DERIVADOS SUSTITUIDOS DE 1, 5-DIHIDROPIRROL-2-ONA ACTIVOS COMO ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR NMDA PARA EL TRATAMIENTO DE
DOLORES
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a derivados sustituidos de 1, 5-dihidropirrol-2-ona, a métodos para su producción, a medicamentos que contienen estos compuestos, así como al uso de estos compuestos para preparar medicamentos. El tratamiento de estados de dolor crónicos y no crónicos tiene una gran importancia en la medicina. Existe una necesidad a nivel mundial de terapias analgésicas efectivas. La urgente demanda de acción orientada a tratamientos de estados de dolor crónicos y no crónicos satisfactorios para el paciente y orientados a resultados, siendo que por esto se debe entender el tratamiento del dolor exitoso y satisfactorio para el paciente esta documentada por la gran cantidad de trabajos científicos que han aparecido a últimas fechas en el campo de la analgesia aplicada y respectivamente el estudio con respecto a los fundamentos de la nocicepción. Los opioides clásicos como, por ejemplo, la morfina, son efectivos en la terapia de dolores fuertes a intensos. Sin embargo, su aplicación se ve limitada debido a los conocidos efectos secundarios, por ejemplo sofocación, vómito, sedación, estreñimiento, adicción,
. . . ? *M* **.-. *• ^to *.^******^ .... ftüÉflüüiiüiiii á dependencia y desarrollo de tolerancia. Por lo mismo solo es posible administrarlos por períodos de tiempo más prolongados o en dosificaciones mas altas con medidas de atención especiales como, p.e., recetas de prescripción 5 especial (Goodman, Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, 1990). Además, son menos efectivos en el caso de ciertos estados de dolor, en
• particular en el caso de dolores neuropáticos o incidentes. Los opioides desarrollan su actividad analgésica
10 mediante unión a receptores localizados en las membranas que pertenecen a la familia de los así denominados receptores acoplados a la proteina G. Además existen otros
• receptores y canales de iones que participan de manera esencial en el sistema del origen del dolor y la
15 transmisión del dolor como, por ejemplo, el canal de iones N-metil-D-aspartato (NMDA) , a través del cual se desarrolla una parte esencial de la comunicación de las sinapsis y mediante el cual se controla el intercambio de iones de calcio entre la célula neuronal y su entorno. 20 Los conocimientos sobre el significado fisiológico de las sustancias selectivas del canal de iones se obtuvieron mediante el desarrollo de la técnica patch- clamp, con la cual se puede comprobar el efecto de los antagonistas de NMDA sobre el metabolismo del calcio en el
25 interior de la célula.
Uno de los objetos en que se funda la invención consistió en proporcionar nuevos compuestos adecuados para la terapia del dolor o la ansiedad. Además, estos compuestos debían exhibir el mínimo posible de los efectos secundarios de los analgésicos opioides como, por ejemplo, náusea, vómito, dependencia, sofocación o estreñimiento. Otros objetos consistían en proporcionar nuevas sustancias activos para el tratamiento de reacciones inflamatorias y/o alérgicas, depresiones, adicción a las drogas y/o el alcohol, gastritis, diarrea, incontinencia urinaria, enfermedades cardiovasculares, enfermedades de las vías respiratorias, tos, enfermedades anímicas, epilepsia, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, isquemias cerebrales, infartos cerebrales, sicosis condicionadas por nivel incrementado de aminoácido, apoplejías, edemas cerebrales, hipoxia, anoxia, demencia por SIDA, encefalomielitis, síndrome de Tourette, tinnitus aurium o asfixia perinatal. Se descubrió ahora que derivados sustituidos de 1, 5-dihidropirrol-2-ona de la siguiente fórmula general I, como antagonistas de NMDA, atacan selectivamente el sitio de unión de la glicina y son adecuados para el tratamiento de reacciones inflamatorias y/o alérgicas, depresiones, adicción a las drogas y/o el alcohol, gastritis, diarrea, incontinencia urinaria, enfermedades cardiovasculares,
enfermedades de las vías respiratorias, tos, enfermedades anímicas, epilepsia, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, isquemias cerebrales, infartos cerebrales, sicosis mediadas por nivel incrementado de aminoácido, apoplejías, edemas cerebrales, hipoxia, anoxia, demencia por SIDA, encefalomielitis, síndrome de Tourette, tinnitus aurium o asfixia perinatal, y que además exhiben una marcada activiad analgésica y/o anxiolítica. Por consiguiente son objeto de la invención los derivados sustituidos de 1, 5-dihidropirrol-2-ona de fórmula general I
en la que representan X O, S ó NR7 ,
i AA.i*A* » ,- r****** **** . ** *.. * . . .... mi i ákti?éímT l í?ám el radical R1 H, OR11, SR11, COR8, CSR8, NR9R10, COOR8, CONR9R10, CSNR9R10, COCOR8, un radical alquilo-C?-?o, preferiblemente un radical alquilo-C?-6, un radical arilo, un radical heteroarilo o un radical arilo ligado a través de un grupo alquileno-C?-6, preferiblemente a través de un grupo alquileno-C?-3, los radicales R2, R3, iguales o diferentes H, F, Cl, Br,
• CF3, OR , SR11, NRyR , un radical alquilo-C?-?o, preferiblemente un radical alquilo-C?_6, un radical arilo,
10 un radical heteroarilo o un radical arilo ligado a través de un grupo alquileno-C?-6, preferiblemente a través de un grupo alquileno-C?-3, • el radical R4 H, OH, OR11, SR11, COR8, COOR8, COCOR8, CONR9R10, CSNR9R10, un radical alquilo-C?_?0, preferiblemente un
15 radical alquilo-C?-6, un radical arilo, un radical heteroarilo o un radical arilo ligado a través de un grupo alquileno-C?-6, preferiblemente a través de un grupo alquileno-C?-3, los radicales R5, R6, iguales o diferentes H, O, OH, OR11,
20 SR11, COR8, CSR8, COOR8, COCOR8, CONR9R10, CSNR9R10,un radical alquilo-C?-?o, preferiblemente un radical alquilo-C?_6, un radical arilo, un radical heteroarilo o un radical arilo ligado a través de un grupo alquileno-C?-6, preferiblemente a través de un grupo alquileno-C?-3, o juntos R5 y R6
25 significan el grupo =0,
t^*¡^ -" -•" •- - - ^-~<&»>^~' ^>^ »~>*><>-^ el radical R7 H, OR11, SR11, COR8, COOR8, COCOR8, CONR9R10, CSNRR10, un radical alquilo-C?-?0, de preferencia un radical alquilo-C?-6, un radical arilo, un radical heteroarilo o un radical arilo ligado a través de un grupo alquileno-C?-6, 5 preferiblemente a través de un grupo alquileno-C?_3, el radical R8 H, OR11, SR11, NR9R10, un radical alquilo-C?-10, preferiblemente un radical alquilo-C?-6, un radical arilo, un radical heteroarilo o un radical arilo ligado a través de un grupo alquileno-C?-6, preferiblemente a través de un
10 grupo alquileno-C?_3, el radical R9 un radical alquilo-C?-?o, preferiblemente un radical alquilo-C?-6, un radical arilo, un radical
• heteroarilo o un radical arilo ligado a través de un grupo alquileno-C?_6, preferiblemente a través de un grupo
15 alquileno-C?-3, el radical R10 un radical alquilo-C?-?o, preferiblemente un radical alquilo-C?-6, un radical arilo, un radical heteroarilo o un radical arilo ligado a través de un grupo alquileno-C?-6, preferiblemente a través de un grupo
20 alquileno-C?-3, • el radical R11 un radical alquilo-C?-?o, preferiblemente un radical alquilo-C?-6, un radical arilo, un radical heteroarilo o un radical arilo ligado a través de un grupo alquileno-C?_6 preferiblemente a través de un grupo
25 alquileno-C?-3,
en forma de sus racematos, enantiómeros, diaestereómeros o una base respectiva o una respectiva sal fisiológicamente tolerable, siendo que se exceptúan los racematos del ácido l-metil-3-acetamino-5-etoximetilentetrámico, del ácido 3-acetamino-5-etoximetilentetrámico, del ácido a-acetilamino-?-benciltiometilentetrámico, de la acetamida del N-[2, 5-dihiro-2-oxo-4-[ (fenilmetil) tio]- 5-[[ (fenilmetil) tio]metilen]-lH-pirrol-3-ilo], de la acetamida del N-[2 , 5-dihiro-2-oxo-l- (fenilmetil) -4- [ (fenilmetil) tio]-5-[[ (fenilmetil) tio]metilen]-lH-pirrol-3- ilo], de la benzamida del N-[2 , 5-dihiro-2-oxo-l- ( fenilmetil ) -4- [ ( fenilmetil ) tio]-5-[[ ( fenilmetil ) tio]metilen]-lH-pirrol-3- ilo], de la acetamida del N-[2 , 5-dihiro-l-metil-2-oxo-4-[ ( fenilmetil ) tio]-5-[[ ( fenilmetil) tio]metilen]-lH-pirrol-3-ilo], de la propanamida del N-[2 , 5-dihiro-l-metil-2-oxo-4- [ ( fenilmetil ) tio]-5-[[ ( fenilmetil ) tio]metilen]-lH-pirrol-3- ilo], así como los isómeros geométricos de la acetamida del N-[2 , 5-dihiro-l-metil-2-oxo-4-[ ( fenilmetil ) tio]-5-[[ ( fenilmetil ) t?o]metilen]-lH-pirrol-3-ilo], (E) -
de la acetamida del N-[2 , 5-dihiro-l-metil-2-oxo-4- [ ( fenilmetil ) tio]-5-[[ ( fenilmetil ) tio]metilen]-lH-pirrol-3- ilo], ( Z ) - , de la propanamida del N-[2 , 5-dihiro-l-metil-2-oxo-4~ [ ( fenilmetil ) tio]-5-[[ ( fenilmetil ) tio]metilen]-lH-pirrol-3- ilo], (E) -, y de la propanamida del N-[2 , 5-dihiro-l-metil-2-oxo-4~ [ ( fenilmetil ) tio]-5-[[ ( fenilmetil) tio]metilen]-lH-pirrol-3- ilo], ( Z ) - . Por radicales alquilo se entienden también hidrocarburos ramificados, no ramificados o cíclicos, insubstituidos o al menos monosustituidos, preferiblemente con F, Cl, Br, CN, N02, CHO, S02-alquilo-C?_6, S02CF3, OR8, NR9R10, COR8, COOR8, COCOR8, CONR9R10 y/o CSNR9R10, siendo que los radicales R8 a R10 tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I. Si estos radicales alquilo contienen más de un sustituto, entonces estos pueden ser iguales o diferentes. Los radicales alquilo son de preferencia metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, ter-butilo, neopentilo, n-hexilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo. Por un radical arilo también se entienden fenilos insustituidos o al menos monosustituidos con OH, F, Cl, Br, CF3, CN, N02, CHO, S02-alquilo-C?-6, S02CF3, NR9R10, COR8,
COOR8, COCOR8, CONR9R10, CSNR9R10, un radical alquilo-C?_6, un radical alcoxi-C?_6, un radical alquileno-C2_6, un radical heterociclilo y/o un radical fenilo, siendo que los radicales R8 a R10 tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I. Si los radicales arilo contienen más de un sustituto, entonces estos pueden ser iguales o diferentes. La expresión también puede significar naftilo. Los radicales fenilo también pueden estar condensados con otros anillos. Por un radical heteroarilo también se entienden los compuestos heterocíclicos insaturados de 5 o 6 miembros, opcionalmente provistos con un radical arilo condensado, los cuales contienen a lo menos un heteroátomo, preferiblemente nitrógeno y/u oxígeno y/o azufre. El radical heteroarilo es de preferencia furano, tiofeno, pirrol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, ftalazina o quinazolina. Se prefieren particularmente los siguientes derivados sustituidos de 1, 5-dihidropirrol-2-ona : 5-benciliden-4-metoxi-3-nitroso-l, 5- dih?dropirrol-2-ona, 4-bencilamino-5-bencil?den-3-nitroso-l, 5- dih?dropirrol-2-ona, 5-benciliden-4-hidroxi-3-nitroso-l, 5- dihidropirrol-2-ona,
5-benciliden-3-nitroso-4-fenilamino-l, 5- dihidropirrol-2-ona, 5-benciliden-4-metilamino-3-nitroso-l, 5- dihidropirrol-2-ona, 5 4-amino-5-benciliden-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol- 2-ona, 5-benciliden-4-hidroxi-3-nitro-l, 5-dihidropirrol- 2-ona, 5-benciliden-3-nitro-4-fenilamino-1, 5- 10 dihidropirrol-2-ona, 4-bencilamino-5-benciliden-3-nitro-l, 5- dihidropirrol-2-ona, • 5-benciliden-4-metilamino-3-nitro-l, 5- dihidropirrol-2-ona, 15 y 4-amino-5-benciliden-3-nitro-l, 5-dihidropirrol-2- ona .
Otro objeto de la presente invención son los 20 métodos para la producción de los derivados sustituidos de
• 1, 5-dihidropirrol-2-ona de fórmula general I, en los que los ácidos tetrámicos de fórmula general II
25
II 10 en la cual los radicales R1 a R3 tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I se hacen reaccionar a baja
• temperatura, de preferencia en solución acida enfriada por hielo, de manera especialmente preferida en solución acida
15 enfriada por hielo de ácido acético glacial, con una solución acuosa de nitrito alcalino, preferiblmente nitrito de sodio, para obtener compuestos de fórmula general III,
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en la cual los radicales R1 a R3 tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I, y estos preferiblemente se purifican y aislan mediante recristalización, de preferencia con etanol. Por lo general estos compuestos de 5 fórmula general III existen en mezcla con los correspondientes tautómeros nitrosos. La síntesis de los compuestos de partida, los ácidos tetrámicos de fórmula general II, se puede llevar a cabo según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm. Pharm.
10 Med. Chem. 1998, Vol. 331, páginas 389-394) y Stachel et al. (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195-1199 y Liebigs Ann. Chem. 1985, páginas 1692-1696) y los pasajes
• de literatura citados en ellos. Diciendo esto se introducen como referencia y por consiguiente se consideran como parte
15 de la revelación. Los compuestos de fórmula general III en los que los radicales R1 a R3 tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I se pueden hacer reaccionar mediante alquilación con agentes de alquilación en sí conocidos, de
20 preferencia diazoalcanos, dialquilsulfatos o halogenuros de
• alquilo, en solución, de manera particularmente preferida con diazoalcanos en solución etérea, o mediante reacción con cloruros de ácidos, bromuros de ácidos, esteres del ácido clorocarbónico, esteres del ácido fluorocarbónico,
25 isocianatos o isotiocianatos en solventes apolares, de
¡fi i átiA?liiÉt iÉa itAfi iwifl»,-^ ,„. ,,,.t??*****»****. ±J? , *. ^^^p?t?tfr??MrtlM---^ i?^ri|| ff ^ preferencia en éteres de cadena abierta o cíclicos, hidrocarburos, hidrocarburos halogenados, y/o en solventes apróticos polares, preferiblemente dimetilformamida y/o N- metilpirrolidona, y/o en solventes próticos polares, preferiblemente dimetilsulfóxido, para obtener compuestos de fórmula general IV,
IV 15 en la que los radicales R1 a R4 tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I, y los radicales R5 y R6 significan juntos el grupo =0, los cuales se purifican y aislan según métodos convencionales. 20 Los compuestos de fórmula general IV en la que los radicales R1 a R4 tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I, y los radicales R5 y R6 significan juntos el grupo =0 se pueden seguir derivando aún más si se hacen reaccionar con nucleófilos, de preferencia aminas primarias
25 o secundarias, alcoholatos alifáticos, aromáticos o
Mn? t ,<*ÉkÉmi É? i.*m bJ? éM heteroaromáticos, o tiolatos, fenolatos y/o tiofenolatos adecuados, en solventes polares, preferiblemente en metanol, etanol y/o isopropanol, para obtener compuestos de fórmula general V
en la que los radicales R1 a R4 así como X tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I, y los radicales R5 y R6 significan juntos el grupo =0, se purifican y aislan mediante recristalización, de preferencia mediante recristalización con metanol, etanol y/o isopropanol. Los compuestos de fórmula general V en la que los radicales R1 a R4 así como X tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I, y los radicales R5 y R6 significan juntos el grupo =0 se pueden reducir a compuestos de fórmula general I en la que los radicales R5 y R6 significan respectivamente H y R1 a R4 así como X
tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I, mediante la reacción con un agente reductor, preferiblemente con Zn/ácido acético glacial, hidruro de aluminio y litio, BH3, Na[BH3CN]/TiCl3, alcóxidos de sodio o 5 mediante la hidrogenación con hidrógeno en presencia de catalizadores de metales de transición. Una derivación adicional de los compuestos de
• fórmula general I en la que R5 y R6 significan respectivamente H y los radicales R1 a R4 así como X tienen
10 el significado de acuerdo a la fórmula general I, para obtener compuestos de fórmula general I en la que los radicales R5, R6, iguales o diferentes, representan O, OH,
• OR11, SR11, COR8, CSR8, COOR8, COCOR8, CONR9R10, CSNR9R10, un radical alquilo-C?-?o, preferiblemente un radical alquilo-Ci- 15 ß, un radical arilo, un radical heteroarilo o un radical arilo ligado a través de un grupo alquileno-C?-6, y los radicales R1 a R4 así como X tienen el significado de acuerdo a la fórmula general I, se puede efectuar según diversos métodos conocidos por el experto. 20 Los compuestos de fórmula general V en los que R5
• y Rd significan juntos el grupo =0 también se pueden obtener mediante oxidación de los compuestos de fórmula general III, preferiblemente con KMn04 y ácido peroxitrifluoracético, y ser purificados y aislados de
25 acuerdo a los métodos convencionales.
Los compuestos de conformidad con la invención se pueden convertir de manera en sí conocida a las correspondientes sales fisiológicamente tolerables con ácidos como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido 5 bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido fórmico, ácido acético, ácido oxálico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido glutámico, ácido aspártico. La formación de la sal se lleva a cabo de preferencia en un
10 solvente como, por ejemplo, éter dietílico, éter diisopropílico, éster alquilacéti co, acetona y/o 2- butanona. Para la producción de los clorhidratos
• correspondientes resulta adecuado, además, el trimetilclorosilano en solución acuosa. 15 Los derivados sustituidos de 1, 5-dihidrop?rrol-2- ona de fórmula general I son toxicológicamente inocuos y por consiguiente constituyen sustancias activas farmacéuticas adecuadas. Otro objeto de la invención son por consiguiente
20 los medicamentos que contienen como sustancia activa a lo
• menos un derivado sustituido de 1, 5-dihidropirrol-2-ona de fórmula general I y/o una base correspondiente y/o una respectiva sal fisiológicamente tolerable, así como opcionalmente otras sustancias activas y/o auxiliares. El
25 medicamento también puede contener una mezcla de a lo menos
dos enantiómeros y/o las bases correspondientes y/o las respectivas sales fisiológicamente tolerables de un compuesto de fórmula general I de conformidad con la invención, siendo que los enantiómeros no existen en 5 cantidades equimolares. Los medicamentos de preferencia se usan para combatir dolores o para tratar reacciones inflamatorias y/o
^ alérgicas, depresiones, adicción a las drogas y/o el alcohol, gastritis, diarrea, incontinencia urinaria,
10 enfermedades cardiovasculares, enfermedades de las vías respiratorias, tos, enfermedades anímicas, enfermedades neurodegenerativas, epilepsia, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, isquemias cerebrales, infartos cerebrales,
15 sicosis condicionadas por nivel incrementado de aminoácido, apoplejías, edemas cerebrales, estados de subabastecimiento del sistema nervioso central, hipoxia, anoxia, demencia por SIDA, encefalomielitis, síndrome de Tourette, asfixia perinatal, Tinnitus aurium o para la anxiolísis. 20 Otro objeto de la invención es también el uso de mf a lo menos un derivado sustituido de 1, 5-dihidropirrol-2- ona de fórmula general I y/o de una base correspondiente y/o una respectiva sal fisiológicamente tolerable para la preparación de un medicamento para combatir dolores y/o
25 tratar reacciones inflamatorias y/o alérgicas, depresiones,
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adicción a las drogas y/o el alcohol, gastritis, diarrea, incontinencia urinaria, enfermedades cardiovasculares, enfermedades de las vías respiratorias, tos, enfermedades anímicas, enfermedades neurodegenerativas, epilepsia, 5 esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, isquemias cerebrales, infartos cerebrales, sicosis condicionadas por nivel
• incrementado de aminoácido, apoplejías, edemas cerebrales, estados de subabastecimiento del sistema nervioso central,
10 hipoxia, anoxia, demencia por SIDA, encefalomielitis, síndrome de Tourette, asfixia perinatal, Tinnitus aurium o para la anxiolísis. • Para la preparación de las formulaciones farmacéuticas correspondientes, además del a lo menos un
15 derivado sustituido de 1, 5-dihidropirrol-2-ona de fórmula general I se pueden usar coadyuvantes como, por ejemplo, vehículos, sustancias de relleno, solventes, diluyentes, colorantes y/o aglutinantes. La elección de los coadyuvantes así como las cantidades de estos a ser usadas
20 depende del tipo de aplicación del medicamento, como por
• ejemplo oral, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intranasal, bucal o local, por ejemplo sobre infecciones de la piel, de las mucosas y en los ojos. Para la aplicación oral son adecuadas, por ejemplo, las
25 preparaciones en forma de tabletas, grageas, cápsulas,
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gotas, jugos y jarabes, así como las preparaciones multiparticulares, por ejemplo, aglomerados o granulados que opcionalmente también pueden estar llenados en cápsulas o comprimidos a tabletas, para la aplicación parenteral, 5 tópica y de inhalación son adecuadas, por ejemplo, las soluciones, suspensiones, preparaciones anhidras de fácil reconstitución así como los aerosoles. Los compuestos de
• fórmula I de conformidad con la invención en un depósito, en forma disuelta o en un parche, opcionalmente con la 10 adición de agentes que promueven la penetración de la piel son adecuadas preparaciones de aplicación percutánea. Las formas de preparación de uso oral o percutáneo también
• pueden liberar en forma retardada los compuestos de fórmula general I de conformidad con la invención. 15 La cantidad de principio activo a ser administrada al paciente varía en función del peso del paciente, de la forma de aplicación, de la indicación y de la gravedad de la enfermedad. Usualmente se aplican de 2 a 500 mg/kg de peso corporal del paciente de al menos un 20 derivado sustituido de 1, 5-dihidropirrol-2-ona de fórmula
• general I . Estudios farmacológicos a) Análisis sobre la afinidad al receptor: Los análisis para determinar la afinidad de los 25 derivados sustituidos de 1, 5-dihidropirrol-2-ona de fórmula general I de conformidad con la invención al sitio de unión de la glicina del canal receptor de NMDA se llevaron a cabo en homogeneizados de membranas cerebrales (homogeneizado del área de la corteza y el hipocampo del cerebro de ratas macho, especie istar, Charles River, IGA GmbH, Sulzbach, Alemania) según Barón B.M. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther., Vol. 279, páginas 62-68 (1996). Para este propósito se aislaron la corteza y el hipocampo de cerebros de rata recién sacados y se homogenizaron enfriados por hielo en 5 mmol/1 de regulador de acetato TRIS, 0.32 mol/1 de sacarosa pH 7.4 (10 ml/g de peso fresco) con un homogenizador Potter (de la compañía Braun, Melsungen, Alemania, 10 carreras de émbolo a 500 revoluciones por minuto (rpm) ) , y a continuación se centrifugaron durante 10 minutos a 1,000 g y 4°C. Se recolectó el primer sobrenadante, y el sedimento nuevamente se homogenizó enfriado por hielo con 5 mmol/1 de regulador de acetato TRIS, 0.32 mol/1 de sacarosa pH 7.4 (5 ml/g del peso neto fresco original de corteza e hipocampo de cerebro de rata) con el homogenizador Potter (10 carreras de émbolo a 500 rpm), y se centrifugaron durante 10 minutos a 1,000 g y 4°C. El sobrenadante resultante se reunió con el sobrenadante de la primera centrifugación y se centrifugó a 17,000 g durante 20 minutos a 4°C. El sobrenadante resultante después de esta centrifugación se desechó y el
sedimento de membrana se asimiló con 5 mmol/1 de regulador de acetato de TRIS pH 8.0 (20 ml/g de peso fresco original) y se homogenizó con 10 carreras de émbolo a 500 rpm. A continuación el homogeneizado de membrana se 5 incubó durante 1 hora a 4°C y se centrifugó durante 30 minutos a 50,000 g y 4°C. El sobrenadante se desechó y el tubito del centrifugado con el sedimento de membrana se
• cerró con parafina y se congeló durante 24 horas a -20°C. Al dia siguiente se descongeló el sedimento de membrana y
10 se asimiló con 5 mmol/1 de regulador de acetato de TRIS glacial, 0.1 % de saponina (peso/volumen) pH 7.0 (10 ml/g del peso neto fresco original) y se homogenizó con 10 carreras de émbolo a 500 rpm y a continuación se centrifugó durante 20 minutos a 50,000 g y 4°C. El sobrenadante
15 resultante se desechó y el sedimento se asmimiló en un volumen pequeño con 5 mmol/1 de regulador de acetato de TRIS pH 7.0 (aproximadamente 2 ml/g del peso original fresco) , y nuevamente se homogenizó con 10 carreras de émbolo a 500 rpm. Después de determinar el contenido de
20 proteína el homogeneizado de membrana se ajusto con 5
• mmol/1 de regulador de acetato de TRIS pH 7.0 a una concentración de proteína de 10 mg de proetína/ml y se congeló en alicuotas hasta la ejecución del examen. Para el ensayo de la unión al receptor se
25 descongelaron las alicuotas, se diluyeron 1:10 con 5 mmol/1
de regulador de acetato de TRIS pH 7.0, se homogenizaron enfriadas por hielo con 10 carreras de émbolo a 500 rpm con el homogenizador Potter, y se centrifugaron durante 60 minutos a 55,000 g a 4°C. El sobrenadante se decantó y el 5 homogeneizado de membrana se ajusto con 50 mmol/1 de regulador de acetato de TRIS pH 7.0 glacial a una concentración de proteína de 1 mg/ml y se volvió a
• homogenizar con 10 carreras de émbolo a 500 rpm y se mantuvo en suspensión en baño de hielo mediante agitación
10 sobre un agitador magnético. De este homogeneizado de membrana se usaron respectivamente 10 µl por 1 mi de preparación en el ensayo de la unión al receptor (0.1 mg de
• proteína/ml en la preparación final). En el ensayo de afinidad se usaron como regulador
15 50 mmol/1 de regulador de acetato de TRIS pH 7.0 y como ligando radioactivo 1 nmol/1 de (3H)-MDL 105.519 (Barón B.M. et al. Pharmacol. Exp. Ther., Vol. 279, páginas 62-68 (1996)). La proporción de unión no específica se determinó en presencia de 1 mmol/1 de glicina. 20 En otras preparaciones se adicionaron los compuestos de conformidad con la invención en series de concentración y se determinó la expulsión del ligando radioactivo de su liga específica al sitio de unión de la glicina del canal receptor de NMDA. Las respectivas
25 preparaciones por triplicado se incubaron durante 120
minutos a 4°C y a continuación, para determinar el ligando radioactivo ligado al homogeneizado de membrana se recolectaron mediante filtración a través de esteras filtrantes de fibra de vidrio (tipo Whatman GF/B, compañía Adi Hassel, Munich, Alemania) . La radioactividad retenida sobre los filtros de fibra de vidrio se midió en el contador ß (Packard TRI-CARB Liquid Szintillation Analyzer 2000CA, compañía Packard Instrument, Meriden, CT 06450, E.U.A.) después de la adición de escintilador (Ready Protein, compañía Beckmann Coulter GmbH, Krefeld, Alemania) . La afinidad de los compuestos de conformidad con la invención al sitio de unión de la glicina del canal receptor de NMDA se calculó como CI50 (concentración con 50% de expulsión del ligando radioactivo de su unión específica) según la ley de acción de las masas mediante regresión no lineal, y después de la conversión (según la ecuación de Cheng-Prussoff (Y. Cheng, .H. Prissoff, 1973, Biochem. Pharmacol. Vol. 22, páginas 3099-3108)) se especificó como valor Ki (constante de inhibición) . b) Flujos de iones inducidos por NMDA/glicina en oocitos Xenopus inyectados con RNA El examen para determinar cambios de función del canal receptor de NMDA mediante los compuestos de fórmula general I de conformidad con la invención se llevó a cabo
A*i * Jjfefe Ifafe^^ÉaaMfct^^a^ífca^ ftffr fi^Bll^j^M^gÉt con oocitos del sapo con garras africano, Xenopus laevis. Para este propósito se formaron canales receptores de NMDA neuronales en oocitos después de inyectar RNA de cerebros de ratón, y se midieron los flujos de iones desencadenados mediante la aplicación conjunta de NMDA y glicina. Los oocitos Xenopus de las fases V y VI (Dumont, J.N., J. Morphol., Vol. 136, páginas 153-180 (1972)) se microinyectaron (100-130 ng/célula) con RNA completo del tejido cerebral de ratones adultos, y se conservaron hasta 10 dias en medio de cultivo (composición: 88.0 mmol/1 de NaCl, 1.0 mmol/1 de KC1, 1.5 mmol/l de CaCl2, 0.8 mmol/1 de MgS04, 2.4 mmol/l de NaHC03, 5 mmol/1 de HEPES, 100 IU/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, pH 7.4) a 20°C. Los flujos de iones transmembranosos se registraron con el auxilio de la técnica convencional de bornes de potencial de dos electrodos con un potencial tenedor de -70 mV
(Bloms-Funke P. et al., (1996) Neurosci. Lett . 205, páginas
115-118 (1996)). Para el registro de los datos y el control del aparato de ensayo se usaron la interfaz OTC y el soporte lógico Cellworks (compañía npi, República Federal de Alemania) . Los compuestos de conformidad con la invención se adicionaron a un medio nominalmente exento de Mg2+ (composición: 89.0 mmol/1 de NaCl, 1.0 mmol/l de KC1, 1.8 mmol/l de CaCl2, 2.4 mmol/l de NaHC03, 5 mmol/1 de HEPES, pH 7.4) y se aplicaron en forma sistémica con el
Í*á A*M auxilio de clamps de concentración (compañía npi, República Federal de Alemania) . Para probar los efectos de la sustancia que son mediados a través del sitio de unión de glicina B del canal receptor de NMDA se registró la curva 5 de actividad de dosis de glicina con y sin el respectivo compuesto de conformidad con la invención. Para este propósito se aplicaron conjuntamente NMDA en una concentración fija de 100 µmol/l con glicina en concentraciones cumulativas (0-100 µmol/1) . A continuación
10 se llevó a cabo el experimento de la misma manera con una concentración fija del compuesto de conformidad con la invención. Las amplitudes de corriente se normalizaron a
• las de la respuesta de control a la aplicación conjunta de NMDA (100 µmol/1) con glicina (µmol/1) . El análisis de los
15 datos se llevó a cabo con el soporte lógico Igor-Pro (versión 3.1, WaveMetrics, E.U.A.). Todos los resultados se especificaron como valor medio de a lo menos 3 experimentos con diversos oocitos de al menos dos sapos. La importancia de las magnitudes de medición no apareadas se determina con
20 el auxilio de la prueba U de Mann-Whitney y para las
• magnitudes de medición apareadas mediante la Prueba de Wilcox (Sysstat, SPSS Inc., E.U.A.). Los valores CE50 se calcularon de acuerdo a la fórmula siguiente:
25 Y = Ymln + ( Ymax " Yrran ) / d + ( X/CE50 ) _P )
iridi a ****i*Í** k*lA,* ?>w,, , , ., . .,!*** ,- ,. ^x***^* ,*** ^,.^.. ^.**^ (Ypan = valor de prueba mínimo, Yma? = valor de prueba máximo, Y = amplitud relativa de corriente, X = concentración de las sustancia de prueba, p = factor de inclinación) . En el caso del desplazamiento hacía la derecha de la curva de actividad de dosis de glicina se determinó gráficamente mediante una regresión Schild el valor pA2 del compuesto de conformidad con la invención. Las relaciones de concentración se calcularon en base a los valores CE50 que se calcularon independientemente para cada curva de actividad de dosis. c) Prueba de formalina en el ratón Los análisis para determinar la actividad antinociceptiva de los derivados sustituidos de 1,5- dihidropirrol-2-ona de conformidad con la invención se llevaron a cabo con la prueba de la formalina en ratones Albino macho (NMRI, 25 - 35 g, Iffa Credo, Bélgica) . En la prueba de la formalina se diferencian la fase primera (temprana) (0 - 15 minutos después de la inyección de formalina) y la fase segunda (tardía) (15 - 60 minutos después de la inyección de formalina) (D. Dubuisson et al., Pain, Vol. 4, páginas 161 - 174 (1977)). La fase temprana constituye un patrón de dolor agudo como reacción directa a la inyección de formalina, en tanto que la fase tardía se considera como patrón de dolor persistente (crónico) (T. J. Coderre et al., Pain, Vol. 52, páginas
259-285 (1993) ) . Los compuestos de conformidad con la invención se analizaron en la segunda fase de la prueba de formalina, con el fin de obtener datos sobre las actividades de los
5 compuestos de conformidad con la invención en el caso del dolor crónico/inflamatorio. Mediante una única inyección subcutánea de
• formalina (20 µl, solución acuosa al 1%) en la parte dorsal de la pata trasera derecha se indujo una reacción
10 nociceptiva en animales de ensayo con libertad de movimiento, la cual se exterioriza notablemente con lamidos y mordidas de la pata afectada. Durante el intervalo de tiempo del análisis en la segunda fase (tardía) de la prueba de formalina se captó
15 continuamente el comportamiento nociceptivo de los animales mediante observación. La cuantificación del comportamiento al dolor se efectuó mediante la suma de los segundos durante los cuales los animales mostraron lamer y morder la pata afectada dentro del intervalo del examen. Después de
20 la inyección de compuestos que son antinociceptivamente
• activos en la prueba de la formalina se reducen e incluso eventualmente suprimen las reacciones de comportamiento de los animales que se describieron. Proporcionalmente a los experimentos de sustancia en los que a los animales se les
25 inyectó la sustancia de prueba previamente a la aplicación
de la formalina, a los animales del control se les inyecto vehículo, es decir, disolvente (por ejemplo, solución de NaCl al 0.9%) antes de la aplicación de la formalina. El comportamiento de los animales después de la administración 5 de sustancia (10 ratones por dosificación de sustancia) se comparó con un grupo de control (10 ratones). En base a la cuantificación del comportamiento al
• dolor se determinó en por ciento la actividad de la sustancia en la prueba de la formalina como variación 10 respecto al control. Los cálculos de DE50 se efectuaron mediante análisis de regresión. El momento de la aplicación previo a la inyección de formalina se eligió en función de
• la forma de aplicación de los compuestos de conformidad con la invención (intraperitoneal : 15 minutos, intravenosa: 5 15 minutos) . Ejemplos Los rendimientos de los compuestos producidos no se optimizaron. Los puntos de fusión determinados no están 20 corregidos. Ejemplo 1 5-benciliden-4-hidroxi-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2-ona, A una solución enfriada por hielo de 2 mmol (0.432 g) de 5-benciliden-4-hidroxi-l, 5-dihidropirrol-2-ona
25 (preparada según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm.
Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 389 - 394) y Stachel et al. (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y Liebigs Ann . Chem. 1985, páginas 1692 - 1696)) en 5 mi de ácido acético se adicionó con agitación una solución acuosa de nitrito de sodio (0.075 g, 1.1. mmol) y se agitó durante 30 minutos a la temperatura ambiente. La solución de la reacción se concentró y, mediante la recristalización con etanol se obtienen cristales de la 5-benciliden-4-hidroxi- 3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2-ona con un rendimiento de 65
La sustancia se descompone a 205°C. El análisis de este compuesto mediante espectroscopia de RMN XH dio por resultado las señales siguientes : xH-RMN(d6-DMS0, d en ppm): 14.66 (s, 1 H) ; 11.25 (s, 0.66 H) ; 11.18 (s, 0.33 H) ; 7.64-7.31 (m, 5 H) ; 6.42 (s, 0.33 H) ; 6.36 (s, 0.66 H) . Ejemplo 2 5-benciliden-4-metoxi-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2-ona, Una suspensión de 5-benciliden-4-hidroxi-3- nitroso-1, 5-dihidropirrol-2-ona (preparada según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 389 - 394) y Stachel et al. (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y Liebigs Ann. Chem. 1985, páginas 1692 - 1696) ) en metanol se mezcló con un
exceso de una solución etérica de diazometano. Después de terminado la violenta generación de nitrógeno la solución de la reacción se concentra al vacío y el residuo que de esta manera se obtiene se recristaliza con metanol. Se 5 obtuvieron cristales rojos de 5-benciliden-4-metoxi-3- nitroso-1, 5-dihidropirrol-2-ona con un punto de fusión de 172°C con un rendimiento del 90 %. El análisis de este compuesto mediante espectroscopia de RMN 1H dio por resultado las señales 10 siguientes: ^-RMNÍdß-DMSO, d en ppm): 11.16 (s, 1 H) ; 7.66- 7.33 (m, 5 H) ; 6.42 (s, 1 H) ; 4.34 (s, 3 H) . • Ejemplo 3 4-bencilamino-5-benciliden-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2- 15 ona Una solución de 0.11 g (0.5 mmol) de 5- benciliden-4-metoxi-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2-ona (preparada según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 389 - 394) y Stachel et al.
20 (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y
• Liebigs Ann. Chem. 1985, páginas 1692 - 1696)) en metanol se mantuvo en ebullición a reflujo durante dos minutos con
0.25 mi (0.25 mmol) de bencilamina. Después de la recristalización con metanol se obtuvo el compuesto 4- 25 bencilamin-5-benciliden-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2-ona
¡ttA.aaí A *,?* i *?U?*t.*. *. *.~* *~ . ** Ji^..M?a?^*^^am***í^?>m. -»S.^.
como cristales rojo violeta con un rendmiento del 60%. El compuesto se descompuso a 220°C. El análisis de este compuesto mediante espectroscopia de RMN XH dio por resultado las señales siguientes: ^-RMNKdß-DMSO, d en ppm): 10.66 (s, 1 H) ; 8.09 (s, 1 H) ; 7.57-7.23 (m, 10 H) ; 6.09 (s, 1 H) ; 4.06 (s, 2 H) . Ejemplo 4 5-benciliden-3-nitroso-4-fenilamino-1, 5-dihidropirrol-2-ona, Una solución de 0.11 g (0.5 mmol) de 5-benciliden-4-metoxi-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2-ona (preparada según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 389 - 394) y Stachel et al. (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y Liebigs Ann. Chem. 1985, páginas 1692 - 1696) ) en metanol se mantuvo en ebullición a reflujo durante dos minutos con 0.25 mi (0.25 mmol) de anilina. Después de la recristalización con metanol se obtuvo el compuesto 5-benciliden-3-nitroso-4-fenilamino-1, 5-dihidropirrol-2-ona con un rendmiento del 30%. El compuesto se descompone a 230°C. El análisis de este compuesto mediante espectroscopia de RMN """H dio por resultado las señales
***^?¡M i^jkj i siguientes : ^-RMNÍdß-DMSO, d en ppm) : 10.04 (s, 1 H) ; 7.68- 7.11 (m, 10 H) ; 6.10 (s, 1 H) . Ejemplo 5 5 5-benciliden-4-metilamino-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2-ona Una solución de 0.11 g (0.5 mmol) de 5- benciliden-4-metoxi-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2-ona (preparada según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 389 - 394) y Stachel et al. 10 (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y Liebigs Ann. Chem. 1985, páginas 1692 - 1696)) en metanol se mantuvo en ebullición a reflujo durante dos minutos con
• 0.25 mi (0.25 mmol) de solución de metilamina. Después de la recristalización con metanol se obtuvo el compuesto 5- 15 benciliden-4-metilamino-3-nitroso-l, 5-dihidro-pirrol-2-ona con un rendmiento del 50%. El compuesto se descompone a 220°C. El análisis de este compuesto mediante espectroscopia de RMN 1H dio por resultado las señales 20 siguientes: • xH-RMN(d6-DMSO, d en ppm) : 7.57-7.21 (m, 5 H) ; 6.09 (s, 1 H) ; 3.30 (s, 3 H) . Ejemplo 6 4-amino-5-benciliden-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2-ona 25 Una solución de 0.11 g (0.5 mmol) de 5-
benciliden-4-metoxi-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol-2-ona (preparada según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 389 - 394) y Stachel et al. (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y
5 Liebigs Ann. Chem. 1985, páginas 1692 - 1696) ) en metanol se mantuvo en ebullición a reflujo durante dos minutos con
0.25 mi (0.25 mmol) de una solución acuosa de amoniaco.
• Después de la recristalización con metanol se obtuvo el compuesto 4-amino-5-benciliden-3-nitroso-l, 5-dihidropirrol- 10 2-ona con un rendmiento del 45%. El compuesto se descompone a 260°C. El análisis de este compuesto mediante
• espectroscopia de RMN 1H dio por resultado las señales siguientes : 15 1H-RMN(d6-DMSO, d en ppm): 10.06 (s, 1 H) ; 7.57- 7.23 (m, 5 H) ; 6.08 (s, 1 H) . Ejemplo 7 5-benciliden-4-hidroxi-3-nitro-l, 5-dihidropirrol-2-ona A una solución de 0.18 g (1 mmol) del ácido
20 tetrámico correspondiente (preparada según H. Poschenrieder m et al. (Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 389 - 394) y Stachel et al. (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y Liebigs Ann. Chem. 1985, páginas 1692 - 1696) ) disuelta en ácido acético glacial se adicionaron
25 0.5 mi de ácido nítrico concentrado. Después de unos
i i.. L?.,*. .*.AS i£A*. -<-«**f- • "?JÍ?^tg-^'?Tfr i ***^ minutos se precipita un sedimento, el cual se separa por filtración y se lava con poco ácido acético glacial. Los cristales amarillos 5-benciliden-4-hidroxi-3-nitro-l, 5- dihidropirrol-2-ona se obtienen con un rendmiento del 60% y se descomponen a 250°C. El análisis de este compuesto mediante espectroscopia de RMN 1H dio por resultado las señales siguientes : xH-RMN(d6-DMSO, d en ppm): 11.89 (s, 1 H) ; 7.54- 7.18 ( , 5 H) ; 6.14 (s, 1 H) . Ejemplo 8 5-benciliden-3-nitro-4-fenilamino-1, 5-dihidropirrol-2-ona Una suspensión de 0.46 g (2 mmol) de benciliden- 4-hidroxi-3-nitro-l, 5-pirrolin-2-ona (preparada según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 389 - 394) y Stachel et al. (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y Liebigs Ann. Chem. 1985, páginas 1692 - 1696) ) en 20 mi de metanol se mezcla con un exceso de diazometano en éter. Después de terminada la generación de nitrógeno se extrae el solvente, el residuo se disuelve en metanol y se calienta a reflujo durante cinco minutos con un exceso de anilina, con lo que se obtienen cristales amarillos que se extraen por succión y se lavan con metanol. La 5-benciliden-3-nitro-4- fenilamino-1, 5-dihidropirrol-2-ona se obtuvo con un
rendimiento del 50% y se descompone a 236°C. El análisis de este compuesto mediante espectroscopia de RMN 1H dio por resultado las señales siguientes : 5 Hl-RMN.dß-DMSO, d en ppm): 10.82 (s, 1 H) ; 10.08 (s, 1 H) ; 7.48-7.30 (m, 10 H) ; 6.29 (s, 1 H) . Ejemplo 9 • 4-bencilamino-5-benciliden-3-nitro-l, 5-dihidrop?rrol-2-ona Una suspensión de 0.46 g (2 mmol) de benciliden- 10 4-hidroxi-3-nitro-l, 5-pirrolin-2-ona (preparada según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 389 - 394) y Stachel et al. (J. Heterocycl. Chem.
• 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y Liebigs Ann. Chem. 1985, páginas 1692 - 1696) ) en 20 mi de metanol se mezcla 15 con un exceso de diazometano en éter. Después de terminada la generación de nitrógeno se extrae el solvente, el residuo se disuelve en metanol y se calienta a reflujo durante cinco minutos con un exceso de bencilamina, con lo que se obtienen cristales amarillos que se extraen por 20 succión y se lavan con metanol. La 4-bencilamino-5- • bencil?den-3-nitro-l, 5-dihidropirrol-2-ona se obtuvo con un punto de fusión de 218°C con un rendimiento del 60%. El análisis de este compuesto mediante espectroscopia de RMN 1H dio por resultado las señales 25 siguientes:
d en ppm) : 7.43-7.32 (m, 10 H) ; 6.69 (s, 1 H) ; 5.11 (s, 2 H) . Ejemplo 10 5-benciliden-4-metilamino-3-nitro-l, 5-dihidropirrol-2-ona 5 Una suspensión de 0.46 g (2 mmol) de benciliden- 4-hidroxi-3-nitro-l, 5-pirrolin-2-ona (preparada según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998,
• 331, 389 - 394) y Stachel et al. (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y Liebigs Ann. Chem.
10 1985, páginas 1692 - 1696) ) en 20 mi de metanol se mezcla con un exceso de diazometano en éter. Después de terminada la generación de nitrógeno se extrae el solvente, el residuo se disuelve en metanol y se calienta a reflujo durante cinco minutos con un exceso de solución de
15 metilamina, con lo que se precipitan cristales amarillos, que se extraen por succión y se lavan con metanol. La 5- benciliden-4-metilamino-3-nitro-l, 5-dihidropirrol-2-ona se obtuvo con un punto de fusión de 238 °C con rendimiento del 45%. 20 El análisis de este compuesto mediante
• espectroscopia de RMN 1H dio por resultado las señales siguientes : ^-RMNÍdd-DMSO, d en ppm) : 8.85 (s, 1 H) ; 7.42- 7.27 (m, 5 H) ; 6.32 (s, 1 H) ; 3.45 (s, 3 H) . 25 Ejemplo 11
*Á**** *A l l lÉlÜliill ll llil ll l llll 4-amino-5-benciliden-3-nitro-l, 5-dihidropirrol-2-ona Una suspensión de 0.46 g (2 mmol) de benciliden- 4-hidroxi-3-nitro-l, 5-pirrolin-2-ona (preparada según H. Poschenrieder et al. (Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 389 - 394) y Stachel et al. (J. Heterocycl. Chem. 1980, Vol. 17, páginas 1195 - 1199 y Liebigs Ann. Chem. 1985, páginas 1692 - 1696) ) en 20 mi de metanol se mezcla con un exceso de diazometano en éter. Después de terminada la generación de nitrógeno se extrae el solvente, el residuo se disuelve en metanol y se calienta a reflujo durante cinco minutos con un exceso de solución de amoniaco, con lo que se precipitan cristales amarillos que se extraen por succión y se lavan con metanol. La 4-amino- 5-benciliden-3-nitro-l, 5-dihidropirrol-2-ona se obtuvo con un punto de fusión > 260°C con un rendimiento del 75%. El análisis de este compuesto mediante espectroscopia de RMN 1H dio por resultado las señales siguientes : 1H-RMN(d6-D SO, d en ppm): 9.92 (s, 1 H) ; 9.49 (s, 1 H) ; 7.66-7.34 (m, 5 H) ; 7.00 (s, 1 H) . Análisis farmacológicos b) Análisis respecto a la unión al receptor Los análisis para determinar la afinidad de los compuestos de conformidad con la invención según los ejemplos 3 a 6 y 8 a 11 al sitio de unión de la glicina del
canal receptor de NMDA se llevaron a cabo como se describió en lo precedente. La afinidad al sitio de unión de la glicina del canal receptor de NMDA se calculó como CI50 (concentración con 50% de expulsión del ligando radioactivo de su unión específica) según la ley de acción de las masas mediante regresión no lineal, y se indica en la tabla 1 siguiente como valor Ki (constante de inhibición) después de la conversión (según la ecuación de Cheng-Prussoff (Y. Cheng, W.H. Prissoff, 1973, Biochem. Pharmacol. Vol. 22, páginas 3099-3108) ) .
Tabla 1
Í ? ******kámA .*?-.^- b) Prueba de formalina en ratones Los análisis para determinar el efecto antinociceptivo de los compuestos de conformidad con la invención se llevó a cabo como se describió en lo precedente . Los resultados correspondientes de la prueba de la formalina en ratones se compilan en la tabla 2 siguiente :
Tabla 2
ii L.*A :*A.Í*á,t*l.Íi..** l *.' *<ij *.*..íí ¡É^^^^^^^^^^^í2i»^^4¿^^fe