MXPA00012617A - Adenovirus recombinante con replicacion defectuosa con un promotor tardio principal mutado. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un adenovirus recombinante que tiene un genoma con una deficiencia en la region E1 y una mutacion en el MLP. La presente invencion tambien proporciona materiales de existencia de dichos viruses y composiciones incluyendo los viruses de la presente invencion. La presente invencion, tambien proporciona lineas celulares para propagar los adenoviruses recombinantes.

Description

ADENOVIRUS RECO BINANTE CON REPLICACION DEFECTUOSA CON UN PROMOTOR TARDÍO PRINCIPAL MUTADO Campo del Invento La presente invención se refiere a un adenovirus recombinante específicamente un virus que tiene un promotor tardío mayor alterado.

Antecedentes del Invento Los adenoviruses modificados han probado ser convenientes •' sistemas de vector para aplicaciones de transferencia de gen de investigación y terapéuticas, y los sistemas virales adenovirales presentan algunas ventajas para dichos usos. El desarrollo de vectores adenoviraies se apoya en el 15 entendimiento de genéticas virales y biología molecular. Estructuralmente, todos los viruses adenovirales son capsidas no envueltas con un número de proteínas de superficie. A través de las interacciones de estas proteínas de capsida con la superficie de una célula huésped, el virus se interna y se guarda en un organelo 20 cubierto por clatrina asemejando un vaso endocitótico (Pastan y asociados, Conceptos en Patogénesis viral, Notkins y Oldstone, ediciones. Springer-Verlag, Nueva York, páginas de la 141 a la 146 (1987)). La condición acídica dentro de la vesícula, altera la 25 configuración de la superficie del virus, dando como resultado una ruptura de la vesícula y la liberación del virus en el citoplasma de la célula, en donde es parcialmente liberada de proteínas asociadas, mientras que es transportada al núcleo. Una vez que el genoma adenoviral está dentro del núcleo de la célula huésped, su expresión procede a través de una cascada bien caracterizada y altamente ordenada. Normalmente los grupos de genes adenovirales (por ejemplo unidades de translación) están organizados en unidades ("regiones") de transcripción común, teniendo cada una por lo menos un promotor distinto. La transcripción de cada región, es procesada - íi después de la transcripción para generar las especies de mARN múltiples correspondientes a cada gen viral. Generalmente, las regiones separadas son ya sea "tempranas" o "tardías" aunque algunos genes se expresan tanto en forma temprana como tardía. Los factores de transcripción celular, se enlazan primero al 15 aumentador de corriente ascendente de la primera región temprana (E1 A) del genoma adenoviral. Los productos del gen E1 A, a su vez, regulan la expresión de los otros promotores tempranos, uno de los cuales (E2B) conduce la expresión de la unidad de transcripción incluyendo tres genes tempranos comprendidos en la réplica de ADN 20 adenoviral (Doefler, páginas de la 1 a la 95, en ADN de Adenovirus, el Genoma Viral, y Expresión, Nojhoff, Boston, (1986)). Estas tres proteínas (la proteína terminal precursora (pTP), La proteína de enlace ADN de trenzado simple (ssDBP), y la forma de polimerasa de ADN {po/)), forman una unidad ajustada con por lo menos tres 25 proteínas celulares para conducir a la promoción de alargamiento del genoma viral (Bodnar y asociados, J. Virol., 63, páginas de la 4344 a la 53 (1989); Schnack y asociados, desarrollos de Genes, 4, páginas de la 1197 a la 1208 (1990); Pronk y asociados, Clomosoma, 102, S39-S45 (1992); Kelly y asociados páginas 271-308 en el Adenoviruses (H.S.Ginsberg, ed), Plenum Press, Nueva York (1984)).

Una vez que comienza la réplica de ADN viral, la actividad de los promotores tempranos disminuye (Sharp y asociados , páginas de la 173 ala 204, en los Adenoviruses (ediciones H.S.Ginsberg), Plenum Press, Nueva York (1984)), conforme se hace la expresión de los genes celulares, debido a la actividad de los productos del gen temprano de corte del huésped viral. De manera adversa, los promotores que controlan la expresión de los genes tardíos, se vuelven activos comenzando con el desencadenamiento de la réplica de ADN viral (Thomas y asociados, Célula 22, páginas de la 523 a la 33 (1980)). En efecto, la réplica de ADN parece necesaria para la expresión de algunos genes tardíos. Por ejemplo, mientras que el promotor tardío mayor (MLP) exhibe alguna actividad en momentos tempranos, únicamente se expresan los genes próximos promotores (Shaw y asociados. Célula 22,905-16 (1980)); Winter y asociados, J. Virol., 65, páginas de la 5250 a la 5259 (1991 )). Sin embargo, la actividad del MLP filoso incrementa siguiendo el desencadenamiento de la réplica del ADN viral (Shaw y asociados, supra), dando como resultado la expresión de todos los productos del gen MLP (Doeller y asociados, supra; Thomas y asociados, supra, Nevins y asociados, Nature 290, páginas de la 113 a la 118 (1981 )). La estructura de este promotor ha sido caracterizada extensamente (ver por ejemplo, Lu y asociados, J. Virol., 71 (1 ), páginas de la 102 a la 109 (1997) Lutz y asociados, J. Virol., 70 (3), páginas de la 1396 a la 1405 (1996); Reach y asociados, EMBO J., 10 (11 ), páginas de la 3439 a la 3446 (1991 ); Reach y asociados., J. Virol., 64 (12), páginas de la 5851 a la 5860(1990), Brunet y asociados, Mol Cell. Biol., 7 (3), páginas de la 1091 a la 1100 (1987); Miyamoto y asociados, EMBO J., 4, págnias de la 3563 a la 3570 (1985)) en particular, el MLP del serotipo Add tiene tres elementos promotores de corriente ascendente, dos elementos de corriente descendente y un elemento iniciador (INR,SEQ ID NO:1 ) •' localizado en el sitio de partida. Los tres elementos de corriente ascendente son una caja de CAAT invertida (por ejemplo, GTTA) localizada en la corriente ascendente de 76 pares base del sitio de partida, un elemento promotor ascendente (UPE, SEQ ID NO:2) 15 localizada en la corriente ascendente de 63 pares base del sitio de partida, y la caja TATA (secuencia: TATAAAA), localizada en la corriente ascendente de 31 pares base del sitio de partida. Los dos elementos de corriente descendente son (SEQ ID NO: 4), localizada en la corriente descendente de 86 pares base del sitio de partida, y 20 DE2 (SEQ ID NO: 4), localizados en la corriente ascendente de 101 pares base del sitio de partida. Estos varios elementos promotores interactúan con proteínas virales y celulares para conducir a la transcripción tardía del MTLU. Por ejemplo, dos proteínas (DEF-A y DEF-B) enlazan con los elementos de corriente descendente en 25 forma que depende de la fase tardía. El DEF-B ha sido identificado como el producto del gen intermedio de adenovirus IVa2 (plVa2) (Tribouley y asociados, J Virol., 68, páginas de la 4450 a la 4457 (1994)), el cual ha sido clonado (van Beveren y asociados, Gen, 16, páginas de la 179 a la 189 (1981 )). Además, tal y como se mencionó anteriormente, los productos del gen E1A conducen a alguna actividad MLP durante la etapa temprana de la infección. El procesamiento Post-transcripcional de la unidad de transcripción tardía principal (MTLU), da surgimiento a cinco familias de mARN, tardías, designadas respectivamente como desde L1 hasta |0 L5, las cuales codifican los componentes estructurales de la capsida viral (Shaw y asociados, Célula 22, páginas de la 905 a la 916 (1980)). Estas proteínas son altamente tóxicas para las células, y pueden potencializar respuestas inmunes contra células infectadas (ver por ejemplo, Yang y asociados, Proc. Nat. Acad. Sci, (EUA), 91 , 5 páginas de la 4407 a la 4411 (1994)). Esta respuesta inmune conduce a la hinchazón del tejido y la destrucción de las células transducidas, acortando el periodo de tiempo en que los transgenes son expresados en la célula. "La Primera Generación" de vectores adenovirales, ha sido construida para silenciar el genoma adenoviral 0 con el objeto de reducir estos efectos nocivos. Como ya se mencionó, debido a que los productos del gen E1 A comienzan la cascada de la expresión del gen viral, los vectores adenovirales más tempranos carecen de regiones E1A funcionales. Por ejemplo, la inserción de un gen exógeno en la región E1 , da como resultado 5 vectores recombinantes que puede expresar el gen exógeno pero no el gen E1 A. Los adenoviruses recombinantes, deben ser propagados ya sea en células complementarias o en la presencia de un virus auxiliar para suministrar los productos E1 esenciales ausentes o disparejos (Davidson y asociados, J. Virol., 61 , 1226-39 (1987); Mansour y asociados, Mol, Cell Biol., 6, páginas de la 2684 a la 2694 (1986)). Mientras que dichos viruses de primera generación han probado ser efectivos en varias aplicaciones de transferencia de genes, no son óptimos para todos los usos. En particular, debido a que deben ser crecidos en la presencia de ADN, de complementación E1 , en algunos casos de recombinación de frecuencia pueden generar una réplica de adenovirus competente (RCA). La contaminación RCA de existencias virales, es problemática debido a que RCAs puede causar que no crezcan las existencias recombinantes y puede transformar las células huésped. Además, en la multiplicidad más alta de infecciones (m.o.i.s), algunos promotores adenovirales están activos aún en la ausencia de los productos del gen E1 A, los cuales pueden conducir a la producción de proteínas adenovirales citotóxicas (Nevins, Cell, 26, páginas de la 213 a la 20 (1981 ); Nevins y asociados, Curr. Top Microbiol. Immunol., 113, páginas de la 15 a la 19 (1984)). Una desventaja adicional de los vectores de primera generación, se atribuye en gran parte a esta expresión anterior de los productos del gen tardío. Por ejemplo, dicha expresión tardía del gen residual pude potencializar respuestas inmunes huésped, eliminando células transducidas virálmente (ver por ejemplo, Yang y asociados, supra; Gilgenkrantz y asociados, Hum. Gene. Ther., 6, páginas de la 1265 a la 1274 (1995) Yang y asociados, J. Virol., 69, páginas de la 2008 a la 2015 (1995); Yang y asociados, J. Virol., 70, páginas de la 7209 a la 7212 (1996)).

Un método para bloquear la presión tardía del gen, es la réplica viral de bloque en forma selectiva, montando el virus de modo que falle para expresar una o más de las tres encimas E2B involucradas en la réplica de ADN viral. Sin embargo, se pueden generar viruses con deficiencia de E1 A que carecen de función E2B, el método requiere el uso de líneas celulares de complementación o viruses auxiliares para suministrar el producto del gen esencial ausente (Almafitano, J. Virol., 72 (2), páginas de la 926 a la 933 (1998)). Tal como se mencionó anteriormente, un inconveniente principal de dicho método, es que los casos de recombinación dentro de las células de empaque entre dichos vectores y genes de complementación, pueden generar RCAs. Además, de los tres genes E2B, no es normalmente posible propagar un virus que carece completamente del gen ssDBP debido a que es letal la co-expresión requerida de los productos del gen ssDBP y E1A de complementación en la misma célula de empaque (Klessig y asociados, Mol. Cell Biol., 4, páginas de la 1354 a la 1362 (1984)). Se ha construido un vector que tiene una mutación sensible a la temperatura del gen ssDBP (Engelhardt y asociados, Proc. Nat. Acad. Sci. (EUA), 91 , páginas de la 6196 a la 6200 (1994)). En algunos sistemas, este vector ha dado como resultado un expresión del gen más larga y una respuesta inmune-inflamatoria reducida, que los vectores de primera generación (Yang y asociados, Proc. Nat. Acad. Sci. (EUA), 92, páginas de la 7257 a la 7261 (1995) Engelhardt y asociados, Hum. Gene Ther., 5, páginas de la 1217 a la 1229 (1994)). Sin embargo, es imperfecta la mutación sensible a la temperatura, permitiendo alguna actividad ssDBP basal a temperatura del centro del cuerpo, especialmente en m.o.i.s. superior (Yang y asociados, Proc. Nat. Acad. Sci., (USA), 92, páginas de la 7257 a la 7261 (1995)). Además de estos inconvenientes, el método de interrumpir la región E2B, también impacta el MTLU, debido a que los tres genes E2B dependen del cordón cromosomal directamente opuesto a los genes del L1 al L5 y MLP, (ver por ejemplo, Almafitano y asociados, Gene Ther., 4, páginas de la 258 a la 263 (1997)). En vista de los problemas anteriores, existe la necesidad de un adenovirus recombinante, específicamente un virus que exhiba una propensión reducida para generar RCAs dentro de las células de empaque, y menos capaces que los vectores de primera generación, para expresar los productos tardíos del gen viral, en una célula huésped.

Sumario del Invento La presente invención, se refiere a la necesidad antes mencionada de proporcionar un adenovirus recombinante, el cual, además de carecer de la expresión del gen E1 , tenga un MLP mutado. La mutación en el MLP, atenúa en gran parte la expresión del gen L1- L5 en células huésped no permitidas. Por lo tanto, dichos adenoviruses recombinantes son menos capaces que los vectores de primera generación, para expresar productos tardíos del gen viral en una célula huésped. Además, muchos adenoviruses recombinantes, pueden ser crecidos en células de empaque sin la presencia de ADN complementario al MLP adenoviral tipo natural, reduciendo substancialmente de este modo la probabilidad de generación de RCAs. Los adenoviruses recombinantes de la presente invención, probarán que son altamente útiles en investigaciones biológicas. Específicamente, la presente invención proporciona reactivos y métodos que permiten que los biólogos estudien de manera más fácil genéticas moleculares virales y citotoxicidad. Además, la presente invención proporciona reactivos y métodos que permiten a los biólogos investigar la biología celular del crecimiento e infección viral. Además, los adenoviruses recombinantes de la presente invención, equiparán al biólogo con nuevas herramientas para la investigación de la biología molecular y celular de la expresión de genes, y la regulación en nuevos antecedentes genéticos. Por ejemplo, dichos estudios, se puede enfocar en la interacción entre productos de genes en un antecedente celular definido o seleccionado, la capacidad de los factores de transcripción para transregular la expresión de genes a través de elementos promotores, represores o aumentadores, construidos en los adenoviruses, etc. Los adenoviruses recombinantes de la presente invención, también probarán ser altamente útiles como vehículos de transferencia de genes para investigación o en el ajuste clínico. Específicamente, los adenoviruses de la presente invención, son vectores útiles para introducir transgenes en células de cultivo de tejido o en las células de animales para estudiar el desarrollo o reparación de tejidos. Los vectores encontrarán aplicación también, en el tratamiento de enfermedades a través de la transferencia de genes terapéuticos. Estas y otras ventajas de la presente invención, así como características inventivas adicionales se apreciarán a partir de la siguiente descripción detallada.

Descripción Detallada del Invento. Tal y como se usa en la presente descripción, incluyendo las reivindicaciones adjuntas a la misma, los términos que se encuentran a continuación se emplean tal y como sigue: Un adenovirus, se refiere a cualquier virus del adenoviridae genus, sin importar la especificidad de las especies huésped o serotipo viral. Sin embargo, por claridad y facilidad de referencia, la presente invención será descrita con referencia al serotipo Add. Una Célula de empaque, es una célula que tiene la capacidad de propagar adenoviruses recombinantes suministrando un producto requerido para el crecimiento viral eficiente. Por ejemplo, cuando un adenovirus recombinante contiene deficiencias en uno o más genes esenciales para una réplica eficiente, la célula de empaque expresa el producto del gen viral ausente, ya sea a partir de su propio genoma o a partir de un gen localizado en un vector dentro de la célula (por ejemplo, un plásmido, un "virus auxiliar" etc.). Un gen, se define como una secuencia de ADN o ARN correspondiente a (por ejemplo, codificación) una especie de ADN madura. En muchos casos, un gen codifica una proteína; sin embargo, algunos genes ARN tanto activo como maduro (por ejemplo, rRNA, ARN antipercepción, ribocimas, etc). Mutación, se define ampliamente para significar cualquier cambio de un nativo de secuencia ADN al serotipo del cual se deriva el adenovirus recombinante. Dichas mutaciones pueden ser la eliminación de por lo menos un nucleótido procedente del genoma adenoviral nativo, y las mutaciones también pueden ser la inserción de uno o más nucleótidos no nativos en el genoma adenoviral. Por supuesto, las secuencias pueden ser eliminadas y las secuencias no nativas pueden ser insertadas para efectuar una mutación de reemplazo del ADN adenoviral nativo (tal como la inserción de un transgen en el genoma adenoviral). Una deficiencia en un gen o función del gen, es un tipo de mutación que sirve para estropear o suprimir la función del gen cuya secuencia de ADN fue mutada por completo o en parte. La presente invención proporciona, un adenovirus recombinante que tiene un genoma con una deficiencia en la región E1 y una mutación en el MLP. La deficiencia en la región E1 puede afectar E1A, E1 B o tanto E1 A como E1 B, y en el arte se conocen virus recombinantes que tienen dichas deficiencias. Además, las mutaciones de la región E1 pueden afectar opcionalmente el gen plX no esencial. Tal como se sabe en el arte, las mutaciones en el gen plX reducen la eficiencia de empaque de los genomas adenovirales grandes. Además, los adenoviruses producidos en la ausencia del producto de gen plX son más lábiles por calor que los adenoviruses de tipo natural. A pesar de estos fenotipos, la remoción de una parte de la región E1 puede efectuar el E1 a, E1 b, o ambos el E1A y E1 B, y los viruses recombinantes que tienen dichas deficiencias son conocidos en el arte. Además, las mutaciones de la región E1 puede afectar opcionalmente al gen plX no esencial. Como es sabido en el arte, las mutaciones en el gen plX reducen la eficiencia de empaque de los genomas adenovirales grandes. Además los adenoviruses producidos en la ausencia del producto del gen plX son más lábiles al calor que los adenovirules naturales. A pesar de estos fenotipos, la remoción de una porción de las secuencias que rigen la expresión del plX es preferida en algunas aplicaciones debido a que dichas mutaciones minimizan el traslape de la secuencia entre el genoma adenoviral y el ADN que complementa el E1 en las líneas celulares generalmente usadas para propagar los vectores adenovirales de la primera generación (por ejemplo, las células HEK-193), minimizando de este modo la probabilidad de que los eventos de recombinación genera un ARC. Preferentemente, el adenovirus recombinante de la presente invención es deficiente por lo menos en una función provista por la región E1 en la combinación con una deficiencia en la región E2 (por ejemplo, E2A, E2B, o ambas E2A y E2B), y/o E3, y/o E4.

Más preferentemente, el adenovirus recombinante de la presente invención comprende una deficiencia en las regiones E1 y E3. Aunque el adenovirus puede tener estas, y otras deficiencias (por ejemplo, uno o más genes tardíos (L1 -L5), IVa2, etc.), para facilitar la duplicación del ADN y el empaque de los genomas recombinantes en cápsidos adenovirales que están madurando, preferentemente ya sea por lo menos la terminal viral invertida se repite y algunos de los promotores o por lo menos la terminal viral invertida se repite y la señal de empaque queda intacta. Como se mencionó anteriormente, ia mutación de la deficiencia puede incluir la inserción de, incluyendo el reemplazo de las secuencias nativas, por ADN extraño (por ejemplo, ADN que no sea ADN nativo para un serotipo determinado), el cual puede ser un gen extraño. Dicho gen extraño puede estar bajo el control de un promotor adenoviral nativo. Por ejemplo, la inserción de un gen extraño en la región E2A es facilitada por la introducción de un sitio único de restricción, de modo que el producto del gen extraño puede ser expresado a partir del promotor E2A. Por el contrario, el gen extraño puede ser colocado bajo el control de un promotor no nativo. En este aspecto, cualquier promotor no nativo puede ser empleado para generar la expresión de un cassette de transcripción no nativo. Los ejemplos de los promotores adecuados incluyen promotores procarióticos o promotores virales (por ejemplo, elementos de repetición retroviral de la terminal intermedia (ITRs), repetidores virales de terminal larga (LTRs); promotores tempranos virales inmediatos, tales como los promotres IE de virus del herpes, o promotores IE del citomegalovirus (CMV); y otros promotores virales, tales como el Virus del Sarcoma Rous (RV), o promotores del Virus de fe la Leucemia Murina (MLV)). Otros promotores adecuados son los 5 promotores eucarióticos, tales como los promotores consecutivamente activos (por ejemplo, promotores de ß-actin), promotores específicos de señal (por ejemplo, promotores, inducibles y/o represibles, tales como promotores que responden al factor de necrosis de tumor, RU-486, Metalotionina, rec), y IfO promotores de tejido específico (por ejemplo, aquellos activos en el tejido de la epidermis, tejido dérmico, tejido de los órganos digestivos (por ejemplo,, las células del esófago, estómago, intestino, colon, etc., o sus glándulas relacionadas), músculos lisos, tales como los músculos lisos vasculares, músculos cardíacos, 15 músculos del esqueleto, tejido del pulmón, hepatocitos, linfocitos (por ejemplo, células T, células B, células Nk, etc), células del endotelio, esclerocitos, células del riñon, células glandulares (por ejemplo, aquellas del timo, ovarios, testículos, páncreas, adrenales, pituitaria, etc)., células de tumores, células en el tejido conectivo, 20 células en el sistema nervioso central (por ejemplo, neuronas, neuralgia, etc), células en el sistema nervioso periférico, y otras células de interés), Además de la deficiencia anteriormente mencionada en por lo menos la región E1 , el adenovirus recombinante también tiene una 25 mutación en el MLP. La mutación en el MLP puede estar en cualquiera de los elementos de control del MLP (explicados anteriormente) de modo que altera la capacidad de respuesta del promotor. Preferentemente, la mutación hace que el MLP sea menos activo dentro de una célula que no sea una célula de empaque. Debido a que muchos de los elementos de control del MLP son redundantes, por lo menos en la presencia de los productos del gen E1 A (por ejemplo, las funciones promotoras a pesar de la mutación del elemento), de una manera deseable, la mutación del MLP implica más de uno de los elementos de control del MLP. Por ejemplo, aunque la ablación de cualquiera de los elementos de la caja INR y la caja TATA solos no alteran de manera apreciable la actividad del MLP, la mutación de ambas cajas INR y TATA no amortigua la proliferación viral. De un modo similar, los virus que tienen crecimiento alterado de las cajas CAAT con cinéticas normales; sin embargo, los mutantes dobles, mutantes CAAT-TATA crecen desiguales. De este modo, la mutación en el MLP implica de manera deseable por lo menos dos de los elementos del MLP. Preferentemente, con el objeto de atenuar más el promotor, la mutación implica tres o hasta más de los elementos del MLP (por ejemplo, cuatro o más de los elementos MLP), y la mutación puede implicar hasta cinco o, sin duda, todos los elementos dei MLP. Algunas mutaciones del MLP (por ejemplo, ciertas mutaciones de la caja CAAT), atenúan al promotor pero no tienen un efecto apreciable en la proliferación viral. Un adenovirus con E1 deficiente que tiene dicha mutación es un adenovirus recombinante adecuado de la presente invención. En las células de empaque (por ejemplo, aquellas que suministran los productos del gen E1 ), la mutación del MLP no inhibe el crecimiento viral. Sin embargo, la mutación en el MLP atenúa de manera efectiva el crecimiento de dichos viruses en las células no complementarias más allá, de los visto en los vectores adenovirales de la "primera generación" que carecen solamente de los productos del gen E1. En otras modalidades, la mutación el MLP reduce severamente el crecimiento viral reduciendo grandemente la actividad del MLP (por ejemplo, mutaciones CAAT-UPE). Dichos viruses pueden ser propagados en las células de empaque tales como las descritas en la presente descripción (por ejemplo, una línea celular que expresa el E1 y los productos del Gen L1-L5). Todavía otra mutaciones del MLP reducen el crecimiento viral solamente en las células no complementarias alterando la capacidad de respuesta del MLP. Por ejemplo, el MLP puede ser mutado para responder a los factores de transcripción presentes dentro de las células de empaque pero que no están presentes dentro de las células objetivo. A la luz de esto, la mutaciones ya sea en la caja TATA de modo que falla para enlazar la proteína de enlace TATA del tipo natural (TBP) (Wobbe y asociados, Mol. Cell. Biol. 10, páginas 3859 a 3867 (1990)) o en una secuencia ascendente de modo que falla en el enlace de la proteína USF, pero no altera el crecimiento de los viruses resultantes (Reach y asociados, 1990, supra; Reach y asociados, 1991 , supra). Sin embargo, como se mencionó anteriormente, cuando ambas de estas mutaciones están presentes, el amortiguamiento del efecto del crecimiento en el virus es letal (Reach y asociados, supra). La letalidad de esta combinación se superado en las células de empaque que expresan una forma mutante del TBP que reconoce la secuencia mutante (Bryant y asociados, Genes Dev., 10, páginas 2491 a 2501 (1996); Tansey y asociados, Science, 175, páginas 829 a 831 (1997); consultar también Burley, Nature, 381 , páginas 112 a 113 (1996)). De este modo, el adenovirus recombinante de la presente invención puede tener una mutación que produce el MLP que responde a dicho TBP alterado. En otras modalidades, la mutación en el MLP coloca al MTLU bajo el control de un promotor exógeno. Para evitar la expresión del MTLU en una célula huésped, el promotor exógeno, de una manera deseable, no es un promotor activo constitutivamente. De este modo, el promotor exógeno es preferentemente, un promotor que se puede inducir o un promotor específico de tejido. En los casos en los que el promotor es un promotor específico de tejido, éste preferentemente no es activo en la célula huésped deseada, mientras que es activo en la célula de empaque. Para maximizar el alcance de los tipos de las células huésped en las cuales puede ser empleado el adenovirus recombinante de la presente invención, más preferentemente, el promotor exógeno es un promotor que se puede inducir. Más preferentemente, la mutación en el MLP no produce el adenovirus recombinante deficiente para el gen pol. Desafortunadamente, la mayoría de los promotores que se pueden inducir son grandes y complejos, y por lo tanto, no es probable que sean introducido con éxito en el genoma adenoviral sin estruir el gen pol. Sin embargo, un promotor que se puede inducir adecuado (y específico del tipo de célula) es el elemento de respuesta del NF-AT1. Este promotor tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, y la introducción del mismo en el genoma adenoviral da como resultado un producto mutante del gen pol, pero la mutación no es tan severa como para hacer inoperable a la polimerasa. El elemento de respuesta NF-AT1 generalmente responde al factor presente solamente en las células T. Dentro de las células T, el factor está presente dentro del citoplasma a menos que sea inducido para ser transportado al núcleo, en donde enlaza al elemento de respuesta de 30 nucleótidos para activar la transcripción (ver Loh y asociados, J. Biol. Chem. 271 , páginas 10884 a 10891 (1996)). Por lo tanto, en la mayoría de los tipos celulares, el adenovirus recombinante que tiene un elemento exógeno de respuesta NF-AT1 , no expresará los genes L1-L5. Los efectos de las mutaciones del MLP en la actividad del MLP pueden ser evaluados mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, un ensayo de protección de ARNasa puede detectar la actividad relativa del promotor en varios cursos de tiempo. Sin embargo, los resultados de un ensayo de protección de ARNasa no se correlacionan necesariamente con el efecto de una mutación del MLP determinada en el crecimiento viral (ver por ejemplo, Reach y asociados, 1991 , supra). De este modo, además de la actividad del promotor, es ensayado de manera deseable, el efecto de una mutación del MPL determinada en di crecimiento viral. Los métodos para el ensayo del crecimiento adenoviral son bien conocidos en el arte. Como se mencionó anteriormente, los productos de los genes tardíos principales yacen en la cadena de cromosomas directamente opuestos a la secuencia de codificación pol. Por lo que, cualquier ensayo para el crecimiento viral, debe incluir, como un control, células que expresan el gen ?<?/adenoviral para diseccionar el efecto del MLP mutado en el crecimiento viral de cualquier efecto de una alteración del gen pol. Aunque la mutación altera la actividad del MLP, preferentemente, la mutación no da como resultado una deficiencia en el gen pol, la cual como se mencionó anteriormente, yace en la cadena de cromosomas directamente opuesta al MLP. Esto se prefiere, con el fin de evitar el uso de líneas celulares que complementan el gen pol, ya que dichas líneas celulares pueden dar como resultado la producción de RCAs. Por supuesto, las mutaciones de adiciones o retiros en los elementos MLP no deben introducir mutaciones de cambio de estructura en la secuencia de codificación pol. Se pueden hacer muchas mutaciones de los elementos del MLP sin alterar la secuencia pol de aminoácidos. Otras mutaciones que agregan o retiran uno o unos cuantos aminoácidos de la secuencia poíno dan como resultado deficiencias (ver, por ejemplo, Reach y asociados, 1990, supra; Reach y asociados, supra, 1991 , Lu y asociados, 1997 supra).

Indudablemente, aún si el producto pol es algo dañado por una mutación, el virus no obstante, puede ser viable, ya que el producto poise necesita solamente como catalizador (por ejemplo, cantidades relativamente bajas), contrario a los niveles estequiométricos. Un ensayo conveniente para evaluar si una mutación determinada da como resultado una deficiencia en el gen pol, es evaluar si el producto del gen pol debe ser complementado para que crezca el virus, por ejemplo usando líneas celulares, tales como aquellas descritas en el presente documento. El adenovirus recombinante de la presente invención puede ser producido mediante cualquier método adecuado, muchos de los cuales son conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Berkner y asociados, Nucí. Acids, Res., 12 páginas 925 a 941 (1984); Berkner y asociados., Nucí, Acids Res., 11 , páginas 6003 a 6020 (1983); Brough y asociados, Virol., 190, páginas 624 a 634 (1992). Sin embargo, un método típico para producir adenoviruses recombinantes, es emplear la recombinación homologa dentro de la célula huésped adecuada. En este método, se genera primero mediante técnicas estándar biológicas moleculares un cassette que tiene un gen o región adenoviral con la mutación deseada (por ejemplo, dentro del MLP). Este ADN alterado es clonado en un plásmido mucho más grande que contiene una porción grande (por ejemplo, hasta aproximadamente una mitad) del genoma del adenovirus. El paso siguiente es transfectar el ADN plásmido (que contiene el retiro o modificación) y otro ADN que contiene el resto del genoma adenoviral dentro de la célula receptora. Generalmente el adenovirus recombinante de la presente fe invención, es más útil cuando se puede suministrar lo suficiente del 5 virus a una población de células huésped, para asegurar que las células sean confrontadas con un cierto número de viruses. Por lo tanto la presente invención proporciona una existencia de adenovirus recombinante preferentemente una existencia libre de RCA de adenovirus recombinante. La preparación y análisis de NO adenovirus es bien conocida en el arte. Las existencias virales varían considerablemente, dependiendo en gran medida del genotipo viral y del protocolo y líneas celulares utilizadas para prepararlas. Las existencias virales de la presente invención, pueden tener una titulación de por lo menos aproximadamente 107 pfu (tal como 15 aproximadamente 108 pfu), y muchas de dichas existencias pueden tener titulaciones superiores, tales como por lo menos i aproximadamente 109 pfu o aún por lo menos aproximadamente 1011 pfu (por ejemplo, aproximadamente 1012 pfu). Dependiendo de la naturaleza del virus recombinante y de la línea celular de empaque, 20 es posible que la existencia viral de la presente invención pueda tener una titulación aún de aproximadamente 1013 pfu o superior. Preferentemente, un material viral de la presente invención se compone de por lo menos el 90% de desde uno hasta aproximadamente cuatro vectores virales. Esto es, que las 25 existencias virales de la presente invención están substancialmente libres de viruses contaminantes, sin tomar en cuenta la competencia de replica del virus contaminante. Tal como se mencionó anteriormente, los adenoviruses recombinantes de la presente invención pueden ser utilizados para estudiar la reproducción del gen viral. De manera alternativa, tal como se mencionó anteriormente, el adenovirus recombinante de la presente invención puede tener genes no-nativos; por lo tanto son útiles vectores de expresión. En cualquier aplicación, el virus (o existencia viral), es transferido a la célula objetivo deseada (por ejemplo, célula huésped) bajo condiciones apropiadas para que el virus infecte en forma productiva la célula. En donde se sabe de la titulación de una existencia viral, se puede suministra una cantidad predeterminada de virus a la célula objetivo deseada (por ejemplo un m.o.i. deseado). Para el suministro a una célula deseada, se puede incorporar un adenovirus recombinante (o existencia viral) de la presente invención en un transportador adecuado. Por lo tanto la presente invención proporciona una composición que comprende un adenovirus recombinante de la presente invención y un transportador adecuado. En donde la célula huésped está dentro de un animal, el transportador preferentemente es un transportador farmacológicamente aceptable para minimizar los efectos nocivos dei protocolo en la célula huésped. Cualquier preparación adecuada está dentro del alcance la presente invención; por supuesto, la formulación exacta depende de la naturaleza de la aplicación deseada (por ejemplo, tipo de célula objetivo, modo de administración, etc.), y está dentro del alcance de los expertos en el arte. Por lo tanto, está disponible una amplia variedad de formulaciones disponibles para utilizarse en el contexto de la presente invención, de las cuales muchos tipos se describen en cualquier otra parte de la misma, por ejemplo en la solicitud internacional publicada WO 95/34671. De manera deseable, se emplea una línea celular de empaque para propagar el adenovirus recombinante de la presente invención, así como para reproducir las existencia virales de la misma. Muchas líneas celulares que tienen la capacidad de complementar los productos del gen E1 adenovirales esenciales se conocen en el arte (por ejemplo, células HEK-293, células A594, células Per.Cß, etc.), y cualquiera de estas líneas son adecuadas para preparar viruses de la presente invención, no deficientes esenciales diferentes a los genes E1. De manera adicional, para variar la especificidad de algunas mutaciones del MLP, tal como el opuesto al gen pol, se puede emplear una línea celular de complementación E?Ipol dichas líneas celulares se conocen en el arte (Almafitano y asociados, 1996, supra). Aunque las mutaciones en el MLP preferentemente no perjudican de manera significativa el gen pol, dichas líneas celulares pueden ser utilizadas para propagar viruses recombinantes en los cuales se perjudica el gen pol. La presente invención, proporciona líneas celulares de complementación para propagar adenoviruses que requieren factores diferentes a los productos del gen E1.

Las líneas celulares de la presente invención, complementan todas la funciones esenciales a las que les falta el adenovirus recombinante de interés (por ejemplo, genes dentro de la región E1 , así como cualesquiera otros genes adenovirales esenciales tales como, los genes descritos en la presente invención). Dichas células se general utilizando técnicas biológicas moleculares estándar, por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente internacional publicada WO95/34671. Preferentemente, las líneas celulares contienen múltiples genes de complementación en un modo de no-traslape, lo cual reduce o elimina substancialmente la posibilidad de la recombinación del genoma viral con el ADN celular para producir RCAs. La línea celular de complementación expresa de manera deseable los productos del gen de complementación en un nivel apropiado para generar una alta existencia de titulación del adenovirus recombinante. Por ejemplo, el producto E2A de DBP, debe ser expresado en niveles estoiquimétricos (por ejemplo, en niveles relativamente altos), para la replica de ADN adenoviral, mientras que otros productos del gen son necesarios únicamente en niveles catalíticos (por ejemplo, niveles relativamente bajos). Además, la expresión temporal de producto es deseablemente consistente con la observada en la infección normal de una célula. Por ejemplo, los componentes necesarios para la replica de ADN viral deben ser expresados antes de que sean necesarios para el ensamble virion. Para minimizar o evitar la toxicidad celular procedente de la presencia de los productos virales, para regular la expresión temporal de los productos, se utilizan de manera deseable sistemas promotores inducibles. Por ejemplo, se puede utilizar el sistema promotor fe inducible de metaliotonina de oveja para expresar la región E4 5 completa, la estructura 6 de lectura abierta de la región E4, y/o la región E2. Otros ejemplos de sistemas promotores inducibles adecuados, incluyen, pero no se limitan a, operón lac bacterial, el operón de tetraciclina, el sistema de polimeraza T7, y combinaciones y construcciones quiméricas de factores de transcripción HO eucariótico y procariótico, represores, y otros componente. Cuando el producto viral que será expresado es altamente tóxico, un sistema inducible bipartito en donde el inductor es transportado en un vector viral y el producto inducible es llevado dentro del cromatín de la línea celular de complementación, controla adicionalmente la expresión. 15 Las líneas celulares de la presente invención, pueden expresar uno o más factores (por ejemplo, factores de transcripción) que , enlazan el MLP. La línea celular puede ser construida para producir proteínas DEF-A DEF-B o factores que enlazan un MLP modificado, tal como se mencionó anteriormente. Por ejemplo, cuando el MLP tiene 20 una caja TATA alterada, la línea celular puede expresar una forma mutante de TBP ( por ejemplo, TBPm3e) que reconoce la secuencia TATA mutante (Bryan y asociados, supra., Tensey y asociados., supra; Burley, Nature, supra). De manera similar las células pueden ser construidas para expresar el gen NF-AT1 para propagar 25 adenoviruses recombinantes que tienen el elemento de respuesta NF-AT1. Las líneas celulares utilizadas para propagar adenoviruses con deficiencia de E1 (por ejemplo, células HEK-293, células A549 células Per.Cß etc.), no expresan ya sea el gen TBPm3e o NF-AT1. Sin embargo, las secuencias de estos genes son conocidas, y el cADN está disponible (Bryan y asociados., supra Tansey y asociados., supra; Burley, Nature, supra; Loh y asociados supra; van Beveren y asociados., supra). Por lo tanto de cADN puede ser construido en un vector apropiado (por ejemplo, que contenga un marcador seleccionable), como para introducción en una línea celular complementada por E1 adecuado. Dicha línea celular tiene la capacidad de propagar un adenovirus que tiene un elemento de respuesta exógeno enlazado en forma operable al MTLU. Otra línea celular de la presente invención, expresa los productos E1A y también los productos del gen L1-L5. Dicha línea celular es útil para propagar adenoviruses recombinantes de la presente invención, que tienen una mutación en el MLP que recorta en forma severa el crecimiento viral reduciendo en gran parte la actividad del MLP. Preferentemente, las regiones de codificación de ADN L1-L5 dentro de las cuales las líneas de empaque están enlazadas a un promotor (o promotores, si los genes están dentro de cassettes separados), diferentes a un promotor MLP. El uso de dichos promotores no-MLP para conducir productos del gen L1-Ld complementarios, minimiza la probabilidad de eventos de recombinación que ocurrirán entre el genoma viral y el ADN complementarios. Además el uso de dichos promotores no-MLP minimiza el riesgo de que cualesquiera de dicha combinación pueda resultar en un virus viable debido a que dichas secuencias de ADN, si son recombinadas en el genoma viral, convertirían de igual manera cualquier virus resultante deficiente para el producto del gen. Todas las referencias mencionadas en la presente invención, incluyendo patente, solicitudes de patente y publicaciones están incorporadas a la misma en su totalidad como referencia. Aunque la presente invención ha sido escrita con un énfasis en las modalidades preferidas, será obvio para los expertos en el arte que se pueden utilizar variaciones en las modalidades preferidas, y que se pretende que la presente invención pueda ser practicada en forma diferente a la descrita de manera específica en la misma. Por lo tanto, la presente invención incluye todas las modificaciones comprendidas dentro del espíritu y alcance de la misma, tal como se define a través de las Reivindicaciones siguiente.

Lista de Secuencias <110> Genevec, Inc. Brough, Douglas E. Kovesdi, Irme <120> Adenovirus Recombinante <130> 201337 <140> WO <141> 1999-06-24 <150> US 09-105,515 <151> 1998-06-26 <160> 4 atente, int. Ver 2.0 <211> 15 <212> ADN <213> Desconocido <400> 1 tcctactct cttcc <210> 2 <211> 12 15 <212> ADN <213> Desconocido <400> 2 ggccacgtga ce • <210> 3 <211> 11 <212> ADN <213> Desconocido 20 <400> 3 ttgtcagttt c <210> 4 <211> 15 <212> ADN <213> Desconocido <400> 4 aacgaggagg attga 25

Claims (19)

R E I V I N D I C A C I O N E S Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto, reclamamos como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES:

1.- Un adenovirus recombinante que comprende un genoma con una deficiencia en la región E1 y una mutación en el MLP, de modo que MLP es menos activo dentro de una célula diferente a una célula de empaque.

2,. El adenovirus recombinante tal como se describe en la Reivindicación 1 caracterizado además porque, dicho genoma comprende adicionalmente una deficiencia en la región 3.

3.- El adenovirus recombinante tal como se describe en la Reivindicación 1 ó 2 caracterizado además porque, dicho genoma comprende adicionalmente un gen que codifica una polimeraza de ADN adenoviral funcional.

4.- El adenovirus recombinante tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado además porque, dicha mutación en el MLP está dentro de un elemento de control de dicho MLP, seleccionado del grupo de elementos de control que consisten de la caja CAAT, la UPE, la caja TATA, DE1 , y DE2 invertidos.

5.- El adenovirus recombinante tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado además porque, dicha mutación convierte al MLP responsable de un TBP alterado.

6.- El adenovirus recombinante tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizado además porque, además porque dicha mutación en el MLP coloca el MTLU bajo el control de un promotor inducible exógeno.

7.- El adenovirus recombinante tal y como se describe en la Reivindicación 6, caracterizado además porque, dicho promotor exógeno es la secuencia de respuesta NF-AT1.

8.- El adenovirus recombinante tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 7, caracterizado además porque, dicho genoma comprende una pluralidad de mutaciones en el MLP.

9.- El adenovirus recombinante tal y como se describe en la Reivindicación 8, caracterizado además porque, cada una de dichas mutaciones en el MLP, está dentro de un elemento de control de dicho MLP seleccionado del grupo de elementos de control que consiste de la caja CAAT, el UPE, la caja TATA, DE1 y DE2.

10.- El adenovirus recombinante tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 9, caracterizado además porque, comprende adicionalmente un gen no-nativo. •

11.- Un material de existencia que comprende el adenovirus recombinante en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 10.

K0 12.- El material de existencia tal y como se describe en la Reivindicación 11 , caracterizado además porque, está substancialmente libre de RCAs.

13.- El material de existencia tal y como se describe en 15 la Reivindicación 11 , caracterizado además porque, tiene una titulación de por lo menos 107 pfu.

14.- Una composición que comprende el adenovirus recombinante tal y como se describe en cualesquiera de las 20 Reivindicaciones de la 1 a la 10, y un transportador farmacológicamente aceptable.

15.- Una línea celular recombinante, la cual produce productos de gen E1 y DEF-A ó DEF-B adenoviral. 25

16.- Una línea celular recombinante, la cual se duplica el adenovirus recombinante tal y como se describe en la Reivindicación 1.

17.- La línea celular tal y como se describe en la Reivindicación 16, caracterizada además porque, expresa los productos del gen E1 adenoviral y una forma mutante del TBP, que reconoce una secuencia TATA mutante de dicho adenovirus recombinante.

18.- La línea celular tal y como se describe en la Reivindicación 16, caracterizada además porque, expresa productos del gen E1 adenoviral y el gen NF-AT1.

19.- La línea celular tal y como se describe en la Reivindicación 16, caracterizada además porque, expresa productos del gen E1 y uno o más L1-L5 adenovirales.