ES2200865T3 - Combinacion de n-butildesoxino,jirimicina (nb-onj) y enzimas degradadoras de glicolipidos en terapia. - Google Patents
Combinacion de n-butildesoxino,jirimicina (nb-onj) y enzimas degradadoras de glicolipidos en terapia.Info
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Abstract
El uso de N-butildesoxinojirimicina (NB-DNJ) en la fabricación de un medicamento para la administración combinada con un agente capaz de incrementar el índice de degradación de glicolípidos en el tratamiento de un trastorno del almacenamiento de glicolípidos seleccionado entre: enfermedad de Gaucher, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Fabrys, enfermedad de Tay-Sachs, trastorno del almacenamiento de Niemann-Pick tipo C y gangliosidosis GM1.
Description
Combinación de
N-butildesoxinojirimicina (NB-ONJ) y
enzimas degradadoras de glicolípidos en terapia.
La presente invención se refiere al uso de un
inhibidor de la síntesis de la glucosilceramida,
N-butildesoxinojirimicina, en la fabricación de
medicamentos para usar en terapia combinada en el tratamiento de
los siguientes trastornos los cuales tienen al menos un componente
basado en el almacenamiento de glicolípidos: trastorno del
almacenamiento de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de
Gaucher, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de
Tay-Sachs, gangliosidosis GM1 y enfermedad de
Fabrys.
Las gangliosidosis GM2 son un grupo de trastornos
del almacenamiento lisosomal de glicoesfingolípidos (GSL) que
incluye la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad
de Sandhoff y la deficiencia del activador de GM2 (Grave et al.
(1995) en The Metabolic and Molecular Bases of Inherited
Disease (Scriver et al.) Vol 2, pp 2.839-79, 3
vols, McGraw Hill, New York). Estas enfermedades resultan de las
mutaciones en los genes que codifican la subunidad \alpha y la
subunidad \beta de la hexosaaminidasa y la proteína activadora
de GM2 respectivamente. Se caracterizan por la neurodegeneración
progresiva en respuesta a los niveles elevados de almacenamiento
lisosomal de GM2 y GSLs relacionados, en neuronas del sistema
nervioso central (SNC) (Grave et al. (1995) en The Metabolic
and Molecular Bases of Inherited Disease (Scriver et al.) Vol
2, pp 2.839-79, 3 vols, McGraw Hill, New York).
Actualmente no hay terapias para estas enfermedades. Las
estrategias terapéuticas potenciales para la enfermedad de
Tay-Sachs y la enfermedad de Sandhoff incluyen un
aumento enzimático y una privación de sustrato (Radin (1996)
Glycoconj. J. 13:153-7; Platt et al.
(1998) Biochemical Pharmacology
56:421-30). El aumento del nivel de enzima se
puede conseguir usando tres estrategias clínicas: sustitución
enzimática, transplante de médula ósea y terapia genética.
La administración intravenosa de
glucocerebrosidasa terminada en manosa
(\beta-D-glicosil-N-acilesfingosina
glucohidrolasa, EC 3.2.1.45) es una terapia eficaz para la
enfermedad de Gaucher tipo 1, la cual es una enfermedad por
almacenamiento de GSL no neurológico (Grabowski et al. (1995)
Ann. Intern. Med. 122:33-39; Beutler
et al. (1991) Blood 78:1.183-9).
Puesto que las enzimas de glicoproteína no logran atravesar la
barrera de sangre cerebral, ésta no es una propuesta adecuada para
la enfermedad que supone un almacenamiento de GSL en el SNC. El
transplante de médula ósea tiene el potencial para incrementar los
niveles enzimáticos en la periferia y para un alcance limitado en
el SNC, debido a la secreción de enzima a partir de las células de
origen de médula ósea, incluyendo la microglía (Krivit et al.
(1995) Cell-Transplant
4:385-392). Los resultados del transplante
de médula ósea en trastornos del almacenamiento lisosomal de GSL que
suponen un almacenamiento en el SNC han sido mixtos (Hoogerbrugge
et al. (1995) Lancet
345:1.398-1.402). Recientemente Se informó
del éxito parcial en un modelo de ratón de enfermedad de Sandhoff
de médula ósea tipo silvestre singeneica dada (Norfus et al.
(1998) J. Clin. Invest. 101:1.881-8).
Esto condujo a un incremento de la supervivencia de los ratones y
a un mejoramiento de la función neurológica. La terapia genética
también es prometedora para tratar estas enfermedades, aunque
actualmente esto es experimental (Salvetti et al. (1995) Br.
Med. Bull 51:106-122). La privación de
sustrato es una propuesta farmacológica genérica potencial para
tratar los trastornos del almacenamiento de GSL (Platt et al.
(1998) Biochemical Pharmacology
56:421-30), incluyendo las gangliosidosis
GM2. Esta estrategia está basada en la inhibición parcial de la
glucosiltransferasa específica de ceramida (glucosilceramida
sintasa,
UDP-glucosa:N-acilesfingosina
D-glucosiltransferasa, EC 2.4.1.80) que cataliza la
primera fase en la biosíntesis de GSL (Sandhoff et al. (1998)
Adv. Lipid Res. 26:119-142). Esto
reduciría los niveles de GSLs sintetizados, así podrían ser
enteramente catabolizados por la actividad enzimática residual
presente en las células.
La privación de sustrato, utilizando el inhibidor
de la biosíntesis de GSL, N-butildesoxinojirimicina
(NB-DNJ), se ha ensayado previamente en un modelo
in vitro de la enfermedad de Gaucher y se ha demostrado para
prevenir el almacenamiento (Platt et al. (1994) J. Biol.
Chem. 269:8.362-6). La
NB-DNJ también se ha evaluado en un modelo
asintomático de ratón de la enfermedad de Tay-Sachs
y se ha demostrado para reducir la acumulación de GM2 en el
cerebro y para prevenir la neuropatología asociada con su
almacenamiento (Platt et al. (1997) Science
276:428-31).
El amino azúcar
N-butildesoxinojirimicina (NB-DNJ)
es un potente inhibidor de la alfa-glucosidasa 1
(implicada en la síntesis del N-glicano), e incluso
un inhibidor más potente de la glucosilceramida
glucosiltransferasa. La NB-DNJ actualmente está
sometiéndose a pruebas clínicas como un tratamiento para las
enfermedades de Gaucher tipo 1 y de Fabry, trastornos del
almacenamiento de glicolípidos resultante de las mutaciones en la
glucocerebrosidasa y en la alfa-galactosidasa A,
respectivamente.
Ahora hemos encontrado que la
NB-DNJ administrada a ratones junto con la
glucocerebrosidasa (la terapia más importante para los pacientes de
Gaucher Tipo 1), inesperadamente no compromete la actividad de la
glucocerebrosidasa y proporciona un aumento de la actividad
enzimática a lo largo del tiempo debido a un efecto protector de
la NB-DNJ sobre la enzima. Esto es sorprendente,
puesto que se esperaría que la eficacia de la enzima se
comprometiera en presencia de la NB-DNJ, puesto que
ésta es un inhibidor débil de la glucocerebrosidasa (IC_{50}=0,52
mM). Además, también hemos encontrado que la
co-administración de NB-DNJ con el
transplante de médula ósea (para proporcionar un aumento
enzimático para incrementar el índice de degradación de
glicolípidos neuronal) proporciona un efecto sinérgico
inesperado.
Así la presente invención proporciona el uso de
la N-butildesoxinojirimicina
(NB-DNJ) en la fabricación de un medicamento para la
administración combinada con un agente capaz de incrementar el
índice de degradación en el tratamiento de un trastorno del
almacenamiento de glicolípidos seleccionado entre: enfermedad de
Gaucher, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Fabrys, enfermedad
de Tay-Sachs, trastorno del almacenamiento de
Niemann-Pick tipo C y gangliosidosis GM1.
La enfermedad de Gaucher, enfermedad de Sandhoff,
enfermedad de Fabrys, enfermedad de Tay-Sachs,
trastorno del almacenamiento de Niemann-Pick tipo C
y la gangliosidosis GM1 son trastornos que resultan de la
acumulación/almacenamiento de la glucosilceramida que contiene
glicolípidos.
Los agentes capaces de incrementar el índice de
degradación de glicolípidos (preferiblemente pero no básicamente
glicolípidos neuronales) incluyen enzimas que degradan
glicolípidos, por ejemplo glucocerebrosidasa, hexosaaminidasas
lisosomales, galactosidasas, sialidasas y glucosilceramida
glucosidasa, y moléculas que incrementan la actividad de dichas
enzimas. Además, el agente podría comprender una secuencia de
ácido nucleico (ADN o ARN) que codifica las enzimas mencionadas
anteriormente, es decir, dichas secuencias podrían introducirse
para incrementar la producción natural de dichas enzimas. El
agente incluso puede comprender médula ósea transplantada. Se puede
usar una combinación de los agentes anteriores.
Se conoce el análogo de galactosa de la
NB-DNJ,
N-butildeoxigalactonojirimicina
(NB-DGJ), para inhibir la síntesis de GSL in
vitro tan eficazmente como la NB-DNJ, pero es
más específico en el sentido de que no inhibe la
\alpha-glucosidasa I y II ni la
\beta-glucocerebrosidasa (Platt et al., (1994)
J. Biol. Chem. 269(43):27.108-14). Se
sabe que sólo aproximadamente el 10% del nivel en suero de
NB-DNJ está presente en el fluido
cerebro-espinal. Por lo tanto, puede que se tenga
que administrar dosis sistemáticas elevadas de
NB-DNJ para conseguir niveles terapéuticos en el
SNC, y puede que se tenga que administrar mientras dure la vida de
los pacientes. Las concentraciones elevadas de
NB-DJN en humanos causan diarrea y en ratones causan
pérdida de peso y reducen el tamaño de los órganos linfoides.
Se prevé que la NB-DNJ puede
administrarse a un paciente con un trastorno del almacenamiento de
glicolípidos para mantener los niveles bajos de glicolípidos. Si la
dosificación de NB-DNJ, por cualquier razón, es
incorrecta se puede administrar un agente para incrementar el
índice de degradación de glicolípidos para restablecer los niveles
bajos de glicolípidos.
Los métodos y los procesos para la fabricación de
N-butildesoxinojirimicina pueden encontrarse, por
ejemplo, en el documento de patente US A 4.182.767, EP B
0.012.278,EP A 0.624.652, US A 4.266.025, US A 4.405.714 y US A
5.151.519.
Los medicamentos descritos en la invención pueden
incluir uno o más de los siguientes: agentes conservantes, agentes
solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes humedificantes,
emulsionantes, edulcorantes, aromatizantes, sales, tampones,
agentes de revestimiento o antioxidantes. También pueden contener
agentes terapéuticamente activos además de los compuestos y/o
agentes descritos en la invención.
Los medicamentos pueden estar adaptados para la
administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo: vía oral
(incluyendo bucal y sublingual), rectal, nasal, local (incluyendo
bucal, sublingual o transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo
subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Dicha
composición puede preparase por cualquier método conocido en la
técnica de farmacia, por ejemplo, mezclando el ingrediente activo
con un vehículo bajo condiciones estériles.
Ahora, varias vías de administración se
considerarán a mayor detalle:
Los medicamentos adaptados para la administración
oral pueden proporcionarse como cápsulas o comprimidos; como
polvos o gránulos; como disoluciones, jarabes o suspensiones (en
líquidos acuosos o no acuosos); como espumas comestibles o batidos;
o como emulsiones.
Los comprimidos o las cápsulas de gelatina dura
pueden comprender: lactosa, almidón de maíz o derivados del mismo,
ácido esteárico o sales del mismo.
Las cápsulas de gelatina blanda pueden
comprender: aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos
o líquidos, etc.
Las disoluciones y los jarabes pueden comprender:
agua, polioles y azúcares.
Para la preparación de suspensiones de aceites
(por ejemplo, aceites vegetales) pueden suministrarse suspensiones
de aceite en agua o suspensiones de agua en aceite.
\newpage
Los medicamentos adaptados para la administración
transdérmica pueden proporcionarse como parches específicos con la
intención de mantener en íntimo contacto con la epidermis del
destinatario durante un periodo de tiempo prolongado.
Por ejemplo, el ingrediente activo puede
liberarse del parche por iontoforesis (la iontoforesis está
descrita en Pharmaceutical Research, 3(6):318
(1986)).
Los medicamentos adaptados para la administración
local pueden proporcionarse como: pomadas, cremas, suspensiones,
lociones, polvos, disoluciones, pastas, geles, pulverizadores,
aerosoles o aceites.
Para las infecciones del ojo o de otros tejidos
externos, por ejemplo la boca y la piel, preferiblemente se usa
una pomada o una crema local. Si está formulado en una pomada, el
ingrediente activo puede emplearse tanto con una base de pomada
parafínica como con una base de pomada miscible en agua.
Alternativamente, el ingrediente activo puede estar formulado en
una crema con una base de aceite en agua con una base de agua en
aceite.
Los medicamentos adaptados para la administración
local para el ojo incluyen gotas para los ojos. Aquí el
ingrediente activo puede disolverse o suspenderse en un vehículo
adecuado, por ejemplo, en un disolvente acuoso.
Los medicamentos adaptados para la administración
local en la boca incluyen: caramelos, pastillas y enjuagues.
Los medicamentos adaptados para la administración
rectal pueden proporcionarse como supositorios o enemas.
Los medicamentos adaptados para la administración
nasal, los cuales usan vehículos sólidos, incluyen un polvo grueso
(por ejemplo uno que tiene un tamaño de partícula en el intervalo
de 20 a 500 micras). Éste puede administrarse a la manera en que
se toma el tabaco en polvo, es decir, inhalando rápidamente a través
de la nariz desde un recipiente de polvo mantenido cerca de la
nariz.
Las composiciones adaptadas para la
administración nasal, las cuales usan vehículos líquidos, incluyen
pulverizadores nasales o gotas nasales. Éstas pueden comprender
disoluciones acuosas o disoluciones de aceite del ingrediente
activo.
Los medicamentos adaptados para la administración
por inhalación incluyen partículas finas de polvo o vahos, que
pueden generarse por medio de varios tipos de aparatos, por
ejemplo: aerosoles presurizados, nebulizadores o insufladores.
Dichos aparatos pueden construirse así para proporcionar
dosificaciones predeterminadas del ingrediente activo.
Los medicamentos adaptados para la administración
vaginal pueden proporcionarse como fórmulas en: pesarios, tampones,
cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores.
Los medicamentos adaptados para la administración
parenteral incluyen disoluciones o suspensiones inyectables
estériles acuosas y no acuosas. Estas pueden contener
antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que dejan a las
composiciones sustancialmente isotónica con la sangre del
destinatario deseado. Otros componentes que pueden estar presentes
en dichas composiciones incluyen, por ejemplo: agua, alcoholes,
polioles, glicerina y aceites vegetales. Las composiciones adaptadas
para la administración parenteral pueden presentarse en
recipientes de dosis única o de dosis múltiple, por ejemplo
ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en una condición
de secado por congelación (liofilizado) que solamente requiere la
adición de un vehículo líquido estéril, por ejemplo agua estéril
para las inyecciones, inmediatamente antes de usar. Pueden
prepararse disoluciones y suspensiones extemporáneas de la
inyección a partir de polvos, gránulos y comprimidos.
Las dosificaciones se determinarán fácilmente
mediante pruebas rutinarias, y estarán bajo el control del médico o
del clínico. El principio para determinar una dosis adecuada
procederá de una cantidad de material adecuadamente eficaz pero no
tóxica o aceptablemente tóxica. Para la NB-DNJ, una
dosificación diaria para un adulto se podría esperar que estuviera
en el intervalo de 1 mg a 2 g de agente activo, y puede estar en
el intervalo de 100 a 800 mg o de 300 a 600 mg. La dosificación
puede administrarse en una única dosis diaria o alternativamente
en dos, tres o más dosis durante el día.
Las características preferidas de cada aspecto de
la invención son como para cada una de los otros aspectos
mutatis mutandis.
En los dibujos adjuntos:
La Figura 1 es una gráfica que representa el % de
supervivencia frente a la edad, en días, de los ratones Sandhoff
tratados con diferentes agentes.
Las Figuras 2A-D son gráficas que
muestran la distribución a corto plazo de la
NB-DNJ y NB-DGJ radiomarcada en
ratón. Los ratones (n = 5 por grupo) se analizaron minuciosamente
90 min después de la administración oral de
[^{14}C]-NB-DNJ (barras vacías) o
[^{3}H]-NB-DGJ (barras rellenas).
A = compuesto total en intestino y en orina. B = compuesto total
en órganos. C = concentración del compuesto en suero. D = compuesto
en órganos expresado como una proporción de compuesto en suero. *
indica una diferencia significativa entre los ratones tratados con
NB-DNJ y los ratones tratados con
NB-DGJ (p<0,05).
Las Figuras 3A-C muestran la
reducción de glicoesfingolípido en hígado de ratón después de
alimentarlos con NB-DNJ o NB-DGJ. Se
purificaron los gangliósidos del hígado y se separaron por TCL. La
concentración de GM2 se midió mediante una densitometría de los
cromatogramas de TCL escaneados. A = concentración de GM2 en
hígados de ratones alimentados con 300-4.800
mg/kg/día de NB-DNJ (barras vacías) o de
NB-DGJ (barras rellenas) durante 10 días, (n = 5 por
grupo). B = banda de GM2 de hígados de ratones tratados durante 5
semanas con 2.400 mg/kg/día, separada por TCL. C = densitometría
del TCL en B. * indica concentraciones significativamente
inferiores que la concentración control (p<0,05).
La Figura 4 muestra el crecimiento de los ratones
alimentados con NB-DNJ o con
NB-DGJ. Se dio a los ratones 2.400 mg/kg/día de
NB-DNJ (o), NB-DGJ ( ), o de una
dieta control ( ), N = 10 por grupo. *indica una diferencia
significativa en comparación con los pesos del control
(p<0,001).
La figura 6 muestra la inhibición de la actividad
de la lactasa por NB-DNJ, NB-DGJ,
DNJ y DGJ. La actividad de la lactasa expresada como el % de
actividad control a diferentes concentraciones de
NB-DNJ (o), NB-DGJ ( ), DNJ
\hbox{( )} y DGJ ( ).
Ahora se describirá la invención con referencia a
los siguientes ejemplos, los cuales, no deberían interpretarse de
ninguna manera como limitantes del alcance de la invención.
Se trataron un grupo de ratones con
NB-DNJ a 4.800 mg/kg/día durante 5 semanas. Después
de una dosis intravenosa baja (5-10 U/kg) de
Ceredase™ (Genzyme Corporation), administrada como una inyección
individual por la vena del rabo, la actividad enzimática en suero
se midió mediante la toma secuencial de muestras de suero de la
vena del rabo para controlar la actividad enzimática a lo largo del
tiempo. Ceredase™ es una forma modificada de la
\beta-glucocerebrosidasa. Los resultados se
muestran en la Tabla 1 de a continuación.
| Efecto del NB-DNJ sobre la actividad circulatoria y la semivida de Ceredase™ | ||
| Ratón | Pico de Actividad | T_{1/2} (min) |
| Control 1 | 5,8 | 4,2 |
| 2 | 7,9 | 3,3 |
| 3 | 8,0 | 1,5 |
| 4 | 6,8 | 1,8 |
| 5 | 30,0 | 1,4 |
| Efecto del NB-DNJ sobre la actividad circulatoria y la semivida de Ceredase™ | ||
| Ratón | Pico de Actividad | T_{1/2} (min) |
| 6 | 2,8 | 2,0 |
| 7 | 13,6 | 1,2 |
| 8 | 17,6 | 1,2 |
| Media \pm EEM | 11,6\pm3,1 | 2,1\pm0,4 |
| NB-DNJ 1 | 13,9 | 1,7 |
| 2 | 32,1 | 4,9 |
| 3 | 24,1 | 5,3 |
| 4 | 13,1 | 3,0 |
| 5 | 21,0 | 3,5 |
| 6 | 68,3 | 2,4 |
| 7 | 19,2 | 2,8 |
| Media \pm EEM | 27,4\pm7,2 | 3,4\pm0,5 |
La actividad y las semividas en suero de
Ceredase™ parecían incrementarse en ratones tratados con
NB-DNJ, sugiriendo un efecto protector del compuesto
a la muerte enzimática. Por tanto, (a) la
co-administración de NB-DNJ con
Ceredase™ no compromete la actividad y (b) hay un sorprendente
aumento de la actividad enzimática a lo largo del tiempo debido a
un efecto protector del compuesto sobre la enzima.
Se transplantó la médula ósea a ratones Sandhoff
a las dos semanas de edad y se inició la terapia a las
9,5-11 semanas de edad (600 mg/kg/día). Las curvas
de supervivencia se trazaron, para cada grupo de animales, con cada
punto sobre la gráfica que representan una muerte (véase Figura
1). Los no tratados (no TMO, no fármaco) sobrevivieron (el
superviviente más duradero) hasta 140 días (círculos rellenos),
solamente con NB-DNJ (no TMO) sobrevivieron hasta
170 días, solamente con TMO (no NB-DNJ)
sobrevivieron hasta 200 días, y con NB-DNJ más TMO
se había ampliado la supervivencia de 200 a 280 días. Los datos
muestran sinergia de aproximadamente el 13% del aditivo
anterior.
En los ejemplos 3-7 de a
continuación, se usaron los siguientes materiales y métodos:
Ratones C57BL/6 hembra se guardaron bajo
condiciones no-estériles estándar. Se proporcionó a
los ratones agua ad libitum y, anterior a la administración
del fármaco, se alimentaron con comida en píldora (expended Rat and
Mouse Chow 1, SDS Ltd., Withman, Essex, GB). Todos los experimentos
se realizaron sobre animales agrupados por edad.
Los ratones (6 semanas de edad) se alimentaron
con una dieta de comida en polvo (expended Rat and Mouse Chow 3,
ground, SDS Ltd,) o con una dieta que contiene
NB-DNJ o NB-DGJ. La dieta y el
compuesto (ambos como sólidos secos) se mezclaron totalmente, se
almacenaron a temperatura ambiente, y se usaron a los 7 días de la
mezcla. Los ratones se mantuvieron con NB-DNJ o
NB-DGJ a dosis de 300-4.800
mg/kg/día durante 10 días, o dosis de 2.400 mg/kg/día durante 5
semanas.
Un método de galactosa
oxidasa/Na[^{3}H]_{4}B se usó para radiomarcar el
carbono C6 de la NB-DGJ. Una disolución de
NB-DGJ (1,3 mg), galactosa oxidasa (80 unidades), y
catalasa (37.000 unidades) en 200 \mul de tampón fosfato sódico
10 mM se incubó durante 24 h a temperatura ambiente mientras se
agitaba. La reacción se paró calentando la disolución a 95ºC
durante 5 min. Después de centrifugar (10 min, 13.000 rpm), se
añadió NaOH 1M al supernatante hasta que se alcanzó un pH
10-12. Se añadió Na[^{3}H]_{4}B
(4,3 ml) y se incubó la disolución durante 2h a 30ºC, después de
esto se añadió NaBD_{4} (1 mg) y se incubó la disolución durante
1 h a 30ºC. La disolución fue neutralizada con ácido acético 1M y
luego se secó. Después de eliminar el borato mediante el lavado con
metanol acidificado (ácido acético glacial al 0,6% en metanol) de
5-10 veces, la mezcla se resuspendió en agua, se
añadió a una columna AG50 (calibrada con agua) y se eluyó con
NH_{3} 1-4M. Además, la
[^{3}H]-NB-DGJ se purificó en
HPLC (Cromatografía CS10 hpcec Dionex, elución isocrática con
Na_{2}SO_{4} 50 mM, H_{2}SO_{4} 2,5 mM, y ACN al 5% y
finalmente se repitió la fase de la columna AG50.
Los ratones fueron oralmente alimentados por
sonda con 100 \mul de agua que contenía 25 \mug (10^{6} cpm)
de [^{14}C]-NB-DNJ o
[^{3}H]-NB-DGJ y 1 mg de
NB-DNJ o NB-DGJ no radiomarcada,
respectivamente. Se recogieron la orina y los excrementos durante
90 min. Después de 90 min los ratones fueron sacrificados y se
recogió el suero, los órganos y cualquier orina y excrementos
adicionales. Los órganos se homogeneizaron en un volumen de cuatro
veces de agua y los excrementos en un volumen de diez veces. Las
alícuotas de 500 \mul de homogeneizado, 100 \mul de orina o de
50 \mul de suero se mezclaron con 4 ml de fluido florescente y
se midieron los recuentos de [^{14}C] o [^{3}H]. El
enfriamiento para los diferentes tejidos de ambos isótopos se
determinó midiendo los recuentos de las cantidades conocidas del
compuesto radiomarcado añadido a los homogeneizados de tejido y por
lo tanto, se corrigieron los resultados.
Las muestras de hígado se homogeneizaron en agua
y se liofilizaron. Los homogeneizados secos se extrajeron dos veces
en cloroformo: metanol (2:1, v/v), primero durante la noche a 4ºC
y luego durante 3 h a temperatura ambiente, se juntaron y secaron
bajo nitrógeno. Los extractos se resuspendieron en 500 \mul de
cloroformo:metanol (1:1, v/v), se trataron con base mediante la
adición de 83 \mul de NaOH 0,35M en metanol y se dejaron reposar
durante 90 min a temperatura ambiente y se dividieron mediante la
adición de 83 \mul de agua:metanol (9:1, v/v), 166,5 \mul de
agua y 416 \mul de cloroformo. La fase superior que contenía los
gangliósidos se separó de la fase inferior después de mezclar y
centrifugar a baja velocidad, y la fase inferior se lavó dos veces
con Folsh (cloroformo:metanol:KCl al 0,47%, 3:48:47, v/v). Las
fases inferiores se combinaron, se secaron hasta medio volumen bajo
nitrógeno, se sometieron a diálisis frente a agua, se liofilizaron
y se resuspendieron en cloroformo:metanol (2:1, v/v). Un
equivalente de 5 mg de peso seco de tejido se separó por TCL con
cloroformo:metanol:CaCl_{2} al 22%, 60:35:8, v/v). La placa de TCL
se secó al aire, se pulverizó con orcinol:ácido sulfúrico (0,2%
(w/v):2N), y se trató con calor (90ºC durante 10 min). La
intensidad de las bandas se cuantificó mediante una densitometría de
barrido.
El homogeneizado del suero y del supernatante de
hígado (130 mg/ml en metanol al 10%) se centrifugó tres veces a
través de un filtro Millipore Ultrafree, después de que se hubiera
añadido un estándar interno (NB-pentilDNJ) a las
muestras. Los filtrados juntados se purificaron en una columna SCX
precondicionada a HC1, se eluyeron con NH_{3} al 1% en MeOH, se
secaron, se resuspendieron en agua, además se purificaron sobre una
columna C18 (precondicionamiento a MeOH, lavado en agua y elución de
MeOH) y, finalmente, se cuantificaron por HPLC (cromatografía hpcec
CS10 Dionex, elución isocrática con Na_{3}SO_{4} 50 mM,
H_{3}SO_{4} 2,5 mM y ACN al 5%).
Las enzimas sucrasa-isomaltasa
(EC 3.2.1.10/48) y lactasa-florizina hidrolasa (EC
3.2.1.62/108) se purificaron a partir del intestino porcino a 4ºC
como sigue: el intestino (100 g) se cortó en trozos pequeños, se
lavó mediante agitación en 250 ml de NaCl 150 mM/KCl 10mM durante
30 min y se extrajo dos veces con 125 ml de urea 2M, EDTA 50 mM y
KCl 50 mM a pH 7; los extractos de urea se combinaron y se
homogeneizaron (batidora Waring), el homogeneizado se centrífugo a
60.000g durante 75 min y el aglomerado se resuspendió en 50 ml de
una disolución que contenía EDTA 10 mM y
L-cisteina-HCl 10 mM en tampón
fosfato potásico 50 mM a pH 7,5 (pre-calibrado a
37ºC); después de la adición de papaína (15 unidades/ml), la mezcla
se incubó durante 30 min a 37ºC y se centrifugó a 105.000g durante
60 min; se retiró el supernatante y se precipitó en 75 ml de etanol
a -20ºC durante 1 h; el precipitado se recuperó por centrifugación
a 5.000g durante 10 min, se disolvió en 5-10 ml de
tampón fosfato potásico 10 mM a pH 7,5 y la disolución se
centrifugó a 30.000g durante 60 min. Se retiró el supernatante y se
almacenó a 4ºC en presencia de azida sódica al 0,02%. La actividad
de la sucrasa, maltasa y lactasa se determinó en la precipitación
enzimática (diluida a una concentración adecuada) incubando 50
\mul de enzima, 125 \mul de tampón citrato sódico (60 mM, pH 6)
y 125 \mul de sustrato de disacárido a 37ºC durante 30 min,
calentando a 100ºC durante 3 min para inactivar la enzima,
centrifugando la mezcla a 13.000g durante 10 min y determinando la
concentración de glucosa mediante la adición de 50 \mul del
supernatante a 1 ml de reactivo trinder (Sigma) y leyendo la
absorbancia a 505 nm después de 18 min.
Se emplearon métodos estadísticos convencionales
para calcular los valores medios y los errores estándar de la media
(EEM). Las diferencias entre los grupos de ratones se ensayaron en
cuanto a significatividad usando la prueba t de Student para
observaciones impares. Los resultados en el texto y en las tablas se
presentan como las medias \pmEEM.
La distribución a corto plazo de
NB-DGJ y NB-DNJ en ratones se
determinó dando los compuestos a los animales por alimentación por
sonda oral. Los recuentos radiactivos en órganos, suero,
excrementos y orina se midieron después de 90 min. La concentración
de NB-DNJ fue de un 28% más alta que de
NB-DGJ en el total de orina recogida, mientras que
en el intestino hubo un 77% más de NB-DGJ que de
NB-DNJ (Fig. 2A). Esto sugiere que la
NB-DGJ salió más lentamente del tracto
gastrointestinal (GI) en relación con la NB-DNJ.
Parecía no haber diferencia en la distribución de los dos
compuestos en otro tejido (Fig 2B). Sin embargo, la concentración
en suero difería significativamente con un nivel más bajo de la
NB-DGJ en relación con la NB-DNJ
(Fig 2C), posiblemente reflejando una absorción más lenta de la
NB-DGJ desde el tracto GI. Cuando se ajustó a los
niveles diferenciales en suero, la NB-DGJ se
distribuyó al tejido más eficazmente que la NB-DNJ
(Fig. 2D).
Para ensayar los niveles de estado estacionario
de los compuestos cuando se administran a largo plazo por vía
oral, las concentraciones de NB-DNJ y
NB-DGJ en suero e hígado se determinaron por HPLC
después de tratar a los ratones con 2.400 mg/kg/día de
NB-DNJ o NB-DGJ
(no-radiomarcada) durante 5 semanas (véase la Tabla
2 de a continuación). Tanto la concentración en suero como la
concentración en hígado del fármaco fueron más elevadas en ratones
tratados con NB-DGJ en comparación con los ratones
tratados con NB-DNJ (66\pm3,1 \muM en
comparación con 51\pm13,3 \muM para suero y 207\pm30,6
\muM en comparación con 103\pm21,2 para hígado). El nivel de
NB-DGJ en hígado en comparación con el de
NB-DNJ sugiere que la NB-DGJ es
absorbida selectivamente dentro del hígado en comparación con la
NB-DNJ. Así, la NB-DGJ puede entrar
en los tejidos más eficazmente y persistir más tiempo que la
NB-DNJ.
| Concentración de NB-DGJ y NB-DNJ en suero e hígado: Los ratones se trataron con 2.400 mg/kg/día | ||
| de NB-DGJ o NB-DNJ durante 5 semanas (n=2), y luego se determinó la concentración del compuesto | ||
| en suero e hígado por series duplicadas en HPLC. | ||
| Concentración de compuesto (\muM) | ||
| Suero | Hígado | |
| NB-DGJ | 60\pm3,1 | 207\pm30,6 |
| NB-DNJ | 51\pm13,3 | 103\pm21,2 |
El grado de reducción de GSL en hígado después de
10 días o 5 semanas de tratamiento se comparó entre ratones
administrados con NB-DGJ o NB-DNJ.
Los hígados se extrajeron en cloroformo:metanol, los gangliósidos
se analizaron mediante cromatografía de capa fina y la intensidad
de la banda de GM2 se cuantificó por densitometría. Las
concentraciones relativas de GM2 (comparadas con los ratones
control) en hígados de ratones tratados con un intervalo de dosis de
NB-DGJ o NB-DNJ
(300-4.800 mg/kg/día) durante 10 días muestran una
respuesta dependiente de la dosis para ambos compuestos (véase
Fig. 3A). No hubo diferencia significativa entre la reducción de
GM2 conseguida por los dos compuestos a ninguna de las
concentraciones ensayadas. Después de un tratamiento más duradero
(2.400 mg/kg/día durante 5 semanas), las concentraciones de GM2 en
los hígados de los ratones tratados con NB-DNJ o
NB-DGJ se redujeron a 35\pm4% y a 26\pm11%,
respectivamente, en relación con la concentración en los hígados
control (véase Figs 3B y C).
Así, ambos análogos (NB-DNJ y
NB-DGJ) mostraron ser potentes inhibidores de la
biosíntesis de GSL in vivo. Después de 10 días de
tratamiento, la reducción dependiente de la dosis de GSL se vio en
hígados de ratones alimentados tanto con NB-DNJ
como con NB-DGJ. La dosis más baja que causó
reducción de GSL fue de 600 mg/kg/día (una reducción del 25%). La
dosis más elevada evaluada (4.800 mg/kg/día) causó una reducción
del 60-70%. Datos similares se obtuvieron con ambos
compuestos. Aunque hay una concentración de NB-DGJ
en hígado dos veces más elevada, ésta no se observó cuando se midió
la reducción de GSL, donde ambos compuestos dan una inhibición de
la biosíntesis de GM2 comparable. Esto puede reflejar una absorción
celular diferencial de los compuestos en los hepatocitos, células
endoteliales y en las células de Kuppfer cuando el GM2 puede ser
principalmente el producto de un tipo de célula, mientras que el
compuesto podría aislarse en células no sintetizadoras de GM2.
También se determinó la reducción de GSL después de un tratamiento
más duradero a una dosificación de 2.400 mg/kg/día. Después de 5
semanas de alimentación, la concentración de GM2 se redujo en un
74% por la NB-DGJ y en un 65% por la
NB-DNJ.
Para examinar el buen estado general de los
ratones tratados con NB-DGJ o
NB-DNJ (2.400 mg/kg/día durante 5 semanas), los
ratones se controlaron 2-3 veces por semana, se
tomaron los pesos corporales y se determinaron los efectos de la
NB-DGJ y NB-DNJ sobre los índices de
crecimiento (véase Fig. 4). Los ratones tratados con
NB-DNJ crecieron más lentamente que los ratones
control no tratados, mientras que los ratones tratados con
NB-DGJ no mostraron diferencia en los índices de
crecimiento en relación con los controles no tratados. Después de 5
semanas de tratamiento, los ratones con NB-DNJ
pesaron un 25% menos que los ratones control y que los ratones con
NB-DGJ. Los timos y los bazos extraídos de los
ratones con NB-DNJ fueron más pequeños que
aquellos de los ratones control o de los ratones con
NB-DGJ (véase Fig. 5), mientras que los pesos de
los otros órganos tales como el hígado y el riñón no estaban
afectados. El tratamiento con NB-DNJ redujo el peso
de los timos en un 61\pm2% y del bazo en un 62\pm3% en
comparación con los órganos de los ratones control. En contraste,
la NB-DGJ no tenía efecto sobre el peso del órgano
linfoide. La pérdida de peso corporal en ratones con
NB-DNJ no justificaba la gran reducción en el tamaño
del órgano linfoide. Si se expresaba como una proporción con el
peso corporal, los pesos de los órganos se redujeron aún
significativamente (timos en relación con el peso corporal se
reducía en un 45\pm5% y el bazo en relación con el peso corporal
en un 48\pm4% en ratones con NB-DNJ en
comparación con los controles). Se observó que los ratones tratados
con NB-DNJ tenían menos grasa asociada con sus
órganos (riñón, bazo, etc.) y carecían de grasa subcutánea en
comparación con los ratones control o con los ratones tratados con
NB-DGJ (no se muestran los datos).
El hecho de que la pérdida de peso corporal y la
reducción del tamaño del órgano linfoide sean causadas por la
NB-DNJ, pero no por la NB-DGJ,
sugiere que estos efectos son una función de la inhibición de la
glucosidasa (o una actividad no identificada hasta ahora) por el
NB-DNJ, no inhibición de la biosíntesis del GSL (una
actividad compartida por ambos compuestos). El efecto de la
NB-DNJ en el presente estudio sobre la inhibición
de la degradación del glicógeno podría proporcionar una posible
explicación a al menos parte de la pérdida de peso observada en
los ratones tratados con NB-DNJ. Se mostró que,
después de 12h de inanición, cuando los ratones control y los
tratados con NB-DGJ habían destruido la mayoría de
su glicógeno, los ratones tratados con NB-DNJ aún
tenían una cantidad significativa de glicógeno en sus hígados.
Tanto siguiendo la inanición como entre los episodios de
alimentación, el ratón degradaría normalmente glicógeno para
proporcionar glucosa al cerebro, a los músculos y a los otros
tejidos del cuerpo. Sin embargo, si la glicogenolisis se inhibiera
parcialmente, como en los ratones tratados con
NB-DNJ, el ratón tendría que usar otras fuentes de
combustible, tales como la grasa, para cubrir su demanda de
energía. El almacenamiento del tejido adiposo disminuiría con el
tiempo dando como resultado un peso corporal reducido. Esta
hipótesis concuerda con la observación de que los ratones tratados
con NB-DNJ (tanto alimentados como hambrientos)
tenían muy poca grasa subcutánea en comparación con los ratones
normales o con los ratones tratados con NB-DGJ. La
inhibición de la glicogenolisis por la NB-DGJ es
probablemente debida a la inhibición de la enzima desramificante de
glicógeno
(4-\alpha-glucanotransferasa, EC
2.4.1.25 y
\alpha-1,6-glucosidasa, EC
3.2.1.33). Aunque nunca se informó para NB-DNJ, la
inhibición de la actividad
\alpha-1,6-glucosidasa de esta
enzima ha sido previamente observada para otros derivados de la DNJ
(Aral et al. 1998, Circulation
97(13):1.290-7; Bollen et al. Eur. J.
Biochem. 181(3):775-80). Si esto es
también el caso de la NB-DNJ, en los periodos de
tratamiento prolongados esto podría causar almacenamiento de
glicógeno (patológico). Sin embargo, si esto ocurre, se estará
excediendo el almacenamiento lento ya que los animales con fármacos
durante periodos prolongados superiores a seis meses no muestran
signos de patología (no se muestran los datos). Lo que puede estar
ocurriendo es que el nivel basal de glicógeno se incremente debido
a la inhibición parcial de la enzima, pero que esto permanece
relativamente constante a lo largo del tiempo a las dosis de
inhibidor usadas en este estudio.
Los ratones tratados con NB-DNJ
tenían consistentemente órganos linfoides más pequeños. Sin
embargo, la NB-DGJ no mostró este efecto, insinuando
de nuevo que éste no es el resultado de la inhibición de la
biosíntesis de GSL en animales tratados con
NB-DNJ.
La NB-DGJ, NB-DNJ
y el compuesto DNJ no-alquilatado parental se
valoraron por sus capacidades de inhibir las actividades de la
sucrasa y maltasa de la enzima sucrasa-isomaltasa
(la cual tiene actividades disacaridasas para la degradación de la
sucrosa, maltosa e isomaltosa). La inhibición de esta enzima por la
DNJ ha sido previamente informada (Hanozet et al.,(1981), J.
Biol. Chem. 256:3.703-3.711). Se
variaron las concentraciones tanto del sustrato como del inhibidor
y se calculó la K_{i} (véase Tabla 3). Se encontró que la
NB-DNJ y la DNJ eran inhibidores potentes de tanto
sucrasa como de maltasa (K_{i} (sucrasa) = 0,03 \muM y K_{i}
(maltasa = 0,07 \muM para DNJ, y K_{i} (sucrasa) = 0,26 \muM
y K_{i} (maltasa) = 0.37 \muM para NB-DNJ),
mientras que la NB-DGJ era menos potente (K_{i}
(sucrasa) = 2 mM, (maltasa) no inhibidor a 2 mM).
La NB-DNJ, DNJ,
NB-DGJ y DGJ también se ensayaron por su capacidad
para inhibir la lactasa (Fig. 6 y Tabla 4). La DNJ,
NB-DGJ y DGJ inhibieron la lactasa (K_{i} de 13
\muM, 30 \muM y 85 \muM para DNJ, DGJ y
NB-DGJ, respectivamente). La inhibición de la
lactasa por NB-DNJ fue muy débil (K_{i} =
4mM).
| K_{i}s para la inhibición de sucrasa y maltasa por DNJ, NB-DNJ y NB-DGJ. NI (no-inhibidor a 2 mM) | ||
| K_{i}(\muM) | ||
| Sucrasa | Maltasa | |
| DNJ | 0,03 | 0,07 |
| NB-DNJ | 0,26 | 0,37 |
| NB-DGJ | 2000 | NI |
| K_{i}s para la inhibición de lactasa por DNJ, NB-DNJ, DGJ y NB-DGJ | |
| K_{i}(\muM) | |
| DNJ | 13 |
| NB-DNJ | 4000 |
| DGJ | 30 |
| NB-DGJ | 85 |
El efecto secundario principal de la
NB-DNJ se ha observado que es diarrea osmótica. Se
piensa que la diarrea es causada por la inhibición de las
disacaridasas en el intestino, lo cual significa que los azúcares
como la sucrosa y la maltosa no pueden ser catabolizados y
absorbidos a partir del sistema digestivo. La sucrosa consta de una
glucosa y un residuo de fructosa, y la maltosa de dos residuos de
glucosa. Por tanto, no es sorprendente que los resultados en estos
ejemplos muestren que los análogos de glucosa,
NB-DNJ y DNJ, son inhibidores muy potentes de la
actividad de la sucrasa y de la maltasa, mientras que el análogo
de galactosa, NB-DGJ, no es inhibidor. Se encontró
que la DNJ, NB-DGJ y la DGJ inhibían la lactasa,
pero el K_{i}s era de al menos 10^{2} veces mayor que para la
inhibición de sucrasa y maltasa por los análogos de glucosa. Sin
embargo la NB-DNJ, no era buen inhibidor de lactasa
(K_{i} 4mM).
(Tabla pasa a página
siguiente)
| NB-DNJ | NB-DGJ | |
| Biosíntesis de GSL | + | + |
| Pérdida de peso | + | - |
| Reducción del órgano linfoide | + | - |
| Inhibición de ER \alpha-glucosidasa I y II* | + | - |
| Inhibición de Sucrasa y Maltasa** | + | - |
| Inhibición de Lactasa*** | - | + |
| * Platt et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(43):27108-14 | ||
| ** K_{i} (sucrasa) = 0,26 \muM y K_{i} (maltasa) = 0.37 \muM para NB-DNJ | ||
| *** K_{i} (lactasa) = 85 \muM para las muestras con NB-DGJ (mostradas entre paréntesis) |
Claims (10)
1. El uso de
N-butildesoxinojirimicina (NB-DNJ)
en la fabricación de un medicamento para la administración
combinada con un agente capaz de incrementar el índice de
degradación de glicolípidos en el tratamiento de un trastorno del
almacenamiento de glicolípidos seleccionado entre: enfermedad de
Gaucher, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Fabrys, enfermedad de
Tay-Sachs, trastorno del almacenamiento de
Niemann-Pick tipo C y gangliosidosis GM1.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el trastorno del almacenamiento de glicolípidos es la
enfermedad de Gaucher.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
en el que el agente capaz de incrementar el índice de degradación
de glicolípidos es una enzima implicada en la degradación de
glicolípidos.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en
el que la enzima es seleccionada entre el grupo que consiste en:
glucocerebrosidasa, hexosaaminidasa lisosomal, galactosidasa,
sialidasa y glucosilceramida glucosidasa.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
el que la enzima es una glucocerebrosidasa.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
en el que el agente capaz de incrementar el índice de degradación de
glicolípidos es una molécula que incrementa la actividad de una
enzima degradadora de glicolípidos.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
en el que el agente capaz de incrementar el índice de degradación de
glicolípidos es una secuencia de ácido nucleico que codifica una
enzima degradadora de glicolípidos.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
en el que el agente capaz de incrementar el índice de degradación de
glicolípidos es la médula ósea transplantada.
9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el medicamento está adaptado para
la administración simultánea, secuencial o por separado con el
agente capaz de incrementar el índice de degradación de
glicolípidos.
10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que los medicamentos están adaptados
para la administración oral.
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