CN1780603A - 预防或治疗上皮组织损伤或毛发脱落 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种预防和/或治疗由诸如炎性反应、老化或癌症引起的上皮组织损伤和/或预防和/或治疗毛发脱落的方法。尤其是，本发明涉及改变，特别是阻断内源性CD1d功能的物质和/或组合物。本发明的另一个方面也提供了筛选适用于本发明方法的化合物以及组合物的方法。

Description

预防或治疗上皮组织损伤或毛发脱落
本发明涉及一种用于预防和/或治疗受诸如炎性反应、老化或癌症影响的上皮组织损伤和/或预防和/或治疗毛发脱落的方法。尤其是，本发明涉及改变，特别是阻断内源性CD1d功能的物质和/或组合物。本发明的另一个方面也提供了筛选适用于本发明方法的化合物以及组合物的方法。
皮肤是生物体中最突出的上皮组织，其存在于生物体的大多数器官中。包括表皮、真皮和角质层的皮肤系统与内脏相关联，并同时与环境相互作用。作为生物体本身与环境之间的接触面，皮肤受外界因素以及生物体内部系统的可变参数的强烈影响。因此，皮肤的调节机制需要对于系统性变化的诱导一直是活性的，其中系统性变化是维持与皮肤外层形态和活性相关的正常病理学事件所必需的。大量的根据皮肤需求确保对增加流入的高能和塑性物质的充分消耗的方法成为皮肤结构的形态和功能稳定性的保证。因此，覆盖物的状态决定代谢过程的实现，其中代谢过程是皮肤细胞生存能力以及导致诸如屏障功能、弹性、膨胀特性、湿度、色素沉着等健康的皮肤特性出现的活性所必需的。
在生物的一生中，在皮肤上出现各种病征、老化特征，其主要的临床病征是随老化增加或加重而出现的细纹以及深的皱纹。此外，皮肤的肤色通常被改变并扩散刺激性并且偶而在特定的区域形成毛细血管扩张。
甚至通过将皮肤暴露于外来的作用，诸如例如UV辐射、污染物、自由基或化学物质而增加了这些老化的病征。
适度的UV照射导致通常众所周知的伴随炎症反应的皮肤变红，通常称为红斑。这些现象，常常称为“晒斑”，是令人疼痛的并且通常导致随后的皮肤脱皮。
此外，过度的UV照射皮肤也可能导致严重紊乱，诸如致癌，大部分的肿瘤为基底细胞癌(BCC)，其次是鳞状细胞性癌(SCC)，更少地为恶性黑色素瘤。除对DNA水平的损伤之外，由UV照射导致的免疫抑制也导致非-黑素瘤和黑素瘤癌的增加。目前已知光-诱导的免疫-抑制使得起始的肿瘤细胞逃避正常免疫机制的识别和排斥，保持潜伏达很长的时期，并且最后增殖成为肿瘤。这些原理与下述发现相符合：无免疫应答的病人，无论遗传地(着色性干皮病)或药理学地，诸如例如器官移植受众者，都与具有合适功能的免疫系统的人相比具有较高的的皮肤癌发病率。
在本领域中，一些方法已被建议用于预防环境因素对上皮细胞特别是皮肤上皮细胞的破坏作用。
关于对太阳辐射的防护，已经可以利用“防晒乳”或“遮光剂”，在晒太阳之前施用于皮肤。典型地，遮光剂组合物包括化学试剂，诸如某些二苯甲酮、二苯甲基甲烷或取代的对-氨基苯甲酸酯，即吸收紫外线的化合物，使得紫外线不能穿透皮肤。然而，一些用于此目的的化合物显示出缺少充分的光稳定性并且长期使用会产生毒性。此外，当暴露于光照时，它们必须持续地维持在皮肤的表面上。然而，遮光剂通过出汗或游泳很容易被擦掉或冲洗掉并且还通过渗透到皮肤中而损失掉。
另一种分别预防皮肤退化或老化的手段，是提供清除自由基的化合物。就这方面来说，在EP 0 761 214中公开了含有苯胺衍生物和二糠基胺衍生物的单重态氧猝灭剂，据报道其减少对皮肤的氧化压力。
然而，所有的这些手段和方法不能充分地保护皮肤来应对在我们的环境中不断增长的挑战。增加的大气污染以及社会性行为都对此有贡献，因此太阳-晒黑与健康、美丽和状态有关。因此许多人将皮肤暴露于日照来获得棕褐色，而不管伴随此行为的众所周知的负面结果。
这些问题甚至因为覆盖地球的臭氧保护层变得稀薄而对生物导致强烈的UV辐射而更加凸出。
因此，人们有给皮肤提供一种针对环境因素诸如压力或日射的较好保护的需求。
相应地，本发明的目的是克服现有技术的缺点以及提供保护皮肤免受环境中的不利影响的方法，特别是免受氧化或化学应力或日射。
此问题已通过提供一种物质，也即能基本上改变，特别是阻断上皮细胞中的内源性CD1d功能的物质而得以解决。
在图中，
图1A.野生型小鼠在暴露于单剂量(86mJ/m2)的UVB辐射之后表现出皮肤损伤(烧伤)。
图1B.野生型小鼠在暴露于单剂量(86mJ/m2)的UVB辐射之后表现出皮肤损伤(烧伤)(特写)。
图1C.CD1d敲除小鼠在暴露于单剂量(86mJ/m2)的UVB辐射之后没有显示明显的皮肤损伤迹象。
图1D.CD1d敲除小鼠在暴露于单剂量(86mJ/m2)的UVB辐射之后没有显示明显的皮肤损伤迹象(特写)。
图2.暴露于两个剂量(86mJ/m2)的UVB辐射的野生型(右)和CD1d敲除(左)小鼠之间的UVB-诱导的皮肤损伤的差异程度。
图2A.暴露于两个剂量(86mJ/m2)的UVB辐射的野生型小鼠损伤(损害)的脊背皮肤(特写)。
图2B.暴露于两个剂量(86mJ/m2)的UVB辐射的CD1d敲除小鼠的未受损伤的脊背皮肤。
图3.CD1d敲除小鼠与野生型小鼠相比，在其脊背上皮中显示出增加的表皮细胞凋亡，按照通过TUNEL测定。野生型(A)和CD1d敲除(B)小鼠的皮肤不暴露于紫外线照射。暴露于单剂量(86mJ/m2)的UV-辐射48h后的野生型小鼠(C)和CD1d敲除(D)小鼠的皮肤。
图4a和b为显示小鼠和人的各种组织中CD1d的大约含量的图表。
图5.表示在暴露于单一剂量(430mJ/cm2)的UVB辐射之后，CD1d蛋白在小鼠皮肤的表皮中表达；
图6显示鼠皮肤CD1d基因转录在UVB照射后受到调节；
图7显示鼠皮肤CD1d基因转录在模拟日光的光照射后受到调节；
图8显示无限增殖的(DK7)人角化细胞中的CD1d基因转录在日光紫外线照射后受到调节；
图9.表示在UVB-辐射的CD1d敲除小鼠的皮肤中，COX-2和TNF-αmRNA水平被下调节。
图10a和b)显示CD1d KO小鼠皮肤中的IL-6和MIP1-蛋白水平在UVB照射48小时后显著地减少。
图11显示在暴露于化学应力的细胞中，皮质醇抑制CD1d转录；以及
图12显示CD1d在人毛发小囊中表达。
本发明大体上基于下述的发现：由一定量的不同细胞特别是上皮细胞表达的跨膜蛋白CD1d调节细胞对应力的各种不同应答。这些通过下列的优选方案的具体描述将更加容易理解，大体上改变，特别是阻断细胞中内源性CD1d功能使得所述膜分子能够预防应力包括紫外线-诱导的皮肤损伤的有害作用，例如，烧伤、表皮增生、突变体累积、炎症、免疫抑制和皮肤老化。更令人惊奇的是下述发现：当基本上阻断上皮细胞中的CD1d功能时，可预防所述细胞中癌症即基底细胞癌、鳞状细胞性癌、恶性黑色素瘤、结肠癌、乳房癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌等癌症的诱导。此外，已令人惊讶地发现改变，特别是阻断CD1d功能影响毛发的生长和/或发育。
CD1d是类似于与B2-微球蛋白非-共价结合的I型跨膜MHCI类蛋白。CD1d分子被在免疫调节和效应反应中起作用的自然杀伤T-细胞(NKT)的T-细胞受体所识别。
已经证明了CD1d可将脂类呈递于NKT细胞来用于它们的活化，此观点受到CD1d晶体结构具有两个高度疏水的凹陷的事实所支持，其中高度疏水的凹陷是呈递疏水分子诸如脂质到免疫系统所必需的。
在导致本发明的研究中，令人惊讶地注意到CD1d基因在小鼠皮肤中的转录对外部压力诸如紫外辐射起反应，此种发现在人角化细胞中得以证实。此外，已注意到皮肤CD1d通过诱导COX-2和TNF-α基因转录以及抑制UV-诱导的细胞凋亡而介导UV-诱导的皮肤损伤/炎症。
不希望被任何理论所约束，目前假定CD1d在活生物中的一个内源性功能是直接调节正常的上皮细胞的动态平衡。
正常皮肤的动态平衡取决于表皮细胞的表皮分化、细胞凋亡、增殖和抗-细胞凋亡之间的临界和精细调谐的平衡。在皮肤中，通过脂类，特别是通过神经酰胺和葡糖神经酰胺(鞘脂类)调节这些过程。当有核细胞层产生葡糖苷脂酰鞘氨醇(GlcCer)时，GlcCer与Cer的比例在表皮分化的末期减少了，角质层中剧烈增加的Cer含量充当表皮渗透屏障的胞外组分。除它们的结构特性之外，神经酰胺与细胞增殖的抑制、细胞分化和细胞程序死亡的诱导有关。相反，GlcCer诱导细胞增殖和抑制细胞程序性死亡。
根据本发明的发现，CD1d好象是一个通过上述脂类能完成它们的生物学功能的受体。具体地，CD1d似乎负调节细胞凋亡。因此，在处于应力下的细胞中，例如当暴露于UV-辐射时，CD1d支持所述应力细胞的继续存在，甚至当它们的遗传物质被损伤和/或突变时，该损伤的细胞将促进诱导炎症过程并且最后导致老化现象或最终导致发展为肿瘤。
在阻断和/或改变内源性CD1d功能中，在应力下细胞的细胞凋亡可能被促进，而不是存活和繁殖，在一定程度上已损伤的细胞的作用，尤其是在DNA水平，没有偶然发生的增殖和在身体内扩散的情况。细胞一旦死亡则将通过自然过程在体内消除并且被“健康的”上皮细胞所替代。同样地，通过阻断或改变CD1d的方式，基本上预防或改变了与NKT的相互作用，其中暴露于紫外辐射过程中的免疫抑制现象基本上减少或完全被阻止了。同样，这些情况被期望辅助生物体的免疫系统来消除经暴露于UV造成损伤的细胞。
能够阻断和/或改变CD1d跨膜分子活性的物质可以是任意的干扰CD1d的内源性生物学功能的物质，并且特别是阻止或减少CD1d与内源性或外源性脂类相结合的物质。可通过包括下述步骤的方法获得所述物质：(a)将上皮细胞暴露于目的物质，(b)将上皮细胞置于应力情况下，(c)通过筛选下列一个或多个试验测定所述应力对所述上皮细胞的作用：(i)上皮细胞增生(H&E)，(ii)上皮细胞增殖(BrUd，PCNA)，(iii)上皮细胞的细胞凋亡，(iv)p53突变累积，(v)上皮细胞脂类的定量和定性评价，(vi)细胞凋亡和非-细胞凋亡性细胞表面受体的共-聚簇模式，(vii)促-炎细胞因子的产生，(viii)调节免疫的细胞因子的产生，(ix)炎症的标记，(x)抗-细胞凋亡的转录因子活性(xi)老化的标记，以及(d)与用对照获得的结果相比较。此种对照可以是例如一个试验，其中细胞处于相同的应力情况，然而其中没有添加所研究的物质(阴性对照)。同样地，对照也可以是，包括具有试验中已知正结果的物质以及通过测定被研究的物质和已知物质而获得的结果的差异(阳性对照)。
如果物质能预防任意的上述试验中所述应力的负作用，则其在本申请上下文中被认为是活性的。
受到欣赏的是可通过在基因水平或蛋白水平上作用的物质来阻断和/或改变CD1d的活性。
在基因水平上作用的物质为影响，特别是阻止CD1d基因，诸如与CD1d基因或CD1d-mRNA的至少一部分反义的多核苷酸的转录或翻译的化合物。
在这里可互换地使用的术语寡聚核苷酸和多核苷酸，包括自然的或修饰的单体或连接基团的线性寡聚物/聚合物，包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其α-异头物形式，聚酰胺核酸等，能够通过单体-单体间相互作用，诸如Watson-Crick型的碱基配对，Hoogsteen或反向hoogsteen类型的碱基配对等的规则模式来特异性地结合于目标核酸。通常单体通过磷酸二酯键或其类似物连接来形成几个单体单位例如3-5个，到几百乃至几千个单体单位大小的寡聚核苷酸。
(反-)正义寡-/多核苷酸也可包括侧基或部分，来增强特异性、核酸酶抗性、运输或其它与效力有关的特性，诸如例如胆固醇部分、双链体嵌入剂诸如吖啶、聚-L-赖氨酸、采用一个或多个核酸酶-抗性连接基团诸如硫逐磷酸酯的“封端”等等。相应的寡聚核苷酸可用来阻断转录、RNA加工和/或mRNA的翻译，因此，寡聚核苷酸可包括外显子，以及包括所要的CD1d-靶基因的内含子序列。
人CD1d基因或mRNA的核苷酸序列可获自NCBI(登记号分别为AP002532和NM001766)。根据公知的常识和技巧，技术人员可选择CD1d基因编码区的至少一部分并设计适当的反义多核苷酸，其阻止CD1d基因的转录和/或翻译。同样地，CD1d基因的非编码区的一部分可作为分别阻止CD1d基因转录或减少CD1d基因转录本数量的试剂。在这里，尤其是启动子区域的部分可作为制备反义多核苷酸的模板，如从内含子到外显子的过渡区，反之亦然。根据优选的实施方案，此种物质可以是DNA或cRNA(RNA-干扰)。
然而，除CD1d基因是目标之外，同样地，可修饰大量的调节上皮细胞动态平衡的调节分子，诸如神经酰胺和/或葡糖神经酰胺，使其发挥预期的对CD1d分子的作用。为了达到此目的，可通过设计与葡糖神经酰胺合酶基因或葡糖神经酰胺合酶mRNA的至少一部分反义的多核苷酸来减少葡糖神经酰胺合酶转录本的数量，使得最终上皮细胞增殖的信号被下调。葡糖神经酰胺合酶基因的核苷酸序列公开在Ichikawa等，PNAS 93(1996)，4638-4643上，该文件被引入作为参考。同样地，非编码区可用作反义多核苷酸的模板，诸如启动子区域和/或从内含子到外显子的过渡区，反之亦然。根据优选的实施方案，此物质是DNA或cRNA(RNA-干扰)。
除了减少增殖信号之外，同样可增强通过CD1d分子驱动上皮细胞凋亡的信号。在此方面，相应的转录本的数量可增加，其可能受到提供较大数量的编码一种序列的多核苷酸的影响，该序列被包括在鞘磷脂酶或神经酰胺合酶基因和/或鞘磷脂酶或神经酰胺合酶mRNA中。
除了基因水平外，也可改变CD1d分子的生物活性，尤其是在蛋白质水平，特别是通过与上皮细胞上或中的CD1d受体结合并阻断其内源性生物学功能的任意物质来阻断CD1d分子的生物活性。
根据优选的实施方案，能够改变，特别是阻断生物学CD1d功能的物质为与CD1d受体结合并阻断其生物学功能，诸如与NKT相互作用的多肽或肽，特别是疏水性肽，更优选地为抗体或其部分。作为其部分，特别是考虑缺少Fc部分的微-抗体。根据任选的实施方案，能够阻断生物学CD1d功能的物质也可以是可溶性的CD1d受体，也即缺少将多肽锚定在膜上的区域的多肽的那个部分。可溶性CD1d受体将清除促进应激细胞存活的活体内配体，因此促进了细胞凋亡。此外，自然杀伤细胞与活体内CD1d的结合将减少，因此阻止了T-细胞的活化以及随后的炎症和/或免疫抑制反应。
根据优选的实施方案，能够阻断和/或改变生物学CD1d功能的物质为来自植物、微生物或动物的脂类，包括磷脂、神经节苷脂、鞘脂类、鞘糖脂、磷脂酰肌醇磷酸、甾醇、多酚、甘油酯或脂肪酸。这些脂类可通过结合CD1d分子直接地或通过影响CD1d基因表达而间接地影响CD1d功能。
根据替代的实施方案，能够阻断和/或改变生物学CD1d功能的物质为神经酰胺，诸如神经酰胺8或鞘氨醇磷酸胆碱或属于TNF-超家族的受体，特别是CD95/APO-I/Fas的配体，其诱导细胞凋亡，因此干扰CD1d的抗-细胞凋亡功能。在另一个实施方案中，目的物质为通过化学合成获得的有机化合物。
已经公认的是，通过葡糖神经酰胺合酶的神经酰胺糖基化作用以及随后的葡糖神经酰胺的集结允许细胞逃脱应激-诱导的细胞程序性死亡，赋予各种癌症包括乳房癌、皮肤癌、结肠癌以及上皮癌对细胞毒性的抗-癌试剂的癌细胞抗性。由于CD1d可结合葡糖神经酰胺并且被这些相同的多重耐药性的癌细胞(例如鳞状细胞性癌)超表达，可以预见CD1d的抗-细胞凋亡活性可能在蛋白-葡糖基-神经酰胺结合的水平上调节癌细胞对细胞毒性药物的抗性。因此，原则上本发明的阻断和/或改变内源性CD1d功能的物质强烈地降低各种癌症包括皮肤癌、肠癌和乳腺癌症的多重-耐药性。
原则上，本发明的物质也影响CD1d往返于膜的双向运输。
该物质可包含在任意的适用于将物质施用于个体的组合物中，特别是食品组合物，化妆品组合物或药物组合物中。
包括至少一种能够阻断或改变本发明的CD1d表面分子的物质的药物组合物可被施用来用于预防和/或治疗的方法。在治疗应用中，以足以治愈或至少部分缓解疾病及其并发症的症状的量将组合物施用于已经遭受疾病的患者，如下所述。充分达到这个目的的量被定义为“治疗有效量”。有效量取决于疾病的严重程度以及患者的体重和总体状态。
在预防应用中，包括至少一种能够阻断或改变本发明的CD1d表面分子的物质的组合物被施用于对特定疾病敏感或处于危险中的患者。这样的量被定义为“预防有效量”。在此应用中，精确的量同样取决于患者的健康状态和体重。
本发明的化合物优选地与药用载体一起施用，载体的特性随施用方式，例如非肠道，静脉注射，口服和局部的(包括眼用)路径而变化。
可利用各种赋形剂，包括例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精纤维素钠、碳酸镁来制备目的制剂。此组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、溶液、悬浮液、糖浆、干燥的口服补品、湿润的口服补品、干燥的管饲物、湿的管饲物等。为了控制药物的释放，还可以使用缓释的制剂。
载体/赋形剂的种类及其量取决于物质的特性以及预定输送药物和/或施药的方式。例如，对于含有微弱溶解反义寡核苷酸的制剂可以使用，微-乳剂，例如通过利用非离子型的表面活性剂，诸如约0.04-0.05％(w/v)的Tween 80来增加溶解度。其它的组分可包括抗氧化剂，诸如抗坏血酸、亲水聚合物，诸如单糖、二糖以及其它的碳水化合物包括纤维素或其衍生物、糊精、螯合剂，诸如EDTA，以及在药物科学领域中的技术人员熟知的组分。这些不同的组分提供了各种各样的功能，包括调节药物的浓度、调节溶解度、化学稳定性、调节粘度、增强吸收、调节pH等。例如，在水溶性制剂中，药物组合物优选地包括缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲液，或其它的有机酸盐，优选地pH为大约7-8。
将要欣赏的是，本领域技术人员基于其自己掌握的知识应能选择适当的组分和制剂形式来把活性化合物靶向到目的组织，例如结肠、胃、肾脏或肝脏中，可以考虑的给药途径是通过注射、局部施用、鼻内施用、通过植入物或透皮的缓释系统等方式。
也可将目的物质配制在化妆品产物中，诸如洗液、洗发剂、乳剂、防晒剂、晒后乳剂、太阳阻断剂、抗-老化乳剂、膏剂和/或抗-毛发脱落的液体中。这证明基本上阻断皮肤中的CD1d功能并且防止太阳辐射的副作用、光-老化以及皮肤暴露于自由基是特别是有利的。因此，例如通过提供含有除普通试剂之外还含有如在这里定义的吸收UV-光的物质的防晒剂，可以提供对日晒的保护，迄今为止对其的了解仅限于此。这个特征尤其是基于下述的事实：目的物质将穿透皮肤并且在到达靶分子后发挥其作用。因为这些作用将持续一段时间，甚至在防晒剂已被擦掉或已被洗掉的情况下仍存在对太阳的防护，如例如在运动过程中等。然而，除防晒剂之外，目的物质可以包含在普通的霜、洗涤剂等中，来预防日常环境，包括污染、氧化性应力等的负作用。将会理解本发明的化妆品将含有技术人员公知的不同组分的混合物，确保目的物质迅速地渗透到皮肤中并且防止在储藏过程中发生降解。
本发明的另一种高度重要的组合物是食物。在我们目前的社会中，大量的食物被摄取，诸如香肠、腌肉或烤肉等。其含有对内脏有害的防腐剂、成分或物质。例如烤肉含有已知致癌的脂族和芳香族化合物。同样地，食物(例如香肠)中含有的通过操纵DNA杀死微生物的防腐剂，将对内脏细胞发挥类似的作用。事实上，在我们的社会中，肠癌的数量稳定地增加，其至少部分是由于人摄取的食物类型所导致的。
因此，本发明提供了预防内脏紊乱的起病和/或发展的食物组合物，诸如选自下组的组合物：牛奶或发酵的牛奶产品，诸如例如含有至少一种能基本上阻断和/或改变CD1d功能的物质的酸奶、凝乳、奶酪、乳制发酵产品、冰淇淋、乳制粉剂、婴儿配制食品、谷制品以及发酵的谷制品、矿泉水、巧克力或宠物食品。由于包含在食品中的目的化合物的量没有影响到食品的原始味道，消费者不会注意到产品的任何变化，但是其具有了有益的作用，也即保护性的乃至治疗的作用。一旦食物被摄取，目的物质将达到靶细胞，其可以是内脏的上皮细胞，即胃或肠的上皮细胞，并且将结合于CD1d受体并发挥其活性。因此，已经损伤的细胞优选地发生细胞凋亡而不是维持在所述的损伤形式。
因为已经在许多器官诸如肝脏、小肠、结肠、肾、前列腺、子宫、胰腺、乳房、皮肤和结膜中发现了具有CD1d的上皮细胞，上面具体描述的组合物的选择大体上取决于靶组织。如所了解的，对于皮肤而言，化妆品是优选的组合物，而就输送目的物质直接地到内脏或结肠来说，食品可能是首选的。然而，食品也适于输送目的物质或物质到其它器官，诸如肾或肝脏中，其取决于物质在身体内的稳定性以及内脏的吸收能力。因为食物是日常摄取的物质，此种产品提供了多种不同的可能性。然而，在目的物质在内脏中容易降解的情况下，可选择药物组合物，提供例如胶囊或其它制剂形式来输送目的物质到靶组织/到靶细胞中。
可以理解本发明的概念同样可用于辅助目前所用药物治疗的辅助治疗。在这方面，本发明的药物组合物可以与例如细胞静止剂一起施用来预防接受治疗的肿瘤的逃逸，其往往发生在特定肿瘤的长期治疗中，或辅助杀死药物疗法没有捕捉的残留癌细胞。因为本发明的物质可容易地与食物一起施用，特定的含有高含量目的物质的临床食物可被应用。同时，可直接地用抗黑素瘤的抗体药物治疗与在此处描述的药物组合物或化妆品一起来治疗黑素瘤。很显然，本领域的技术人员通过阅读本说明书与所附的权利要求书将能够设计各种在此提及的特定实施方案的替换方案。
原则上，本发明的物质可被用于诸如例如皮肤、内脏、眼睛、肺、肝脏、前列腺、乳房、肾脏和/或子宫中的上皮组织损伤的治疗和/或预防，这些损伤是由应力情况，例如通过化学的、生物学的或物理学应力所产生的，例如通过暴露于氧化剂或致癌物质，暴露于细菌、病毒、真菌、包裹细胞和/或微生物的脂类，或暴露于紫外线照射而产生的。同样地，可利用这些物质来预防和/或治疗毛发脱落。
因此，本发明的物质和/或组合物可用于治疗和或预防皮肤损伤，尤其是皮肤的光化和老化损伤，诸如干燥、光化性角化病、不规则色素沉着(显著地含有斑点、雀斑、斑点黑色素过少症以及顽固性色素沉着过度)、皱纹(显著地含有细表面线和深皱纹)、星形假伤疤、弹性组织变性、无弹性、毛细血管扩张、静脉色淀、紫斑病、粉刺、脂肪增生、软垂疣、樱桃血管瘤、皮脂溢、雀斑、基底细胞癌和鳞状细胞性癌、皮肤烧伤和/或水泡、白内障形成、表皮增生、炎症、免疫抑制以及癌症，例如非-黑素瘤以及黑素瘤皮肤癌。
为了获得具有本发明上述特征的其它物质，本发明也提供了筛选此种物质的方法。在此方法中，所用的上皮细胞可以为原始培养物的形式，即直接获自个体的或是细胞系的形式。为了实施该方法，尤其优选细胞培养，因为其允许在实验过程中连续地供应上皮细胞。必须小心地操作上皮细胞的细胞培养，因为所用的上皮细胞需表现出与原始培养物细胞或从组织样品中获得的上皮细胞相同的表型特征。可以理解，本领域的技术人员应能基于试验选择原材料。因此，如果第一轮试验是要进行细胞培养设计似乎是最适当的话，而进行进一步轮次的试验即评定可能的候选物的活性时，组织或甚至是动物模型似乎是更为适当的。
将上皮细胞暴露于目的物质达充分的时间以确保物质与细胞接触。在下一步中，将上皮细胞暴露于应力情况，这例如可通过用各种剂量的紫外线灯照射细胞，或添加过氧化氢或有毒的化学物质到细胞培养物中。然而，应力的类型不是关键的，只要细胞被激发而启动通常在应力情况下启动的过程，诸如例如产生促-炎细胞因子例如IFN-、TNF-、IL-1、IL-6、IL-8、细胞凋亡、改变的脂类代谢、p53产生的增加，由于细胞表面受体共-集簇改变模式而改变的细胞信号传导、NF-过程K B激活、AP1激活、显示超增殖(抗-细胞凋亡)、改变的屏障功能等。可以理解，可同时进行多种物质也即一种或多种物质的混合物的试验，其可证明对于第二轮或更进一步轮次的试验是有益的。
在下一步骤中，通过评价一个或多个下述的特征来测定所述应力对上皮细胞的作用，例如：上皮细胞增生(PCNA：Ouhtit等，AmericanJournal of Pathology[2000]，156：201-207；BrUd：Lu Y-P等，CancerResearch[1999]，59：4591-4602)；上皮细胞的细胞凋亡(Tunel Assay；对Ouhtit等人描述的方案的改进，American Journal of Pathology[2000]，156：201-207)；p53突变累积(等位基因-特异性聚合酶链式反应[AS-PCR]以及单链构象多形性[SSCP]，Ananthaswamy等，NatureMedicine[1997]，3：510-514)；促-炎和调节免疫的细胞因子的产生(例如TNF-α、PGE-2、IL-1、IL-6、IL-8、IL-4、IL-10、血小板活化因子、TGFβ)；炎症标记(例如COX-2、iNos)；以及抗-细胞凋亡的转录因子(包括AP-1，NFkappaB)活性，通过TaqMan实时RT-PCR、ELISA以及免疫组织化学；定性和定量地评价磷脂、鞘糖脂和鞘脂类的含量(Electron-Spray Tandem Mass Spectrometry)；通过荧光共振电子转移分析(FRET)分析上皮细胞表面受体分子的共-簇集模式，所述的表面受体分子包括细胞因子受体(例如IL-6)、TNF-超家族受体的分子(例如CD95/APO-I/Fas)和调节生长的受体(例如EGF，胰岛素)；老化的标记，例如弹性蛋白酶、胶原酶、金属蛋白酶、明胶酶、溶基质素、端粒酶。
然后将获得的结果与对照比较，其可以是简单的试验，其中相同类型的细胞暴露于相同的应力情况，但不提供用于评价CD1d阻断能力的化合物。至于动物模型，将阳性对照表示为CD1d -/-动物，其中完全没有CD1d活性。
下列实施例用于更具体地说明本发明而不是对其进行限定。
实施例1
CD1d突变体小鼠的产生
小鼠CD1d被CD1d1和CD1d2两个基因编码，其具有高度的核苷酸序列同一性(Bradbury等，EMBO J.，7(1988)，3081-3086)。已有关于CD1d1基因的产物被所有的抗-CD1抗体所识别的描述，而CD1d2产物的表面表达还没有被证明。此外，预测的CD1d2基因产物的α2结构域没有域内二硫键，该二硫键存在于所有已公开的典型的和非-典型的MHC I类分子的α2区域中(Bradbury，同上)。该二硫键被认为对于抗原-结合沟的折叠是关键的。因此，CD1d2基因不编码功能性的抗原-呈递分子，并且所有以前认为是小鼠CD1的功能可能是通过CD1d1基因产物进行的。因此，决定将靶向突变引入到CD1d1基因中，而将CD1d2保持完整。
通过聚合酶链式反应，使用探针从菌株129/Sv噬菌体文库中分离CD1d基因。利用2.8kb的含有CD1d基因5′区域的Apal片段，含有CD1d基因3′区域的3.2kbBamHI-Notl片段(在此片段中的NotI位点来自pBluescript载体，其中pBluescript载体被最初亚克隆导入噬菌体DNA)、新霉素抗性基因(neo)以及pBluescript质粒(Stratagene)来制备靶向构建体。此构建体被设计成缺失了CD1d1的从编码α2区域的外显子片段开始的约200bp的片段。使用NotI-线性靶向载体转染菌株129/Sv-来源的胚胎干(ES)细胞系TL1。根据Van Kaer等，Cell 71(1992)，1205-1214所描述的方法选择和分离G418-抗性克隆。用EcoRI降解来自个体克隆的基因组DNA以及与来自CD1d1基因5′末端的2.3kb CIaI EcoRI探针杂交。
通过用KpnI降解以及与来自CD1d1基因3′末端的700bpBamHI-EcoRI探针杂交证明了重组。将嵌合小鼠与C57BL/6小鼠交配而获得传代，并且将杂合的突变体小鼠互交来获得(C57BL/6x129/Sv)F2纯合突变体。通过使用5′探针进行的基因组Southern印迹法，根据它们的CD1d1状况对小鼠进行分型。突变体小鼠是健康的并且正常地繁殖。
因为用于产生突变体动物的ES细胞和小鼠菌株在它们的TL状况方面是不同的(129/Sv为TL+菌株，而C57BL/6为TL-菌株)，在此研究中使用的所有小鼠被基因分型为TL。为了根据TL状况对小鼠进行分型，用BgIII降解尾DNA并与检测菌株129/Sv(TL+)和C57BL/6(TL-)之间多态性的TL-特异性探针杂交(Pontarotti等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)，1782-1786)。此探针是通过聚合酶链式反应，利用一组根据公开的序列设计的引物制备的(Pontarotti，同上)：
5′-TATACAGAGCTCCGTAGGAC-3′；和
5′-AGTTGTCTGCAGCCACGAAC-3′.
CD1d1突变体和野生型小鼠被圈在无特异性病原体的栅栏动物装置中，经美国实验动物管理认证协会(AAALAC)授权。使用12-16周龄的动物开始实验。它们被圈养在12h光-暗控制循环的过滤-防护罩中，并提供高压灭菌的NIH开放式小鼠食物和随意的水。
公共机构“动物护理和使用委员会”(Animal Care and UseCommittee)批准了所有的方法。各实验中的所有小鼠是年龄-和性别匹配的。
需强调的是可使用其它用于产生CD1d突变体小鼠的遗传背景，诸如Balb/C遗传背景。
实施例2
小鼠的紫外线照射
将五个Philips TL-40W/12日光灯(Philips，荷兰)的组合用于照射小鼠。这些灯发射从270到400nm的光谱；54％的照射在太阳光谱的UVB范围内(280-315nm)，45％的在UVA(315-400nm)区域，并且小于1％的在UV-C(240-280nm)范围。如通过UVB PMA研究辐射计所测定的，五个灯泡的辐射度平均为10W/m2。
用电剪刀除去小鼠的脊背毛发并将小鼠放到通过有机玻璃分隔器分隔成单独隔室的有机玻璃箱中，并且用金属丝罩覆盖，其减少了14％的照射剂量。对于每一UV-照射，每次将箱子放置在灯下的同一位置来补偿沿着灯管长度导致的能量的不均匀分布。将小鼠暴露于来自五个Philips TL 40W/12日光灯的86mJ/cm2UVB入射剂量一次或两次。在第一次暴露后96h将小鼠暴露于第二剂量的UVB照射。在最后的UVB暴露后分析所有小鼠24、48、72和96h时的皮肤损伤的症状。
肉眼可清楚地观察到，在UVB照射剃毛后的背部后，在野生型和CD1d敲除小鼠之间的皮肤损伤程度的差异。UV-照射的野生型小鼠出现清楚的和显著的皮肤损伤(烧伤，皮肤损害)，而在UV-照射的CD1d敲除小鼠中没有观察到明显的皮肤损伤症状。
实施例3
表皮细胞细胞凋亡的测定
利用DeadEndTM Fluorometric TUNEL系统(Promega)检测凋亡的细胞死亡，其通过利用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)在3′-OH DNA末端催化掺入荧光素-12-dUTP来测定凋亡的细胞碎片的DNA。利用TUNEL试验原理使TdT形成一个聚合物尾部。简要地，在室温下在新制备的二甲苯中冲洗5分钟，对富尔马林固定石蜡包埋的玻片上的组织切片进行脱蜡两次。在100％乙醇中冲洗5分钟，然后通过用梯度(100％、95％、85％、70％、50％)乙醇连续地冲洗3分钟而沉浸切片来进行再水化。然后，将切片浸于0.85％NaCl中5分钟，用PBS冲洗，然后固定在4％多聚甲醛中15分钟，接着用PBS冲洗两次。通过轻敲除去切片的残留液体后，在室温下用20μg/ml蛋白酶K覆盖组织切片8-10分钟。在蛋白酶K处理后，在PBS中漂洗组织切片，然后固定在多聚甲醛中5分钟。然后在PBS中冲洗，通过轻敲除去残留液体并在平衡缓冲液(Promega)中温育5-10分钟。平衡后，在37℃下将切片与TdT酶一起温育在湿润的小室中1h。在中止缓冲液(SSC；Promega)中浸泡切片15分钟来终止反应，然后在三种不同的PBS中漂洗。漂洗之后，用新近在PBS中稀释为1μg/ml的碘化丙啶溶液在黑暗中染色15分钟。在去离子水中冲洗三次，各5分钟，然后擦去包围细胞区域的过量液体。然后立即在荧光显微镜下检测切片。
在UV照射2、6、24、48、72和96h之后(急性/慢性)，用取自CD1d -/-和野生型小鼠的皮肤进行TUNEL试验(按照Ouhtit等人描述的方案的改进，American Journal of Pathology[2000]，156：201-207)。结果表明CD1d -/-小鼠皮肤内部的表皮细胞与野生型小鼠的相比具有高度的细胞凋亡。相比之下，野生型皮肤中的表皮细胞则遭受显著较少的细胞凋亡。
实施例4
表皮增生的测定
将脊背皮肤活组织切片固定在4％多聚甲醛中过夜并用石蜡包埋。
用苏木精和曙红(H&E)对切片进行染色并通过光学显微镜进行观察。
在UVB照射后，与UV照射的野生型小鼠相比，在最后一次UVB处理48h后，CD1d -/-小鼠显示出显著减少的表皮增生。
实施例5
基因绘图
为了说明CD1d功能，进行比较野生型和CD1d敲除小鼠基因表达的基因绘图试验。
分别利用Trizol试剂盒(Invitrogen AG，巴塞尔，瑞士)和QiagenRNeasy微-试剂盒(巴塞尔，瑞士)从5个个体野生型和CD1d敲除小鼠中提取皮肤组织，然后按照生产商的说明用RNA酶I处理来除去任何基因组的DNA污染物。通过OD定量测定RNA样品，然后用AgilentBioanalyser进行动态凝胶电泳来分析完整的28S和18S rRNA(所有的28/18比率在1.6和2.0之间)。判断所研究的样品含有充分的用于与GeneChips杂交的高质量RNA。作为另一种定量控制方法，在与Affymetrix GeneChips(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)杂交之前，我们利用Affymetrix试验碎片(试验碎片5′/3′比率小于3.0)证实，所有的样品发出预选择基因的强烈信号。
取含有10μg总RNA的皮肤作为所有个体小鼠样品的初始材料。通常，总RNA被转变为生物素化的cRNA，在Affymetrix探针阵列盒中杂交，染色，然后定量。利用SuperScript Choice系统(InvitrogenAG，巴塞尔，瑞士)，按照生产商的说明，进行第一和第二链cDNA的合成，但是利用含有T7 RNA聚合酶结合部位结合位点的寡-dT引物。用RNA Transcript Labeling试剂盒(EnzoBiochem Inc.，NY)制备标记的cRNA。将生物素化的CTP和UTP与未标记的NTPs一起应用在反应中，并用Nucleospin柱(Macherey-Nagel，Diiren，德国)除去未掺入的核苷酸。将cRNA(20μg)在94℃在含有200mM Tris-醋酸盐pH8.1，500mM KOAc，150mM MgOAc的缓冲液中破碎35分钟。杂交前，将在杂交混合液(含有100mM MES，1M NaCl，20mMEDTA，0.01％Tween20，0.5ng/μl BSA，0.1ng/μl鲱鱼精和Affymetrix对照)中破碎的cRNA加热到95℃达5分钟，冷却至45℃并装载到Affymetrix探针阵列盒上。将探针阵列在45℃于恒定转速(60rpm)下温育16h，然后进行Affymetrix冲洗和染色流程。
此流程包括：
●用非-严谨缓冲液(6XSSPE，0.01％Tween20，0,005％消泡剂)冲洗一次
●用严谨缓冲液(100mM MES，0.1 MNaCl，0.01％tween20)冲洗一次
●用在含有100mM MES，1M NaCl，0.05％Tween20，4mg/ml的BSA的缓冲液中的0.01mg/ml链霉亲和素-藻红蛋白共轭物(分子探针)进行第一次染色。
●用非-严谨缓冲液(6XSSPE，0.01％Tween 20，0,005％消泡剂)冲洗一次
●用在含有100mM MES，1M NaCl，0.05％Tween 20，4mg/ml的BSA的缓冲液中的3μg/ml生物素化的抗-链霉亲和素+0.2mg/ml的IgG进行第二次染色。
●用在含有100mM MES，1M NaCl，0.05％Tween 20，4mg/ml的BSA的缓冲液中的0.01mg/ml链霉亲和素-藻红蛋白共轭物(分子探针)进行第三次染色。
●用非-严谨缓冲液(6X SSPE，0.01％Tween 20，0.005％消泡剂)冲洗一次
发展了一种数学方法并应用于未加工的GeneChip数据来筛选差别调节的基因。除了通过考虑绝对表达式或绝对差异强度上下文中的标准偏差(SD)来去除单一倍数变化截止点外，此方法很适用。
该方法包括下列步骤：(A)通过市售的“MAS5”Affymetrix程序(Santa Clara，CA，USA)进行数据加工以及进行重新排列，(B)将重新排列的数据对数转换成正态分布，(C)进行多重假设(每个基因一个)的方差分析(ANOVA)试验，(D)在条件SD(方程式1)内，在根据平均ADI水平定购的200基因的储存箱内确定大致的平均数，来确定条件之间的显著性界限SD，命名为REGExpress功能(方程式2来自Genome Biology20012(12)：preprint0009.1-0009.31)；以及(E)随后依据REGExpress和ANOVA的p值排列基因，来辅助集中于作用的重要性上。依据从多重假设(每个基因一个)ANOVA试验产生的p值和/或依据REGExpress产生的p值进行选择。
在488nm处利用氩离子激光器(Agilent制备的用于Affymetrix)扫描的探针阵列。用Affymetrix基因表达分析软件分析定量扫描的读数。
将研究结果概括在下面的表I到III中。增加(+)或减少(-)的倍数是统计学上显著的在CD1d敲除小鼠中表达基因相对倍数的增加或减少，与相同基因在野生型小鼠中的表达相比较。很显然阻断CD1d上调了控制毛囊发育的基因，并且下调了与炎症和癌症发展有关的基因。
表I
调节毛囊发育的基因
  基因名称   增加/降低的倍数   Wt平均数   CD1d -/-平均数   生物学功能
  μ结晶   +27.0   0.922   4.251   调节毛囊发育的甲状腺结合蛋白
  补丁同系物2   +2.763   3.810   4.826   毛囊发育
表II
调节炎症的基因
  基因名称   增加/减少的倍数   平均Wt   平均CD1d -/-   生物学功能   相关疾病
  TGFβ激活的激酶   +1.743   3.630   4.186   p38-MAP激酶和应力激活的蛋白激酶(SAPK)通道的信号分子。
  Rel-A(NfKappaB)   -0.735   7.350   7.043   抗-细胞凋亡，诱导炎症   炎症
  细胞色素β   -0.738   6.829   6.525   过氧化物产生
  纤溶酶原活化因子抑制剂(PAI-1)   -0.357   3.906   2.875   丝氨酸蛋白酶抑制剂。调节纤维溶解。   炎症
  MRP14   -0.202   3.943   2.344   炎症反应中Ca++依赖性调控蛋白.   急性的和慢性的炎症反应例如牛皮癣
  肥大细胞蛋白酶   -0.661   6.427   6.014   蛋白质水解和肽分解   炎症
  P-选择蛋白   -0.685   6.439   6.060   细胞粘着   炎症
  TFII-1   +1.373   5.707   6.024   调节c-Fos活性的转录因子
  白介素-6   -0.268   1.882   0.565   细胞因子：多功能的   炎症
表III
调节癌症生长/发育的基因：
  基因名称   增加/减少的倍数   平均Wt   平均CD1d -/-   生物学功能   相关疾病
  v-Rel(NfKappaB)   -0.735   7.350   7.043   致癌-转化细胞   癌症
  纤溶酶原活化因子抑制剂(PA1-1)   -0.357   3.906   2.875   丝氨酸蛋白酶抑制剂   转移性肿瘤
  P-选择蛋白   -0.685   6.439   6.060   粘着   促进肿瘤转移
  组织蛋白酶S   -0.697   7.545   7.184   半胱氨酸蛋白酶   恶性肿瘤
  增殖蛋白   -0.234   1.870   0.419   调节血管生成   小鼠纤维肉瘤
  白介素-6   -0.268   1.882   0.565   由基底细胞癌和恶性黑色素瘤分泌
  CSF-1受体   -0.750   7.196   6.909   调节细胞增殖的生长因子   癌症
实施例6
对单一局部施用TPA诱导的炎性应答的评价
将由Sigma Aldrich(L′Isle d′Abeau Chesnes BP701，38297 SaintQuentin Fallavier，法国)提供的佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(TPA)以0.01％(W/V)的剂量溶于丙酮中，并且将25μl溶液局部应用于CD1d -/-小鼠或野生型小鼠的右耳的内侧面来诱导急性炎性应答。
采用标准的颗粒饲料将动物饲养在单独的笼子中，采用12-小时光-暗循环。由设备供给具有22+/-2℃的温度和55+/-10％的相对湿度的过滤空气。
在施加后6小时、24小时和48小时，通过利用千分尺(《oditest》Kroeplin Gmbh，Postfach 1255 D36372Schliichlem，德国提供的)测定耳浮肿的方法定量测定炎性应答。
如下计算浮肿：(浮肿＝治疗组的耳厚度-丙酮组的耳)。
利用Student′s t检验比较CD1d -/-组的平均值与野生型组的平均值。
实施例7
单一局部施用花生四烯酸诱导的炎性反应的评价
将由Sigma Aldrich(L′Isle d′Abeau Chesnes BP701，38297 SaintQuentin Fallavier，法国)提供的花生四烯酸(5-8-11-二十碳四烯酸)以140nM的浓度溶于丙酮中，并且将25μl的所述溶液局部施用在CD1d -/-小鼠或野生型小鼠的右耳的内侧面来诱导急性的炎性反应。
采用标准颗粒饲料将动物饲养在单独的笼子中，采用12-小时光-暗循环。设备供给具有22+/-2℃的温度和55+/-10％的相对湿度的过滤空气。
在施加后1小时、2小时和4小时，通过利用千分尺(《oditest》Kroeplin Gmbh，Postfach 1255 D31372 Schliichlem，德国提供的)测定耳浮肿的方法来定量测定炎性反应。
如下计算浮肿：
(浮肿＝治疗组的耳厚度-丙酮组的耳)。
利用Student′s t检验比较CD1d -/-组的平均值与野生型组的平均值。
实施例8
评价由恶唑酮诱导的DTH(迟发型高敏感型)反应
将由Sigma Aldrich(L′Isle d′Abeau Chesnes BP701，38297 SaintQuentin Fallavier，法国)提供的恶唑酮(4-乙氧基亚甲基-2-苯基噁唑-5-酮)以1％(W/V)的浓度溶于丙酮中，并且将50μl的所述溶液每日一次局部施用在剃毛的CDIa-小鼠或剃毛的野生型小鼠的腹部皮肤上持续四天时间。
对动物攻击4天后，通过单次给药(20μl)以0.3％的剂量在右耳的内侧上施用溶于丙酮中的恶唑酮。在施加后24小时和48小时，通过利用千分尺(《oditest》Kroeplin Gmbh，Postfach 1255D36372Schliichlem，德国提供的)测定耳浮肿的方法定量测定攻击后的应答。
如下计算浮肿：
(浮肿＝治疗组的耳厚度-丙酮组的耳)。
利用Student′s t检验比较CD1d -/-组的平均值与野生型组的平均值。
实施例9
评价通过利用太阳模拟器进行紫外线照射而诱导的皮肤损伤
配备UVC滤光镜的太阳模拟器(Oriel 81050)用于照射CD1d -/-小鼠或野生型小鼠。
照射：精确的UVB+UVA剂量
对表皮的影响：SBC计量，表皮增生测量法
对真皮的影响：用免疫组织化学法测定MMPI和MMP3的表达
实施例10
通过紫外辐射进行的CD1d基因转录的调节以及CD1d在UV-诱导的COX-2和TNF-α基因转录调节中的作用
小鼠
无特异性病原体的雄性杂种129/C57BL/6野生型和129/C57BL/6CD1d敲除小鼠获自L.Van Kaer，Vanderbilt UniversityMedical Center(Nashville，TN，USA)。按照当前的Swiss规则和标准将动物饲养在装置中。将它们圈养在滤光器-保护的笼子中，并且控制周边照明来提供12小时光/12小时黑暗的循环周期。随意提供高压灭菌开放式的小鼠食物和水。所有动物试验方法经公共性机构动物管理和使用委员会检查和批准。各实验中的所有小鼠是年龄-和性别匹配的。在小鼠为16周龄时开始进行各种实验。
UV光源
UVB源为五个Philips TL-40W/12日光灯(Philips，荷兰)的组合。
这些灯发射从270到400nm的光谱；54％的辐射在太阳光谱的UVB范围内(280-315nm)，45％的在UVA(315-400nm)区域并且小于1％的在UV-C(240-280nm)范围。如通过UVBPMA研究辐射计测定的，五个灯泡的辐射度平均为10W/m2。通过配备WG-320大气衰减滤光镜(1mm厚度)的1000W exon UV太阳模拟器(Solar Light公司，PA，美国)、穿过闭塞滤波器(UG-5；5mm厚度)的可见的/红外谱带以及双色镜来进一步地减少可见的和红外能量来生产太阳模拟灯(UVA+UVB)。
小鼠的UV照射
用电剪刀除去小鼠脊背的毛发。为了将小鼠暴露于UVB照射，将小鼠放到通过有机玻璃分隔器分隔成单独隔室的有机玻璃箱中，并且用金属盖覆盖，其减少14％的照射剂量。对于每一UV-照射，每次箱子被放置在灯下的同一位置来补偿沿着灯管长度导致的能量的不均匀分布。为了将小鼠暴露于太阳UV照射(UVA+UVB)，在将小鼠暴露于太阳模拟器的光束之前，将其麻醉来固定它们。
将小鼠暴露于来自五个Philips TL 40W/12目光灯的86，215或430mj/cm2UVB照射剂量一次。将暴露于日光(UVA+UVB)的小鼠暴露于1680照射剂量(1分钟)、16,800(10分钟)或33,600mJ/cm2(20分钟)的日光辐射一次。
角化细胞的细胞培养物的UV照射
对培养在无菌6-孔平皿(Corning，荷兰)中的角化细胞融合培养物进行单剂量(5700mJ/cm2)的太阳UV照射。在除去培养基并用无菌HBSS进行替换后，在无塑料盖的情况下进行处理。
对照培养物没有被照射。在UV照射后，除去HBSS并换回原来的培养基。在37℃、5％CO2中温育细胞并且在其后的不同时间点收集RNA。
小鼠组织的免疫染色
将野生型小鼠皮肤的活体组织在石蜡包埋之前固定在甲醛水溶液中。
利用下列方法制备石蜡包埋组织的横截面切片(5μm厚度)，通过温热脱蜡，脱水以及再水化：在二甲苯中3分钟2次，100％乙醇中3分钟，95％乙醇中3分钟，80％乙醇中3分钟以及1×PBS中3分钟。新的皮肤也包埋在Tissue-Tek(4583，Sakura Finetek，Torrance，美国)中，并且冷冻在液氮中。然后在1x PBS中再水化切片几分钟。利用抗-小鼠CD1d 1H1初级mAb对切片染色并且利用小鼠Histostain-plus试剂盒(ZYMED Laboratories Inc.，San Francisco，美国)展开。
从皮肤细胞溶解产物中提取总RNA
将培养在6-孔平皿中的人角化细胞的处理的培养物和对照培养物置于冰上，并利用1×PBS在4℃冲洗两次。通过在补充了1％的β-巯基乙醇的裂解缓冲液RLT(74104，QiagenAG，巴塞尔，瑞士)中破碎细胞，并通过简单地涡流来获得细胞溶解产物。使用QIAshredder柱(79656，QiagenAG，巴塞尔，瑞士)以13,000xg离心2分钟来均质化细胞提取物。利用RNAeasy试剂盒(74104，Qiagen AG，巴塞尔，瑞士)，按照生产商的规程制备总RNA。利用无RNA酶的DNA酶系列(79254，Qiagen AG，巴塞尔，瑞士)在柱上DNA酶降解而去除基因组DNA污染物。将1cm×1cm的皮肤样品切割成小块并在1ml的TRIZOL试剂(15596-026，Invitrogen AG，巴塞尔，瑞士)中利用转子-定子式匀浆器(Polytron，Kinematica，Luzern，瑞士)均质化。将在12,000xg下离心后获得的上清液回收在新的管中并且在室温下温育5分钟。将0.2ml的氯仿添加到管中，用力振荡15秒并在室温下温育2-3分钟。在4℃和12,000xg下离心样品15分钟。将上层液相转入新管中，并利用0.5ml的异丙醇在室温下沉淀总RNA10分钟。用1ml的75％EtOH冲洗，通过在4℃12,000xg离心获得的RNA颗粒10分钟，然后在4℃下在7,500xg下离心5分钟。最后在室温下干燥RNA颗粒并通过在55-60℃温育样品10分钟将其溶解在40μl的无水RNA酶中。利用无RNA酶的DNA酶组进行柱上RNA酶降解来去除可能的DNA污染物。
半定量的RT-PCR
A.逆转录-聚合酶链式反应和PCR反应
按照生产商的说明，利用进行RT-PCR的Superscript第一链合成系统(11904-018，Invitrogen AG，巴塞尔，瑞士)通过启动第一链cDNA的寡-dT来逆转录5μg的总RNA。进行cDNA PCR来检测单基因(单PCR)或多基因(多基因PCR)的特异性表达。为了进行单PCR，将48μl的含有5μl PCR缓冲液、3ul 25mM MgCl2、1μl的10mMdNTPs、0.5μl的正义和反义寡核苷酸、3μl DMSO、34.5μl的水以及0.5μl的5U/μl Tag DNA聚合酶的PCR主要混合物添加到2μl的cDNA中。所有的试剂购自Invitrogen(15558-013，Invitrogen AG，巴塞尔，瑞士)。用于扩增cDNA样品的循环次数和退火温度对于各种试验的基因来说是特异性的，一个循环由94℃30s、x℃30s、和72℃30s组成，各个扩增以94℃2min开始以及以72℃3min结束。根据说明书使用用于细胞凋亡和与炎症相关基因的多基因PCR的试剂盒MP-70211(Maxim Biotechnologies，旧金山，USA)。在使用各试剂盒之前，确定同时检测多基因的多重反向和正向引物作用的条件。含有用于检测TNF-α和COX-2基因的引物的试剂盒MP-70211的使用条件如下：96℃1min和60℃4min(2个循环)；94℃1min和60℃2min(29个循环)；70℃10min(1个循环)和在25℃浸泡。MPCR试剂盒中使用的依据一系列条件检测多基因的反向和正向引物的DNA序列是私有的并且因此没有描述在此报告中。
引物序列和扩增的循环次数：
人：
  基因   引物   序列(5′-3′)   退火温度.   循环次数   产物大小
  GAPDH   正向反向   AATCCCATCACCATCTTCCAGTCATCATATTTGGCAGGTT   52   16   558
  CD1d   正向反向   GCTCAACCAGGACAAGTGGACGAGAGGAACAGCAAGCACGCCAGGACT   66   27   452
小鼠：
  基因   引物   序列(5′-3′)   退火温度.   循环次数   产物大小
  GAPDH   正向反向   TTC ACC ACC ATG GAG AAG GCGGCATG GAC TGT GGT CAT GA   60   22   236
  CD1d.1   正向反向   ACG TCC TGG CAGACA GTC CCA GGTTA ATG TTG AAA AGA GCG TAC TGG   60   24   706
B.mRNA水平的相对定量分析
通过在3％琼脂糖凝胶上装载PCR产物进行基因扩增，其中在150V下将3％琼脂糖凝胶运行在含有2％Ethidium Bromide的1×TAE缓冲液中达30分钟的时间。在紫外线灯下可见PCR产物的荧光条带。使用Kodac DC 120相机扫描凝胶并且利用Software Scion Image P 4.02Win(Scion Corporation，Maryland，美国)定量分析条带的荧光强度。
当研究鼠系统中的CD1d蛋白质时，在造血细胞以及肠的上皮细胞以及肝细胞上显示出广泛的组成型表达，不知道这些分子是否是由正常的和/或UV照射小鼠的皮肤细胞，特别是角化细胞表达的。为了解决此问题，将来自未经照射的和经UVB-照射的野生型小鼠的小鼠皮肤固定在甲醛水溶液中，切片并用抗-小鼠的CD1d mAb(1H1)染色来检测CD1d蛋白。对正常的未经照射的皮肤中的CD1d蛋白的探测是阴性的(没有显示数据)。然而，在UVB-照射小鼠皮肤的表皮和真皮中检测到了CD1d蛋白(褐色)(图5)。染色主要限于皮肤的较为分化的层(颗粒层和角质层)并且在细胞水平上被定位于细胞质和核膜。
因此，UVB-诱导的小鼠皮肤损伤/烧伤可在小鼠角化细胞而不是通过抗原呈递细胞的水平上被直接地调节(局部地或系统地)。
通过UV照射调节CD1D基因的转录
已经证明了UVB-诱导的皮肤损伤受到CD1d调节以及证明了CD1d蛋白由小鼠表皮细胞(角化细胞)表达之后，接下来非常重要的是确定皮肤CD1d表达是否受UV照射的调节。任何皮肤CD1d的表达受UV照射调节的指示提示皮肤中CD1d水平的调节是控制UV-诱导的皮肤损伤的关键因素。为了解决这个问题，将背部剃毛的野生型小鼠暴露于单一剂量(86mJ/cm2)的UVB照射，在照射不同的时间(6、24、48、72和96h)后切除照射的皮肤，提取RNA并纯化，并通过半定量的RT-PCR测定CD1d mRNA水平。作为对照，将正常的非-照射小鼠皮肤切除，提取RNA并纯化以及通过半定量的RT-PCR测定CD1d mRNA水平。
如图6所示，在UVB照射后6h时，整个小鼠皮肤中减少的CD1dmRNA的水平与正常的非-照射皮肤中的相比，在照射后24h显著地减少了。相比之下，在UVB照射后48、72和96小时时，CD1d mRNA水平增加了而高于在正常的未经照射的对照皮肤中检测的水平。为了进一步证实我们对UVB照射对皮肤CD1d基因转录的影响的研究，我们将背部剃毛的野生型小鼠暴露于不同剂量的太阳UV照射(UVB+UVA)1680mJ/cm2(1分钟)、16,800mJ/cm2(10分钟)或33,600mJ/cm2(20分钟)。在照射后6和72h，切除照射的小鼠皮肤，提取和纯化RNA并通过半定量的RT-PCR测定CD1d mRNA水平(图7)。如同用UVB照射的一样，我们分别地观察到在日光UV照射后6和72h，CD1d mRNA水平的类似减少和增加，与UV剂量无关，此表明了皮肤CD1d基因转录对UV照射的应答是皮肤对UV照射的损伤作用应答中的重要事件。
通过日光UV照射调节人角化细胞CD1D基因的转录
为了试图弄清楚是否人CD1d基因转录受UV照射的调节，我们研究了培养的人角化细胞在对UV辐照的反应是否显示出类似的对UV照射的基因转录动态分布。在一式三份的DK7细胞角化细胞培养物对单一剂量的5700mJ/cm2日光UV照射后的不同时间点，收集细胞的RNA并进行半定量RT-PCR来测定CD1d mRNA的相对水平(图8)。如同用UV照射(UVB或日光)小鼠皮肤所观察到的，CD1d mRNA水平与正常的非-照射对照相比在照射后6h减少了。在照射后10小时时，CD1dmRNA的分析表明这些水平与正常的非-照射细胞培养物中检测的水平相比具有进一步的减小。
在UV照射后16和48h之间，CD1d mRNA的水平按比例地增加；在UV照射的整个野生型皮肤的皮肤中也观察到一种模式：该模式表明小鼠皮肤中UV-诱导的CD1d基因转录可能在角化细胞的水平上被调节。
人角化细胞CD1d基因转录是对UV照射的应答，并且好象是以与小鼠皮肤CD1d类似的方式被调节，此表明a)皮肤CD1d在皮肤对UV照射应答的调节中引起关键的作用，以及b)皮肤中CD1d水平的调节是调节UV-诱导的皮肤炎症/损伤的关键因素。
调节皮肤炎症的关键基因的基因转录在UVB照射的CD 1d敲除小鼠皮肤中减少了
为了进一步证实CD1d是调节UVB-诱导皮肤炎症/损伤的关键分子，我们接下来研究是否COX-2和TNF-α基因转录(调节UVB-诱导的皮肤炎症的关键基因)在UV-照射的CD1d敲除小鼠的皮肤中被解除了调节。我们发现COX-2和TNF-αmRNA水平在UV照射后48和72h的CD1d敲除小鼠皮肤中被抑制了(图9)。由于在UV照射后48和72h的野生型小鼠中观察到了UV-诱导的皮肤损伤/炎症，这些数据证明了皮肤CD1d通过诱导COX-2和TNF-α基因转录而介导UV-诱导的皮肤炎症/损伤。
实施例11
在CD1d敲除小鼠的UV-照射的皮肤中的炎性细胞因子的合成与野生型对照小鼠相比减小了。
UV照射小鼠
将小鼠暴露于200mJ/cm2照射剂量的UVB照射一次。将三个月大的雌性自交129/C57BL/6 WT和129/C57BL/6CD1 KO小鼠用于此研究中(n＝4)。
细胞因子定量分析
在照射后0h、24h、48h、72h、96h和168h收集8mm的皮肤打孔活体组织并且立即冷冻在液氮中。利用标准的ELISA方法定量测定皮肤匀浆中的IL-6和MIP1-α。
在照射后48小时，在WT小鼠中UV-B照射诱导了高度上调节的炎性细胞因子的合成，而CD1d KO小鼠中IL-6和MIP1-α蛋白的合成显著地减少了。这些证明了CD1d在UVB诱导的皮肤炎症中的主要作用。
实施例12
皮质醇下调节化学应力-诱导的CD1d基因转录。
在初级人角化细胞暴露于作为压力因子的300μM H2O2之前，将其培养在完全的KGM中。在培养48小时后，用不含皮质醇的KGM替代KGM培养基并用300μM的H2O2处理培养物。在处理后的不同时间点提取总的RNA并通过实时PCR定量测定CD1d mRNA。
为了进行Taq Man试验，Applied Biosystems推荐每孔使用10到100ng的初始RNA。因此，在20μl体积的1μg总RNA和150μg的随机六聚体中按照生产商的说明进行第一链cDNA合成(用于RT-PCR的Superscript第一链合成系统，11904-018，Invitrogen)。通过实时PCR将1μg所得的cDNA样品产物用于扩增。
用于检测CD1d cDNA的引物和探针系列由Applied Biosystems asAssays on Demand提供(分别为Hs00174321_ml和HsO0166289_ml)。以PDARS形式提供管家基因GAPDH的引物和探针(4310884E，Applied Biosystems)。
所有的cDNA样品一式三份。在冰上微在离心管中制备PCR反应混合物。对于一次复制而言，利用1.25μl的20x靶或对照混合物、10.25μl的水和12.5μl的2XTaqMan通用主混合物制备24μl的预混合物，并添加到1μl的cDNA中。将PCR反应混合物轻轻地和迅速地离心，然后以25μl每孔的比率等分加至96孔平皿中。将平皿密封，以2000rpm离心30秒并置入5700序列检测系统中，利用下述PCR程序进行热循环和荧光分析：
-50℃2分钟
-95℃10分钟
-40个循环的95℃15秒和60℃1分钟
利用GeneAmp 5700 SDS软件分析结果。获得了显示目的cDNA的扩增作为循环次数的函数的扩增绘图。
通过下式的比较性的Ct方法测定与对照条件下的比较，在试验条件下获得的基因表达倍数的变化：
倍数变化＝2-ΔΔCt＝2-(ΔCt试验-ΔCt对照)
  其中ΔCt＝Ct靶基因-Ct管家基因
如图11所示，当细胞暴露于H2O2时，观察到CD1d基因表达随时间的调节。在皮质醇的存在下，在H2O2攻击后获得的CD1d基因表达模式在皮质醇抑制的CD1d转录中是不同的。
因此，皮质醇能下调节遭受应激的细胞中的CD1d表达。
实施例13
与野生型皮肤相比，在CD1d敲除小鼠的皮肤和肠中磷脂水平被除了调节。
小鼠：将5月龄的雌性自交C57BL/6 CD1d -/-和野生型C57BL/6小鼠处死并切取相应的组织。利用液氮将来自各小鼠的皮/肠组织快速冷冻。然后将它们用于脂含量的分析。
皮肤中通过CD1d调节的主要脂类家族为磷脂。
              每克皮肤组织的nmol
  CD1d -/-*   野生型
  鞘磷脂溶血卵磷脂卵磷脂丝氨酸磷脂   33+/-30.43.8+/-3.735.1+/-21.167+/-30.4   176+/-11610.0+/-4.18.5+/-12.9115+/-33
所述值在统计学上显著地不同于野生型对照(p0.05)
鞘磷脂
其是动物细胞膜中普遍存在的成分，其中其是迄今最丰富的鞘脂类。实际上，其包括特定组织中脂类的50％，尽管其通常比卵磷脂的含量少。例如，它占脑的脂类的大约10％。它是大多数反刍动物的红细胞中唯一的最丰富的脂类，其中它完全地代替了卵磷脂。在这种情况下，已知高效的磷脂酶A分解甘油磷酸酯，而不是分解鞘磷脂。类似于卵磷脂，鞘磷脂在原生质膜中是最丰富的，特别是在细胞的外小叶中。
目前，已知鞘磷脂(及其它鞘脂类)和胆固醇可共同定位于膜的特异性亚区域(‘膜筏’或相关的称为‘细胞膜穴样内陷’的结构)。作为含有长的、大体上饱和的酰基链的鞘脂类，它们更为紧凑地聚集在一起，因此鞘脂类比膜甘油磷酸酯具有更高的熔化温度。这些紧凑的酰基链聚集是卵筏脂质组织化所必需的，因为鞘脂类和磷脂的不同的聚集结构被认为导致膜中的相分离，产生甘油磷酸脂-富集区域(‘液体-紊乱’相)包围的富含鞘脂类卵筏(‘液体有序’相)。在这些卵筏中的特异性细胞蛋白和脂类之间的相互作用被认为在信号传导机制中是重要的，此表明了鞘磷脂在调节细胞信号传导中的重要作用。
鞘磷脂是与细胞凋亡有关的信号转导过程中的主要脂类。
同样，鞘磷脂是神经酰胺、作为‘鞘磷脂循环’的一部分的长链基体和鞘氨基醇-1-磷酸酯以及很多其它的重要鞘脂类的前体。(参见下图)。其中的一些具有作为胞内信使的功能，而其它的是膜的必要组分
Figure A0382444600351
溶血卵磷脂
-促-炎的磷脂
-在牛皮癣伤口中增加
-皮内注射诱导皮肤炎症
-在磷脂酶A2的作用下形成，它是花生四烯酸产生中的速率限制步骤。(与CD1d对COX-2的调控相关联)。
对于大肠，获得如下的结果：
             大肠
          nMole每克组织
  脂类种类   饱和度   脂肪酸家族   CD1d -/-*   野生型
  心磷脂   饱和的   硬脂酸   405±89   950±442
  总共   405   950
  不饱和的   11-十八碳单烯酸   74±21   167±45
  油酸   216±42   377±86
  α亚麻酸   23±9   43±9
  DHA   164±92   596±278
  亚油酸   781±210   2066±727
  DGLA   36±12   60±16
  总计   1294   3309
  总心磷脂   1699   4259
  溶血卵磷脂   饱和的   肉豆蔻酸   78±41   27±5
  花生酸   7±3   3±0.5
  总计   85   30
  不饱和的   二十碳烯酸   9±5   3±2
  芥子酸   234±143   17±36
  二十碳二烯酸   153±98   30±61
  DGLA   11±5   4±1
  二十二碳二烯酸   12±8   2±3
  总计   419   56
  总溶血卵磷脂   504   86
  游离脂肪酸   饱和的   十五碳烷酸   31±10   17±5
  总计   31   17
  不饱和的   神经酸   9±5   2±4
  总计   9   2
  总游离脂肪酸   40   19
  胆甾醇酯   不饱和的   二十碳五烯酸   5±3   1±3
  Palmitelaidic acid   49±27   13±8
  总计   54   14
  甘油二酸酯   不饱和的   二十碳烯酸   11±8   33±16
  总计   11   33
  卵磷脂   不饱和的   亚油酸   2551±2321   6398±2862
  总计   2551   6398
  丝氨酸磷脂   不饱和的   亚油酸   501±105   1102±338
  总计   501   1102
*所有的值在统计学上显著地不同于野生型组(p＜0.05)
对于小肠，得到了如下的结果：
           小肠
       nMole每克组织
  脂类种类   饱和度   脂肪酸家族   CD1d -/-*   野生型
  心磷脂   不饱和的   二十碳烯酸   12±7   21±3
  DHA   178±124   480±121
  总计   190   501
  卵磷脂   饱和的   二十二碳烷酸   13±10   27±10
  总计   13   27
  不饱和的   蜜糖酸   7±4   15±4
  二十碳四烯酸   2±3   7±3
  DGLA   154±96   310±115
  二十二碳二烯酸   5±4   10±3
  总计   168   342
  总卵磷脂   181   369
*所有的值在统计学上显著地不同于野生型组(p＜0.05)
上面这些数据支持了CD1d在磷脂的新陈代谢调控中的作用，而新陈代谢调节炎性过程。

Claims (37)

1.一种能够阻断或改变内源性CD1d功能的物质，其通过包括下述步骤的方法获得：
(a)将上皮细胞暴露于目的物质，
(b)将上皮细胞置于应激情况下，
(c)通过筛选下列一个或多个试验测定所述应激对所述上皮细胞的影响，
(i)上皮细胞增生(H&E)，
(ii)上皮增殖(BrUd，PCNA)，
(iii)上皮细胞的细胞凋亡，(TUNEL)
(iv)p53突变累积，
(v)上皮细胞脂类的定量和定性评价，
(vi)细胞凋亡和非-细胞凋亡性细胞表面受体的共-聚簇模式，
(vii)促-炎细胞因子的产生，
(viii)免疫调节细胞因子的产生，
(ix)炎症的标记，
(x)抗-细胞凋亡的转录因子，
(xi)老化的标记，
(d)与用对照获得的结果相比较。
2.根据权利要求1的物质，其能够预防和/或治疗应激对上皮细胞的有害影响。
3.根据权利要求1的物质，其能够预防或治疗毛发脱落。
4.根据前述权利要求中任意一项的物质，其是减少CD1d基因转录和/或翻译的化合物。
5.根据权利要求4的物质，其是CD1d-基因和/或CD1d-mRNA所含序列的反义多核苷酸。
6.根据权利要求1到4中任意一项的物质，其是葡糖神经酰胺合酶基因和/或葡糖神经酰胺合酶mRNA所含序列的反义多核苷酸。
7.根据权利要求1到4中任意一项的物质，其是鞘磷脂酶或神经酰胺合酶基因和/或鞘磷脂酶或神经酰胺合酶mRNA所含序列的正义多核苷酸。
8.根据权利要求1到4中任意一项的物质，其是与CD1d结合并且基本上阻断或改变CD1d功能的多肽或肽。
9.根据权利要求8的物质，其中所述的多肽是抗体或抗体的可变部分。
10.根据权利要求1到4中任意一项的物质，其是脂类。
11.根据权利要求10的物质，其中所述的脂类为鞘脂类、鞘糖脂、磷脂、神经节苷脂、甾醇、脂肪酸、甘油酯或磷脂酰肌醇磷酸酯。
12.根据权利要求10和11的物质，其来自植物、微生物或动物或植物化学品，特别是自然的或合成的多酚或绿茶的组分以及银杏内酯、维生素、氨基酸或类胡萝卜素。
13.根据权利要求8的物质，其为神经酰胺或属于TNF超家族的受体的配体，特别是CD95/APO-l/Fas。
14.根据前述权利要求中任意一项的物质，用于制备用于预防和/或治疗应激对上皮细胞的有害作用和/或毛发脱落的载体。
15.一种组合物，包括至少前述权利要求中任意一项中的一种物质。
16.根据权利要求15组合物，其为食物组合物、化妆品组合物或药物组合物。
17.根据权利要求16的组合物，其为牛奶、酸奶、凝乳、乳酪、发酵牛奶、基于乳的发酵制品、冰淇淋、基于乳的粉末、婴儿配制品、谷制品、发酵的谷基制品、矿泉水、巧克力或宠物食品，或是洗液、香波、奶油、防晒剂、日晒后软膏、抗-老化乳膏和/或油膏或片剂、液体、干燥的口服补品、湿的口服补品，干燥的管饲食物或湿润的管饲食物或抗-癌药物。
18.权利要求1到14中任意一项所述的物质或权利要求13到15中任意一项所述的组合物在预防和/或治疗由应激情况产生的上皮组织损伤和/或毛发脱落中的应用。
19.根据权利要求18的应用，其中所述的应激情况为化学应激、生物学应激或物理压力。
20.根据权利要求19的应用，其中所述的化学应激是通过暴露于氧化剂或致癌物质而施加的，或其中生物学应激是通过暴露于细菌、病毒、真菌、由细胞和/或微生物周围获得的脂类而施加的，或其中的物理应激是通过暴露于UV照射而施加的。
21.根据权利要求18到20中任意一项所述的应用，其中所述的损伤为皮肤烧伤和/或起水泡、白内障形成、表皮增生、癌症、炎症、免疫抑制、皮肤老化。
22.根据权利要求18到21中任意一项所述的应用，其中所述的上皮细胞获自皮肤、内脏、眼睛、肺、前列腺、肝脏、乳房、肾脏和/或子宫。
23.根据权利要求21的应用，其中所述的癌症为乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、非-黑素瘤以及黑素瘤皮肤癌。
24.一种用于鉴定阻断或改变CD1d的物质的方法，其包括下列步骤：
(a)将上皮细胞暴露于目的物质，
(b)将上皮细胞置于应激情况下，
(c)通过筛选下列一个或多个试验测定所述应激对所述上皮细胞的影响，
(i)上皮细胞增生(H&E)，
(ii)上皮细胞增殖(BrUd，PCNA)，
(iii)上皮细胞的细胞凋亡，(TUNEL)
(iv)p53突变累积，
(v)上皮细胞脂类的定量和定性评价，
(vi)细胞凋亡和非-细胞凋亡性细胞表面受体的共-聚簇模式，
(vii)促-炎细胞因子的产生，
(viii)调节免疫的细胞因子的产生，
(ix)炎症的标记，
(x)抗-细胞凋亡的转录因子，
(xi)老化的标记，
(d)与用对照获得的结果相比较。
25.根据权利要求24的方法，其中的应激情况为化学应力、生物学应力或物理应力。
26.根据权利要求25的方法，其中化学应力是通过暴露于氧化剂或致癌物质而施加的，或其中生物学应力是通过暴露于细菌、病毒、真菌、由细胞和/或微生物周围获得的脂类而施加的，或其中的物理应力是通过暴露于UV照射而施加的。
27.根据权利要求24到26的方法，其中促-炎细胞因子选自由IL-1、TNF-α、PGE-2、IL-6、IFN-γ或IL-8组成的组。
28.根据权利要求24到26中任意一项的方法，其中调节免疫的细胞因子选自由PAF、IL-10、IL-4或TGF-β组成的组。
29.根据权利要求24到26中任意一项的方法，其中所述的脂类选自由磷脂、鞘脂类和鞘糖脂组成的组。
30.根据权利要求24到26中任意一项的方法，其中所述的炎症标记包括Cox-2和iNos。
31.根据权利要求24到26中任意一项的方法，其中抗-细胞凋亡的转录因子包括AP-1和NFkappaB。
32.根据权利要求24到26中任意一项的方法，其中所述的老化标记包括弹性蛋白酶、胶原酶、金属蛋白酶、明胶酶、基质溶素、端粒酶。
33.根据权利要求1到14中任意一项的物质或根据权利要求15到17中任意一项的组合物在降低癌症的多重耐药性中的应用。
34.根据权利要求33的应用，其中所述的癌症为皮肤癌、消化道癌或乳腺癌。
35.表达和/或超表达CD1d的细胞在筛选改变和/或阻断CD1d功能的物质的试验中的应用。
36.CD1d -/-动物作为试验模型在影响由应激情况产生的上皮组织损伤和/或毛发脱落的物质的活性测定中的应用。
37.根据权利要求1到14中任意一项的物质在基因治疗中的应用。
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