JP2009261409A

JP2009261409A - 血管形成の調節に有用なトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ由来ポリペプチド

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Publication number: JP2009261409A
Application number: JP2009157410A
Authority: JP
Inventors: Paul Schimmel; ポール・シメール; Keisuke Wakasugi; 桂輔若杉; Martin Friedlander; マーテイン・フリードランダー
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2009-11-12
Anticipated expiration: 2022-02-22
Also published as: CN100486992C; ATE420653T1; DE60230860D1; WO2002067970A1; CA2438273C; CA2438273A1; EP1377305A1; AU2007219318A1; HK1069322A1; JP4448925B2; BR0207449A; EP1377305B1; PL208008B1; US20030017564A1; KR20030078935A; ZA200307383B; MXPA03007586A; IL201755A; JP2004532010A; EP1377305A4

Abstract

【課題】ケモカイン作用があり、研究、診断、予後及び治療用途に有用であり、血管内皮細胞機能の調節、特に血管形成、特に眼内血管新生の阻害に有用であるトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼに由来し、天然に存在するものよりも短いポリペプチドの提供。
【解決手段】トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼに由来する単離形水溶性ポリペプチドは血管形成の阻害に有用である。本ポリペプチドは主にアミノ酸残基配列：

又はその血管形成阻害フラグメントから構成され、単離形ポリペプチドは約４５キロダルトン以下の寸法である、本ポリペプチドの使用方法。
【選択図】なし

Description

本発明は短縮ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドを含む組成物と、前記短縮ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドをコードする核酸に関する。このような組成物の製造及び使用方法も開示する。

ｔＲＮＡ分子のアミノアシル化を触媒するアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは翻訳プロセス中に遺伝情報をデコードするのに不可欠な古典的タンパク質である。高等真核生物では９種のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが少なくとも３種の他のポリペプチドに会合して超分子多酵素複合体を形成する（Ｍｉｒａｎｄｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７：２８１−８９（１９８５））。真核ｔＲＮＡシンテターゼは、ｔＲＮＡシンテターゼの原核対応物に密接に関連するコア酵素と、このコア酵素のアミノ末端又はカルボキシル末端に付加した付加ドメインから各々構成される（Ｍｉｒａｎｄｅ，Ｐｒｏｇ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：９５−１４２（１９９１））。

殆どの場合、付加ドメインは多酵素複合体の結合に寄与すると思われる。しかし、付加ドメインの存在はシンテターゼと多酵素複合体の会合には厳密に相関していない。

哺乳動物ＴｒｐＲＳ分子はアミノ末端付加ドメインをもつ。正常ヒト細胞では、全長分子（配列番号１のアミノ酸残基１〜４７１）から構成される大きい形態と、小さい短縮形態（「ミニＴｒｐＲＳ」；配列番号３のアミノ酸残基１〜４２４）の２形態のＴｒｐＲＳを検出することができる。小さい形態はプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを介してアミノ末端ドメインの欠失により作製される（Ｔｏｌｓｔｒｕｐら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３９７−４０３（１９９５））。ミニＴｒｐＲＳのアミノ末端は全長ＴｒｐＲＳ分子の４８位の「ｍｅｔ」残基であることが決定されている（同上）。あるいは、タンパク分解により短縮ＴｒｐＲＳを作製することもできる（Ｌｅｍａｉｒｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１：２３７−５２（１９７５））。例えば、ウシＴｒｐＲＳは膵臓で高度に発現され、膵液に分泌され（Ｋｉｓｓｅｌｅｖ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ７５：１０２７−３９（１９９３））、その結果、短縮ＴｒｐＲＳ分子が生産される。以上の結果は短縮ＴｒｐＲＳがｔＲＮＡのアミノアシル化以外の機能をもち得ることを示唆している（同上）。

血管形成即ち既存血管からの新しい毛細血管の増殖は胚発生、後続成長及び組織修復に必要な基本プロセスである。血管形成は血管樹の発生分化と広範な基礎生理プロセス（例えば胚形成、体細胞成長、組織と臓器の修復と再生、黄体と子宮内膜の周期的増殖、及び神経系の発生分化）の前提条件である。雌生殖系では妊娠の設定と維持のために発生中の卵胞、排卵後の黄体及び胎盤で血管形成が起こる。更に、例えば創傷や骨折の治癒のような身体修復プロセスの一部としても血管形成が起こる。腫瘍が増殖するためには新しい毛細血管の増殖を連続的に刺激する必要があるので血管形成は腫瘍増殖にも関与する。血管形成はヒト固形癌の増殖の主要部分でもあり、異常な血管形成は関節リウマチ、乾癬及び糖尿病性網膜症等の他の疾患にも関連している（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．とＫｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：４４２−４４７（１９８７））。

数種の因子が血管形成に関与している。酸性及び塩基性繊維芽細胞増殖因子はいずれも内皮細胞及び他の細胞種のマイトジェンである。アンジオトロピンとアンジオテンシンは血管形成を誘導するらしいが、その機能は不明である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，ＣａｎｃｅｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．１５３−１７０，ＬｅａａｎｄＦｅｂｉｇｅｒＰｒｅｓｓ（１９９３））。血管内皮細胞に高度に選択性のマイトジェンは血管内皮細胞増殖因子即ちＶＥＧＦである（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，ら，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３：１９−３２（１９９２））。

失明に至る大多数の疾患は眼内血管新生に起因し、６５歳以上の１２００〜１５００万人の米国人が加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）にかかり、そのうち１０〜１５％が脈絡膜（網膜下）血管新生の直接結果として視力障害を併発している。６５歳以下の米国人では視力障害の主因は糖尿病であり、米国では１６００万人が糖尿病にかかり、年間４００００人が疾患の眼科合併症を併発しており、その多くの原因が網膜血管新生である。危険度の高い糖尿病患者群で重度視力障害を予防するにはレーザー光凝固が有効であったが、１０年間の総網膜症発生率は実質的に変わっていない。ＡＲＭＤ又は眼ヒストプラスマ症等の炎症性眼疾患による脈絡膜血管新生患者には、光凝固は少数の例外を除いて視力障害の予防に無効である。最近開発された非破壊的光線力学療法は従来治療できなかった脈絡膜血管新生患者数を一時的に減らすのに期待できるが、３〜４カ月おきに治療して視力が改善又は安定した患者はプラシーボ治療群の４５．９％に比較して６１．４％に止まっている。

正常成人では血管形成は厳密に調節され、創傷治癒、妊娠及び子宮周期に制限される。血管形成は塩基性及び酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオテンシン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の特定血管形成分子により刺激される。血管形成はインターフェロンα、トロンボトポンジン−１、アンジオスタチン及びエンドスタチン等の阻害分子により抑制することができる。これらの天然刺激剤と阻害剤のバランスにより正常休止毛細血管系が調節される。所定疾患状態のようにこのバランスが崩れると、毛細血管内皮細胞が増殖し、移動し、最終的に分化する。

血管形成は癌や眼内血管新生を含む種々の疾患に中心的な役割を果たす。種々の腫瘍の持続的増殖と転移も新しい宿主血管が腫瘍由来血管形成因子に反応して腫瘍に成長するためであることが分かっている。大半の眼疾患と失明の主要知見（例えば増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、ＡＲＭＤ、血管新生緑内障、間質性角膜炎及び早期網膜症）でも種々の刺激に反応して新血管の増殖が生じている。これらの疾患では、組織損傷が血管形成因子の放出を刺激する結果、毛細血管増殖を生じると考えられる。ＶＥＧＦは虹彩血管新生と血管新生網膜症に主要な役割を果たす。眼内ＶＥＧＦ値と虚血性網膜症眼内血管新生の相関は明確に報告されているが、ＦＧＦが関与している可能性もある。正常成人網膜に塩基性及び酸性ＦＧＦが存在することは知られているが、検出可能な濃度が常に血管新生と相関している訳ではない。これは主にＦＧＦが細胞外マトリックスの荷電成分に非常に密接に結合し、眼液の標準アッセイで検出される自由に拡散可能な形態では容易に得られないためであると思われる。

血管形成反応の一般的な最終経路の１つは増殖中の血管内皮細胞と細胞外マトリックスの間でインテグリンに媒介される情報交換である。インテグリンと呼ばれるこの類の接着受容体は全細胞上でα及びβサブユニットをもつヘテロダイマーとして発現される。このようなインテグリンの１例であるα_ｖβ_３はこのファミリーの最も相手を選ばないメンバーであり、内皮細胞を多種多様な細胞外マトリックス成分と相互作用させる。このインテグリンのペプチド及び抗体アンタゴニストは増殖中の血管内皮細胞のアポトーシスを選択的に誘導することにより血管形成を阻害する。２つのサイトカイン依存性血管形成経路が存在し、別個の血管細胞インテグリンα_ｖβ_３及びα_ｖβ_５への依存性により定義することができる。特に、各インテグリンの抗体アンダコニストはウサギ角膜及びニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデルでこれらの血管形成経路の一方を選択的に阻害するので、塩基性ＦＧＦ及びＶＥＧＦにより誘導される血管形成は夫々インテグリンα_ｖβ_３及びα_ｖβ_５に依存する。全αインテグリンを阻害するペプチドアンタゴニストはＦＧＦ及びＶＥＧＦの刺激による血管形成を阻害する。正常ヒト眼内血管はインテグリンα_ｖβ_３及びα_ｖβ_５のどちらも示さないが、活性な血管新生眼疾患患者からの組織ではこれらのインテグリンが血管上に選択的に示される。ＡＲＭＤ患者からの組織には常にα_ｖβ_３しか観察されないが、ＰＤＲ患者からの組織にはα_ｖβ_３及びα_ｖβ_５の両者が存在する。インテグリンのペプチドアンタゴニストを全身投与すると、マウス網膜血管形成モデルで新規血管形成が阻止された。

Ｍｉｒａｎｄｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７：２８１−８９（１９８５）Ｍｉｒａｎｄｅ，Ｐｒｏｇ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：９５−１４２（１９９１）Ｔｏｌｓｔｒｕｐら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３９７−４０３（１９９５）Ｌｅｍａｉｒｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１：２３７−５２（１９７５）Ｋｉｓｓｅｌｅｖ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ７５：１０２７−３９（１９９３）Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．とＫｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：４４２−４４７（１９８７）Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，ＣａｎｃｅｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．１５３−１７０，ＬｅａａｎｄＦｅｂｉｇｅｒＰｒｅｓｓ（１９９３）Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，ら，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３：１９−３２（１９９２）

従って、抗血管形成剤は網膜変性の治療でこれらの栄養及び増殖因子の有害作用を防ぐ機能がある。血管形成剤は細胞への血流を増すことにより望ましい脈管新生を促進して網膜変性を抑制する機能もある。

トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼに由来し、天然に存在するものよりも短いポリペプチドはケモカイン作用があり、研究、診断、予後及び治療用途に有用である。１態様では、これらのｔＲＮＡシンテターゼ由来ポリペプチドは血管内皮細胞機能の調節、特に血管形成、特に眼内血管新生の阻害に有用である。

これらの短縮トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ由来ポリペプチドはアミノ末端が短縮しているが、ロスマンフォールドヌクレオチド結合ドメインを含むことができる。これらのポリペプチドは血管内皮細胞機能を調節することができる。

好ましい短縮トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ由来ポリペプチドとしては、配列番号１のアミノ酸残基９６〜４７１から構成されるポリペプチドとその血管形成阻害フラグメント、特に配列番号１０及び配列番号１１に示すシグナチャー配列の間のフラグメント又はこれらのシグナチャー配列の少なくとも一方を含むフラグメントが挙げられる。１好適態様では、短縮ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。

別の態様では、本発明は配列番号６のポリヌクレオチド、配列番号６のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、配列番号７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号７のポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号７のポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドから構成される群から選択されるポリヌクレオチドの配列に少なくとも９５％一致するヌクレオチド配列をもつ単離形ポリヌクレオチドに関する。本発明は上記トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ由来ポリペプチドの任意のものをコードする単離形核酸分子を含む組換え発現ベクターにも関する。別の態様はこのような組換え発現ベクターを含む宿主細胞である。

本発明は更に短縮トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ由来ポリペプチドと医薬的に適切な賦形剤を含む組成物及び製剤を提供する。このような組成物は眼内（例えば硝子体内、網膜下等）及び全身投与（例えば経皮、経粘膜、腸管又は腸管外投与）に適している。

別の態様では、本発明は血管形成阻害量の上記ポリペプチドと適切な生理的に適合可能な賦形剤又はキャリヤーを投与することにより、加齢黄斑変性、糖尿病眼合併症、血管新生緑内障、早期網膜症、角膜炎、虚血性網膜症（例えば鎌状細胞）、病的近視、眼ヒストプラスマ症、翼状片、点状内部脈絡膜症等の血管新生眼疾患を治療する方法を提供する。

トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドのアミノ酸残基配列（配列番号１）を示し、短縮形（配列番号１のアミノ酸残基配列９４〜４７１）に含まれるシグナチャー配列（配列番号１０及び配列番号１１）を囲みの中に示す。マウスモデルにおける網膜血管発生を示す顕微鏡写真。実施例３に報告したデータのグラフ。実施例４に報告したデータのグラフ。マウスモデルの網膜におけるＴｒｐＲＳのフラグメント（Ｔ２）の結合局在を示す顕微鏡写真。

定義
「短縮ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド」とは対応する全長ｔＲＮＡシンテターゼよりも短いポリペプチドを意味する。

「ＴｒｐＲＳ」とはトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼを意味する。

「細胞培養液」とは培地と培養細胞の両者を包含する。

「細胞培養液からポリペプチドを単離する」なる表現は培地から可溶性又は分泌ポリペプチドを単離することと、培養細胞から膜内在性タンパク質を単離することを包含する。

「細胞抽出液」は培地、特に細胞を取出した後の廃培地を含む。目的ＤＮＡ又はタンパク質を含有する細胞抽出液は目的タンパク質を発現するか又は目的ＤＮＡを含む細胞から得られる均質調製物又は無細胞調製物を意味すると理解すべきである。

「プラスミド」は自律性自己複製染色体外ＤＮＡ分子であり、小文字「ｐ」とその前及び／又は後に大文字及び／又は数字で表す。本明細書に記載する出発プラスミドは公に無制限に得られる市販品でもよいし、文献記載の方法に従って市販プラスミドから構築してもよい。更に、記載するプラスミドに等価のプラスミドも当分野で公知であり、当業者に自明である。

ＤＮＡの「消化」とはＤＮＡ中の所定配列のみに作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを意味する。本明細書で使用する種々の制限酵素は市販されており、その反応条件、補因子及び他の要件は当業者に公知の通りに使用した。分析目的では、一般にプラスミド又はＤＮＡフラグメント１μｇを緩衝液約２０μｌ中で酵素約２単位と使用する。プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する目的では、一般にＤＮＡ５〜５０μｇをもっと多い容量中で酵素２０〜２５０単位で消化する。特定制限酵素に適した緩衝液と基質の量は製造業者に指定されている。通常は３７℃で約１時間のインキュベーション時間を使用するが、製造業者の指示に従って変動できる。消化後に反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動させ、所望フラグメントを単離する。種々のＤＮＡ及びＲＮＡフラグメントに存在するヌクレオチドを本明細書では当分野で使用されている標準一文字表記（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）で表す。

本発明の１態様である「ポリヌクレオチド」はＲＮＡ形態でもＤＮＡ形態でもよく、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは２本鎖でも１本鎖でもよく、１本鎖の場合にはコーディング鎖でも非コーディング（アンチセンス）鎖でもよい。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は配列番号６に示すコーディング配列と同一でもよいし、遺伝コードの冗長又は縮重の結果として配列番号７に示す同一成熟ポリペプチド配列をコードする別のコーディング配列でもよい。

「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語はポリペプチドのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチドと、付加コーディング及び／又は非コーディング配列を加えたポリヌクレオチドを包含する。

「オリゴヌクレオチド」とは化学的に合成可能な１本鎖ポリヌクレオチド又は２本の相補的ポリヌクレオチド鎖を意味する。このような合成オリゴヌクレオチドは５’リン酸をもたないので、キナーゼの存在下にリン酸とＡＴＰを加えないと別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸されていないフラグメントに連結する。

「アミノ酸残基」とはポリペプチドを構成するアミノ酸を意味する。本明細書に記載するアミノ酸残基はＬ”異性形が好ましい。しかし、所望機能特性がポリペプチドに維持される限り、任意Ｌアミノ酸残基をＤ”異性形残基に置換してもよい。ＮＨ_２はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を意味する。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に記載され、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２に公認されている標準ポリペプチド命名法に従い、アミノ酸残基の略称を下表に示す。

本明細書に式で表す全アミノ酸残基配列は慣例通り、左から右に向かってアミノ末端からカルボキシル末端である。更に、「アミノ酸残基」なる用語は表１に記載するアミノ酸だけでなく、参考資料として本明細書に組込む３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２に記載されているような改変及び特殊アミノ酸も含むものとして広義に定義される。アミノ酸残基配列の先頭と末尾のダッシュは１個以上のアミノ酸残基からなる付加配列又はＮＨ_２等のアミノ末端基又はＣＯＯＨ等のカルボキシル末端基とのペプチド結合を示す。

ペプチド又はタンパク質ではアミノ酸の適切な保存置換が当業者に公知であり、一般に置換後の分子の生理活性を変えずに可能である。当業者に自明の通り、一般にポリペプチドの非必須領域の単一アミノ酸置換は生理活性を実質的に変えない（例えばＷａｔｓｏｎら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ，第４版，１９８７，ＴｈｅＢｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕｍｍｉｎｇｓＰｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４参照）。

このような置換は下表２の記載に従うことが好ましい。

他の置換も許容可能であり、経験又は公知保存置換に従って決定することができる。

「相補プラスミド」とは細胞ゲノム内の染色体に安定に組込むためのパッケージング細胞株に核酸を送達するプラスミドベクターを意味する。

「送達プラスミド」とは治療遺伝子又は治療物質もしくはその前駆物質をコードする遺伝子又は調節遺伝子又はｉｎｖｉｖｏもしくは細胞株（例えばパッケージング細胞株が挙げられるが、これに限定されない）に送達すると治療効果を生じて治療ウイルスベクターを増殖する他の因子をコードする核酸を輸送又は送達するプラスミドベクターである。

本明細書には種々のベクターを記載する。例えば、あるベクターは染色体に安定に組込むためのパッケージング細胞株に特定核酸分子を送達するために使用される。この種のベクターを本明細書では一般に相補プラスミドと呼ぶ。本明細書に記載する別種のベクターは治療ウイルスベクターを増殖させる目的で核酸分子を細胞株（例えばパッケージング細胞株）に輸送又は送達するものであり、これらのベクターを本明細書では一般に送達プラスミドと呼ぶ。本明細書に記載する第３「種」のベクターは治療を必要とする対象の特定細胞又は細胞種に治療タンパク質もしくはポリペプチド又は調節タンパク質もしくは調節配列をコードする核酸分子を輸送するために使用され、これらのベクターを本明細書では一般に治療ウイルスベクター又は組換えアデノウイルスベクター又はウイルスＡｄ由来ベクターと呼び、治療遺伝子を発現させるための発現カセットを含むウイルス核酸を封入したウイルス粒子の形態である。

「ＤＮＡ又は核酸ホモログ」とは治療ポリペプチドをコードする配列等の予め選択された保存ヌクレオチド配列を含む核酸を意味する。「実質的に相同」なる用語は相同度が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％であるか、又は相同度もしくは一致度百分率は前記よりも低いが、生理活性又は機能が保存されていることを意味する。

「相同度」及び「一致度」なる用語は同義に使うことが多い。ここで、相同度又は一致度は例えばＧＡＰコンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することにより決定することができる。ＧＡＰプログラムはＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアラインメント法をＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の変法に従って利用している。要約すると、ＧＡＰプログラムは類似する整列記号（即ちヌクレオチド又はアミノ酸）の数を２つの配列の短いほうの合計記号数で割った数として類似度を定義する。ＧＡＰプログラムの好適デフォルトパラメーターは（１）（一致に１、不一致に０の値を含む）単項比較マトリックスと、ＳｃｈｗａｒｔｚとＤａｙｈｏｆｆ編，ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載されているようなＧｒｉｂｓｋｏｖとＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス、（２）各ギャップに３．０のペナルティと各ギャップの各記号に追加０．１０ペナルティ、（３）末端ギャップにペナルティなしを含むことができる。任意２つの核酸分子が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％「一致する」ヌクレオチド配列をもつか否かは例えばＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）に記載されているようなデフォルトパラメーターを使用して「ＦＡＳＴＡ」プログラム等の公知コンピューターアルゴリズムを使用して決定することができる。あるいは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベースのＢＬＡＳＴ関数を使用して一致度を決定することもできる。一般に、最高位マッチが得られるように配列を整列する。「一致度」自体は当業者に一般に認められている通りの意味であり、文献記載の方法を使用して計算することができる。（例えばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９９３）；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ，ＰａｒｔＩ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，（１９９４）；ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，（１９８７）；及びＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ，ＭＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９９１）参照）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の一致度を測定する方法は多数存在するが、「一致度」なる用語は当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．４８：１０７３（１９８８））。２つの配列間の一致度又は類似度を決定するために一般に使用されている方法としては、ＭａｒｔｉｎＪ．Ｂｉｓｈｏｐ編，ＧｕｉｄｅｔｏＨｕｇｅＣｏｍｐｕｔｅｒｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，（１９９４）やＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法が挙げられるが、これらに限定されない。一致度及び類似度を決定する方法はコンピュータープログラムで体系化されている。２つの配列間の一致度及び類似度を決定するための好適コンピュータープログラム法としてはＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２（Ｉ）：３７４（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））が挙げられるが、これらに限定されない。

「一致度」なる用語は試験ポリペプチド又はポリヌクレオチドと参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの比較を表す。例えば、参照ポリペプチドと９０％以上一致する任意ポリペプチドとして試験ポリペプチドを定義することができる。本明細書で使用する少なくとも「９０％一致」なる用語は参照ポリペプチドに対して９０〜９９．９９％の一致度百分率を意味する。９０％以上の一致度は、例えば１００アミノ酸長の試験ポリペプチドと参照ポリヌクレオチドを比較した場合に試験ポリペプチドと参照ポリペプチドの相違が１０％（即ちアミノ酸１００個のうちの１０個）以下であることを示す。同様の比較を試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドの間で行うことができる。このような相違はアミノ酸配列の完全長にわたってランダムに分配された点突然変異でもよいし、最大許容差（例えば１０／１００アミノ酸差（約９０％一致度））までの変動長の１以上の位置に群発していてもよい。相違は核酸又はアミノ酸置換又は欠失として定義される。

「遺伝子治療」及び「遺伝子療法」なる用語はこのような治療を要する疾患又は状態をもつ哺乳動物、特にヒトの所定細胞、標的細胞への異種ＤＮＡの導入を意味する。異種ＤＮＡが発現され、このＤＮＡにコードされる治療物質が生産されるように異種ＤＮＡを選択標的細胞に導入する。あるいは、異種ＤＮＡは治療物質をコードするＤＮＡの発現を何らかの方法で媒介するものでもよいし、治療物質の発現を直接又は間接的に何らかの方法で媒介する物質（例えばペプチド又はＲＮＡ）をコードするものでもよい。遺伝子療法は遺伝子産物をコードする核酸で欠損遺伝子を置換するため又は前記核酸を導入する哺乳動物又は細胞により生産される遺伝子産物を補充するためにも使用できる。導入する核酸は通常は哺乳動物宿主で生産されないか又は治療上有効な量もしくは治療上有用な時点で生産されない治療化合物（例えば増殖因子もしくはその阻害剤又は腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤又はその受容体）をコードするものでもよい。治療物質をコードする異種ＤＮＡは治療物質又はその発現を強化又は他の方法で改変するために疾患宿主の細胞に導入する前に修飾してもよい。

「異種ＤＮＡ」はこのＤＮＡを発現させる細胞が通常はｉｎｖｉｖｏで生産しないＲＮＡ及びタンパク質をコードするＤＮＡでもよいし、転写、翻訳又は他の調節可能な生化学プロセスに作用することにより内在ＤＮＡの発現を改変するメディエーターを媒介又はコードするＲＮＡ及びタンパク質をコードするＤＮＡでもよい。異種ＤＮＡは外来ＤＮＡと言うこともできる。ＤＮＡを発現させる細胞に対して異種又は外来であると当業者に認識又は判断される任意ＤＮＡを本明細書では異種ＤＮＡに包含する。異種ＤＮＡの例としては、追跡可能なマーカータンパク質（例えば薬剤耐性を付与するタンパク質）をコードするＤＮＡ、治療上有効な物質（例えば抗癌剤、酵素及びホルモン）をコードするＤＮＡ、及び他の種のタンパク質（例えば抗体）をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。異種ＤＮＡによりコードされる抗体は異種ＤＮＡを導入した細胞の表面に分泌又は発現させることができる。従って、「異種ＤＮＡ」又は「外来ＤＮＡ」とは対応する野生型アデノウイルスに存在する対応するＤＮＡ分子と全く同一の方向と位置には存在しないＤＮＡ分子を意味する。別の生物もしくは種（即ち外因性）又は別のＡｄ血清型からのＤＮＡ分子を意味する場合もある。

「治療上有効なＤＮＡ産物」とは、ＤＮＡを宿主に導入すると、遺伝性もしくは後天性疾患の症状、徴候を有効に改善もしくは解消するか又は前記疾患を治癒する物質が発現されるように異種ＤＮＡによりコードされる物質である。一般に、所望異種ＤＮＡをコードするＤＮＡをプラスミドベクターにクローニングし、リン酸カルシウムによるＤＮＡ取込み又はマイクロインジェクション等の日常的方法により産生細胞（例えばパッケージング細胞）に導入する。産生細胞で増幅後に異種ＤＮＡを含むベクターを選択標的細胞に導入する。

「発現又は送達ベクター」とは適切な宿主細胞で発現させるため、即ちＤＮＡによりコードされるタンパク質又はポリペプチドを宿主細胞系で合成するために外来又は異種ＤＮＡを挿入することができる任意プラスミド又はウイルスを意味する。１種以上のタンパク質をコードするＤＮＡセグメント（遺伝子）の発現を誘導することが可能なベクターを本明細書では「発現ベクター」と言う。逆転写酵素を使用して生産されたｍＲＮＡからｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）をクローニングするためのベクターも含む。

「遺伝子」はそのヌクレオチド配列がＲＮＡ又はポリペプチドをコードする核酸分子である。遺伝子はＲＮＡでもＤＮＡでもよい。遺伝子はコーディング領域の前後の領域（リーダー及びトレーラー）と、各コーディングセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含んでいてもよい。

核酸分子、ポリペプチド又は他の生体分子について「単離形」と言う場合には、核酸又はポリペプチドがポリペプチド又は核酸を獲得した遺伝環境から分離していることを意味する。天然状態からの改変を意味する場合もある。例えば、本明細書で使用する用語によると、生きた動物に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離」形ではないが、その天然状態の共存物質から分離された同一ポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離」形である。従って、組換え宿主細胞内で生産されるか及び／又は組換え宿主細胞に含まれるポリペプチド又はポリヌクレオチドは単離形とみなす。組換え宿主細胞又は天然源から部分的又は実質的に精製されたポリペプチド又はポリヌクレオチドも「単離形ポリペプチド」又は「単離形ポリヌクレオチド」とみなす。例えば、化合物の組換え生産物はＳｍｉｔｈとＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ６７：３１−４０（１９８８）に記載されている１段階法により実質的に精製することができる。「単離」及び「精製」なる用語は同義に使用する場合もある。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部でもよいし、及び／又はこのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部でもよく、このようなベクター又は組成物はその天然環境を構成しないのでやはり単離形と言える。

「単離形ポリヌクレオチド」とは、核酸が（仮に存在するとして）生物の天然ゲノムで目的核酸をコードする遺伝子のすぐ両側の遺伝子のコーディング配列をもたないことを意味する。単離形ＤＮＡは１本鎖でも２本鎖でもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えハイブリッドＤＮＡ又は合成ＤＮＡのいずれでもよい。天然ＤＮＡ配列と同一でもよいし、１個以上のヌクレオチドの欠失、付加又は置換によりこのような配列と相違していてもよい。

生体細胞又は宿主から作製した調製物について「単離」又は「精製」と言う場合には、指定ＤＮＡ又はタンパク質を含有する任意細胞抽出液を意味し、目的ＤＮＡ又はタンパク質の粗抽出液を含む。例えばタンパク質の場合には、個々の操作又は一連の調製もしくは生化学操作後に精製調製物を得ることができ、目的ＤＮＡ又はタンパク質はこれらの調製物に種々の純度で存在し得る。手法としては硫安分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度勾配遠心分離及び電気泳動を挙げることができるが、これらに限定されない。

「実質的に純粋」であるか又は「単離」形のＤＮＡ又はタンパク質調製物とは、このようなＤＮＡ又はタンパク質が通常天然に会合している天然物質を含まない調製物を意味する。「ほぼ純粋」とは少なくとも９５％の目的ＤＮＡ又はタンパク質を含む「高度に」精製された調製物を意味すると理解すべきである。

「パッケージング細胞株」は欠失遺伝子産物又はその等価物を提供する細胞株である。

「アデノウイルス粒子」はウイルスの最小構造又は機能単位である。ウイルスは単粒子、粒子ストック又はウイルスゲノムを意味することができる。アデノウイルス（Ａｄ）粒子は比較的複雑で種々のサブ構造に分解することができる。

「転写後調節エレメント（ＰＲＥ）」はスプライスされてない即ちイントロンなしのメッセージであるウイルス又は細胞メッセンジャーＲＮＡに存在する調節エレメントである。例えばヒト肝炎ウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルス、ＴＫ遺伝子及びマウスヒストン遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＲＥはポリＡ配列の前で異種ＤＮＡ配列の後に配置することができる。

「シュードタイピング」とはベクター自体の血清型とは異なる血清型に由来する１種以上の改変キャプシドタンパク質をもつアデノウイルスベクターの生産を意味する。１例はＡｄ３７繊維タンパク質を含むアデノウイルス５ベクター粒子の生産である。これは種々の繊維タンパク質を発現するパッケージング細胞株でアデノウイルスベクターを生産することにより実施することができる。

「本発明の該当プロモーター」は誘導型でも構成型でもよい。誘導型プロモーターは付加分子の存在下でしか転写を開始せず、構成型プロモーターは遺伝子発現の調節に付加分子の存在を必要としない。ＲＮＡポリメラーゼ結合及び開始率又は程度が外部刺激により調節される場合には調節又は誘導型プロモーターもプロモーターと言うことができる。このような刺激は種々の化合物又は組成物、光、熱、ストレス及び化学エネルギー源等であるが、これらに限定されない。誘導、抑圧及び抑制型プロモーターは調節プロモーターとみなす。本発明で好ましいプロモーターは眼細胞、特に光受容細胞で選択的に発現されるプロモーターである。

「受容体」とは他の分子と特異的に結合する生体活性分子を意味する。「受容体タンパク質」なる用語は特定受容体のタンパク性をより厳密に示すために使用することができる。

「組換え」とは遺伝子組換えの結果として形成される任意子孫を意味する。これはパッケージング細胞でプラスミドの組換えにより形成されるウイルスを表すためにも使用することができる。

「トランスジーン」又は「治療核酸分子」はＲＮＡ又はポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ分子を含む。このような分子は「天然」又は天然由来配列でもよいし、天然又は組換え由来の「非天然」又は「外来」でもよい。「トランスジーン」なる用語は本明細書では「治療核酸分子」と同義に使用することができ、ウイルスベクターにより輸送されて宿主細胞に導入される異種又は外来（外因性）遺伝子を表すために使用することが多い。治療ヌクレオチド核酸分子はアンチセンス配列又はアンチセンス配列に転写可能なヌクレオチド配列を含む。全治療ヌクレオチド配列（又はトランスジーン）は前記治療配列を送達する細胞又は細胞核で所望効果を生じるように機能する核酸分子を含む。例えば、治療核酸分子は機能タンパク質を生産することができない細胞に送達するための機能タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

「硝子体」とは水晶体の後方の室を満たす物質（即ち硝子体液又は硝子体）を意味する。

「プロモーター領域」とはこの領域と作動的に連結されたＤＮＡの転写を調節する遺伝子のＤＮＡ部分を意味する。プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼ認識、結合及び転写開始に十分な特定ＤＮＡ配列を含む。プロモーター領域のこの部分をプロモーターと言う。更に、プロモーター領域はこのＲＮＡポリメラーゼ認識、結合及び転写開始活性を調節する配列を含む。これらの配列はシス作用型でもよいし、トランス作用因子に反応性のものでもよい。プロモーターは調節の種類に応じて構成型でもよいし、調節型でもよい。

「作動的に連結」とは１つのセグメント上の調節配列が他のセグメントの発現又は複製等を調節するように配列又はセグメントが（１本鎖でも２本鎖でもよい）ＤＮＡの１片に共有結合していることを意味する。但し、２つのセグメントは必ずしも隣接していなくてもよい。

「パッケージ」とは本発明のポリペプチド、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を一定区域内に保持することが可能なガラス、プラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレン又はポリカーボネート）、紙、箔等の固体マトリックス又は材料を意味する。従って、例えばパッケージはｍｇ量の所期ポリペプチドを収容するために使用するガラスバイアルでもよいし、夫々抗体又は抗原に免役学的に結合できるようにμｇ量の所期ポリペプチド又は抗体を作動的に固定（即ち結合）したマイクロタイタープレートウェルでもよい。

「使用説明書」は一般に試薬濃度又は少なくとも１つのアッセイ方法パラメーター（例えば混合する試薬と試料の相対量、試薬／試料混合物の保持時間、温度、緩衝液条件等）を記載した有形文書を含む。

本発明の関連で「診断システム」は本発明のポリペプチド又は抗体分子を含む免役複合体の形成を示すことが可能な標識又は指示手段も含む。

本明細書で使用する「複合体」とは抗体−抗原又は受容体−リガンド反応等の特異的結合反応の生成物を意味する。複合体の例は免役反応物である。

各種文法形で記載する「標識」及び「指示手段」は複合体の存在を示すための検出可能なシグナルの発生に直接又は間接的に関与する単原子又は分子を意味する。本発明の抗体又はモノクローナル抗体組成物を構成する発現タンパク質、ポリペプチド又は抗体分子に任意標識又は指示手段を結合又は組込むことができ、あるいは別に使用してもよく、これらの原子又は分子は単独で使用してもよいし、付加試薬と併用してもよい。このような標識自体は臨床診断化学で周知であり、他の点で新規なタンパク質、方法及び／又は系と併用する場合のみに本発明を構成する。

考察
図１に配列番号１のアミノ酸残基９４〜４７１（例えば配列番号１２）として示すポリペプチド及び配列番号７のアミノ酸配列をもつポリペプチド又は配列番号６のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドは本発明を構成する。本発明は上記ポリペプチドの変異体とポリヌクレオチドの変異体にも関する。ポリヌクレオチド変異体はポリヌクレオチドの天然対立遺伝子変異体でもポリヌクレオチドの非天然変異体でもよい。従って、本発明は配列番号７、配列番号１２に示すと同一のポリペプチド及び配列番号６のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号７及び配列番号１２のポリペプチドの血管形成阻害フラグメント、誘導体又は類似体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体に関する。このようなヌクレオチド変異体としては欠失変異体、置換変異体及び付加又は挿入変異体が挙げられる。

上述のように、ポリヌクレオチドは配列番号６に示すコーディング配列の天然対立遺伝子変異体であるコーディング配列をもつことができる。当分野で公知のように、対立遺伝子変異体はコードされるポリペプチドの機能を実質的に変えずに１個以上のヌクレオチドを置換、欠失又は付加したポリヌクレオチド配列の代替形である。

本明細書で使用するＴ１なる用語は配列番号１３のアミノ酸配列をもつポリペプチドと、配列番号５のアミノ酸配列をもつＨｉｓ_６タグ付きポリペプチドの両者を意味する。本明細書で使用するＴ２なる用語は配列番号１２のアミノ酸配列をもつポリペプチドと、配列番号７のアミノ酸配列をもつＨｉｓ_６タグ付きポリペプチドの両者を意味する。本明細書で使用するＴｒｐＲＳなる用語は配列番号１の残基１〜４７１のアミノ酸配列をもつポリペプチドと、配列番号１のアミノ酸配列をもつＨｉｓ_６タグ付きポリペプチドの両者を意味する。

本発明は宿主細胞からのポリペプチドの発現と分泌を助長するポリヌクレオチド（例えば細胞からのポリペプチドの輸送を調節するための分泌配列として機能するリーダー配列）に成熟ポリペプチドのコーディング配列を同一読み枠で融合できるポリヌクレオチドにも関する。リーダー配列をもつポリペプチドはプレタンパク質であり、宿主細胞により開裂されるとポリペプチドの成熟形を形成するリーダー配列をもつことができる。ポリヌクレオチドは５’アミノ酸残基を付加した成熟タンパク質であるプロタンパク質をコードすることもできる。プロ配列をもつ成熟タンパク質はプロタンパク質であり、タンパク質の不活性形である。プロ配列を開裂すると活性成熟タンパク質が残る。

従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質又はプロ配列をもつタンパク質又はプロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両者をもつタンパク質をコードすることができる。

本発明のポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレーム融合したコーディング配列をもつこともできる。マーカー配列は細菌宿主の場合にはマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を可能にするためにｐＱＥ−９ベクターにより提供されるヘキサヒスチジンタグとすることができ、あるいは例えば哺乳動物宿主（例えばＣＯＳ−７細胞）を使用する場合にはマーカー配列はヘマグルチニン（ＨＡ）タグとすることができる。ＨＡタグはインフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．，ら，Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））。

本発明は更に配列間に少なくとも５０％、好ましくは７０％の一致度が存在する場合に上記配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドにも関する。本発明は特に上記ポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用する「ストリンジェント条件」なる用語は配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の一致度が存在する場合のみにハイブリダイゼーションが起こることを意味する。１好適態様で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドは配列番号６のｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生理機能又は活性を保持するポリペプチドをコードする。

配列番号７、配列番号１２のポリペプチド又は配列番号６のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関して「フラグメント」、「誘導体」及び「類似体」と言う場合には、これらのポリペプチドと実質的に同一の抗血管形成（即ち血管形成阻害）機能又は活性を保持するポリペプチド部分を意味する。従って、「類似体」はプロタンパク質部分の開裂により活性化されると抗血管形成活性成熟ポリペプチドを生産することができるプロタンパク質を含む。

本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドでも、天然ポリペプチドでも、合成ポリペプチドでもよいが、組換えポリペプチドが好ましい。

配列番号７、配列番号１２のポリペプチド又は配列番号６のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの血管形成阻害フラグメント、誘導体又は類似体は（ｉ）アミノ酸残基の１個以上を保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換したものでもよく、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるものでもされないものでもよく、（ｉｉ）アミノ酸残基の１個以上が置換基を含むものでもよいし、（ｉｉｉ）ポリペプチドの半減期を増すための化合物（例えばポリエチレングリコール）等の別の化合物にポリペプチドを融合したものでもよいし、（ｉｖ）リーダーもしくは分泌配列又はポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列等の付加アミノ酸をポリペプチドに融合したものでもよい。このようなフラグメント、誘導体及び類似体は本明細書の教示から当業者が容易に想到し得るとみなす。

本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは単離形態で提供することが好ましく、均質まで精製されていることが好ましい。

本発明は更に本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子組換えした宿主細胞及び組換え技術による本発明のポリペプチドの製造にも関する。

宿主細胞は例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の本発明のベクターを用いて遺伝子組換え（形質導入又は形質転換又はトランスフェクト）する。ベクターは例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態とすることができる。組換え宿主細胞はプロモーターの活性化、形質転換体の選択又はｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド遺伝子の増幅等の目的で適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は発現に選択する宿主細胞に従来使用されている通りであり、当業者に自明である。

本発明のポリヌクレオチドは組換え技術により対応するポリペプチドを製造するために使用することができる。従って、例えば、種々の発現媒体、特にポリペプチド発現用ベクター又はプラスミドの任意のものにポリヌクレオチド配列を挿入できる。このようなベクターとしては染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列（例えばＳＶ４０の誘導体）、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病ウイルス）が挙げられる。好ましいベクターはｐＥＴ２０ｂである。しかし、宿主で複製可能且つ生存可能であれば他の任意プラスミド又はベクターも使用できる。

上述のように、適切なＤＮＡ配列を種々の方法によりベクターに挿入することができる。一般に、当分野で公知の方法により適切な制限酵素部位にＤＮＡ配列を挿入する。このような方法等も当業者が容易に想到できるとみなす。

発現ベクター内のＤＮＡ配列はｍＲＮＡ合成を誘導するのに適した発現調節配列（プロモーター）に作動的に連結させる。このようなプロモーターの代表的な例としてはＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、ファージλＰ_Ｌプロモーター及び原核もしくは真核細胞又はそれらのウイルスで遺伝子の発現を調節することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターは更に翻訳開始のためのリボソーム結合部位と転写ターミネーターも含む。ベクターは更に発現の増幅に適した配列も含むことができる。

更に、配列ベクターは形質転換宿主細胞の選択用表現型を提供するための遺伝子（例えば真核細胞培養にはデヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、大腸菌ではテトラサイクリン又はアンピシリン耐性）を含むことが好ましい。

上記のような適切なＤＮＡ配列と適切なプロモーター又は調節配列を含むベクターを使用して適切な宿主を形質転換すると、宿主にタンパク質を発現させることができる。適切な宿主の代表的な例としては細菌細胞（例えば大腸菌、ネズミチフス菌、ストレプトミセス）、真菌細胞（例えば酵母）、昆虫細胞（例えばショウジョウバエ及びＳｆ９）、動物細胞（例えばＣＨＯ、ＣＯＳ又はボーズメラノーマ）、植物細胞等が挙げられる。適切な宿主の選択は本明細書の教示から当業者が容易に想到できるとみなす。

より特定的には、本発明は上記に概説したような配列の１種以上を含む組換え構築物にも関する。構築物は本発明の配列を順又は逆方向に挿入したベクター（例えばプラスミド又はウイルスベクター）を含む。本態様の１好適側面では、構築物は配列に作動的に連結した調節配列（例えばプロモーター）を更に含む。多数の利用可能なベクターやプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。例えば以下のベクターが挙げられる。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びｐＥＴ２０Ｂ。１好適態様では、ベクターはｐＥＴ２０Ｂである。しかし、宿主で複製可能且つ生存可能であれば他の任意プラスミド又はベクターも使用できる。

プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は選択マーカーをもつ他のベクターを使用して任意所望遺伝子から選択することができる。適切なベクターを２種挙げると、ｐＫＫ２３２−８とｐＣＭ７である。特定名の細菌プロモーターとしてはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ_Ｒ、ＰＬ及びｔｒｐが挙げられる。真核プロモーターとしてはＣＭＶ極初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲ及びマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターとプロモーターの選択は当業者が容易に実施できる。

別の態様では、本発明は上記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞等の高等真核細胞でもよいし、酵母細胞等の下等真核細胞でもよいし、細菌細胞等の原核細胞でもよい。構築物を宿主細胞に導入するにはリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション又はエレクトロポレーションを利用することができる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９８６）。

宿主細胞中の構築物を慣用方法で使用し、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生産することができる。あるいは、慣用ペプチド合成器により本発明のポリペプチドを合成することもできる。

タンパク質は適切なプロモーターの制御下に哺乳動物細胞、酵母、細菌又は他の細胞で発現させることができる。無細胞翻訳系を利用し、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を生産することもできる。原核及び真核宿主で使用するのに適したクローニング及び発現ベクターはＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）に記載されており、その開示内容は参考資料として本明細書に組込む。

本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核細胞による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増進する。エンハンサーは通常約１０〜約３００塩基対（ｂｐ）のＤＮＡのシス作用エレメントであり、プロモーターに作用してその転写を増進する。例としては複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。

一般に、組換え発現ベクターは複製起点と、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー（例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＲＰ１遺伝子）と、下流構造配列の転写を誘導するための高度発現遺伝子に由来するプロモーターを含む。このようなプロモーターは特に３−ホスホグリセル酸キナーゼ（ＰＧＫ）、αファクター、酸ホスファターゼ又は熱ショックタンパク質等の解糖酵素をコードするオペロンから誘導することができる。翻訳開始及び終結配列と、好ましくは翻訳されたタンパク質を細胞周辺腔又は細胞外媒質に分泌させることが可能なリーダー配列と異種構造配列を適切な段階で結合する。場合により、異種配列は所望特性（例えば発現される組換え産物の安定化や簡易精製）を付与するＮ末端認識ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることもできる。

適切な宿主株を形質転換し、宿主株を適切な細胞密度まで増殖させた後に選択プロモーターを適切な手段（例えば温度変化又は化学的誘導）により抑圧し、細胞を更に一定期間培養する。

細胞を一般に遠心分離により回収し、物理的又は化学的手段で破砕し、得られた粗抽出液を更に精製するために保持する。

タンパク質の発現に使用する微生物細胞は凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破砕、又は細胞溶解剤の使用等の任意慣用方法により破砕することができる。

種々の哺乳動物細胞培養系を使用して組換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例としてはＧｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）に記載されているサル腎繊維芽細胞株ＣＯＳ−７や、適合可能なベクターを発現することが可能な他の細胞株（例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株）が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは複製起点と、適切なプロモーター及びエンハンサーと、必要な任意リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与及び受容部位、転写終結配列、並びに５’フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列（例えばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位）を使用すると、必要な非転写遺伝エレメントを提供することができる。

従来使用されている方法（例えば硫安又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチカン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー）により組換え細胞培養液からポリペプチドを回収し、精製する。精製中に存在するカルシウムイオンは低濃度（約０．１〜５ｍＭ）にすることが好ましい（Ｐｒｉｃｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４：９１７（１９６９））。必要に応じて成熟タンパク質の構成を完成するのにタンパク質リフォールディング段階を使用してもよい。最後に、最終精製段階として高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。

本発明のポリペプチドは天然精製物でもよいし、化学合成物でもよいし、原核又は真核宿主（例えば培養細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞）から組換え技術により製造してもよい。組換え製造法で使用する宿主に応じて、本発明のポリペプチドを哺乳動物又は他の真核炭水化物でグリコシル化してもよいし、グリコシル化しなくてもよい。

本発明のポリペプチドは安定性を改善し、力価を増すために当分野で公知の手段により改変することができる。例えば、Ｌアミノ酸をＤアミノ酸で置換してもよいし、アミノ末端をアセチル化してもよいし、カルボキシル末端を修飾（例えばエチルアミンでキャップ）してもよい（Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．，ら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５５：３３２−３３８（１９９９））。

本発明のポリペプチドはこのようなポリペプチドをｉｎｖｉｖｏ発現させることにより本発明による遺伝子治療として利用することもできる。

本明細書に教示するような遺伝子治療に利用可能な種々のウイルスベクターとしてはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又は好ましい例としてＲＮＡウイルス（例えばレトロウイルス）が挙げられる。レトロウイルスベクターはマウス又は鳥類レトロウイルスの誘導体であるか又はレンチウイルスベクターであることが好ましい。好ましいレトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。単一外来遺伝子を挿入可能なレトロウイルスベクターの例としてはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。多数の付加レトロウイルスベクターに複数遺伝子を組込むこともできる。これらの全ベクターは導入した細胞を同定及び作製できるように選択マーカー遺伝子を導入又は組込むことができる。例えば、特定標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と共に亜鉛フィンガーに由来する目的ＤＮＡ結合ポリペプチド配列をウイルスベクターに挿入することにより、ベクターを標的特異的にする。例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによりレトロウイルスベクターを標的特異的にすることができる。好適ターゲティングは抗体を使用してレトロウイルスベクターを送達することにより実施される。亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質ポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を実現できるようにレトロウイルスゲノムに挿入可能な特定ポリヌクレオチド配列は当業者に公知であるか又は過度の実験なしに容易に見出すことができる。

組換えレトロウイルスは欠損しているので、感染性ベクター粒子を生産するためには補助が必要である。この補助は例えばＬＴＲ内の調節配列の制御下にレトロウイルスの全構造遺伝子をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を使用することにより得られる。これらのプラスミドはキャプシド封入用ＲＮＡ転写産物をパッケージング機構に認識させるヌクレオチド配列を欠失している。パッケージングシグナルを欠失するヘルパー細胞株としては例えばΨ２、ＰＡ３１７及びＰＡ１２が挙げられるが、これらに限定されない。ゲノムがパッケージングされないので、これらの細胞株は空のビリオンを生産する。パッケージングシグナルは無傷であるが、構造遺伝子を他の目的遺伝子で置換したこのような細胞にレトロウイルスベクターを導入すれば、ベクターをパッケージングし、ベクタービリオンを生産することができる。その後、この方法により生産したベクタービリオンを使用して組織細胞株（例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞）に感染させると、大量のキメラレトロウイルスビリオンを生産することができる。

亜鉛フィンガー由来ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの別の標的送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系として巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ及び脂質系（例えば水中油エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソーム）が挙げられる。本発明の好適コロイド系はリポソームである。リポソームはｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ送達媒体として有用な人工膜小胞である。０．２〜４．０μｍの寸法範囲の大きな単層小胞（ＬＵＶ）は大きな巨大分子を含む実質的百分率の水性緩衝液を封入できることが分かっている。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び無傷のビリオンを内部水相に封入し、生理活性形態で細胞に送達することができる（Ｆｒａｌｅｙら，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７，（１９８１））。哺乳動物細胞以外に、リポソームは植物、酵母及び細菌細胞にポリヌクレオチドを送達するためにも使用されている。リポソームが効率的な遺伝子導入媒体であるためには、以下の特性が必要である。（１）生理活性を損なわずに高効率で目的遺伝子を封入できる、（２）非標的細胞に比較して標的細胞に優先的且つ実質的に結合する、（３）小胞の水分を高効率で標的細胞の細胞質に送達する、（４）遺伝情報を正確且つ有効に発現する（Ｍａｎｎｉｎｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８））。

リポソームの組成は通常はリン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質を通常はステロイド、特にコレステロールと組合せている。他のリン脂質や他の脂質も使用できる。リポソームの物性はｐＨ、イオン強度及び２価カチオンの存在に依存する。

リポソーム製造に有用な脂質の例としてはホスファチジル化合物（例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン）、スフィンゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシドが挙げられる。脂質部分が１４〜１８、特に１６〜１８個の炭素原子を含み、飽和しているジアシルホスファチジルグリセロールが特に有用である。リン脂質の例としては卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。

リポソームのターゲティングは解剖学的及び機械的因子に基づいて分類されている。解剖学的分類は例えば臓器特異的、細胞特異的及びオルガネラ特異的等の選択性レベルに基づく。機械的ターゲティングは受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的ターゲティングはリポソームが洞様毛細血管を含む臓器の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分配される自然傾向を利用している。他方、能動的ターゲティングはリポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質又はタンパク質等の特異的リガンドに結合するか、天然局在部位以外の臓器及び細胞種にターゲティングできるようにリポソームの組成又は寸法を変えることによりリポソームを改変する。

標的送達系の表面は種々の方法で改変することができる。リポソーム標的送達系の場合には、ターゲティングリガンドとリポソーム二重層の安定な結合を維持するようにリポソームの脂質二重層に脂質基を組込むことができる。脂質鎖をターゲティングリガンドに結合するには種々の連結基を使用することができる。

一般に、標的送達系の表面に結合する化合物は、標的送達系に所望細胞を検出させてこの細胞に「誘導」するリガンドと受容体である。リガンドは受容体等の別の化合物に結合する任意目的化合物とすることができる。

一般に、特定エフェクター分子に結合する表面膜タンパク質を受容体と言う。本発明では、抗体が好適受容体である。抗体を使用するとリポソームを特異的細胞表面リガンドに送達することができる。例えば、腫瘍細胞上で特異的に発現される所定抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と呼ばれ、抗体−亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質を含むリポソームを悪性腫瘍に直接送達する目的で使用することができる。亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質遺伝子産物は細胞種に無差別に作用するので、標的送達系は非特異的リポソームをランダムに注入するよりも著しい改善をもたらす。ポリクローナル又はモノクローナル抗体をリポソーム二重層に共有結合するには多数の方法を利用できる。抗体標的リポソームは標的細胞上の抗原エピトープに効率的に結合するならばモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいし、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２等のそのフラグメントでもよい。ホルモン又は他の血清因子の受容体を発現する細胞にリポソームを送達してもよい。

核酸分子を標的細胞に導入するのに適した多数のウイルス及び非ウイルス方法が当業者に利用可能である。一次腫瘍細胞の遺伝子操作は当分野で周知である。細胞の遺伝子改変は遺伝子治療分野で周知の１種以上の方法を使用して実施することができる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，５（４）：５４３−５６３（１９９３））。ウイルス導入法は標的細胞に感染させるためにシアリルトランスフェラーゼ活性をもつタンパク質の発現を誘導又は阻害する核酸配列を含む組換えＤＮＡ又はＲＮＡウイルスを使用することができる。本発明で使用するのに適したＤＮＡウイルスとしてはアデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス又はポリオウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用するのに適したＲＮＡウイルスとしてはレトロウイルス又はシンドビスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。当業者に自明の通り、本発明で使用するのに適したこのようなＤＮＡ及びＲＮＡウイルスは数種のものが存在する。

ワクチン開発のために動物モデルで真核遺伝子発現を試験する目的で真核細胞に遺伝子導入するにはアデノウイルスベクターが有用である。嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）遺伝子を肺に導入するなど、Ａｄ媒介遺伝子治療もヒトで利用されている。組換えＡｄを各種組織にｉｎｖｉｖｏ投与する経路としては例えば気管内注入、筋肉注射、末梢静脈注射及び脳定位注入が挙げられる。アデノウイルスベクターは当業者に広く入手可能であり、本発明で使用するのに適している。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は遺伝子治療で潜在用途がある遺伝子導入系として最近開発された。野生型ＡＡＶは高レベル感染性、広い宿主範囲及び宿主細胞ゲノムへの組込み特異性を示すと報告されている。１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）は神経向性があるため、特に神経系で使用するのにベクター系として注目されている。ポックスウイルスファミリーのワクシニアウイルスも発現ベクターとして開発されている。上記ベクターは各々当業者に広く入手可能であり、本発明で使用するのに適していると思われる。

レトロウイルスベクターは高率の標的細胞に感染し、細胞ゲノムに組込むことができる。レトロウイルスは他のウイルスよりも比較的初期に遺伝子導入ベクターとして開発され、遺伝子マーキングとアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）のｃＤＮＡのヒトリンパ球導入に使用するのに最初に成功した。好適レトロウイルスとしてはレンチウイルスが挙げられる。好適態様では、レトロウイルスはＨＩＶ、ＢＩＶ及びＳＩＶから構成される群から選択される。

遺伝子治療に使用又は提案されている「非ウイルス」送達法としてはＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注入、ＣａＰＯ_４沈殿、遺伝子銃法、エレクトロポレーション、リポソーム及びリポフェクションが挙げられる。これらの方法はいずれも当業者に広く利用可能であり、本発明で使用するのに適していると思われる。他の適当な方法も当業者に利用可能であり、当然のことながら、本発明は利用可能な任意トランスフェクション法を使用して実施することができる。このような方法のいくつかは当業者に利用され、種々の成果を上げている。リポフェクションは単離形ＤＮＡ分子をリポソーム粒子に封入し、リポソーム粒子を標的細胞の細胞膜に接触させることにより実施することができる。リポソームはホスファチジルセリンやホスファチジルコリン等の両親媒性分子から構成される脂質二重層が内部親水相を囲むように周囲媒体の一部を封入する自己結合性コロイド粒子である。内部に所望薬品、薬剤又は本発明のように単離形ＤＮＡ分子を含むように単層又は多層リポソームを構成することができる。

細胞はｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏのいずれでトランスフェクトしてもよい。細胞は患者から単離した一次細胞としてトランスフェクトしてもよいし、一次細胞に由来する細胞株としてトランスフェクトしてもよく、必ずしも最終的に細胞を投与する患者の自系でなくてもよい。ｅｘｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏトランスフェクション後に細胞を宿主に移植してもよい。

標的細胞内で本発明の核酸の転写を得るためには、標的細胞で遺伝子発現を誘導することが可能な転写調節領域を使用する。転写調節領域はプロモーター、エンハンサー、サイレンサー又はリプレッサーエレメントを含むことができ、本発明の核酸と機能的に関連させる。転写調節領域は標的細胞で高レベルな遺伝子発現を誘導することが好ましい。本発明で使用するのに適した転写調節領域としてはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーター、アルブミンプロモーター、ＰＧＫ及びＣＭＶエンハンサーに結合したαアクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のベクターは当業者に広く利用可能な標準組換え技術を使用して構築することができる。このような技術はＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１９８９）、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９１）、及びＩｎｎｉｓら，ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）等の一般分子生物学参考書に記載されている。

本発明のポリペプチド又は核酸を標的細胞にｉｎｖｉｖｏ投与するには、当業者に周知の種々の方法の任意のものを使用して実施することができる。

本発明のベクターは医薬的に許容可能な慣用キャリヤー、アジュバント及びビヒクルを含む用量単位製剤として経口、非経口、吸入スプレー、直腸又は局所投与することができる。本明細書で使用する非経口なる用語は皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、輸液法又は腹腔内を含む。常温で固体であるが、直腸温度で液体となるので、直腸で溶けて薬剤を放出する適当な非刺激性賦形剤（例えばカカオバターやポリエチレングリコール）と薬剤を混合することにより薬剤の直腸投与用坐薬を製造することができる。

本発明のベクター及び／又は本発明の組成物で疾患又は疾病を治療するための投薬計画は疾病の種類、患者の年齢、体重、性別、症状、症状の重篤度、投与経路、及び使用する特定化合物等の種々の因子に基づいて決定する。従って、投薬計画は多様であるが、標準方法を使用して通常通りに決定することができる。

本発明の医薬活性化合物は慣用製薬法に従って加工し、ヒト及び他の哺乳動物を含む患者に投与する医薬組成物又は薬剤を製造することができる。経口投与用として、医薬組成物は例えば液剤、眼インサート、カプセル剤、錠剤、懸濁液の形態にすることができる。医薬組成物は所与量の活性剤を含有する用量単位形態で製造することが好ましい。例えば、ウイルス粒子約１０^３〜１０^１５個、好ましくは約１０^６〜１０^１２個の量のベクターを含むことができる。ヒト又は他の哺乳動物に適した１日用量は患者の症状又は他の因子に応じて広い範囲をとることができるが、この場合も日常的方法を使用して決定することができる。生理食塩水、デキストロース又は水等の適当な薬理的に許容可能なキャリヤーとの組成物として活性剤を注射により投与することもできる。

本発明の核酸及び／又はベクターは単独活性薬剤として投与できるが、本発明の１種以上のベクター又は他の薬剤と併用することもできる。併用剤として投与する場合には、同時又は時間をずらせて投与する別々の組成物として治療剤を処方してもよいし、単一組成物として治療剤を投与してもよい。

本発明のポリペプチドは適当な医薬キャリヤーと併用することもできる。このような組成物は治療上有効な量のタンパク質と、医薬的に許容可能なキャリヤー又は賦形剤を含む。このようなキャリヤーとしては生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びその組合せ等が挙げられるが、これらに限定さない。製剤は投与方法に適合しなければならない。

本発明は更に本発明の医薬組成物の成分の１種以上を充填した１個以上の容器を含む医薬パック又はキットも提供する。このような容器には医薬又は生物製品の製造、使用又は販売を管轄する政府機関が規定した形態の表示を付することができ、この表示にはヒト投与用製造、使用又は販売を政府機関に認可されたことを示す。更に、本発明のポリペプチドは他の治療化合物と併用することもできる。

医薬組成物は眼内、点眼及び全身経路等の慣用方法で投与することができる。ｔＲＮＡシンテターゼ由来ポリペプチドの患者への投与量と投薬計画は投与方法、治療する症状の種類、治療する対象の体重及び処方医の判断等の多数の因子に依存する。一般に、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の治療上有効な量のポリペプチドを投与する。頻度、投与経路、症状等を考慮すると、用量は毎日約１０μｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重が好ましい。

血管形成と新血管形成は固体腫瘍増殖の必須段階であるので、抗血管形成ＴｒｐＲＳ療法を使用すると、内因及び外因血管形成因子の血管形成活性を阻止し、それ以上の増殖を防ぐか固体腫瘍を退化させることさえできる。このような治療はいずれも異常な血管形成を特徴とする関節リウマチ、乾癬及び糖尿病性網膜症の治療にも使用することができる。

本発明は特定受容体を発現する細胞に治療遺伝子産物を送達するための組換えアデノウイルス送達ベクターを治療上有効な量と濃度で含有する組成物も提供する。これらの細胞には眼細胞が含まれる。眼の光受容細胞が特に有利である。投与は光受容細胞との接触を行う任意手段により実施することができる。光受容細胞に接近できるようにするために好ましい投与方法としては網膜下注射や硝子体内注射が挙げられるが、これらに限定されない。

組換えウイルス組成物はコラーゲンスポンジ等の生分解性支持体に吸着させる等の持続放出製剤や、リポソームとして前眼房又は後眼房、好ましくは硝子体腔に移植するように処方することもできる。持続放出製剤は１カ月又は約１年間まで等の選択期間中に数回投与するように多重用量投与用に処方することができる。従って、例えば単用量を１回の注射で合計約２回〜約５回以上まで投与するようにリポソームを製造することができる。

ベクターは約０．０５ｍｌ〜０．１５ｍｌ、好ましくは約０．０５〜０．１ｍｌの容量の眼内、好ましくは硝子体内投与に眼科学的に許容可能なキャリヤーで処方する。

組成物は眼内投与すると約５０〜１５０μｌ容量中に少なくとも約１０^７、より好ましくは少なくとも約１０^８プラーク形成単位を含む十分な量のウイルス粒子を光受容細胞に送達する量の活性剤を含む密閉無菌バイアルに収容して提供することができる。従って、バイアルは一般に約０．１５ｍｌの組成物を含む。

このような組成物を製造するためには、ウイルス粒子を適当な眼科学的に許容可能なキャリヤーで透析するか、ウイルス粒子をこのようなキャリヤーで濃縮及び／又は混合する。得られる混合物は溶液でも、懸濁液でも、エマルションでもよい。更に、ウイルス粒子は組成物中の単独医薬活性成分として処方してもよいし、治療する特定疾患に適した他の活性剤と併用してもよい。

眼内注射又は点眼剤として投与するのに適したキャリヤーとしては生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、平衡塩類溶液（ＢＳＳ）、リンゲル乳酸溶液、及び増粘剤と可溶化剤（例えばグルコース、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールとその混合物）を含む溶液が挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム懸濁液も医薬的に許容可能なキャリヤーとして利用できる。これらは当業者に公知の方法に従って製造することができる。適当な眼科学的に許容可能なキャリヤーは公知である。眼科用溶液又は混合物は適当な塩でｐＨ約５〜７の０．０１％〜１０％等張溶液として処方することができる（例えば眼洗浄液と局所投与用溶液の典型的組成について記載した米国特許第５，１１６，８６８号参照）。このような溶液はｐＨを約７．４に調整し、例えば９０〜１００ｍＭ塩化ナトリウム、４〜６ｍＭ第二リン酸カリウム、４〜６ｍＭ第二リン酸ナトリウム、８〜１２ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５〜１．５ｍＭ塩化マグネシウム、１．５〜２．５ｍＭ塩化カルシウム、１５〜２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１０〜２０ｍＭＤ，Ｌ−β−ヒドロキシ酪酸ナトリウム及び５〜５．５ｍＭグルコースを含有する。

組成物は活性剤が体内から短時間で排出されないようにするキャリヤーを（例えば徐放製剤やコーティング）用いて製造することができる。このようなキャリヤーとしては制御放出製剤（例えばマイクロカプセル送達系が挙げられるが、これに限定されない）や、生分解生体適合性ポリマー（例えばエチレン−酢酸ビニル、ポリ無水酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及び前眼房又は後眼房又は硝子体腔に直接挿入可能な他の種のインプラント）が挙げられる。組成物はＥＬＶＡＸ（登録商標）ペレット（エチレン−酢酸ビニルコポリマー樹脂、ＤｕＰｏｎｔ）等のペレットとして投与することもできる。

組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁液も医薬的に許容可能なキャリヤーとして利用できる。例えば、リポソーム製剤は当業者に公知の方法により製造することができる（例えばＫｉｍｍら，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈ．Ａｃｔａ７２８：３３９−３９８（１９８３）；Ａｓｓｉｌら，ＡｒｃｈＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１０５：４００（１９８７）；及び米国特許第４，５２２，８１１号参照）。ウイルス粒子はリポソーム系の水相に封入することができる。

活性材料又は活性剤は所望作用を損なわない他の活性材料又は所望作用を補うかもしくは他の作用をもつ材料と混合してもよく、このような材料としては粘弾性材料が挙げられ、例えばヒアルロン酸ナトリウム（例えば米国特許第５，２９２，３６２号、５，２８２，８５１号、５，２７３，０５６号、５，２２９，１２７号、４，５１７，２９５号及び４，３２８，８０３号参照）約３００万フラクションの高分子量（ＭＷ）溶液である商品名ＨＥＡＬＯＮ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ）で市販されているヒアルロン酸、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ヘプタデカフルオロデシルメタアクリレート（例えば米国特許第５，２７８，１２６号、５，２７３，７５１号及び５，２１４，０８０号参照）等の含フッ素（メタ）アクリレートである商品名ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（ＡｌｃｏｎＳｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）で市販されている樹脂、商品名ＯＲＣＯＬＯＮ（登録商標）（ＯｐｔｉｃａｌＲａｄｉａｔｉｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，例えば米国特許第５，２７３，０５６号参照）で市販されている樹脂、メチルセルロース、ヒアルロン酸メチル、ポリアクリルアミド及びポリメタクリルアミド（例えば米国特許第５，２７３，７５１号参照）が挙げられる。粘弾性材料は一般に共役材料の約０．５〜５．０重量％、好ましくは１〜３重量％の範囲の量を配合し、被処理組織を被覆及び保護するように機能する。組成物は眼に注入したときに組成物を判別できるように更に色素（例えばメチレンブルー又は他の不活性色素）を加えてもよい。付加活性剤も加えてもよい。

組成物はガラス、プラスチック又は他の適当な材料から製造したアンプル、使い捨て注射器又は多重もしくは単一用量バイアルに密封することができる。このような密封組成物をキットで提供することができる。特に、約０．１００ｍｌを送達するために十分な量の組成物を加えたバイアル、アンプル又は他の容器、好ましくは使い捨てバイアルと、使い捨て針、好ましくはセルフシーリング２５〜３３ゲージ以下の針を含むキットも本発明により提供される。

最後に、組成物はパッケージング材料、一般にはバイアルと、本発明のポリペプチドを含む眼科学的に許容可能な組成物と、組成物の治療用途を表示したラベルを含む製品としてパッケージングすることができる。

本明細書に記載する方法を実施するためのキットも提供する。キットは１回用量を投与するのに十分な組成物を充填した１個以上の容器（例えば密閉バイアル）と、１本以上の針（例えば２５〜３３ゲージ以下、好ましくは３３ゲージ以下のセルフシーリング針）と、硝子体内注射に適した精密目盛付き注射器又は他の精密目盛付き送達装置を含む。

組成物の投与は眼内注射が好ましいが、十分な量の化合物を硝子体腔に接触できるならば他の投与方法も有効であり得る。眼内注射は硝子体内注射、房水注射又は眼の外層注射（例えば結膜下注射又は上強膜下注射）により実施することができ、浸透製剤を使用する場合には角膜局所投与も実施できる。

任意特定患者毎に個体要求と組換えウイルス投与者又は投与監督者の専門的判断に従って特定投薬計画を経時的に調節すべきである。本明細書に記載する濃度と量の範囲は例示に過ぎず、特許請求の範囲に記載する方法の範囲又は実施を制限するものではない。

以下、実施例により本発明の特定態様とその種々の使用を例証する。以下の実施例は例証と説明の目的に過ぎず、発明を制限するとみなすべきではない。

無内毒素組換えＴｒｐＲＳの作製
無内毒素組換えヒトＴｒｐＲＳを次のように作製した。全長ＴｒｐＲＳ（配列番号１のアミノ酸残基１〜４７１）又は配列番号１の残基９４〜４７１（即ち全長ＴｒｐＲＳの残基９４〜４７１）から主に構成される短縮ＴｒｐＲＳ（以下、Ｔ２（配列番号１２）と言う）と、配列番号１の残基７１〜４７１から主に構成される第２の短縮ＴｒｐＲＳ（以下、Ｔ１（配列番号１３）と言う）を作製した。各プラスミドは６個のヒスチジン残基（例えば配列番号１のアミノ酸残基４７２〜４８４）を含むＣ末端タグと開始メチオニン残基もコードした。Ｈｉｓ_６タグ付きＴ１は配列番号５のアミノ酸配列をもち、Ｈｉｓ_６タグ付きＴ２は配列番号７のアミノ酸配列をもつ。

上記プラスミドを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に導入した。同様に６個のヒスチジン残基からなるＣ末端タグをコードするヒト成熟ＥＭＡＰＩＩも同様に作製して使用した。細胞をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで４時間処理することにより組換えＴｒｐＲＳの過剰発現を誘導した。次に細胞を溶解させ、上清からのタンパク質をＨＩＳ・ＢＩＮＤ（登録商標）ニッケルアフィニティーカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）で製造業者の提案プロトコールに従って精製した。精製後、１μＭＺｎＳＯ_４を加えたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の存在下にＴｒｐＲＳタンパク質をインキュベートした後、遊離Ｚｎ^２＋を除去した（Ｋｉｓｓｅｌｅｖら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：５１１−１７（１９８１））。

ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４を使用して相分離により内毒素をタンパク質試料から除去した（Ｌｉｕら，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：４５５−６３（１９９７））。Ｅ−ＴＯＸＡＴＥ（登録商標）ゲル−クロットアッセイ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用してタンパク質試料の内毒素含有量が１ｍＬ当たり０．０１単位未満であることを確認した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として使用してＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によりタンパク質濃度を測定した。

ＰＭＮエラスターゼによるヒトＴｒｐＲＳの開裂
ＰＭＮエラスターゼによるヒト全長ＴｒｐＲＳの開裂を試験した。プロテアーゼ：タンパク質比が１：３０００となるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）中ＰＭＮエラスターゼでＴｒｐＲＳを０、１５、３０又は６０分間処理した。開裂後、試料を１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。ＤＮＡのヌクレオチド３４２８〜４７３８（配列番号２）によりコードされる約５３ｋＤａの全長ＴｒｐＲＳをＰＭＮエラスターゼで開裂すると、約４６ｋＤａの大きいフラグメント（配列番号５、Ｃ末端ヒスチジンタグをもつＴ１）と約４３ｋＤａの小さいフラグメント（配列番号７、Ｃ末端ヒスチジンタグをもつＴ２）が生成された。

組換えＴｒｐＲＳタンパク質のカルボキシル末端Ｈｉｓ_６タグに対する抗体を使用してウェスタンブロット分析した処、どちらのフラグメントもそのカルボキシル末端にＨｉｓ_６タグをもつことが判明した。即ち、２つのＴｒｐＲＳフラグメントはアミノ末端のみが短縮していた。ＡＢＩＭｏｄｅｌ４９４シーケンサーを使用してエドマン分解法によりＴｒｐＲＳフラグメントのアミノ末端配列を決定した。これらのフラグメントのシーケンシングによると、アミノ末端配列はＳ−Ｎ−Ｈ−Ｇ−Ｐ（配列番号８）及びＳ−Ａ−Ｋ−Ｇ−Ｉ（配列番号９）であり、大小ＴｒｐＲＳフラグメントのアミノ末端残基は全長ＴｒｐＲＳの夫々７１位と９４位に位置することが判明した。これらのヒトＴｒｐＲＳ構築物を図１に要約する。シグナチャー配列−ＨＶＧＨ−（配列番号１０）及び−ＫＭＳＡＳ−（配列番号１１）を囲みの中に示す。

大小ＴｒｐＲＳフラグメントの抗血管形成活性を血管形成アッセイで分析した。これらのアッセイではＣ末端ヒスチジンタグ（配列番号１のアミノ酸残基４７２〜４８４）を各々もつ大小ＴｒｐＲＳフラグメント（配列番号５及び配列番号７）の組換え形を使用した。どちらのＴｒｐＲＳフラグメントも血管形成を阻害することができた。

ＴｒｐＲＳの短縮フラグメントは網膜血管形成に強力な抗血管形成作用を示す。

生後マウス網膜血管形成モデルでトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ、５３ｋｄ；配列番号１）に由来する短縮形の抗血管形成活性を試験した。Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ７０９−Ｂ８４及び７１４−Ｂ８９，ＩＯＶＳ４１（４）：１３８−１３９（Ｍａｒｃｈ１５，２０００）はマウスでは生後網膜血管形成が段階的に進行すると報告している。本発明はこの段階的な網膜血管真性を利用することにより血管形成阻害をアッセイする方法を提供する。

無内毒素組換えミニＴｒｐＲＳ（ヒスチジンタグ付きＴｒｐＲＳの４８ｋＤａスプライス変異体、配列番号３）及びＴ２（ヒスチジンタグ付きＴｒｐＲＳの４３ｋＤａ開裂産物、配列番号７）を組換えタンパク質として作製した。これらのタンパク質を新生Ｂａｌｂ／Ｃマウスに生後（Ｐ）７又は８日に硝子体内注射し、Ｐ１２又はＰ１３に網膜を摘出した。コラーゲンＩＶ抗体とフルオレセイン結合二次抗体を使用して全網膜プレパラート中の血管を可視化した。注射したタンパク質が外深部脈管叢の形成に及ぼす効果に基づく共焦点顕微鏡試験により抗血管形成活性を評価した。解剖顕微鏡（ＳＭＺ６４５，Ｎｉｋｏｎ，日本）を使用して硝子体内注射と網膜分離を実施した。生後７日（Ｐ７）にマウスの眼瞼に薄刃ブレードで裂け目をつけて眼球を露出させ、Ｔ２（５ｐｍｏｌ）又はＴｒｐＲＳ（５ｐｍｏｌ）を注射した。試料（０．５μｌ）は３２ゲージ針（ＨａｍｉｌｔｏｎＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）を装着した注射器で注射した。注射は赤道と角膜輪部の間に行い、注射中は針先端の位置を直接目視により監視し、針先端が硝子体腔内にあることを確認した。水晶体又は網膜が針で損傷した眼は試験から除外した。注射後に眼瞼を元に戻して裂け目を閉じた。

生後１２日（Ｐ１２）に動物を安楽死させて眼を摘出した。４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に１０分間浸漬した後、角膜、水晶体、強膜及び硝子体を辺縁切開により分離した。氷上でメタノールに１０分間浸漬した後に氷上でＰＢＳ中２０％正常ヤギ血清（ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）を加えた５０％胎仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）で１時間ブロックすることにより単離網膜を調製した。ブロッキング緩衝液で１８時間４℃で２００倍に希釈したウサギ抗マウスコラーゲンＩＶ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）で網膜を染色することにより血管を特異的に可視化した。ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４を結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）（ブロッキング緩衝液で２００倍に希釈）を網膜に加えて２時間４℃でインキュベートした。退色防止マウント液Ｍ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて網膜をマウントした。

Ｐ８〜Ｐ１２の間に形成される外深部網膜血管層（二次層）における血管形成度に基づいて抗血管形成活性を評価した。内部血管網（一次層）の外観を正常発生と毒性徴候の有無について評価した。本実施例で使用したタンパク質構築物のうちで一次層に有害な影響を及ぼすものは皆無であった。

図２はＴ２がマウス網膜の二次深部血管網の血管新生を阻害する能力を示す顕微鏡写真である。図２中、Ａ段はＴｒｐＲＳに暴露した網膜の血管網を示し、Ｂ段はミニＴｒｐＲＳに暴露した網膜の血管網を示し、Ｃ段は本発明のポリペプチドＴ２に暴露した網膜の血管網を示す。第１（左）列は一次表層網を示し、第２列は二次深部網を示す。図２から明らかなように、一次表層網に作用するポリペプチドはなかったが、Ｔ２のみは二次深部網の血管新生を有意に阻害した。

ＰＢＳで処理した眼の大半は正常な網膜血管発生を示したが、処理した眼（ｎ＝７３）の約８．２％に外側血管層の完全阻害が認められた。ミニＴｒｐＲＳ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で処理した眼（ｎ＝７５）の２８％には外側網の完全阻害が認められた。もっと小さい短縮形（Ｔ２）は更に強力な用量依存的血管形成阻害剤であり、０．１ｍｇ／ｍｌのＴ２で処理（ｎ＝１４）後は１４．３％、０．２５ｍｇ／ｍｌで処理（ｎ＝２０）後は４０％、０．５ｍｇ／ｍｌで処理（ｎ＝５３）後は６９．８％が完全に阻害された。０．５ｍｇ／ｍｌ処理のデータを図３にグラフにより示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットによる分析では、マウス網膜抽出物はヒトミニＴｒｐＲＳと同一の見掛け分子量と免役反応性をもつタンパク質を含む。マウスとヒトの全長ＴｒｐＲＳはアミノ酸一致度が約８８％であり、夫々アミノ酸４７５個及び４７１個を含む。ＴｒｐＲＳの短縮形、特にＴ２は網膜血管発生に強力な抗血管形成効果をもつ。

マトリゲル血管形成アッセイ
Ｂｒｏｏｋｓら，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２９：２５７−２６９（１９９９）及びＥｌｉｃｅｉｒｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，４：９１５−９２４（１９９９）に記載されている方法に従ってマウスマトリゲル血管形成アッセイを使用してＴ２（配列番号７）の抗血管形成活性を試験した。文献記載の方法を次のように改変して行った。２０ｎＭＶＥＧＦを加えた増殖因子無添加マトリゲル（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ）４００μｌを無胸腺Ｗｅｈｉマウスに皮下注射した。マトリゲルプラグに２．５μＭＴ２を加えることによりまずＴ２の抗血管形成活性を試験した。種々の濃度のＴ２をプラグに加えて力価を測定した。５日目にフルオレセイン標識内皮結合レクチンＧｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）ＳｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａＩ、イソレクチンＢ４（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）をマウスに静脈注射し、マトリゲルプラグを切除した。ＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）中でプラグを粉砕後に分光学的分析により各プラグのフルオレセイン含量を定量した。

網膜内のＴ２結合の局在
網膜に注入したＴ２の取込みと局在を調べるために、フルオレセイン標識（ＡＬＥＸＡ（登録商標）４８８，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，ＥｕｇｅｎｅＯＲ）したＴ２を生後７日（Ｐ７）に硝子体に注入した。Ｐ８とＰ１２に眼球を摘出し、４％ＰＦＡで１５分間固定した。更に網膜から付着性非網膜組織を切除し、４％ＰＦＡに４℃で一晩浸した後、ドライアイス上で媒質（ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．，ＳａｋｕｒａＦｉｎｅＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｏ．，日本）で包埋した。クリオスタット切片（１０ミクロン）をＰＢＳで再水和し、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ、２％正常ヤギ血清でブロックした。血管を抗マウスコラーゲンＩＶ抗体で上述のように可視化した。ＤＡＰＩ核染色剤を加えたＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して組織をカバースリップにマウントした。

別法として、非染色網膜切片にブロッキング緩衝液中２００ｎＭフルオレセイン標識全長ＴｒｐＲＳ又はフルオレセイン標識Ｔ２を加えて一晩４℃でインキュベートした。切片を各々ＰＢＳで５分間６回洗浄後、１μｇ／ｍｌＤＡＰＩを加えて５分間インキュベートし、核を可視化した。フルオレセイン標識Ｔ２と共にインキュベートする前に１μＭ未標識Ｔ２を８時間４℃でインキュベートすることにより未標識Ｔ２によるプレブロッキングを行った。多光子ＢｉｏＲａｄＭＲＣ１０２４共焦点顕微鏡で網膜を試験した。ＣｏｎｆｏｃａｌＡｓｓｉｓｔａｎｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して１組のＺ系画像から３−Ｄ血管画像を生成した。

マウスマトリゲルプラグアッセイにおける抗血管形成力価。Ｔ２（配列番号７）がアミノアシル化活性を失っても抗血管形成活性をもつかどうかを試験した。マウスマトリゲルアッセイを使用してＴ２のｉｎｖｉｖｏ抗血管形成活性を試験した。ＶＥＧＦ_１６５はマウスマトリゲルプラグに血管の発生を誘導する。ＶＥＧＦ_１６５と共にＴ２をマトリゲルに加えると、図４に示すように血管形成は１．７ｎＭのＩＣ_５０で用量依存的に阻止された。

フルオレセイン標識Ｔ２は網膜血管に局在する。Ｔ２（配列番号７）の眼内局在を可視化するために、生後７日に硝子体内注射後にフルオレセイン標識Ｔ２の分布を試験した。網膜を翌日摘出し、切断し、共焦点顕微鏡を使用して試験した。注射したタンパク質の分配は血管に限定されていた。標識Ｔ２で処理した眼をフルオレセイン標識（ＡＬＥＸＡ（登録商標）５９４）抗コラーゲンＩＶ抗体で同時染色することによりこの局在を確認した（データは示さず）。フルオレセイン標識Ｔ２注射後５日（Ｐ１２）に標識Ｔ２の緑色蛍光はまだ目に見えていた（図５Ａ）。これらの網膜ではＰ１２に二次血管層は観察されず、フルオレセイン標識Ｔ２が未標識Ｔ２と同等の抗血管形成活性をもつと考えられた。フルオレセイン標識全長ＴｒｐＲＳをＰ７に注射した網膜はＰ１２までに二次血管層を形成し、血管染色は観察されなかった（図５Ｂ）。図５中、フルオレセイン標識タンパク質は緑、コラーゲン標識血管は赤、核は青である。

標識Ｔ２の結合特性を更に評価するために、正常新生網膜の横断面切片をフルオレセイン標識Ｔ２で染色した。これらの条件下ではフルオレセイン標識Ｔ２のみが血管に結合した（図５Ｃ）。結合は未標識Ｔ２と共にプレインキュベートすることにより阻止されたので特異的であった（データは示さず）。フルオレセイン標識全長ＴｒｐＲＳを網膜に加えても網膜血管染色は観察されず（図５Ｄ）、全長酵素に抗血管形成活性がないことを裏付けた。

図５に示すように、フルオレセイン標識Ｔ２は抗血管形成性であり、網膜血管に局在する。フルオレセイン標識Ｔ２（図５Ａ）又は全長ＴｒｐＲＳ（図５Ｂ）を生後７日（Ｐ７）に注射した（０．５μｌ、硝子体内）。網膜をＰ８に摘出し、抗コラーゲンＩＶ抗体とＤＡＰＩ核染色剤で染色した処、標識Ｔ２（図５Ａの血管を示す上部矢印）は一次表層網（１°）の血管に局在した。二次深部網は全く存在しない（２°）ことに留意されたい。フルオレセイン標識全長ＴｒｐＲＳを注射した眼には一次（１°）及び二次（２°）両者の血管層が存在する（図５Ｂの矢印）が、標識は観察されない。

別の実験でＰ１５網膜の凍結切片をフルオレセイン標識Ｔ２（図５Ｃ）又はフルオレセイン標識全長ＴｒｐＲＳ（図５Ｄ）で染色し、共焦点走査型レーザー顕微鏡で画像を調べた。標識Ｔ２は血管に選択的に局在し、図５Ｃの記号「２°」のすぐ下に一次及び二次網膜血管層を貫く明るい緑色の管として見える。全長ＴｒｐＲＳでは染色は観察されなかった（図５Ｄ）。

全長ＴｒｐＲＳはユニークなＮＨ_２末端ドメインを含み、抗血管形成活性をもたない。この完全ドメインの一部又は全部を除去すると、抗血管形成活性をもつタンパク質が現れる。Ｔ２の抗血管形成活性に関与する構造はコアロスマンフォールドヌクレオチド結合ドメインに含まれると思われる。ＮＨ_２末端ドメインは選択的スプライシング又はタンパク分解により欠失させることができるので、恐らく全長ＴｒｐＲＳでは接近できない血管形成抑制に必要な結合部位を露出することによりＴｒｐＲＳの抗血管形成活性を調節できると思われる。

マウスマトリゲルモデルでＶＥＧＦにより誘導した血管形成は新生網膜における生理的血管形成と同様にＴ２により完全に阻害された。興味深いことに、ｉｎｖｉｔｒｏとＣＡＭ及びマトリゲルモデルにおけるＴｒｐＲＳフラグメントの最も強力な抗血管形成作用はＶＥＧＦ刺激による血管形成で観察される。新生マウス網膜血管形成結果はＶＥＧＦ刺激による血管形成とＴｒｐＲＳフラグメントの抗血管形成効果の関係を裏付け、この系の網膜血管形成はＶＥＧＦにより誘導されると思われる。更に、網膜モデルで観察される阻害は新たに発生する血管に特異的であり、（注射時に）既存の一次血管層の血管は処置しても変化しなかった。Ｔ２の抗血管形成活性のメカニズムは不明であるが、Ｔ２が網膜内皮脈管系に特異的に局在していることと、Ｔ２の作用が新たに発生する血管に選択的であることは、Ｔ２が増殖中又は移動中の細胞で発現される内皮細胞受容体を介して機能するらしいことを示唆している。Ｔ２抗血管形成活性のメカニズムを更に解明するには該当細胞受容体を同定する必要がある。

インターフェロンγで刺激すると抗血管形成ミニＴｒｐＲＳを生産する種々の細胞種はＩＰ−１０等の抗血管形成因子も生産する。従って、これらの結果から正常な生理的に関連する血管形成経路にＴｒｐＲＳが関与している可能性がある。別の遍在細胞タンパク質であるプロＥＭＡＰＩＩ（ｐ４３）は本明細書でＴｒｐＲＳについて報告する機能に似た無関係に見える２つの機能をもつ。プロＥＭＡＰＩＩは哺乳動物アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの多重シンテターゼ複合体と会合することによりタンパク質翻訳を助長する。プロＥＭＡＰＩＩはプロセシングされてＥＭＡＰＩＩとして分泌され、ＥＭＡＰＩＩは肺発生中の抗血管形成メディエーターとして機能することが示唆されている。

従って、Ｔ２は正常又は病的状態で観察される生理的に関連する血管形成リモデリングに利用することができる。正常血管形成では、Ｔ２は網膜中心の中心無血管ゾーン等の所定臓器に存在する生理的に重要な無血管ゾーンの設定を助長すると思われる。全長ＴｒｐＲＳの開裂が阻害され、血管が過剰増殖すると、病的血管形成が生じると思われる。

眼疾患では、新血管形成は失明に至る恐れがある。これらの患者は潜在的に血管形成阻害治療により多大な恩恵を受けると思われる。血管内皮増殖因子は網膜で新血管形成と斑状水腫に関連付けられているが、他の血管形成刺激も網膜血管形成に関与していると考えられる。本発明者らはＶＥＧＦ刺激による血管形成とＴｒｐＲＳフラグメントの強力な抗血管形成活性の間に関連を見出し、これらの分子を低酸素性及び他の増殖性網膜症の治療に利用できるようにした。本発明のＴ２（図５）のように当時７０％の割合で血管形成を完全に阻害する抗血管形成剤は文献に報告されていない。ＴｒｐＲＳフラグメントは天然の抗血管形成剤であり、従って潜在的に非免疫原性の抗血管形成剤であるという利点もある。従って、これらの分子は細胞標的又はウイルスベクター型治療により送達することができる。多くの血管新生眼疾患患者は全身虚血性疾患を併発しているので、遺伝子組換え細胞又はウイルスベクターを眼に直接投与する局所抗血管形成治療が望ましい。

血管形成網膜症の治療に加え、本発明のＴｒｐＲＳフラグメント、特にＴ２とその血管形成阻害フラグメントは腫瘍の血管新生を防ぐことにより固体腫瘍増殖を阻害することもできる。本発明のＴｒｐＲＳフラグメントはＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞のｉｎｖｉｔｒｏ増殖と走化性を阻害し、従って、望ましくない内皮細胞増殖及び血管新生を伴う任意疾病の治療に有用である。

Claims

血管形成又は血管新生を阻害することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は配列番号７で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列のフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％一致するヌクレオチド配列であり、かつ配列番号１におけるアミノ酸残基７１〜９３のアミノ酸配列をコードしないヌクレオチド配列である、ポリヌクレオチド。
前記ポリペプチドがプロタンパク質、プレタンパク質又は成熟タンパク質である請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
さらにリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１又は２に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が該リーダー配列をコードするヌクレオチド配列に同一読み枠で融合されている単離されたポリヌクレオチド。
前記リーダー配列がポリペプチドを細胞外又は細胞周辺腔へ分泌させることが可能な請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
請求項１から４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号７で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列のフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９７％一致するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
請求項１から４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号６で表されるポリヌクレオチド配列、配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列のフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
請求項１から６のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ＲＮＡウイルス及びプラスミドからなる群から選択される請求項７に記載のベクター。
ＲＮＡウイルスがＳＩＶ、ＢＩＶ及びＨＩＶからなる群から選択されるレンチウイルスである請求項７に記載のベクター。
宿主細胞に請求項１から６のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを導入することを含む組換え宿主細胞の製造方法。
請求項１から６のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを含み、血管形成又は血管新生を阻害することができるポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
患者における血管新生又は血管形成を阻害するための医薬組成物であって、血管新生又は血管形成を阻害する量で投与される医薬組成物の製造における請求項１から６のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドの使用。
患者における血管新生又は血管形成を阻害するための医薬組成物であって、血管新生又は血管形成を阻害する量で投与される医薬組成物の製造における請求項７から９のいずれかに記載のベクターの使用。
患者における血管新生又は血管形成を阻害するための医薬組成物であって、血管新生又は血管形成を阻害する量で投与される医薬組成物の製造における請求項１から６のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの使用。
血管新生が眼内血管新生である請求項１２から１４のいずれかに記載の使用。
投与が硝子体内注射、眼内注射、房水注射、結膜下注射、上強膜下注射又は持続性の送達装置によるものである請求項１５に記載の使用。