ES2357742T3 - N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para el uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina. - Google Patents
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para el uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de resistencia a la insulina.
Description
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para el uso en el
tratamiento de la resistencia a la insulina.
La presente invención se refiere al uso de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina,
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de la resistencia
a la insulina en el que la síntesis de glucosilceramida y/o otros
glicosfingolípidos tienen una función. La resistencia a la insulina
crónica causa diabetes mellitus tipo II.
La incidencia de diabetes mellitus tipo II está
aumentando espectacularmente. El defecto primario subyacente es una
comprensión perjudicada de glucosa del flujo sanguíneo por músculo y
tejido adiposo como el resultado de una sensibilidad reducida para
movilizar los transportadores de GLUT4 a su superficie celular en
respuesta a la insulina. Es ya conocido durante muchos años que
concentraciones aumentadas del palmitato de ácido graso se asocian
con homeóstasis de glucosa aberrante. No obstante, el mecanismo
molecular por el que la lipotoxicidad causa la aparición y
progresión de la diabetes es poco comprendido. Una comprensión
ulterior en esta materia por lo tanto ayudará a mejorar/desarrollar
medicamentos para tratar la resistencia a la insulina y la diabetes
mellitus tipo II.
Las actividades de investigación en
glicoesfingolípidos y diabetes mellitus tipo II en el Departamento
de Bioquímica del Centro Académico Médico/Universidad de Amsterdam
han llevado recientemente a una nueva comprensión inesperada en la
lipopatogénesis de la diabetes mellitus tipo II. El mecanismo
subyacente está descrito en detalle más debajo.
Una función está supuesta para
(glico)esfingolípidos en la patogénesis de resistencia a la
insulina. Este pensamiento proviene del hecho ignorado de que el
palmitato es el bloque de construcción esencial de la fracción de
ceramida en esfingolípidos: el primer paso de su biosíntesis implica
la transferencia de palmitato a serina, catalizado por serina
palmitoiltransferasa, véase figura 1. El índice de síntesis de
esfingolípidos en el hígado es altamente dependiente de la
concentración de palmitato. De manera importante, esto podría ser
experimentalmente confirmado para células musculares cultivadas
(células de músculo liso, mioblastos): la adición de 0.1, 0.5, 1.0
mM de palmitato en el medio de cultivo condujo a aumentos
proporcionales en la síntesis de glicoesfingolípidos, como fue
revelado por incorporación aumentada de serina radiomarcada en estas
estructuras.
Este descubrimiento incitó un examen más
detallado de la posibilidad de que en realidad los
(glico)esfingolípidos median la lipotoxicidad en los
músculos subyacente a la resistencia a la insulina. Ha sido
destacado recientemente que GM3 (el gangliósido más simple en la
superficie de la célula, véase figura 2) puede perjudicar la
señalización de insulina. En este aspecto se observa que la
concentración de GM3 en la superficie de la célula parece regular
la absorción de glucosa en respuesta a la insulina interfiriendo
negativamente con multi-agrupamiento de receptores
de insulina. Por otra parte, concentraciones altas de GM3 se asocian
con movilización reducida de GLUT4 a la superficie celular.
Recíprocamente, la reducción de GM3 se asocia con una sensibilidad
de insulina mejorada (véase Yamishita et al. Proc Natl Acad
Sci USA (2003) 100, 3445-9 Enhanced insulin
sensitivity in mice lacking ganglioside GM3; Tagami et al.
(2002) J Biol Chem 277, 3085-92. El gangliósido GM3
participa en las condiciones patológicas de resistencia a la
insulina). Postulamos que en condiciones de obesidad, los niveles de
palmitato son elevados de manera crónica y que por lo tanto la
formación de glicoesfingolípidos en adipocitos al igual que células
musculares ocurrirá a índices aumentados, favoreciendo la
resistencia a la insulina. La conexión entre concentración
aumentada de palmitato en músculo como fuerza impulsora para la
síntesis de glicoesfingolípidos local (incluyendo GM3) y
resistencia a la insulina (véase figura 3) no ha sido aún reconocida
por otros.
Se descubrió además que la concentración de GM3
y otros gangliósidos en la superficie celular depende de la
actividad de la glucosilceramida sintasa (la síntesis de
glucosilceramida), la etapa limitadora del índice en la síntesis de
gangliósidos (véase figura 3). Esta enzima cataliza la formación de
glucosilceramida de ceramida y UDP-glucosa. Los
valores de Km de ambos de sus sustratos (ceramida y
UDP-glucosa) están en la gama fisiológica.
Mostramos que la glucosilceramida sintasa es una enzima reguladora
clave respecto a la sensibilidad de insulina. Aumentos en su
actividad han sido proporcionados y observados previamente en
respuesta a citoquinas inflamatorias (TNF-alfa),
hormonas esteroides, ácido graso saturado, e infección vírica (véase
figura 4). Se ha descubierto ahora sorprendentemente que los
cambios en la síntesis de glicosfingolípidos tienen un impacto en
la promoción de resistencia a la insulina que puede finalmente
desarrollarse en diabetes mellitus tipo II. Este descubrimiento de
que la lipopatogénesis impacta en la resistencia a la insulina
muestra que la inhibición de la actividad de la glucosilceramida
sintasa ejerce un efecto provechoso
anti-hiperglicémico.
Se ha vuelto evidente que las
desoxinojirimicinas, una categoría particular de iminoazúcares, son
agentes adecuados para reducir la síntesis glicosfingolípidos por
la inhibición de la síntesis de glucosilceramida. Además, la
experiencia práctica ha sido obtenida con la seguridad de
administración de iminoazucar en seres humanos.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere al uso de un inhibidor de glucosilceramida sintasa, dicho
inhibidor siendo
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina,
para la preparación de un medicamento para el tratamiento de
resistencia a la insulina.
La glucosilceramida sintasa no es la única
enzima que se inhibe por desoxinojirimicinas. De hecho varias
enzimas "procesadoras de glucosa" en la superficie celular y en
varios compartimentos intracelulares se inhiben por las
desoxinojirimicinas (véase Butters et al. Chem. Rev. (2000),
100: 4683-96). Las consecuencias de administración
de desoxinojirimicinas in vivo no siempre se correlacionan
con la potencia in vitro contra las enzimas diana, debido a
la accesibilidad diferente del fármaco a compartimentos diferentes
de la célula. Por ejemplo
n-butil-desoxinojirimicina es un
glicano potente que corta el inhibidor de
\alpha-glucosidasa in vitro
(sub-\muM K_{i}) y sólo un inhibidor modesto de
glucosilceramida sintasa (síntesis de glicoesfingolípido es inhibida
sólo un 20-30% por 100 mg de TID
n-butil-desoxinojirimicina). Sin
embargo, debido a la accesibilidad superior de la enzima última al
fármaco (el dominio catalítico de glucosilceramida sintasa está
enfrente del citosol, mientras que las
\alpha-glucosidasas residen en el ER).
N-butil-desoxinojirimicina ha sido
recientemente registrada para el tratamiento de la enfermedad de
Gaucher de tipo 1 basado en su capacidad para inhibir la
biosíntesis de glicoesfingolípidos. Así la evaluación in vivo
es esencial para establecer en qué medida son significantes las
actividades inhibitorias potenciales de las desoxinojirimicinas.
Un inhibidor adecuado debería tener un valor
IC50 in vivo para glucosilceramida sintasa inferior a 1 mM,
como determinado por una medición in vivo de la actividad de
glucosilceramida sintasa utilizando células cultivadas como se
describe en los ejemplos. Preferiblemente el IC50 es inferior a 0.5
mM, más preferiblemente inferior a 0.1 mM e incluso más
preferiblemente inferior a 0.05 mM.
Se prefiere que el inhibidor de glucosilceramida
sintasa inhiba otras enzimas lo menos posible. En este contexto en
particular las enzimas intestinales son de relevancia ya que
inhibidores potentes de glicosidasas intestinales pueden causar
dolencias intestinales severas y pueden no ser muy bien toleradas
por muchos individuos. Así se prefiere que el derivado de
desoxinojirimicina no sea un inhibidor potente de sucrosa
intestinal, maltasa y/o lactasa. La inhibición de sucrosa, maltasa
y/o lactasa que se localizan a la superficie de los enterocitos
puede ser adecuadamente determinada en un ensayo in vitro
utilizando homogenizados de intestino. Un derivado de
desoxinojirimicina no se considera un inhibidor potente de sucrosa,
maltasa y/o lactasa si el valor IC50 in vitro es 0.5 mM o
más, preferiblemente superior a 1 mM, más preferiblemente superior a
2.5 mM, más preferiblemente superior a 5 mM para al menos una de
sucrosa, maltasa y lactasa, preferiblemente para al menos dos de
sucrosa, maltasa y lactasa, más preferiblemente para cada una de
sucrosa, maltasa y lactasa como fue determinado por una medición
in vitro de actividad de glucosidasa utilizando una
preparación de membrana como se describe en los ejemplos.
Derivados de desoxinojirimicina mostrando un
IC50 in vivo para glucosilceramida sintasa inferior a 1 mM y
un valor IC50 in vitro para sucrosa, maltasa y/o lactasa,
preferiblemente para al menos sucrosa, de 0.5 mM o más tienen la
selectividad deseada para ser usados para el tratamiento de
resistencia a la insulina con un nivel concomitante aceptable de
efectos secundarios en forma de dolencias intestinales.
Otras enzimas que son preferiblemente inhibidas
lo menos posible son la glucosilceramidasa lisosómica y enzima
desramificante. Preferiblemente el valor IC50 para
glucosilceramidasa, como fue establecido en células cultivadas
debería exceder de 0.5 mM. Preferiblemente el valor IC50 para enzima
desramificante debería exceder de 0.5 mM.
Un derivado de desoxinojirimicina que no se
adecua para ser usado conforme a la presente invención es
N-hidroxietil-desoxinojirimicina
(miglitol). Su valor IC50 para glucosilceramida sintasa en células
cultivadas excede 1mM y su valor IC50 para sucrosa está por debajo
de 5 mM.
Derivados de desoxinojirimicina que pueden
idóneamente ser usados de acuerdo con la presente invención están
descritos en WO 98/02161 y J. Biol. Chem. 273,
26522-27(1998). El derivado de
desoxinojirimicina comprende una cadena lateral apolar vinculada al
átomo de nitrógeno de desoxinojirimicina. La cadena lateral apolar
comprende una fracción grande hidrofóbica que se deriva de
adamantanometanol, o, adamantanol y es capaz de insertarse en las
bicapas lipídicas. La fracción grande hidrofóbica se vincula a dicho
átomo de nitrógeno de la desoxinojirimicina mediante un separador
que comprende un alcoxi polialquileno o cadena de polialquileno de
3 a 8 átomos de carbono. La palabra "separador" se refiere a
cualquier fracción o grupo bivalente capaz de conectar un grupo
hidrofóbico al átomo N de desoxinojirimicina.
En particular
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina;
conocido precedentemente también como AMP-DNM, ha
sido identificado como un inhibidor muy potente de la
glucosilceramida sintasa (IC50 \sim 100 nM en células
cultivadas), que se explica por el hecho de que el moldeo molecular
de la estructura enzimática revela que tiene un ajuste casi
perfecto el sitio catalítico.
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina
tiene varias características adicionales atractivas. Además el
compuesto muestra una buena biodisponibilidad oral.
Por lo tanto, el derivado de desoxinojirimicina
es
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina.
El presente uso se refiere al tratamiento de un
individuo que sufre de resistencia a la insulina, con un
medicamento comprendiendo el presente derivado de
desoxinojirimicina, o una sal del mismo farmacéuticamente
aceptable, y un portador farmacéuticamente aceptable.
La selección de una forma de administración
adecuada y formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas
está incluida en las habilidades normales de las personas expertas
en la técnica. Ejemplos de vías de administración adecuadas son
inyecciones o infusiones parentales (intravenosa, subcutánea,
intramuscular), ingestión oral, y aplicación tópica.
Estudios en animales han indicado que
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina
es bien tolerada y no supone ninguna patología abierta. En vista de
ello, fue examinado si
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina
es capaz de reducir los niveles de GM3 a la superficie de las
células. Para este propósito, las células fueron expuestas durante
3 días a
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina,
y expresión de GM3 fue evaluada por análisis FACS con un anticuerpo
monoclonal específico al gangliósido. En varios tipos de células
(incluyendo células musculares), la superficie de GM3 fue
potentemente reducida. El valor de IC50 para la reducción de la
superficie de GM3 fue aproximadamente 250 nM. Después la capacidad
de
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina
para inhibir varias glicosidasas y glucosiltransferasas fue
estudiada y comparada con aquella de otros iminoazúcares diseñados
y conocidos. Como será claro de la tabla 1,
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
es, con diferencia, de todos los iminoazúcares investigados el
inhibidor más potente y específico de la síntesis de
glucosilceramida. Variaciones en la fracción hidrofóbica
(adamantanometil, adamantanil, fenantril, colesteril y colestanil)
y separador (3-8 átomos de carbono de longitud y
presencia de fracción de carbonilo) indican que
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina
es el inhibidor más óptimo.
Después, la capacidad de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
para inhibir la síntesis de varias glicosidasas y
glucosiltransferasas fue estudiada y fue comparada con aquella de
otros iminoazúcares diseñados y conocidos.
El valor de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
como supresor de hiperglicemia fue estudiado en modelos de ratón
con obesidad.
Ratones C57BL/6J (ob-/-, db-/-, y +/+) fueron
tratados por vía oral con 0, 25 o 100 mg
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina/kg
de masa corporal diaria. La glucosa en sangre, ingesta de agua e
ingesta de alimentos fueron controlados.
La administración de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
por alimento resultó en ratones obesos y con diabetes (dependiente
de la dosis) en reducciones de glucosa en sangre e ingesta de agua.
Véase Figuras 6-7. Incluso en ratones normales una
pequeña reducción de la glucosa en sangre fue ya notada.
Además, una reducción más importante en glucosa
miccional fue notada después de 2 semanas de tratamiento,
particularmente en ratones ob-/ob a la dosis máxima de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi
pentil)desoxinojirimicina. Véase figura 8.
Efectos similares a los presentados en las
Figuras 5-8 fueron notados en varios experimentos
independientes. Estos resultados son una prueba firme de que
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina
se puede usar como un agente anti-hiperglicémico
para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II.
En ratones FVB y C57BL/6J el efecto de
administración oral de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
en (glico)esfingolípidos fue estudiada para convalidar el
modo de acción de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina.
Usando un método muy sensible y basado en HPLC precisa, los niveles
de ceramida y de glucosilceramida en ratones tratados (100 mg de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina/kg)
y no tratados unidos fueron comparados. Hígado, músculo y cerebro
fueron analizados. Ningún cambio en la concentración de ceramida en
cualquiera de estos tejidos fue notado. Concomitantemente la
glucosilceramida del hígado fue reducida un 80% y la
glucosilceramida muscular un 50%. Ningún cambio fue detectado en la
concentración de galactosilceramida del cerebro. El análisis de TLC
fue empleado para controlar los efectos en gangliósidos. Una
reducción marcada fue notada en GM3 del hígado (véase figura 9). Una
reducción fue también observada en GM3 muscular (no mostrada).
Ningún cambio fue notado en gangliósidos del cerebro o sulfátido
(figura 9).
Los descubrimientos en niveles de
glicoesfingolípidos en el hígado son consistentes con el
descubrimiento de que niveles en plasma de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
son 1 uM (4 semanas 100 mg
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina/kg
por vía oral, como fue determinado por el método enzimático).
Aparentemente,
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina
penetra poco en el cerebro pero es capaz de alcanzar el tejido
muscular.
En conclusión, los cambios en
glicoesfingolípidos ejercidos por la administración oral de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
se correlacionan bien con el efecto
anti-hiperglicémico del compuesto. Estos
descubrimientos claramente muestran la fuerza atractiva de la
presente invención.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención serán entendidos considerando los siguientes experimentos
ilustrativos.
Ejemplo
1
En células cultivadas la mejora de señalización
de insulina se revela por la expresión de superficie aumentada de
GLUT4 por adipocitos y absorción de desoxiglucosa aumentada por
adipocitos cultivados y células musculares bajo influencia de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina.
Experimentos iniciales ya confirmaron este efecto.
Ejemplo
2
El aumento en sensibilidad de insulina bajo la
influencia de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
en ratas alimentadas con dieta elevada en grasas y ratones obesos
(deficitarias de leptina) puede ser determinado usando pinzamientos
euglicémicos hiperinsulinémicos.
La realización de la función crucial de
palmitato y glicoesfingolípidos en la resistencia a la insulina en
músculo de pacientes de diabetes de tipo II dieron un fundamento
para el desarrollo de un fármaco
anti-hiperglicémico.
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina
muestra características farmacológicas muy atractivas
(biodisponibilidad, defecto de metabolismo) y su administración oral
no supone ninguna patología abierta. De manera importante,
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
es capaz de interferir directamente en la cascada patológica
disminuyendo los niveles de GM3 en el músculo de ratones. Sólo el
metabolismo de glicoesfingolípidos es afectado, no lo es aquel de
galactoesfingolípidos y esfingomielina. La inhibición de formación
de glucosilceramida tampoco afecta las concentraciones de ceramida.
La administración oral de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
resulta en la reducción deseada de glucosa en sangre y urinaria en
ratones obesos que padecen de diabetes mellitus tipo II. Una prueba
del concepto para el uso de
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina
como agente anti-hiperglicémico fue así
obtenida.
Otro enfoque para intervenir en la diabetes
mellitus tipo II se basa en amortiguar la absorción de sacárido
derivado de alimentos en el tracto gastrointestinal por inhibición
de glicosidasas intestinales. Inhibidores sintéticos de sucrosa
(acarbosa;
n-hidroxietil-desoxinojirimicina) se
basan en este concepto y son fármacos registrados contra la
diabetes.
N-hidroxietil-desoxinojirimicina es
el agente más potente contra la diabetes que ejerce su actividad a
través de la inhibición de sucrosa.
La gran desventaja de los inhibidores
sintéticos potentes de glicosidasas intestinales como
N-hidroxietil-desoxinojirimicina y
acarbosa es, no obstante, que ellos pueden causar dolencias severas
intestinales. Una inhibición potente de glicosidasa intestinal
resulta en acumulación de azúcares osmóticos activos en el lumen
gastrointestinal y favorece el crecimiento enterobacteriano, ambos
contribuyendo a espasmos y diarrea. Los inhibidores potentes de
glicosidasa intestinal
N-hidroxietil-desoxinojirimicina y
acarbosa no son por lo tanto muy bien tolerados por muchos
individuos, dando como resultado una adaptabilidad pobre y
aplicación limitada.
Puesto que una inhibición moderada de
glicosidasas intestinales puede ejercer un efecto adicional
provechoso en individuos con diabetes mellitus tipo II sin causar
las dolencias intestinales indeseadas provocadas por inhibidores
potentes, los iminoazúcares fueron examinados en este aspecto. Se
descubrió que
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
es también capaz de inhibir la sucrosa intestinal (IC50 -4.5 mM).
La inhibición es, no obstante, mucho menos fuerte que la ejercida
por N-butil desoxinojirimicina y
N-hidroxietil-desoxinojirimicina.
Descubrimientos similares fueron hechos respecto a la inhibición de
maltasa-glicoamilasa. Nuevamente
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
se comportó favorablemente al compararse con
N-hidroxietil-desoxinojirimicina y
N-butil-desoxinojirimicina. Las
estructuras de estos compuestos se muestran en la figura 10.
Para identificar el agente más deseable basado
en iminoazucar para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II,
el siguiente conjunto de criterios fue usado: el compuesto debería
ser altamente biodisponible al ser administrado por vía oral
(favoreciendo un carácter hidrofóbico como mostrado por
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina);
el compuesto debería ser un inhibidor potente de glucosilceramida
sintasa; el compuesto debería ser específico e inhibir mal la
glicosidasa lisosómica, alfa-glucosidasa y
glucosilceramidasa; el compuesto no debería ser un inhibidor
agresivo de sucrosa intestinal; y el compuesto debería ser
metabólicamente inerte. El cumplimiento de este criterio resulta en
un agente anti-hiperglucémico bien tolerado, seguro
y eficaz.
La
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
usada de acuerdo con la presente invención reúne este criterio.
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
resultó ser un agente óptimo. Ellos son más atractivos que
N-butil-desoxinojirimicina y
N-hidroxietil-desoxinojirimicina en
virtualmente cada aspecto.
Todos los iminoazúcares
N-sustituidos fueron sintetizados según el
procedimiento general descrito en J. Biol. Chem, 273,
26522-27 (1998).
Células (células de melanoma, fibroblastos o
macrófagos) se cultivan en una incubadora de CO_{2} en matraces
de 25 cm^{2} conteniendo 3 ml de medio RPMI con 50 mM de HEPES. Se
añade 5 nmol de C6-NBD-Ceramida
durante 1 hora. Las siguientes células son lavadas y recogidas por
tripsinisación. Los lípidos son extraídos y analizados después de
HPTLC exactamente como se ha descrito anteriormente (van Weely S.
Brandsma M, Strijland A, Tager JM, Aerts JM. Demonstration of the
existence of a second, non-lysosomal
glucocerebrosidase that is not deficient in Gaucher disease.
Biochim Biophys Acta. 1993 Mar 24;
1181(1):55-62). La conversión de
C6-NBD-Ceramida a
C6-NBD-Glucosilceramida es una
medida directa para la actividad de glucosilceramida sintasa. De
forma similar la actividad de glucosilceramidasa in vivo fue
medida como se describe en J. Biol. Chem, 273,
26522-27 (1998).
Los valores de IC50 de los inhibidores se
determinan mediante la realización del ensayo descrito con células
incubadas con cantidades variables del compuesto evaluado.
Las actividades de sucrosa, lactasa y maltasa
fueron determinadas usando membranas intestinales de rata recién
aisladas. Homogenizados de membrana fueron preparados por lavado
extensivo y homogenización usando una sonicación de Potter y de
ultrasonido. Los homogenizados de membrana fueron incubados a 0.5 M
fosfato potásico (pH 6.5) durante 120 min a 37ºC con bien 25 mM de
sacarosa, 25 mM de lactosa o 25 mM de maltosa. Las reacciones
fueron detenidas por exposición de la muestra durante 2 minutos a
100ºC. Después del centrifugado el contenido de glucosa del
sobrenadante fue determinado espectrofotométricamente a 550 nM
usando el procedimiento de GOD-PAP (Merck) según
las instrucciones del fabricante.
La medición de la actividad de la enzima
desramificante se basa en la determinación de la liberación de
glucosa de dextrina límite. Como fuente enzimática se usan
eritrocitos ya que ellos no contienen otras enzimas que puedan
degradar glicógeno o dextrina límite. La solución de sustrato es
0.9% de dextrina límite en tampón de sustrato (0.15 M de His/NaOH
(pH 6.5) + 1 mM de EDTA). La mezcla del ensayo es como sigue.
Eritrocito homogeneizado (20 ul), solución de sustrato (40 ul).
Incubación durante 24 horas a 37ºC. Reacción detenida tras 2
minutos de ebullición. Centrifugado durante 10.min a 10.000 r.p.m.
El contenido de glucosa de una alícuota del sobrenadante se
determina con un equipo comercial (Sigma).
Los valores de IC50 fueron determinados
exponiendo preparaciones enzimáticas a varias diluciones de
iminoazúcares y determinando la concentración en la que la actividad
enzimática fue reducida al 50%.
Los lípidos fueron extraídos de tejido y plasma
siguiendo el procedimiento bien conocido de Bligh & Dyer.
La fase (de cloroformo) inferior fue secada bajo
vapor de nitrógeno. El residuo de lípido total fue desacetilado en
0.5 ml de NaOH 0.1 M en metanol en un horno de microondas
SAM-155 durante 20 minutos al 75% de energía
máxima. Posteriormente los lípidos fueron extraídos según el
procedimiento de Folch, y la fase de cloroformo fue secada y los
lípidos fueron resuspendidos en 250 ul de metanol. Glicolípidos
desacetilados fueron derivatizados con O-ftalato y
sometidos a cromatografía en fase líquida de alto rendimiento. El
análisis de HPLC fue realizado usando una columna C18 de Hypersil
BDS con un sistema de solvente de metanol: 0.1 M de ácido bórico pH
3.8 (87.5:12.5, v/v).
La fase superior de la extracción de Bligh &
Dyer fue usada para la detección de gangliósidos. Para este
propósito, la fase superior fue secada y el residuo fue absorbido en
1 ml de NaCl 0.1M, pH 4.0. La solución fue pasada a través de un
cartucho C18 Sep-Pak, lavada con agua y los
gangliósidos fueron eluidos de forma cuantitativa con
cloroformo:metanol (1:1). Gangliósidos individuales fueron separados
en placas de sílice HPTLC usando cloroformo:metanol:agua (55:45:10
v/v/v) conteniendo 0.2% de cloruro de calcio. Gangliósidos fueron
posteriormente visualizados pulverizando con la tinte de orcinol y
cuantificados por densitometría.
Células (células de músculo liso transformadas,
mioblastos, fibroblastos y hepatocitos de rata recién aislados)
fueron cultivadas en medio RPMI en presencia del 10% suero de
ternero fetal.
Ratones (obeso-lep^{ob}
(C57B1/6)laHsd-Lep^{ob}); diabetes
lepr^{db} (C57B1/6KsOlaHsd - Lepr ^{db}); tipo salvaje
(C57B1/6J OlaHsd) y tipo salvaje FVB (FVB/NHanHsd) fueron obtenidos
de Harlan Nederland. Los animales fueron alimentados con dieta
AM-II con o sin
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
(Hope Farms Netherlands). Los ratones fueron mantenidos en grupos
de cinco en cada jaula. El consumo de agua y la ingesta de
alimentos fueron determinados tres veces por semana por jaula. La
masa corporal de animales individuales fue determinada tres veces
por semana. La glucosa en plasma fue determinada con el método de
GOD-PAP (Merck), y la glucosa en la orina fue
determinada usando tiras reactivas de GLUKETUR (Roche).
Los valores de IC50 (es decir, concentraciones
de inhibidor dando como resultado 50% de inhibición) fueron
determinados por variación de concentraciones de inhibidor. Nota:
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina
penetra pocos lisosomas en células intactas y los valores de IC50
para la inhibición de glicosidasa lisosómica (glucocerebrosidasa,
alfa-glucosidasa ácida) son al menos 20 veces
superiores a los valores in vitro.
Figura 1: Vista de conjunto de formación de GM3:
índice límite son palmitato y conversión de ceramida +
UDP-glucosa a glucosilceramida.
Figura 2: Biosíntesis de glicoesfingolípidos más
importantes.
Figura 3: Concepto de músculo con
lipo-patogénesis en diabetes mellitus tipo II:
función reguladora clave para glucosilceramida sintasa.
Figura 4: Factores de riesgo para diabetes:
promotores de formación GlcCer.
Figura 5: Efecto de administración diaria oral
de x mg
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina/kg)
en ratones C57B16 (medias de 5 animales) (MZ-21=
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina).
Figura 6: Efecto de administración diaria oral
de x mg
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina/kg)
en ratones C57B16 0b-/0b-(medias de 5 animales).
Figura 7: Efecto de administración diaria oral
de x mg
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina/kg)
en ratones C57B16 db-/db-(medias de 5 animales).
Figura 8: Efecto de administración diaria de
MZ21 en glucosa miccional después de 2 semanas de tratamiento.
Figura 9: Cambios en gangliósidos en tejidos de
ratones tratados con
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina
(2 semanas 100 mg/kg).
Figura 10: Estructuras de las citadas
desoxinojirimicinas N-sustituidas.
Claims (4)
1. Uso de
N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina,
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de resistencia a
la insulina.
2. Uso según la reivindicación 1 donde
N-(5-adamantano-1-il-metoxipentil)desoxinojirimicina,
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma es un inhibidor
de glucosilceramida sintasa.
3. Uso según la reivindicación 1 o 2 donde el
medicamento es para el tratamiento de diabetes mellitus tipo
II.
4. Uso según la reivindicación 1 - 3 donde el
medicamento debe ser administrado por vía oral.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03078396 | 2003-10-29 | ||
| EP03078396 | 2003-10-29 | ||
| EP04076936 | 2004-07-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2357742T3 true ES2357742T3 (es) | 2011-04-29 |
Family
ID=34924006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04793684T Active ES2357742T3 (es) | 2003-10-29 | 2004-10-29 | N-(5-adamantano-1-il-metoxi-pentil)desoxinojirimicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para el uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2357742T3 (es) |
-
2004
- 2004-10-29 ES ES04793684T patent/ES2357742T3/es active Active
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