MX2013003481A

MX2013003481A - Polipeptidos manipuladores que tienen duracion de accion incrementada.

Info

Publication number: MX2013003481A
Application number: MX2013003481A
Authority: MX
Inventors: David C Litzinger; Soumitra S Ghosh; Mary Erickson; Zijian Guo
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals Llc
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2011-09-28
Publication date: 2013-10-25
Also published as: US20140107019A1; HK1225307A1; CN103370083A; CA2812951A1; JP2013545724A; MX345245B; CN106986940A; EP3028720A1; BR112013007442A2; WO2012050923A3; WO2012050923A2; CN103370083B; EP2621538B1; JP6121330B2; EA201390450A1; HK1188710A1; US9593154B2; ES2563091T3; EP2621538A2; US20170114114A1

Abstract

Se proporcionan compuestos que tienen entre otras cosas buena duración de acción, alta potencia y/o regímenes de dosificación convenientes, incluyendo la administración oral. Los compuestos son polipéptidos manipulados que incorporan un dominio de unión a albúmina en combinación con uno o más polipéptidos biológicamente activos. También se proporcionan composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento de enfermedades y trastornos que incluyen obesidad y sobrepeso, diabetes, dislipidemia, hiperlipidemia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de hígado graso, síndrome del intestino corto, mal de Parkinson, enfermedad cardiovascular, y otros trastornos del sistema nervioso central.

Description

POLIPEPTIDOS MANIPULADOS QUE TIENEN DURACION DE ACCION INCREMENTADA Campo de la Invención La presente solicitud se refiere a compuestos que tienen buena duración de acción, alta potencia y/o regímenes de dosificación convenientes incluyendo administración oral, y a un método para uso de los mismos. En la presente se proporcionan polipéptidos manipulados que incorporan un dominio de unión a albúmina en combinación con un péptido biológicamente activo. Sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que debido a que los polipéptidos manipulados descritos a la presente podrían unirse a albúmina, los compuestos pueden ser secuestrados (por ejemplo, unidos a albúmina) mientras están en la circulación, llevando a duración de acción incrementada, debido por ejemplo a depuración renal y/o degradación reducidas. Las enfermedades que pueden ser tratadas de esta manera incluyen obesidad y sobrepeso, diabetes, dislipidemia, hiperlipidemia, síndrome del intestino corto, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de hígado graso, mal de Parkinson, enfermedad cardiovascular y otros trastornos del sistema nervioso central, o combinaciones de los mismos.

Antecedentes de la Invención Sigue habiendo la necesidad por desarrollar REF.: 240203 polipéptidos útiles en las enfermedades metabólicas, afecciones y trastornos descritos arriba. En consecuencia, un objetivo de la presente invención es proporcionar polipéptidos manipulados con vidas medias extendidas útiles para tratar las afecciones anteriores y métodos para producirlos y usarlos.

Cada patente, solicitud de patente y publicación citada en la presente se incorpora aquí por referencia en su totalidad y para todos los propósitos.

Breve descripción de la Invención Se proporcionan compuestos de polipéptidos manipulados que tienen afinidad de unión para albúmina y una utilidad terapéutica adicional. Los compuestos son polipéptidos manipulados que incluyen un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD, por sus siglas en inglés) como el definido a la presente capaz de unirse a albúmina y un polipéptido de dominio de hormona (HD, por sus siglas en inglés) , polipéptidos HD que pueden ser biológicamente activos y pueden provocar una respuesta biológica benéfica, en enlace covalente con el ABD. Cualquiera de los polipéptidos ABD o HD descritos en la presente ' puede ser unido covalentemente en forma opcional en el polipéptido manipulado a través de un enlazador L, por ejemplo Ll como el descrito en la presente. Sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que debido a que los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden unirse a albúmina, los compuestos pueden ser secuestrados en un sujeto llevando a duración de acción incrementada en el sujeto.

En un primer aspecto se proporciona un polipéptido manipulado como el descrito en la presente. El polipéptido manipulado incluye un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) como el descrito en la presente y un dominio de hormona (HD1) . El dominio de hormona incluye un polipéptido que es un exendin, un fragmento de un exendin o un análogo de un exendin.

En otro aspecto, se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto que requiera tratamiento. El método incluye administrar un polipéptido manipulado como el descrito en la presente al sujeto.

En otro aspecto más, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un compuesto de polipéptido manipulado descrito en la presente en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto más se proporcionan polinucleótidos que codifican para el polipéptido manipulado y sus intermedios, vectores de expresión que portan estos polinucleótidos, células hospederas que expresan estos polinucleótidos y medios para su expresión, síntesis, modificación post-traduccional y aislamiento.

Una ventaja de la presente invención es que los polipéptidos manipulados pueden ser sintetizados completamente mediante métodos recombinantes, evitando etapas sintéticas o químicas complejas o adicionales y reactivos y catalizadores reactivos asociados. En consecuencia, los polipéptidos de la presente invención pueden ser mucho menos costosos de sintetizar que los compuestos químicamente derivados de duración de acción prolongada. Además de una larga duración de acción (por ejemplo, al menos una semana en un sujeto humano, aunque una vez al día también puede lograrse si se desea) , una ventaja más es un tamaño relativamente pequeño, el cual puede permitir suministro oral para mejorar la cooperación del paciente.

Los compuestos descritos en la presente demuestran sorprendente eficacia en una prueba OGTT DOA, por sus siglas en inglés (prueba de tolerancia a glucosa oral para duración de acción) de al menos 24 horas y todavía más larga hasta 2 días en ratones, lo cual se traduce en 7 días o más en humanos, un control glucémico robusto y pérdida de peso corporal en ratones obesos diabéticos (ob/ob) , y proporcionan una reducción dependiente de dosis de consumo de alimento durante al menos 2 días en ratones. En ratas normales, la exposición al compuesto dura varios días (incluso tanto como 4 días, lo cual se traduce en por lo menos una vez por semana en humanos) después de dosificación subcutánea e intravenosa. Los compuestos son estables en plasma y a proteasas de plasma, son activos mientras están unidos a albúmina de suero y proporcionan sorprendentemente mayor eficacia máxima in vivo que exendin-4 como se muestra en la presente. Todavía más sorprendentemente los compuestos son adecuados para suministro oral.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1A: Histograma de datos de nivel de glucosa en sangre (BGL, por sus siglas en inglés) antes de alimentación forzada 1 día después de dosis de Comp 15 en prueba OGTT DOA. Glucosa pre-alimentación forzada media de vehículo: 117 mg/dL. Simbología (de izquierda a derecha) : vehículo (abierto) , 2 nmol/kg (diagonal superior j izquierda a derecha inferior) ; 25 nmol/kg (diagonal inferior izquierda a derecha superior); 250 nmol/kg (diagonal fina). Figura IB: Cambio en glucosa en sangre a 30 min. Gl-ucosa pre-alimentación forzada media en vehículo: 117 mg/dL. Simbología: Igual que en la figura 1A. * p<0.5 vsj control de vehículo; A OVA, prueba de Dunnett .

Figura 2A: Histograma de datos de nivel de glucosa en sangre (BGL) antes de alimentación forzada! un día 2 después de dosis de compuesto 15 en prueba OGTT DOA. Glucosa pre-alimentación forzada media en vehículo: ¡135 mg/dL. Simbología (izquierda a derecha) : Vehículo (abierto) , 25 nmol/kg (líneas verticales) ; 250 nmol/kg (líneas diagonales) . i Figura 2B: Cambio en glucosa en sangre a 30 minutjos . Glucosa pre-alimentación · forzada media en vehículo: 135 mg/dL.

Simbología: Igual que en figura 2A. * p<0.5 vs.( control de vehículo; ANOVA, prueba de Dunnett .

Figura 3A: Histograma de datos de nivel de glucosa en sangre (BGL) antes de alimentación forzada 1 día después de dosis de Comp 15 y Comp 8 en prueba OGTT DOA. Glucosa pre-alimentación ' forzada media por vehículo: 117 mg/dL. Simbología (izquierda a derecha) : vehículo (abierto) ; 2 nmol/kg Comp 15 (diagonal izquierda superior ¡ a derecha inferior) ; 25 nmol/kg Comp 15 (diagonal izquierda inferior a i derecha superior) ; 250 nmol/kg Comp 15 (diagonal fina) ; 2 nmol/kg Comp 8 (mosaico) ; 25 nmol/kg Comp 8 (líneas i horizontales) ; 250 nmol/kg Comp 8 (punteado) . Figura 3B: Cambio en glucosa en sangre a 30 minutos. Glucosa pre-alimentación forzada media de vehículo: 117 mg/dL. Simbología: igual que en figura 1A. * p<0.5 vs . · control de vehículo; ANOVA, prueba de Dunnett.

• Figuras 4A-4F: Efecto de Comp 15 ¡ en ratas anestesiadas alimentadas con HSD. Figura 4A: Curso de tiempo de glucosa después de prueba de tolerancia , a glucosa intravenosa (IVGTT). Simbología: Vehículo (triángulo con punta hacia arriba) ; Comp 15 a 240 mol/kg (cuadro) . Figura 4B: Histograma que ilustra glucosa (AUC, 0-60 min) después de IVGTT. Simbología: Vehículo (izquierda); Comp 15 (derecha). Figura 4C: Curso de tiempo de insulina después' de IVGTT.

I Simbología : Como en figura 4A. Figura 4D: Histograma que ilustra cambio en insulina (AUC, 0-30 min) . Simbología: Como en figura 4B. Figura 4E: Curso de tiempo de cambio en peso corporal después de inyección se de Comp 15. Simbología: Como en figura 4A. Figura 4F: Histograma de consumo de alimento diario después de inyección se de Comp 15. Simbología: Para cada día, el histograma ilustra vehículo y Comp 15 (240 nmol/kg) en orden de izquierda a derecha. * p<0.05 vs . control de vehículo; prueba de Dunnett.

Figuras 5A, 5B y 5C: Efecto de Comp 15 en ratones ob/ob. Figura 5A: Curso de tiempo de cambio en peso corporal (0-10 días) después de inyección de Comp 15 a 250 nmol/kg. Simbología: Vehículo (cuadrado) ; Comp 15 (triángulo) . Figura 5B: Curso de tiempo de cambio en glucosa en sangre después de dosis como se describió para figura 5A. Simbología: Como en figura 5A. Figura 5C: Curso de tiempo de cambio en HbAlc después de dosis como se describió para figura 5A. Simbología: Como en figura 5A. * p<0.5 vs . control de vehículo; ANOVA, prueba de Dunnett.

Figuras 6A y 6B: Eféctos de Comp 15 en ratas grasas diabéticas Zucker. Figura 6A: Curso de tiempo de cambio en peso corporal después de tratamiento de ratas grasas diabéticas Zucker con Comp 15. Figura 6B : Curso de tiempo de glucosa en plasma (mg/dL) después de tratamiento con Comp 15. Simbología: Vehículo (cuadro relleno); Comp 15 (0.17 mg/kg) (triángulo con punta hacia arriba); Comp 15 (0.5 mg/kg) (triángulo con punta hacia abajo) .

Figura 7: Comparación en OGTT DOA. Efectos de Cmpds 15, 8 y 10, en comparación con exendin-4, se evaluaron como el cambio en glucosa en sangre a 30 minutos (% pre-alimentación forzada). Simbología: Compuestos en orden de izquierda a derecha de histograma: Vehículo; Comp 15 a 2 nmol/kg; Comp 15 a 25 nmol/kg; Comp 15 a 250 nmol/kg; Comp 8 a 2 nmol/kg; Comp 8 a 25 nmol/kg; Comp 8 a 250 nmol/kg; Comp 10 a 25 nmol/kg; Comp 10 a 250 nmol/kg; exendin-4 a 250 nmol/kg. * p<0.5 vs. control de vehículo; ANOVA, prueba de Dunnett .

Figura 8: Presenta un perfil en tiempo del porcentaje de compuesto restante en plasma humano durante un curso de tiempo de 5 horas. Simbología: Péptido (SEQ ID NO: 4) (cuadro relleno) ; Comp 7 (cuadro vacío) ; Comp 31 (cruz) ; Comp 15 (diamante vacío); GLP-1 (7-36) amida (diamante relleno) .

Figura 9 : Histograma de datos de nivel de glucosa en sangre (BGL) antes de alimentación forzada 1 día después de dosis de Comp 31. Glucosa pre-alimentación forzada media por vehículo: 126 mg/dL. Simbología: Vehículo (vacío), Comp 31 (25 nmol/kg; relleno) . Simbología: Igual que en figura 1A. * p<0.5 vs . control de vehículo; ANOVA, prueba de Dunnett.

Figuras 10A y 10B: Figura 10A demuestra el curso en tiempo del efecto de Comp 31 en inhibir el consumo de alimento en ratones normales sobre 6 horas. Simbología: Vehículo (cuadro) ; Comp 31 a 1 nmol/kg (diamante) ; Comp 31 a 10 nmol/kg (cruz) ; Comp 31 a 30 nmol/kg (círculo) ; Comp 31 a 100 nmol/kg (estrella) . Figura 10B ilustra el histograma de resultados del efecto de Comp 31 en inhibir consumo de alimento en ratones normales durante 54 horas. Simbología (izquierda a derecha para cada periodo de tiempo) : Vehículo (vacío); [14Leu] exendin-4 a 1 nmol/kg (líneas verticulares) ; [14Leu) exendin-4 a 10 nmol/kg (líneas diagonales, izquierda superior a derecha inferior); [1Leu] exendin-4 a 30 nmol/kg (líneas diagonales, izquierda inferior a derecha superior); [14Leu] exendin-4 a 100 nmol/kg (líneas diagonales finas); Comp 31 a 1 nmol/kg (líneas verticales) ; Comp 31 a 10 nmol/kg (puntos claros) ; Comp 31 a 30 nmol/kg (puntos gruesos) ; Comp 31 a 100 nmol/kg (cuadrícula) .

Figuras 11A-11D: Figura 11A (Cmpd 15) y Figura 11B (Cmpd 21) ilustran curso en tiempo de cambios en glucosa en sangre en comparación con liraglutida, todos dados dos veces por semana (BIW) . Simbología (figuras 11A-11B) : vehículo (cuadro); liraglutida a 250 nmol/kg BIW (triángulo rellenos-compuesto de prueba a 25 nmol/kg BIW (triángulo vacío) ; compuesto de prueba a 250 nmol/kg BIW (diamante) . Figura 11C ilustra un histograma que muestra la reducción de HbAlc (% de cambio a partir de línea de base) para Comp 15 y Comp 21 dados dos veces por semana (BIW) , en comparación con exendin-4 dado mediante infusión subcutánea continua (CSI) . Simbología (izquierda a derecha) : vehículo (vacío); Comp 15 a 25 nmol/kg BIW (cuadrícula fina) ; Comp 15 a 250 nmol/kg BIW (punteado) ; Comp 21 a 25 nmol/kg BIW (rayas diagonales) ; Comp 21 a 250 nmol/kg BIW (rayas verticales-horizontales) ; exendin-4 a 7.2 nmol/kg/día CSI (mosaicos oscuros); exendin-4 a 100 nmol/kg/día CSI (mosaicos claros) . Figura 11D ilustra la reducción en peso corporal (% de cambio a partir de línea de base) para Comp 15 y Comp 21 dados dos veces por semana (BIW) , en comparación con exendin-4 dado por infusión subcutánea continua (CSI, por sus siglas en inglés) . Simbología (izquierda a derecha) : como en figura 11C.

Figuras 12A, 12B y 12C: Las figuras 12A-12C ilustran el perfil farmacocinético (PK) y actividad biológica de polipéptidos manipulados ejemplares Comp 15 y Comp 21 dosificados subcutáneamente en ratas Harían Sprague-Dawley (HSD) normales. Figura 12A ilustra el efecto de los compuestos para reducir consumo de alimento. Figura 12B ilustra el efecto de compuestos para reducir peso corporal. Figura 12C ilustra un perfil PK de los compuestos después de una sola dosis. Simbología: Vehículo (cuadro); Comp 21 (triángulo) ; Comp 15 (diamante) .

Figuras 13A, 13B y 13C: Las figuras 13A-13C ilustran el perfil farmacocinético (PK) y actividad biológica de un polipéptido manipulado ejemplar Comp 31 en , comparación con análogo de exendin no conjugado dosificado intravenosamente en ratas Harían Sprague-Dawley (HSD) normales. Figura 13A ilustra el efecto de los compuestos para reducir consumo de alimento. Figura 13B ilustra el efecto de los compuestos para reducir peso corporal. Figura 13C ilustra un perfil PK de los compuestos después de una sola dosis. Inserto: Tabulación de tiempo contra resultados , PK (pg/mL) para [1Leu] exendin-4 a 2 nmol/kg IV y Comp 31 a 2 nmol/kg IV. Simbología: Vehículo (diamante); [14Leu] exendin-4 a 2 nmol/kg IV (cuadro) ; Comp 31 a 2 nmol/kg IV (círculo) .

Figura 14: Esta figura ilustra un curso de tiempo de actividad biológica de un ejemplo de polipéptido manipulado (Cmpd 15) en comparación con análogo de exendin no conjugado a glucosa en sangre inferior después de suministro oral. Véase ejemplo 18. Glucosa pre-tratamiento media: -623 mg/dL. Simbología: Vehículo (cuadro relleno); análogo de exendin-4 (cuadro vacío) ; Comp 15 (diamante) .

Descripción detallada de la invención I. Definiciones "Obesidad" y "sobrepeso" se refieren a mamíferos i que tienen un peso mayor que el esperado normalmente, y se puede determinar mediante, por ejemplo, apariencia física, índice de masa corporal (BMI) como se conoce en la técnica, relaciones de circunferencia de cintura a cadera, grosor de I I pliegues de la piel, circunferencia de la cintura y similares. Los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) definen sobrepeso como un humano adulto que tiene un BMI de 25 a 29.9; y definen obeso como un humano adulto que tiene un BMI de 30 o más. Métricas adicionales para la determinación de obesidad existen. Por ejemplo, el CDC indica que una persona con una relación de cintura a cadera mayor que 1.0 tiene sobrepeso.

"Masa corporal magra" se refiere a la masa libre de grasa del cuerpo, es decir, peso corporal total menos peso de grasa corporal es la masa corporal magra. La masa corporal i magra puede medirse mediante métodos tales como pesado hidrostático, cámaras computarizadas , absorciometría de rayos X de energía doble, calibres de piel, formación de imágenes por resonancia magnética (MRI, por. sus siglas en inglés) y análisis de impedancia bioeléctrica (BIA, por sus siglas en inglés) como se conoce en la técnica.

"Mamífero" se refiere a animales de sangre caliente que generalmente tienen pelaje o pelo, que dan nacimiento vivo a su progenie, y que alimentan a su progenie con leche. Los mamíferos incluyen humanos; animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos) ; animales de granja (por ejemplo, vacas, caballos, borregos, cerdos, cabras) ; animales salvajes y similares. En una modalidad, el mamífero es una1 hembra. En una modalidad, el mamífero es un humano hembra. En una modalidad, el mamífero es un gato o perro. En una modalidad, el mamífero es un mamífero diabético, por ejemplo, un humano que tiene diabetes tipo 2. En una modalidad, el mamífero es un mamífero diabético obeso, por ejemplo, un mamífero obeso que tiene diabetes tipo 2. El término "sujeto" en el contexto de métodos descritos en la presente se refiere a un mamífero.

"Fragmento" en el contexto de polipéptidos se refiere en la presente en el sentido químico común a una porción de un polipéptido. Por ejemplo, un fragmento puede ser el resultado de una supresión N-terminal o supresión extermina! de uno o más residuos de un polipéptido de origen, y/o un fragmento puede ser el resultado de la supresión interna de uno o más residuos de un polipéptido de origen. "Fragmento" en el contexto de un anticuerpo se refiere a una porción de un anticuerpo que puede ser enlazada a una molécula biológicamente activa para modular solubilidad, distribución dentro de un sujeto y similares. Por ejemplo, exendin-4 (1-30) describe un fragmento biológicamente activo de exendin-4 en donde la "cola" del C-terminal de. exendin de los aminoácidos 31-39 es eliminada. El término "de origen" en el contexto de polipéptidos se refiere, en el sentido común, a un polipéptido que sirve como una estructura de referencia antes de la modificación, por ejemplo, inserción, supresión y/o sustitución. El término "conjugado" en el contexto de polipéptidos manipulados descritos en la presente se refiere al enlace covalente entre componentes polipéptidos, por ejemplo, HBD, HD1 y similares. El término "fusión" en el contexto de polipéptidos manipulados descritos en la presente se refiere a enlace covalente entre polipéptidos componentes, por ejemplo, ABD, HD1 y similares, por medio ya sea de grupos funcionales tanto amino o carboxi terminales de la estructura de base del péptido. Los polipéptidos manipulados pueden ser hechos en forma sintética o recombinante . Típicamente, se hacen fusiones usando biotecnología recombinante, sin embargo, también se pueden hacer mediante síntesis química y métodos de conjugación.

"Análogo" según se usa en la presente en el contexto de polipéptidos, se refiere a un compuesto que tiene inserciones, supresiones y/o sustituciones de aminoácidos en relación con un compuesto de origen. "Secuencia análoga" según se usa en la presente en el contexto de polipéptidos, se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene inserciones, supresiones y/o sustituciones de aminoácidos con relación a una secuencia de aminoácidos de origen (por ejemplo, secuencia tipo silvestre, secuencia nativa) . Un análogo puede tener superior estabilidad, solubilidad, eficacia, vida media y similares. En algunas modalidades, un análogo es un compuesto que tiene al menos 50%, por ejemplo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, O todavía más, de identidad de secuencia con el compuesto de origen. En una modalidad preferida el análogo tiene de 1 a 5 modificaciones de aminoácido seleccionadas independientemente de cualquiera o una combinación de una inserción, supresión, adición y sustitución. En cualquiera de las modalidades en la presente, el análogo exendin puede tener de 1 a 5 modificaciones de aminoácido seleccionadas independientemente de cualquiera o una combinación de una inserción, supresión, adición y sustitución, y conserva de preferencia al menos 50%, por ejemplo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o todavía más, de identidad de secuencia con el compuesto de origen, y aún más preferiblemente al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o todavía más, de identidad de secuencia con el compuesto de origen, y de preferencia el compuesto de origen es exendin-4, exendin-4 (1-38) , exendin- (1-37) , exendin-4 (1-36) , exendin-4 (1-35) , exendin-4 (1-34) , exendin-4(1-33), exendin-4 (1-32) , exendin-4 (1-31) , exendin-4 (1-30) , exendin- (1-29) . o exendin-4 (1-28) , y muy preferiblemente el compuesto de origen tiene la secuencia de exendin-4. En una modalidad por lo menos los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 de exendin-4 son aquellos como en exendin4 nativa, y además la una a cinco modificaciones son sustituciones de aminoácido conservadoras en posiciones que no son las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 de exendin-4. Por ejemplo, en otra modalidad más de las modalidades de la presente, un análogo de exendin conserva el aminoácido al menos como se encuentra en la posición 3, 4, 6, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 18, 19, 22, 23, 25, 26 y/o 30 de exendin-4, y además preferiblemente tiene no más de 1 a 5 de las posiciones restantes sustituidas con otro aminoácido, muy preferiblemente un aminoácido químicamente conservador. En todos los análogos de la presente, cualquier sustitución o modificación en las posiciones 1 y/o 2 conservará resistencia a corte por DPP-IV mientras conserva o mejora actividad insulinotrópica como se conoce en la técnica para análogos de exendin-4, tales como desamino-histidil-exendin-4. Como es común en la técnica, el término "conservador" en el contexto de sustituciones de aminoácido se refiere a sustitución que mantiene propiedades de tipo carga (por ejemplo, aniónica, catiónica, neutra, polar y similares) , hidrofobicidad o hidrofilicidad, volumen (por ejemplo, contactos de van der Waals y similares), y/o funcionalidad (por ejemplo, hidroxi , amina, sulfhidrilo y similares) . El término "no conservador" se refiere a una sustitución de aminoácido que no es conservadora .

"Identidad", "identidad de secuencia" y similares en el contexto de comparar dos o más ácido nucleicos o secuencias de polipéptidos , se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente 50% de identidad, de preferencia 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o identidad todavía más alta sobre una región especificada, cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o región designada) según se mide usando algoritmos de comparación de secuencias como los conocidos en la técnica, por ejemplo BLAST o BLAST 2.0. Esta definición incluye secuencias que tienen supresiones y/o adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones, así como las variantes polimórficas o alelas de origen natural y variantes hechas por el hombre. En algoritmos preferidos, se toman en cuenta los espacios y similares, como se conoce en la técnica. Para comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, secuencias de prueba y referencia son ingresadas en una computadora, coordenadas subsecuentes son designadas si es necesario, y los parámetros del programa de algoritmo de secuencia son designados. De preferencia, se pueden usar parámetros de programa preestablecidos, o se pueden diseñar parámetros alternativos. i El algoritmo de comparación de secuencias calcula después el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, con base en los parámetros de programa. La alineación óptima de secuencias para comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl . Math. 2:482, por el algoritmo de alineación por homología de Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol.

Biol . 48:443, por la búsqueda para método de similitud de Pearson & Limpman, 1988, Proc . Nat'l. Acad. Sci. E.U.A. 85:2444, por implementaciones computarizadas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en thé Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), o por alineación manual e inspección visual. Véase, por ejemplo, Current Protocole in Molecular Biology (Ausubel et al., eds . 1995 suplemento)) . Ejemplos preferidos de algoritmos que son adecuados para - determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia incluyen los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul et al., 1977, Nucí. Acids. Res. 25:3389-3402 y Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST y BLAT 2.0 se usan, como se conoce en la técnica, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El software para llevar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del sitio web del Centro Nacional para Información de Biotecnología. Este1 algoritmo incluye identificar primero pares de secuencias de alta i I I puntuación (HSPs) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, las cuales ya sea coincidan o satisfagan cierta puntuación umbral de valor positivo T cuando se alineen con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T Se conoce como el umbral de puntuación de palabra adyacente (Altschul et al., Id.). Estos aciertos de palabra adyacente inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largas que los contengan. Los aciertos de palabras son extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para tanto como se puede incrementar la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, por ejemplo, para secuencias de nucleótidos, los parámetros (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de castigo para residuos no coincidentes; siempre <0) . Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: La puntuación de alineación acumulativa cae por debajo de la cantidad X de su valor logrado máximo; la puntuación acumulativa pasa a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o el final de cada secuencia es alcanzado. Los parámetros de algoritmo BLAT W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como omisiones una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como omisiones una longitud de palabra de 3 , y expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, 1989, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras.

El término "aproximadamente" en el contexto de un valor numérico se refiere a +/- 10% del valor numérico.

Los términos "péptido" y "polipéptido" en el contexto de componentes de los polipéptidos manipulados descritos en la presente son sinónimos.

II. Compuestos En un primer aspecto, se proporcionan compuestos de polipéptidos manipulados con secuencia que incluya una secuencia de polipéptidos de dominios de unión a albúmina (ABD) y al menos una secuencia de dominios de hormona de polipéptido (HD1) . Los términos "dominio de unión a albúmina", "ABD" y similares se refieren a polipéptidos capaces de unirse a albúmina como se describe en la presente. Los términos "dominio de hormona", "polipéptido de dominio de hormona" y similares se refieren a un polipéptido agonista de receptor de GP-1 capaz de provocar una respuesta biológica en el sujeto. Ejemplos de dominios de hormona incluyen, pero no están limitados a, un exendin, un fragmento de exendin o un análogo de exendin.

Se encontró sorprendentemente que ün exendin, análogo de exendin o fragmento activo puede fusionarse a un dominio de unión a albúmina (ABD) de muy alta afinidad derivado de los dominios de unión a albúmina de proteína G bacteriana de la cepa G148 de estreptococo, conservando al mismo tiempo suficiente actividad biológica de exendin-4 y teniendo una excelente duración de acción, por ejemplo de al menos 3 días e incluso 5 días en un roedor, lo cual se traduce en una duración de al menos una semana o más en un sujeto humano. "Duración de acción" se refiere en el sentido común a permitir una dosis más infrecuente en un régimen terapéutico. Así, una duración de acción prolongada permitirá programas de dosificación menos frecuentes y/o más convenientes. Esto fue sorprendente en parte debido a que estos péptidos ABD no han demostrado extensamente ser una plataforma robusta como un portador de proteína terapéutico, son relativamente hidrófobos lo cual podría interactuar adversamente con un péptido terapéutico unido, y no fueron capaces de actuar como un portador para al menos una familia de hormonas péptidas. Específicamente, amilina de rata cuando se conjugó o fusionó a los ABDs descritos en la presente no presentó ninguna actividad in vivo significativa o de larga acción en los mismos modelos de roedor en los cuales se encontró que varias construcciones de exendin-ABD eran activas y con larga duración de acción.

Componentes biológicamente activos. Los componentes de compuesto biológicamente activo contemplados para usarse en los compuestos y métodos descritos en la presente incluyen los exendins . Los términos "compuesto biológicamente activo" y similares se refieren en sentido común a compuestos, por ejemplo, polipéptidos y similares, que pueden provocar una respuesta biológica.

Exendins. Los exendins son péptidos que se encuentran en las secreciones salivales del monstruo de Gila y el lagarto barbado mexicano, reptiles que son endémicos de Arizona y el Norte de México. Exendin-3 está presente en las secreciones salivales de Heloderma horridu (lagarto barbado mexicano) , y exendin-4 está presente en las secreciones salivales de Heloderma suspectum (monstruo de Gila) . Véase Eng et al., 1990, J. Biol . Chem. , 265: 20259-62; Eng et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:7402-7405. Las secuencias de exendin-3 y exendin-4, respectivamente, son las siguientes: HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIE LKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO: 1) ; HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIE LKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO: 2) .

Hargrove et al (Regulatory Peptides, 2007, 141:113-119) reportaron un análogo de péptido de exendin-4 que es un análogo de péptido de exendiri-4 amidado C-terminalmente de longitud completa con una sola diferencia de nucleótido en la posición 14 en comparación con exendin-4 nativo. La secuencia de [14Leu] exendin-4 es la siguiente: HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO: 3) . Otro análogo de péptido de exendin-4 es una quimera de los primeros 32 aminoácidos de exendin-4 que tiene sustituciones i de aminoácido en las posiciones 14 y 28 seguidas por una secuencia de 5 aminoácidos desde el C-terminal de 'una GLPl no de mamífero (rana): [Leu14, Gln28] Exendin-4 (l-32),-fGLP-l (33-37) . Este compuesto tiene la siguiente secuencia: HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIE LKQGGPSKEIIS (SEQ ID No: 4 ) . También se conocen en la técnica las formas biológicamente activas truncadas en el C-terminal de exendin-4, tales como exendin-4(1-28), exendin-4 (1-29) , exendin-4 (1-30) , exendin-4 (1-31) , exendin-4 (1-32) y sus formas amidadas. Todos estos análogos de exendin son adecuados como componentes de los polipéptidos 1 manipulados de la presente invención. Como es común en la técnica, los corchetes (es decir, "[]") en un nombre de compuesto peptídico indica sustitución del residuo o característica química dentro de los corchetes. Por ejemplo, [14Leu] Exendin-4 , [14Leu]Ex4, y similares se refieren a exendin-4 que tiene leucina en la posición 14. La posición numérica de un aminoácido puede indicarse por números previos o posteriores en una variedad de maneras , empleados rutinariamente en la técnica. Por ejemplo, los términos 14Leu, Leul4, 14Leu, Leu14 y similares, son sinónimos al referirse a leucina en la posición 14.

Se entiende que en algunas modalidades Una amida C-terminal, u otra porción de tapado C-terminal puede estar presente en los compuestos descritos aquí .

Aunque los exendins tienen cierta similitud de secuencia con varios miembros de la familia de péptidos tipo glucagón, con la homología más alta, 53%, siendo a GLP-1 (7- i 36)NH2 (Goke et al., 1993, J. Biol . Chem. , 268:19650-55) [secuencia de GLP-1 (7-37)NH2; HAEGTFTSDVSSYLEGQAA EFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 5), conocida también algunas veces como "GLP-1") que tiene un efecto insulinotrópico en estimular la secreción de insulina de células beta pancreáticas, los exendins no son I homólogos de GLP-1.

Estudios farmacológicos han llevado a reportes de i que exendin-4 puede actuar en receptores de GLP-1 in vitro en ciertas células secretoras de insulina, sin embargo, también se ha reportado que exendin-4 puede actuar en receptores en los que no actúa GLP-1. Además, exendin-4 comparte ciertas pero no todas las propiedades biológicas in vivo con GLP-1, y tiene una duración de acción significativamente más larga que GLP-1. Con base en sus actividades insulinotrópicas , el uso de exendin-3 y exendin-4 para el tratamiento de diabetes mellitus y la prevención de hiperglucemia ha sido propuesto (Eng, patente de E.U.A. No. 5,424,286, incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos) , y de hecho, exendin-4 ha sido aprobado en los Estados Unidos y en Europa para usarse como un terapéutico para tratar diabetes tipo 2.

De hecho, se cree que los exendins no son el homólogo de especie de GLP-1 de mamífero como se había reportado por Chen y Drucker quienes clonaron al gen exendin del monstruo de Gila (J. Biol. Chem. 272:4108-15 (1997)). La observación de que el monstruo de Gila tiene también genes separados para pro-glucagones (de los cuales se procesa GLP-1) , que son más similares a pro-glucagón de mamífero que exendin, indicó que exendins no son simplemente homólogos de especie de GLP-1.

Los métodos para regular la motilidad gastrointestinal usando agonistas de exendin se describen en la patente de E.U.A. NO. 6,858,576 (es decir, a base de la solicitud de E.U.A. No. de serie 08/694,954 presentada el 8 de agosto de 1997, la cual es una continuación en parte de la solicitud de E.U.A. NO. de serie 08/694,954 presentada el 8 de agosto de 1996) . Los métodos para reducir el consumo de alimento usando agonistas de exendin se describen en la patente de E.U.A. No. 6,956,026 (es decir, basada en la solicitud de E.U.A. NO. de serie 09/003,869, presentada el 7 de enero de 1998, la cual reclama en beneficio de las solicitudes de E.U.A. Nos. 60/034,905 presentada el 7 de enero de 1997, 60/055,404 presentada el 7 de agosto de 1997, 60/065,442 presentada el 14 de noviembre de 1997, y 60/066,029 presentada el 14 de noviembre de 1997.

Secuencias de compuestos agonistas de exendin novedosas útiles en los polipéptidos manipulados descritos en la presente se describen en WO 99/07404 (es decir, PCT/US98/16387 presentada el 6 de agosto de 1998) , en WO 99/25727 (es decir, PCT/US98/24210 , presentada el 13 de noviembre de 1998) , en WO 99/25728 (es decir, PCT/US98/24273 , presentada el 13 de noviembre de 1998) , en WO 99/40788, en WO 00/41546 y en WO 00/41548, las cuales se incorporan en la presente por referencia y para todos los propósitos junto con sus contrapartes de patente estadounidense concedidas. Los métodos para ensayar actividades de exendin in vi tro e in vivo, como se conoce en la técnica, incluyendo actividad insulinotrópica, de inhibición de consumo de alimento y actividad de pérdida de peso, se describen aquí y también en referencias anteriores y otras referencias mencionadas en la presente .

Ciertos ejemplos de exendins, agonistas de exendins y agonistas de análogos de exendin incluyen: fragmentos de exendin-4 (1-30) (His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly); exendin-4 (1-28) , exendin-4 (1-29) , exendin-4(1-30), exendin-4 (1-31) y exendin-4 (1-32 ) . Los análogos incluyen sustitución en la posición 14Met (es decir, 14Met) con un aminoácido no oxidante tal como leucina. Ejemplos incluyen [1Leu] exendin-4 , [14Leu] exendin-4 (1-30) , [1Leu] exendin-4 (1-28) y [14Leu, 25Phe] exendin-4.

Los agonistas de análogos de exendin para usarse en los polipéptidos manipulados descritos en la presente incluyen aquellos descritos en la patente de E.U.A. NO. 7,223,725 (incorporada en la presente por referencia y para todos los propósitos), tales como compuestos de la fórmula: Xaax Xaa2 Xaa3 Gly Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaag Xaai0 Xaan Xaai2 X a^3 Xa Xaais Xa i6 X ai7 Ala Xaai9 Xaa2o Xaa2i Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28-Zi; en donde Xaai es His, Arg o Tyr; Xaa2 es Ser, Gly, Ala o Thr; Xaa3 es Ala, Asp o Glu; Xaa5 es Ala o Thr; Xaa6 es Ala, Phe, Tyr; Xaa7 es Thr o Ser; Xaa8 es Ala, Ser o Thr; Xaa9 es Asp o Glu; Xaa10 es Ala, Leu, He, Val, o Met; Xaan es Ala o Ser; Xaai2 es Ala o Lys; Xaai3 es Ala o Gln; Xaai es Ala, Leu, He, Val o Met; Xaai5 es Ala o Glu; Xaais es Ala o Glu; Xaai7 es Ala o Glu; Xaaig es Ala o Val; Xaa2o es Ala o Arg; Xaa2i es Ala o Leu; Xaa22 es Ala, Phe, Tyr; Xaa23 es He, Val, Leu, o Met; Xaa24 es Ala, Glu o Asp; Xaa25 es Ala, Trp, Phe, Tyr; Xaa26 es Ala o Leu; Xaa27 es Ala o Lys; Xaa28 es Ala o Asn; Zx es -OH, -NH2 , Gly-Z2, Gly Gly-Z2, Gly Gly Xaa31-Z2, Gly Gly Xaa3i Ser-Z2, Gly Gly Xaa3i Ser Ser-Z2, Gly Gly Xaa3i Ser Ser Gly-Z2, Gly Gly Xaa3i Ser Ser Gly Ala-Z2, Gly Gly Xaa3i Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z2 o Gly Gly Xaa3i Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z2; Xaa3i, Xaa36, Xaa37 y Xaa38 son independientemente Pro o están ausentes; y Z2 es -OH o -NH2. En cualquiera y cada uno de los análogos de exendin descritos arriba, también se contemplan específicamente aquellos en los que un reemplazo para la histidina que corresponde a Xaal se hace con cualquiera de D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homohistidina, N-alfa-acetil-histidina, alfa-fluorometil-histidina, alfa-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina, 4-piridilalanina, 4-imidazoacetilo, des-amino-histidilo (imidazopropionilo) , beta-hidroxi-imidazopropionilo, N-dimetil-histidilo o beta-carboxi-imidazopropionilo. Además se contemplan específicamente en la presente los análogos de exendin descritos aquí en los que un reemplazo por la glicina en Xaa2 se hace con cualquiera de D-Ala, Val, Leu, Lys, Aib, ácido (1-amino ciclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido 1-aminociclopentilcarboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico o ácido (1-mino-ciclooctil) carboxílico.

De acuerdo con una modalidad, ejemplos de compuestos incluyen aquellos de las fórmulas anteriores en donde: Xaax es His o Arg; Xaa2 es Gly o Ala; Xaa3 es Asp o Glu; Xaa5 es Ala o Thr; Xaa6 es Ala o Phe; Xaa7 es Thr o Ser; Xaa8 es Ala, Ser o Thr; Xaa9 es Asp o Glu; Xaai0 es Ala, o Leu; Xaan es Ala o Ser; aai2 es Ala o Lys; Xaa13 es Ala o Gln; Xaai4 es Ala o Leu; Xaai5 es Ala o Glu; Xaai6 es Ala o Glu; Xaa17 es Ala o Glu; Xaai9 es Ala o Val; Xaá2o es Ala o Arg; Xaa2i es Ala o Leu; Xaa22 es Phe; Xaa23 es lie, Val; Xaa24 es Ala, Glu o Asp; Xaa25 es Ala, Trp o Phe; Xaa26 es Ala o Leu; Xaa27 es Ala o Lys; Xaa28 es Ala o Asn; Z es -OH, -NH2, Gly-Z2, Gly Gly-Z2, Gly Gly Xaa3i-Z2, Gly Gly Xaa31 Ser-Z2, Gly Gly Xaa3i Ser Ser-Z2, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z2, Gly Gly Xaa3i Ser Ser Gly Ala-Z2, Gly Gly Xaa3i Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2, Gly Gly Xaa3i Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z2/ Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z2; Xaa31; Xaa36, Xaa37 y Xaa38 siendo independientemente Pro o está ausente y Z2 siendo -OH o -NH2; siempre y cuando no más de tres de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa8 , Xaaio , Xaan, X3-^i2 , Xaai3 , Xaai , Xaa^s , X ais , Xaai7 , Xaais , Xaa20, Xaa2i, Xaa2 , Xaa25, Xaa26, Xaa27 y Xaa28 sean Ala. En todos y cualquiera de los análogos de exendin descritos arriba, también se contemplan específicamente aquellos en los que un reemplazo por la histidina que corresponde a la posición de Xaal se hace con cualquiera de D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homohistidina, N-alfa-acetil-histidina, alfa-fluorometil-histidina, alfa-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2 -piridilalanina, 4 -piridilalanina , 4- imidazoacetilo, des-amino-histidil ( imidazopropionilo) , beta- hidroxi-imidazopropionilo, N-dimetil-histidilo o beta- carboxi- imidazopropionilo. También se , contemplan específicamente en la presente análogos de exendin descritos aquí en los que un reemplazo para la glicina en Xaa2 se hace con cualquiera de D-Ala, Val, Leu, Lys, Aib, ácido (1- aminociclopropil ) carboxílico, ácido (1- aminociclobutil) carboxílico, ácido (1- aminociclopentil ) carboxílico, ácido (1- aminociclohexil) carboxílico, ácido (1- aminocicloheptil ) carboxílico, o ácido (1- aminociclooctil) carboxílico. I Otros ejemplos de compuestos incluyen aquellos mostrados en WO 99/257527 identificados ahí como1 compuestos 2-23. De acuerdo con otra modalidad, se proporcionan compuestos en los que Xaai4 es Leu, lie o Val muy preferiblemente Leu y/o Xaa25 es Trp, Phe o Tyr, muy i preferiblemente Trp o Phe. Estos compuestos serán menos susceptibles a degradación oxidante, tanto in vi ro como in i _ vivo, así como durante la síntesis del compuesto.

Ejemplos adicionales de análogos de exendin adecuados para usarse en los presentes polipéptidos de fusión incluyen aquellos descritos en la patente de Estados Unidos 6528486 publicada el 4 de marzo de 2003 (incorporada en la presente por referencia y para todos los propósitos) .

Específicamente, los análogos de exendin incluyen aquellos que consisten en un exendin o análogo de exendin que tiene al menos 90% de homología con exendin-4 que tiene opcionalmente entre una y cinco supresiones en las posiciones 34-39, y una extensión C-terminal de una secuencia de péptidos de 4-20 unidades de aminoácido unidas covalentemente al exendin en donde cada unidad de aminoácido en la secuencia de extensión de péptido se selecciona del grupo que consiste en Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His y Met . Muy preferiblemente la extensión es una secuencia de péptidos de 4-20 residuos de aminoácido, por ejemplo, en el intervalo de 4-15, muy preferiblemente en el intervalo de 4-10 en particular en el intervalo de 4-7 residuos de aminoácido, por ejemplo, de 4 , 5, 6, 7, 8 ó 10 residuos de aminoácido, en donde 6 residuos de aminoácido se prefieren. Más preferiblemente, de acuerdo con la patente de E.U.A. 6528486, el péptido de extensión contiene al menos un residuo Lys, y está incluso todavía más preferiblemente de 3 a 7 lisiñas y aún más preferiblemente 6 lisinas.

Por ejemplo, un análogo es HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLK GGPSSGAPPSKKKKKK (SEQ ID NO: 118) (también designado ( [des-36Pro] exendin-4 (1-39) -Lys6) . Ejemplos de análogos adicionales incluyen Lys6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Ser- (Lys) 6 (H-Lys6-des Pro36exendin-4 (1-39) -Lys6) (SEQ ID NO: 184) ; His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser (H- [des36, 38Pro] exendin-4 (1-39) -NH2) (SEQ ID NO: 185); Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser (H- (Lys) 6- [des36Pro, 37'38Pro] exendin-4 (1-39) (SEQ ID NO: 186); Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser (H-Asn- (Glu) 5- [des36Pro, 37,38Pro] exendin-4 (1-39) (SEQ ID NO: 187); His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser- (Lys) 6 ( [des36Pro, 37'38Pro] exendin-4 ( 1-39) - (Lys) 6) (SEQ ID NO: 188); (Lys) g-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser- (Lys) 6 (H- (Lys) 6- [des36Pro, 37'38Pro] exendin-4 (1-39) - (Lys) 6) (SEQ ID NO: 189); y Asp-Glu-GlurGlu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser- (Lys)6 (Asn- (Glu) s - [des36Pro, 37'38Pro] exendin-4 (1-39) - (Lys) e) (SEQ ID NO: 190) . Como es común en la técnica, la repetición de un aminoácido puede ser indicada por un número en subíndice que indique el número de repeticiones; es decir, Lys6 (Lys)6 y similares se refieren a hexalisilo (SEQ ID NO: 191) . En cualquiera y todos los análogos de exendin descritos arriba, se contemplan específicamente aquellos en los que un reemplazo por la histidina que corresponde a la posición 1 se hace con cualquiera de D-histidina, desamino-histidina , 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homohistidina , N-alfa-acetil-histidina, alfa-fluorometil-histidina, alfa-metil-histidina, 3 -piridilalanina, 2-piridilal,anina, 4-piridilalanina, 4-imidazoacetilo, des-amino-histidilo (o imidazopropionilo) , beta-hidroxi-imidazopropioriilo, N-dimetil-histidilo o beta-carboxi-imidazopropipnilo. Se contemplan además específicamente aquí los análogos de exendin descritos en la presente en los que un reemplazo por la glicina en la posición 2 se hace con cualquiera de D-Ala, Val, Leu, Lys, Aib, ácido (l-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido 1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, o ácido (1-aminociclooctil) carboxílico .

Ejemplos adicionales de análogos de exendin adecuados para usarse en las construcciones de pólipéptidos manipulados son aquellos descritos en la solicitud de PCT publicada WO2004035623 (incorporada en la presente por referencia y para todos los propósitos) , particularmente aquellos que comprenden aminoácidos de origen natural, que describe análogos de exendin que tienen al menos . un residuo de aminoácido modificado particularmente en las posiciones 13Gln, 1Met, 2STrp o 28Asn con referencia a las posiciones correspondientes de exendin-4 (1-39) . De acuerdo con esa publicación están esos análogos adicionales que comprenden además una extensión C-terminal de 1-7 aminoácidos que comprende al menos un aminoácido Lys y muy preferiblemente al menos cinco unidades de aminoácido Lys tales como seis o siete unidades de aminoácido Lys.

Otros ejemplos más de análogos de exendin adecuados para usarse en las construcciones de polipéptidos manipulados son aquellos descritos en la solicitud de PCT publicada WO/2010/120476 , titulada "Compuestos Agonistas del Receptor de GLP-l Restringidos en Conformación en el N-terminal" (incorporada en la presente por referencia y para todos los propósitos) , que describe análogos de exendin que tienen residuos de aminoácido modificados en la porción N-terminal de un exendin o análogo de exendin para crear una vuelta beta alta característica de esa región. Por ejemplo, los análogos se diseñan para indicar residuos de aminoácidos Hisl Gly2 Glu3 al crear una región de conformación restringida, incluyen análogos de exendin que contienen un péptido I mimético de tiazolidina-prolina en Hisl Gly2 Glu3 (véase por ejemplo compuestos descritos en las figuras 17A-F ahí) , que se pueden usar como una modificación en exendin-4, lixisenatide u otros análogos descritos en la presente.

En cualquiera y cada uno de los exendins, análogos de exendin y fórmulas descritas en la presente, se contemplan específicamente aquellos en los que un reemplazo por la histidina que corresponda a la posición 1 se hace con cualquiera de L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homohistidina, N-alfa-acetil-histidina, alfa-fluorometil-histidina, 'alfa-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina, 4-piridilalanina, 4-imidazoacetilo, des-amino-histidil (imidazopropionilo) , beta-hidroxi-imidazopropionilo, N-dimetil-histidilo o beta-carboxi- imidazopropionilo. Por ejemplo, análogos de exendin preferidos para usarse en los conjugados de polipéptidos manipulados como los descritos en la presente en los que la posición Hisl es modificada son (4-imidazoacetilo) exendin-4 , (des-amino-histidilo) exehdin-4 (o ( imidazopropionilo) exendin-4 ) , (beta-hidroxi-imidazopropionilo) exendin-4 , (N-dimetil-histidilo) exendin-4 y (beta-carboxi-imidazopropionilo) exendin-4. Se contemplan además específicamente en la presente exendins o análogos de exendin descritos aquí en los que un reemplazo por la lisina en la posición 2 se hace con cualquiera de D-Ala, Val, Leu,' Lys, Aib, i ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido aminociclobutil ) carboxílico, ácido aminociclopentil) carboxílico, ácido aminociclohexil) carboxílico, ácido aminocicloheptil) carboxílico, o ácido aminociclooctil) carboxílico .

Cualquiera de los anteriores análogos de exendin y sus fragmentos activos son adecuados para usarse en los presentes polipéptidos manipulados, con o sin un enlazador al ABD.

Péptidos de dominio de unión a albúmina (ABD) . Los péptidos de dominio de unión a albúmina (ABD) para usarse en la invención son aquellos con afinidad comparablemente alta con albúmina y que se derivan de dominios de unión a albúmina de proteína G bacteriana de la cepa G148 de estreptococo. De esta manera, los péptidos ABD contemplados para los polipéptidos manipulados descritos en la presente incluyen aquellos que tienen los motivos de unión a albúmina como los descritos por Jonsson et al. (Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527) así como los péptidos ABD descritos ahí, y aquellos motivos y péptidos ABD descritos además en la solicitud de PCT publicada No. WO2009/016043 , así como análogos de los mismos, particularmente aquellos que tienen al menos 85% de identidad de aminoácido. En una modalidad el péptido ABD puede incluir un motivo de unión a albúmina (ABM, por sus siglas en inglés) que incluya la secuencia de aminoácidos GVSD X5 YK X8X9I ??1 X12 A Xi4 TVEGV X20 AL X23 X2 25 I (SEQ ID NO: 119) en donde, independientemente unos de otros, X5 se selecciona de Y y F; X8 se selecciona de N, R y S; X9 se selecciona de V, I, L, M, F y Y; X11 se selecciona de N, S, E y D; X12 se selecciona de R, K y N; X14 se selecciona de K y R; X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D; y X25 se selecciona de H, E y D.

De preferencia, el péptido ABD se une a albúmina con un valor KD de la interacción que es de cuando mucho 1 x 10"6 M, y todavía más preferiblemente cuando mucho 1 x 10"9 M (afinidad todavía más estrecha) . El término "KD" se refiere a una constante de disociación, como es común en la técnica. Muy preferiblemente el valor KD de la interacción que es de cuando mucho 1 x .10"10 M, todavía más preferiblemente es de cuando mucho 1 x 10"1:LM, aún más preferiblemente es de cuando mucho 1 x 10"12 M, y aún más es de cuando mucho 1 x 10"13 M. Por ejemplo, un valor Kd de 1 x 10"14 M es un valor KD de la interacción que es de cuando mucho 1 x 10"13 M. Los valores KD pueden determinarse como se describe en la solicitud de PCT publicada NO. WO 2009/016043, de preferencia a albúmina sérica humana. En una modalidad se contempla el género anterior con la condición de que la secuencia de aminoácidos no sea GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO: 120) .

Como se demuestra en la presente y en las referencias citadas, la capacidad de unión a albúmina del péptido ABD puede conservarse a pesar de cambios de aminoácidos siempre y cuando estos cambios conserven suficiente estructura terciaria del péptido ABD. Estos cambios incluyen, por ejemplo, una sustitución en donde un residuo de aminoácido que pertenece a cierto grupo funcional de residuos de aminoácido (por ejemplo, hidrófobos, hidrófilos, polares, etc.) se cambia por otro residuo de aminoácido del mismo grupo funcional. En consecuencia, en una de estas modalidades del péptido ABD, el motivo X5 es Y. En una modalidad del ABD X8 se selecciona de N y R, y puede en particular ser R. En una modalidad, X9 es L. En una modalidad Xn se selecciona de N y S, y puede en particular ser N. En una modalidad X12 se selecciona de R y K, tal como Xi2 siendo R o Xi2 siendo K. En una modalidad X14 es K. En una modalidad X2o se selecciona de D, N, Q, E, H, S y R, y en particular puede ser E. En una modalidad X23 se selecciona de K e I, y en particular puede ser K. En una modalidad X24 se selecciona de A, S, T, G, H y L. En una modalidad más específica, X24 es L. En una modalidad todavía más específica "X23X24" es KL. En otra modalidad todavía más específica "X23X24" es TL. En una modalidad X24 se selecciona de A, S, T, G y H. En una modalidad. más específica X24 se selecciona de A, S, T, G y H y X23 es I. En una modalidad X25 es H.

Las secuencias de motivos de unión a albúmina individuales dentro de la fórmula anterior incluyen aquellas presentadas como SEQ ID NOS: 1-257 en la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, incorporada en la presente por referencia y para todos los propósitos. En ciertas modalidades del polipéptido de unión a albúmina, el motivo de unión a albúmina consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-257. En modalidades todavía más específicas de este aspecto de la invención, la secuencia de motivo se selecciona de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244 y SEQ ID NO: 245 de la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043. En una modalidad más específica de este aspecto de la invención, la secuencia de motivo se selecciona de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 239 de la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043. Los polipéptidos de unión a albúmina, que contienen estos motivos de unión a albúmina y son entonces adecuados para conjugación o fusión a un dominio de hormona como el descrito en la presente, se describen más en la presente y abajo y se ejemplifican en la tabla 1 y los ejemplos. Sin ser limitados por teoría se cree que el motivo de unión a albúmina puede formar parte de un dominio de proteína de grupo de tres hélices. Por ejemplo, el motivo puede constituir esencialmente o formar parte en dos hélices alfa con un asa interconectora, dentro del dominio de proteína del grupo de tres hélices. En consecuencia, en modalidades particulares de la invención, este dominio de proteína de grupo de tres hélices se selecciona del grupo de dominios de tres hélices de proteína G de receptor bacteriano de las cepas G 148 de estreptococo. En diferentes variantes de esta modalidad, el dominio de proteína de grupo de tres hélices del cual forma parte el motivo se selecciona del grupo del dominio GA1 , dominio GA2 y dominio GA3 de proteína G de la cepa G148 de estreptococo, en particular dominio GA3.

En modalidades de la presente invención en las que el motivo "forma parte de un dominio de proteína de grupo de tres hélices", se entiende que esto significa que la secuencia del motivo de unión a albúmina es "insertada en" o "injertada" sobre o "fusionada" a la secuencia del dominio de grupo de tres hélices de origen natural (o de otra manera original) , por lo que el motivo reemplaza un motivo estructural similar en el dominio original. Por ejemplo y sin desear ser limitados por teoría, se cree que el motivo constituye dos de las tres hélices de un grupo de tres hélices, y puede" reemplazar este motivo de dos hélices dentro de cualquiera del grupo de tres hélices. El reemplazo de dos hélices del dominio de grupo de tres hélices por el motivo de dos hélices descrito en la presente se lleva a cabo para no afectar de esta manera la estructura básica del polipéptido. Es decir, el doblez total del esqueleto del polipéptido de acuerdo con esta modalidad de la invención será sustancialmente igual a aquél del dominio de proteína del grupo de tres hélices del cual forma parte, por ejemplo, teniendo los mismos elementos de estructura secundaria en el mismo orden etc. Así, un motivo útil para los polipéptidos manipulados de la presente puede "formar parte" de1 un dominio de grupo de tres hélices si el polipéptido de acuerdo con esta modalidad tiene el mismo doblamiento que el dominio original, implicando que las propiedades estructurales básicas son compartidas, aquellas propiedades resultando por ejemplo en espectros CD similares. 1 En consecuencia, en una modalidad el polipéptido de dominio de unión a albúmina es un dominio de proteína de grupo de tres hélices, el cual incluye el motivo de unión a albúmina como el definido arriba y secuencias adicionales que constituyen el resto de la configuración de tres hélices. A este polipéptido de dominio de unión a albúmina se le puede fusionar un exendin o análogos o fragmentos activos del mismo j i para crear los polipéptidos manipulados como los descritos aquí. Un polipéptido de dominio de unión a albúmina adecuado para conjugación o fusión a un compuesto exendin puede incluir la secuencia de aminoácidos: LAEAK XaXb A XcXd EL Xe KY (SEQ ID NO: 182) enlazada covalentemente a un motivo de unión a albúmina (ABM) que está enlazado además covalentemente a la secuencia de aminoácidos LAALP (SEQ ID NO: 183) , en donde ABM es un motivo de unión a albúmina como el definido aquí, Xa se selecciona de V y E; Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L e I; Xd se selecciona de R y K; y Xe se selecciona de D y K. En algunas modalidades, un polipéptido de dominio de unión a albúmina adecuado para conjugación o fusión a un compuesto exendin es la secuencia de aminoácidos: LAEAK XaXb A XcXd EL Xe KY (SEQ ID . NO : 182) enlazada covalentemente a un motivo de unión a albúmina (ABM) el cual está enlazado además covalentemente a la secuencia de aminoácidos LAALP (SEQ ID NO: 183) como la descrita arriba.

En algunas modalidades, el polipéptido de dominio de unión a albúmina incluye la secuencia de aminoácidos LAEAK XaX AXcXd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I Xn X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I LAALP (SEQ ID NO: 121) , en donde Xa se ¡selecciona de V y E; Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L e I; Xd se selecciona de R y K; Xe se selecciona de D y K; X5 se selecciona de Y y F; X8 se selecciona de N, R y S; X9 se selecciona de V, I, L, M, F y Y; Xn se selecciona de N, S, E i ¡ y D; X12 se selecciona de R, K y N; X14 se selecciona de K y R; X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D; y X25 se selecciona de H, E y D.

Además para cada una de las modalidades de la presente de la secuencia ABD, la prolina C-terminal (que corresponde a la posición 46 arriba) puede estar opcionalmente ausente. Todavía más para cada modalidad de la secuencia de ABD, la leucina en la posición 45 puede estar opcionalmente presente o ausente. La "secuencia de ABD" es una secuencia de un compuesto ABD que es monovalente o divalente, según sea adecuado, que forma parte de un polipéptido manipulado descrito en la presente. La "secuencia de dominio de hormona de péptido (HD1)" es una secuencia de un compuesto de dominio de hormona péptida (HD1) que es monovalente o divalente, según sea adecuado, que forma parte de un polipéptido manipulado descrito en la presente. La "secuencia de exendin" es una secuencia de un compuesto exendin que es monovalente o divalente, según sea adecuado, que forma parte de un polipéptido manipulado descrito en la presente. La "secuencia de análogo de exendin" es una secuencia de un compuesto análogo de exendin que es monovalente o divalente, según sea adecuado, que forma parte de un polipéptido manipulado descrito en la presente. La "secuencia de fragmento activo de exendin" es una secuencia de un compuesto de fragmento activo de exendin que es monovalente o divalente, según sea adecuado, que forma parte de un polipéptido manipulado descrito en la presente. La "secuencia de fragmento activo de análogo de exendin" es una secuencia de un compuesto de fragmento activo de análogo de exendin que es monovalente o divalente, según sea adecuado, que forma parte de un polipéptido manipulado descrito en la presente. La "secuencia de motivo de unión a albúmina (ABM)" es una secuencia de ABM que.es monovalente o divalente, según sea adecuado, que forma parte de un polipéptido manipulado descrito en la presente. A menos que se indique lo contrario, se entiende que cuando un polipéptido manipulado "comprende" un compuesto (por ejemplo, un ABD o HD1) , la secuencia del polipéptido manipulado incluye la secuencia del compuesto (por ejemplo, una secuencia ABD o una secuencia HD1) .

Debido a la presencia de un motivo de unión a albúmina, el péptido ABD se une a albúmina con un valor KD de la interacción que es de cuando mucho 1 x 10"6 M y todavía más preferiblemente cuando mucho 1 x 10"9 M (afinidad incluso más estrecha) . Muy preferiblemente el valor KD de la interacción que es cuando mucho 1 x 10"10 M, todavía más preferiblemente es cuando mucho 1 x 10"11 M, aún más preferiblemente es cuando mucho 1 x 10~12 M, y todavía más es de cuando mucho 1 x 10"13 M. Los valores son muy preferiblemente para afinidad a albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés) .

En una modalidad de este polipéptido de unión a albúmina Xa es V. En una modalidad de este polipéptido Xb es L. En una modalidad de este polipéptido Xc es N. En una modalidad de este polipéptido X es R. En una modalidad de este polipéptido Xe es D.

En ciertas modalidades, Xa es E. En ciertas modalidades b es D. En ciertas modalidades, Xc es I. En ciertas modalidades, d es K. En ciertas modalidades, Xa es independientemente E y/o independientemente Xb es D, y/o independientemente Xc es I y/o independientemente ¾ es K. En ciertas modalidades, el polipéptido de dominio de unión a albúmina es LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP (SEQ ID NO: 122) . En ciertas modalidades, el polipéptido de dominio de unión a albúmina es LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO : 123) . En ciertas modalidades, el polipéptido de dominio de unión a albúmina es LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO: 124) .

Las secuencias de polipéptidos de dominio de unión a albúmina individuales adecuadas para fusión con los péptidos de dominio de hormona activa como los descritos en la presente se presentan en Jonsson et al . (Id.) y como SEQ ID Nos: 258-514 en la solicitud de PCT publicada NO. O 2009/016043, incorporada en la presente por referencia. Las secuencias seleccionadas se describen en la tabla 1 abajo. La presente invención también abarca un polipéptido de unión a albúmina que tiene una secuencia de aminoácidos con 85% o mayor identidad con una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS: 258-514. En modalidades particulares, la secuencia del polipéptido de unión a albúmina se selecciona de SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO:501 y SEQ ID NO: 502 en la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, y secuencias que tienen 85% o mayor identidad con la misma. En modalidades más específicas de este aspecto de la invención, la secuencia del polipéptido de unión a albúmina se selecciona de SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 310 y SEQ ID NO: 496 en la solicitud de. PCT publicada No. WO 2009/016043 y secuencias que tienen 85% o más de identidad con la misma. En modalidades todavía adicionales, la secuencia del polipéptido de unión a albúmina se selecciona de SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, . SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID. NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489 y SEQ ID NO: 480 en la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, y secuencias que tienen 85% o mayor identidad con las mismas.

Ejemplos de especies ABD incluyen, pero no están limitadas a, los compuestos con la secuencia mostrada en la tabla 1 siguiente y los ejemplos. Véase también la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para' todos los propósitos. Una secuencia de péptido ABD útil en los compuestos, métodos y composiciones farmacéuticas descritos en la presente pueden ser un fragmento o análogo de una secuencia de péptidos ABD descrito en la presente . o conocido en la técnica siempre y cuando contenga una secuencia de motivo de unión a albúmina y se una a albúmina con la afinidad descrita en la presente. ' Tabla 1 Péptidos ABD seleccionados Los términos "unión a albúmina" y "afinidad de unión para albúmina" según se usan en la presente se refieren a una propiedad de un polipéptido que puede ser probado por ejemplo mediante el uso de tecnología de resonancia de un plasmón en superficie, tal como en un instrumento Biacore como se conoce en la técnica. Por ejemplo, como se describe en los ejemplos abajo, la afinidad de unión a albúmina puede probarse en un experimento en el cual albúmina, o un fragmento de la misma, se inmovilice en un chi^ sensor de instrumento, y la muestra que contenga el polipéptido a ser probado se pase sobre el chip. Como alternativa, el polipéptido a ser probado es inmovilizado en un chip sensor del instrumento, y una muestra que contiene albúmina, o un fragmento de la misma, se pasa sobre el chip. La albúmina puede, en este respecto, ser una albúmina de suero de un mamífero, tal como albúmina de suero humano. La persona experta puede interpretar después los resultados¡ obtenidos mediante estos experimentos para establecer al , menos una medición cualitativa de la afinidad de unión del polipéptido para albúmina. Si se desea una medida cualitativa, por ejemplo para determinar un valor KD para la interacción, también se pueden usar métodos de resonancia de un plasmón en superficie. Los valores de unión pueden por ejemplo definirse en un instrumento Biacore2000 (GE Healthcare) . La albúmina se inmoviliza adecuadamente en un chip sensor de la medición, y muestras del polipéptido cuya afinidad va a determinarse se prepara mediante dilución en serie y se inyectan. Los valores KD pueden ser luego calculados a partir de los resultados usando por ejemplo el modelo de unión de Langmuir 1:1 del software BIAevaluation 4.1 proporcionado por el fabricante de instrumento (GE Healthcare) .

En una modalidad, el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto se une a albúmina de tal manera que el valor kDff de la interacción sea cuando mucho 5 x 10"5 s"1, tal como cuando mucho 5 x 10"6 s"1.

En otra modalidad preferida del ABD usado en los polipéptidos manipulados descritos en la présente, la secuencia de aminoácidos de la porción de polipéptido de unión a albúmina de un polipéptido manipulado incluye un ABD seleccionado de cualquiera de las secuencias descritas en la presente, incluyendo aquellas de la tabla 1 o el listado de la presente y que incluye además sus formas des-Prq46.

En una modalidad, el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto incluye además uno o más residuos de aminoácido adicionales colocados en el extremo N-y/p C-terminal de la secuencia de ABD definida o ejemplificada en la presente. Estos residuos de aminoácido adicionales pueden jugar un papel en incrementar más la unión de albúmina por el polipéptido, y mejorar la estabilidad de conformación del dominio de unión a albúmina doblado, pero igualmente pueden servir para otros propósitos, relacionados por ejemplo con una o más de producción, purificación, estabilización in vivo o in vitro, acoplamiento, marcado o detección del polipéptido, así como cualquier combinación de los mismos. Estos residuos de aminoácido adicionales pueden incluir uno o más residuos de aminoácido añadidos para efectos de acoplamiento químico, por ejemplo, al HD1.

Por ejemplo, los aminoácidos que precedan directamente o sigan la hélice alfa en el N- o C-terminal de la secuencia de aminoácidos ABD pueden entonces en una modalidad afectar la estabilidad de conformación. Un ejemplo de un residuo de aminoácido que puede contribuir a estabilidad de conformación mejorada es un residuo de serina colocado en el N-terminal de la secuencia de aminoácidos de ABD como se definió arria. El residuo de serina N-terminal en algunos casos puede formar una caja de tapado S-X-X-E canónica, al implicar unión de hidrógeno entre el oxígeno gama de la cadena lateral de serina y el esqueleto de polipéptido NH del residuo de ácido glutámico. Este tapado N-terminal puede contribuir a la estabilización de la primera hélice alfa del dominio de tres hélices que constituye el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

Así, en una modalidad, los aminoácidos adicionales incluyen por lo menos un residuo de serina en el N-terminal del polipéptido. La secuencia de aminoácidos ABD es en otras palabras precedida por uno o más residuos de serina. En otra modalidad del polipéptido de unión a albúmina, los aminoácidos adicionales incluyen un residuo de glicina en el N-terminal de la secuencia ABD. Se entiende que la secuencia de aminoácidos ABD puede ser precedida por uno, dos, tres, cuatro o cualquier número adecuado de residuos de aminoácido. Así, la secuencia de aminoácidos ABD puede ser precedida por un solo residuo de serina, un solo residuo de glicina o una combinación de los dos, tal como una combinación glicina- serina (GS) o una combinación glicina-serina-serina (GSS) . Un ejemplo de uno de estos ABD que tiene una serina N-terminal es SLAEAKVLA RELDKYGVSDFY RLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 176) . La forma des-prolina correspondiente sería SLAEKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEAL LHILAAL (SEQ ID NO: 177) .

En otra modalidad más, los residuos de aminoácido adicionales incluyen una alanina ácida en el N-terminal del polipéptido ABD definido en la presente, o en combinación con 'serina como una secuencia alanina-serina en el N-terminal de las secuencias ABD anteriores. En otra modalidad, los residuos de aminoácido adicionales incluyen un ácido glutámico en el N-terminal del polipéptido ABD definido en la presente.

De manera similar, el tapado C-terminal puede ser explotado para mejorar la estabilidad de la tercera hélice alfa del dominio de tres hélices que constituye el polipéptido de unión a albúmina. El residuo de prolina C-terminal presente en el C-terminal de la secuencia de aminoácidos ABD definida arriba puede funcionar al menos parcialmente como un residuo de tapado. Un residuo de lisina que siga al residuo de prolina en el C-terminal puede contribuir a estabilización adicional de la tercera hélice del polipéptido de unión a albúmina, mediante unión por hidrógeno entre el grupo épsilon amino del residuo de lisina y los grupos carbonilo de los aminoácidos ubicados dos y tres residuos antes de la lisina en el esqueleto del polipéptido, por ejemplo, los grupos carbonilo de los residuos de leucina y alanina de la secuencia de aminoácidos ABD definida arriba. Así, en una modalidad, los aminoácidos adicionales incluyen un residuo de lisina en el C-terminal del polipéptido.

Como se indicó arriba, los aminoácidos adicionales pueden estar relacionados con la producción del polipéptido de unión a albúmina. En particular, uno o más residuos de aminoácido opcionales después de la prolina C-terminal pueden proporcionar ventajas cuando el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto se produzca mediante síntesis de péptidos química. Estos residuos de aminoácido adicionales pueden por ejemplo evitar la formación de sustancias no deseadas, tales como dicetopiperazina y la etapa dipéptida de la síntesis. Un ejemplo de este residuo de aminoácido es glicina. Así, en una modalidad, los aminoácidos adicionales incluyen un residuo de glicina en el, C-terminal del polipéptido, que sigue directamente al residuo¡ de prolina o que sigue a un residuo de lisina y/o glicina adicional como se indicó arriba. Como alternativa, la producción de polipéptidos puede beneficiarse de la amidación del residuo de prolina C-terminal de la secuencia de aminoácidos ABD. En este caso, la prolina C-terminal incluye un grupo amina adicional en el carbono de carboxilo.

La persona experta está consciente de métodos para lograr modificación C-terminal, tal como mediante , diferentes tipos de matrices pre-elaboradas para síntesis de peptidos.

En otra modalidad, los residuos de j aminoácido adicionales incluyen un residuo de cisteína en el ¡extremo N-y/o C-terminal del polipéptido. Este residuo dé cisteína puede preceder y/o seguir directamente a la secuencia de aminoácidos ABD como la definida aquí o puede preceder y/o seguir a cualquier otro residuo de aminoácido adicional como el descrito arriba. Mediante la adición de un residuo de cisteína a la cadena de polipéptido, un grupo tiol para i conjugación dirigida a sitio del polipéptido de unión a albúmina puede ser obtenido. Como alternativa, un residuo de selenocisteína puede introducirse en el C-terminal de la cadena del polipéptido, de una forma similar a ' la de la introducción de un residuo de cisteína, para facilitar la conjugación específica de sitio (Cheng et al., Nat Prot 1:2, 2006) .

En una modalidad, el polipéptido dé unión a albúmina incluye no más de dos residuos de cisteína. En otra modalidad, el polipéptido de unión a albúmina incluye no más de un residuo de cisteína.

En otra modalidad, los residuos de 1 aminoácido adicionales del polipéptido de unión a albúmina incluyen un "marcador" para purificación o detección del polipéptido, tal como un marcador de hexahistidilo (HIs6) , o un marcador "myc" ("c-Myc") o un marcador "FLAG" para interacción con anticuerpos específicos para el marcador y/o para' usarse en purificación. La persona experta está consciente de otras alternativas.

Por ejemplo, en modalidades de pólipéptidos manipulados preferidas el ABD incluye LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLI KAKTVEGVEALKLHILAALP (SÉQ ID NO: 35) , y sus formas de secuencia ABD extendidas N-terminalmente inc1uyendo SLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 176) : y GSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 178) . La serina en la posición 2 está tapando la secuencia, elevando la Tm aproximadamente 2°C en comparación ¡ con tener una glicina o una alanina en esta posición. Uria alanina también puede preceder inmediatamente la serina como en ASLAEAKVLA RELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 179) . Se prefieren también los polipéptidos correspondientes en donde la prolina C-terminal, glicina o ambas están ausentes en cada una de las secuencias ABD anteriores. En consecuencia, también se prefieren secuencias en donde el ABD incluye las formas des-prolina, las cuales pueden mejorar rendimientos en comparación con las formas de origen LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAAL (SEQ ID NO: 35) , y sus formas de secuencia ABD extendidas N-terminalmente incluyendo SLAEKVLANRELDKYGVSDFYKRLI KAKTVEGVEALKLHILAAL (SEQ ID NO: 177) y GSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKHILAAL (SEQ ID NO: 180) y ASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAAL (SEQ ID NO: 181) . En un aspecto con cualquiera de las secuencias ABD descritas en la presente, el enlazador a exendin-4 o análogo de exendin es un enlazador que incluye glicina como el descrito en la presente, por ejemplo G, GGG, GGS, GGGS (SQ ID NO: 192), TGGGGAS (SEQ ID NO: 193), TGGGGGAS (SEQ ID NO: 194) o TGGGGSAS (SEQ ID NO : 195) .

En un aspecto con cualquiera de las secuencias ABD descritas en la presente, el enlazador al C-terminal de exendin-4 o análogo de exendin es un enlazador que incluye glicina como el descrito en la presente, por ejemplo G, GGG, GGS, GGGS, TGGGGAS, TGGGGGGAS y TGGGGSAS.

En una modalidad de los polipéptidos manipulados descritos en la presente, particularmente aquellos que concluyen en su C-terminal con prolina u otro aminoácido conocido por racemizarse durante la síntesis de péptidos, se puede añadir una glicina al C-terminal para contrarrestar problemas potenciales con la racemización del residuo de aminoácidos C-terminal. Como alternativa, el aminoácido C-terminal puede en su forma amidada (grupo alfa-amino) , por ejemplo, prolina versus prolina amida, más que concluir con una glicina. Sin embargo, si el polipéptido amidado se desea que sea producido mediante síntesis recombinante en lugar de química, entonces la amidación del aminoácido C-terminal puede llevarse a cabo mediante varios métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, el uso de enzima PAM de amidación.

Otro aspecto de los polipéptidos manipulados es que el ABD puede proporcionar un incremento en la solubilidad en solución acuosa de una variante de exendin de baja solubilidad o de deficiente solubilidad. Esta propiedad puede ser impartida por el propio ABD o debido al consiguiente complejo del polipéptido manipulado unido a albúmina altamente soluble in vivo o in vitro, el cual en asociación incrementa la solubilidad del polipéptido manipulado en solución acuosa. Así, en una modalidad de este aspecto adicional, se proporciona una composición, que incluye un compuesto de exendin el cual per se tiene una solubilidad en agua de no más de 1 mg/ml, o no más de 2 mg/ml o no más de 5 mg/ml, acoplado covalentemente a un dominio de unión a albúmina como una proteína de fusión o conjugado como se describe en la presente, en donde el compuesto y el polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado se acoplan covalentemente y la solubilidad del polipéptido manipulado es mayor que aquella del compuesto exendin activo no fusionado (o no conjugado) .

Unión a albúmina. La albúmina sérica es la proteína más abundante en sueros de mamífero (40 g/L; aproximadamente 0.7 mM en humanos) en donde se une a una variedad de moléculas incluyendo pero no limitadas a lípidos y bilirrubina (Peters T, 1985, Advances in Protein Chemistry 37:161) . Se ha observado que la vida media de albúmina sérica es directamente proporcional al tamaño del animal, en donde por ejemplo albúmina sérica humana (HSA) tiene una vida media de 19 días y albúmina sérica de conejo tiene una vida media de alrededor de 5 dlas (McCurdy TR et al. , J. Lsh. Clin. Med. 143:115, 2004) . La albúmina sérica humana está ampliamente distribuida a lo largo del cuerpo, en particular en los compartimientos intestinales y sanguíneos, en donde está implicada principalmente en el mantenimiento de osmolaridad. Estructuralmente, las albúminas son proteínas de cadena individual que incluyen tres dominios homólogos y que totalizan 584 ó 585 aminoácidos (Dugaiczyk L et al., 1982, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 79:71). Las albúminas contienen 17 puentes de disulfuro y un solo tiol reactivo, C34, pero carecen de porciones de carbohidrato N-enlazadas y 0-enlazadas (Peters, 1985, Id.; Nicholson JP et al., 2000, Br J Anaest 85:599). La falta de glicosilación simplifica la expresión recombinante de albúmina. Esta propiedad de la albúmina, junto con el hecho de que su estructura tridimensional se conoce (He, XM y Cárter, DC, Nature 358:209 1992) , la ha hecho un candidato atractivo para usarse en proteínas de fusión recombinante. Estas proteínas de fusión combinan generalmente una proteína terapéutica (la cual sería rápidamente depurada del cuerpo después de la administración de la proteína per se) y una proteína de plasma (la cual exhibe una depuración lenta natural) én una sola cadena de polipéptidos (Sheffield WP, Curr. Drug Targets Cardiovacs. Haematol . Dísord. 1:1 2001). Estas proteínas de fusión pueden proporcionar beneficios clínicos al requerir una inyección menos frecuente y niveles más altos de proteína terapéutica in vivo. Sin embargo, los polipéptidos manipulados de la presente no están conjugados a albúmina, sino que en su lugar contienen motivos que permiten unión no covalente a albúmina.

Vida media de albúmina. Se ha observado que la vida media de la albúmina en diferentes especies se adhiere generalmente a la escalada alométrica con base en el peso del animal. Por ejemplo, la vida media de albúmina en ratón, rata, conejo y humano se ha calculado como de 1, 1.9, 5.6 y 19 días, respectivamente. De hecho, el análisis dp ajuste de potencia (Davies & Morris, 1993, Pharm. Res. (N.Y.) 10:1093-1095) proporciona la ecuación: Vida media de albúmina (días) = 3.75 * peso corporal (kg) 0,368 Modalidades adicionales. Se entiende que cada uno de los polipéptidos descritos en la presente también se contempla que incluya una metionina en el N-terminal en cuadro con el primer aminoácido de origen natural del mismo, por ejemplo, Met-exendin-4 , que es exendin-4 con una metionina N-terminal añadida. Se entiende además ; que cuando una Gly C-terminal aparece en una secuencia de pólipeptidos manipulados mostrada en la presente, el residuo puede perderse durante amidación subsecuente. Algunas modalidades son intermediarios en síntesis, por ejemplo, tales como aquellos que tienen un "marcador His" el cual se usa para purificación por afinidad como se conoce en la técnica, y que pueden ser opcionalmente removidas subsecuentemente para producir un polipéptido manipulado maduro adecuado para uso terapéutico.

En algunas modalidades de cualquiera de los polipéptidos manipulados descritos en la presente, un análogo de exendin puede tener al menos 70%, por ejemplo 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o todavía más, de identidad de secuencia con relación a una secuencia exendin de origen. En i i algunas modalidades, el exendin de origen es exendin-4, y el análogo de exendin puede tener al menos 70%, por ejemplo 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o todavía más, de identidad de secuencia con relación a exendin-4. Como se conoce en la técnica, GLP-1 (péptido 1 tipo glucagón) no es un exendin; y la secuencia de GLP-1 es excluida específicamente de las secuencias de exendin adecuadas para los polipéptidos manipulados descritos en la presente.

En algunas modalidades, se proporcionan compuestos que tienen un enlazador, por ejemplo Ll , como el descrito en la presente, que enlaza covalentemente un dominio de hormona de polipéptido con un peptido.ABD. En algunas modalidades, un primer enlazador (Ll) enlaza covalentemente HDl con el polipéptido manipulado. En algunas modalidades, Ll es un enlace. En algunas modalidades, el dominio de hormona de polipéptido (por ejemplo, HDl como el descrito en la presente) puede ser enlazado covalentemente al péptido ABD por medio de un enlazador de péptido. Cualquier enlazador es opcional, es decir, cualquier enlazador puede ser simplemente un enlace. Cuando está presente la estructura química de un enlazador no es crítica porque sirve principalmente como una función separadora. En una modalidad el enlazador incluye de 1 a 30 aminoácidos enlazados por enlaces péptidos. Los aminoácidos pueden seleccionarse de los 20 aminoácidos de origen natural (es decir, fisiológicos) . Como alternativa, los aminoácidos no naturales pueden ser incorporados ya sea mediante síntesis química, modificación química post-traduccional o mediante incorporación in vivo por expresión recombinante en una célula hospedera. Algunos de estos aminoácidos pueden ser glucosilados . En otra modalidad, los 1 a 30 aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, y lisina, y además de aspartato y glutamato. En una modalidad más, el enlazador está constituido de una mayoría de aminoácidos que están estéricamente no impedidos, tales como glicina, alanina y/o serina. "Estéricamente no impedidos" se refiere, en el sentido común, a un aminoácido que tiene una cadena lateral pequeña, por ejemplo, 0-2 átomos no de hidrógeno, de tal manera que el impedimento estérico se minimiza con relación a los aminoácidos que tienen cadenas laterales más grandes, por ejemplo, Leu, Trp, Tyr, Phe y similares. Las poliglicinas son particularmente útiles, por ejemplo, (Gly)3, (Gly)4 (SEQ ID NO: 125), (Gly)5 (SEQ ID NO: 126), al igual que las polialaninas , poli (Gly-Ala) y poli (Gly-Ser) . Las poliglicinas cargadas pueden ser útiles, e incluyen, por ejemplo, motivos poli (Glyn-Glu) (SEQ ID NO: 127), poli (Glyn-Lys) (SEQ ID NO: 128), poli (Glyn-Asp) (SEQ ID NO: 129), y poli (Glyn-Arg) (SEQ ID NO: 130) (en donde n puede ser 1 a 6) . Otros ejemplos específicos enlazadores son (Gly) 3Lys (Gly) (SEQ ID NO: 131); (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 132); (Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 133); y GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 134). Combinaciones de Gly y Ala son particularmente útiles al igual que una combinación de Gly y Ser. Así, en una modalidad más el enlazador péptido se selecciona del grupo de un péptido rico en glicina, por ejemplo, Gly-Gly-Gly; las secuencias [Gly-Ser] n (SEQ ID NO: 135), [Gly-Gly-Ser] n (SEQ ID NO: 136), [Gly-Gly-Gly-Ser]„ (SEQ ID NO: 137) y [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser] n (SEQ ID NO: 138), en donde n es l, 2, 3, 4, 5 ó 6, por ejemplo [Gly-Gly-Gly-Gly Ser] 3. Un "péptido rico en glicina" se refiere a un polipéptido que incluye una pluralidad de residuos de glicina, de preferencia una mayoría de residuos de glicina, más preferiblemente una preponderancia de residuos de glicina.

En ciertas modalidades, se pueden usar enlazadores cargados. Estos enlazadores cargados pueden contener un número significativo de residuos de aminoácido (por ejemplo, Asp, Glu y similares) , o pueden contener un número significativo de residuos básicos (por ejemplo, Lys, Arg y similares) , de tal forma que el enlazador tenga un pl inferior a 7 o mayor que 7, respectivamente. Como se entiende por el experto, y todo lo demás en igualdad de condiciones, entre mayor sea la carga relativa de los residuos ácidos o básicos en un enlazador dado, menor o más alto, respectivamente, será el pl de ese enlazador. Estos enlazadores pueden impartir propiedades adecuadas para los polipéptidos manipulados descritos en la presente, tales como modificar el pl (punto isoeléctrico) de los péptidos, lo cual puede a su vez mejorar las características de solubilidad y/o estabilidad de estos polipéptidos a un pH particular, tal como a pH fisiológico (por ejemplo, entre pH 7.2 y pH 7.6, inclusive) , o en una composición farmacéutica que incluye estos polipéptidos. Como se conoce en la técnica, la solubilidad por un polipéptido puede mejorarse mediante formulación en una composición que tenga un pH que sea al menos o más que más o menos una unidad de pH del pl del péptido .

Por ejemplo, un "enlazador ácido" es un enlazador que tiene un pl de menos de 7; entre 6 y 7, inclusive; entre 5 y 6, inclusive; entre 4 y 5, inclusive; entre 3 y 4, inclusive; entre 2 y 3, inclusive; o entre 1 y 2, inclusive. De manera similar, un "enlazador básico" es un enlazador que tiene un pl de más de 7; entre 7 y 8, inclusive; entre 8 y 9, inclusive; entre 9 y 10, inclusive; entre 10 y 11, inclusive; entre 11 y 12, inclusive; o entre 12 y 13, inclusive. En ciertas modalidades, un "enlazador ácido" contendrá una secuencia que se seleccione del grupo de [Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 139); [Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 140); [Gly-Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 141); [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 142), [Gly-Asp]n (SEQ ID NO: 143); [Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 144); [Gly-Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 145); [Gly-Gly-Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 146), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más; por ejemplo, [Gly-Gly-Glu] 6 · En ciertas modalidades, un enlazador básico contendrá una secuencia que se seleccione del grupo de [Gly-Lys]n (SEQ ID NO: 147); [Gly-Gly-Lys]n (SEQ ID NO: 148); [Gly-Gly-Gly-Lys]„ (SEQ ID NO: 149); [Gly-Gly-Gly-Gly-Lys] n (SEQ ID NO : 150), [Gly-Arg] n (SEQ ID NO: 151); [Gly-Gly-Arg] n (SEQ ID NO: 152); [Gly-Gly-Gly-Arg]n (SEQ ID NO: 153); [Gly-Gly-Gly-Gly-Arg] n (SEQ ID NO: 154) en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, o más; por ejemplo, [Gly-Gly-Lys] 6 · Además, se pueden preparar enlazadores que posean ciertos motivos o características estructurales, tales como una hélice alfa. Por ejemplo, ese enlazador puede contener una secuencia que se seleccione del grupo de [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n (SEQ ID NO: 155), donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, por ejemplo, -Glu-Ala-Ala [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3, [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys] 4 , o [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys] 5. Alguien en la técnica puede determinar fácilmente el contenido de hélices de cualquier secuencia enlazadora particular.

Un enlazador biocompatible distinto de un enlace peptídico se puede usar para unir covalentemente el C-terminal de un exendin con el N-terminal de la secuencia de ABD o AB . El ligador puede ser un polímero biocompatible, preferiblemente soluble en agua, y más preferiblemente de aproximadamente 50kD a aproximadamente 5000kD, o I aproximadamente 50kD a 500kD, o aproximadamente lOOkD a 500kD. Un ejemplo de un polímero enlazador biocdmpatible y soluble en agua es un enlazador de PEG, tal como - (CH2-CH2-0)n- en donde n es tal que el enlazador de PEG puede tener un i peso molecular de 100 a 5000 kD, preferiblemente 100 a 500 kD. Tal enlazador puede ser-NH-CH2-CH2- (0-CH2-CH2) Á-0-CH2-CO- , donde n es tal que el peso molecular del enlazador de PEG es de lOOkD a 5000kD, . preferiblemente lOkD a 500kD. Otros polímeros biocompatibles pueden ser utilizados, tales como incluyendo pero no limitados a los polisacáridos, polipropilenglicol , y copolímeros de propileno y etilenglicoles . Típicamente, este enlazador incluirá un grupo reactivo en cada extremo que puede ser el mismo o diferente grupo reactivo. Estos enlazadores con grupos reactivos son conocidos y están disponibles. Preferiblemente, el grupo i reactivo es reactivo ya sea con un grupo amino N-terminal o carboxi C-terminal de un péptido. Por ejemplo, un grupo I reactivo puede ser un butilaldehído, un propionaldehído, un aldehido, una succinimida d una porción de maleimida, como se conoce en la técnica. Menos preferidos son enlazadores alquílicos tales como -NH- (CH2) nC (0) - , en donde n = 2-20, y que pueden estar adicionalmente sustituidos por ¡ cualquier grupo que no impida estéricamente la función del péptido, tal como un alquilo inferior (por ejemplo, Ci-C6) , acilo inferior, halógeno, CN, y NH2.

Debe entenderse también que los enlazadores adecuados para uso de acuerdo con la invención púeden poseer una o más de las características y- motivos descritos anteriormente y aquí. Por ejemplo, un enlazador puede incluir í un enlazador de ácido, así como un motivo estructural, tal como una hélice alfa. De manera similar, un enlazador puede incluir un enlazador básico y un motivo estructural, tal como una hélice alfa. Un enlazador puede incluir un enlazador de ácido, un enlazador de base, y un motivo estructural, tal I como una hélice alfa. Además, es de entenderse también que los polipéptidos manipulados de acuerdo con la invención pueden poseer más de un enlazador, y cada enlazador tal puede poseer una o más de las características descritas en la presente .

Los enlazadores descritos en este documento son ejemplares, y enlazadores dentro del alcance de esta invención pueden ser mucho más largos y pueden incluir otros residuos. En una modalidad, se excluyen expresamente los polipéptidos manipulados en los que la secuencia j de exendin está unida directamente a la secuencia de ABD sin un enlazador .

En algunas modalidades, el polipéptido manipulado incluye una secuencia de ABD en el C-terminal, y una secuencia de HD1 en el N-terminal. En ciertas modalidades preferidas, el N-terminal es una secuencia de exendin, una secuencia de fragmento de exendin o una secuencia de análogo de exendin. Además de las modalidades que incluyen un ABD y un HD1, el polipéptido manipulado puede tener la estructura HD1-ABD.

Se entiende que en ausencia de una indicación expresa de la N-terminal y/o C-terminal de un polipéptido manipulado en el presente documento, el polipéptido manipulado debe ser leído en la orientación del N-terminal al C'-terminal. Por ejemplo, cuando HD1 tiene la secuencia de un compuesto de exendin o análogo de la misma, los términos HD1-ABD, HD1-L1-ABD, HD1-ABD, y similares significan, en ausencia de una indicación expresa del N-terminal y/o el C-terminal, en el que la secuencia de exendin o análogo de la misma reside en el N-terminal del polipéptido manipulado, y el ABD reside en el C-terminal. A la inversa, si el N-terminal y/o C-terminal se indica expresamente, entonces el polipéptido manipulado debe ser leído de acuerdo con la indicación expresa de los extremos. Por ejemplo, los extremos HDlC-term-ABD, HDl-Ll-ABDN_term y similares significan que el ABD reside en el N-terminal del polipéptido manipulado, y HD1 reside en el C-terminal .

En algunas modalidades, la polipéptido manipulado aquí descrito tiene una afinidad para albúmina de suero que es diferente que la afinidad del polipéptido ABD, es decir, en ausencia de un dominio de hormona fusionado. Con el fin de obtener asociación eficaz, el polipéptido manipulado puede tener una afinidad de unión para albúmina de suero tal que la constante de disociación KD sea, por ejemplo, menos de aproximadamente 10"6 M, 10"7 M, 10"8 M, 10"9 M, 10"10 M, 10'11 M, 10"12 M, 10"13 M, 10"14 M o incluso 10"15 M. En algunas modalidades, la afinidad no es excesivamente estrecha de tal manera que el polipéptido manipulado se puede disociar de la albúmina y provocar una respuesta biológica, por ejemplo la unión a un receptor, por ejemplo, un receptor de exendin. La afinidad se puede medir como se describe en la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, preferentemente a albúmina sérica humana, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad y para todos los propósitos, incluyendo sin limitación los ensayos y métodos de síntesis. En algunas modalidades, un polipéptido manipulado aquí descrito es superior a un compuesto correspondiente que tiene un resto diferente que puede extender la vida media plasmática (por ejemplo, PEG o de Fe o albúmina) conjugado con un dominio de hormona. En este contexto, el término "superior" se refiere a una variedad de propiedades funcionales que podrían ser ponderadas en la evaluación de un tratamiento para una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, el polipéptido manipulado aquí descrito podría requerir componente (dominio de hormona) menos biológicamente activo, por ejemplo IX, 2X, 3X, 4.X, 5X, o incluso menos, que el compuesto correspondiente que tiene un resto diferente conjugado con el dominio de hormona. Por ejemplo además, el polipéptido manipulado aquí descrito podría tener una potencia superior, por ejemplo, 1.5X, 2X, 3X, 4X, 5X, 10X, 20X, 50X, o potencia aún mayor.

Los compuestos de polipéptidos manipulados contemplados aquí incluyen los compuestos que se exponen en la tabla 2 siguiente. Un compuesto preferido es Comp 31.

Tabla 2 Polipéptidos manipulados ejemplares seleccionados Otros compuestos polipeptídicos contemplados aquí incluyen los compuestos que se exponen en la tabla 3A siguiente : Tabla 3A Polipéptidos manipulados ejemplares seleccionados Se contemplan específicamente los compuestos de las secuencias anteriores en los que cualquier metionina N-terminal está ausente. La metionina N-terminal puede estar presente principalmente como una conveniencia para la expresión bacteriana. Sin embargo, los, péptidos manipulados de la presente invención se pueden expresar en una célula hospedera eucariota (por ejemplo, levadura (Pichia por ejemplo), mamífero, baculovirus) u otra célula hospedera que tenga procesamiento proteolítico N-terminal post -traduccional para producir un aminoácido N-terminal como el encontrado en un homólogo de péptido maduro de origen natural de la hormona deseada o secuencia ABD, es decir, sin la metionina añadida u otra secuencia líder. Alternativamente, una secuencia N-terminal que se use para' la expresión y/o secreción (e incluso purificación) puede ser una que se pueida retirar después de la traducción, por ejemplo, mediante el uso de Í una proteasa tal como TEV.

Otros compuestos de polipéptidos manipulados contemplados en este documento, que tienen una variedad de componentes HD1, LI y ABD, incluyen los compuestos que tienen la estructura de cualquiera de los po!l ipépt idos manipulados de las tablas y listado en la presente, incluyendo los descritos en la siguiente Tabla 3B.

Tabla 3B Polipéptidos manipulados ejemplares seleccionados Secuencia HGEGTFTSDLS QMEEEAVRLFIEWLKMTGGGGSASLAEAKVLANRELD YGVSDFY KRLINKA TVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID N0:51) HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLF1EWLKNTGGGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDFY KRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:52) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAÉAKVLAN RELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:53) HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKVLAN RELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:54) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASLAEAKVLANRE LDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLH1LAALP (SEQ ID NO:55) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSGGGSGGGSGGGSA SLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:56) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEnSTGGGGSASLAEAKVLANRELD KYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:57) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEI1STGGGGSGGGSGGGSGGGSASL AEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:58) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKKTGGGGSASLAEAK VLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:59) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKKTGGGGSGGGSGGG GGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDFY KRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:60) HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGLAEAKVLANRELDKYG VSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:61) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKVLAN RELDKYGVSDYYKNUNRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO:62) HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASLAEAKVLANRE LDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO:63) HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSGGGSGGGSGGGSA SLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO:64) HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASLAEAKVLANRELDK YGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO:65) HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLA EAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO:66) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNTGGGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDYY Secuencia 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Métodos de diseño y producción Diseño de construcciones. Los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden ser diseñados a nivel de aminoácidos. Estas secuencias pueden ser después traducidas de nuevo usando una variedad de productos de software conocidos en la técnica de tal manera que la secuencia de nucleótidos sea optimizada para el anfitrión de expresión deseado, por ejemplo, con base en la expresión de proteínas, optimización de codones, contenido de sitios de restricción. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede ser optimizada para la expresión de proteínas a base de E. coli y para el contenido de sitios de restricción. Con base en la secuencia de nucleótidos de interés, se puede proporcionar oligonucleót idos superpuestos para PCR de varias etapas, como se conoce en la técnica. Estos oligonucleót idos pueden usarse en varias reacciones de PCR bajo condiciones bien conocidas, en la técnica para construir el ADNc que codifique para la proteína de interés. Un ejemplo es regulador de pH IX Amplitaq, 1.3 mM de gCl2, 200 uM de dNTPs, 4 U Amplitaq Gold, 0.2 uM de cada cebador (AmpliTaq Gold, ABI), con parámetros de ciclo: (94C:30s, 58C:1 rain, 72C:lmin), 35 ciclos.

Se pueden añadir sitios de restricción a los extremos de los productos de PCR para usarse en ligación de vectores como se conoce en la técnica. Los sitios específicos pueden incluir Ndel y Xhol, de tal manera que el ADNc pueda estar luego en el marco de lectura adecuado en un vector de expresión pET45b (Novagen) . Usando estos sitios, cualquier marcador His N-terminal que esté en este vector puede ser iluminado toda vez que el sitio de inicio de traducción estaría entonces hacia el extremo 3' del marcador. Una vez que se completan las construcciones de expresión, se puede llevar a cabo una verificación mediante secuenciación usando, por ejemplo, cebador del promotor T7, cebador terminador T7 y protocolos ABI BigDye Term v3.1 estándares como se conoce en la técnica. La información de secuencia puede obtenerse de, por ejemplo, un analizador de ADN ABI 3730 y se puede analizar usando el software Vector NTI v.10 (Invitrogen) . Las construcciones de expresión pueden diseñarse de una manera modular de tal manera que las secuencias enlazadoras puedan ser fácilmente cortadas y (cambiadas, como se conoce en la técnica.

Los sitios de reconocimiento de proteasa, conocidos en la técnica o descritos en la presente, pueden ser incorporados en construcciones útiles para el diseño, construcción, manipulación y producción de polipéptidos de manipulación recombinantes descritos en la presente.

Ejemplos de construcciones. Lás const ucciones útiles en la producción de polipéptidos manipulados contemplados aquí incluyen construcciones que ' codifican para los polipéptidos indicados en . la Tabla 4 siguiente .

Tabla 4 Ej emplos de construcciones seleccionadas para la producción de polipéptidos manipulados Métodos de producción generales . Los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden prepararse usando técnicas de ADN biológicas, químicas y/o recombinantes que se conocen en la técnica. Ejemplos de métodos se describen en la presente y en la patente de E.U.A. No. 6,872,700; WO ; y publicación de E.U.A. No. 2007/0238669, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades y para todos los propósitos. Otros métodos para preparar los compuestos se muestran en la presente.

Los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden prepararse usando técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida estándares, tales como un sintetizador de péptidos automático o semiautomático . Brevemente y en general, el ABD y el péptido terapéutico hormonal se pueden hacer por separado y luego conjugarse entre sí o se pueden hacer como un solo polipéptido. Por lo tanto, el polipéptido de unión a albúmina, hormona terapéutica o polipéptido manipulado pueden alternativamente producirse por síntesis de péptidos no biológica utilizando aminoácidos y/o derivados de aminoácidos que tengan cadenas laterales reactivas protegidas, síntesis de péptidos no biológica incluyendo acoplamiento por etapas de los aminoácidos y/o los derivados de aminoácidos para formar un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto que tenga cadenas laterales reactivas protegidas, eliminando los grupos protectores de las cadenas laterales reactivas del polipéptido, y doblando el polipéptido en solución acuosa. Así, aminoácidos normales (por ejemplo glicina, alanina, fenilalanina , isoleucina, leucina y valina) y derivados de aminoácidos pre-protegidos se utilizan para construir secuencialmente una secuencia de polipéptidos , en solución o en un soporte sólido en un solvente orgánico.. Cuando una secuencia de polipéptidos completa se construye, los grupos protectores se eliminan y el polipéptido se permite doblar en una solución acuosa.

Cada polipéptido de acuerdo con la presente descripción se dobla reversiblemente, con el dominio ABD doblándose reversiblemente en un dominio de grupo de tres hélices sin factores añadidos, y por lo tanto se dobla espontáneamente. El conjugado manipulado se puede producir por un método que incluya la producción de un polipéptido de unión a albúmina según cualquier método, por ejemplo, como se describe en la presente, tal como mediante síntesis de péptidos no biológica, y conjugando el polipéptido ABD producido con la hormona terapéutica definida aquí, los ABDs de la presente se doblan en forma completamente reversible. Esto se evaluó por análisis de espectros de dicroísmo circular; un espectro tomado a 20°C y un segundo espectro después de calentar a 90°C seguido de un retorno a 20°C. Durante este procedimiento la Tm, como se conoce en la técnica, se determinó y se encontró que estaba sin cambios después del doblamiento del polipéptido desnaturalizado.

Típicamente, utilizando tales técnicas, un aminoácido protegido con alfa-N-carbamoilo y un aminoácido unido a la cadena de péptidos en crecimiento en una resina se acoplan a temperatura ambiente en un solvente inerte (por ejemplo, dimetilformamida , N-metilpirrolidinona, cloruro de metileno y similares) en presencia de agentes de acoplamiento (por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida, 1-hidroxibenzo-triazol, y similares) en presencia de una base (por ejemplo, diisopropiletilamina, y similares) . El grupo protector alfa-N-carbamoilo se separa de la resina peptídica resultante usando un reactivo (por ejemplo, ácido trifluoroacético, piperidina, y similares) y la reacción de acoplamiento se repite con el siguiente aminoácido N-protegido deseado que se añadirá a la cadena de péptidos. Los grupos N-protectores adecuados son bien conocidos en la técnica, tales como t-butiloxicarbonilo (tBoc) , fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) , y similares. Los solventes, derivados de aminoácidos y la resina de 4-metilbenzhidril-amina utilizados en el sintetizado de péptidos se pueden comprar a partir de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) .

Para la síntesis química, puede usarse síntesis de péptidos en fase sólida para los polipéptidos manipulados, toda vez que en general la síntesis en fase sólida es un enfoque directo con excelente escalabilidad a escala comercial, y es generalmente compatible con polipéptidos manipulados relativamente largos. La síntesis de péptidos en fase sólida se puede llevar a cabo con un sintetizador de péptidos automático (modelo 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, California) usando el sistema NMP/HOBt (opción 1) y química de tBoc o Fmoc (véase Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, versión 1.3B, julio 1, 1988, sección 6, pp . 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) con tapado. Las resinas de Boc-péptido pueden ser cortadas con HF (-5°C a 0°C, 1 hora) . El péptido puede ser extraído de la resina con agua y ácido acético alternantes, y los filtrados liofilizados . Las resinas de Fmoc-péptido pueden ser cortadas de acuerdo con métodos estándares (por ejemplo, Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, pp. 6-12). Los péptidos también pueden ser ensamblados usando un Advanced Chem Tech Synthesizer (modelo MPS 350, Louisville, Ky.).

Los compuestos (exendins, ABDs, enlazadores, polipéptidos manipulados) descritos en la presente también se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinantes , mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 2a edición, Cold Spring Harbor. Los compuestos no péptidos pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, aminoácidos que contengan fosfato y péptidos que contengan estos aminoácidos, pueden prepararse usando métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Barlett et al, 1986, Biorg. Chem. 14:356-377. los compuestos pueden ser conjugados usando métodos de la técnica o como los descritos en la presente.

Los polipéptidos manipulados pueden producirse como alternativa mediante técnicas recombinantes bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989 (Id.) . Estos polipéptidos manipulados producidos mediante tecnologías recombinantes pueden ser expresados a partir de un polinucleótido . Un experto en la técnica apreciará que los polinucleótidos, incluyendo ADN y ARN, que codifican para estos polipéptidos manipulados pueden obtenerse del ADNc tipo silvestre, por ejemplo, leptina humana, tomando en consideración la degeneración del uso de codones, y se pueden manipular además según se desee para incorporar las sustituciones indicadas. Estas secuencias de polinucleótidos pueden incorporar codones que faciliten la transcripción y traducción de ARNm en anfitriones microbianos. Estas secuencias de fabricación pueden construirse fácilmente de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, WO 83/04053, incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Los polinucleótidos anteriores también pueden codificar opcionalmente para un residuo de metionilo N-terminal. Los compuestos no péptidos útiles en la presente invención pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, aminoácidos que contengan fosfatos y péptidos que contengan estos aminoácidos pueden ser preparados usando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Barlett y Landen, 1986, Bioorg. Chem. 14:356-77.

Una variedad de sistemas de vector de expresión/anfitrión pueden utilizarse para contener y expresar ' una secuencia de codificación de polipéptidos manipulados. Estas incluyen pero no están limitadas a microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, vectores de expresión de ADN plásmidos o cósmidos ; levadura transformada con vectores de expresión de levadura, sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus) .,· sistemas de células vegetales transfectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células animales. Las células de mamífero que son útiles en las producciones de proteínas recombinantes incluyen pero no están limitadas a células VERO, células HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), células COS (tales como COS-7) , células 138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 y 293. Ejemplos de protocolos para la expresión recombinante de la proteína se describen aquí y/o se conocen en la técnica.

De esta forma, las secuencias de polinucleótidos son útiles para generar vectores de ADN virales y de plásmidos nuevos y útiles, células hospederas procarióticas y eucarióticas transformadas y transíectadas nuevas y útiles (incluyendo células bacterianas, de levadura y de mamífero cultivadas en cultivo) y métodos nuevos y útiles para el crecimiento cultivado de estas células hospederas capaces de expresión de los presentes polipéptidos manipulados. Las secuencias de polinucleótidos que codifican para polipéptidos manipulados de la presente pueden ser útiles para terapia génica en casos en los que una subproducción de polipéptidos manipulados sería aliviada, o la necesidad de niveles incrementados de éstos pudiera ser satisfecha.

La presente invención también proporciona procesos para la producción de ADN recombinante de los presentes polipéptidos manipulados. Se proporciona un proceso para producir los polipéptidos manipulados a partir de una célula hospedera que contiene ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido manipulado que comprenden: (a) cultivar la célula hospedera que contenga los polinucleótidos que codifiquen para el polipéptido manipulado bajo condiciones que faciliten la expresión de la molécula de ADN; y (b) obtener los polipéptidos manipulados.

Las células hospederas pueden ser procarióticas o eucarióticas e incluir bacterias, células de mamífero (tales como células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , células de mono, células de riñon de hámster bebé, células de cáncer u otras células), células de levadura y células de insecto.

Los sistemas anfitriones de mamífero para la expresión de la proteína recombinante también se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Las cepas de células hospederas pueden seleccionarse- para una capacidad particular para procesar la proteína expresada o producir ciertas modificaciones después de traducción que serán útiles para proporcionar actividad de proteína. Estas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no están limitadas a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento después de traducción, el cual corta una forma "prepro" de la proteína, también puede ser importante para una correcta inserción, doblez y/o función. Diferentes células hospederas, tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, W138 y similares, tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para estas actividades después de traducción, y se pueden seleccionar para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña introducida.

Como alternativa, se puede emplear un sistema de levadura para generar los polipéptidos manipulados de la presente invención. La región de codificación del ÁDN de los polipéptidos manipulados es amplificado mediante PCR. Un ADN que codifica para la secuencia líder de levadura pre-pro-alfa se amplifica a partir de ADN genómico de levadura en una reacción de PCR usando un cebador que contiene nucleótidos 1-20 del gen del factor de acoplamiento alfa y otro cebador complementario a los nucleótidos 255-235 de este gen (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell, 30:933-43). La secuencia de codificación del líder pre-pro-alfa y fragmentos de secuencia de codificación de polipéptido manipulado son ligados en un plásmido que contiene el promotor de alcohol deshidrogenasa de levadura (ADH2) , de tal manera que el promotor dirija la expresión de una proteína de fusión que consista en el factor pre-pro-alfa fusionado al polipéptido manipulado maduro. Como se enseña por Rose y Broach, Meth. Enz . 185: 234-79, Goeddel ed. , Academic Press, Inc., San Diego, California (1990), el vector incluye además un terminador de transcripción ADH2 hacia la dirección 3' del sitio de clonación, el origen de replicación de "2 mieras" de levadura, el gen leu-2d de levadura, los genes REP1 y REP2 de levadura, el gen de beta-lactamasa de E. coli, y un origen de replicación de E. coli. Los genes de beta- lactamasa y leu-2d proporcionan la selección en bacterias y levaduras, respectivamente. El gen leu-2d también facilita un número de copias incrementado del plásmido en levadura para inducir niveles más altos de expresión. Los genes REP1 y REP2 codifican para proteínas implicadas en la regulación del número de copias de plásmidos .

La construcción de ADN descrita en el párrafo anterior es transformada en células de levadura usando el método conocido, por ejemplo, tratamiento con acetato de litio (Stearns et al., 1990., Meth. Enz . ,. 185: 280-297). El promotor ADH2 es inducido después del agotamiento de glucosa en los medios de crecimiento (Price et al., 1987, Gene 55:287). La secuencia pre-pro-alfa lleva a cabo la secreción de la proteína de fusión de las células. De manera concomitante, la proteína KEX2 de levadura corta la secuencia pre-pro a partir de los polipéptidos manipulados maduros (Bitter et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 81:5330-5334) .

Los polipéptidos manipulados de la invención también pueden ser expresados en forma recombinante en levadura, por ejemplo, Pichia, usando sistemas de expresión disponibles comercialmente , por ejemplo, el sistema de expresión de Pichia (Invitrogen, San Diego, California) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Este sistema también se basa en la secuencia pre-pro-alfa para dirigir la secreción, pero la transcripción del inserto es conducida por el promotor de alcohol oxidasa (AOX1) después de la inducción por metanol . El polipéptido manipulado secretado es purificado a partir del medio de crecimiento de levadura mediante, por ejemplo, los métodos usados para purificar al polipéptido manipulado a partir de sobrenadantes de células bacterianas y de mamífero.

Como alternativa, el ADN que codifica para un polipéptido manipulado puede ser clonado en un vector de expresión de baculovirus, por ejemplo, pVL1393 (PharMingen, San Diego, California) . Este vector de codificación de polipéptido manipulado se usa después de acuerdo con las direcciones del fabricante (PharMingen) o técnicas conocidas para infectar células de Spodoptera f ugiperda, cultivadas po ejemplo en medios libres de proteína sF9, y para producir proteína recombinante . La proteína es purificada y concentrada a partir de los medios usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, una columna de heparina-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) y columnas de dimensionamiento molecular secuencial (Amicon, Beverly, Massachusetts) , y se resuspende en solución adecuada, por ejemplo, PBS . Se puede usar análisis SDS-PAGE para caracterizar la proteína, por ejemplo al mostrar una sola banda que confirme el tamaño del polipéptido manipulado deseado, al igual que un análisis de secuencia de aminoácidos completo, por ejemplo, secuenciación Edman en un Protón 29090 Peptide Sequencer, o confirmación de su secuencia N-terminal.

Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifique para el polipéptido manipulado maduro predicho puede ser clonada en un plásmido que contenga un promotor deseado y, opcionalmente , una secuencia líder (véase, por ejemplo, Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043). La secuencia de esta construcción puede confirmarse mediante secuenciación automática. El plásmido es luego transformado eh E. coli, cepa MC1061, usando procedimientos estándares empleando incubación en CaCl2 y tratamiento por chopie térmico de las bacterias (Sambrook et al., Id.). Las bacterias transformadas se cultivan en medio LB complementado con carbenicilina, y la producción de la proteína expresada es inducida por crecimiento en un medio adecuado. Si está présente, la secuencia líder afectará la secreción del polipéptido manipulado maduro y puede ser cortada mediante la ! secreción . El polipéptido manipulado recombinante secretado se purifica de los medios de cultivo bacteriano mediante el método descrito en la presente.

Como alternativa, los polipéptidos manipulados pueden ser expresados en un sistema de insecto. Los sistemas de insecto para expresión de proteínas se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. En un sistema de este tipo, virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia . La secuencia de codificación de polipéptidos manipulados es clonada en la región no esencial del virus, tal como el gen de poliedrina, y puesto bajo el control del promotor de poliedrina. Una inserción exitosa de un polipéptido manipulado hará al gen de poliedrina inactivo y producirá virus recombinantes que carezcan de cápside de proteína. Los virus recombinantes se usan después para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las cuales el polipéptido manipulado de la presente invención sea expresado (Smith et al., 1983, J. Virol . 46:584; Engelhard et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 91:3224-3227).

En otro ejemplo, la secuencia de ADN que codifica para los polipéptidos manipulados puede ser amplificada por PCR y clonada en un vector adecuado, por ejemplo, pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) . El vector pGEX está diseñado para producir una proteína de fusión que comprende glutationa-S-transferasa (GST) , codificada por el vector, y una proteína codificada por un fragmento de ADN insertado en el sitio de clonación del vector. Los cebadores para la PCR pueden ser generados para incluir, por ejemplo, un sitio de corte adecuado. La proteína de fusión recombinante puede ser después cortada de la porción GST de la proteína de fusión. La construcción pGEX-3X/polipéptido manipulado se transforma en células XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, La Jolla, California) , y los transformantes individuales se aislan y cultivan a 37°C en medio LB (complementado con carbenicilina) hasta una densidad óptica a longitud de onda 600 nm de 0.4, seguida por incubación adicional durante 4 horas en presencia de 0.5 mM de beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo (Sigma Chemical Co. , St . Louis, Missouri) . ADN Plasmídico de transformantes individuales se purifica y secuencia parcialmente usando un secuenciador automático para confirmar la presencia del inserto de gen de codificación de polipéptido manipulado deseado en la orientación adecuada.

La proteína de fusión, cuando se espera que sea producida como un cuerpo de inclusión insoluble en las bacterias, puede ser purificada como se describe arriba como sigue. Las células son cosechadas por centrifugación; lavadas en NaCl 0.15 M, 10 mM de Tris, pH 8, 1 mM de EDTA; y tratadas con 0.1 mg/mL de lisozima (Sigma Chemical Co.) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El lisado se limpia por sonicación, y los restos celulares se sedimentan por centrifugación durante 10 minutos a 12,000 xg. El sedimento que contiene proteína de fusión es resuspendido en 50 mM de Tris, pH 8, y 10 mM de EDTA, estratificado sobre 50% de glicerol y centrifugado durante 30 minutos a 6,000 xg. El sedimento se resuspende en solución salina de pH regulado con fosfato estándar (PBS) libre de Mg++ y Ca++ . La proteína de fusión se purifica más al fraccionar el sedimento resuspendido en un gel de poliacrilamida SDS de desnaturalización (Sambrook et al., citado arriba). El gel es sumergido en KCl 0.4 M para visualizar la proteína, la cual es extirpada y electroeluida en regulador de pH de activación con gel que carece de SOS. Si la proteína de fusión de GST/polipéptido manipulado se producen bacterias como una proteína soluble, puede ser purificado usando el GST Purification Module (Pharmacia Biotech) .

La proteína de fusión puede ser sujeta a digestión para cortar el GST del polipéptido manipulado maduro. La reacción de digestión (20-40 ug de proteína de fusión, 20-30 unidades de trombina humana (4000 U/mg (Sigma) en 0.5 mL de PBS) es incubada 16-48 horas a temperatura ambiente y cargada en un gel SDS-PAGE de desnaturalización para fraccionar los productos de reacción. El gel es sumergido en KCl 0.4 M para visualizar las bandas de proteínas. La identidad de la banda de proteínas que corresponde al peso molecular esperado del polipéptido manipulado puede confirmarse mediante análisis de secuencia de aminoácidos parcial usando un secuenciador automático (Applied Biosystems modelo 473A, Foster City, California) .

En un método particularmente ejemplar de expresión recombinante de los polipéptidos manipulados de la presente invención, 293 células pueden ser co- ransfectadas con plásmidos que contengan el ADNc de los polipéptidos manipulados en el vector pCMV (promotor CMV 5', secuencia poli A HGH 3') y pSV2neo (que contiene el gen de resistencia neo) mediante el método de fosfato de calcio. En una modalidad, los vectores podrían ser linearizados con Seal antes de la transfección . De manera similar, se puede usar una construcción alternativa que use un vector pCMV similar al gen neo incorporado. Las líneas de células estables se seleccionan de clones unicelulares por dilución limitante en medios de crecimiento que contienen 0.5 mg/mL G418 (antibiótico tipo neomicina) durante 10-14 días. Las líneas celulares son tamizadas para la expresión de polipéptidos manipulados por ELIS o Wester blot, y las líneas celulares de alta expresión son expandidas para crecimiento a gran escala.

Es preferible que las células transformadas se usen para producción de proteínas de alto rendimiento a largo plazo y de esta manera la expresión estable es deseable. Una vez que estas células son transformadas con vectores que contienen marcadores seleccionables junto con el cásete de expresión deseado, las células pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que sean cambiadas por medio selectivo. El marcador seleccionable se diseña para conferir resistencia a selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Grupos resistentes de células establemente transformadas pueden ser proliferados usando técnicas de cultivo de tejidos adecuados para la célula .

Un número de sistemas de selección pueden usarse para recuperar las células que hayan sido transformadas para traducción de proteínas recombinantes . Estos sistemas de selección incluyen, pero no están limitados a, HSV timidina cinasa, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y genes de adenina fosforribosiltransferasa, en células tk- , hgprt- o aprt-, respectivamente. Asimismo, resistencia anti-metabolitos puede ser usada como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato ; gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglicósido, G418; también, que confiere resistencia a clorosulfurón; e hygro, que confiere resistencia a higromicina . Genes seleccionables adicionales que pueden ser útiles incluyen trpB, el cual permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, el cual permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina. Los marcadores que dan una indicación visual para la identificación de transformantes incluyen antocianinas , beta-glucuronidasa y su substrato, GUS, y luciferasa en su substrato, luciferina.

Los polipéptidos manipulados de la presente invención pueden producirse usando una combinación de técnicas de síntesis de péptidos tanto automáticas como recombinantes. Por ejemplo, cualquiera o ambos de: la leptina; un análogo de leptina, un fragmento de leptina activo o derivado de leptina; y un ABD; y opcionalmente un enlazador; empleado en la preparación de los polipéptidos manipulados como los descritos en la presente, se puede hacer sintéticamente o en forma recombinante y luego ligarse juntos usando métodos conocidos en la técnica, tales como "ligación química nativa" y variaciones conocidas de la misma en las cuales un enlace de amida se forma que une los compuestos de origen. Véase, por .ejemplo, patente de Estados Unidos No. 6,326,468, la cual se incorpora en la presente por referencia para todos los propósitos. Como alternativa, por ejemplo, un polipéptido manipulado de la presente invención puede contener una combinación de modificaciones que incluyan supresión, sustitución, inserción y derivación mediante PEGilación (u otra porción, por ejemplo, polímero, cadena acilo grasa, amidación C-terminal) . Este polipéptido manipulado puede ser producido por etapas. En la primera etapa, un polipéptido manipulado intermedio que contenga las modificaciones de supresión, sustitución, inserción y cualquier combinación de las mismas, se puede producir mediante técnicas recombinantes como las descritas. Luego, después de una etapa de purificación opcional como la descrita en la presente, el polipéptido manipulado intermedio es PEGilado (o sometido a otra derivación química, por ejemplo, acilación, amidación C-terminal) a través de modificación química con un reactivo de PEGilación adecuado (por ejemplo, de NeKtar Transforming Therapeutics ,. San Carlos, California) para producir el derivado de polipéptido manipulado deseado. Un experto en la técnica apreciará que el procedimiento descrito arriba puede generalizarse para aplicar a un polipéptido manipulado que contenga una combinación de modificaciones seleccionadas de selección, sustitución, inserción, derivación y otros medios de modificación bien conocidos en la técnica y contemplados por la presente invención.

La amidación C-terminal puede lograrse mediante el uso de un precursor extendido C-terminalmente del aminoácido glicina, sintetizado por ejemplo en levadura (por ejemplo, Pichia) como proteína de fusión de factor alfa que será secretada en medio de cultivo. Después de la purificación, la glicina C-terminal del precursor de polipéptido manipulado puede convertirse en amida mediante amidación enzimática, por ejemplo, monooxigenasa de alfa-amidación de peptidilglicina (PAM) . Véase, por ejemplo, Cooper et al., 1989, Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258. Véase también la patente de Estados Unidos 6319683, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos, que enseña métodos para amidación enzimática, incluyendo una enzima de alfa-amidación de rata que es suficientemente pura en enzima de alfa-amidación como para exhibir una actividad específica de por lo menos aproximadamente 25 mU por mg de proteína, y que está suficientemente libre de impurezas proteolíticas como para ser adecuada para usarse con substratos purificados a partir de fuentes naturales o producirse mediante técnicas de ADN recombinante.

Los péptidos pueden ser purificados mediante cualquier número de métodos conocidos en la técnica, incluyendo como los descritos en la presente. En un método se purifican péptidos mediante RP-HPLC (preparativa y analítica) usando un sistema aters Delta Prep 3000. Una columna preparativa de C4 , C8 o C18 (10 µ, 2.2X25 cm; Vydac, Hesperia, California) se puede usar para aislar péptidos, y la pureza se puede determinar usando una columna analítica de C4, C8 o C18 (5µ, 0.46X25 cm; Vydac). Los solventes (A=0.1% de TFA/agua y B=0.1% de TFA/CH3CN) pueden ser suministrados a la columna analítica a una velocidad de flujo de 1.0 ml/min y a la columna preparativa a 15 ml/min. Análisis de aminoácidos pueden llevarse a cabo en el sistema Waters Pico Tag y procesarse usando el programa Máxima. Los péptidos pueden ser hidrolizados mediante hidrólisis ácida en fase de vapor (115°C, 20-24 h) . Los hidrolizados pueden derivarse y analizarse mediante métodos estándares (Cohén et al., THE PICO TAG METHOD: A MANUAL OF ADVANCED TECHNIQUES FOR AMINO ACID ANALYSIS, pp . 11-52, Millipore Corporation, Milford, Mass. (1989)) . Puede llevarse a cabo análisis de bombardeo de átomos rápido mediante M-Scan, Incorporated (West Chester, Pa.). La calibración de masa se puede llevar a cabo usando yoduro de cesio o yoduro de cesio/glicerol . Análisis de ionización por desorción de plasma usando detección de tiempo de vuelo puede llevarse a cabo en un espectrómetro de masas Applied Biosystems Bio-Ion 20.

Ensayo de expresión de polipéptidos manipulados . Están disponibles métodos para ensayar el nivel de expresión de proteínas por una célula hospedera. Los procedimientos útiles para ensayar el nivel de expresión de proteína por una célula hospedera se ejemplifican en el siguiente protocolo típico. Aproximadamente 25 µ? de células de E. cqli BL21 se transforman con 2 ul de ADN plasmídico (vector de expresión para el polinucleótido manipulado) . Las células pueden ser colocadas en placas e incubadas durante la noche a 37 °C a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés) durante un periodo de 48 horas. Una sola colonia puede seleccionarse y usarse para cultivar un cultivo de partida en 4 mi de medio LB con antibiótico adecuado durante - 6 horas. Soluciones de glicerol pueden prepararse al añadir 100 ul de glicerol' estéril al 80% a una solución de 900 ul , la cual puede ser luego mezclada suavemente y almacenada a -80°C. Puede retirarse una muestra de 250 µ? para una muestra no inducida de TCP. Una alícuota, por ejemplo, 2 mi de medio Magic que contenga antibiótico adecuado puede ser inoculada con 5 µ? de cultivo de partida, la cual puede ser luego incubada durante la noche (hasta 24 horas) a 37°C, 300 rpm. Como se conoce en la técnica, Magic Media es autoinducto . Como alternativa, 60 mi de Magic Media que contiene antibiótico adecuado pueden inocularse con 60 µ? de cultivo de partida en un matraz Thompson de 250 mi o 125 mi, del cual puede ser después incubado durante la noche (hasta 24 horas) a 30°G, 300 rpm. Después de la incubación, 250 µ? de cultivo pueden ser removidos de cada tubo y las células sedimentarse. Las células pueden ser resuspendidas en 1 mi de Tris 50 mM pH 8, 150 mM de NaCl, al cual se le pueden añadir 0.1 volúmenes (100 ul) de reactivo de cultivo POP y µ? de r-lisozima (dilución 1:750 en regulador de pH de r-lisozima) . La mezcla puede ser luego mezclada bien e incubada al menos 10 minutos a temperatura ambiente. La preparación puede ser centrifugada después 10 minutos a 14,000 x G. El sobrenadante (fracción soluble) puede ser removido y retenido, y las muestran pueden prepararse para análisis en gel (15 µ? + 5 µ? de LDS) . El sedimento de cuerpos de inclusión restante puede ser resuspendido en 1 mi de SDS al 1% con sonicación. La muestra puede prepararse para análisis de gel (15 ul + 5 µ? de LDS) . Para muestras no inducidas, 1.0 volúmenes de reactivo de cultivo POP y 1 µ? de r-lisozima (dilución 1:750 en regulador de pH de r-lisozima) pueden ser añadidos. La mezcla puede mezclarse bien e incubarse al menos 10 minutos a temperatura •ambiente. Estas muestras pueden no tener que ser centrifugadas. La muestra puede ser después preparada para análisis en gel (15 µ? + 5 µ? LDS) . Geles NU-PAGE (4-12%) no reducidos en regulador de pH 1XMES pueden ser corridos y j teñidos con un protocolo de microondas SimplyBlue. La destinción puede llevarse a cabo durante la noche, como se conoce en la técnica. Puede conservarse una imagen en gel, y analizarse para determinar los niveles de expresión de proteínas.

Los polipéptidos manipulados pueden íser y se expresaron y aislaron como sigue. Una secuencia dé proteínas del polipéptido manipulado deseado se diseñó y se volvió a traducir usando un software comercial a una secuencia de ADN para la clonación en un vector de expresión dé E. coli. Secuencias de ácido nucleico se obtuvieron ya sea como oligonucleótidos y .se ligaron usando técnicas estándar de I amplificación por PCR, o se digirieron a ¡partir de construcciones de expresión existentes utilizando enzimas de restricción estándares y después se ligaron juntas. Las secuencias que expresaban la proteína de interés se colocaron en el plásmido pET45 con un promotor T7 para lai expresión inducible. Después las construcciones fueron verificadas por secuenciación, el ADN del vector se purificó y se transformó en un anfitrión de expresión, típicamente BL21 (DE3) . Una sola colonia se seleccionó para crecer un cultivoi iniciador en 4 mi de medio LB durante ~6 hrs . Soluciones de abastecimiento de glicerol ' se prepararon añadiendo lOOul de glicerol al 80% a solución de abastecimiento de 900ul y se almacenó a -80C. Opcionalmente , 500 ul de muestra no inducida se mantuvo para el análisis de gel. Un cultivo de 60 mi (por ejemplo MagicMedia™ E. coli Expression Médium; Invitrogen, E.U.A.; ver Glenn et al, J". Biol . Chem. 2008, 283 (19) : 12717-29) se inoculó con 60ul de cultivo iniciador en un matraz Thompson de 125ml y se incubó a 30 grados C durante la noche. Se retiró una muestra de 250ul para el análisis. Las células fueron recogidas como sedimento por centrifugación, y se congelaron para su posterior procesamiento. La preparación del extracto de células y purificación de primer paso con resina de níquel se realizó como sigue. Sedimentos celulares de E. coli se resuspendieron completamente en un volumen de regulador de pH de lisis (50 mM Tris HC1, 150 mM NaCl, pH 8.0) igual al volumen del cultivo de partida. Las células se sometieron a continuación a un microfluidizador (Microfluidics , MA) a 100 psi (7.03 kg/cm2) durante tres veces. Los extractos celulares se centrifugaron durante 30 minutos a 16,000 xg para eliminar los residuos. EGTA (solución de 150 mM) se añadió al extracto celular a una concentración final de 3 mM de EGTA. El lisado se aplicó después a una columna Ni-NTA Superflow que se había lavado y pre-equilibrado . La proteína unida a la columna se lavó después con regulador de pH de lisis más EGTA (50 mM Tris HC1, 150 mM NaCl, pH 8,0, 3 mM EGTA) antes de que la proteína unida se eluyera con 50 mL de regulador de pH de elución (25 mM Tris HC1, 50 mM NaCl , 250 mM de imidazol, pH 8,0). La escisión de His-Tag y la posterior purificación fue la siguiente. La proteína eluida se concentró con unidad de filtro centrífugo Amicon-Ultral5 (Millipore, E.U.A.) y después se diluyó con 25 mM de TrisHCl, pH 8.0, 50 mM de NaCl para preparar para la digestión de proteasa que elimina la HisTag del N-terminal de la proteína deseada. Se añadió 0.1% de ß-mercaptoetanol y 1% de proteasa Turbo TEV (2 mg/ml, 10,000 unidades/mg; Excellgen, E.U.A.) a la solución de proteína, la cual se mezcló y se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas y después a 4°C durante la noche. Una columna Ni-NTA Superflow (Qiagen, E.U.A.) fue pre-equilibrada con 50 mM de Tris HC1, 100 mM de NaCl, 45 mM de imidazol, pH 8.0. La reacción de digestión con TEV se diluyó 2 veces con 50 mM de Tris HCl , 150 mM de NaCl, pH 8.0. La reacción de digestión diluida se aplicó cuidadosamente a la parte superior de la columna Ni-NTA y el paso de flujo se recogió. A la columna se añadieron 10 mL de 50 mM de Tris HCl, 100 mM de NaCl, 45 mM de imidazol, pH 8.0, para eluir cualquier proteína no unida. Las proteínas eluidas de la columna se recogieron y combinaron, y se pulieron a continuación usando cromatografía de exclusión de tamaño (2x con columna Superdex 75 HiLoad 26/60; GE Healthcare Biosciences, E.U.A.). Cualquier endotoxina bacteriana remanente se eliminó usando EndoTrap Red (Lonza, Suiza) según las instrucciones del fabricante.

Preparación de cuerpos de inclusión. Para polipéptidos manipulados que se encuentran en la fracción de cuerpos de inclusión, puede ser benéfico el siguiente procedimiento. El sedimento celular puede ser resuspendido en un mínimo de 100 mi de regulador de pH de lisis para cada cultivo de 50 mi. Después de la adición de 30 mi, se puede usar una pipeta de 10 mi para resuspender, luego el tubo puede ser lavado con 70 mi adicionales. La solución de células resuspendidas puede ser corrida varias veces, por ejemplo, 4 pasadas, a través de un microfluidizador a 100 PSI (7.03 kg/cm2) (min) teniendo cuidado de mantener la cámara en agua helada a lo largo del proceso completo. La suspensión fluidizada puede ser centrifugada a 14,000 x g, 20 min (por ejemplo, JLA 10.5, 10,000 rpm, usando botellas Nalgene® de 250 mi) . El sedimento de cuerpos de inclusión puede ser resuspendido en hielo en regulador de pH de lisis enfriado con barra de agitación y placa de agitación durante 1 hora a 4°C después de la ruptura con la punta de la pipeta. El sedimento puede ser resuspendido una segunda vez en H20 destilada con barra de agitación y placa de agitación durante 1 hora y 4°C después de la interrupción con punto de pipeta, seguido por centrifugación a 14,000 x g, 15 min. El sobrenadante puede ser removido y descartado. El resultado puede ser almacenado a -80°C.

Purificación de proteínas. Como se describe en la presente, se conocen numerosos métodos para aislamiento de polipéptidos expresados. Se prefieren los pplipéptidos manipulados secretados. Sin embargo, el siguiente es un ejemplo si se forman cuerpos de inclusión. Sedimentos de cuerpos de inclusión pueden solubilizarse en un volumen adecuado de regulador de pH de solubilización (urea 8M o guanidina 8M, 50 mM de Tris, 10 mM de DTT, pH 7.75) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los sedimentos solubilizados pueden ser centrifugados durante 20 minutos a 27,000 g. Sobrenadante filtrado (por ejemplo, 0.4 um) puede ser transferido gota a gota en un volumen adecuado de regulador de pH de redoblamiento (50 mM de Tris-HCl, 1 M de urea, 0.8 M de arginina, 4 mM de cisteína, 1 mM de cistamina,- pH 8) a temperatura ambiente. El resultado puede ser luego puesto a 4°C durante la noche o más con mezclado suave. Las muestras pueden ser concentradas y corridas en una columna de filtración en gel (Superdex™ 75 26/60) a 1-2 ml/min en ambiente a 4°C usando un GE Healthsciences AKTAFPLC™ . Las fracciones que contengan proteína adecuadas pueden ser identificadas mediante SDS-PAGE, agrupadas y corridas a través de una segunda columna de filtración en gel. Las proteínas agrupadas pueden ser luego concentradas en un filtro Amicon hasta concentración adecuada y ensayadas para niveles de endotoxinas usando, por ejemplo, Endosafe® PTS Reader (Charles River) , como se conoce en la técnica. Una vez que una muestra de proteínas haya pasado los criterios de' endotoxina, puede ser filtrada estéril, colocada en alícuotas y corrida a través de ensayos de control de calidad. Los ensayos de ' control de calidad pueden incluir HPLC-SEC, analítica, SDS-PAGE no reductora y RP HPLC - MS para obtener masa aproximada. Las proteínas pueden obtenerse en lxPBS (137 mM de cloruro de sodio, 2.7 mM de cloruro de potasio, 4.3 mM de fosfato disódico, 1.4 mM de fosfato de monopotasio, pH 7.2), distribuidas en alícuotas y congeladas rápidamente para su almacenamiento a -70 a -80 °C.

IV. Métodos de uso y tratamiento de enfermedades Indicaciones. Una variedad de enfermedades y trastornos se contemplan para ser tratados benéficamente por los compuestos de polipéptidos y métodos descritos en la presente.

Obesidad y sobrepeso. La obesidad y sus trastornos asociados incluyendo sobrepeso son problemas de salud pública comunes y serios en los Estados Unidos y a lo largo del mundo. La obesidad de cuerpo superior es el factor de riesgo más fuerte conocido para diabetes mellitus tipo 2 y es un fuerte factor de riesgo para enfermedad cardiovascular. La obesidad es un factor de riesgo reconocido para hipertensión, aterosclerosis , insuficiencia cardiaca congestiva, apoplejía, I enfermedad de vesícula biliar, osteoartri is , apnea del sueño, trastornos reproductivos tales como síndrome de ovarios poliquísticos , cánceres de seno, próstata y colon, e incidencia incrementada de complicaciones de anestesia general. Véase, por ejemplo, Kopelman, 2000, Nature 404: 635-43. i La obesidad reduce la expectativa de vida y porta un serio riesgo de las co-morbidades listadas arriba, así como trastornos tales como infecciones, venas varicosas, acantosis negra, eczema, intolerancia al ejercicio, resistencia a insulina, hipertensión, hipercolesterolemia, colelitiasis , lesiones ortopédicas y enfermedad tromboembólica . Véase, por ejemplo, Rissanen et al., 1990, Br. Med. J. , 301: 835-7. La obesidad es también uri factor de riesgo para el grupo de . condiciones llamadas síndrome de resistencia a insulina, o "síndrome X" y síndrome metabólico. El costo médico mundial para tratamiento de obesidad y trastornos asociados es enorme.

Se cree que la patogénesis de la obesidad es multifactorial . Un problema es que, en sujetos obesos, la disponibilidad de nutrientes y gasto de energía no entran en equilibrio hasta que existe un exceso de tejido adiposo. El sistema nervioso central (SNC) controla el equilibrio de energía y coordina una variedad de actividades de comportamiento, autonómicas y endocrinas adecuadas para el estado metabólico del animal. Los mecanismos o sistemas que controlan estas actividades están ampliamente distribuidos a través del cerebro delantero (por ejemplo, hipotálamo), cerebro trasero (por ejemplo, tallo cerebral) y médula espinal. Finalmente, información metabólica (es decir, disponibilidad de combustible y cognitiva (es decir, preferencias aprendidas) de estos sistemas se integra y la decisión para involucrarse en comportamientos de apetito (búsqueda de alimento) y consumismo (ingestión) : es ya sea activada (procuración inicio de alimentación) , o apagada (conclusión de alimentación) . Se cree que el hipotálamo es principalmente responsable de integrar estas señales y luego emitir comandos al tallo cerebral. Los núcleos, del tallo cerebral que controlan los elementos del sistema de control motor de consumo (por ejemplo, músculos responsables de masticación y deglución) . Así, estos núcleos del SNC literalmente han sido conocidos como constituyendo la "vía i común final" para el comportamiento de ingestión.

Evidencia neuroanatómica y farmacológica soporta que las señales de energía y homeostasis nutricional se integran en los núcleos del cerebro frontal y que .el sistema de control motor de consumo reside en los núcleos del tallo celular, probablemente en regiones que rodean el núcleo motor trigeminal. Existe una extensa conexión recíproca, entre el hipotálamo y el tallo cerebral. Una variedad de terapéuticos antiobesidad dirigidos al SCN (por ejemplo, moléculas pequeñas y péptidos) se enfocan principalmente en substratos del cerebro frontal que residen en el hipotálamo y/o en substratos del cerebro posterior que residen en el tallo cerebral .

La obesidad sigue siendo un trastorno metabólico esencialmente intratable, crónico y deficientemente tratable. En consecuencia, existe la necesidad por nuevas terapias útiles en la reducción de peso y/o mantenimiento de peso en un sujeto. Estas terapias llevarían a un profundo efecto benéfico en la salud del sujeto. Métodos y térapias que emplean los péptidos manipulados descritos en la presente, ya sea solos o en combinación con otros agentes antiobesidad (véase, por ejemplo, O 2009064298 y US 20080207512 pueden proporcionar estos efectos benéficos.

Diabetes y enfermedad cardiovascular. La diabetes mellitus se reconoce como una enfermedad crónica y compleja en la cual 60% a 70% de todas las muertes causales entre pacientes diabéticos son resultado de complicaciones cardiovasculares. La diabetes no sólo se considera un equivalente de riesgo de enfermedad cardiaca coronaria sino que también se define como un predictor independiente de eventos adversos, incluyendo infarto de miocardio recurrente, insuficiencia cardiaca congestiva y muerte después de un incidente cardiovascular. La adopción de un control de glucosa más estrecho y tratamiento agresivo de factores de riesgo cardiovasculares se esperaría que redujera el riesgo de complicaciones de enfermedad cardiaca coronaria y mejorará la supervivencia total entre los pacientes diabéticos. No obstante, los pacientes diabéticos son dos a 3 veces más propensos a experimentar un infarto de miocardio agudo que los pacientes no diabéticos, y los pacientes diabéticos viven ocho a treinta años menos que los pacientes no diabéticos.

Para entender la naturaleza de alto riesgo de los pacientes diabéticos/de infarto de miocardio agudo,- los lineamientos de la práctica clínica del Colegio Norteamericano de Cardiología/Asociación Norteamericana Cardiaca ( "ACC/AHA" , por sus siglas en inglés) para el manejo de pacientes hospitalizados con angina inestable o infarto de miocardio sin elevación de ST (colectivamente conocidos como "ACS") recientemente reconocieron que los pacientes diabéticos hospitalizados son una población especial que requiere el manejo agresivo de hiperglucemia . Específicamente, los lineamientos indican que la terapia de reducción de glucosa para pacientes diabéticos/ACS hospitalizados debería enfocarse en lograr glucosa preprandial de menos de 10 mg/dL, un objetivo diario máximo que 180 mg/dL, y una hemoglobina de post-descarga Ale inferior a 7%.

En una muestra a nivel nacional de pacientes de ACS de edad avanzada, se demostró que un incremento en la mortalidad a 30 días en pacientes diabéticos correspondía con los pacientes que tenían valores de glucosa más altos después de su admisión en el hospital. Véase "Diabetic Coronary Artery Disease & Intervention" , Coronary Therapeutics 2002, Oak Brook, IL, septiembre 20, 2002. Existe cada vez más evidencia de que hiperglucemia prolongada en lugar de glucosa elevada transitoria después de admisión en hospital está relacionada con eventos adversos serios. Aunque la métrica ideal para hiperglucemia y riesgo bascular en pacientes no se conoce fácilmente, parece que el valor de glucosa promedio durante la hospitalización es más predictiva de mortalidad. En un estudio separado de pacientes de ACS de más de 40 hospitales en los Estados Unidos, se encontró que hiperglucemia persistente, a diferencia de valores de glucosa aleatorios después de admisión en el hospital, era más predictiva de mortalidad en hospital. Véase Acute Coronary Syndrome Summit: A State of the Art Approach, Kansas City, MO, septiembre 21, 2002. En comparación con los valores de glucosa después de la admisión, un modelo de regresión logística del control de glucosa sobre la hospitalización completa fue más predictivo de mortalidad. Hubo un riesgo incrementado casi dos veces de mortalidad durante hospitalización para cada incremento de 10 mg/dL en glucosa sobre 120 mg/dL. En una cohorte más pequeña de pacientes diabéticos/ACS consecutivos, hubo un incremento gradado en la mortalidad a un año con niveles de glucosa cada vez más altos después de admisión en hospital. En el escenario de hospital, los lineamientos de ACC/AHA sugieren el inicio de una terapia con insulina agresiva para lograr glucosa en sangre más baja durante la hospitalización.

Enfermedades de regulación de lípidos. La dislipidemia es una interrupción del componente lípido normal en la sangre. Se cree que la elevación prolongada de los niveles de insulina puede llevar a dislipidemia. La hiperlipidemia es la presencia de niveles elevados o anormales de lípidos y/o lipoproteínas en la sangre. La enfermedad del hígado graso, por ejemplo, enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD, por sus siglas en inglés) se refiere a un amplio espectro de enfermedades hepáticas que varían desde hígado graso simple (esteatosis) , a esteatohepatitis no alcohólica (NASH, por sus siglas en inglés) , a cirrosis (irreversible, cicatrización avanzada del hígado) . Todas las etapas de NAFLD tienen en común la acumulación de grasa (infiltración grasa) en las células hepáticas (hepatocitos) .

Además, sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que una deficiencia de insulina relativa en diabetes tipo 2, toxicidad de glucosa y carga de ácidos grasos libres hepáticos incrementada a través de un suministro elevado a partir de tejido adiposo intra-abdominal por medio de la vena portal, están implicados como posibles causas en trastornos de hígado graso. De hecho, sé ha creado la hipótesis de que el comportamiento alimenticio es el factor clave que conduce el síndrome metabólico de obesidad con sus muchos corolarios, incluyendo NASH. En consecuencia, los tratamientos enfocados a reducir el consumo de; alimento e incrementar el número de comidas pequeñas, como ya se ha demostrado en diabetes tipo 2, puede tratar y prevenir de manera efectiva NASH: Los fármacos que promueven la secreción i de insulina y cantidad de peso, y retrasan el vaciado gástrico también son efectivos para mejorar la tolerancia a glucosa y de esta - manera puede mejorar hígado graso con su hiperinsulinemia. inherente. Así, el uso de exendins, agonistas de análogos de exendins, agonistas de derivados de exendins, particularmente exendin-4, puede ser muy adecuado como una modalidad de tratamiento para esta afección. En consecuencia, los polipéptidos manipulados descritos en la presente que incluyen un exendin o componente de péptido i (dominio de hormona) biolgóicamente activo, o fragmento o análogo del mismo, pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos de hígado graso.

Enfermedad de Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer (AD) , como se conoce en la técnica, está asociada pon placas y marañas en el cerebro que incluyen la desregulación de la i i protelna A-beta. La estimulación receptores de GLP-1 neuronales se ha informado que desempeña un papel importante en la regulación de la plasticidad neuronal y la supervivencia celular. GLP-l se ha informado que induce la excrecencia de neuritas y protege contra la muerte celular excitotóxica y la lesión oxidativa en células neuronales cultivadas. GLP-1 y exendin-4 se informó que reducen los niveles endógenos de péptido amiloide beta (protelna A-beta) en cerebro de ratón y reducen los niveles de la proteína precursora beta amiloide (beta-APP) en las neuronas. Véase, por ejemplo, Perry et al, 2004, Curr. Drug Targets 5(6):565-571. El tratamiento con los compuestos manipulados descritos en este documento puede proporcionar un beneficio a los objetivos terapéuticos asociados con la enfermedad de Alzheimer.

Mal de Parkinson. El mal de Parkinson (PD, por sus siglas en inglés) es sinónimo de "parkinsonismo primario", es decir, parkinsonismo aislado debido a un proceso neurodegenerativo sin ninguna causa sistémica secundaria. El parkinsonismo se caracteriza por síntomas de temblor, rigidez, y la ralentización del movimiento causado por la pérdida de dopamina. Sin desear estar ligados por ninguna teoría, se cree que exendin-4 puede actuar como un factor de supervivencia para neuronas dopaminérgicas al funcionar como un factor de desactivación de microglia y sugiere que exendin-4 puede ser un valioso agente terapéutico para enfermedades neurodegenerativas tales como PD.

Síndrome metabólico X. El síndrome metabólico X se caracteriza por resistencia a insulina, dislipidemia, hipertensión y distribución visceral de tejido adiposo, y juega un papel central en la patofisiología de diabetes tipo 2. También se ha encontrado que está fuertemente correlacionado con NASH, fibrosis y cirrosis del hígado. En consecuencia, los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden ser útiles en el tratamiento de síndrome metabólico X.

Diabetes inducida por esteroides. Los glucocorticoides son bien conocidos por afectar el metabolismo de hidratos de carbono. En respuesta a la administración de glucocorticoides exógenos, aumento de la producción hepática de glucosa y secreción reducida de insulina y absorción de glucosa estimulada por insulina en los tejidos periféricos se observa. Además, el tratamiento con glucocorticoides altera la relación proinsulina (Pl) /insulina inmunorreactiva (IRI), como se conoce en la técnica. Las características típicas de la hiperglucemia inducida por glucocorticoides en sujetos sin diabetes incluyen una mínima elevación de la glucosa en sangre en ayunas, hiperglucemia postprandial exagerada, insensibilidad a insulina exógena, y falta de respuesta a terapia con metformina o sulfonilurea . En consecuencia, los polipéptidos manipulados descritos en este documento que incluyen un componente peptídico de exendin biológicamente activo (dominio de hormona) , o un fragmento o análogo del mismo, puede ser útiles en el tratamiento de diabetes inducida por esteroides .

Diabetes inducida por tratamiento de Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) . Poco después de la introducción de inhibidores de proteasa (PIs, por sus siglas en inglés) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) -1 en uso clínico de rutina, informes que relacionan el uso de PT con el desarrollo de la hiperglucemia comenzaron a aparecer. Mientras que aproximadamente 1% a 6% de los sujetos infectados por VIH que son tratados con PIs desarrollarán diabetes mellitus, una proporción considerablemente mayor desarrollará resistencia a insulina y la tolerancia a glucosa alterada. En consecuencia, los polipéptidos manipulados descritos en la presente que incluyen un componente peptídico de exendin biológicamente activo (dominio de hormona) , o un fragmento o análogo del mismo, pueden ser útiles en el tratamiento de diabetes inducida por el tratamiento de VIH.

Diabetes autoinmune latente en adultos (LADA, por sus siglas en inglés) . La diabetes autoinmune progresiva, también conocida como diabetes autoinmune latente en adultos (LADA) , se cree que estará presente en aproximadamente 10% de los pacientes diagnosticados con diabetes . tipo 2. Los pacientes con LADA tienen anticuerpos circulantes ya sea contra un antígeno citoplásmico de células de islote o, más frecuentemente, ácido glutámico decarboxilasa. Estos sujetos presentan rasgos clínicos características de diabetes tipo 1 y tipo 2. Aunque la secreción de insulina se conserva mejor en la forma que progresa lentamente que en la forma rápidamente progresiva de la diabetes autoinmune, la secreción de insulina tiende a deteriorarse con el tiempo en sujetos con LADA. En consecuencia, los pplipéptidos manipulados descritos en este documento que incluyen un componente peptídico de exendin biológicamente activo (dominio de hormona) , o un fragmento o análogo del mismo, pueden ser útiles en el tratamiento de LADA.

Hipoglucemia asintomática (HU, por sus siglas en inglés).. Una contrarregulación de glucosa defectuosa puede ocurrir incluso después de un solo episodio reciente de hipoglucemia.. Los sujetos que experimentan episodios repetidos de hipoglucemia con frecuencia pierden su capacidad para reconocer los síntomas típicamente asociados con la hipoglucemia o shock insulínico inminente, una condición llamada "hipoglucemia asintomática" . Debido a que el paciente no aprecia su propio estado, los niveles de glucosa en la sangre pueden caer entonces tan bajo que se produzcan graves problemas neurológicos , incluyendo convulsiones y coma. En consecuencia, los polipéptidos manipulados descritos en este documento que incluyen un componente peptídico de exendin biológicamente activo (dominio de hormona) , o un fragmento o análogo del mismo, pueden ser útiles en el tratamiento de HU.

Enfermedad pulmonar restrictiva. El receptor de GLP 1 se ha localizado en el pulmón. Los exendins pueden provocar una respuesta biológica a través del receptor de GLP-1. En particular, la sarcoidosis es una enfermedad granulomatosa sistémica que implica con frecuencia el pulmón. Aunque clásicamente considerada como una enfermedad, pulmonar restrictiva, la obstrucción de las vías respiratorias se ha convertido en una característica reconocida de la enfermedad en los últimos años. La sarcoidosis puede afectar a la vía aérea en cualquier nivel y cuando la participación incluye las vías aéreas pequeñas, puede parecerse a las enfermedades obstructivas de las vías respiratorias más comunes, como el asma y la bronquitis crónica. En consecuencia, los polipéptidos manipulados descritos en este documento que incluyen un componente peptídico de exendin biológicamente activo (dominio de hormona) , o un fragmento o análogo del mismo, pueden ser útiles en el tratamiento de la enfermedad pulmonar restrictiva porque ese péptido de dominio hormonal puede mejorar la elasticidad del pulmón o retrasar la rigidez.

Síndrome del intestino corto (SBS, por sus siglas en inglés). Exendin-4 ha sido reportado como' eficaz para el tratamiento del síndrome del intestino corto. Véase' unkel et al. Neurogastroenterol . Motil. (2011). SBS esj un grave trastorno clínico caracterizado por diarrea y privación nutricional . El péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) , producido por las células L en el íleo, regula el tránsito intestinal proximal. Cuando resección ileal extensa se produce, como en SBS, GLP-1 puede ser deficiente. La exenatida mejoró el estado nutricional y los síntomas intestinales de pacientes con SBS. En consecuencia, los pacientes con SBS son susceptibles de tratamiento con los polipéptidos manipulados descritos en la presente. Mejora de la frecuencia y forma intestinal y obtención de movimientos intestinales que ya no están relacionados más con la comida se puede lograr. Un beneficio adicional es que la nutrición parenteral total puede ser detenida. Estos compuestos en la presente proporcionarán una mejora sustancial en los hábitos intestinales, el estado nutricional y la calidad de vida de los pacientes de SBS, y pueden reducir aún más la necesidad de una nutrición parenteral y trasplante de intestino delgado.

Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto. i El sujeto está en necesidad de tratamiento para la enfermedad o trastorno. En algunas modalidades, el sujeto en necesidad de tratamiento es obeso. La enfermedad o trastorno es diabetes, sobrepeso, obesidad, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de hígado graso, dislipidemia, enfermedad coronaria, accidente cerebrovascular, SBS o hiperlipidemia , u otras enfermedades descritas aquí. La diabetes puede incluir tipo I, tipo II, gestacional o pre-diabetes , así como diabetes inducida por VIH o esteroides. El método de tratamiento incluye la administración al sujeto de un polipéptido manipulado como el descrito en la presente en una cantidad eficaz para el tratamiento de la enfermedad o trastorno. Particularmente útiles para estas enfermedades son los compuestos descritos en la presente que tienen actividad de disminución de. glucosa (por ejemplo, exendin-4 o sus fragmentos o análogos ligados a un ABD) , con una reducción del peso corporal o reducción de la actividad de ingesta de alimentos, reducción de HbAlc, retraso de vaciamiento gástrico, disminución de glucagón en plasma y/o beneficio de motilidad intestinal.

En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es diabetes, sobrepeso u obesidad, o dislipidemia o hiperlipidemia. El polipéptido manipulado puede incluir polipéptidos ABD y HD1, y opcionalmente un enlazador Kl, en donde HD1 es un exendin o un fragmento o análogo del mismo. En consecuencia, el polipéptido manipulado puede tener una de las siguientes estructuras: HD1-ABD o HD1-L1-ABD.

En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es diabetes, sobrepeso, obesidad, dislipidemia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de hígado graso, SBS o hiperlipidemia . El polipéptido manipulado puede incluir un exendin o un fragmento o análogo del mismo. Por consiguiente, el polipéptido manipulado puede tener una de las siguientes estructuras: HD1-ABD o HD1-L1-ABD . En algunas modalidades, el exendin en el polipéptido manipulado es exendin-4. En algunas modalidades, el fragmento de exendin es un fragmento de exendin-4. En algunas modalidades, el análogo de exendin tiene al menos 70%, por ejemplo 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o incluso más, de identidad con exendin-4. Particularmente útiles para estas enfermedades son compuestos descritos en la presente que tienen actividad de disminución de glucosa (por ejemplo, exendin-4 o sus fragmentos o análogos ligados a un ABD) , con una reducción del peso corporal o reducción de la actividad de ingesta de alimentos, reducción de HbAlc, retraso de vaciamiento gástrico, disminución de glucagón en plasma, o beneficio de motilidad intestinal.

En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es diabetes, sobrepeso, obesidad, dislipidemia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de hígado graso, SBS o hiperlipidemia. El polipéptido manipulado puede incluir un exendin o un fragmento o análogo del mismo. En consecuencia, el polipéptido manipulado puede tener una de las siguientes estructuras: HDl ABD o HD1 LI ABD. En algunas modalidades, el exendin es exendin-4. En algunas modalidades, el fragmento de exendin es un fragmento de exendin-4. En algunas modalidades, el análogo de exendin tiene al menos 70%, por ejemplo 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o incluso más, de identidad con exendin-4. Particularmente útiles para estas enfermedades son los compuestos descritos en la presente que tienen actividad de disminución de glucosa (por ejemplo, exendin-4 o sus fragmentos o análogos ligados a un ABD) , con una reducción del peso corporal o reducción de la actividad de ingesta de alimentos, retraso del vaciado gástrico, disminución de glucagón en plasma o beneficio de motilidad intestinal. El polipéptido manipulado puede incluir sólo el exendin, o un análogo o fragmento del mismo, como un dominio de hormona.

La enfermedad o trastorno puede ser diabetes, sobrepeso, obesidad, dislipidemia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de hígado graso, SBS, hiperlipidemia, mal de Parkinson o enfermedad cardiovascular u otras enfermedades descritas en la presente. El polipéptido manipulado puede incluir un exendin o un fragmento o análogo del mismo. En consecuencia, el polipéptido manipulado puede tener una de las siguientes estructuras: HD1 ABD o HD1 LI ABD. En algunas modalidades, el exendin es exendin-4. En algunas modalidades, el fragmento de exendin es un fragmento de exendin-4. En algunas modalidades, el análogo de exendin tiene al menos 70%, por ejemplo 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o incluso más, de identidad con exendin-4. Particularmente útiles para estas enfermedades son los compuestos descritos en la presente que tienen actividad de disminución de glucosa (por ejemplo, exendin-4 o sus fragmentos o análogos ligados a un ABD) , con una reducción del peso corporal o reducción de la actividad de ingesta de alimentos, reducción de HbAlc, retraso del vaciado gástrico, reducción de glucagón en plasma, o beneficio de motilidad intestinal.

Las enfermedades y trastornos adiciónales que pueden ser tratados por los compuestos y métodos descritos en la presente incluyen diabetes inducida por esteroides, diabetes inducida por tratamiento para VIH, diabetes autoinmune latente en adultos (LADA) , esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD) , hipoglucemia asintomática (HU) , enfermedad pulmonar restrictiva incluyendo sarcoidosis y síndrome metabólico X. El polipéptido manipulado puede incluir un exendin o fragmento o análogo del mismo. En consecuencia, el polipéptido manipulado puede tener una de las siguientes estructuras: HD1-ABD o HD1-L1-ABD. En algunas modalidades, el exendin es exendin-4. En algunas modalidades, el fragmento de exendin es un fragmento de exendin-4. En algunas modalidades, el análogo de exendin tiene al menos 70%, por ejemplo 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o todavía más, de identidad con exendin-4. Particularmente útiles para estas enfermedades son los compuestos descritos en la presente que tienen actividad reductora de glucosa (por ejemplo, exendin-4 o sus fragmentos o análogos enlazados a un ABD) , que tienen reducción de peso corporal o reducción de actividad de consumo de alimento, retraso de vaciado gástrico, reducción de HbAlc, reducción de glucagón en plasma o beneficio en la motilidad intestinal. El polipéptido manipulado puede incluir sólo exendin, o análogo o fragmento del mismo, como un dominio de hormona. La enfermedad o trastorno puede ser diabetes, sobrepeso, obesidad, dislipidemia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de hígado graso, hiperlipidemia, mal de Parkinson o enfermedad cardiovascular u otras enfermedades descritas en la presente.

Enfermedades y trastornos adicionales que pueden ser tratados por los compuestos y métodos descritos en la presente incluyen diabetes inducida por esteroides, diabetes inducida por tratamiento para VIH, diabetes autoinmune latente en adultos (LADA) , esteahepatitis no alcohólica (NASH) y enfermedad de hígado graso rio alcohólica (NAFLD) , hipoglucemia asintomática (HU) , enfermedad pulmonar restrictiva incluyendo sarcoidosis y síndrome metabólico X. Particularmente útiles para estas enfermedades son los compuestos descritos en la presente que tienen actividad reductora de glucosa (por ejemplo, exendin-4 o sus fragmentos o análogos enlazados a un ABD) .

V. Ensayos , Los métodos para la producción y ensayo de polipéptidos manipulados descritos en la presente están disponibles generalmente para el experto en la técnica. Además, en la presente se describen métodos específicos así como en las solicitudes de patente y otras referencias citadas en la presente, las cuales se incorporan por referencia para este propósito adicional.

Ensayos de unión y funcionales al receptor de GLP-1: La actividad y afinidad de unión al receptor de GLP-1 pueden medirse en cualquier número de métodos conocidos. Por ejemplo, en un método la actividad de unión se mide usando un ensayo de desplazamiento de unión en el cual la, fuente de receptor es membranas celulares RINm5F, y el ligando es [125I] GLP-1 o exendin(l-39) yodado o exendin ( 9-39) yodado. Membranas de células RINm5F homogeneizadas son incubadas en 20 mM de regulador de pH HEPES con 40,000 cpm de rastreador de [125I] GLP-1 (o exendin), y concentraciones variables del compuesto de prueba durante 2 horas a 23 °C con mezcla constante. Las mezclas de reacción se filtran a través de almohadillas de filtro de vidrio pre-sumergidas en solución de PEI al 0.3% y enjuagadas con solución salina de pH regulado con fosfato helada. Los recuentos unidos se determinan usando un contador por centelleo. Las afinidades de unión se calculan usando software GraphPad Prism® I I I (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) .

Los ensayos in vitro para activación de receptor de GLP-1 funcional se pueden llevar a cabo usando métodos conocidos y células y tejidos. Por ejemplo, la estimulación por exendin-4 de células portadoras de receptor de GLP-1 puede inducir un incremento en la activación de adenilato ciclasa, síntesis de cAMP, despolarización de membrana, elevación en calcio intracelular e incremento en la secreción de insulina inducida por glucosa. Véase, por ejemplo, Holz et al., 1995, J. Biol. Chem. 270 (30) : 17749-57. Los ensayos a base de células que usan la línea de células rMTC 6-23 (clon 6) se pueden usar para determinar la actividad agonista del receptor de GLP-1 de un compuesto con base en el cAMP generado. En una modalidad del bioensayo la actividad del agonista del receptor de GLP-1 de un compuesto se determina cuantitativamente por correlaciones a producción de cAMP en ensayos a base de células con células 6-23 (clon 6) . El ensayo a base de células usa células 6-23 (clon 6) vivas. Las células 6-23 (clon 6) están disponibles de l Colección Americana de Tipos de Cultivos como ATCC® No. CRL-1607™ y la Colección Europea de Cultivos Celulares como ECACC No. 87042206. En otra modalidad el ensayo a base de células es un ensayo de fluorescencia resuelto en tiempo homogéneo (HTRF®) . Los kits de HTRF® están disponibles comercialmente de Cisbio International (Bedford, Mass.) . Los métodos para usar los kits HTRF® se conocen en la técnica y los kits incluyen generalmente manuales de instrucciones, por ejemplo, sobre cómo preparar muestras, estándares, curvas de calibración y llevar a cabo experimentos. Los ensayos a base de células por fluorescencia resulta en tiempo homogéneo se describen en la patente de E.U.A. No. 5,527,684, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente, y el documento No. de referencia 62AM4PEB rev02 (agosto de 2007) disponible de Cisbio HTRF® Product Center. Véase www.htrf.com/products/gper/camp/, cuya descripción se incorpora por referencia en la presente. En un método preferido el bioensayo usa las células 6-23 (clon 6) de carcinoma de tiroides de rata en un ensayo a base de células usando el kit de ensayo dynamic 21,000 cAMP HTRF®, disponible de Cisbio como NO. de catálogo 62AM4PEB. Los estándares y calibraciones HTRF® se preparan siguiendo las instrucciones en el kit. Los ensayos pueden llevarse a cabo con o sin la presencia de albúmina.

Los ensayos in vivo para la actividad y duración de acción y farmacociné ica pueden hacerse usando métodos conocidos. Por ejemplo, la duración se puede llevar a cabo usando una prueba de tolerancia a glucosa oral (OGTT, por sus siglas en inglés) en la cual el fármaco se administre al sujeto en un punto de tiempo deseado antes de que la glucosa se administre oralmente (para medir la duración de acción del fármaco; OGTT DOA) y los niveles de glucosa en sangre se miden (por ejemplo, se hace fácilmente en ratones) . La actividad y duración también se pueden medir usando una prueba de tolerancia a glucosa intravenosa (IVGTT, por sus siglas en inglés) en la cual el fármaco se administre al sujeto en un punto de tiempo deseado antes de que la glucosa se administre IV (IVGTT DOA) y los niveles de glucosa en sangre son medidos (por ejemplo, pueda hacerse fácilmente en ratas) . Los compuestos manipulados preferidos tienen un efecto deseado en glucosa en sangre de al menos 24 horas de duración después de una sola dosis de fármaco, de preferencia al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, y al menos 1 semana después de que se dé la dosis individual de fármaco.

Por ejemplo, el polipéptido de prueba se inyecta subcutáneamente en t=0 inmediatamente después de una muestra de línea de base en ratones hembra NIH/Swiss. Se toman muestras de sangre en periodos de tiempo deseados tales como t=2, 4 y 8 horas durante el día 1 y después diariamente a través de día 5 o a través de día 7 o más. La glcuosa en sangre se mide con un OneTouch®Ultra® (LifeScan, Inc., a Johsnon & Johsnon Company, Milpitas, CA) . Para una determinación de duración de actividad (DOA, por sus siglas en inglés) , tal como para actividad de control de glucosa de un fármaco, se puede llevar a cabo un OGTT o IVGTT en el punto deseado después de la administración del fármaco. El peso corporal también puede ser medido, así como el consumo de alimento, u otro parámetro farmacológico o farmacocinético . Por ejemplo, ratones NIH/Swiss hembra (8-20 semanas de edad) se alojan por grupos con un ciclo de 12:12 horas de luz : oscuridad con luces encendidas en 0600. Agua y una ruta de alimento para ratones granulada estándar estuvieron disponibles ad libitum, excepto cuando se indique. La mañana del experimento, los animales se dividen en jaulas con 3 ratones/j aula . En tiempo = 0 minuto, se toma una muestra de glucosa en sangre e inmediatamente es seguida por una inyección intraperitoneal de vehículo compuesto en una cantidad que varía de aproximadamente 1 nmol/kg a 25 nmol/kg. La glucosa en sangre puede medirse después de 30, 60, 120, 180 y 240 minutos y diariamente durante una semana o más después de la dosis individual. En una variación del experimento, se proporcionan dosis diariamente o incluso semanalmente durante un periodo más largo tal como 14 ó 28 días. El porcentaje de pre-tratamiento se calcula al dividir la glucosa en sangre en el punto de tiempo medido, por ejemplo, 60 minutos o día 1, entre la glucosa en sangre en tiempo = 0 minuto. Los efectos de tratamientos significativos se identificaron por A OA (p<0.05). Cuando existe una diferencia significativa, medias de prueba se comparan con la media de control usando la prueba de Dunnett (Prim® v. 4.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA) . La glucosa en sangre puede medirse con el OneTouch® Ultra® (LifeScan, Inc., a Johnson & Johnson Company, Milpitas, CA) . * p<0.05 vs . Vehículo de control; ANOVA, prueba de Dunnétt . Otros parámetros también pueden ser medidos.

Ensayo in vivo para inhibición de consumo de alimento: Los polipéptidos manipulados pueden probarse para su duración y grado de supresión de apetito y para su duración y grado de efecto en pérdida de peso corporal en varios métodos conocidos. Por ejemplo, los polipéptidos pueden probarse para supresión de apetito en el ensayo de consumo de alimento de ratón y para su efecto en ganancia de peso corporal en ratones de obesidad inducida por dieta (DIO) . Un protocolo experimental para estos ensayos se describe a continuación.

Por ejemplo, ratones NIH/Swiss hembra (8-24 semanas de edad) se alojan por grupos con un ciclo de luz : oscuridad de 12:12 horas con luces encendidas en 0600. Agua y dieta de alimento para ratones granulado estándar están disponibles ad lijbitum, excepto según se indique. Los animales son ayunados iniciando a aproximadamente 1,500 horas, 1 día antes del experimento. La mañana del experimento, los animales se dividen en grupos experimentales. En un estudio típico, n=4 jaulas con 3 ratones/j aula . En tiempo = 0 minuto, a todos los animales se les administra una inyección intraperitoneal de vehículo o compuesto de prueba, típicamente en una cantidad que varía de alrededor de 2 nmol/kg a 75 nmol/kg, e inmediatamente se les da una cantidad pre -pesada (10-15 g) de alimento estándar. El alimento se retira y se pesa en varios tiempos, típicamente 30, 60 y 120 minutos o más1, tal como diariamente, para determinar la cantidad dé alimento consumida (Morley, Flood et al., 1994, Am. J. Physiol. 267: R178-R184). El consumo de alimento se calcula al restar el peso del alimento que . queda en el punto de tiempo de por ejemplo 30 ó 60 minutos, del peso del alimentp provisto iniciálmente en tiempo =0. Efectos de tratamiento significativos se identifican por AMOVA (p<0.05). Cuando existe una diferencia significativa, las medias de prueba se i comparan con la media de control usando la de pruéba Dunnett (Prism® v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA) . El peso corporal también puede ser medido.

Ensayos de peso corporal, redistribución de grasa y masa corporal magra: Los ensayos para peso corporal y efectos relacionados también se pueden llevar a cabo cómo sigue. Obesidad inducida por dieta (DIO) en la rata Sprague-Dawley es un modelo valioso para el estudio de obesidad y regulación de homeostasis de energía. Estas ratas fueron desarrolladas a i partir de una línea de ratas (Crl : CD® (SD) BR) que son propensas a volverse obesas en una dieta relativamente alta en grasa y energía. Véase, por ejemplo, Levin, 1994, Am. J. 1 ' Physiol. 267 :R527-R535, Levin et al . , 1997, Am. J. Physiol. 273 :R725-R730. Ratas macho DIO se obtienen de Charles River Laboratories, Inc. ( ilmington, MA) . Las ratas son alojadas individualmente en jaulas tipo caja de zapatos a 22 °C en un ciclo de luz y oscuridad de 12/12 horas. Las ratas se mantienen ad libitum en una dieta moderadamente alta en grasa (32% Kcal de grasa; Research Diets D1226B) . Los animales logran típicamente un peso corporal medio de aproximadamente 500 g. Ratas DIO Levin son habituadas al ambiente de jaula durante 7 días. Durante las 3 noches de habituación, los animales reciben una sola inyección intraperitoneal (IP) de vehículo. El día de la prueba, a las ratas se les administra una sola inyécción IP de compuesto o vehículo (por ejemplo, 10% de DMSO) en el inicio del ciclo de oscuridad. El consumo de alimento se mide por un sistema de medición de consumo de alimento automático (BioDAQ, Research Diets) a intervalos de 5 segundos a lo largo del curso del estudio. El peso corporal se registra nocturnamente.

La composición corporal puede medirse antes de y después de tratamiento con fármaco usando RMN (Echo Medical Systems, Houston, TX) . Para mediciones de composición corporal, las ratas son puestas brevemente (~1 min) en un tubo de plexiglás-ventilado que después fue insertado en una máquina de RMN para roedores especializada. Esto hizo posible el cálculo de cambios en gramos reales de grasa y tejido magro seco (por ejemplo, gramos de grasa corporal después de tratamiento - gramos de grasa corporal en línea: de base = cambio en gramos de grasa corporal) y los cambios en el % de composición corporal para grasa y tejido magro seco (por ejemplo, % de grasa corporal después de tratamiento -% de grasa corporal en línea de base = cambio en % de grasa corporal) . Todos los datos se representan como media ± SEM. El análisis de varianza (ANOVA) y pruebas post-hoc se usan para probar la diferencia de grupo. Un valor P <0.05 se considera significativo. Análisis estadístico y graficado se llevan a cabo usando PRISM® 4 para Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) . Las gráficas y resultados se presentan típicamente como cambios corregidos por vehículo en porcentaje de peso corporal, grasa corporal y cambios en proteínas corporales.

VI. Composiciones farmacéuticas En un aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen compuestos descritos en la presente, en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, portador) . El término "portador farmacéuticamente aceptable", según se usa en la presente se refiere a excipientes farmacéuticos, por ejemplo, sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmacéutica y fisiológicamente aceptables adecuadas para aplicación enteral o parenteral que no reaccionan de forma dañina con el agente activo. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, soluciones de sal (por ejemplo, solución de Ringer y similares), alcoholes, aceites, gelatinas y carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, esteres de ácido graso, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidina . Estas preparaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influenciar la presión osmótica, reguladores de pH, sustancias colgantes y/o aromáticas y similares que no reaccionen en forma dañina con los compuestos de la invención.

En un aspecto más, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un polipéptido manipulado como el descrito en la presente en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición farmacéutica es una composición farmacéutica oral como la descrita en la presente. En algunas modalidades, la composición farmacéutica es una composición farmacéutica de larga duración. El término "larga duración" en el contexto de administración de una composición farmacéutica se refiere a duración de acción. En consecuencia, una composición farmacéutica de larga duración puede administrarse a intervalos de, por ejemplo, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes o todavía más. En una modalidad, la administración es dos veces al día (es decir, "dos veces diariamente"). En una modalidad preferida, la administración es una vez al día (es decir, "una vez diariamente"). En modalidades que más se prefieren, la administración es una vez por semana (es decir, "una vez semanalmente" ) . En algunas modalidades, el polipéptido manipulado se selecciona de los polipéptidos manipulados mostrados en las tablas 2, 3A y 3B en la presente. En algunas modalidades, el polipéptido manipulado se selecciona de los polipéptidos manipulados mostrados en las tablas 2 y 3A en la presente. En algunas modalidades, el polipéptido manipulado se selecciona de los polipéptidos manipulados mostrados en la tabla 2 en la presente.

A. Formulaciones Los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden administrarse solos o pueden ser coadministrados a un sujeto. Co-administración intenta incluir la administración simultánea o secuencial de los compuestos individualmente o en combinación (más de un compuesto) . Por ejemplo, se ha encontrado que la obesidad puede ser tratada benéficamente con una terapia de combinación que incluya leptina (por ejemplo, metreleptina) y una amilina (por ejemplo, pramlintida) . Véase, por ejemplo, solicitud de E.U.A. publicada NO. 2008/0207512. En consecuencia, un polipéptido manipulado descrito en la presente que incluya un ABD y un compuesto exendin útil para el tratamiento de, por ejemplo, obesidad y sobrepeso, se puede administrar solo para lograr este tratamiento o co-administrarse ya sea con una leptina o agonista de leptina, por ejemplo, metreleptina y/o una amilina o agonista de amilina, por ejemplo, pramlintida.

En algunas modalidades, las formulaciones y métodos descritos en la presente proporcionan además que el polipéptido manipulado de exendin, análogo de exendin o agonista de análogo de exendin se co-administre con uno o más agentes antidiabéticos, tales como agentes anti-hiperglucemia, por ejemplo, insulina (incluyendo insulinas regulares, de corta acción, de larga acción y basal) , amilinas, pramlintida, metformina y tiazolidindionas (incluyendo rosiglitazona y poioglitazona) .

En algunas modalidades, las formulaciones y métodos descritos en la presente proporcionan además que el polipéptido manipulado de exendin, análogo de exendin o agonista de análogo de exendin se co-administre con uno o más agentes reductores de colesterol y/o triglicéridos . Ejemplos de agentes incluyen inhibidores de HMG CoA reductasa (por ejemplo, atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina) ; secuestrantes de ácidos biliares (por ejemplo, colesevelam, colestiramina, colestipol) ; fibratos (por ejemplo, fenofibrato, clofibrato, gemfibrozil) ; ezetimibe, ácido nicotínico, probucol, una combinación de lovastatina/niacina ; una combinación de atorvastatina/amlodipino; y una combinación de simvastatina/ezetimibe .

La presente invención proporciona la composición para usarse como un medicamento, es decir, para usarse en terapia, toda vez que el compuesto exendin es un compuesto terapéuticamente activo, y conserva sorprendentemente actividad cuando se fusiona a ABD. Las composiciones que incluyen un polipéptido manipulado, ya sea en forma líquida o seca, y opcionalmente al menos un portador y/o ¡ excipiente farmacéuticamente aceptable, también se contemplan específicamente y se ejemplifican en la presente.

La composición tiene la capacidad de asociarse con albúmina iñ vivo o in vitro. En ciertos casos, puede ser benéfico formar un complejo de. la composición con albúmina fuera de un organismo vivo, es decir, añadir albúmina exógena a la composición. Esta composición puede ser liofilizada, proporcionando una formulación que sea adecuada para almacenamiento a temperatura ambiente. Así, la presente invención también proporciona una composición como la definida arriba que incluya además albúmina, tal como albúmina sérica humana, y la cual puede opcionalmente estar en forma seca . · , La co-administración puede lograrse al administrar por separado el polipéptido manipulado de exendin, agonista de exendin o análogo de exendin con el segundo agente, o al administrar una sola formulación farmacéutica que incluya el polipéptido manipulado de exendin, agonista de exendin o agonista de análogo de exendin y el segundo agente. Los regímenes de dosificación adecuados para los segundos agentes se conocen generalmente en la técnica.

Las preparaciones también pueden ser coadministradas, cuando se desee, con otras sustancias activas (por ejemplo, para reducir degradación metabólica) como se conoce en la técnica u otros agentes terapéuticamente activos. Un polipéptido manipulado de exendin descrito en la presente puede administrarse con otros agentes anti-diabetes o anti -obesidad activos, tales como compuestos de leptina o agonistas de leptina y amilina o agonistas de amilina, por ejemplo, las amilinas, incluyendo davalintida y sus análogos.

Amilinas. La amilina es una hormona péptida sintetizada por células ß pancreáticas que es co-secretada con insulina en respuesta a consumo de nutrientes. La secuencia de amilina es altamente conservada a través de especies de mamíferos, con similitudes estructurales con el péptido relacionado con gen de calcitonina (CGRP, por sus siglas en inglés) , las calcitoninas , las intermedinas y adrenomedulina, como se conoce en la técnica. Las acciones glucorreguladoras de amilina complementan aquellas de insulina al regular la velocidad de aparición de glucosa en la circulación mediante supresión de la secreción de glucagón estimulada por nutrientes y reducción de la velocidad del vaciado gástrico. En pacientes tratados con insulina que tienen diabetes, la pramlintida, un análogo sintético y equipotente de amilina humana, reduce las excursiones de glucosa postprandial al suprimir la secreción de glucagón postprandial elevada inadecuadamente y hacer más lento el vaciado gástrico. Las secuencias de amilina de rata, amilina humana y pramlintida son las siguientes: KCNTATCATQRLANFLVRSS LGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO: 6); KCNTATCATQRLA FLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO : 7) ; KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO : 8) .

Davalintida. La davalintida, también conocida como "AC-2307" es un potente agonista de amilina útil en el tratamiento de una variedad de indicaciones de enfermedad. Véase WO 2006/083254 y WO 2007/114838, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad y para todos los propósitos. La davalintida es un péptido quimérico, que tiene una región de asa N-terminal de amilina o calcitonina y análogos de las mismas, una región alfa-helicoidal de por lo menos una porción de una región alfa-helicoidal de calcitonina o análogos de la misma o una región alfa-helicoidal que tiene una porción de una región alfa-helicoidal de amilina y una región alfa-helicoidal de calcitonina o análogo de la misma, y una región de cola C-terminal de amilina o calcitonina. Las secuencias de calcitonina humana, calcitonina de salmón y davalintida son las siguientes: CGNLSTC LGTYQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO : 9) ; CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP (SEQ ID. NO: 10) ; KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO: 11) .

Sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que las amilinas y davalintida, y fragmentos y análogos de las mismas, pueden requerir amidación C-terminal para provocar una respuesta biológica completa. Se entiende que los compuestos de amilina tales como aquellos descritos en la presente que incluyen amilinas y/o davalintida, y fragmentos y análogos de las mismas, pueden amidarse en el C-terminal.

Los "compuestos agonistas de amilina" incluyen péptidos de amilina activos, péptidos análogos de amilina y otros compuestos (por ejemplo, moléculas pequeñas) que tienen actividad agonista de amilina. Los "compuestos agonistas de amilina" pueden derivarse de fuentes naturales, pueden ser sintéticos o pueden derivarse de técnicas de ADN recombinante . Los compuestos agonistas de amilina tienen actividad de unión al receptor agonista de amilina y pueden incluir aminoácidos (por ejemplo, naturales, no naturales o una combinación de los mismos) , péptido miméticos, porciones químicas y similares. El experto en la técnica reconocerá compuestos agonistas de amilina usando ensayos de unión a receptor de amilina o midiendo la actividad agonista de amilina en ensayos de músculo soleo. En una modalidad, los compuestos agonistas de amilina tendrán una IC50 de aproximadamente 200 nM o menos, alrededor de 100 nM o menos, o aproximadamente 50 nM o menos, en un ensayo de unión a receptor de amilina, tal como aquél descrito en la presente, en la patente de E.U.A. No. 5,686,411 y la publicación de E.U.A. No. 2008/0176804, cuyas descripciones se incorporan por referencia en la presente en sus totalidades y para todos los propósitos. En una modalidad, los compuestos agonistas de amilina tendrán una EC5o de aproximadamente 20 nM o menos, alrededor de 15 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos o alrededor de 5 nM o menos en un ensayo de músculo soleo, tal como aquél descrito en la presente y en la patente de E.U.A. No. 5,686,411. En una modalidad, el compuesto agonista de amilina tiene al menos 90% o 100% de identidad de secuencia con 25,28,29Pro-amilina humana. En una modalidad, el compuesto agonista de amilina es una quimera péptida de amilina (por ejemplo, amilina humana, amilina de rata y similares) y calcitonina (por ejemplo, calcitonina humana, calcitonina dé salmón, y similares) . Compuestos agonistas de amilina adecuados y ejemplares también se describen en la publicación de E.U.A. No. 2008/0274952, cuya descripción se incorpora por referencia en la presente en su totalidad y para todos los propósitos .

Cuando se co-administran con otro agente activo, los compuestos pueden ser administrados simultáneamente o secuencialmente, formulados juntos o por separado. Ya que los compuestos manipulados de la presente son inherentemente de larga acción, son adecuados para administración una vez al día, una vez a la semana o más. En consecuencia, el otro agente puede ser administrado ya sea en una o varias dosis, por ejemplo, una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, una vez a la semana, según se requiera, durante el periodo de dosis del polipéptido manipulado por exendin, por ejemplo, una vez por semana.

Las formulaciones de un solo o de varios usos de otros agentes tales como compuestos de amilina han sido reportadas. Por ejemplo, la pramlintida ha sido formulada para y administrada exitosamente para administración una, dos y tres veces al día para tratar diabetes y para tratar obesidad.

Estos compuestos farmacéuticos pueden formularse con portadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables así como cualesquiera otros adyuvantes y excipientes conocidos de acuerdo con técnicas convencionales tales como aquellas descritas en Remington ' s Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin. Véase también Wang et al. (1988) J. of Parenteral Sci. y Tech., Technical No. de reporte 10, Supp . 42:2 S.

En general, los polipéptidos manipulados pueden formularse en una composición farmacéutica segura y estable para su administración a un paciente. Las formulaciones farmacéuticas contempladas para usarse en los métodos de la invención pueden incluir aproximadamente 0.01 a 1.0% (p/v) , en ciertos casos 0.05 a 1.0%, del polipéptido manipulado, aproximadamente 0.02 a 0.5% (p/v) de un regulador de pH de acetato, fosfato, citrato o glutamato que permite un pH final de la composición de aproximadamente 3.0 a alrededor de 7.0; aproximadamente 1.0 a 10% (p/v) de un tonificador de i carbohidrato o alcohol polihídrico y, opcionalmente , aproximadamente 0.005 a 1.0% (p/v) de un' conservador i seleccionado del grupo de m-cresol, alcohol bencílico, metil, etil, propil y butilparabenos y fenol. Este conservador se incluye generalmente si el péptido formulado va a incluirse en un producto de uso múltiple.

En modalidades particulares, una formulación farmacéutica de los presentes polipéptidos manipulados puede contener una gama de concentraciones de los compuestos, por ejemplo, entre aproximadamente 0.01% a alrededor de 98% p/p, o entre alrededor de 1 a aproximadamente 98% p/p, o de preferencia entre 80% y 90% p/p, o preferiblemente entre aproximadamente 0.01% a alrededor de 50% p/p, o más preferiblemente entre alrededor de 10%T a aproximadamente 25% p/p en estas modalidades. Una cantidad suficiente de agua para inyección puede usarse para obtener la concentración de solución deseada.

Agentes tonificadores adicionales tales como cloruro de sodio, así como otros excipientes conocidos, también 'pueden estar presentes, si se desea. En algunos casos, estos excipientes son útiles en el mantenimiento de la tonicidad total del compuesto. Un excipiente puede incluirse en las formulaciones actualmente descritas en varias concentraciones. Por ejemplo, un excipiente puede incluirse en la gama de concentraciones de 0.02% a alrededor de 20% p/p, de preferencia entre alrededor de 0.02% y 0.5% p/p, aproximadamente 0.02% a alrededor de 10% p/v, o alrededor de 1% a aproximadamente 20% p/p. Además, de manera similar a las propias formulaciones presentes, un excipiente puede incluirse en forma sólida (incluyendo en polvo), líquida, semisólida o gel .

Las formulaciones farmacéuticas pueden estar compuestas en varias formas, por ejemplo, sólida, líquida, semisólida o líquida. El término "sólida", según se usa en la presente, intenta abarcar todos los usos normales de este término incluyendo, por ejemplo, polvos y formulaciones liofilizadas . Las formulaciones actualmente descritas pueden ser liofilizadas .

Los términos regulador de pH, solución reguladora de pH y solución de pH regulado, cuando se usan con referencia a concentración de iones de hidrogenó o pH, se refieren a la capacidad de un sistema, particularmente una solución acuosa, para resistir un cambio de pH después de añadir ácido o álcali, o después de la dilución con solvente. Característica de las soluciones de pH regulado, las cuales sufren pequeños cambios de pH después de la adición de ácido o base, es la presencia ya sea de un ácido débil o una sal del ácido débil, o una base débil y una sal de la base débil. Un ejemplo del primer sistema es ácido acético y acetato de sodio. El cambio de pH es ligero siempre y cuando la cantidad de ion de hidronio o hidroxilo añadida no exceda la capacidad del sistema regulador de pH para neutralizarla.

Como se describe en la presente, una variedad de vehículos líquidos son adecuados para usarse en las formulaciones de polipéptidos manipulados, por ejemplo, agua o una mezcla o suspensión de solvente acuoso/orgánico.

La estabilidad de una formulación de polipéptidos manipulados para usarse como se describe en la presente se incrementa al mantener el pH de la formulación en un intervalo determinado por métodos conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, el pH de la formulación se mantiene en el intervalo de aproximadamente 3.5 a 5.0, o alrededor de 3.5 a 6.5, en algunas modalidades de aproximadamente 3.7 a 4.3, o alrededor de 3.8 a 4.2. En algunas modalidades, el pH puede ser de aproximadamente 4.0, alrededor de 5.0, aproximadamente 6.0, alrededor de 7.0, aproximadamente 8.0, alrededor de 9.0 o todavía más alto. En algunas modalidades, el pH puede estar en el intervalo fisiológico, pH 6-8, de preferencia pH 7-7.6.

En ciertas modalidades, el regulador de pH con el polipéptido manipulado es un regulador de pH de acetato (de preferencia a una concentración de formulación final de aproximadamente 1-5 a alrededor de 60 mM) , regulador de pH de fosfato (de preferencia a una concentración de formulación final de aproximadamente 1-5 a alrededor de 30 mM) o regulador de pH de glutamato (de preferencia a una concentración de formulación final de aproximadamente 1-5 a alrededor de 60 mM) . En algunas modalidades, el regulador de pH es acetato (de preferencia a una concentración de formulación final de aproximadamente 5 a alrededor de 30 mM) .

Se puede incluir el estabilizador en las formulaciones pero no necesariamente se requiere. Sin embargo, si se incluye, un estabilizador útil en la práctica de la presente invención es un carbohidrato ó un alcohol polihídrico. Un estabilizador adecuado útil en la práctica de la presente invención es de aproximadamente 1.0 a 10% (p/v) de un carbohidrato de alcohol polihídrico. Los alcoholes polihídricos y carbohidratos comparten la misma característica en sus esqueletos, es decir, -CHOH-CHOH-, que es responsable de estabilizar las proteínas. Los alcoholes polihídricos incluyen compuestos tales como sorbitol, manitol, glicerol y polietilenglicoles (PEGs) . Estos compuestos son moléculas de cadena recta. Los carbohidratos, tales como ma osa, ribosa, sucarosa, fructosa, trehalosa, maltosa, inositol y lactosa, por otro lado, soñ moléculas cíclicas que pueden contener un grupo ceto o aldehido. Estas dos clases de compuestos han demostrado ser efectivas para estabilizar proteínas contra desnaturalización causada por temperatura elevada y por procesos de congelación/descongelación o lifofilización . Los carbohidratos adecuados incluyen: galactosa, arabinosa, lactosa o cualquier otro carbohidrato que no tenga un efecto adverso en un paciente diabético, es decir, el carbohidrato no es metabolizado para formar concentraciones inaceptablemente grandes de glucosa en la sangre. Estos carbohidratos se conocen bien en la técnica como adecuados para diabéticos. Sacarosa y fructosa son adecuados para usarse con el compuesto en aplicaciones no diabéticas (por ejemplo, tratar obesidad) .

En ciertas modalidades, si se incluye un estabilizador, el compuesto se estabiliza con un alcohol polihídrico tal como sorbitol, manitol, inositol, glicerol, xilitol y copolímero de polipropileno/etilenglicol, así como varios polietilenglicoles (PEG) de peso molecular 200, 400, 1450, 3350, 4000, 6000, 8000 y todavía más alto) . El alcohol polihídrico que se prefiere en algunas modalidades es manitol. Otra característica útil de las formulaciones liofilizadas de la presente invención es el mantenimiento de la tonicidad de las formulaciones liofilizadas descritas en la presente con el mismo componente de formulación que sirve para mantener su estabilidad. En algunas modalidades, manitol es el alcohol polihídrico preferido usado para este propósito.

La Farmacopea de los Estados Unidos (USP, por sus siglas en inglés) indica que los agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas deben añadirse a preparaciones contenidas en recipientes de varias dosis. Deben estar presentes en concentración adecuada en el momento de uso para evitar la multiplicación de microorganismos introducidos accidentalmente en la preparación mientras se retira una porción de los contenidos con una aguja y jeringa hipodérmica, o usando otros medios invasivos para suministro, tales como inyectores de pluma. Los agentes antimicrobianos deben evaluarse para asegurar compatibilidad con todos los demás componentes de la fórmula, y su actividad debe evaluarse en la fórmula total para asegurar que un agente particular que sea efectivo en una formulación no sea inefectivo en otra. No es poco común encontrar que un agente antimicrobiano particular sea efectivo en una formulación pero no efectivo en otra formulación .

Un conservador es, en el sentido farmacéutico común, una sustancia que previene o inhibe el crecimiento microbiano se puede añadir a las formulaciones farmacéuticas para este fin para evitar un deterioro consecuente de la formulació por microorganismos. Aunque la cantidad del conservador no es grande, puede no obstante afectar la estabilidad general del péptido. Aunque el conservador para usarse en las composiciones farmacéuticas puede variar de 0.005 a 1.0% (p/v) , en algunas modalidades, el intervalo para cada conservador, solo o en combinación con otros, es: alcohol bencílico (0.01-1.0%) o m-cresol (0.1-0.6)i%) o fenol (0.1-0.8%) o combinación de metil (0.05-0.25%) y etil o propil o butil (0.005%-0.03%) parabenos . Los parabenos son' ésteres alquílicos inferiores de ácido para-hidroxibenzoico. Una descripción detallada de cada conservador se muestra en Remington's Pharmaceutical Sciences (Id.).

Los polipéptidos manipulados pueden no tener una tendencia a adsorberse sobre el vidrio en un recipiente de vidrio cuando estén en una forma líquida, por lo tanto, podría no requerirse un tensioactivo para estabilizar más la formulación farmacéutica. Sin embargo, con respecto a compuestos que sí tienen esta tendencia cuando están en forma líquida, se podría usar un tensioactivo en su formulación. Estas formulaciones pueden ser luego liofilizadas . Los tensioactivos causan frecuentemente desnaturalización de proteínas, tanto de interrupción hidrófoba como por separación por puentes de sal. Concentraciones relativamente bajas de tensioactivo pueden ejercer una potente actividad desnaturalizante, debido a las fuentes interacciones entre porciones tensioactivas y los sitios reactivos en proteínas. Sin embargo, el uso juicioso de esta interacción puede estabilizar proteínas contra desnaturalización interfacial o superficial. Los tensioactivos que podrían estabilizar más al polipéptido manipulado pueden estar presentes opcionalmente en el intervalo de alrededor de 0.001 a 0.3% (p/v) de la formulación total e incluyen polisorbato 80 (es decir, monooletato de polioxietilen (20) sorbitan) , CHPAS® (es decir, 3- [ (3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propansulfonato) , Brij® (por ejemplo, Brij® 35, que es (éter laürílico de polioxietileno (23) ) , poloxámero, u otro tensioactivo no iónico.

También puede ser deseable añadir cloruro de sodio u otra sal para ajustar la tonicidad de la formulación farmacéutica, dependiendo del tonificador seleccionado. Sin embargo, esto es opcional y depende de la formulación particular seleccionada. Las formulaciones parenterales pueden ser de preferencia isotónicas o sustancialmente isotónicas .

Un vehículo preferido para productos parenterales es agua. Agua de calidad adecuada para administración parenteral puede prepararse ya sea por destilación o por osmosis inversa. Agua para inyección es el vehículo acuoso preferido para usarse en las formulaciones farmacéuticas.

Es posible que otros ingredientes puedan estar presentes en las formulaciones farmacéuticas. Estos ingredientes adicionales pueden incluir, por ejemplo, agentes humectantes, emulsionantes, aceites, antioxidantes, agentes de volumen, modificadores de tonicidad, agentes quelantes, iones metálicos, -vehículos oleaginosos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana, gelatina o proteínas) y un zwiterión (por ejemplo, un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina) . Además, soluciones poliméricas, o mezclas con polímeros proporcionan la oportunidad de una liberación controlada del péptido. Estos ingredientes adicionales, por supuesto, no deben afectar adversamente la estabilidad total de la formulación farmacéutica de la presente invención.

Los recipientes también son una parte integral de la formulación de una inyección y pueden considerarse un recipiente, toda vez que no hay recipiente que sea totalmente inerte, o que no de alguna manera afecte el líquido que contiene, particularmente si el líquido es acuoso. Por lo tanto, la selección de un recipiente para una inyección particular debe basarse en una consideración de la composición del recipiente, así como de la solución, y el tratamiento para el cual será sometido. La adsorción del péptido a la superficie de vidrio del frasco también puede minimizarse, si es necesario, mediante el uso de vidrio de borosilicato, por ejemplo, vidrio de borosilicato Wheaton tipo I #33 (Wheaton Type 1-33) o su equivalente (Wheaton Glass Co.). Otros proveedores de frascos y cartuchos de vidrio de borosilicato similares aceptables para fabricación incluyen Kimbel Glass Co., West Co., Bunder Glas GMBH and Form a Vitrum. Las propiedades biológicas y químicas del compuesto pueden establecerse mediante formulación y liofilización en un frasco para suero de borosilicato Wheaton tipo 1-33 hasta una concentración final de 0.1 mg/ml y 10 mg/ml del compuesto en presencia de 5% de manitol, y 0.02% de Tween 80.

Para formulaciones que serán suministradas por inyección, para permitir la introducción de una aguja desde una jeringa hipodérmica en un frasco de varias dosis y proporcionar resellado tan pronto como la aguja sea retirada, el extremo abierto de cada frasco es de preferencia sellado con un dispositivo de cierre de tapón de caucho mantenido en su lugar por una banda de aluminio.

Los tapones para frascos de vidrio, tales como West 4416/50, 4416/50 (cara de teflón) y 4406/40, Abbott 5139 o cualquier tapón equivalente pueden usarse como el dispositivo de cierre para farmacéuticos para inyección. Para formulaciones que incluyen agentes anti-obesidad péptidos, estos tapones son compatibles con el péptido así como con los demás componentes de la formulación. Los inventores también descubrieron que estos tapones pasan la prueba de integridad de tapón cuando se prueban usando patrones de uso de pacientes, por ejemplo, el tapón puede soportar al menos aproximadamente 100 inyecciones. Como alternativa, el péptido puede ser liofilizado en frascos, jeringas o cartuchos para reconstitución subsecuente. Las formulaciones líquidas de la presente invención pueden ser llenadas en cartuchos de una o dos cámaras, o jeringas de una o dos cámaras.

Cada uno de los componentes de la formulación farmacéutica descrita arriba se conoce en la técnica y se describe en Pharmaceutical Dosage Forms: . Parenteral Medications, vol . 1, 2 a edición, Avis et al. Ed. , Mercel Dekker, Nueva York, N.Y. 1992, la cual se incorpora por referencia en su totalidad en la presente.

El proceso de fabricación para las formulaciones líquidas anteriores implica generalmente etapas de mezcla, filtración estéril y llenado. El procedimiento de mezcla incluye disolución de ingredientes en un orden específico (conservador seguido por estabilizador/agentes de tonicidad, reguladores de pH y péptido) o disolución al mismo tiempo.

Formulaciones alternativas, por ejemplo, no parenterales , pueden no requerir de esterilización. Sin embargo, si se desea o es necesaria la estabilización, se puede usar cualquier proceso de esterilización adecuado para desarrollar la formulación farmacéutica péptida de la presente invención. Los procesos de esterilización típicos incluyen filtración, vapor (calor húmedo) , .calor seco, gases (por ejemplo, óxido de etileno, formaldehídio, dióxido de cloro, óxido de propileno, beta-propiolactona, ozono, cloropicrina, bromuro metílico de ácido peracético y similares) , exposición a una fuente de radiación, y manejo aséptico. La filtración es el método de esterilización preferido para formulaciones líquidas de la presene invención. La filtración estéril incluye filtración a través de 0.45 um y 0.22 um (1 ó 2) que pueden estar conectados en serie. Después de la filtración, la solución se llena en frascos o recipientes adecuados.

En ciertas modalidades, los polipéptidos manipulados descritos en la presente se administran periféricamente a los sujetos.. En algunas . modalidades, las formulaciones farmacéuticas líquidas de la presente invención están diseñadas para administración parenteral . Las rutas de administración adecuadas incluyen intramuscular, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intraarticula , intratecal y similares. En algunas modalidades, se prefiere la ruta de administración- subcutánea. En ciertas modalidades, se prefiere también el suministro en mucosas. Estas rutas incluyen, pero no están limitadas a, rutas oral, nasal, sublingual, pulmonar y bucal que pueden incluir administración del péptido en forma líquida, semisólida o sólida. Para formulaciones que incluyan polipéptidos manipulados, la administración por medio de estas rutas puede requerir sustancialmente más compuesto para obtener los efectos biológicos deseados debido a biodisponibilidad reducida en comparación con el suministro parenteral .

Además, el suministro de liberación controlada parenteral puede lograrse al formar microcápsulas poliméricas, matrices, soluciones, implantes y dispositivos y administrándolos parenteralmente o por medios quirúrgicos. Ejemplos de formulaciones de liberación controlada se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,368,630/ 6,379,704 y 5,766,627, las cuales se incorporan en la presente por referencia. Estas formas de dosis pueden tener una biodisponibilidad más baja debido a que atrapan una parte del péptido en la matriz polimérica o dispositivo. Véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 6,379,704, 6,379,703, y 6,296,842, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos.

Los compuestos pueden ser provistos en forma de dosis única que contenga una cantidad del polipéptido manipulado que será efectiva en una o varias dosis.

Como se . reconocerá por aquellos en el campo, una cantidad efectiva del polipéptido manipulado variará con muchos factores incluyendo la edad y peso del sujeto, la condición física del sujeto, la afección que será tratada y otros factores conocidos en la técnica. Una cantidad efectiva de los polipéptidos manipulados también variará con la combinación particular administrada. Como se describe en la presente, la administración de los polipéptidos manipulados en combinación puede permitir que una cantidad reducida de cualquiera de los polipéptidos manipulados administrados sea una cantidad efectiva.

La administración puede ser por ruta oral, incluyendo rutas transcelular, paracelular o mediada por receptor. Sin desear ser limitados por ninguna teoría, los polipéptidos manipulados que contienen un exendin como los descritos en la presente están disponibles oralmente, en parte debido a su tamaño relativamente pequeño y estabilidad relativa a las enzimas del intestino. Se ha reportado que las estrechas uniones entre las células intestinales abiertas por potenciadores de absorción/permeación son de menos de 20 nm de ancho. Véase, por ejemplo, Chao et al., 1998, J. Drug Targeting, 6: 37-43. En consecuencia, un polipéptido manipulado suficientemente pequeño (por ejemplo, menos de 10 kD o 15 kD) como el descrito en la presente puede transitar la pared intestinal y unirse a albúmina en el sistema portal, de esta manera obteniendo acceso a la circulación. El suministro oral de los polipéptidos manipulados de la presente invención puede ser dos veces al día, una vez al día, un día sí y otro no, una vez cada tres días, una vez por semana, una vez en dos semanas, una vez en tres semanas o incluso una vez al mes: Los sistemas de suministro oral adecuados para otros péptidos pueden ser usados. En una modalidad el sistema de suministro oral puede tener un perfil de absorción relativamente rápido, por ejemplo, de 1 a 4 horas, en cuyo caso la duración de acción inherentemente larga del polipéptido manipulado proporciona la duración de acción extendida deseada, tal como para administración una vez al día o una vez por semana. La duración de acción puede seleccionarse, por ejemplo, mediante la elección de ABD y su afinidad para albúmina. Aunque no se desea ser limitados por teoría, se cree que afinidad más alta a albúmina producirá tiempos en circulación más largos proporcionando duración de acción más larga. El suministro oral puede ser probado usando métodos in vitro e in vivo conocidos. Por ejemplo, un ratón puede ser alimentado de manera forzada oralmente con una solución que contenga un polipéptido manipulado formulado con o sin un potenciador de permeación/absorción y/o inhibidor de proteasa para de esta manera probar la disponibilidad oral y llevar a cabo cualquier excipiente añadido. Cualquiera o ambos de farmacodinámica (efectos terapéuticos) y farmacocinética (propiedades de fármaco) puede añadirse con el tiempo, tales como niveles de fármaco en plasma, glucosa aguda o crónica y/o reducción de HbAlc, niveles de insulina en plasma, inhibición de consumo de alimento, pérdida de peso y/o niveles de lípidos.

B. Dosis efectivas Las composiciones farmacéuticas provistas en la presente incluyen composiciones en las que el ingrediente activo está contenido en una cantidad terapéuticamente efectiva, es decir, en una cantidad efectiva para lograr su propósito deseado. La cantidad efectiva real para una aplicación particular dependerá, entre otras cosas, de la afección que esté siendo tratada. Por ejemplo, cuando se administren en métodos para tratar diabetes, estas composiciones contendrán una cantidad de ingrediente activo efectiva para lograr el resultado deseado (por ejemplo, reducir la glucosa en sangre en ayunas en un sujeto) . Cuando se administren en métodos para tratar obesidad, estas composiciones contendrán una cantidad de ingrediente activo efectiva para lograr el resultado deseado (por ejemplo, reducir la masa corporal) .

La dosis y frecuencia (dosis individual o múltiples) de compuesto administrada puede variar dependiendo de una variedad de factores, incluyendo ruta de administración, talla, edad, sexo, salud, peso corporal, índice de masa corporal y dieta del receptor; naturaleza y grado de síntomas de la enfermedad que esté siendo tratada (por ejemplo, la enfermedad sensible a los compuestos descritos en la presente; glucosa en ayunas en sangre) ; presencia de otras enfermedades u otros problemas relacionados con la salud; tipo de tratamiento concurrente; y complicaciones de cualquier enfermedad o régimen de tratamiento. Otros regímenes o agentes terapéuticos pueden usarse en conjunto con los métodos y compuestos de la invención.

Las cantidades terapéuticamente efectivas para usarse en humanos pueden determinarse a partir de modelos con animales. Por ejemplo, una dosis para humanos puede lograrse para lograr una concentración que se haya encontrado como efectiva en animales. La dosis en humanos puede ajustarse al monitorear uno o más parámetros fisiológicos, incluyendo pero no limitados a azúcar en sangre y masa corporal, y ajustando ' la dosis hacia arriba o hacia abajo, como se describió arriba y se conoce en la técnica.

Las dosis pueden ser variadas dependiendo de las necesidades del paciente y del compuesto que esté siendo empleado. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para llevar a cabo una respuesta terapéutica benéfica en el paciente con el tiempo. El tamaño de la dosis también será determinado por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso. Generalmente, -el tratamiento es iniciado con dosis más pequeñas, las cuales son menores que la dosis óptima del compuesto. Posteriormente, la dosis se incrementa a incrementos pequeños hasta que se alcance el efecto óptimo bajo las circunstancias. En una modalidad de la invención, el intervalo de dosis es de 0.001% a 10% p/v. En otra modalidad, el intervalo de dosis es 0.1% a 5% p/v.

Sin embargo, las dosis típicas pueden contener desde un límite inferior de aproximadamente 1 ug, 5 ug, 10 ug, 50 ug, 100 ug a 150 ug al día hasta un límite superior de alrededor de 50 ug a 100 ug, a 150 ug, a 200 ug o incluso hasta 300 ug del compuesto farmacéutico a la semana en vista de la vida media extendida de los polipéptidos manipulados de la presente. Las dosis pueden ser suministradas en dosis únicas individuales en el intervalo deseado, por ejemplo, diariamente o semanalmente .

Las cantidades e intervalos de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles del compuesto administrado efectivos para la indicación médica particular que esté siendo tratada. Esto proporcionará un régimen terapéutico que vaya de acuerdo con la severidad del estado de enfermedad del individuo.

Utilizando las enseñanzas proporcionadas en la presente, un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico efectivo puede planearse el cual no cause toxicidad sustancial y no obstante sea completamente efectivo para tratar los síntomas clínicos demostrados por el paciente particular. Esta planeación debe implicar la elección cuidadosa del compuesto activo al considerar factores tales como potencia del compuesto, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, presencia y severidad de efectos secundarios adversos, modo de administración preferido y el perfil de toxicidad del agente seleccionado.

La sorprendente propiedad de reducción de dosis de los polipéptidos manipulados de la presente invención, junto con su vida media en plasma sorprendentementé larga y duración de acción farmacológica, proporciona un agente terapéutico superior. También es sorprendente en el caso de los polipéptidos manipulados que contienen exeñdin y su disponibilidad oral. Las propiedades superiores que incluyen reducción de dosis, permiten una dosificación más baja, y de esta manera menos o efectos secundarios menos severos y costo de bienes mejorado y/o formulaciones más económicas y simples para administración una vez al día o una vez por semana no lograda actualmente por los compuestos de origen solos.

C. Toxicidad La relación entre toxicidad y efecto terapéutico para un compuesto particular es su índice terapéutico y se puede expresar como la relación entre LD50 (la cantidad de compuesto letal en 50% de la población) y ED50 (la cantidad de i compuesto efectiva en 50% de la población) . Se prefieren compuestos que exhiben altos índices terapéuticos. Datos de índices terapéuticos obtenidos de ensayos de cultivo de células y/o estudios en animales pueden usarse para formular una gama de dosis para usarse en humanos. La dosis de esos compuestos se encuentra de preferencia dentro de un intervalo de concentraciones en plasma que incluye la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración utilizada. Véase, por ejemplo, Fingí et al., En: THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS , capítulo 1, pág. 1, 1975. La formulación exacta, ruta de administración y dosis pueden seleccionarse por el médico individual en vista de la condición del paciente y del método particular en el cual se usa el compuesto.

Sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que la fusión de un dominio de unión a albúmina ABD con un dominio de hormona como el descrito en la presente, puede proporcionar inmunogenicidad reducida según se juzga por una reducción en la respuesta inmune con relación al dominio de hormonas sin fusión a ABD. Véase, por ejemplo, WO 2009/016043, incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos.

VII. Ejemplos Los péptidos útiles en los siguientes ejemplos incluyen : HaPGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIE LKGGPSSGAPPPSTGGGGSASLAEAKVLANRELDKY GVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP; HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA LVKLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEG VEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 164) ; HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIE LKLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGV EALKLHILAALP (SEQ ID NO: 165); HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIE LKNGGPSSGAPPPSGGSLKNAKEDAIAELKKAGITS DFYFNAVNKAKTVEEVNALKNEILKALP (Cmpd 22) (SEQ ID NO: 168); H (Aib) QGTFTSDYSKYLDEQAAKEFIAWLMNTYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHIL AALP (SEQ ID NO: 171) ; HSQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFIAWLMNTYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 172) ; HSQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFIA LMNTGGGSYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHIL AALP (SEQ ID NO: 173); HaPGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIE LKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASLAEAKVLANRELDK YGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (Cmpd 14), y [ [Lys27#] HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS] [LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLI KAKTVEGVEALKLHILAALP-GGG-#] (Cmpd 30) . Como es común en la técnica, una abreviatura de aminoácido de una sola letra en minúsculas (por ejemplo, "a") indica un D-aminoácido (por ejemplo, D-Ala) . En la nomenclatura de los compuestos péptidos enlazados por cadena lateral, los corchetes ("[]") indican fragmentos separados y el gato ("#") indica posiciones de enlace.

Ejemplo 1 Purificación de polipéptido manipulado de análogo de exendin- ABD Método. Comp 15 Ejemplar (SEQ ID NO: 163) se produjo inicialmente que tenía una extensión N-terminal que incorpora un "marcador" His6 (SEQ ID NO: 49) como se conoce en la técnica, con la secuencia: MAHHHHHHVGTGSNENLYFQHGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEI ISTGGG GSASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLI KAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 50) .

Preparación de extracto celular. Para preparar el extracto celular, sedimentos celulares de 50 mL de cultivos de células se resuspendieron completamente en 60 mL de regulador de pH de lisis (50 mM de TrisHCl, 150 mM de NaCl, pH 8.0). Las células resuspendidas se corrieron a través de un microfluidizador (Microfluidics , MA) a 100 PSI (70.3 kg/cm2) tres veces. Los extractos celulares se centrifugaron durante 30 minutos a 16,000 x g para remover restos. Se añadió EGTA (solucion de 150 mM) al extracto celular hasta una concentración final de 3 mM.

Cromatografía Ni-NTA. Diez mL de una suspensión al 50% de superflujo Ni-NTA se empacaron en una columna vacía de 15 mL. La columna se lavó con 10 mL de agua, 50 mL de regulador de pH de lisis y 20 mL de regulador de pH de lisis con 3 mM de EGTA (50 mM de TrisHCl, 150 mM de NaCl, pH 8.0, 3- mM de EGTA).

El extracto celular se añadió cuidadosamente a la parte superior de la columna Ni-NTA, y se recogió el flujo continuo. La columna se lavó con 30 mL de regulador de pH de lisis con EGTA (50 mM de TrisHCl, 150 mM de NaCl, pH 8.0, 3 mM de EGTA) . Se añadieron a la parte superior de la columna 10 mL de regulador de pH de elución (25 mM de TrisHCl, 50 mM de NaCl, 250 mM de imidazol, pH 8.0) y las fracciones de elución (2 mL/fracción) fueron recogidas. Se llevó a cabo SDS-PAGE para verificar el flujo continuo y cada fracción. Las fracciones que contenían compuesto marcado con His fueron agrupadas.

Digestión de proteasa TEV. El compuesto marcado con Hiss se diluyó tres veces con 25 mM de TrisHCl, 50 mM de NaCl, pH 8.0. Se añadieron ß-mercaptoetanol (0.1%) y 2% de proteasa Turbo TEV (2 mg/mL, 10,000 unidades/mg, Accelagen) , y el resultado se mezcló y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas y a 4°C durante la noche.

Remoción de marcador His cortado y turbo TEV con Ni-NTA. Seis mL de una suspensión al 50% de superflujo Ni-NTA « se empacaron en una columna vacía de 15 mL. La columna se lavó con 20 mL de agua y 20 mL de 50 mM de TrisHCl, 100 mM de NaCl, 45 mM de imidazol, pH 8.0. La reacción de digestión TEV" se diluyó 2 veces con 50 mM de TrisHCl, 150 mM de NaCl, pH 8.0. La reácción de digestión diluida se añadió cuidadosamente a la parte superior de la columna Ni-NTA, y se recogió el flujo continuo. Se añadieron a la columna 10 mL de TrisHCl 50 mM, 100 mM de NaCl , 45 mM de imidazol, pH 8.0, para eluir cualquier proteína no unida. Los flujos continuos se recogieron y combinaron.

Primera cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) . El flujo continuo del Ni-NTA se filtró con un filtro de 0.2 um. Una columna Superdex 75 HiLoad 26/60 se pre-equilibró con 390 mL de PBS . El flujo continuo filtrado se inyectó en la columna HiLoad 26&0 con una bomba de muestra. La proteína fue eluida con 1.5 CV de PBS, y el pico de monómero se agrupó.

Segunda cromatografía de exclusión de tamaño. El primer fondo de SEC se filtró con un filtro de 0.2 um. Una columna Superdex 75 HiLoad 26/60 fue pre-equilibrada con 390 mL de PBS. El flujo continuo filtrado se inyectó a la columna HiLoad 26/60 con una bomba de muestra. La proteína fue eluida con 1.5 CV de PBS, y el pico de monómero se agrupó.

Tercera cromatografía de exclusión de tamaño. El segundo fondo de SEC se filtró con un filtro de 0.2 um. Una columna Superdex 75 HiLoad 26/60 fue pre-equilibrada con 390 mL de PBS. El flujo continuo filtrado se inyectó en la columna HiLoad 26/60 con una bomba de muestra. La proteína fue eluida con 1.5 CV de PBS, y el pico de monómero se agrupó.

Remoción de endotoxina residual con EndoTrap Red. El tercer fondo de SEC aún contenía -20 EU/mg de endotoxina, que se removió mediante el uso de EndoTrap Red. Brevemente, 0.5 mL de suspensión en gel se .activó al añadir 1 mL de regulador de pH de regeneración a la suspensión y mezclando al agitar suavemente el tuvo durante aproximadamente 5 segundos. El sobrenadante se centrifugó y aspiró. Esta etapa se repitió dos veces más. Se añadieron 1 mL de regulador de pH de equilibrio, y se llevó a cabo la mezcla al agitar suavemente el tubo mediante aproximadamente 5 segundos. El sobrenadante se centrifugó y se aspiró. Esta etapa se repitió dos veces más. Muestra de proteína (5.5 mL) se añadió a la resina y se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente, con mecimiento o rotación suave del tubo mientras se incubaba. El resultado se centrifugó a 1,200 x g durante 5 minutos, y el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio.

Resultados. La proteína purificada final migró en gel SDS-PAGE como una proteína de aproximadamente 6 kD bajo las condiciones empleadas. La LC-MS mostró un peso molecular correcto de 9827 daltons . El rendimiento de proteína fue 3.3 mg a partir de 50 mL de cultivo de células.

Ej emplo 2 Actividades de polipéptidos manipulados con exendin-ABD Polipéptidos manipulados con exendin-ABD de la invención conservaron suficiente actividad exendin en un ensayo de activación celular in vitro. Además, los polipéptidos manipulados proporcionaron una duración de acción dramáticamente mejorada para reducción de glucosa en sangre y pérdida de peso corporal, cuando se compararon con exendin-4, cuando se administraron como, una sola dosis a un mamífero. Sorprendentemente, la duración de acción puede ser extendida hasta por lo menos 1 día, incluso al menos 4 días, e incluso por lo menos 7 días, o más, en un modelo de roedor, el cual se traduce a por lo menos una duración de una semana de acción en un sujeto humano, de esta manera adecuado para administración dos veces al día, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces por semana o incluso una vez por semana.

La actividad funcional de los compuestos descritos en la presente puede determinarse usando una línea ' celular que expresa el receptor GLP-1. Véase, por ejemplo, solicitud de patente de Estados Unidos publicación US20110097751A1 , incorporada por referencia para el método de ensayo. En este ejemplo, la actividad funcional se determinó usando células que expresan endógenamente GLP-IR, y la inducción de cAMP se detecta como una medida de la actividad de exendin. Se usó un kit de ensayo HTRF (Cisbio International (Bedford, Mass) . El bioensayo usó las células 6-23 (clon 6) de carcinoma de tiroides de rata en el ensayo a base de células usando el kit de ensayo HTRF® cAMP dynamic 2 1,000, disponible de Cisbio como No. de catálogo 62AM4PEB. Los estándares y calibraciones HTRF® se prepararon siguiendo las instrucciones en el kit. La acumulación de cAMP se mide después de 30 minutos de tratamiento de compuesto usando el kit de ensayo de cAMP a base de células HTRF (CisBio) en formato de 384 pocilios. La eficacia de los péptidos se determina con relación al tratamiento de células con 10 uM de forscolina (un activador constitutivo -de adenilato cilasa) , y la potencia (EC50) de los péptidos se determina mediante el análisis de una curva de respuesta a concentración usando análisis de regresión no lineal ajustado a un modelo de 4 parámetros. Los resultados de la actividad funcional del receptor GLP-1 (inducción de cAMP) para potencia (EC50) se proporcionan en la siguiente tabla 5, en donde los valores fueron normalizados a un estándar de exendin-4. El dominio ABD no se unió ni activó al receptor de GLP-1.

Tabla 5 Actividad funcional de GLP-1R Ej emplo 3 Actividad OGTT DOA Los efectos en glucosa en sangre antes de administración forzada de glucosa (1.5 k/kg de dextrosa) y 30 minutos después de la alimentación forzada con glucosa fueron investigados 1 día después de la dosis del compuesto péptido con cantidades variables de Comp 15, con los resultados mostrados en las figuras 1A-1B. Comp 31 a 25 nmol/kg También demostró actividad 24 horas después de la dosificación, como se muestra en la figura 9. El fármaco se administró a ratones NIH/Swiss ayunados durante 4 horas a las dosis indicadas en las figuras. Las barras representan media ± sd. El péptido se inyectó IP a t=-l día. La alimentación forzada con glucosa (1.5 k/kg) dada en t=0 a ratones hembra NIH/Swiss ayunados 4 horas. La glucosa en sangre se midió con un OneTouch® Ultra® (LifeScan, Inc., a Johnson & Johnson Company, Milpitas, CA) * p<0.05 vs . vehículo de control; ANOVA, prueba de Dunnett. Este OGTT DOA indica actividad de fármaco que está presente al menos 24 horas después de que se administre el fármaco. Exendin-4 (no conjugado) no fue efectivo en este ensayo cuando se dosificó en t-24 horas (1 día antes del ensayo de glucosa), e incluso a dosis más altas.

Ejemplo 4 Actividad OGTT DOA Los efectos de glucosa en sangre antes de la alimentación forzada (1.5 k/kg de dextrosa) y 30 minutos después fueron investigados 2 días después de la dosis con cantidades variables de Comp 15, con los resultados mostrados en las figuras 2A-2B. El fármaco se administró a ratones NIH/Swiss ayunados 4 horas a las dosis indicadas en las figuras. Este OGTT DOA indica que la actividad de fármaco está presente al menos 48 horas después de que el fármaco se administra.

Ejemplo 5 Actividad OGTT DOA Una comparación de los efectos de Cmpds 15 y 8 en glucosa en sangre fue llevada a cabo, con los resultados ilustrados en las figuras 3A-3B. El fármaco se administró a ratones NIH/Swiss ayunados 4 horas a las dosis indicadas en las figuras. Este OGTT DOA indica que actividad de fármaco está presente al menos 24 horas después de que se administró el fármaco.

Ejemplo 6 Efecto de Comp 15 en ratas anestesiadas alimentadas con HSD Los efectos de tratamiento con Comp 15 (240 nmol/kg) se investigaron en ratas Sprague Dawley anestesiadas y alimentadas 5 días después de la dosis. El curso de tiempo de glucosa en sangre después de IVGTT se ilustra en la figura 4A. Los niveles de glucosa integrados (AUC0-6o) se ilustran en el histograma de la figura 4B. El curso de tiempo del cambio en los niveles de insulina en los sujetos de prueba se ilustra en la figura 4C. Los niveles de insulina integrados (AUC0-3o) se ilustran en la figura 4D. El curso de tiempo de cambio en peso corporal (% de cambio a partir de línea de base) se ilustra para los sujetos de prueba en la figura 4E. Una ilustración por histograma de consumo de alimento diario para los sujetos de prueba se proporciona en la figura 4F. Este IVGTT DOA indica que actividad de fármaco está presente al menos 5 días horas después de que el fármaco se administra, particularmente para efectos en peso corporal y consumo de alimento diario.

Ejemplo 7 Efecto de Comp 15 en ratones oh/oh El curso de tiempo del efecto de Comp 15 en peso corporal, glucosa y HbAic en ratones oh/oh se investigó después de la dosis. Como se ilustra en la figura 5A, la pérdida de peso corporal significativa tiene que ver con el tratamiento con 250 nmol/kg de Comp 15. Los cambios en glucosa (% pre-tratamiento) y en HbAlc (% pre-tratamiento) se ilustran en las figuras 5B-5C. Los puntos representan media ± s.d. (desviación estándar). Comp 15 Se inyectó se el día =0 inmediatamente después de la recolección de la muestra de línea de base en ratones oh/oh macho no ayunados. A menos que se indique lo contrario, las mediciones de glucosa en sangre descritas en la presente emplearon un dispositivo OneTouch® (LifeScan, Inc. Miliptas, CA) . Comp 21 También demostró pérdida de peso corporal y reducción de HbAlc.

Ejemplo 8 , Actividad de Comp 15 en ratas grasas diabéticas Zucker (ZDF, por sus siglas en inglés) Para evaluar la eficacia combinada de reducción en peso corporal y glucosa de los compuestos ¡ejemplares descritos aquí, los efectos dependientes de dosis de Comp 15 en ratas ZDF macho de -14 semanas de edad fueron investigados. La glucosa en línea de base fue 426 mg/dL, y el peso corporal en línea de base fue 431 g. Tamaño de grupo n=8. La figura 6A ilustra el curso de tiempo del, cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) después de tratamiento. La figura 6B ilustra el curso de . tiempo de glucosa en plasma.

I Ejemplo 9 Actividad de Cmpds 15, 8 y 10 en OGTT DOA (duración de acción) Se investigaron los efectos de Cmpds 15, 8 y 10 en el cambio en glucosa en sangre a 30 min (% pre-alimentación) forzada, como se ilustra en la figura 7. En la figura 7, las barras representan media ± s.d. El compuesto de prueba se inyectó IP en t=-l día. La alimentación forzada de glucosa (1.5 g/kg) dada en t=0 a ratones hembra NIH/Swiss ayunados j durante 4 horas . La glucosa en sangre se midió como se describió en la presente. Este OGTT DOA indica que actividad de fármaco está presente al menos 24 horas después de que se administra el fármaco.

Ejemplo 10 Actividad de Cmpds en OGTT DOA (duración de acción) a 24 horas Los efectos de los compuestos descritos en la presente en el cambio en glucosa en sangre a 30 minutos (% pre-alimentación forzada) se investigaron como se describió arriba. El compuesto de prueba se inyectó IP en t=-l día a 25 nmol/kg. Alimentación forzada de glucosa (1.5 g/kg) dada a 5=0 a ratones hembra NIH/Swiss ayunados 4 horas. La glucosa en sangre se midió como se describe en la presente. Este OGTT DOA indica que actividad de fármaco está presente al menos 24 horas después de que se administra el fármaco. Los resultados se presentan en la siguiente tabla 6. Comp 30 (Enlazado a lisina 27) y Comp 32 no dieron reducción de glucosa, indicando una falta de presencia 24 horas después bajo estas condiciones. Exendin-4 (no conjugado) fue inefectivo en este ensayo cuando se dosificó en t-24 horas, e incluso a dosis mayores. Comp 14 con prolina en posición 3 fue esencialmente inactivo en el ensayo funcional in vitro e inactivo (y tal vez promotor de peso) en el ensayo OGTT de reducción de glucosa (datos no mostrados) . Comp 22 Con una secuencia de unión a albúmina en proteína PAB de P. magnus tuvo muy poca si es que alguna reducción de peso (3%) en el ensayo anterior. Comp 19 y Comp 20 Con ABDs truncados mantuvo aún actividad in vitro, pero con duración reducida, teniendo 6% y 8% de reducción de glucosa en los ensayos OGTT DOA, respectivamente .

Tabla 6 Reducción de glucosa en OGTT 24 horas después de dosis La caracterización de la unión de compuestos polipéptidos manipulados a albúmina se puede llevar a cabo mediante cualquier número de métodos, incluyendo aquél de Biacore descrito en la presente. En este ejemplo se levaron a cabo mediciones de unión con un sistema BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Hércules CA, E.U.A. ; pROTEON xpr36 Protein Interaction Array número de catálogo #176-0100) , usando un chip sensor GLC a 25 grados C. Para acoplamiento de amina el chip GLC se activó durante 5 minutos usando una mezcla 1:1 de sulfo-NHS/EDC diluido 30 veces a partir de la solución inicial en agua como se muestra abajo. Cada muestra de albúmina se diluyó a 25 ug/ml en 10 mM de acetato de sodio pH 5.0 y se inyectó durante 5 minutos sobre superficies sensoras separadas. Cada superficie se bloqueó después con etanolamina 1 M pH 8.5. Cada albúmina se acopló a una densidad de 2000-5000 en unidades de resonancia. La unión de un polipéptido manipulado se probó usando 5 nM como la concentración más alta en una serie de diluciones de tres veces. El regulador de pH de corrida contenía 10 mM de HEPES pH 7.4, 150 mM de NaCl , 3 mM de EDTA y 0.005% de tween-20. Todas las muestras se probaron usando una serie de diluciones de 3 veces. Cada serie de concentraciones se probó por duplicado. La fase de disociación para la concentración más alta se monitoreó durante 3 horas .

La KD relativa medida para los polipéptidos manipulados se presenta en la tabla 7 abajo. Los resultados demuestran que los polipéptidos de unión a albúmina se asocian con albúminas séricas con alta afinidad. El número entre paréntesis representa la desviación estándar en el último dígito significativo. Como se ve a partir de la siguiente tabla los polipéptidos exendin fusionados a dominios de unión a albúmina de SEQ ID NO: 35 conservan afinidad extremadamente alta para albúmina sérica de varias especies, especialmente albúmina sérica humana, incluso cuando se comparan con el propio péptido ABD no conjugado.

Tabla 7 Ejemplo 12 Actividad en presencia de albúmina sérica La caracterización de la actividad in vitro de los compuestos de polipéptidos manipulados en la presencia de albúmina sérica fue demostrada. Los ensayos pueden llevarse a cabo en presencia y ausencia de una albúmina, particularmente albúmina sérica humana. Los datos anteriores se determinaron en presencia de aproximadamente 0.1% de albúmina' sérica de bovino (BSA) . La siguiente tabla presenta la actividad funcional del ensayo de activación de receptor (inducción de cAMP) descrito arriba, pero en presencia de albúmina sérica de varias especies. Como puede verse, sorprendentemente, incluso cuando los compuestos se unen a albúmina sérica, tal como a albúmina sérica humana, a pesar de la presencia de la gran albúmina sérica, con su potencial para impedimento estérico e incluso un cambio en el radio Stoke aparente de los compuestos que resulta de unión a albúmina, el polipéptido manipulado conserva actividad agonista del receptor GLP-1. Dada la actividad picomolar de ABD y los polipéptidos manipulados a ciertas especies de albúmina sérica, por ejemplo, albúmina sérica humana, se cree que el polipéptido manipulado se une efectivamente completamente a albúmina presente en el ensayo (y de esta manera también in vivo en sangre circulante) . Debido a la afinidad extremadamente alta del compuesto que se une a albúmina (como arriba) y a la presencia de una alta concentración de albúmina sérica en la sangre, se espera que los compuestos existan esencialmente en el estado unido in vivo pero que sorprendentemente proporcionen funciones de exendin suficientes (como se demuestra en la presente) .

Tabla 8 Ejemplo 13 Los compuestos son estables para plasma humano y enzima de plasma humano Se examinaron los compuestos para estabilidad a plasma humano y proteasas de membrana celular humana. La estabilidad de los péptidos representativos en plasma humano se llevó a cabo como sigue. Se prepararon 10 pg/ml de un compuesto en plasma humano a un volumen suficiente como para eliminar muestras de 100 µL cada 10 minutos durante el periodo de tiempo (5 horas) , iniciando en el punto de tiempo cero. Después de la adición del compuesto al plasma humano, la muestra se mezcla suavemente y se transfieren úna muestra de 100 µL de la mezcla a un tubo microcentrífugo para representar el punto de tiempo cero. El resto de la muestra i se puso en una incubadora a 37 grados C, mezclando a 600 RPM durante 60 minutos. A intervalos de 10 minutos, se retiró una muestra de 100 µ? de la mezcla y se transfirió a tubos microcentrífugos separados. Después de la transferencia de la muestra de 100 µ? en el punto de tiempo cero y cada intervalo de 10 minutos, cada muestra colectada se extrajo mediante adición lenta de 100 µL de ácido fórmico al 0.2% frío : acetonitrilo, mientras se mezclaba. Después de la adición de la solución de acetonitrilo, la mezcla se mezcló por remolino a alta velocidad durante 15 minutos. Las muestras extraídas se almacenaron a -20°C durante al menos 20 i ¡ minutos y luego se centrifugaron a 11,000 x g durante 10 minutos a 5 grados C. El sobrenadante de cada muestra se transfirió a un tubo microcentrífugo nuevo, se centrifugó de nuevo, y finalmente se transfirió para análisis LC/MS. El análisis de la muestra se hizo en un Agilent HPLC (LC/MS 1200) usando un gradiente de 5-95% de acetonitrilo en agua que contenía ácido trifluoroacético al 0.1%. La tabla 9 presenta resultados normalizados a un estándar (100%) . La figura 8 presenta un perfil de tiempo del porcentaje de compuesto que permanece en plasma humano durante el curso de tiempo de 5 horas.

Tabla 9 La estabilidad relativa de los péptidos representativos en un ensayo de membrana de borde en cepillo de riñon humano (KBBM, por sus siglas en inglés) se llevó a cabo como sigue. Extractos de proteína de membrana de borde en cepillo de riñon humano son ricos en varias peptidasas. La preparación del extracto de proteínas (hKBB P) , 5 microL (aproximadamente 7 microgramos/mL de proteína) se diluyó con 625 microL de regulador de pH HEPES (25 mM, pH 7.4) en un tubo microcentrífugo de polipropileno con un sello de junta tórica para evitar evaporación del solvente. En un frasco separado, solución de abastecimiento de péptidos (300 microM en 50% de acetonitrilo en agua) fue preparada y 70 microL de esta solución se añadieron a la solución de hKBBMP anterior. La solución se mezcló suavemente mediante agitación manual de tal forma que la concentración de péptido final fuera de 30 microM. Después 100 microL de esta solución se hicieron alícuotas en seis tubos diferentes y en un tubo de 200 microL de solución de paro de enzima (acetonitrilo al 50% en agua con. 0.1% de TFA) se añadieron. Este tubo se usó para la medición de la concentración de péptido inicial en tiempo t=0 minuto mientras todos los demás 5 tubos fueron incubados a 37 grados C usando un baño de agua. A los intervalos de 1, 2, 3, 4 y 5 horas, cada tubo fue sacado y enfriado rápidamente con 200 microL de solución de paro. Finalmente, todos los seis tubos fueron centrifugados a 1800 x g durante 10 minutos para remover cualquier proteína precipitada. El sobrenadante (10 microL) se transfirió a un automuestreador de HPLC, y usando el método de recuento iónico seleccionado se midió la AUC. Cada muestra se corrió por triplicado y la AUC promedio se calculó para análisis de datos. El análisis de la muestra se izo en Agilent HPLC con detector de masa con un gradiente de acetonitrilo con TFA al 0.1%. El porcentaje de péptido progenitor que permanecía a partir del tiempo t=0 a 5 horas de digestión enzimática se gráfico usando software GraphPad Prism® 5. Los datos se reportaron como estabilidad de péptido relativa contra control positivo para cada péptido. Como se indicó las muestras fueron corridas como n = 6, y CV estuvo dentro de 20%. Los resultados del ensayo de estabilidad hKBBM se presentan en la tabla 10.

Tabla 10 Ejemplo 14 Falta de vacuolización Con algunos fármacos, tales como algunas proteínas pegiladas, se pueden formar vacuolas no deseables . en citoplasma de células epiteliales que revisten los túbulos convolutos proximales, que es una medida de toxicidad indeseable. Los compuestos de unión a albúmina manipulados de la presente solicitud no forman vacuolas en riñon. Ratones hembra C57BL6 (n=2 jaulas, 3 ratones/j aula) se pesaron diariamente 3 horas antes de apagar luces. Inmediatamente después del pesado, los días 0-6 los ratones fueron inyectados subcutáneamente con compuesto de prueba. Los ratones fueron sacrificados el día 7 y los ríñones se sometieron a histopatología . La puntuación de severidad para vacuolación citoplásmica de células epiteliales tubulares corticales renales fue la siguiente: puntuación 1 = mínimo (8-15%); 2 = leve (16-35%); 3 = moderado (36-60%); 4 = marcado (>60%) . Un compuesto de control positivo que se sabe causa formación de vacuolas se calificó como 3. El propio polipéptido ABD calificó 0. Comp 15 calificó 0.

Ejemplo 15 Efecto en inhibición de consumo de alimento en ratones normales El curso de tiempo del efecto de los compuestos de prueba en la inhibición de consumo de alimento de ratones normales fue determinado. Como se ilustra en la figura 10A, una pérdida de peso corporal significativa y dependiente de dosis tiene que ver con el tratamiento con Comp 31 durante 6 horas. La figura 10B demuestra una inhibición prolongada y dependiente de dosis de consumo de alimento después de una sola dosis de compuesto, durante al menos 54 horas en ratones normales. El efecto del análogo exendin se va a las 24 horas. Comp 31 Aún inhibe significativamente el consumo de alimento incluso después de 3 días a la dosis más alta. Los puntos representan media ± sd en n=4 jaulas (3 ratones/j aula) . El péptido fue inyectado IP en t=0. Se introdujo alimento inmediatamente después de la inyección y la cantidad consumida se midió en t=30, 60, 120, 180, 240, 300, 360 min, 24 horas, 30 horas, 48 horas y 54 horas. * p<0.05 vs . Control de vehículo; ANOVA, prueba de Dunnett . Las ED50's fueron -10 nmol/kg para Comp 31 y 2 nmol/kg para [Leul4] exendin-4.

Ejemplo 16 Efecto de un polipéptido de dominio de unión a albúmina- exendin en ratones ob/ob diabéticos Para demostrar el efecto de la exposición crónica de un polipéptido manipulado de dominio de unión a albúmina-exendin descrito en la presente en la reducción de glucosa, la reducción de HbAlc y la reducción de peso corporal, ratones ob/ob diabéticos fueron tratados con Comp 15 y Comp 21. El curso de tiempo del efecto del compuesto de prueba en peso corporal, reducción de glucosa y reducción de HbAic en ratones ob/ob se investigó después de dosis, con valores a 4 semanas presentados en las figuras 11A, 11B, 11C y 11D. Las figuras 11A (Cmpd 15) y 11B (Cmpd 21). ilustra cambios en glucosa en sangre en comparación con liraglutida, todas dadas dos veces por semana (BIW) , y la figura 11C ilustra la reducción de HbAlc (% de cambio a partir de línea de base) para Comp 15 y Comp 21 dados dos veces por semana (BIW) , en comparación con exendin-4 dado mediante infusión subcutánea continua (CSI) . La figura 11D ilustra la reducción en peso corporal (% de cambio a partir de línea dé base) para Comp 15 y Comp 21 dados dos veces por semana (BIW) , en comparación con exendin-4 dado mediante infusión subcutánea continua (CSI). Sorprendentemente, como se puede ver de las figuras 11A y 11B, cada compuesto es superior a liraglutida a una dosis equimolar para reducción de glucosa después de exposición crónica. Además, a una dosis equimolar para liraglutida, Comp 15 y Comp 21 fueron cada uno más efectivos que liraglutida [N-épsilon- (gama-Glu (N-alfa-hexadecanoil) ) -Lys26,Arg34] -GLP-1- (7-37) -ácido, un derivado de GLP-1 de unión a albúmina de larga acción, en reducción de HbAlc y pérdida de peso corporal (datos no mostrados)1. Como se ilustra en la figura 11C, una reducción de HbAlc significativa está relacionada con el tratamiento en la figura 11D una pérdida de peso corporal significativa está relacionada con tratamiento, con 25 y 250 nmol/kg de cada compuesto provistos intraperitonealmente (IP) dos veces cada semana durante 28 días. Los puntos representan media ± s.d. (desviación estándar) . Cada compuesto de prueba se : inyectó IP el día = 0 inmediatamente después de recolección de muestra de línea de base en ratones ob/ob macho no ayunados. Los efectos observados para la dosis de 25 nmol/kg biw (dos veces por semana) fueron mayores que aquellos observados para exendin-4 dado a ~7.2 nmol/kg/d mediante infusión; continuas (CSI) , una dosis que se sabe proporciona una eficafcia máxima i para exendin-4. De esta manera a una dosis equimolar comparable, Comp 15 y Comp 21 excedieron los efectos de pérdida de peso corporal y glicémico de la dosis máximamente eficaz de exendin-4. A 250 nmol/kg, Comp 15 fue significativamente mayor y Cmpd21 fue el doble de efectivo, que la dosis máximamente eficaz que exendin-4. A menos que se indique lo contrario, las mediciones de glucosa en sangre descritas en la presente emplearon un dispositivo OneTouch® Ultra® (LifeScan, Inc. Miliptas, CA) .

Sorprendentemente, a pesar de la potencia in vitro reducida en comparación con exendin-4 no conjugado como se observó arriba, la actividad in vivo aguda (dentro de 6 horas) en un exendin fusionado a un polipéptido de unión a albúmina descrito en la presente es similar a aquella de exendin no conjugado con respecto a la eficacia máxima y sólo ligeramente menor (varias veces) con respecto a la potencia (ED50 por ejemplo) , tal como cuando se mide mediante reducción de consumo de alimento en ratones (datos no mostrados) . Todavía más sorprendentemente, el efecto de una exposición crónica demuestra que un exendin fusionado a los polipéptidos de unión a albúmina descritos en la presente es tan potente o incluso tiene mayor potencia que exendin-4 (infundido continuamente) pero es capaz de proporcionar un efecto máximo más grande. Además, en vista de la afinidad muy alta para albúmina de ratón o rata y bajas velocidades inactivas, todos los compuestos manipulados se unen de manera efectiva a albúmina en los ensayos in vivo (así como en los ensayos in vitro) . De esta manera, los polipéptidos manipulados conservaron actividad funcional GLP-1R incluso cuando se unieron a albúmina. Esto es sorprendente en parte porque los compuestos de albúmina, por ejemplo, liraglutida, se han reportado como significativamente activos sólo cuando se disocian de albúmina. Y otros han reportado una necesidad por eliminar proteolíticamente un exendin de un péptido de unión a albúmina al cual se conjugó para de esta manera obtener función de exendin. En consecuencia, las actividades in vivo como las mostradas en la presente son todavía más impresionantes.

Ejemplo 17 Larga duración y acción de los polipéptidos manipulados in vivo Para demostrar más la vida media larga y larga duración de actividad de los polipéptidos manipulados descritos en la presente, las propiedades farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD) se determinaron usando ratas. El perfil farmacocinético y actividad biológica de polipéptidos manipulados ejemplares Comp 15 y Cpmp 21 dosificados subcutáneamente en ratas Harían Sprague-Dawley (HSD) normales es presentado. Los compuestos manipulados recombinantes Comp 21 y Comp 15 fueron inyectados subcutáneamente en t=0 a 25 nmol/kg en ratas HSD normales. La sangre se tomó por medio de sangrado de cola en t=l hora, 3 horas, 6 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas y 168 horas a partir de ratas macho HSD alimentadas. El alimento y pesos corporales se midieron diariamente. La figura 12A ilustra el efecto de Comp 15 y Comp 21 para reducir consumo de alimento. La figura 12B ilustra el efecto de Comp 15 y Comp 21 para reducir peso corporal . La figura 12C ilustra un perfil PK de Comp 15 y Comp 21 después de una sola dosis. Los puntos representan media ± s.d.

La exposición de al menos hasta siete (7) días se observó para ambos péptidos manipulados ejemplares. Comp 15 Tiene una vida media aparente de 54 horas y Comp 21 tiene una vida media aparente de 61 horas en ratas mediante este suministro subcutáneao. Por escala alométrica y en vista de la fuerte afinidad de los polipéptidos manipulados por albúmina humana, la duración de actividad física y biológica al menos tan larga e incluso todavía más larga se espera en sujetos humanos. En consecuencia, los compuestos tiene uso para administración al menos dos veces al día (por ejemplo, mañana y noche) , al menos diariamente, dos veces por semana e incluso una vez por semana, especialmente en sujetos humanos.

Se presentan el perfil farmacocinético y actividad biológica de un polipéptido manipulado ejemplar dosificado intravenosamente en ratas Harían Sprague-Dawley (HSD) normales. El compuesto manipulado recombinante Comp 31 se inyectó intravenosamente en t=0 a 2 nmol/kg en ratas HSD normales. La sangre se tomó por medio de sangrado de cola en t=l hora, 3 horas, 6 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas y 168 horas de ratas macho HSD alimentadas. El alimento y pesos corporales se midieron diariamente. La figura 13A ilustra el efecto de Comp 31 para reducir consumo de alimento. La figura 13B ilustra el efecto de Comp 31 para reducir peso corporal. La figura 13C ilustra un perfil PK de Comp 31 después de una sola dosis IV. La vida media se estima a aproximadamente al menos 14 horas, los puntos representan media ± s.d.

La exposición de hasta siete (7) días se observó para este polipéptido manipulado ejemplar, incluso a estas dosis relativamente bajas. Mediante escalada alométrica y en vista de la fuerte afinidad de los polipéptidos manipulados para albúmina humana, la duración de actividad física y biológica al menos tan larga e incluso todavía más larga se espera en sujetos humanos. En consecuencia, los compuestos tienen uso para administración al menos dos veces al día (por ejemplo, mañana y noche) , al menos diariamente, dos veces por semana e incluso una vez por semana, especialmente en sujetos humanos.

Ejemplo 18 Suministro oral de polipéptidos manipulados logra distribución sistémica Se investigó el suministro oral con absorción intestinal usando un compuesto manipulado representativo. Ratones db/db diabéticos fueron dosificados oralmente (alimentación forzada por vía oral) con 240 nmol/kg de los siguientes compuestos, un análogo de exendin [Leul4,Gln28]exendin-4- (1-32) -fGLP-1- (33-37) y Comp 15. Los datos demuestran que los péptidos manipulados son oralmente biodisponibles, incluso en una formulación de PBS/propilenglicol (50:50) ausente otros excipientes específicos que pudieran incrementar el suministro de absorción. En comparación con el análogo de exendin, Comp 15 (ambos a una dosis de 1 mg/kg) a más de dos veces el peso molar del análogo de exendin también es oralmente biodisponible en la misma formulación. Los resultados indican que ambos compuestos fueron activos cuando se dosificaron oralmente, e igualmente eficaces bajo las condiciones probadas hasta 120 minutos. Los resultados se presentan en la figura 14. Los puntos representan media +/- s.d. Los péptidos se dosificaron por vía oral mediante alimentación forzada en t=0 inmediatamente después de la toma de una muestra de línea de base. Los ratones fueron ratones db/db ayunados 2 horas. En consecuencia, los compuestos presentados en la presente tienen utilidad para administración al menos dos veces al día (por ejemplo, mañana y noche) , al menos diariamente, tres veces por semana, dos veces por semana e incluso una vez por semana de administración oral, especialmente en sujetos humanos.

VIII. Modalidades Modalidad 1. Un polipéptido que manipulado que comprende: una secuencia de polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) y una primera secuencia de dominio de hormona péptida (HD1) seleccionada de una secuencia de exendin, una secuencia de análogos de exendin, una secuencia de fragmentos i activos de exendin o una secuencia de fragmentos activos de I análogos de exendin.

Modalidad 2. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 1, que comprende además un primer enlazador (Ll) que enlaza covalentemente la secuencia ABD y la secuencia HD1. · Modalidad 3. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 2, en' donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia ABD como una porción C-terminal y la secuencia HD1 como una porción N-terminal . 1 Modalidad 4. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 3, que tiene la estructura HD1-ABD.

Modalidad 5. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 3, que tiene la estructura HD1-L1-ABD.

Modalidad 6. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 5, en donde la secuencia HD1 consiste de la secuencia de exendin o la secuencia de análogos de exendin.

Modalidad 7. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 6, en donde la secuencia de exendin es una secuencia de exendin- .

Modalidad 8. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 6, en donde la secuencia de fragmentos activos de es la secuencia de exendin-4 (1-28) , exendin-4 (1-29), exendin-4 (1-30) , exendin-4 (1-31) o exendin-4 ( 1-32) (SEQ ID NO: 2) .

Modalidad 9. El polipéptido manipulado de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la secuencia del exendin o análogo de exendin comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en (SEQ ID NO: 3) , (SEQ ID NO: 4) , (SEQ ID NO: 2), (SEQ ID NO: 111), (SEQ ID NO: 112), (SEQ ID NO: 113), (SEQ ID NO: 114), (SEQ ID NO: 115), (SEQ ID NO: 116), (SEQ ID NO: 117), y (SEQ ID NO: 118).

Modalidad 10. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 9, en donde la secuencia de análogos de exendin tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de exendin-4 o con una secuencia de análogos de exendin seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias (SEQ ID NO: 3) , (SEQ ID NO: 4) , (SEQ ID NO: 2), (SEQ ID NO: 111), (SEQ ID NO: 112), (SEQ ID NO: 113), (SEQ ID NO: 114), (SEQ ID NO: 115), (SEQ ID NO: 116), (SEQ ID NO: 117), y (SEQ ID NO: 118).

Modalidad 11. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 10, en donde la secuencia de análogos de exendin comprende de 1 a 5 modificaciones de aminoácido con relación a la secuencia de exendin-4, o para un análogo de exendin con secuencia seleccionada del grupo que consiste en (SEQ ID NO: 3), (SEQ ID NO: 4), (SEQ ID NO: 2), (SEQ ID NO: 111), (SEQ ID NO: 112), (SEQ ID NO: 113), (SEQ ID NO: 114), (SEQ ID NO: 115), (SEQ ID NO: 116), (SEQ ID NO: 117), y (SEQ ID NO: 118), las modificaciones se seleccionan independientemente de cualquiera o una combinación de una inserción, deleción, adición y sustitución.

Modalidad 12. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 11, en donde la secuencia ABD comprende una secuencia de motivo de unión de albúmina (ABM) .

Modalidad 13. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 11, en donde la secuencia ABD comprende una secuencia de motivo de unión de albúmina (ABM) que consiste en la secuencia de aminoácidos: GVSD X5 YK X8 X9 I Xll X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I (SEQ ID NO: 119) , en donde X5 se selecciona de Y y F; X8 se selecciona de N, R y S; X9 se selecciona de V, I, L, M, F y Y; Xll se selecciona de N, S, E y D; X12 se selecciona de R, K y N; X14 se selecciona de K y R; X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D, y X25 se selecciona de H, E y D.

Modalidad 14. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades l a 13, en donde la secuencia ABD comprende una secuencia de motivo de unión a albúmina (ABM) que no consiste en la secuencia de aminoácidos GVSDYYKNLI NAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO: 120) .

Modalidad 15. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 14, en donde la secuencia ABD comprende la secuencia de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY (SEQ ID NO: 182) unida covalentemente a una secuencia de motivo de unión a albúmina (ABM) que está además unida covalentemente a la secuencia de aminoácidos LAALP (SEQ ID NO: 183), en donde Xa se selecciona de V y E; Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L y I ; Xd se selecciona de R y K; y Xe se selecciona de D y K.

Modalidad 16. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 15, en donde la secuencia ABD comprende la secuencia de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I XI1 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I LAALP (SEQ ID NO: 121), en donde Xa se selecciona de V y E; Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L y I; Xd se selecciona de R y K; Xe se selecciona de D y K; X5 se selecciona de Y y F; X8 se selecciona de N, R y S; X9 se selecciona de V, I, L, M, F y Y; Xll se selecciona de N, S, E y D; X12 se selecciona de R, K y N; X14 se selecciona de K y R; X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D, y X25 se selecciona de H, E y D.

Modalidad 17. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 16, en donde en la secuencia ABD de la prolina C-terminal está ausente.

Modalidad 18. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16 a 17, en donde en la secuencia ABD la leucina en la posición 45 está ausente.

Modalidad 19. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16 a 18, en donde la secuencia ABD comprende además una adición N-terminal seleccionada de A, AS, G o GS .

Modalidad 20. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 16, en donde la secuencia ABD comprende la secuencia de aminoácidos LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 35) .

Modalidad 21. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 16, en donde la secuencia ABD comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (SEQ ID NO: 23), (SEQ ID NO: 24), (SEQ ID NO: 25), (SEQ ID NO: 26), (SEQ ID NO: 27), (SEQ ID NO: 28), (SEQ ID NO: 29), (SEQ ID NO: 30), (SEQ ID NO: 31), (SEQ ID NO: 32), (SEQ ID NO: 33), (SEQ ID NO: 34), (SEQ ID NO: 35), (SEQ ID NO: 122), (SEQ ID NO: 123) y (SEQ ID NO: 124) .

Modalidad 22. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 11, en donde la secuencia del ABD tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de un ABD con secuencia seleccionada del grupo que consiste en (SEQ ID NO: .23), (SEQ ID NO: 24), (SEQ ID NO: 25), (SEQ ID NO: 26), (SEQ ID NO: 27), (SEQ ID NO: 28), (SEQ ID NO: 29), (SEQ ID NO: 30), (SEQ ID NO: 31), (SEQ ID NO: 32), (SEQ ID NO: 33), (SEQ ID NO: 34), (SEQ ID NO: 35), (SEQ ID NO: 122), (SEQ ID NO: 123) y (SEQ ID NO: 124).

Modalidad 23. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16 a 22, en donde en la secuencia ABD la prolina C-terminal está ausente.

Modalidad 24. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16 a 23, en donde en la secuencia ABD la leucina en la posición 45 está ausente.

Modalidad 25. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 24, en donde el enlazador Ll es un enlazador peptídico de 1 a 30 aminoácidos.

Modalidad 26. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 25, en donde el enlazador Ll se selecciona de los 20 aminoácidos de origen natural .

Modalidad 27. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 25, en donde el enlazador Ll comprende un aminoácido no natural incorporado por síntesis química, modificación química post-traduccional o por incorporación in vivo mediante expresión récombinante en una célula hospedera.

Modalidad 28. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 27, en donde los aminoácidos del enlazador Ll se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina.

Modalidad 29. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 28, en' donde el i enlazador Ll comprende una mayoría de aminoácidos que son impedidos estéricamente .

Modalidad 30. El polipéptido manipulado 'de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 29, en donde el enlazador Ll comprende poliglicina, . polialanina, poli (Gly- Ala) o poli (Gly-Ser) . ! Modalidad 31. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 30, en donde el enlazador Ll comprende la secuencia (Gly) 3, (Gly) 4 (SEQ ID NO: 196), o (Gly) 5 (SEQ ID NO: 197) .

Modalidad 32. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 29, en donde el enlazador Ll comprende la secuencia (Gly) 3Lys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 131); (Gly) 3AsnGlySer (Gly) 2 (SEQ ID NO: 132); (Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 133); o GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 134).

Modalidad 33. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 32, en donde el enlazador Ll comprende combinaciones de Gly y Ala.

Modalidad 34. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 32, en donde el enlazador Ll comprende la combinación de Gly y Ser.

Modalidad 35. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 34, en donde el enlazador Ll se selecciona del grupo que consiste de un péptido rico en glicina.

Modalidad 36. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 35, en donde el enlazador Ll comprende un dipéptido TG N-terminal.

Modalidad 37. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 36, en donde el enlazador Ll comprende un dipéptido AS C-terminal.

Modalidad 38. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 37, en donde el enlazador Ll comprende un dipéptido TG N-terminal y un dipéptido AS C-terminal.

Modalidad 39. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 2 a 38, en donde el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de TG-(GGGS)1 (SEQ ID NO: 198), TG-(GGGS)2 (SEQ ID NO: 199), TG (GGGS)3 (SEQ ID NO: 200), TG-(GGGS)4 (SEQ ID NO: 201), TG-(GGGS)5 (SEQ ID NO: 202), (GGGS)l-AS (SEQ ID NO: 203), (GGGS)2-AS (SEQ ID NO: 204), (GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 205), (GGGS)4-AS (SEQ ID NO: 206), (GGGS) 5-AS (SEQ ID NO: 207), TG- (GGGS) 1-AS (SEQ ID NO: 208), TG- (GGGS) 2 -AS (SEQ ID NO: 209), TG- (GGGS) 3 -AS (SEQ ID NO: 210), TG (GGGS)4-AS (SEQ ID NO: 211), y TG- (GGGS) 5-AS (SEQ ID NO: 212).

Modalidad 40. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 39, en donde el dipéptido TG o dipéptido AS del enlazador Ll están ausentes o son sustituidos por un par de aminoácidos seleccionados de T, A, S, y G.

Modalidad 41. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 40, el cual se une a albúmina de suero con una constante de disociación menor de aproximadamente 10-6 mol/L.

Modalidad 42. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 41, el cual se une a albúmina de suero con una constante de disociación menor de aproximadamente 10-9 mol/L.

Modalidad 43. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 42, el cual se une a albúmina de suero con una constante de disociación inferior a aproximadamente 10-12 mol/L .

Modalidad 44. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 43, en donde el polipéptido tiene una duración de acción de al menos 1 día.

Modalidad 45. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 44, en donde el polipéptido tiene una duración de acción de al menos 3 días.

Modalidad 46. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 45, en donde el polipéptido tiene una duración de acción de al menos 6 días.

Modalidad 47. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 46, en donde el polipéptido tiene una duración de acción de al menos 6 días en un sujeto humano.

Modalidad 48. El polipéptido manipulado de cualquiera de las modalidades 1 a 47 que comprende (SEQ ID NO: 40), (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 163), (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 169), (SEQ ID NO: 170), (SEQ ID NO: 95), (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 96), (SEQ ID NO: 55), (SEQ ID NO: 53), (SEQ ID NO: 62), (SEQ ID NO: 67), (SEQ ID NO: 166), (SEQ ID NO: 167), (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 52), (SEQ ID NO: 53), (SEQ ID NO: 54), (SEQ ID NO: 55), (SEQ ID NO: 56), (SEQ ID NO: 57), (SEQ ID NO: 58), (SEQ ID NO: 59), (SEQ ID NO: 60), (SEQ ID NO: 61), (SEQ ID NO: 62), (SEQ ID NO: 63), (SEQ ID NO: 64), (SEQ ID NO: 65), (SEQ ID NO: 66), (SEQ ID NO: 67), (SEQ ID NO: 68), (SEQ ID NO: 70), (SEQ ID NO: 71), (SEQ ID NO: 72), (SEQ ID NO: 73) , (SEQ ID NO: 74) , (SEQ ID NO: 75) , (SEQ ID NO: 76), (SEQ ID NO: 77), (SEQ ID NO: 78), (SEQ ID NO: 79), (SEQ ID NO: 80) , (SEQ ID NO: 81) , (SEQ ID NO: 82) , (SEQ ID NO: 83), (SEQ ID NO: 84), (SEQ ID NO: 85), (SEQ ID NO: 86), (SEQ ID NO: 87) , (SEQ ID NO: 88) , (SEQ ID NO: 89) , (SEQ ID NO: 90), (SEQ ID NO: 91), (SEQ ID NO: 92), (SEQ ID NO: 93), (SEQ ID NO: 94), (SEQ ID NO: 95) , (SEQ ID NO: 96) , (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 98), (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 100) (SEQ ID NO: 101), (SEQ ID NO: 102) , (SEQ ID NO: 103) , (SEQ ID NO: 104) , (SEQ ID NO: 105), (SEQ ID NO: 106) , (SEQ ID NO: 107) , (SEQ ID NO: 108) o (SEQ ID NO: 109) .

Modalidad 49. El polipéptido manipulado de cualquiera de las modalidades 1 a 47 que comprende (SEQ ID NO: 40), (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 51) , (SEQ ID NO: 163) , (SEQ ID NO: 99) , (SEQ ID NO: 169) , (SEQ ID NO: 170) , (SEQ ID NO: 95) , (SEQ ID NO: 97) , (SEQ ID NO: 96), (SEQ ID NO: 55) , (SEQ ID NO: 53) , (SEQ ID NO: 62), (SEQ ID NO: 67), (SEQ ID NO: 166) o (SEQ ID NO: 167) .

Modalidad 50. El polipéptido manipulado de cualquiera de las modalidades 1 a 47 que comprende (SEQ ID NO: 40), (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43) , (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 163), (SEQ ID NO: 99) , (SEQ ID NO: 169) , (SEQ ID NO: 170), (SEQ ID NO: 95) , (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 96) O (SEQ ID NO : 55) .

Modalidad 51. Un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, que comprende administrar un polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-50 a un sujeto en necesidad del mismo en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o trastorno.

Modalidad 52. El método de acuerdo con la modalidad 51, en donde la enfermedad o trastorno es diabetes, sobrepeso, obesidad, enfermedad de Alzheimer, síndrome de intestino corto, enfermedad del hígado graso, dislipidemia , enfermedad de la arteria coronaria, apoplejía, hiperlipidemia o mal de Parkinson.

Modalidad 53. El método de acuerdo con la modalidad 52, en donde la enfermedad o trastorno es diabetes, sobrepeso, obesidad, síndrome del intestino corto o mal de Parkinson.

Modalidad 54. El método de acuerdo con la modalidad 53, en donde la enfermedad o trastorno es diabetés tipo I, diabetes tipo II o prediabetes.

Modalidad 55. El método de acuerdo con la modalidad 52, en donde la enfermedad o trastorno es diabetes tipo II.

Modalidad 56. El método de acuerdo con la modalidad 52, en donde la enfermedad o trastorno es dislipidemia o hiperlipidemia.

Modalidad 57. El método de acuerdo con la modalidad 52, en donde el sujeto en necesidad de tal tratamiento es obeso.

Modalidad 58. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-50 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Modalidad 59. La composición farmacéutica de acuerdo con la modalidad 58, en donde la composición farmacéutica es una composición farmacéutica oral.' Modalidad 60. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 58 a 59, en donde la composición farmacéutica es una composición farmacéutica liberación sostenida o de larga duración.

Modalidad 61. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 58 a 60, en donde la composición farmacéutica es una composición farmacéutica de una vez al día.

Modalidad 62. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 58 a 60:, en donde la composición farmacéutica es una composición farmacéutica de dos veces al día.

Modalidad 63. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 58 a 60 > en donde la composición farmacéutica es una composición farmacéutica de una vez por semana.

Modalidad 64. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 58 a 6.3 para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto.

Modalidad 65. La composición farmacéutica de la modalidad 64 en dónde la enfermedad o trastorno es diabetes, sobrepeso, obesidad, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de hígado graso, síndrome del intestino corto, dislipidemia , enfermedad de arteria coronaria, apoplejía, hiperlipidemia o mal de Parkinson.

Modalidad 66. La composición farmacéutica de la modalidad 65 en donde la enfermedad o trastorno es diabetes, sobrepeso, obesidad, síndrome del intestino corto, o mal de Parkinson.

Modalidad 67. La composición farmacéutica de la modalidad 66, en donde la enfermedad o trastorno es diabetes i tipo I, diabetes tipo II o prediabetes.

Modalidad 68. El polipéptido manipulado o composición farmacéutica de cualquiera de las modalidades 1 a 67, en donde el polipéptido manipulado o composición farmacéutica proporciona una administración una vez por semana .

Modalidad 69. El polipéptido manipulado o í composición farmacéutica de cualquiera de las modalidades 1 a 67, en donde el polipéptido manipulado o composición farmacéutica proporciona una administración una vez al día.

Modalidad 70. El polipéptido manipulado o composición farmacéutica de cualquiera de las modalidades 1 a 67, en donde el polipéptido manipulado o composición farmacéutica proporciona administración dos veces al día.

Modalidad 71. La composición farmacéutica de cualquiera de las modalidades 58 a 70, en donde el polipéptido manipulado comprende (SEQ ID NO: 40), . (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 163), (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 169), (SEQ ID NO: 170), (SEQ ID NO: 95), (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 96), (SEQ ID NO: 55), (SEQ ID NO: 53), (SEQ ID NO: 62), (SEQ ID NO: 67), (SEQ ID NO: 166), (SEQ ID NO: 167), (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 52), (SEQ ID NO: 53), (SEQ ID NO: 54), (SEQ ID NO: 55), (SEQ ID NO: 56), (SEQ ID NO: 57), (SEQ ID NO: 58), (SEQ ID NO: 59), (SEQ ID NO: 60), (SEQ ID NO: 61), (SEQ ID NO: 62), (SEQ ID NO: 63), (SEQ ID NO: 64), (SEQ ID NO: 65), (SEQ ID NO: 66), (SEQ ID NO: 67), (SEQ ID NO: 68), (SEQ ID NO: 70), (SEQ ID NO: 71), (SEQ ID NO: 72), (SEQ ID NO: 73), (SEQ ID NO: 74), (SEQ ID NO: 75), (SEQ ID NO: 76), (SEQ ID NO: 77), (SEQ ID NO: 78), (SEQ ID NO: 79), (SEQ ID NO: 80), (SEQ ID NO: 81), (SEQ ID NO: 82), (SEQ ID NO: 83), (SEQ ID NO: 84), (SEQ ID NO: 85), (SEQ ID NO: 86), (SEQ ID NO: 87), (SEQ ID NO: 88), (SEQ ID NO: 89), (SEQ ID NO: 90), (SEQ ID NO: 91), (SEQ ID NO: 92), (SEQ ID NO: 93), (SEQ ID NO: 94), (SEQ ID NO: 95), (SEQ ID NO: 96), (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 98), .(SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 100) (SEQ ID NO: 101), (SEQ ID NO: 102), (SEQ. ID NO: 103), (SEQ ID NO: 104), (SEQ ID NO: 105), (SEQ ID NO: 106), (SEQ ID NO: 107), (SEQ ID NO: 108) O (SEQ ID NO: 109) .

Modalidad 72. La composición farmacéutica de cualquiera de las modalidades 58 a 71, donde el polipéptido manipulado comprende (SEQ ID NO: 40), (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 163), (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 169),· (SEQ ID NO: 170), (SEQ ID NO: 95), (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 96), (SEQ ID NO: 55), (SEQ ID NO: 53), (SEQ ID NO: 62), (SEQ ID NO: 67), (SEQ ID NO: 166) o (SEQ ID NO: 167) .

Modalidad 73. La composición farmacéutica de cualquiera de las modalidades 58 a 71, donde el polipéptido manipulado comprende (SEQ ID NO: 40), (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 163), (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 169), ,(SEQ ID NO: 170), (SEQ ID NO: 95), (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 96) o (SEQ ID NO: 55) .

Modalidad 74. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 58 a 67 en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de (SEQ ID NO: 95) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polipéptido que manipulado caracterizado porque comprende: una secuencia de polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) y una primera secuencia de dominio de hormona péptida (HD1) seleccionada de una secuencia de exendin, una secuencia de análogos de exendin, una secuencia de fragmentos activos de exendin o una secuencia de fragmentos activos de análogos de exendin. 2. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además un primer enlazador (Ll) que enlaza covalentemente la secuencia ABD y la secuencia HD1. 3. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia ABD como una porción C-terminal y la secuencia HD1 como una porción N-terminal. 4. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque tiene la estructura HD1-ABD. 5. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque tiene la estructura HDl-Ll-ABD . 6. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia HD1 consiste de la secuencia de exendin o la secuencia de análogos de exendin. 7. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de exendin es una secuencia de exendin-4. 8. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de fragmentos activos de es la secuencia de exendin-4 (1-28) , exendin-4 (1-29) , exendin-4 (1-30) , exendin-4 (1-31) o exendin-4 (1-32) (SEQ ID NO: 2) . 9. El polipéptido manipulado de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia del exendin o análogo de exendin comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en (SEQ ID NO: 3), (SEQ ID NO: 4), (SEQ ID NO: 2), (SEQ ID NO: 111), (SEQ ID NO: 112), (SEQ ID NO: 113), (SEQ ID NO: 114), (SEQ ID NO: 115), (SEQ ID NO: 116), (SEQ ID NO: 117), y (SEQ ID NO: 118). 10. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de análogos de exendin tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de exendin-4 o con una secuencia de análogos de exendin seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias (SEQ ID NO: 3), (SEQ ID NO: 4), (SEQ ID NO: 2), (SEQ ID NO: 111), (SEQ ID NO: 112), (SEQ ID NO: 113), (SEQ ID NO: 114), (SEQ ID NO: 115), (SEQ ID NO: ??'ß) , (SEQ ID NO: 117), y (SEQ ID NO: 118). 11. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de análogos de exendin comprende de 1 a 5. modificaciones de aminoácido con relación a la secuencia de exeridin-4, las modificaciones se seleccionan independientemente de cualquiera o una combinación de una inserción, deleción, adición y sustitución. 12. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia ABD comprende una secuencia de motivo de unión de albúmina (ABM) . 13. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porqué la secuencia ABD comprende una secuencia de motivo de unión de albúmina (ABM) que consiste en la secuencia de aminoácidos: GVSD X5 YK X8 X¾ I Xn X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X2 X25 I (SEQ ID NO: 119) , en donde , X5 se selecciona de Y y F; 1 X8 se selecciona de N, R y S; X9 se selecciona de V, I, L, M, F y Y; Xn se selecciona de N, S, E y D; Xi2 se selecciona de R, K y N; Xi se selecciona de K y R; X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D; y X25 se selecciona de H, E y D. 14. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia ABD comprende una secuencia de motivo de unión a albúmina (ABM) que no consiste en la secuencia de aminoácidos GVSDYYK LI NAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO: 120) . 15. El polipéptido manipulado de conformidad con la i reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia ABD comprende la secuencia de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY (SEQ ID NO: 182) unida covalentemente a una secuencia de motivo de unión 'a albúmina (ABM) que está además unida covalentemente a la secuencia de aminoácidos LAALP (SEQ ID NO: 183), en donde Xa se selecciona de V y E; ; Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L y I; Xd se selecciona de R y K; y Xe se selecciona de D y K. 16. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia ABD comprende la secuencia de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 ?? X8 X9 I XX1 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I LAALP (SEQ ID NO: 121) , en donde Xa se selecciona de V y E; Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L y I; Xd se selecciona de R y K; Xe se selecciona de D y K; X5 se selecciona de Y y F; Xa se selecciona de N, R y S; X9 se selecciona de V, I, L, M, F y Y; X11 se selecciona de N, S, E y D X12 se selecciona de R, K y N; Xl4 se selecciona de K y R; X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S, 23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L ¦ X25 se selecciona de H, E y D. 17. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque en la secuencia ABD de la prolina C-terminal está ausente. 18. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque en la secuencia ABD la leucina en la posición 45 está ausente. 19. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia ABD comprende además una adición N-terminal seleccionada de A, AS, G o GS. 20. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia ABD comprende la secuencia de aminoácidos LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLI KAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 35) . 21. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia ABD comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (SEQ ID NO: 23), (SEQ ID NO: 24), (SEQ ID NO: 25), (SEQ ID NO: 26), (SEQ ID NO: 27), (SEQ ID NO: 28), (SEQ ID NO: 29), (SEQ ID NO: 30), (SEQ ID NO: 31), (SEQ ID NO: 32), (SEQ ID NO: 33), (SEQ ID NO: 34), (SEQ ID NO: 35), (SEQ ID NO: 122), (SEQ ID NO: 123) y (SEQ ID NO: 124). 22. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia del ABD tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de un ABD con secuencia seleccionada del grupo que consiste en (SEQ ID NO: 23), (SEQ ID NO: 24), (SEQ ID NO: 25), (SEQ ID NO: 26), (SEQ ID NO: 27), (SEQ ID NO: 28), (SEQ ID NO: 29), (SEQ ID NO: 30), (SEQ ID NO: 31), (SEQ ID NO: 32), (SEQ ID NO: 33), (SEQ ID NO: 34), (SEQ ID NO: 35), (SEQ ID NO: 122), (SEQ ID NO: 123) y (SEQ ID NO: 124) . 23. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque en la secuencia ABD la prolina C-terminal está ausente. 24. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque en la secuencia ABD la leucina en la posición 45 está ausente. 25. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll es un enlazador peptídico de 1 a 30 aminoácidos. 26. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el enlazador Ll se selecciona de los 20 aminoácidos de origen natural. 27. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el enlazador Ll comprende un aminoácido no natural incorporado por síntesis química, modificación química post-traduccional o por incorporación in vivo mediante expresión recombinante en una célula hospedera. 28. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque los aminoácidos del enlazador Ll se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. 29. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una mayoría de aminoácidos que son impedidos estéricamente . 30. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll comprende poliglicina, polialanina, poli (Gly-Ala) ó poli (Gly-Ser) . 31. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el enlazador Ll comprende la secuencia (Gly)3, (Gly)4- (SEQ ID NO: 196), o (Gly)5 (SEQ ID NO: 197). 32. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll comprende la secuencia (Gly) 3Lys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 131); (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 132); (Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 133); o GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 134). 33. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll comprende combinaciones de Gly y Ala. 34. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll comprende la combinación de Gly y Ser. 35. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll se selecciona del grupo que consiste de un péptido rico en glicina. 36. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll comprende un dipéptido TG N-terminal. 37. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll comprende un dipéptido AS C-terminal. 38. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll comprende un dipéptido TG N-terminal y un dipéptido AS C-terminal. 39. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo qúe consiste de TG-(GGGS)! (SEQ ID NO: 198), TG-(GGGS)2 (SEQ ID, NO: 199), TG-(GGGS)3 (SEQ ID NO: 200), TG-(GGGS)4 (SEQ ID NO :¡ 201), TG-(GGGS)5 (SEQ ID NO: 202), (GGGS) ?-AS (SEQ ID NO: 203), (GGGS)a-AS (SEQ ID NO: 204), (GGGS)3-AS (SEQ ID ' NO: 205), (GGGS)4-AS (SEQ ID NO: 206), (GGGS)5-AS (SEQ ID N0:; 207), TG-(GGGS)i-AS (SEQ ID NO: 208), TG- (GGGS) 2-AS (SEQ IDi NO: 209), TG- (GGGS) 3-AS (SEQ ID NO: 210), TG- (GGGS) 4-AS (SEQ ID NO: 211), y TG- (GGGS) 5-AS (SEQ ID NO: 212). 40. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el dipéptido TG o dipéptido AS del enlazador Ll están ausentes o son sustituidos por un par de aminoácidos seleccionados de T, A, S, y G. 41.' El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a albúmina de suero con una constante de disociación menor de aproximadamente 10"6 mol/L. 42. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque se une a albúmina de suero con una constante de disociación menor de aproximadamente 10~9 mol/L. 43. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque se une a albúmina de suero con una constante de disociación inferior a aproximadamente 10~12 mol/L. 44. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una duración de acción de al menos 1 día. 45. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque tiene una duración de acción de al menos 3 días. 46. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque tiene una duración de acción de al menos 6 días. 47. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque tiene una duración de acción de al menos 6 días en un sujeto humano. 48. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende (SEQ ID NO: 40) , (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 51) , (SEQ ID NO: 163) , (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 169) , (SEQ ID NO: 170), (SEQ ID NO: 95) , (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 96) , (SEQ ID NO: 55) , (SEQ ID NO: 53), (SEQ ID NO: 62), (SEQ ID NO: 67) , (SEQ ID NO: 166) , (SEQ ID NO: 167), (SEQ ID NO: 51) , (SEQ ID NO: 52) , (SEQ ID NO: 53) , (SEQ ID NO: 54), (SEQ ID NO: 55), (SEQ ID NO: 56), (SEQ ID NO: 57) , (SEQ ID NO: 58) , (SEQ ID NO: 59) , (SEQ ID NO: 60), (SEQ ID NO: 61), (SEQ ID NO: 62), (SEQ ID NO: 63), (SEQ ID NO: 64), (SEQ ID NO: 65) , (SEQ ID NO: 66) , (SEQ ID NO: 67) , (SEQ ID NO: 68), (SEQ ID NO: 70), (SEQ ID NO: 71), (SEQ ID NO: 72), (SEQ ID NO: 73) , (SEQ ID NO: 74) , (SEQ ID NO: 75) , (SEQ ID NO: 76), (SEQ ID NO: 77), (SEQ ID NO: 78), (SEQ ID NO: 79), (SEQ ID NO: 80) , (SEQ ID NO: 81) , (SEQ ID NO: 82) , (SEQ ID NO: 83), (SEQ ID NO: 84), (SEQ ID NO: 85), (SEQ ID NO: 86), (SEQ ID NO: 87) , (SEQ ID NO: 88) , (SEQ ID NO: 89) , (SEQ ID NO: 90), (SEQ ID NO: 91), (SEQ ID NO: 92), (SEQ ID NO: 93), (SEQ ID NO: 94) , (SEQ ID NO: 95) , (SEQ ID NO: 96) , (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 98), (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 100) (SEQ ID NO: 101), (SEQ ID NO: 102) , (SEQ ID NO: 103) , (SEQ ID NO: 104) , (SEQ ID NO: 105), (SEQ ID NO: 106) , (SEQ ID NO: 107) , (SEQ ID NO: 108) o (SEQ ID NO: 109) . 49. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende (SEQ ID NO: 40), (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 163), (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 169), (SEQ ID NO: 170), (SEQ ID NO: 95), (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 96), (SEQ ID NO: 55), (SEQ ID NO: 53), (SEQ ID NO: 62), (SEQ ID NO: 67), (SEQ ID NO: 166) o (SEQ ID NO: 167) . 50. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende (SEQ ID NO: 40), (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 163), (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 169), (SEQ ID NO: 170), (SEQ ID NO: 95), (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 96) o (SEQ ID NO: 55). 51. Un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar el polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-50, a un sujeto en necesidad del mismo en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o trastorno. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es diabetes, sobrepeso, obesidad, enfermedad de Alzheimer, síndrome de intestino corto, enfermedad del hígado graso, dislipidemia, enfermedad de la arteria coronaria, apoplejía, hiperlipidemia o mal de Parkinson. 53. El método , de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es diabetes, sobrepeso, obesidad, síndrome del intestino corto o mal de Parkinson. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es diabetes tipo I, diabetes tipo II o prediabetes. 55. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es diabetes tipo II. 56. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es dislipidemia o hiperlipidemia . 57. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el sujeto en necesidad de tal tratamiento es obeso. 58. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones. 1-50, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 59. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque es una composición farmacéutica oral. 60. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque es una composición farmacéutica liberación sostenida o de larga duración. j 61. La composición farmacéutica de confórmida'd con la reivindicación 58, caracterizada porque es una composición farmacéutica de una vez al día. i 62. La composición farmacéutica conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque es una composición farmacéutica de dos veces al día. i ij 63. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque es una composición farmacéutica de una vez por semana. j 64. La compos con la reivindicación 58, el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto. 65. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porque la o trastorno es diabetes, sobrepeso, obesidad, de Alzheimer, enfermedad de hígado graso, síndrome del intestino I corto, dislipidemia, enfermedad de arteria coronaria, i apoplejía, hiperlipidemia o mal de Parkinson. j intestino corto, o mal de Parkinson. j 67. La composición farmacéutica de conformidad! con i la reivindicación 66, caracterizada porque la enfermedad o trastorno es diabetes tipo I, diabetes tipo II o prediabetes 68. El polipéptido manipulado o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67, caracterizado porque el polipéptido manipulado o composición farmacéutica proporciona una administración una vez por semana. 69. El polipéptido manipulado o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67, caracterizado porque el polipéptido manipulado o composición farmacéutica proporciona | una administración una vez al día. 70. El polipéptido manipulado o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de | las reivindicaciones 1 a 67, caracterizado porque el polipéptido manipulado o composición farmacéutica proporciona administración dos veces al día. 71. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 a 67, caracterizada porque el polipéptido manipulado comprende (SEQ ID NO: ¡40) , (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 163), (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 169), (SEQ ID NO: 170), (SEQ ID NO: 95), (SEQ ID NO: 97), (SEQ ID NO: 96), (SEQ ID NO: 55), (SEQ ID NO: 53), (SEQ ID NO: 162), (SEQ ID NO: 67), (SEQ ID NO: 166), (SEQ ID NO: 167), (SE'Q ID NO: 51), (SEQ ID NO: 52), (SEQ ID NO: 53), (SEQ ID NO: 54) , (SEQ ID NO: 55) , (SEQ ID NO: 56) , (SEQ ID NO: 57) , (SEQ ID (SEQ ID NO: 108) o (SEQ ID NO: 109) . j 72. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 a 67, caracterizada porque el polipéptido manipulado comprende (SEQ ID NO: 40) , (SEQ ID NO: 41) , (SEQ ID NO: 42) , (SEQ ID NO: 43) , (SEjQ ID NO: 51) , (SEQ ID NO: 163), (SEQ ID NO: 99) , (SEQ ID NO: 169), (SEQ ID NO: 170) , (SEQ ID NO: 95) , (SEQ ID NO: 97) , (SEQ ID I NO: 96), (SEQ ID NO: 55), (SEQ ID NO: 53), (SEQ ID NO: ¡62), (SEQ ID NO: 67), (SEQ ID NO: 166) o (SEQ ID NO: 167) . 73. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 a 67, caracterizada porque el polipéptido manipulado comprende (SEQ ID NO: |40), (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 51), (SEQ ID NO: 163), (SEQ ID NO: 99), (SEQ ID NO: 169), (SEQ ID NO: 170), (SEQ ID NO: 95), (SEQ ID NO: 97), (SÉQ ID NO: 96) O (SEQ ID NO: 55) . 74. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 a 67, zada porque el polipéptido manipulado comprende (SEQ ID NO: 95) .