyr Thr 105 110 Met His val Gly His Leu Ile Pro 125 Asp val Phe Asn val Pro Leu val 140 Tyr Leu Trp Lys ASp Leu Thr Leu 155 160 Glu Asn Ala Lys Asp Ile ile Ala 170 175 Phe ile Phe ser ASp Leu ASP Tyr 185 190 Lys Asn val val Lys ile Gin Lys 205 Gly Ile phe Gly Phe Thr Asp ser 220 ργο Ala Ile Gin Ala Ala Pro Ser 235 240 Phe Arg Asp Arg Thr Asp ile Gin 250 255 Gin Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr 265 270 Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His 285 Gly Ala Gin Thr Lys Met Ser Ala 300 Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gin ile 315 320 Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr ile 330 335 Asn Cys Asp vai Asp vai Ser Phe 345 350 Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gin Ile 365 Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys 380 Leu ile Ala Glu His Gin Ala Arg 395 400 vai Lys Glu Phe Met Thr Pro Arg 410 415 69 ΕΡ 1 935 976/ΡΤ <210> 6 <211> 401 <212> PRT <213> Homo Ser Asn His 1 Pro Trp Thr Leu lie vai 35 Arg ile Glu 50 Gly Ile Phe 65 Glu Asn Lys Glu Ala Met Leu Gin Asp 115 Glu Lys Tyr 130 Ala vai Glu 145 Lys Thr Phe Phe Tyr Lys vai Lys Gly 195 Ser Phe Pro 210 Gin ile Phe 225 ile Asp Gin ile Gly Tyr sapiens Gly Pro A: vai Gin Tl 20 85 100 165 180

Arg Asp Arg Thr Asp Pro 245 pro lvs 260

Leu Gin Gly Ala Gin Thr Lys Met ser 275 , 280 ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala 290 295 His Ala phe ser Gly Gly Arg 305 310 Gly Gly Asn Cys Asp vai Asp Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu 340 „ i Leu Thr Gly Glu 70 150 Ala Thr Glu Ala Glu Glu ASp Phe val ASp 10 15 Ser Ser Ala 2«; Lys Gly ile ASp Tyr an Asp Lys Ser Ser L J Lys Ile Asp Lys Glu Leu ile Asn 40 45 Gly Gin Arg Pro HÍS His Phe Leu Arg Arg 55 60 Arg Asp Met Asn Gin val Leu Asp Ala Tyr 75 80 Tyr Leu Tyr Thr QO Gly Arg Gly Pro Ser QC Ser His Leu ile Pro Phe Ile Phe Thr yj Lys Trp 105 110 Val pro Leu val Ile Gin Met Thr Asp Asp 120 125 Asp Leu Thr Leu Asp Gin Ala Tyr Ser Tyr 135 140 ASP Ile Ile Ala cys Gly Phe Asp Ile Asn ICf) Asp Leu Asp Tyr J.3 J Met Gly Met Ser Ser XQv Gly 170 175 Lys Ile Gin Lys His val Thr Phe Asn Gin 185 190 phe Thr ASP Ser ASp cys ile Gly Lys Ile 200 205 Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe pro 215 220 Ala Thr Asp ile Gin Cys Leu Ile Pro cys 235 240 Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro ICC Arg Ala Leu Leu í 3 v HÍS Ser Thr Phe Phe ΡΓΟ Ala 265 270 Ala ser Lys Gin Ile Lys Asp Thr vai Ser Asn Ser ser

Gly Ala Met 355 Gin Pro Leu 370 Glu ile vai 385 Gin

Ile Ala Glu Hi| Lys Glu Phe Met 390

Glu Gin 345 Leu Lys 360 Gin Ala

Ile Glu 315 Phe Met 330 ile Arg

Thr Pro

Lys Ala Arg Arg Arg Lys 395

Asp Pro 285 Thr Lys 300 Glu His Tyr Leu Lys Asp Leu Ile 365 Lys Glu 380 Leu Ser vai Asn Lys Arg Gin Phe 320 Thr Phe Phe 335 Tyr Thr Ser 350 Glu val Leu vai Thr Asp Phe Asp Phe 400

Lisboa, 2012-05-03

Claims

ΕΡ 1 935 976/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de células na preparação de uma composição farmacêutica para tratar um mamifero em risco de desenvolver ou que sofre de uma doença retinopática, em particular uma retinopatia da prematuridade, em que: a) as células são uma população isolada de células da medula óssea do tipo mielóide, neqativas para linhagem e vasculotrópicas, na qual as células expressam os antigénios CD44 e CDllb; b) as células foram transfectadas com um ácido nucleico que codifica um fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetase (Trp-RS); c) a composição farmacêutica é para administração das referidas células à retina do mamifero numa quantidade eficaz para promover revascularização fisiológica de áreas danificadas da retina e para melhorar os danos à retina causados pela doença.
2. Utilização da reivindicação 1 em que o fragmento angiostático de TrpRS é T2-TrpRS (SEQ ID NO: 3) ou T2-TrpRS-GD (SEQ ID NO: 4).
3. Utilização da reivindicação 1 em que as células compreendem células estaminais hematopoiéticas e células progenitoras endoteliais.
4. Utilização da reivindicação 1 em que as células são produzidas por um método que compreende isolar medula óssea de um mamifero e seleccionar positivamente células da medula óssea que reagem imunitariamente com um anticorpo seleccionado do grupo que consiste de anti-CD44, anti-CDllb e uma sua combinação.
5. Utilização da reivindicação 1 em que o mamifero é um humano.
6. Utilização da reivindicação 1 em que o mamifero é um mamifero infantil. ΕΡ 1 935 976/ΡΤ 2/2
7. Utilização da reivindicação 6 em que o mamífero infantil foi exposto a condições de hiperóxia.
8. Utilização da reivindicação 1 em que a composição farmacêutica é para administração das células por injecção intra-ocular.
9. Utilização da reivindicação 1 em que as células são autólogas para o mamífero a ser tratado.
10. Utilização da reivindicação 1 em que a composição farmacêutica é para administração das células antes do início dos sintomas da doença.
11. Utilização da reivindicação 1 em que a composição farmacêutica é para administração das células antes de expor o mamífero a condições de hiperóxia. Lisboa, 2012-05-03