JP2007509925A

JP2007509925A - デオキシノジリマイシン誘導体又はその薬学的塩の使用

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Publication number: JP2007509925A
Application number: JP2006537908A
Authority: JP
Inventors: ヨハンネスマリアフランシスカスヘラルダスアーツ
Original assignee: マクロジーメビー．ブイ．
Priority date: 2003-10-29
Filing date: 2004-10-29
Publication date: 2007-04-19
Also published as: US7662838B2; DE602004030604D1; WO2005039578A2; WO2005039578A3; IL175259A0; US20070135487A1; AU2004283631A1; EP1680112B1; ATE491451T1; CA2544086A1; EP1680112A2; PT1680112E; PL1680112T3

Abstract

本発明は、インスリン抵抗性、皮膚の色素沈着過剰症及び／又は炎症過程、真菌症、過体重及び肥満、並びにマイクロバクテリア感染症を治療する薬物を調製するための、デオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の使用に関する。

Description

本発明は、グルコシルセラミド及び／又は他のスフィンゴ糖脂質の合成が役割を果たす様々な疾患を治療する薬物を調製するための、デオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の使用に関する。このような疾患には、インスリン抵抗性、色素沈着過剰症、真菌症、及びマイクロバクテリア感染症（microbacterial infection）が含まれる。特に、本発明は、インスリン抵抗性を治療する薬物を調製するための、デオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の使用に関する。慢性のインスリン抵抗性は、ＩＩ型糖尿病を引き起こす。

ＩＩ型糖尿病の発病率は、劇的に増加している。主要な根源をなす障害は、インスリンに反応してＧＬＵＴ４トランスポーターを細胞表面に動員するための感受性が低下した結果、筋肉及び脂肪組織による血流からのグルコースの取込みが損なわれることである。脂肪酸パルミテートの濃度の増加がグルコースの恒常性の異常に関連することは、長年すでに知られている。しかし、それによって脂肪毒性が糖尿病の発症及び進行を引き起こす分子機構は、十分に理解されていない。したがって、この事柄の見識をさらに深めれば、インスリン抵抗性及びＩＩ型糖尿病を治療する薬物を改良／開発する助けとなるであろう。

脂肪病原性の分子機構
アムステルダム大学、Academic Medical CenterのDepartment of Biochemistryにおけるスフィンゴ糖脂質及びＩＩ型糖尿病に関する研究活動は、最近、ＩＩ型糖尿病の脂肪病原性において予想外の新しい見識をもたらした。根源をなす機序について、以下に詳細に記載する。

後天性のインスリン抵抗性におけるスフィンゴ糖脂質の役割
インスリン抵抗性の病因におけるスフィンゴ（糖）脂質の役割が、仮説として取り上げられている。この考えは、パルミテートはスフィンゴ脂質のセラミド部分の不可欠な構成単位であり、スフィンゴ脂質の生合成の最初の段階は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼが触媒する、パルミテートのセリンへの転換を含むという顧みられなかった事実に起因する。図１を参照されたい。肝臓におけるスフィンゴ脂質の合成速度は、パルミテートの濃度に大きく依存する。重要なことは、これは培養筋肉細胞（平滑筋細胞、筋原細胞）で実験的に確認できたことであり、パルミテートを０．１、０．５、及び１．０ｍＭ培養液に添加すると、これらの構造において放射線ラベルしたセリンの結合が増加することにより明らかになるように、スフィンゴ糖脂質の合成が比例的に上昇する。

この発見により、インスリン抵抗性の根源となる筋肉における脂肪毒性をスフィンゴ（糖）脂質が実際に媒介する可能性について、より詳しい実験が促された。最近、ＧＭ３（細胞表面における最も単純なガングリオシド、図２を参照されたい）がインスリンのシグナリングを損なう可能性があることが証明された。この点に関して、細胞表面におけるＧＭ３の濃度は、インスリンに反応してインスリン受容体のマルチクラスタリングを負方向に妨害することにより、グルコースの取込みを調節しているらしいことが観察されている。さらに、ＧＭ３の濃度の増加は、ＧＬＵＴ４の細胞表面への動員の減少に関連する。それとは反対に、ＧＭ３の減少は、インスリン感受性の増強に関連する（Yamishita et al, Proc Natl Acad Sci USA (2003), 100, 3445-9, Enhanced insulin sensitivity in mice lacking ganglioside GM3; Tagami et al., (2002) J Biol Chem, 277, 3085-92, Ganglioside GM3 participates in the pathological conditions of insulin resistanceを参照されたい）。本発明者らは、肥満状態ではパルミテートのレベルは慢性的に高く、したがって、脂肪細胞及び筋肉細胞におけるスフィンゴ糖脂質の形成が速い速度で起こり、インスリン抵抗性に好都合に働くと仮定している。局所的なスフィンゴ糖脂質合成（ＧＭ３を含む）の増加に対する推進力としての筋肉中のパルミテート濃度の増加と、インスリン抵抗性との関係（図３を参照されたい）については本発明者ら以外によっては（by others）未だ確認されていない。

グルコシルセラミド合成酵素の決定的な役割
細胞表面におけるＧＭ３及び他のガングリオシドの濃度は、ガングリオシド合成における律速段階であるグルコシルセラミド合成酵素の活性（グルコシルセラミドの合成）に依存することがさらに理解された（図３を参照されたい）。この酵素は、セラミド及びＵＤＰ−グルコースからのグルコシルセラミドの形成を触媒している。その両基質（セラミド及びＵＤＰ−グルコース）のＫｍ値は、生理的範囲にある。本発明者らは、グリコシルセラミド合成酵素がインスリン感受性に関して重要な調節酵素であることを示している。その活性は、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α）、ステロイドホルモン、飽和脂肪酸、及びウィルス感染に反応して上昇することが、以前に観察され報告されている（図４を参照されたい）。いまや驚くべきことに、スフィンゴ糖脂質合成酵素における変化は、最終的にＩＩ型糖尿病に発展することがあるインスリン抵抗性の促進に影響を及ぼすことが見出されている。脂肪病原性がインスリン抵抗性に影響を及ぼすというこの発見は、グルコシルセラミド合成酵素の活性を阻害すると有益な血糖降下作用が発揮されることを示している。
Yamishita et al, Proc Natl Acad Sci USA (2003), 100, 3445-9, Enhanced insulin sensitivity in mice lacking ganglioside GM3 Tagami et al., (2002) J Biol Chem, 277, 3085-92, Ganglioside GM3 participates in the pathological conditions of insulin resistance

イミノ糖ベースの阻害剤の新規の使用
イミノ糖の特別な部類であるデオキシノジリマイシンは、グルコシルセラミドの合成を阻害することにより、スフィンゴ糖脂質の合成を減少させるのに適切な薬物であることが明らかになっている。さらに、ヒトへのイミノ糖の投与の安全性について、かなりの実践的な専門技術が得られている。

したがって、本発明は、インスリン抵抗性を治療する薬物を調製するためのグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤の使用に関し、前記阻害剤はデオキシノジリマイシン誘導体である。

メタボリックシンドロームと診断されるほとんどの人々においてインスリン抵抗性が認められているので、本発明による使用のさらなる一実施形態は、メタボリックシンドロームの治療のためである。

グルコシルセラミド合成酵素は、デオキシノジリマイシンが阻害する唯一の酵素ではない。実際、デオキシノジリマイシンは、細胞表面及び様々な細胞内区画におけるいくつかの「グルコース処理」酵素を阻害する（Butters et al., Chem.Rev. (2000) 100, 4683-96を参照されたい）。細胞の様々な区画への薬物の接近しやすさが異なるので、ｉｎｖｉｖｏでデオキシノジリマイシンを投与した結果は、必ずしも標的酵素に対するｉｎｖｉｔｒｏの効力と相関するわけではない。例えば、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシンは、ｉｎｖｉｔｒｏで強力なグリカントリミングα−グルコシダーゼ阻害剤（Ｋｉ μＭ未満）であり、グルコシルセラミド合成酵素の中程度の阻害剤に過ぎない（Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン１００ｍｇＴＩＤはスフィンゴ糖脂質合成を２０〜３０％しか阻害しない）。それにもかかわらず、後者の酵素は薬物への接近しやすさがより大きいためである（グルコシルセラミド合成酵素の触媒領域は細胞基質に面しているが、α−グルコシダーゼは、ＥＲ中に存在する）。Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシンは、スフィンゴ糖脂質の生合成を阻害する能力に基づき、Ｉ型ゴーシェ病の治療に登録されている。したがって、デオキシノジリマイシンの潜在的な阻害活性がいかに大きいかを確立するためには、ｉｎｖｉｖｏの評価は必須である。

グルコシルセラミド合成酵素に対する適切な阻害剤のｉｎｖｉｖｏのＩＣ５０値は、実施例に記載した培養細胞を用いてグルコシルセラミド合成酵素の活性をｉｎｖｉｖｏ測定により決定して、１ｍＭ未満でなければならない。好ましくは、ＩＣ５０は０．５ｍＭ未満であり、より好ましくは０．１ｍＭ未満であり、さらにより好ましくは０．０５ｍＭ未満である。

グルコシルセラミド合成酵素の阻害剤が、他の酵素をできるだけ阻害しないことが好ましい。この文脈では特に腸管酵素に関連する、というのは腸内グリコシダーゼの強力な阻害剤は重篤な腸管の病訴を引き起こす可能性があり、多くの個体に耐用性が大変良いわけではないことがあるからである。したがって、デオキシノジリマイシン誘導体が、腸内スクラーゼ、マルターゼ、及び／又はラクターゼの強力な阻害剤ではないことが好ましい。腸細胞の表面に位置するスクラーゼ、マルターゼ、及び／又はラクターゼの阻害は、腸のホモジネートを使用してｉｎｖｉｔｒｏアッセイで適切に測定することができる。実施例に記載する膜標本を使用してグルコシダーゼ活性をｉｎｖｉｔｒｏの測定により決定して、ｉｎｖｉｔｒｏのＩＣ５０値が、０．５ｍＭ又はそれを超え、好ましくは１ｍＭを超え、より好ましくは２．５ｍＭを超え、より好ましくはスクラーゼ、マルターゼ、及びラクターゼの少なくとも１つに対して、好ましくはスクラーゼ、マルターゼ、及びラクターゼの少なくとも２つに対して、より好ましくはスクラーゼ、マルターゼ、及びラクターゼのそれぞれに対して５ｍＭを超える場合、デオキシノジリマイシン誘導体は、スクラーゼ、マルターゼ、及び／又はラクターゼの強力な阻害剤ではないとみなされる。

グルコシルセラミド合成酵素に対するｉｎｖｉｖｏのＩＣ５０が１ｍＭ未満で、スクラーゼ、マルターゼ、及び／又はラクターゼ、好ましくは少なくともスクラーゼに対するｉｎｖｉｔｒｏのＩＣ５０値が０．５ｍＭ又はそれを超えるデオキシノジリマイシン誘導体は、インスリン抵抗性の治療に用いるのに望ましい選択性を有し、付随する許容されるレベルの腸内の病訴の形態の副作用がある。

できるだけ阻害されないことが好ましい他の酵素は、リソゾームのグルコセレブロシダーゼ及び枝切り酵素である。好ましくは、グルコセレブロシダーゼのＩＣ５０値は、培養細胞で確立して０．５ｍＭを超えるべきである。好ましくは、枝切り酵素に対するＩＣ５０値は、０．５ｍＭを超えるべきである。

本発明に従って用いることができる、適切なデオキシノジリマイシン誘導体は、欧州特許第９４７号、欧州特許第１９３７７０号、米国特許第４９４０７０５号、欧州特許第４８１９５０号、国際公開第９５／２２９７５号、国際公開第００／３３８４３号、国際公開第０１／０７０７８号に記載されており、これらの文献は本明細書に参照として組み入れられる。例えば、本発明に従って用いることができる、適切なデオキシノジリマイシン誘導体は、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン、及びＮ−［β−（４−エトキシカルボニルフェノキシ）−エチル］−デオキシノジリマイシン（エミグリタート）である。本発明に従って用いるのに適切ではないデオキシノジリマイシン誘導体は、Ｎ−ヒドロキシエチル−デオキシノジリマイシン（ミグリトール）である。培養細胞におけるグルコシルセラミド合成酵素に対するＩＣ５０値は１ｍＭを超え、スクラーゼに対するＩＣ５０値は５ｍＭ未満である。

一実施形態では、本発明に従って適切に用いることのできるデオキシノジリマイシン誘導体は、国際公開第９８／０２１６１号、及びJ. Biol. Chem. 273, 26522-27 (1998)に記載されており、これらの文献は両者とも本明細書に参照として組み入れられる。好ましくは、デオキシノジリマイシン誘導体は、デオキシノジリマイシンの窒素原子に結合した無極性の側鎖を含む。好ましくは、この無極性の側鎖は、各々が別の環と２個以上の炭素原子を共有する３個以上の環を含む多環式アルコールから誘導され、且つ脂質二重層に入り込むことができる、大きな疎水性部分を含む。好ましくは、この大きな疎水性部分は、炭素原子３〜８個のアルコキシポリアルキレン鎖又はポリアルキレン鎖を含むスペーサーにより、デオキシノジリマイシンの前記窒素原子に結合している。より好ましくは、この大きな疎水性部分は、アダマンタンメタノール、コレステロール、β−コレスタノール、アダマンタノール、及び９−ヒドロキシフェナントレンからなる群から選択される化合物から誘導される。「スペーサー」は、疎水性の基をデオキシノジリマイシンのＮ原子に結合することができるあらゆる２価の部分又は基を意味する。

特異的阻害剤のデザイン
特に、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンは、以前はＡＭＰ−ＤＮＭとしても知られており、大変強力なグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤として同定されているが（培養細胞でＩＣ５０〜１００ｎＭ）、これは酵素構造の分子モデリングにより、この阻害剤が酵素部位にほとんど完全に適合することが明らかになっている事実から説明される。Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンには、様々なさらなる魅力的な特徴がある。さらに、この化合物は良好な経口のバイオアベイラビリティを示す。

したがって、デオキシノジリマイシン誘導体は、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシン、又はこの誘導体若しくは類似体であることが好ましい。

他の治療的取組み
上記に記載したデオキシノジリマイシン誘導体は、皮膚の色素沈着過剰症及び／又は炎症過程を治療するために用いることができることがさらに見出されている。したがって、本発明は、デオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の、皮膚の色素沈着過剰症及び／又は炎症過程を治療する薬物を調製するための使用にも関する。好ましくは、本発明は、デオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の、皮膚の色素沈着過剰症及び／又は炎症過程を治療する薬物を調製するための使用に関し、デオキシノジリマイシン誘導体又は塩が、グルコシルセラミド及び／又は他のスフィンゴ糖脂質の合成を阻害する能力を示す。

上記に記載したデオキシノジリマイシン誘導体は、真菌症の治療に適切に用いることができることも見出されている。したがって、本発明は、デオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の、真菌症を治療する薬物を調製するための使用にさらに関する。好ましくは、本発明は、デオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の、真菌症を治療する薬物を調製するための使用にさらに関し、デオキシノジリマイシン誘導体又は塩が、グルコシルセラミド及び／又は他のスフィンゴ糖脂質の合成を阻害する能力を示す。

さらに、上記に記載したデオキシノジリマイシン誘導体は、マイクロバクテリア感染症の治療に適切に用いることができることが見出されている。したがって、本発明は、デオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の、マイクロバクテリア感染症を治療するための薬剤を調製するための使用にも関する。したがって、好ましくは、本発明はデオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の、マイクロバクテリア感染症を治療するための薬剤を調製するための使用に関し、デオキシノジリマイシン誘導体又は塩が、グルコシルセラミド及び／又は他のスフィンゴ糖脂質の合成を阻害する能力を示す。上記に記載したデオキシノジリマイシン誘導体は、過体重及び肥満の治療に適切に用いることができることも見出されている。したがって、本発明は、デオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の、過体重及び肥満を治療する薬物を調製するための使用にも関する。したがって、好ましくは、本発明はデオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩の、過体重及び肥満を治療する薬物を調製するための使用にも関し、デオキシノジリマイシン誘導体又は塩が、グルコシルセラミド及び／又は他のスフィンゴ糖脂質の合成を阻害する能力を示す。

本発明は、インスリン抵抗性、皮膚の色素沈着過剰症及び／又は炎症過程、真菌症、過体重及び肥満、並びにマイクロバクテリア感染症からなる群から選択される疾患に罹患している個体を治療するための方法にも関し、前記個体にデオキシノジリマイシン誘導体、又は薬学的に許容できるその塩、及び薬学的に許容できる担体を含む薬物の有効量を投与することを含む。

適切な投与経路、及び薬剤組成物の適切な製剤の選択は、当業者の通常の技術の範囲内である。適切な投与経路の例には、非経口（静脈、皮下、筋肉内）注射又は注入、経口摂取、及び局所適用がある。
［実施例］

動物実験では、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンの耐用性は良く、いかなる明らかな病原性ももたらさないことが示された。これを考慮して、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンは、細胞の表面でＧＭ３のレベルを低下させることができるか否かを実験した。この目的で、細胞を３日間、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンに曝露し、ガングリオシドに特異的なモノクローナル抗体でＦＡＣＳ分析を行ってＧＭ３の発現を評価した。様々な細胞のタイプで（筋肉細胞を含む）、表面のＧＭ３は大きく低下した。表面のＧＭ３低下に対するＩＣ５０値は、約２５０ｎＭであった。次に、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンが様々なグリコシダーゼ及びグルコシルトランセフェラーゼを阻害する能力を試験し、他の既知の、デザインされたイミノ糖の能力と比較した。表１から明らかになるように、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンは、調査したすべてのイミノ糖で、グルコシルセラミドの合成のはるかに最も強力で特異的な阻害剤であった。疎水性部分の変異体（アダマンタンメチル、アダマンタニル、フェナントリル、コレステリル、及びコレスタニル）、並びにスペーサー（長さ３〜８個の炭素原子、及びカルボニル部分の存在）により、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンは、最も適する阻害剤であることが示された。

次に、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンが、様々なグリコシダーゼ及びグルコシルトランスフェラーゼの合成を阻害する能力を試験し、他の既知の、デザインされたイミノ糖の能力と比較した。

Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンの高血糖症の抑制因子としての価値を、マウス肥満モデルで試験した。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｏｂ^−／−、ｄｂ^−／−、及び^＋／＋）に、毎日、体重ｋｇあたり０．２５ｍｇ又は１００ｍｇのＮ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンを経口的に処置した。血漿グルコース、水分摂取、及び食餌摂取をモニターした。

Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンの食餌による投与により、肥満及び糖尿病マウスに（用量依存的に）血中グルコース及び水分摂取の低下がもたらされた。図６〜７を参照されたい。正常マウスにおいても、血中グルコースの少々の低下が早くも認められた。

さらに、２週間の処置の後、特に最も高用量のＮ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンのｏｂ−／ｏｂ−マウスにおいて、尿中グルコースに大幅低下が認められた。図８を参照されたい。

様々な独立した実験において、図５〜８に示したような同様の効果が認められた。これらの結果は、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンを、ＩＩ型糖尿病を治療するための血糖降下薬として用いることができる確固とした証拠となる。

Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンの作用機序を確証するために、ＦＶＢ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで、経口投与のＮ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンのスフィンゴ（糖）脂質に対する効果を試験した。大変感度が良く正確なＨＰＬＣベースの方法を用いて、（Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシン１００ｍｇ／ｋｇ）処置し非処置のマウスに対応させたセラミド及びグルコシルセラミドのレベルを比較した。肝臓、筋肉、及び脳を分析した。これらのいずれの組織にもセラミド濃度の変化は認められなかった。相伴って肝臓のグルコシルセラミドは８０％減少し、筋肉のグルコシルセラミドは５０％減少した。脳のガラクトシルセラミド濃度には変化は検出されなかった。ＴＬＣ分析を使用して、ガングリオシドに対する効果をモニターした。肝臓のＧＭ３に著しい低下が認められた（図９を参照されたい）。筋肉のＧＭ３にも低下が観察された（図は示さず）。脳のガングリオシド又はスルファチドには変化は認められなかった（図９）。

肝臓におけるスフィンゴ糖脂質レベルに関する所見は、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンの血漿レベルが〜１μＭである（酵素法により測定して、経口投与で４週間、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシン１００ｍｇ／ｋｇ体重）という所見と一致する。Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンの脳の透過は良好ではないが、筋肉組織に到達することはできるようである。

結論として、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンの経口投与が及ぼすスフィンゴ糖脂質の変化は、この化合物の血糖降下作用と良好に相関する。これらの所見は、本発明が魅力的であることを明確に示している。

本発明の他の態様及び利点は、以下の例示的な実施例を考察すると理解されよう。

培養細胞では、脂肪細胞によるＧＬＵＴ４の表面の発現の増加、並びにＮ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンの影響下での培養脂肪細胞及び培養筋肉細胞によるデオキシグルコースの取込みの増加により、インスリンシグナル伝達の改善が明らかにされる。初期の実験で、この効果をすでに確認した。

高脂肪食を与えたラット、及び肥満（レプチン欠損）マウスにおける、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンの影響下でのインスリン感受性の増加は、正常血糖高インスリンクランプを用いて決定することができる。

ＩＩ型糖尿病患者の筋肉でパルミテート及びスフィンゴ糖脂質がインスリン抵抗性に決定的な役割を果たすことを理解すれば、血糖降下薬を開発する根本的理由が得られる。Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンは、大変魅力的な薬理学的性質（バイオアベイラビリティ、代謝の欠如）を示し、これを経口投与してもいかなる明らかな病状も引き起こさない。重要なことは、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンは、マウスの筋肉におけるＧＭ３レベルを低下させることにより、病理カスケードを直接妨害することができる。スフィンゴ糖脂質の代謝だけが影響を受け、ガラクトスフィンゴ脂質及びスフィンゴミエリンの代謝は影響を受けない。グリコシルセラミドの形成を阻害しても、セラミド濃度に影響を及ぼさない。Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンを経口投与すると、ＩＩ型糖尿病に罹患している肥満マウスの血中及び尿中グルコースの望ましい低下がもたらされる。Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンを血糖降下薬として使用する概念の証明をこうして得た。

最適の血糖降下性イミノ糖のさらなる選択
ＩＩ型糖尿病に介入する別の取組みは、腸管のグリコシダーゼを阻害することにより胃腸管における食事由来の糖類の取込みを緩衝することに基づく。スクラーゼ（Acarbose、Ｎ−ヒドロキシエチル−デオキシノジリマイシン）の合成阻害剤は、この概念に基づいており、登録されている糖尿病治療薬である。Ｎ−ヒドロキシエチル−デオキシノジリマイシンは、スクラーゼの阻害により活性を発揮する、最も強力な承認された糖尿病治療薬である。

しかし、Ｎ−ヒドロキシエチル−デオキシノジリマイシン及びAcarboseのような腸管のグリコシダーゼの強力な合成阻害剤の大きな短所は、重篤な腸管の病訴をもたらす可能性があることである。腸管のグリコシダーゼを強力に阻害すると浸透圧活性のある糖が消化管腔に蓄積し腸内細菌の増殖に好都合に働き、攣縮及び下痢の一因となる。強力な腸管グリコシダーゼ阻害剤であるＮ−ヒドロキシエチル−デオキシノジリマイシン及びAcarboseは、そのために多くの個体には耐用性があまり良好ではなく、コンプライアンスは低下し適用は制限される。

腸管のグリコシダーゼを中程度に阻害すると、強力な阻害剤が引き起こす望ましくない腸管の病訴を引き起こさずにＩＩ型糖尿病の個体にさらなる有利な効果を及ぼすことがあるので、イミノ糖はこの点について試験を行った。Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンも、腸管のスクラーゼを阻害することができることが見出された（ＩＣ５０〜４．５ｍＭ）。しかし、この阻害は、Ｎ−ブチルーデオキシノジリマイシン、及びＮ−ヒドロキシエチル−デオキシノジリマイシンがなすよりもはるかに強くない。マルターゼ−グリコアミラーゼの阻害に関しても、同様の所見がなされた。再び、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンは、Ｎ−ヒドロキシエチル−デオキシノジリマイシン及びＮ−ブチルーデオキシノジリマイシンに比べると好ましい挙動を示した。これらの化合物の構造を図１０に示す。

ＩＩ型糖尿病を治療するための適切なイミノ糖物質を同定するために用いる基準
ＩＩ型糖尿病を治療するための最も望ましいイミノ糖ベースの物質を同定するために、以下のセットの基準を用いた。化合物は経口投与する場合高度に生物学的に利用可能でなければならず（Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンが示すように疎水性の性質が好ましく）、化合物はグルコシルセラミド合成酵素の強力な阻害剤でなければならず、化合物は特異的でリソゾームのグリコシダーゼであるα−グルコシダーゼ及びグルコセレブロシダーゼをあまり阻害してはならず、化合物は腸管のスクラーゼの積極的な阻害剤であってはならず、化合物は代謝的に不活性でなければならない。これらの基準を満たすことにより、安全で有効で耐用性の良い血糖降下薬がもたらされる。

本発明に従って用いられるデオキシノジリマイシン誘導体は、これらの基準を満たしている。特に、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシン及び構造的に緊密に関連する化合物は、最適な物質であることが見出された。これらは、Ｎ−ブチルーデオキシノジリマイシン及びＮ−ヒドロキシエチル−デオキシノジリマイシンよりも、事実上あらゆる面で魅力的である。

Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシン及び他のイミノ糖の製造
Ｎ−置換されたイミノ糖はすべて、J. Biol. Chem, 273, 26522-27 (1998)に記載された一般的手順に従って合成した。

酵素活性アッセイ
培養細胞を用いたグルコシルセラミド合成酵素活性のｉｎｖｉｖｏ測定
細胞（メラノーマ細胞、線維芽細胞、又はマクロファージ）をＨＥＰＥＳ５０ｍＭ入りＲＰＭＩ培地３ｍｌを含む２５ｃｍ^２フラスコ中でＣＯ_２インキュベーターで培養する。１時間、Ｃ６−ＮＢＤ−セラミドを５ｎｍｏｌ加えた。次に細胞を洗浄しトリプシン処理により回収する。以前に記載された通りに（van Weely S, Brandsma M, Strijland A, Tager JM, Aerts JM. Demonstration of the existence of a second, non-lysosomal glucocerebrosidase that is not deficient in Gaucher disease. Biochim Biophys Acta. 1993 Mar 24; 1181 (1): 55-62）ＨＰＴＬＣに続いて、脂質を抽出し分析する。Ｃ６−ＮＢＤ−セラミドからＣ６−ＮＢＤ−グルコシルセラミドへの転換は、グルコシルセラミド合成酵素活性の直接の尺度である。同様に、ｉｎｖｉｖｏのグルコセレブロシダーゼ活性を、J. Biol. Chem. 273, 26522-27 (1998) に記載されたように測定した。

阻害剤のＩＣ_５０値は、様々な量の試験された化合物とインキュベートした細胞で、記載されたアッセイを行って決定する。

膜標本を用いたグルコシダーゼ活性のｉｎｖｉｔｒｏ測定
新たに分離したラットの腸管膜を用いてスクラーゼ、ラクターゼ、及びマルターゼ活性を測定した。膜のホモジネートを広範に洗浄し、Potter装置及び超音波処理を用いてホモジナイズして、調製した。膜のホモジネートを、２５ｍＭスクロース、２５ｍＭラクトース、又は２５ｍＭマルトースのいずれかとともに、０．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．５）３７℃で１２０分間インキュベートした。サンプルを１００℃に２分間曝露して反応を停止させた。遠心分離後、製造元の指示に従いＧＯＤ−ＰＡＰ手順（Merck社製）を用いて、上清のグルコース含有量を分光光度法により５５０ｎＭで測定した。

枝切り酵素
枝切り酵素の活性の測定は、限界デキストリンからのグルコースの放出を測定することに基づく。赤血球はグリコーゲン又は限界デキストリンを分解することができる他の酵素を含まないので、酵素の源として赤血球を使用する。基質溶液は、０．９％限界デキストリンの基質バッファー溶液（０．１５ＭＨｉｓ／ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）＋１ｍＭＥＤＴＡ）である。アッセイ混合物は以下の通りである。赤血球ホモジネート（２０μｌ）、基質溶液（４０μｌ）。３７℃で２４時間インキュベートする。２分間煮沸して反応を停止させる。１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清一定量のグルコース含有量は、市販のキット（Sigma社製）で測定する。

ＩＣ５０値の決定
ＩＣ５０値は、酵素調製物を様々な希釈のイミノ糖に曝露し、酵素活性が５０％低下した濃度を測定することにより決定した。

脂質の分析
脂質は、良く知られているBligh&Dyerの手順に従って、組織及び血漿から抽出した。

下（クロロホルム）相を気体窒素下で乾燥した。脂質残留物をすべて、SAM-155高周波レンジで最高出力の７５％で２０分間、０．１ＭＮａＯＨのメタノール溶液０．５ｍｌで脱アシル化した。引き続き、Folchの手順に従って、脂質を抽出し、クロロホルム相を乾燥し、脂質を２５０μｌメタノールに再懸濁させた。脱アシル化した糖脂質をＯ−フタレートで誘導体化し、高速液体クロマトグラフィーにかけた。ＨｙｐｅｒｓｉｌＢＤＳＣ１８カラムを用いて、メタノール：０．１Ｍホウ酸ｐＨ３．８（８７．５：１２．５、ｖ／ｖ）の溶剤系でＨＰＬＣ分析を行った。

ガングリオシドの検出には、Bligh & Dyer抽出の上相を用いた。この目的では、上相を乾燥させ、残留物を１ｍｌの０．１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０中に溶解した。溶液をＣ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジを通過させ、水で洗浄し、ガングリオシドをクロロホルム：メタノール（１：１）で定量的に溶離した。ＨＰＴＬＣシリカプレート上で、０．２％塩化カルシウムを含むクロロホルム：メタノール：水（５５：４５：１０ｖ／ｖ／ｖ）を用いて、個々のガングリオシドを分離した。引き続きオルシノール染色液を噴霧してガングリオシドを視覚化し、光学密度計測により定量した。

細胞培養
細胞（形質転換した平滑筋細胞、筋原細胞、線維芽細胞、及び新たに分離したラット肝細胞）を、１０％ウシ胎児血清の存在下でＲＰＭＩ培養液で培養した。

動物
マウス（ｏｂｅｓｅ−ｌｅｐ^ob（Ｃ５７Ｂｌ／６）ｌａＨｓｄ−Ｌｅｐ ^ob）；糖尿病-ｌｅｒｐ^db（Ｃ５７Ｂｌ／６ＫｓＯｌａＨｓｄ−Ｌｅｐｒ^db）；野生型（Ｃ５７Ｂｌ／６ＪＯｌａＨｓｄ）及び野生型ＦＶＢ（ＦＶＢ／ＮＨａｎＨｓｄ）を、Harlan Nederland社より入手した。動物には、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシン（オランダ、Hope Farms社製）あり、又はなしのＡＭ−ＩＩ食を与えた。マウスは各ケージに５匹のグループで飼育した。水分の消費及び食餌の摂取は、週３回、ケージごとに測定した。個々の動物の体重を週３回測定した。血漿中のグルコースはＧＯＤ−ＰＡＰ法（Merck社製）で測定し、尿中グルコースはGLUKETUR試験紙（Roche社製）を用いて測定した。

＃：ＧＣ合成酵素は、Ｃ６−ＮＢＤ−Ｃｅｒを与え、Ｃ６−ＮＢＤ−ＧｌｃＣｅｒの形成がモニターされた完全な細胞で測定した。
^＊ＧｌｃＣｅｒ−ａｓｅは、Ｃ６−ＮＢＤ−Ｇｌｃｅｒを与え、Ｃ６−ＮＢＤ０Ｃｅｒの形成がモニターされた完全な細胞で測定した。
ＡＭＰ−ＤＮＭ：Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシン
ｎｄ：検出されなかった

ＩＣ５０値（即ち、５０％阻害をもたらす阻害剤の濃度）は、阻害剤の濃度を変化させて測定した。注意：Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンは、完全な細胞ではリソゾームを十分に透過せず、リソゾームのグリコシダーゼ（グルコセレブロシダーゼ、酸α−グルコシダーゼ）の阻害に対するＩＣ５０値は、ｉｎｖｉｔｒｏでの値よりも少なくとも２０倍高い。

ＧＭ３形成の概要を示す図である。律速となるのは、パルミテート、及びセラミド＋ＵＤＰ−グルコースのグルコシルセラミドへの転換である。主要なスフィンゴ糖脂質の生合成を示す図である。ＩＩ型糖尿病における脂質病原性筋肉の概念を示す図である。グルコシルセラミド合成酵素の重要な調節上の役割を示す。糖尿病の危険因子を示す図である。ＧｌｃＣｅｒ形成の促進因子を示す。ｋｇあたりｘｍｇのＮ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンを、Ｃ５７Ｂ１６マウスに毎日経口投与した効果（５匹の平均）を表す図である（ＭＺ−２１＝Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシン）。ｋｇあたりｘｍｇのＮ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンを、Ｃ５７Ｂ１６マウスＯｂ−／Ｏｂ−に毎日経口投与した効果（５匹の平均）を表す図である。ｋｇあたりｘｍｇのＮ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンを、Ｃ５７Ｂ１６マウスｄｂ−／ｄｂ−に毎日経口投与した効果（５匹の平均）を表す図である。ＭＺ２１を毎日投与し２週間の処置後、尿中グルコースに対する効果を示す図である。Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシンで処置したマウスの組織におけるガングリオシドの変化を示す図である（１００ｍｇ／ｋｇ、２週間）。引用されたＮ−置換されたデオキシノジリマイシンの構造を示す図である。

Claims

インスリン抵抗性を治療する薬物を調製するための、デオキシノジリマイシン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であるグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤の使用。
皮膚の色素沈着過剰症及び／又は炎症過程を治療する薬物を調製するための、デオキシノジリマイシン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であるグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤の使用。
真菌症を治療する薬物を調製するための、デオキシノジリマイシン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であるグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤の使用。
マイクロバクテリア感染症（microbacterial infection）を治療する薬物を調製するための、デオキシノジリマイシン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であるグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤の使用。
過体重及び肥満を治療する薬物を調製するための、デオキシノジリマイシン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であるグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤の使用。
グルコシルセラミド合成酵素に対する阻害剤のｉｎｖｉｖｏのＩＣ５０値が１ｍＭ未満である、請求項１から５のいずれか記載の使用。
スクラーゼ、マルターゼ、及びラクターゼの少なくとも２つに対する阻害剤のｉｎｖｉｔｒｏのＩＣ５０値が５ｍＭを超える、請求項１から６のいずれか記載の使用。
グルコシルセラミド合成酵素に対する阻害剤のｉｎｖｉｖｏのＩＣ５０が１ｍＭ未満であり、且つスクラーゼ、マルターゼ、及び／又はラクターゼに対するｉｎｖｉｔｒｏのＩＣ５０値が０．５ｍＭを超える、請求項７記載の使用。
デオキシノジリマイシン誘導体が、デオキシノジリマイシンの窒素原子に結合した無極性の側鎖を含む、請求項１から８のいずれか記載の使用。
無極性の側鎖が大きな疎水性部分を含む、請求項９記載の使用。
大きな疎水性部分が、炭素原子３から８個のアルコキシポリアルキレン鎖又はポリアルキレン鎖を含むスペーサーによりデオキシノジリマイシンの窒素原子に結合している、請求項９又は１０記載の使用。
大きな疎水性部分が、アダマンタンメタノール、コレステロール、β−コレスタノール、アダマンタノール、及び９−ヒドロキシフェナントレンからなる群から選択される化合物から誘導される、請求項１０又は１１記載の使用。
無極性の側鎖が、各々が別の環と２個以上の炭素原子を共有する３個以上の環を含む多環式アルコールから誘導され、脂質二重層に入り込むことができ、且つスペーサーが炭素原子３から８個のアルコキシポリアルケン鎖又はポリアルケン鎖を含む、請求項９から１２のいずれか記載の使用。
デオキシノジリマイシンが、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）デオキシノジリマイシン、又はその誘導体若しくは類似体を含む、請求項１から１３のいずれか記載の使用。
インスリン抵抗性に罹患している個体を治療する方法であって、前記個体にデオキシノジリマイシン誘導体又は薬学的に許容できるその塩、及び薬学的に許容できる担体を含む薬物の有効量を投与することを含み、デオキシノジリマイシン誘導体又は塩はグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤である方法。
皮膚の色素沈着過剰症及び／又は炎症過程、真菌症、過体重及び肥満、並びにマイクロバクテリア感染症からなる群から選択される疾患に罹患している個体を治療する方法であって、前記個体にデオキシノジリマイシン誘導体又は薬学的に許容できるその塩、及び薬学的に許容できる担体を含む薬物の有効量を投与することを含む方法。