DE INHIBIDORES DE SÍNTESIS DE GLUCOSILCERAMIDA A DEGRADANTE DEL GLUCOLÍPIDO EN TERAPIA
La presente invención se refiere a compuestos y agentes en la S elaboración de medicamentos para utilizarse en el tratamiento de desordenes que tienen al menos un componente en base al almacenamiento de glucolípido. Tales enfermedades incluyen enfermedad de almacenamiento de Niemann-Pick C, enfermedad de Gaucher, síndrome de Sandhoff, síndrome de Tay-Sach, gangliosidosis GM1 , enfermedad de í Alzheimer, apoplejía, epilepsia y cánceres tales como glioblastoma y astrocitoma. Los gangliósidos GM2 son un grupo de enfermedades de atmacenamiento lisosomal de glucoesfingolípido (GSL) que incluyen síndrome de Tay-Sach, síndrome de Sandhoff y deficiencia del activador
1ß de GM (Gravel et al (1995) en The Metabolic and Molecular Bases of tpfterited Disease (Scriver eí al) Vol 2, pp. 2839-79, 3 vols, McGraw Hill, Nueva York). Resultan de las mutaciones en los genes que codifican la subunidad a de hexosaminidasa, subunidad ß y ia proteína activadora de G 2 , respectivamente. Se caracterizaron por la neurodegeneracíón
20 progresiva en respuesta a niveles elevados de almacenamiento lisosomal de GM2 y GSLs relacionados, en neuronas del sistema nervioso central (CNS) (Gravel eí al., (1995) en The Metabolic and Molecular Bases of Inhereted Disease (Scraver eí al) Vol 2, pp. 2839-79, 3 vols, McGraw Hill, Nueva York). Actualmente no existen terapias para estas enfermedades.
25 Las estrategias terapéuticas potenciales para el síndrome de Tay-Sachs y
Saiidhoff incluyen el aumento y de la enzima y la privación del substrato ( adin (1996) Glycoconj. J. 13: 153-7; Platt eí al., (1998) Biochemical Pharmac&hgy 56:421 -30). El aumento del nivel de enzima puede lograrse utÜfsfáldo tres estrategias clínicas, reemplazo de enzima, transplante de médula ósea y terapia genética. La administración intravenosa de glucocerebrosidasa terminada en mañosa (glucohidrolasa de ß-D-glucosil-? -acilsfingosin, EC 3.2.1 .45) es una terapia eficaz para la enfermedad de Gaucher tipo 1 , que es una enfermedad de almacenamiento de GSL no neurológica (Grabowski eí al., (1995) Ann. Intern. Med. 122:33-39; Beutler eí al (1991 ) Blood 78: 1 189-9). Ya que las enzimas de glucoproteína fallan en cruzar la barrera de sangre-cerebro, esto no es un planteamiento adecuado para la enfermedad que incluye almacenamiento de GSL en el CNS. El transplante de médula ósea tiene el potencial de incrementar los niveles de enzima en la periferia , y a un grado limitado en el CNS debido a la secreción de la enzima de las células de origen de médula ósea, incluyendo microglia (Krivit eí al., (1995) Cell-Transplant 4:385-392). Los resultados del transplante de médula ósea en enfermedades de almacenamiento lisosomal de GSL incluyendo almacenamiento en CNS se han mezclado (Hoogerbrugge eí al (1 995) Lancet 345: 1 398-1402). El éxito parcial se reportó recientemente en un modelo de ratón de síndrome de Sandhoff dado la médula ósea de tipo silvestre singeníco (Norfus eí alk (1998) J. Clin. Invest 101 : 1881 -8). Esto conduce a la supervivencia incrementada del ratón y función neurológica mejorada. La terapia genética también ha prometido tratar estas enfermedades, aunque
«ualfaente es experimental (Salvetti eí al (1995) Br. Med. Bull 51 : 106- 122). La privación de substrato es un planteamiento farmacológico potencialmente genérico para tratar las enfermedades de almacenamiento de GSL (Platt eí al (1998) Biochemical Pharmacology 56:421 -30), incluyendo los gangliósidos GM2- La estrategia se basa en la inhibición parcial de la glucosiltransferasa específica de ceramida (sintasa de glucosilceramida, UDP-glucosa:N-acilesfingosina D-glucosiltransferasa, EC 2.4.1.80) que cataliza la primer etapa en la biosíntesis de GSL (Sandhoff eí al (1998) Adv. Lipid Res 26: 1 19-142). Esto reduciría los niveles de GSLs sintetizados de manera que podrían catabolizarse completamente por la actividad de la enzima residual presente en las células. La privación de substrato, utilizando el inhibidor de biosíntesis de GSL ?/-butildeoxinojirimicina (?/B-DNJ), se ha probado previamente en un modelo in vitro de enfermedad de Gaucher y se ha mostrado que evita et almacenamiento (Platt eí al (1994) J. Biol. Chem. 269:8362-6). ?/B-DNJ también se ha evaluado en un modelo de ratón asintomático de síndrome de Tay-Sachs y se ha mostrado que reduce la acumulación de GM2 en el cerebro y evita la neuropatología asociada con su almacenamiento (Platt eí al (1997) Science 276:428-31 ). ?/B-DNJ se encuentra actualmente bajo evaluación clínica en enfermedad de Gaucher tipo 1 . Los defectos en la biosíntesis de gangliósido se encuentran en la mayoría de los cánceres humanos y se piensa que sustenta las propiedades malignas e invasoras de los tumores cerebrales (Hakomori 1996, Cáncer Res 56:5309-5318, Fredman eí al., 1996 Glycoconj. 13:391 - 399).
; El metabolismo del glucolípido también juegan un papel crítico en otros desordenes neuronales, tales como enfermedad de Alzheimer y epilepsia. Las neuronas del paciente de Niemann-Pick tipo C se presentan con defectos fibrilares evocadores de la morfología observada en la enfermedad de Alzheimer. De manera interesante, la unión del gangliósido GM1 por la proteína beta amiloide induce los cambios conformes que soportan su formación de polímeros fibrosos, y la eliminación fibrilar de esta proteína que es un caso prematuro en la enfermedad de Alzheimer (Yanagisawa eí a/ (1995) Nat Med 1 : 1062-6, Choo-Smith eí al (1997) Biol Chem 272:22987-90). De esta manera, la reducción de la síntesis de GM1 inhibiría la formación de fibra observada en la enfermedad de Alzheimer. N-butildeoxinojirimicina (NB-DNJ) de imino azúcar es un inhibidor potente de alfa-glucosidasa 1 (incluida en la síntesis de N- glican), y un inhibidor más potente de glucosiltransferasa de glucosilceramida. NB-DNJ se encuentra actualmente experimentado pruebas clínicas como un tratamiento de enfermedades de Gaucher y Fabry; desordenes de almacenamiento de glucolípido que resultan de mutaciones en glucocerebrosidasa y alfa-galactosidasa A, respectivamente. Ahora hemos encontrado que NB-DNJ administrada a ratones junto con glucocerebrosidasa (la terapia principal de los pacientes con Gaucher Tipo I) inesperadamente no compromete la actividad de la glucocerebrosidasa y proporciona un aumento de la actividad de la enzima con el tiempo debido a un efecto protector de NB-DNJ en la enzima. Esto
>rendente ya que la eficacia de la enzima se esperaría que se compromete en la presencia de MB-DNJ ya que el último es un inhibidor débil de glucocerebrosidasa (IC5o= 0.52 mM). Además, también hemos ß?i PfitRSrkfo que la co-administración de NB-DNJ con transplante de médula ósea (para proporcionar el aumento de la enzima para incrementar la velocidad de degradación del glucolípido neuronal) proporciona un efecto sinergístico inesperado. De esta manera, en un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un inhibidor de síntesis de glucolípido y un agente capaz de incrementar la velocidad de degradación del glucolípido en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un desorden que tiene al menos un componente en base a almacenamiento de glucolípido. Los desordenes que resultan de la acumulación/almacenamiento de glucolípidos que contienen glucosilceramida incluyen enfermedad de Gaucher, síndrome de Sandhoff, síndrome de Fabry, síndrome de Tay-Sach, enfermedad de almacenamiento de Niemann-Pick C, gangliosidosis GM1 , desordenes genéticos en los cuales la acumulación de glucolípido neuronal contribuye a la patología de la enfermedad, por ejemplo mucopolisacáridosas, desordenes neurológicos en los cuales la acumulación de glucolípido que contiene glucosilceramida contribuye a la patología de la enfermedad tales como, enfermedad de Alzheimer, apoplejía y epilepsia, cánceres de origen neuronal tales como glioblastoma y astrocitoma y cánceres que se origina fuera del tejido neuronal pero que se presentan con metástasis neuronal. En el contexto de la presente invención, el término "inhibidor" incluir los inhibidores que inhiben la síntesis de gíttcosilceramida. Incluye moléculas tales como N-butildeoxinojirimicina, N-butildeoxigalactonojirimicina o N-nonildeoxinojirimicina y otros inhibidores estructuras de imino azúcar de síntesis de glucosilceramida. Sín embargo, además, también incluye cualquier otro inhibidor de gtucolípido, especialmente glucosilceramida, incluyendo agentes tales como 1-fen¡l-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol (PDMP), D-treo-1 - fenil-2-decanoilamino-3-morfilino-1 -propanol y análogos estructuralmente relacionados de los mismos. Además, la inhibición también puede lograrse por el uso de planteamientos genéticos, en base a la introducción de ácido nucleico que codifica las proteínas o péptidos capaces de inhibir la síntesis de glucolípido o secuencias antisensibles o ARN catalítico capaz de interferir con la expresión de las enzimas responsables de la síntesis de glucolípido y especialmente de glucosilceramida (por ejemplo, sintasa de glucosilceramida). Una combinación de cualquiera de los inhibidores anteriores puede utilizarse. Los agentes capaces de incrementar la velocidad de degradación del glucolípido (preferentemente pero no esencialmente glucolípido neuronal) incluyen las enzimas que degradan los glucolípidos, por ejemplo, glucocerebrosidasa, hexosaminidasas lisosomales, galactosidasas, sialidasas y glucosidasa de glucosilceramida, y moléculas que incrementa la actividad de tales enzimas. Además, el agente podría comprender una secuencia de ácido nucleico (ADN o ARN) que codifica las enzimas arriba mencionadas, es decir, tales secuencias podrían introducirse para incrementar la producción natural de tales enzimas. El
* - puede aún comprender médula ósea transplantada. Una combinación de los agentes anteriores puede utilizarse. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona el
VSüi $éé N-butildeoxinojirimicina y un agente capaz de incrementar la
5 velocidad de degradación del glucolípido en la elaboración de un medicamento para utilizarse en el tratamiento de un desorden que tiene al menos un componente en base al almacenamiento de glucolípido. El análogo de galactosa de NB-DNJ, N-butildeoxinojipmicina (NB-DNJ), se sabe que inhibe la síntesis de GSL in vitro tan efectivamente 0 como NB-DNJ, pero es más específico en que no inhibe a-glucosidasa I y II o ß-glucocerebrosidasa (Platt eí al. , (1994) J Biol. Chem 269(43):27108- 14). Se sabe que solamente aproximadamente 10% del nivel de suero de NB-DNJ se encuentra presente en el fluido cerebroespinal. De acuerdo con lo anterior, la dosis sistémica elevada de NB-DNJ puede tener que $ administrarse con objeto de lograr los niveles terapéuticos en CNS, y ptieden tener que administrarse por la duración de la vida de un paciente. Las concentraciones elevadas de NB-DNJ en humanos causa diarrea y en ratones causa pérdida de peso y reduce el tamaño de los órganos l?nfoides. De esta manera, sería ventajoso tener un inhibidor de síntesis .0 de glucosilceramida que no tiene estas desventajas de NB-DNJ. Se ha mostrado que, cuando se administra en ratones sanos, la distribución de NB-DGJ in vivo es equivalente o superior a aquella de NB-DNJ e inhibe la síntesis de GSL. Además y significativamente, NB- DGJ no parece causar los efectos secundarios asociados con NB-DNJ. 5 De esta manera, en un tercer aspecto, la presente invención
rlf rciona el uso de N-butildeoxigalactonojirimicina y un agente capaz í de incrementar la velocidad de degradación del glucolípido en la elaboración de un medicamento para utilizarse en el tratamiento de un dß&aftßM» que tiene al menos un componente en base al almacenamiento de glucolípido. En un cuarto aspecto, la invención proporciona un producto que comprende un inhibidor de síntesis de glucolípido y un agente capaz de incrementar la velocidad de degradación del glucolípido como una preparación combinada para el uso simultáneo, secuencia o separado en el tratamiento de un desorden que tiene al menos un componente en base af almacenamiento de glucolípido. Por ejemplo, se prevee que NB-DNJ (o cualquier otro inhibidor de síntesis de glucolípido) puede administrarse a un paciente con una enfermedad de almacenamiento de glucolípido con objeto de mantener bajos niveles de glucolípidos. Si la dosis de NB-DNJ es incorrecta por cualquier razón, un agente para incrementar la velocidad de degradación del glucolípido puede administrarse para restaurar los bajos niveles de g?ueolípidos. En un quinto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de síntesis de glucolípido y un agente capaz de incrementar la velocidad de degradación del glucolípido. Los métodos y procesos para la producción de N- butildeoxinojirimicina pueden encontrarse por ejemplo en US-A-4182767, EP-B-0012278, EP-A-0624652, US-A-4266025, US-A-4405714 y US-A-
por ejemplo. En otros aspectos, la presente invención proporciona: (a) un método para el tratamiento de un desorden que tiene al 1 1 menos un componente en base al almacenamiento de glucolípido que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de síntesis de glucolípido y un agente capaz de incrementar la velocidad de degradación del glucolípido; (b) un método para el tratamiento de un desorden que tiene al menos un componente en base al almacenamiento de glucolípido que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente eficaz de N-butildeoxinojirimicina y un agente capaz de ¡ncrementar la velocidad de degradación del glucolípido; (c) un método para el tratamiento de un desorden que tiene al menos un componente en base al almacenamiento de glucolípido que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente eficaz de N-butildeoxigalactonojirimicina y un agente capaz de incrementar la velocidad de degradación del glucolípido. Los medicamentos descritos en la presente y que son también para utilizarse en los métodos proporcionados en la presente, pueden incluir uno o más de lo siguiente: agentes conservadores, agentes
"*^^» - - - gg^^^ Z^^^X fizantes, agentes estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, endulzantes, colorantes, desodorantes, sales, reguladores, agentes de revestimiento y ant?oxidantes. También pueden contener gentes terapéuticamente activos además de los compuestos y/o agentes descritos en la presente. Vías de Administración Los medicamentos pueden adaptarse para la administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual o transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Tal composición puede prepararse por cualquier método conocido en la materia de farmacia, por ejemplo al mezclar los ingredientes activos con un vehículo bajo condiciones estériles. Varias vías de administración se considerarán ahora en mayor detalle: (i) Administración oral Los medicamentos adaptados para la administración oral pueden proporcionarse como cápsulas o tabletas; como polvos o granulos; como soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos y no acuosos); como espumas o batidos comestibles; o como emulsiones. Las tabletas o cápsulas de gelatina dura pueden comprender lactosa, almidón de maíz o derivados del mismo, ácido esteárico o sales del mismo. Las cápsulas de gelatina suave pueden comprender aceites
úfales, ceras, grasas, polioles semi-sólidos o líquidos, etc. Las soluciones y jarabes pueden comprender agua, polioles y azucares. Para la preparación de aceites de suspensión (por ejemplo, aceites vegetales) pueden utilizarse para proporcionar suspensiones de aceite en agua o agua en aceite. (ii) Administración Transdérmica Los medicamentos adaptados para la administración fransdérmica pueden proporcionarse como parches discretos que se proponen permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor por un periodo de tiempo prolongado. Por ejemplo, el ingrediente activo puede suministrarse del parche por iontoforesis (lontoforesis se describe en Pharmaceutical Reserach, 3(6):318 (1986)). (iii) Administración tópica Los medicamentos adaptados para la administración tópica pueden proporcionarse como pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, sprays, aerosoles o aceites. Para infecciones del ojo y otros tejidos externos, por ejemplo boca y piel, una crema o pomada tópica se utiliza preferentemente. Cuando se formula en una pomada, el ingrediente activo puede emplearse con ya sea una base de pomada hidromiscible o parafínica. Alternativamente, el ingrediente activo puede formularse en una crema con una base de aceite en agua o base de agua en aceite. Los medicamentos adaptados para ia administración tópica al ojo incluyen gotas para ojos. Aquí, el ingrediente activo puede disolverse o suspenderse en un vehículo adecuado, por ejemplo, en un solvente
.t.-1 -ritoifc- ., .
Los medicamentos adaptados para la administración tópica en la boca incluyen tabletas, pastillas y enjuagues bucales. (iv) Administración Rectal Los medicamentos adaptados para la administración rectal pueden proporcionarse como supositorios o enemas. (v) Administración Nasal « Los medicamentos adaptados para la administración nasal que utilizan vehículos sólidos incluyen un polvo grueso (por ejemplo, que tiene un tamaño de partícula en el rango de 20 a 500 micrones). Esto puede administrarse en la manera en que la aspiración se toma, es decir, por la inhalación rápida a través de la nariz desde un recipiente de un polvo mantenido cercano a la nariz. Las composiciones adoptadas para la administración nasal que utiliza vehículos líquidos incluyen rociadores nasales o gotas nasales. Pueden comprender soluciones acuosas o aceitosas del ingrediente activo. Los medicamentos adaptados para la administración por inhalación incluyen vapores y polvos de partículas finas, que pueden generarse por medio de varios tipos de aparatos, por ejemplo, aerosoles presurizados, nebulizadores o insufladores. Tales aparatos pueden construirse para proporcionar dosis predeterminadas del ingrediente activo. (vi) Administración Vaginal > Los medicamentos adaptados para la administración vaginal pueden proporcionarse como, pesarios, tampones, cremas, geles, pastas,
o formulaciones de spray. (vii) Administración Parenteral Los medicamentos adaptados para la administración parenteral incluyen suspensiones o soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas. Estas pueden contener antioxidantes, reguladores, bacterioestatos y solutos que convierten a la composición en substancialmente isotónica con la sangre de un receptor propuesto. Otros componentes que pueden estar presentes en tales composiciones incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las composiciones adaptadas para la administración parenteral pueden presentarse en recipientes de dosis única o múltiples dosis, por ejemplo frascos y ampolletas cerradas, y pueden almacenarse en una condición seca en hielo (liofilizada) que requiere solamente la adición de un vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua estéril para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las suspensiones y soluciones de inyección extemporáneas pueden prepararse de polvos estériles, granulos y tabletas. Dosis Las dosis se determinarán fácilmente por pruebas de rutina, y se encontrarán bajo control del médico o clínico. El principio guía para determinar una dosis adecuada será el suministro de una cantidad de material adecuadamente eficaz pero no tóxico, o aceptablemente tóxico. Para NB-DNJ o un compuesto similar, una dosis diaria para un adulto podría esperarse que estuviera en el rango de 1 mg a 2 g de agente activo, y puede encontrarse en el rango de 100 a 800 mg o 300 a 600 mg.
dosis puede administrarse en una dosis diaria única o alternativamente en dos, tres o más dosis durante el día. Las características preferidas de cada aspecto de la invención son como para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis. En los dibujos acompañantes: La Figura 1 es una gráfica que representa el % de supervivencia contra la edad de los ratones con Sandhoff en días cuando se tratan con diferentes agentes. Las Figuras 2A-D son gráficas que muestran la distribución a corto plazo de ? B-DNJ y ?/B-DGJ radiomarcadas en ratones. Los ratones (n = 5 por grupo) se anatomizaron 90 min. después de la administración oral de [1 C]-?/B-DNJ (barras abiertas) o [3H]-?/B-DGJ (barras llenas). A = compuesto total en el intestino y orina. B = compuesto total en órganos. C = concentración de compuesto en suero. D = compuesto en órganos expresado como una proporción al compuesto en suero. * denota una diferencia significativa entre los ratones tratados con ?/B-DNJ y ?/B-DGJ. Las Figuras 3A-C muestran la depleción de glucoesfingolípido en el hígado de los ratones después de la alimentación con ? B-DNJ y ?/B- DGJ. Los gabgliósidos se purificaron del hígado y se separaron por TLC. La concentración de GM2 se midió por densiometría de los cromatogramas de TCL escaneados. A = concentración de GM2 en hígados de ratones alimentados con 300 - 480 mg/kg/día de ?/B-DNJ (barras abiertas) o ?/B- DGJ (barras llenas) por 1 0 días, (n = 5 por grupo). B = banda de GM2 separada por TLC de hígados de ratones tratados por 5 semanas con 2400 mg/kg/día. C = densiometría de TLC en B. * denota una concentración
(ftiffteativamente inferior que la concentración de control (p<0.05). La Figura 4 muestra el crecimiento de los ratones alimentados con ?/B-DNJ o ?/B-DGJ. A los ratones se les dio 2400 mg/kg/día de ?/B-DNJ (o), ?/B-DGJ (•), o una dieta de control (D). N = 10 por grupo. * denota una diferencia significativa en comparación con los pesos de control (p < 0.01 ). La Figura 5 muestra el tamaño del órgano linfoide en ratones después del tratamiento con ? B-DNJ y ?/B-DGJ. El peso en húmedo del timo y bazo se determinó en la disección después de 5 semanas de tratamiento con 2400 mg/kg/día de ?/B-DNJ (barras abiertas). ?/B-DGJ (barras llenas), o una dieta de control (barras rayadas). N = 4 por grupo. * denota una diferencia significativa en comparación con los pesos de control (p < 0.001 ). La Figura 6 muestra la inhibición de la actividad de lactasa por ?/B-DNJ, ?/B-DGJ, DNJ y DGJ. La actividad de lactasa se expresa como el % de actividad de control en diferentes concentraciones de ?/B-DNJ (o), ?/B-DDJ (•), DNJ (D) y DGJ (-Í. La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que de ninguna manera se construirían como limitantes del alcance de la invenpión. EJEMPLOS Ejemplo 1 - Co-administración de Ceredase™ y NB-DNJ Un grupo de ratones se trataron con NB-DNJ en 4800 mg/kg/día por 5 semanas. Después de una dosis intravenosa baja (5-10 U/kg) de Ceredase™ (Genzyme Corporation) administrada como una sola ¡ráfción a través de la vena de la cola, la actividad de la enzima de SUero se mide al tomar muestras de suero secuenciales de la vena de la cola para monitorear la actividad de la enzima con el tiempo. Ceredase es " i na forma modificada de glucocerebrosidasa ß. Los resultados se muestran en la Tabla 1 de abajo. Tabla 1 - Efecto de NB-DNJ en la actividad circulatoria y la vida media de Ceredase TM
La actividad de Ceredase y las vidas medias de suero parecen incrementarse en los ratones tratados con NB-DNJ, sugiriendo un efecto
or en el compuesto para la evacuación de la enzima. Por lo tanto, (a) la co-administración de NB-DNJ con Ceredase™ no compromete la actividad y (b) existe un aumento sorprendente de la actividad de la enzima con el tiempo debido a un efecto protector del compuesto en la enzima. Ejemplo 2 - Co-administración de NB-DNJ y transplante de médula ósea en un modelo de ratón con síndrome de Sandhoff A los ratones con Sandhoff se les transplantó médula ósea a las dos semanas de edad y se inició la terapia con medicamentos a ias 9.5-1 1 semanas de edad (600 mg/kg/día). Las curvas de supervivencia se graficaron para cada grupo de animales con cada punto en la gráfica representando una muerte (ver Figura 1 ). Los no tratados (sin BMT, ni medicamento) sobrevivieron (supervivencia más viejo) hasta 140 días (círculos llenos), con NB-DNJ (sin BMT) solamente sobrevivieron hasta 170 días, con BMT solamente (no NB-DNJ) sobrevivieron hasta 200 días, y con NB-DNJ y BMT tuvieron una supervivencia extendida de 200-280 días. Los datos muestran la sinergia aproximadamente 1 3% arriba del aditivo. En los Ejemplos 3-7 de abajo, se utilizaron los siguientes materiales y métodos. Animales Ratones hembra C57BL/6 se alojaron bajo condiciones no estériles estándar. A los ratones se les proporcionó agua ad libitum y antes de la administración del medicamento se alimentaron con alimento granulado (Alimento para Ratón y Rata 1 expendido, SDS Ltd, Witham, Essex, RU). Todos los experimentos se realizaron en animales con la
edad. Tratamiento de Ratones con NB-DNJ y NB-DGJ Los ratones (6 semanas de edad) se alimentaron con una dieta de alimento el polvo (Alimento para Ratón y Rata 3 expendido, molido, SDS Ltd) o dieta que contiene ?/B-DNJ o ?/B-DGJ. La dieta y el compuesto (ambos como sólidos secos) se mezclan completamente, almacenan a temperatura ambiente, y utilizan dentro de 7 días de mezclado. Los ratones se mantuvieron en ?/B-DNJ o ?/B-DGJ en dosis de 300-4800 mg/kg/día por 1 0 días, o 2400 mg/kg/día por 5 semanas. Radiomarcado de NB-DGJ Un método de oxidasa de galactosa/Na[3H]4B se utiliza para radiomarcar el carbono C6 de ?/B-DGJ. Una solución de ?/B-DGJ (1 .3 mg), oxidasa de galactosa (80 unidades), y catalasa (37000 unidades) en 200 µl 10 mM de regulador de fosfato de sodio se incuba por 24 h a temperatura ambiente mientras se agita. La reacción se detiene al calentar la solución a 95°C por 5 min. Después de centrifugar (1 0 mins, 13000 (rpm), 1 M de NaOH se agrega al sobrenadante hasta que el pH 10-12 se logra. Na 3HJ B (4.3 mCi) se agrega y la solución se incuba por 2h a 30°C, después de lo cual NaBD4 (1 mg) se agrega y la solución se incuba por 1 h a 3p°C. La solución se neutraliza con 1 M de ácido acético y después se seca. Después de remover el borato al enjuagarlo con metanol acidificado (0.6% de ácido acético glacial en metanol) 5-1 0 veces, la mezcla de [3H]-?/B-DGJ se resuspende en agua, agrega a una columna AG50 (equilibrada con agua) y eluye con 1 -4 M de NH3. [3H]-?/B-DGJ se purifica además en HPLC (cromatografía hpcec CS 1 0 Dionex; elusión isocrática con 50 mM de
ÉÉI »l-ÍteM»--at- s«t-afe&-« .* * ? ¡í&%Bm¿.!tíi&,^É& t¿^?*.j*.& - % jfa ir l í §¡¡ ^j , 2.5 mM de H2SO4, 2.5 mM de H2SO4, y 5% de ACN), y finalmente ta etapa de columna AG50 se repite Distribución a corto plazo de [ C]-NB-DNJ y fHJ-NB-DGJ en Rßtones 5 Los ratones se alimentaron oralmente con 100 µl de agua que contiene 25 µg (106 cpm) [14C]-?/B-DNJ o [3H]-?/B-DGJ y 1 mg de ?/B-DNJ o ?/B-DGJ, respectivamente. La orina y las heces se recolectaron por 90 min. Después de los 90 min los ratones se mataron y el suero, órganos y cualquier orina o heces se recolectaron. Los órganos se homogeneizaron 0 en un volumen de cuatro veces de agua y heces en un volumen de diez veces. Las alícuotas de 500 µl de homogenato, 1 00 µl de orina, o 50 µl de suero se mezclaron con 4 ml de fluido de centelleo y cuentas de [14C] o J3H] medidas El enfriamiento por los diferentes tejidos de ambos isótopos se determinó al medir las cuentas de cantidades conocidas de compuesto ß radiomarcado agregado a los homogenatos de tejido, y los resultados se corrigen de acuerdo con lo anterior. Análisis de Glucoesfingolípido de Hígado de Ratón Las muestras de hígado se homogeneizaron en agua y liofilizaron. Los homogenatos secos se extrajeron dos veces en 0 cloroformo:mentanol (2: 1 , v/v). primero durante la noche a 4°C y después por 3 h a temperatura ambiente, agruparon y secaron bajo nitrógeno. Los extractos se resuspendieron en 500 µl de cloroformo:metanol (1 : 1 , v/v), se trataron en base al agregar 83 µl de 0.35 M de NaOH en metanol y digirieron por 90 min a temperatura ambiente y se separaron al agregar 83 5 µl de agua:metanol (9: 1 , v/v), 166.5 µl de agua y 416 µl de cloroformo. La
é éuperior que contiene los gangliósidos se separó de la fase inferior después del mezclado y centrifugación a baja velocidad, y la fase inferior se enjuaga dos veces con Folsh (cloroformo:metanol: 0.47% de KCl, 3:48:47, v/v). Las fases superiores se combinaron, secaron a volumen medio bajo nitrógeno, dializaron contra agua, liofilizaron y resuspendieron en cloroformo:metanol (2: 1 , v/v). Un equivalente de 5 mg de peso en seco de tejido se separa por cloroformo de TLC:metanol: 0.22% de CaCI2, 60:35:8, v/v). La placa de TLC se secó con aire, roció con orcinol: ácido sulfúrico (0.2% p/v:2N) y se trato con calor (90°C por 1 0 min). La intensidad de las bandas se cuantifica por densiometría de exploración. Determinación de concentraciones de NB-DNJ y NB-DGJ en Suero e Hígado El suero y el sobrenadante de homogenato de hígado (130 mg/ml en 10% de metanol) se centrifugaron tres veces a través de un filtro Uttralibre de Miliporos, después de que un estándar interno (?/B-pentiIDNJ) se ha agregado a las muestras. Los filtrados agrupados se purificaron en una columna SCX preacondicionada HC1 , eluyeron con 1 % de NH3 en MeOH, secaron, resuspendieron en agua, purificaron además en una columna C1 8 (preacondicimiento de MeOH , enjuague con H2O, y solución de MeOH), y finalmente se cuantificaron por HPLC (cromatografía hpcec CS10 Dionex, elusión isocrática con 50 mM de Na3SO4, 2.5 mM H3SO4, y 5% de ACN). Purificación de Disacáridasas y Medición de la Actividad de Sucrasa, Maltasa y Lactasa La isomaltasa-sucrasa de enzimas (EC 3.2.1 .10/48) e
> -**,*«*r«i*
LA-tAA^.f-..,! -fc-w-»-t ^--j» .A<.aHtJ.»i^--«aa=J-i«lte«a.- ¡ ¡fel¿^1l^j t ídrolasa de lactasa-florazin (EC 3.2.1 .62/108) se purificaron de intestino de porcino a 4°C como sigue. El intestino (100 g) se corta en piezas pequeñas, enjuaga al agitar en 250 ml de 1 50 mM de NaCI/10 mM de KCl por 30 min, y extrae dos veces con 125 ml de 2M urea, 50 mM de EDTA, y 50 mM de KCl en pH 7. Los extractos de urea se combinaron y homogeneizaron (mezclador Waring), el homogenato se centrífuga en 60,000 g por 75 min, y la pastilla se resuspendió en 50 ml de una solución que contiene 10 mM de EDTA y 10 mM de L-cisteína-HC1 en 50 mM de regulador de fosfato de potasio en pH 7.5 (pre-equilibró a 37°C). Después de la adición de papaína (15 unidades/ml), la mezcla se incubó por 30 min a 37°C, y centrifugó a 105000 g por 60 min. El sobrenadante se remueve y precipita en 75 ml de etanol a -20°C por 1 h . El precipitado se recuperó por centrifugación a 5000 g por 1 0 min, disolvió en 5-10 ml de 10 mM de regulador de fosfato de potasio en pH 7.5 y la solución se centrifugó en 30000 g por 60 min. El sobrenadante se remueve y almacena a 4°C en la presencia de 0.02% de azida de sodio. La actividad de sucrasa, maltasa y lactasa se determina en la preparación de enzima (diluida en una concentración adecuada) al incubar 50 µl de enzima. 125 µl de regulador de citrato de sodio (60 mM, pH 6), y 125 µl de substrato de disacárido a 37°C por 30 min, calentado a 100°C por 3 min para inactivar la enzima centrifugando la mezcla en 13000 g por 10 min, y determinado la concentración de glucosa al agregar 50 µl de sobrenadante en 1 ml de reactivo trinder (Sigma) y leer la absorbencia en 505 nm después de 18 min. Análisis Estadístico
kétiLé?A&?iáx Los métodos estadísticos convencionales se emplearon para calcular los valores promedio y los errores estándar del promedio (S.E.M). Las diferencias entre los grupos de ratones se probaron por significado utilizando la prueba t Student para observaciones impares. Los resultados
5 en el texto y las tablas se presentan como promedios + S.E.M. Ejemplo 3 - Distribución a corto plazo de f3Hl- NB-DGJ y f14C1- NB-DNJ en Ratones La distribución a corto plazo de ?/B-DGJ y ?/B-DNJ en ratones se determina al dar los compuestos a ratones por dosis oral. Las cuentas O radioactivas en órganos, suero, heces y orina se midieron después de 90 min. La concentración de ?/B-DNJ fue de 28% más elevada que aquella de
?/B-DGJ en la orina total recolectada mientras en el intestino hubo 77% más de ?/B-DGJ que ?/B-DNJ (Figura 2A). Esto sugiere que ?/B-DGJ pasa más lentamente fuera del tracto gastrointestinal (Gl) relativo a ?/B-DNJ. d Parece que no hay diferencia en la distribución de dos compuestos en otro tejido (Figura 2B). Sin embargo, la concentración de suero difirió significativamente -con un nivel inferior de ?/B-DGJ relativo a ?/B-DNJ
(Figura 2C), reflejando posiblemente la toma más lenta de ?/B-DGJ del tracto Gl. Cuando se ajusta por niveles de suero diferenciales ?/B-DGJ se 0 distribuye en el tejido de manera más eficiente que ?/B-DNJ (Figura 2D). Ejemplo 4 - Distribución a largo plazo de NB-DGJ y NB-DNJ en hígado y suero de ratón Para valorar los niveles de estado fijo de los compuestos cuando se administran a largo plazo a través de la vía oral, las 5 concentraciones de ?/B-DGJ y ?/B-DNJ en suero e hígado se determina por
Ifalldespués de tratar los ratones con 2400 mg/kg/día de ? B-DNJ o ?/B- DGJ (no radiomarcada) por 5 semanas (ver Tabla 2 de abajo). Tanto la concentración de suero como de hígado del medicamento fuero más elevadas en ratones tratados con ?/B-DGJ en comparación con los tratados con ? B-DNJ (66 + 3.1 µM en comparación con 51 + 13.3 µM de suero, y 207 + 30.6 µM en comparación con 103 + 21 .2 para hígado). El nivel de ?/B-DGJ en el hígado en comparación con aquel de ?/B-DNJ sugiere que ?/B-DGJ se toma selectivamente en el hígado en comparación con ?/B-DNJ. De esta manera, ?/B-DGJ puede entrar en los tejidos de manera más eficaz y persistir no más de ?/B-DNJ. Tabla 2 - Concentración de ?/B-DGJ y ?/B-DNJ en suero e hígado: Ratones tratados con 2400 mg/kg/día de ?/B-DGJ o ? B-DNJ por 5 semanas (n=2), y la concentración de compuesto en suero e hígado se determina entonces por pruebas dobles en HPLC
Ejemplo 5 - Depleción de GSL por NB-DGJ v NB-DNJ El grado de depleción de GSL en hígado después de 10 días o 5 semanas de tratamiento se comparó entre los ratones administrados con ? B-DGJ o ?/B-DNJ. Los hígados se extrajeron por cloroformo: metanol, los gangliósidos se analizaron por cromatografía de capa delgada y la intensidad de la banda de GM2 se cuantificó por densiometría. Las concentraciones de GM2 relativas (en comparación con los ratones de
f f) n hígados de ratones tratados con un rango de dosis de A B- , 3"? J$$j o ?/B-DNJ (300-4800 mg/kg/día) por 10 días muestran una respuesta dependiente de la dosis a ambos compuestos (ver Figura 3A). No existe diferencia significativa entre la depleción de GM2 lograda por los dos S compuestos en cualquiera de las concentraciones probadas. Después de un tratamiento más largo (2400 mg/kg/día por 5 semanas), las concentraciones de GM2 en hígados de ratones tratados con ?/B-DNJ o ?/B- DGJ se redujeron a 35 + 4% y 25 + 1 1 %, respectivamente, en relación a la concentración en los hígados de control (ver Figuras 3B y C). 10 De esta manera, ambos análogos (?/B-DNJ y ?/B-DGJ) se muestra que son inhibidores potentes de biosíntesis de GSL in vivo. Después de 10 días de tratamiento, la depleción de GSL dependiente de dosis se observa en hígados de ratones alimentados ya sea con ?/B-DNJ o ?/B-DGJ. La dosis más baja causa que la depleción de GSL sea 600
15 mg/kg/día (25% de reducción). La dosis más elevada evaluada (4800 mg/kg/día) causa 60-70% de depleción. Los datos similares se obtienen con ambos compuestos. Aunque existe una concentración dos veces más elevada de ?/B-DGJ en el hígado esta no se observa cuando la depleción de GSL se mide, en donde ambos compuestos dieron inhibición
20 comparable de biosíntesis de GM2. Esto puede reflejar toma celular diferencial de los compuestos en hepatocitos, células endoteliales y células Kuppfer ya que GM2 puede ser principalmente el producto de un tipo celular mientras que el compuesto se secuestraría en células sin sintetizar de GM2. La depleción de GSL después de un tratamiento más
25 largo en una dosis de 2400 mg/kg/día también se determinó. Después de
^i^ák^i?j^uJi&&AJeSltl¿í??¿^u,,tvtí^&á ????..
fianas de alimentación, la concentración de GM2 se redujo por 74%f por ?/B-DGJ y 65% por ?/B-DNJ. La distribución del medicamento y la depleción de GM2 sugieren que el tratamiento de los desordenes de almacenamiento de GSL debería ser tan eficaz con ?/B-DGJ, ya que se ha mostrado que ? B-DNJ reduce el almacenamiento en modelos de ratón de estas enfermedades y ?/B-DGJ es ligeramente superior a ?/B-DNJ para inhibir la biosíntesis de GSL in vivo. Ejemplo 6 - Efectos de NB-DGJ y NB-DNJ en el Crecimiento v Tamaño del Órgano Linfoide Para examinar la cavidad total de los ratones que se tratan con ?/B-DGJ o ?/B-DNJ (2400 mg/kg/día por 5 semanas) los ratones se monitorearon 2-3 veces por semana, los pesos corporales se registraron y tos efectos de ?/B-DGJ y ?/B-DNJ en velocidades de crecimiento se determinaron (ver Figura 4). Los ratones tratados con ?/B-DNJ crecieron más lentamente que los ratones de control no tratados, mientras que los ratones tratados con ?/B-DGJ no mostraron diferencia en velocidades de crecimiento relativas a los controles sin tratar. Después de 5 semanas de tratamiento, los ratones tratados con ?/B-DNJ pesaron 25% menos que el control y los ratones tratados con ? B-DGJ. Las timusas y bazos removidos de ratones tratados con ?/B-DNJ fueron más pequeños que aquellos de los ratones de control o tratados con ?/B-DGJ (ver Figura 5), mientras que los pesos de otros órganos tales como hígado o riñon no se afectaron. El tratamiento con ?/B-DNJ redujo el peso del timo por 61 + 2% y el peso del bazo por 62 + 3% en comparación con los órganos de los ratones de control. En contraste, ?/B-DGJ no tuvo efecto en el peso del
?© linfoide. La pérdida del peso corporal en ratones tratados con ?/B-DNJ no consideró la gran reducción en el tamaño del órgano linfoide. Si se expresa como una proporción de peso corporal, los pesos de los órganos aún se redujeron significativamente (al proporción de peso de timo a corporal se redujo por 45 + 5% y a proporción de peso de bazo a corporal por 48 + 4% en los ratones tratados con ?/B-DNJ en comparación con los controles). Se observa que los ratones tratados con ?/B-DNJ tuvieron menos grasas asociadas con sus órganos (riñon, bazo, etc.) y carecieron de grasa subcutánea en comparación con los ratones tratados con ? B-DGJ o control (datos no mostrados). El hecho de que la pérdida de peso corporal y la reducción del tamaño del órgano linfoide se causa por ?/B-DNJ pero no por ?/B-DGJ sugiere que estos efectos son una función de inhibición de glucosidasa (o una actividad todavía no identificada) por ?/B-DNJ, no inhibición de biosíntesis de GSL (una actividad compartida por ambos compuestos). El efecto de ?/B-DNJ en el presente estudio en la inhibición de interrupción de glicógeno podría proporcionar una explicación posible por al menos parte de la pérdida de peso observad en ratones tratados con ?/B-DNJ. Se muestra que, después de 12h de inanición, cuando los ratones tratados con ?/B-DGJ y control han evacuado la mayoría de su glucógeno, los ratones tratados con ?/B-DNJ todavía tuvieron una cantidad significativa de glucógeno en sus hígados. Ambos después de la inanición y entres los episodios de alimentación, el ratón normalmente interrumpiría normalmente proporcionar glicógeno al cerebro, músculos y otros tejidos del cuerpo con glucosa. Sin embargo, si la glucogenolosis se inhibió parcial como en los
Í?.??jStitx?,?^A tratados con ?/B-DNJ, el ratón tendría que utilizar otras fuentes ' 'X* de combustible, tales como grasa, para satisfacer su demanda de energía. La tienda de tejido de adiposa disminuiría con el tiempo dando como resultado peso corporal reducido. Esta hipótesis se ajusta con la 5 observación de que los ratones tratados con ?/B-DNJ (tanto alimentados como en inanición) tuvieron muy poca grasa subcutánea en comparación con los ratones tratados con ?/B-DGJ o normales. La inhibición de glucogenolisis por ?/B-DGJ se debe probablemente a la inhibición de la enzima de desramificación de glicógeno (4-a-glucanotransferasa, EC
10 2.4.1.25 y a-1 ,6-glucosidasa, EC 3.2.1 .33). Aunque nunca se reporta para ? B-DNJ, la inhibición de la actividad de a-1 ,6-glucosidasa de esta enzima se ha observado previamente para otros derivados de DNJ (Arai eí al., 1 998 Circulation 97(1 3): 1 290-7; Bollen eí al , Eur-J-Biochem 1íM(3):775-80). Si esto también es el caso para ?/B-DNJ, durante periodos
15 de tratamiento prolongados esto podría causar almacenamiento de glicógeno (patológico). Si esto ocurre, sin embargo, excede el almacenamiento como animales en medicamento por periodos prolongados en exceso de seis meses no muestran señales evidentes de patología (datos no mostrados). Lo que puede ocurrir es que el nivel basal de
20 glicógeno se incrementa debido a la inhibición parcial de enzima, pero eso permanece relativamente constante con el tiempo en las dosis de inhibidor Utilizado en este estudio. Los ratones tratados con ?/B-DNJ tuvieron órganos linfoides relativamente más pequeños. Sin embargo , ?/B-DGJ no muestra este efecto, implicando de nuevo que esto no es el resultado de
25 la inhibición de biosíntesis de GSL en animales tratados con ?/B-DNJ .
lado parenteral se valoran por sus capacidades de inhibir las actividades de maltasa y swcrasa de la sucrasa-isomaltasa de enzima (que tiene actividades de
* sacaridasa para la interrupción de sucrosa, maltosa e isomaltosa). La inhibición de esta enzima por DNJ se ha reportado previamente (Hanozet et al., (1981 ); J. Biol. Chem 256:3703-371 1 ). Tanto la concentración de substrato como de inhibidor se varían y se calculó Ki (ver Tabla 3). ?/B- DNJ y DNJ se encontraron que son inhibidores potentes tanto de sucrasa o como de maltasa (K (sucrasa) = 0.03 µM y KT (maltasa) = 0.07 µM por DNJ, y Ki (sucrasa) = 0.26 µM y Ki (maltasa) = 0.37 µM por ?/B-DNJ), mientras que ?/B-DGJ es menos potente (Ki (sucrasa) = 2 mM, (maltasa) no inhibidor en 2 mM) ?/B-DNJ, DNJ, ?/B-DGJ y DGJ también se prueban por su 5 capacidad para inhibir lactasa (Figura 6 y Tabla 4). DNJ, ?/B-DGJ y DGJ todos inhiben lactasa (Ki de 1 3 µM, 30 µM y 85 µM para DNJ , DGJ y ?/B- DGL, respectivamente). La inhibición de lactasa por ?/B-DNJ fue muy débil (Kt = 4 mM). Tabla 3 - KiS para la inhibición de sucrasa y maltasa por DNJ , ? B-DNJ y 0 ?/B-DGJ NI (no inhibidor en 2 mM) K1 (µM) Sucrasa Maltasa DNJ 0.03 0.07 NB-DNJ 0.26 0.37 NB-DGJ 2000 NI 5
Tabla 4 - K,S para la inhibición lactasa por DNJ, ? B-DNJ, DGJ y ?/B-DGJ
K, (µM) DNJ 1 3 NB-DNJ 4000 DGJ 30 NB-DGJ 85
El efecto secundario principal de NB-DNJ se ha observado que es diarrea osmótica. Se piensa que la diarrea se causa por la inhibición de disacáridos en el intestino, lo que significa que las azucares tales como sucrosa y maltosa no pueden catabolizarse y absorberse del sistema digestivo. La sucrosa consiste de un residuo de fructosa y uno de glucosa, y maltosa de dos residuos de glucosa. Por lo tanto, no es sorprendente que los resultados en este ejemplo muestren que los análogos de glucosa de NB-DNJ y DNJ son inhibidores muy potentes de la actividad de maltasa y sucrasa mientras que el análogo de galactosa de NB-DGJ no es inhibidor. Se encuentra que DNJ. NB-DGJ y DGL todos inhibe lactasa, pero que s fue al menos 102 más elevada que la inhibición de maltasa y sucrasa por los análogos de glucosa. NB-DNJ, sin embargo, no fue un buen inhibidor de lactasa (K 4mM). En términos prácticos esto significa que NB-DGJ puede tolerarse mejor de una dieta libre de lactosa, pero no debería interferir con la digestión de otros carbohidratos. La falta de efectos secundarios asociados con NB-DGJ in vivo puede tener aplicaciones importantes para el tratamiento potencial de infantes y niños jóvenes en donde los efectos secundarios podrían reducir la tolerancia a un grado mayor que aquellos experimentados en adultos.
. t . i De esta manera, puede observarse que ?/B-DGJ ha mostrado que reduce GSL in vivo y muestra poco menos de propiedades inhibidoras de enzima in vivo e in vitro que ?/B-DNJ, haciendo a esto un compuesto más selectivo. De las actividades listadas abajo en la Tabla 5, la inhibición de lactasa es solamente una asociada con ?/B-DGJ y es probablemente la más simple de superar al restringir la toma dietética de lactosa. Tabla 5
** K (sucrasa) = 0.26 µM, Ki (maltasa) = 0.37 µM para NB-DNJ *** Kt (lactasa) = 85 µM para NB-DGJ muestras (mostradas en paréntesis).