MX2013001303A - Metodos para inhibir fucosilacion de proteina in vivo utilizando analogos de fucosa. - Google Patents

Metodos para inhibir fucosilacion de proteina in vivo utilizando analogos de fucosa.

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Abstract

La invención proporciona métodos y composiciones para inhibir la fucosilación de proteínas, incluyendo anticuerpos, in vivo por administración de un análogo de fucosa.

Description

METODOS PARA INHIBIR FÜCOSILACION DE PROTEINA IN VIVO UTILIZANDO ANÁLOGOS DE FUCOSA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente de los E.U.A. Número de Serie 61/371,116, presentada en agosto 5, 2010, la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN L-fucosa, también referida como 6-deoxi-L-galactosa, es un monosacárido que es un componente de algunos glicanos y glicolípidos N- y O-enlazados en animales. (ver Becker y Lowe, Glicobiology 13:41R-51R (2003)). Fucosa típicamente se agrega como una modificación terminal a glicanos, incluyendo glicanos enlazados a antígenos de grupo sanguíneo, selectinas y anticuerpos. La fucosa puede conectarse a glicanos mediante a(l, 2)-, a(1,3)-, a(l,4)- y a(?,6)- enlaces por fucosiltransferasas específicas. Los enlaces a (1, 2) -fucosa típicamente se asocian con los antígenos de grupo de sangre H. Los enlaces oc(l,3) - y a(l,4)-fucosa están asociados con modificación de antígenos de Lewisx. Enlaces <x ( 1 , 6)-fucosa están asociados con moléculas GlcNAc N-enlazadas, tales como aquellas en anticuerpos.
La fucosilación de proteínas se considera que juega un papel en el desarrollo' de mamíferos. Ratones homocigotos para mutación dirigida del gen FX exhiben anormalidades pleiotrópicas incluyendo un fenotipo letal. Recuperación reducida de ratones de cruces heterocigotos también se reportó. (Becker et al., Mammalian Genome 14:130-139 (2003) . Fucosilación de proteína aberrante se ha propuesto asociada con enfermedad humana, incluyendo regulación por incremento de sialil Lewisx y sialil Lewisy en cánceres. Estos glicanos son ligandos para moléculas de E- y P-selectina. Se especula que aumentos en sialil Lewisx y sialil Lewisy glicanos en células de cáncer incrementa metástasis a través de interacción con E- y P-selectinas en el endotelio. Glicanos de fucosilación incrementada también se han observado en pacientes con artritis reumatoide . Actualmente, sin embargo, no hay enfoques de métodos terapéuticos aprobados que hacen blanco en niveles de fucosilación de proteína.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Los métodos y composiciones aquí descritos se basan en parte en los resultados inesperados presentados en los Ejemplos, que muestran que los animales a los que se administran un análogo de fucosa tienen reducida fucosilación de proteína. La fucosilación de anticuerpos y otras proteínas puede ser modulada utilizando los análogos de fucosa aquí descritos.
En un aspecto, se proporcionan métodos y composiciones para la producción in vivo de proteínas desfucosiladas . Animales, tales como mamíferos, a los que se administra un análogo de fucosa (que tiene la fórmula I, II, III, IV, V o VI) produce proteínas, tales como proteínas de superficie celular, que tienen reducida fucosilación . La reducción en fucosilación es relativa a animales sin tratar con los análogos fucosa que tiene las fórmulas I, II, III, IV, V o VI, respectivamente.
En un aspecto relacionado, se proporcionan métodos y composiciones para la producción in vivo de anticuerpos y derivados de anticuerpos con reducida fucosilación núcleo. Animales a los que se administra un análogo de fucosa (que tiene la fórmula I, II, III, IV, V o VI) produce anticuerpos y derivados de anticuerpos que tiene reducida fucosilación núcleo (es decir, reducida fucosilación de N-acetilglucosamina de las cadenas azúcar ligadas a N-glicósido complejas enlazadas a la región Fe a través de la N-acetilglucosamina de la terminal reductora de las cadenas azúcar) . La reducción en fucosilación núcleo es respecto a animales sin tratar con los análogos, fucosa de que tiene las fórmulas I, II, III, IV, V o VI, respectivamente.
En otro aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen análogos fucosa y formuladas para la administración a un animal objetivo. Los análogos fucosa pueden formularse para administración a un animal para inhibir o reducir fucosilación in vivó.
Estos y otros aspectos de la presente invención pueden comprenderse más completamente por referencia a la siguiente descripción detallada, ejemplos no limitantes de modalidades específicas, y figuras anexas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra. los resultados de administración de análogos de fucosa (mediante inyección i.p.) en fucosilación de anticuerpo. Transferencias punto o en mancha se ilustran en el panel izquierdo y una gráfica se muestra en el panel derecho. Los niveles de carga de proteína por transferencia punto o en mancha (izquierda superior) y bioluminescencia específica de fucosa (izquierda inferior) para normas de anticuerpo cAClO (transferencia punto inferior, rectángulo punteado más a la izquierda y columnas correspondientes de transferencia punto superior) , control sin tratar (transferencia punto inferior, segundo rectángulo punteado de la izquierda y la columna correspondiente de la transferencia punto superior) , y alquinil fucosa (SGD-1887; transferencia punto inferior, rectángulo punteado medio y la columna correspondiente de la transferencia punto superior) , alquinil fucosa peracetato (SGD-1890; transferencia punto inferior, segundo rectángulo punteado de la derecha y la columna correspondiente de la transferencia punto superior), y 2-fluorofucosa (SGD-2083; transferencia punto inferior, rectángulo más a la derecha y la columna correspondiente de la transferencia punto superior) . Después de corregir por nivel de carga, el % de fucosilación se muestra en la gráfica a la derecha.
La Figura 2 muestra los efectos en fucosilación de núcleo de anticuerpo de administración de análogos fucosa mediante agua potable. Las gráficas muestran % de fucosilación de, anticuerpos como se determina por cromatógrafo de gases (GC) : los paneles A y B muestran nivel de fucosilación de los anticuerpos anti-KLH (Abs) aislados de los grupos tratados mientras que los paneles C y D muestran los niveles de fucosilación de los anticuerpos IgG restantes (no específicos-KLH) . Los paneles A y C muestran el porciento de fucosilación de cada animal determinado utilizando una curva estándar de anticuerpo purificado (0-100% de fucosilación) . Los paneles B y D muestran el nivel de fucosilación de los grupos tratados como un porcentaje del valor de grupo de control sin tratar promedio.
La Figura 3 muestra los efectos en fucosilación de núcleo de anticuerpo de administración de análogos de fucosa mediante agua potable. En esta figura, niveles de fucosilación de los anticuerpos no específicos KLH se muestran. Transferencias punto de niveles de carga de proteína (izquierda superior) y bioluminescencia específica de fucosa (izquierda inferior) se muestran para normas cAClO (transferencias punto superior e inferior, rectángulo más a la izquierda) , control sin tratar (transferencias punto superior e inferior, segundo de los cuadros izquierdo (superior) y derecho)), y 2-fluorofucosa (transferencias punto superior e inferior, segundo de los rectángulos izquierdo (inferior) y segundo del rectángulo derecho (superior e inferior) ) . Después de corregir el nivel de carga, el % de fucosilación se muestra en la gráfica a la derecha .
La Figura 4 muestra los efectos de diferentes dosis de 2-fluorofucosa, administrada por agua potable, en fucosilación de núcleo de anticuerpo. Las transferencias púnto muestran niveles de carga de proteína (izquierdo) y bioluminescencia específica de fucosa (medio) para control sin tratar y SGD-2083 de 1, 10, y 100 mM (como se indica) . El % de fucosilación comparado con sin tratamiento se muestra en la gráfica a la derecha.
La Figura 5 muestra los efectos de administración de 2-fluorofucosa) en células de glóbulos blancos en circulación y neutrófilos. Panel A. Muestras de sangre se recolectaron de ratones individuales, y el conteo de glóbulos blancos se determina al contar en un hemacitómetro utilizando la solución de Turk de glóbulos rojos extruidos . Panel B. Para determinar conteo de neutrófilos,. el porcentaje de células de glóbulos blancos que fueron Gr-1+ se determinó por citometría de flujo y aplicó al conteo total de células determinado en (A) . Panel C. Un combinado de nodos linfáticos se recolecta de ratones individuales, suspensiones de células sencillas se prepararon y se contaron células en un hemacitometro . Símbolos representan ratones individuales (n=3 por grupo; diamantes, sin tratar; cuadrados, 2-fluorofucosa 1 mM (SGD-2083) ; triángulos, 2-fluorofucosa 10 mM; círculos, 2-fluorofucosa 100 mM) .
La Figura 6 muestra los efectos de administración de 2-fluorofucosa en enlace de E-selectina con neutrófilos. Panel A. Un ejemplo de identificación de neutrófilo por citometría de flujo. Las células se controlaron en dispersión directa y lateral, para incluir células de glóbulos blancos y después aplican al histograma que ilustra tinción de Gr-1 para identificar neutrófilos. Las células positivas se controlaron, el por ciento de células positivas se determinó (utilizado para recuentos de células en la Figura 5B) , y el control se aplica en los histogramas en (B) . Panel B. Ejemplos de enlace de E-selectina a neutrófilos de una animal sin tratar (izquierda) y un animal tratado con 2-fluorofucosa (SGD-2083) administrado oralmente a 100 mM (derecha) . Histogramas en gris muestran enlace de E-selectina y las líneas punteadas muestran enlace en el reactivo secundario solo. La intensidad fluorescente promedio geométrica se determinó para enlace de E-selectina. Panel C. Intensidad fluorescente promedio geométrica de enlace de E-selectina se determina para cada animal como en (?) y comparado entre grupos (n=3, por grupo; barras de error representan desviación estándar) .
La Figura 7 muestra los efectos en fucosilación de proteínas para líneas celulares cultivadas con ciertos análogos de fucosa. Las líneas celulares LS174T, PC- 3, Ramos, HL-60cy y Caki-1 se examinaron.
La Figura 8 muestra los efectos de administración de análogos de fucosa con modelos de cáncer de xenoinjerto de ratón. Los resultados de modelos de xenoinjerto de ratón con líneas celulares LS174T, PC-3, Ramos, HL-60 y Caki-1 (pre-tratadas con 2-flurofucosa (SGD-2083)), se muestran en los paneles A-E, respectivamente. Los resultados de un modelo de xenoinjerto de ratón con líneas de células LS174T sin tratar se ilustran en el panel F.
La Figura 9 muestra el diseño de estudio (panel A) y resultados (panel B) de un modelo de vacuna de tumor con base en pre- inmunización con células de linfoma murino A20 exterminadas, seguido por prueba con células A20 vivas con o sin administración de un análogo de fucosa, (2-fluorofucosa) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones El término "anticuerpo" se refiere a (a) polipéptidos de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de polipéptidos de inmunoglobulina, ' es decir, polipéptidos de la familia de inmunoglobulina o sus fragmentos, que contienen uno o varios sitios de enlace de antígeno que ligan inmuno específicamente un antígeno específico y tienen un dominio Fe que comprende una o varias cadenas azúcar ligadas con N-glicósido complejo o (b) derivados substituidos de manera conservadora de estos polipéptidos de inmunoglobulina o fragmentos que ligan en forma inmuno específica con el antígeno. Anticuerpos en general se describen por ejemplo, Harlow & Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) .
Un "derivado de anticuerpo" significa un anticuerpo, como se definió anteriormente (incluyendo un fragmento de anticuerpo) o dominio o región Fe de un anticuerpo que comprende una cadena azúcar enlazada con N-glicósido complejo, que se modifica por conexión covalente de una molécula heteróloga tal como, por ejemplo, por enlace de un polipéptido heterólogo (es decir, un dominio de enlace de ligando de proteína heteróloga) o por glicosilación (otras diferente a fucosilación núcleo) , desglicosilación (diferente a fucosilación sin núcleo) , acetilación, fosforilación u otra modificación normalmente no asociada con el anticuerpo o dominio o región Fe .
La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un clon de célula sencilla, incluyendo cualquier clon de células eucarióticas o procarióticas o un clon fago, y no el método por el cual se produce. De esta manera, la expresión "anticuerpo monoclonal" no se limita a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma.
La expresión "región Fe" se refiere se refiere a la región constante de un anticuerpo, por ejemplo, un dominio CHl-bisagra-CH2-CH3 , que opcionalmente tiene un dominio CH4 o un derivado substituido en forma conservadora de esta región Fe .
La expresión "dominio Fe" se refiere a dominio de región constante de un anticuerpo, por ejemplo, una bisagra CH1, CH2, dominio CH3 o CH4 o un derivado substituido de manera conservadora de este dominio Fe.
Un "antígeno" es una molécula a la cual se liga específicamente un anticuerpo o derivado de anticuerpo.
Las expresiones "enlace específico" y "enlaza específicamente" significan que el anticuerpo o derivado de anticuerpo enlazará, en una forma altamente selectiva con su antígeno objetivo correspondiente y no con la multitud de otros antígenos. Típicamente, el anticuerpo o derivado de anticuerpo liga con afinidad de al menos aproximadamente lxlO"7 M, y de preferencia 10"8 M a 10"9 M, 10~10 M, 10"11 M o 10"12 M y liga al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad para enlace con un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) diferente al antígeno predeterminado o un antígeno cercanamente relacionado.
Los términos "inhibir" o "inhibición de" significan reducir por una cantidad medible o evitarlo completamente.
Como se emplea aquí, "alquinil fucosa peracetato" se refiere a cualquiera o todas las formas de alquinil fucosa (5-etinilarabinosa) con grupos acetato en las posiciones R1"4 (ver fórmula I y II, arriba), incluyendo 6-etinil-tetrahidro-2H-piran-2 , 3 , 4 , 5-tetrail tetraacetato, incluyendo los (isómeros 2S, 3S, 4R, 5R, 6S) y (2R, 3S, 4R, 5R, 6S) , y 5- ( (S) -1-hidroxiprop-2-inil) -tetrahidrofuran-2 , 3 , 4-triil tetraacetato, incluyendo los isómeros (2S, 3S, 4R, 5R) y (2R, 3S, 4R, 5R) , y la forma aldosa, a menos que se indique de otra forma por contexto. Las expresiones "alquinil fucosa triacetato", "alquinil fucosa diacetato" y "alquinil fucosa monoacetato" se refiere a las formas tri-, di- y mono-acetato indicadas de alquinil fucosa, respectivamente.
A menos que se indique de otra forma por contexto, el término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo de cadena recta o ramificada insaturado sin substituir, que tiene de 1 a 20 'átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono ahí) , a menos que se especifique de otra forma. Un grupo alquilo de l a 3, 1 a 8 ó 1 a 10 átomos de carbono se prefiere. Ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, n-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil- 2-butilp, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-l-butilo, . 2-metil-l-butilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2 -metil-2 -pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3 -metil-3 -pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2, 3-dimetil-2-butilo, y 3 , 3-dimetil-2-butilo .
Grupos alquilo, ya se solos o como parte de otro grupo, cuando se substituyen pueden ser substituidos con uno o más grupos, de preferencia 1 a 3 grupos (y cualesquiera substituyentes adicionales seleccionados de halógeno) , incluyendo pero no limitados a: halógeno, -O- (Ci-C8 alquilo), -0-(C2-C8 alquenilo) , -0- (C2-C8 alquinilo) , arilo, -C(0)R' , -0C(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, NHC(0)R', -SR' , -S03R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, =0, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 Y -CN; en donde cada R' se elige independientemente de -H, -Cx-Cñ alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o arilo.
A menos que se 'indique de otra forma por contexto, los términos "alquenilo" y "alquinilo" se refieren a cadenas de carbono rectas o ramificadas sin substituir u opcionalmente substituidas (cuando se indique) que tiene de 2 a 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono), con de 2 a 3, 2 a 4, 2 a 8 ó 2 a l0 átomos de, carbono preferidos. Una cadena alquenilo tiene cuando menos un doble enlace en la cadena y una cadena alquinilo tiene cuando menos un triple enlace en la cadena. Ejemplos de grupos alquenilo incluyen pero no están, limitados a, etileno o vinilo, alilo, -1 butenilo, -2 butenilo, isobutilenilo, -1 pentenilo, -2 pentenilo, 3 -metil-l-butenilo, -2 metil 2 butenilo, y -2,3 dimetil 2 butenilo. Ejemplos de grupos alquinilo incluyen, pero no están limitados a, acetilénico, propargilo, acetilenilo, propinilo, -1 butinilo, -2 butinilo, -1 pentinilo, 2 pentinilo, y -3 metil 1 butinilo.
Grupos alquenilo y alquinilo, ya sea solos o como parte de otro grupo, cuando están substituidos pueden ser substituidos con uno o más grupos, de preferencia 1 a 3 grupos (y cualesquiera substituyentes adicionales seleccionados de halógeno), incluyendo pero no limitados a: halógeno, -0- (Ci-C8 alquilo) , -0- (C2-C8 alquenilo) , -O- (C2-C8 alquinilo), -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(O)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -SR' , -S03R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, =0, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se elige independientemente de H, -Ci-C8 alquilo, -C2-C alquenilo, -C2-C8 alqunilo o arilo.
A meos que se indique de otra forma por contexto, el término "alquileno" se refiere a un radical hidrocarburo de cadena recta o ramificada, sin substituir, saturado, que tiene de 1 a 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono ahí) , con de l a 8 o l a l0 átomos de carbono que se prefieren y tienen dos centros de radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno de los mismos o dos átomos de carbono diferentes de un alcano precursor. Típicamente alquílenos incluyen, pero no están limitados a, metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno, decaleno, 1, 4-ciclohexileno, y semejantes.
Grupos alquileno, ya sea solos o como parte de otro grupo, cuando están substituidos, pueden estar substituidos con uno o más grupos, de preferencia l a 3 grupos (y cualesquiera substituyentes adicionales seleccionados de halógeno) , incluyendo pero no limitados a: halógeno, -0-(Ci-C8 alquilo) , -O- (C2-C8 alquenilo) , -O- (C2-C8 alquinilo) , -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -SR' , -S03R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, =0, -NH2, - NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se elige independientemente de H, -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -arilo.
"Alquenileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado de cadena recta o ramificada o cíclico, de un grupo alquenilo (como se describió anteriormente) , y que tiene dos centros de radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos diferentes átomos de carbono de un alqueno precursor. Un grupo "alquenileno" puede estar . sin substituir u opcionalmente substituido (cuando se indique) , como se describió con anterioridad para grupos alquenilo. En algunas modalidades, un grupo "alquenileno" no está substituido.
"Alquinileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado, de cadena recta o ramificada o cíclico de un grupo alquinilo (como sé describió anteriormente) , y que tiene dos centros de radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbón diferentes de un alquino precursor. Un grupo "alquinileno" puede estar sin substituir u opcionalmente substituido (cuando se indique) , como se describió con anterioridad para grupos alquinilo. En algunas modalidades, un grupo "alquinileno" no está substituido.
A menos que se indique de otra forma por contexto, el término "arilo" se refiere a un radical hidrocarburo aromático monovalente substituido o no substituido de 6-20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono ahí) derivados por la eliminación de un átomo de hidrógeno a partir de un átomo de carbono sencillo de un sistema de anillo aromático precursor. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras ejemplares como "Ar" .
Grupos arilo típicos incluyen, pero no están limitados a, radicales derivados de benceno, benceno substituido, fenilo, naftaleno, antraceno, bifenilo, y semejantes.
Un grupo arilo, ya sea solo o como parte de otro grupo, puede estar opcionalmente substituido con uno o más, de preferencia 1 a 5 o incluso 1 a 2 grupos incluyendo, pero no limitado a: halógeno, -Ci-C8 alquilo, -G2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo, -0- (Ci-C8 alquilo), -O- (C2-C8 alquenilo), -0- (C2-C8 alquinilo), -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -SR' , -S03R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -N02, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde R' se elige independientemente de H, -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o arilo.
A menos que se indique de otra forma por contexto, el término "heterociclo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico substituido o sin substituir que tiene de 3 a 7 o 3 a 10, átomos de anillo (también referido como miembros de anillo) en donde al menos un átomo de anillo es un heteroátomo seleccionado de N, O, P o S (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono y heteroátomos ahí) . El heterociclo puede tener de 1 a 4 heteroátomos de anillo seleccionados independientemente de N, 0, P o S. Uno o más átomos de N, C o S en un heterociclo pueden estar oxidados. Un heterociclo monocíclico de preferencia tiene 3 a 7 miembros de anillo [por ejemplo, 2 a 6 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O, P o S) . El anillo que incluye el heteroátomo puede ser aromático o no aromático. A menos que se anote de otra forma, el heterociclo se conectas a su grupo secundario o dependiente en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que resulta en una estructura estable.
Heterociclos se describen en Paquette, "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" {VI. A. Benjamín, New York, 1968), particularmente los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 a la actualidad), en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y J. Am. Chem. Soc. 82:5566 (1960). Ejemplos de grupos "heterociclo" incluyen a manera de ejemplo y no de limitación piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo) , tiazolilo, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, fucosilo, azirdinilo, azetidinilo, oxiranilo, oxetanilo, y tetrahidrofuranilo.
Un grupo heterociclo, ya sea solo o como parte de otro grupo, cuando está substituido puede estar substituido con uno' o más grupos, de preferencia 1 a 2 grupos, incluyendo pero no limitados a: -Cx-Cs alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo, halógeno, -0- (Ci-C8 alquilo) , -O- (C2-C8 alquenilo) , -0-(C2-C8 alquinilo), -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)0R', - C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -SR' , -S03R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -NH2 , -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se elige independientemente de H, -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -arilo.
A manera de ejemplo y no de limitación, heterociclos enlazados con carbono pueden estar ligados en las siguientes posiciones: posición 2, 3, 4, 5 ó .6 de una piridina; posición 3, 4, 5 ó 6 de una piridazina; posición 2, 4, 5 ó 6 de una pirimidina,- posición 2, 3, 5 ó 6 de una pirazina; i posición 2, 3, 4 ó 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrolo; posición 2 , 4 ó 5 de un oxazol , imidazol o tiazol; posición 3, 4 ó 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol; posición 2 ó 3 de una aziridina; o posición 2, 3 ó 4 de una azetidina. Heterociclos enlazados con carbono ejemplares pueden incluir 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4 -piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridaziniio, 2-pirimidinilo, 4 -pirimidinilo , 5-pirimidinilo, 6 -pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo.
A manera de ejemplo y no de limitación, heterociclos ligados a nitrógeno pueden ser unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrólo, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2- imidazolina, § 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3 -pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina o lH-indazol; posición 2 de un isoindol o isoindolina; y posición 4 de una morfolina. Aún más típico, heterociclos ligados a nitrógeno incluyen 1-aziridilo, 1-azetidilo, 1-pirrolilo, 1-imidazólilo, 1-pirazolilo, y 1-piperidinilo .
A menos que se anote de otra forma, el término "carbociclo" , se refiere a un sistema de anillo monocíclico substituido o no substituido, saturado o insaturado no aromático que tiene de 3 a 6 átomos de anillo (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono ahí) , en donde todos los átomos de anillo son átomos de carbono.
Grupos carbociclo, ya sea solo o como parte de otro grupo, cuando están substituidos pueden estar substituidos por ejemplo con uno o más grupos, de preferencia 1 o 2 grupos (y cualesquiera substituyentes adicionales seleccionados de halógeno), incluyendo pero no limitados a: halógeno, Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo, -O- (Ci-C8 alquilo), -O- (C2-C8 alquenilo), -0- (C2-C8 alquinilo), arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -SR' , -S03R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, =0, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde R' se elige independientemente de H, -Cx-Cs alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2- C8 alquinilo o arilo.
Ejemplos de substituyentes carbocíclicos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, l-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3 -enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-l-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, l-ciclohex-3-enilo, cicloheptilo , ciclooctilo, -1, 3-ciclohexadienilo, -1, 4-ciclohexadienilo, 1 , 3-cicloheptadienilo, -1, 3 , 5-cicloheptatrienilo, y ciclooctadienilo .
Cuando ocurre cualquier variable más de una vez en cualquier constituyente o en cualquier fórmula, su definición en cada ocurrencia es independiente de su definición en cualquier otra. Combinaciones de substituyentes y/o variables son permisibles solo si estas combinaciones resultan en compuestos estables.
A menos que se indique de otra forma por contexto, un ión (-) designa el punto de conexión con la molécula dependiente. De acuerdo con esto, el término "- (Ci-Ci0 alquileno) arilo" o W-Ci-Ci0 alquileno (arilo)" se refiere a un radical Ci-Ci0 alquileno como se define aquí en donde el radical alquileno se conecta a la molécula dependiente o secundaria, en cualquiera de los átomos de carbono del radical alquileno y uno del átomo de hidrógeno unido a un átomo de carbono del radical alquileno se reemplaza con un radical arilo como se define aquí.
Cuando un grupo particular está "substituido", ese grupo puede tener uno o más substituyentes , de preferencia de uno a cinco substituyentes, más preferible de uno a tres substituyentes, más preferible de uno a dos substituyentes, independientemente seleccionados de la lista de substituyentes. El grupo puede sin embargo, en general tener cualquier cantidad de substituyentes seleccionados de halógeno.
Se pretende que la definición de cualquier substituyente o variable en una ubicación particular en una molécula sea independiente de sus definiciones en otra parte de esa molécula. Se entiende que los substituyentes y patrones de substitución en los compuestos de esta invención pueden seleccionarse por una persona con destreza ordinaria en la técnica para proporcionar compuestos que son activos y químicamente estables y que pueden fácilmente sintetizarse por técnicas conocidas en la especialidad así como aquellos métodos aquí establecidos.
La expresión "farmacéutico (a) aceptable" significa aprobado (a) por un agencia regulatoria del gobierno Federal o Estatal o citado en la Farmacopea de los E.U.A. u otra farmacopea generalmente reconocida para utilizar en animales y. más particularmente en humanos. La expresión "ingrediente farmacéutico compatible" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutico aceptable, con el cual se administra el análogo fucosa.
"Pequeños grupos que retiran electrones" se refiere a cualquier substituyente que tiene mayor electronegatividad en el sitio de conexión de substituyente que, por ejemplo, un átomo de hidrógeno o grupo hidroxi o respecto al substituyente presente en fucosa en ese sitio. En general, el pequeño grupo que retira electrones tiene 10 o menos átomos (diferente a hidrógeno) e incluye grupos tales como nitro . ciano y cianoalquilo (e.g., -CH2CH2CN) ; halógenos; acetileno u otros alquinos o halo alquinos (e.g., -C=CCF3) ; alquenos o halo alquenos; alenos; ácidos carboxílicos , éster, amidas y sus formas halo substituidas; ácidos sulfónicos y fosfónicos, esteres y amidas, y sus formas halo substituidas; grupos haloalquilo (e.g., -CF3, -CHF2, -CH2CF3) , acilo y grupos haloacilo (e.g., -C(0)CH3 y -C(0)CF3); alquilsulfonilo y haloalquilsulfonilo (e.g., -S (O) 2alquilo y -S (0) 2háloalquilo) ; ariloxi (e.g., fenoxi y fenoxi substituido); aralquiloxi (e.g, benziloxi y benziloxi substituido); y oxiranos. Grupos pequeños que retiran electrones preferidos son aquellos que tienen 8, 7 ó 6 o menos átomos (diferente a hidrógeno) .
Los análogos de fucosa típicamente son puros de manera substancial de contaminantes indeseados. Estos significa que · el análogo típicamente es al menos que aproximadamente 50% p/p (peso/peso) de pureza, así como substancialraente libres de proteínas de interferencia y otros contaminantes . En ocasiones los agentes son al menos aproximadamente 80% p/p y más preferible al menos 90% o aproximadamente 95% p/p de pureza. Utilizando técnicas de purificación convencionales, producto homogéneo de al menos 99% p/p puede obtenerse.
General La invención proporciona métodos y composiciones para reducir fucosilación de proteínas en un animal . Los métodos se basan en parte en los resultados inesperados presentados en los Ejemplos, que muestran que administrar un análogo fucosa a un sujeto (por ejemplo, un mamífero) resulta en un anticuerpo o derivado de anticuerpo que tiene reducida fucosilación núcleo, y otras proteínas que también tienen reducida fucosilación. "Reducida fucosilación" en el contexto de proteínas en general se refiere a reducida adición de fucosa a glicanos mediante enlaces a(l,2)-, cc(l,3)-, 0.(1,4)- y a(l,6)-. "Fucosilación núcleo" en el contexto de un anticuerpo se refiere a la adición de fucosa ("fucosilación") a N-acetilglucosamina ("GlcNAc") en la terminal- reductora de un glicano N-enlazado de un anticuerpo. "Fucosilación núcleo reducida" en el contexto de un anticuerpo se refiere a una reducción de fucosa enlazada a N-acetilglucosamina ("GlcNAc") en la terminal reductora de un glicano N-enlazado de un anticuerpo, en comparación con un animal sin tratar.
En los diversos aspectos aquí descritos, el animal al cual el análogo de fucosa se administra, típicamente es un mamífero y de preferencia es humano. La invención por lo tanto además proporciona métodos y composiciones para reducir fucosilación de proteínas en un mamífero, tal como un humano.
En otros aspectos, composiciones farmacéuticas de análogos de fucosa y excipientes farmacéuticos se proporcionan en donde una cantidad efectiva de uno o varios análogos de fucosas está en una mezcla con los excipientes, adecuada para administración a un animal. En algunas modalidades, el análogo de fucosa está en forma seca (por ejemplo, liofilizado) , opcionalmente con estabilizantes que mejoran la estabilidad de la composición para almacenamiento a más largo plazo. En algunas modalidades, una composición farmacéutica de análogos de fucosa y excipientes farmacéuticos, se formula para administración a un mamífero. En algunas modalidades adicionales, una composición farmacéutica de análogos de fucosa y excipientes farmacéuticos se formula para administración a un humano.
En algunas modalidades, se reduce la fucosilación de cadenas azúcar ligadas con N-glicósido complejas enlazadas a la región Fe (o dominio) de un anticuerpo. Como se emplea aquí, una "cadena azúcar enlazada a N-glicósido- compleja" típicamente está enlazada con asparagina 297 (de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat) aunque una cadena azúcar enlazada a N-glicósido compleja también puede estar enlazada a otros residuos asparagina. Como se emplea aquí, la cadena azúcar enlazada a N-glicósido compleja tiene una cadena azúcar compuesta biantenaria, primordialmente que tiene la siguiente estructura: +/-Fuc 1 4GlcNAc i *2 ancx1 +/- GlcNAc i ? GlcNAc i ? 4GlcNAc 4Manpi +/-Gal 1 ? 4GlcNAcp1 ? 2Mana1 ? / en donde + indica que la molécula de azúcar puede estar presente o ausente y los número indican la posición de enlaces entre las moléculas de azúcar. En la estructura anterior, la terminal de cadena azúcar que liga a asparagina se denomina una terminal reductora (a la derecha) y el lado opuesto se denomina una terminal no reductora. Fucosa usualmente se enlaza a N-acetilglucosamina ("GlcNAc") de la terminal reductora típicamente por un enlacé al, 6 (la posición 6 de GlcNAc se enlaza en la posición 1. de fucosa) . "Gal" se refiere a galactosa y "Man" se refiere a mañosa.
Una "cadena azúcar ligada a N-glicósido compleja" excluye un tipo de cadena azúcar de alto contenido de mañosa, en donde solo mañosa se incorpora en la terminal no reductora de la estructura núcleo, pero incluye, 1) un tipo complejo, en donde el lado de terminal no reductora de la estructura núcleo tiene una o más ramificaciones de galactosa-N-acetilglucosamina (también referidas como "gal-GlcNAc" ) y el lado de terminal no reductora de Gal-GlcNAc opcionalmente tiene un ácido siálico, que bisecta N-acetilglucosamina o semejante; o 2) un tipo híbrido, en donde un lado de terminal no reductora de la estructura núcleo tiene ambas ramificaciones de la cadena azúcar enlazada a N-glicósido de alto contenido de mañosa y cadena azúcar enlazada N-glicósido compleja.
En algunas modalidades, la "cadena azúcar enlazada a N-glicósido compleja" incluye un tipo complejo en donde el lado de terminal no reductora de la estructura núcleo tiene cero, una o más ramificaciones de galactosa-N-acetilglucosamina (también referidas como "gal-GlcNAc" ) y el lado de terminal no reductora de Gal-GlcNAc opcionalmente además tiene una estructura tal como un ácido siálico, que bisecta N-acetilglucosamina o semejante, pero excluye cadenas con un componente de alto contenido de mañosa.
De acuerdo con los presentes métodos, típicamente solo una pequeña cantidad de fucosa se incorpora en la o las cadenas azúcar (por ejemplo, cadenas azúcar ligadas a N-glicósido complejo o un glicano) después de administrar un análogo fucosa. Por ejemplo, en diversas modalidades, menos de aproximadamente 60%, menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5% o menos de aproximadamente 1% de los anticuerpos en el suero del animal (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano) son fucosilados en núcleo, en comparación con un animal que no recibe el análogo fucosa. En algunas modalidades, sustancialmente ninguno (es decir, menos de 0.5%) de los anticuerpos en el suero del animal no son fucosilados en núcleo, en comparación con un animal que no recibe el análogo fucosa.
En algunas modalidades, la fucosilación de proteína se reduce en aproximadamente 60%, por aproximadamente 50%, por aproximadamente 40%, por aproximadamente 30%, por aproximadamente 20%, por aproximadamente 15%, por aproximadamente 10%, por aproximadamente 5% o por aproximadamente 1% para proteínas de superficie celular en el animal (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano) se fucosilan, en comparación con un animal que no recibe el análogo de fucosa. En algunas modalidades, la fucosilación de . proteína por enlace de a(l,2) se reduce por aproximadamente 60%, por aproximadamente 50%, por aproximadamente 40%, por aproximadamente 30%, por aproximadamente 20%, por aproximadamente 15%, por aproximadamente 10%, por aproximadamente 5% o por aproximadamente 1% para proteínas de superficie celular en el animal (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano) se fucosilan, en comparación con un animal que no recibe el análogo fucosa .
En algunas modalidades, la fucosilación de proteína mediante enlace a(l, 3) se reduce en aproximadamente 60%, por aproximadamente 50%, por aproximadamente 40%, por aproximadamente 30%, por aproximadamente 20%, por aproximadamente 15%, por aproximadamente 10%, por aproximadamente 5% o por aproximadamente 1% para proteínas de superficie celular en el animal (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano) se fucosilan en comparación con un animal que no recibe el análogo fucosa. En algunas modalidades, la fucosilación de proteína por enlace a(l,4) se reduce en aproximadamente 60%, en aproximadamente 50%, en aproximadamente 40%, en aproximadamente 30%, en aproximadamente 20%, en aproximadamente 15%, en aproximadamente 10%, en aproximadamente 5% o en aproximadamente 1% para proteínas de superficie celular en el animal (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano) se fucosilan en comparación con un animal que no recibe el análogo de fucosa.
En algunas modalidades, fucosilación de proteína mediante un enlace a(l,6) se reduce en aproximadamente 60%, por aproximadamente 50%, en aproximadamente 40%, en aproximadamente 30%, en aproximadamente 20%, en aproximadamente 15%, en aproximadamente 10%, en aproximadamente 5% o en aproximadamente 1% para proteínas de superficie celular en el animal (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano) se fucosilan, en comparación con un animal que no recibe el análogo fucosa.
En algunas modalidades, la fucosilación de células de glóbulos blancos en el suero del animal (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano) se reduce en al» menos aproximadamente 60%, en al menos aproximadamente 50%, en al menos aproximadamente 40%, en al menos aproximadamente 30%, en al menos aproximadamente 20%, en al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 10% . o en al menos aproximadamente 5*%, en comparación con un animal que no recibe el análogo fucosa. En algunas modalidades, fucosilación mediante enlaces a(l,3) de los glóbulos blancos en el suero del animal (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano) se reduce en al menos aproximadamente 60%, en al menos aproximadamente 50%, en al menos aproximadamente 40%, en al menos aproximadamente 30%, en al menos aproximadamente 20%, en al menos aproximadamente 15%,* en al menos aproximadamente 10% o en al menos aproximadamente 5%, en comparación con un animal que no recibe el análogo fucosa. En algunas modalidades, la fucosilación mediante enlaces a(1,4) de glóbulos blancos en el suero del animal (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano) se reduce en al menos aproximadamente 60%, en al menos aproximadamente 50%, en al menos aproximadamente 40%., en al menos aproximadamente 30%, en al menos aproximadamente 20%, en al menos aproximadamente 15%, en al. menos aproximadamente 10% o en al menos aproximadamente 5%, en comparación con un animal que no recibe el análogo de fucosa.
En algunas modalidades, fucosilación de anticuerpos en el suero del animal (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano) se reduce al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 10% o al menos aproximadamente 5%, en comparación con un animal que no recibe el. análogo de fucosa.
En ciertas modalidades, solo una cantidad menor de un análogo de fucosa (o un metabolito o producto del análogo de fucosa) se incorpora en glicanos (por ejemplo la o las cadenas azúcar enlazadas a N-glicósido complejo) del anticuerpo, derivado de anticuerpo u otros glicanos de proteínas. Por ejemplo, en diversas modalidades, menos de aproximadamente 60%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5% o menos de aproximadamente 1% del análogo de fucosa (o un metabolito o producto del análogo de fucosa) se incorporan en glicanos de los anticuerpos en el suero del animal, en comparación con un animal que no recibe el análogo de fucosa. En algunas modalidades, menos de aproximadamente 60%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5% o menos de aproximadamente 1% del análogo de fucosa (o un metabolito o producto del análogo de fucosa) se incorporan en glicanos de las proteínas de superficie celular del animal, en comparación con un animal que no recibe el análogo de fucosa.
En algunas modalidades, menos de aproximadamente 60%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5% o menos de aproximadamente 1% del análogo de fucosa (o un metabolito o producto del análogo , de fucosa) se incorporan en glicanos de glóbulos blancos en el suero del .animal, eri comparación con un animal que no recibe el análogo de fucosa.
Análogos de fucosa Análogos de fucosa convenientes para los métodos de la presente invención (identificados como Fórmulas I, II, III, IV, V y VI) son aquellos que pueden ser administrados en forma segura, a un mamífero en una cantidad efectiva para inhibir fucosilación núcleo de cadenas azúcar ligadas a N-glicósido complejo de anticuerpos o derivados de anticuerpo. Análogos de fucosa se describen en la Solicitud de Patente de los E.U.A. Publicada 2009-0317869 que reducen la incorporación de fucosa en cadenas azúcar enlazadas a N-glicósido complejo de anticuerpos o derivados de anticuerpos producidos por células hospederas in vitro. El análogo fucosa puede suministrarse a un sujeto animal (por ejemplo, un mamífero) por un modo de administración parental, oral u otro conveniente .
En algunas modalidades, un análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) inhibe una o varias enzimas en la ruta de operación de fucosa. (Como se emplea aquí, un metabolito intracelular puede ser por ejemplo, un análogo modificado por GDP o un análogo total o parcialmente des-esterificado. Un producto puede ser por ejemplo, un análogo total o parcialmente des-esterificado) . Por ejemplo, un análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) puede inhibir la actividad de fucoquinasa o GDP-fucosa-pirofosforilasa. En algunas modalidades, un análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) inhibe la fucosiltransferasa (tal como una 1,2-fucosiltransferasa, 1, 3-fucosiltransferasa, 1,4- fucosiltransferasa o 1 , 6-fucosi1transíerasa (por ejemplo, la proteína FUT8)). En algunas modalidades, un análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) puede inhibir la actividad de una enzima en la ruta sintética de novo para fucosa. Por ejemplo, un análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) puede inhibir la actividad de GDP-manosa 4 , 6-dehidratasa y/o GDP-fucosa. En algunas modalidades, el análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) puede inhibir un transportador de fucosa (por ejemplo, un transportador de GDP-fucosa) .
En algunas modalidades,, el análogo de fucosa tiene las siguie (I) (II) ' o una sal o solvato biológicamente aceptable del análogo, en donde cada uno de la fórmula (I) o (II) puede ser el anómero alfa o beta o la forma aldosa correspondiente. En las fórmulas anteriores, cada uno de R1-!*4 independientemente se elige del grupo que consiste de -OH, -0C(0)H, -OC(0)Ci-Cio alquilo, -OC(O)C2-Ci0 alquenilo, OC(0)C2-Ci0 alquinilo, -OC(0)arilo, -0C (0) heterociclo, OCÍOjCx-Cxo alquilen (arilo) , -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (arilo) , -OC(O)C2-Ci0 alquinilen(arilo) , -OC(O)Ci-C10 alquilen (heterociclo), -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (heterociclo) , -0C(0)C2-Cío alquinilen (heterociclo) , -0C (0) CH20 (CH2CH20) nCH3, 0C(0) CH2CH20(CH2CH20)nCH3, -0-tri-d-C3 alquil sililo, -OCi-Ci0 alquilo, -0CH20C(0) alquilo, -0CH20C(0) alquenilo, -0CH20C(0) alquinilo, -0CH20C(0) arilo, -0CH20C(0) heterociclo, OCH2OC(0)0 alquilo, -0CH20C(0)0 alquenilo, -OCH20C(0)0 alquinilo, -0CH20C(0)0 arilo y -0CH20C(0)0 heterociclo, en donde cada n es un entero seleccionado independientemente de 0-5; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, -CH2C=CH, -C(0)0CH3, -CH(0Ac)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en donde X es F, Br,- Cl o I) , -CHX2 (en donde cada X es F, Br o Cl) y metoxirano.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde: cada uno de Rx-R4 es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -OH, -0C(0)H, -OC(0)Ci-Cio alquilo, -0C (O) arilo, OC (0) heterociclo, -OC(O)Ci-Ci0 alquilen (arilo) , -OC(O)Ci-Ci0 alquileno (heterociclo) , -OC (O) CH20 (CH2CH20) nCH3 , -OC(0)CH2CH20(CH2CH20)nCH3, -O-tri-CVC3 sililo, -OCi-Cio alquilo, -OCH2OC(0) alquilo, -OCH2OC(0)0 alquilo, -OCH2OC(0) arilo, y -OCH2OC(0)0 arilo, en donde cada n es un entero seleccionado independientemente de 0-5; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, - CH2C=CH, -C(0)OCH3, -CH(OAc)CH3, -CN, -CH2CN( -CH2X (en donde X es F, Br, Cl o I) , ' -CHX2 (en donde cada X es F, Br o Cl) , y metoxirano.
En algunas modalidades, el análogo fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de Rx-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, - OC(0)d-C10 alquilo, -OC(0)C2-C10 alquenilo, -OC(O)C2-Ci0 alquinilo, -OC(0)arilo, -0C (O) heterociclo , -OC(O)Ci-C10 alquilen (arilo) , -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (arilo) , -OC(0)C2-Cio alquinilen (arilo) , -OC(O)Ci-Ci0 alquilen (heterociclo) , -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (heterociclo) , y -OC(O)C2-Ci0 alquinilen (heterociclo) ,- y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, -CH2C=CH, -C(0)OCH3, CH(0Ac)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en donde X es F, Br, Cl o I) , -CHX2 (en donde cada X es F, Br o Cl) y metoxirano.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada una de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -0-tri-Ci-C3 sililo y -OCi-Cio alquilo; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, -CH2C=CH, -C(0)OCH3, -CH(OAc)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en donde X es Br, Cl o I) y metoxirano.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OCH2OC(0) alquilo, -OCH2OC(0) alquenilo, -OCH2OC(0) alquinilo, OCH2OC(0) arilo, -OCH2OC(0) heterociclo, -OCH20C(0)0 alquilo, -OCH2OC(0)0 alquenilo, -OCH2OC(0)0 alquinilo, -OCH2OC(0)0 arilo, y -0CH20C(O)O heterociclo; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3( - CH2C=CH, C(0)OCH3/' -CH(OAc)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en donde X es F, Br, Cl o I) , -CHX2 (en donde cada uno. es X es F, Br o Cl) y metoxirano .
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R1-!*4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, -OC(0) C1 - Cio alquilo, -OC(O) C2 - Ci0 alqueniio, -OC(0) C2 - Cio alquinilo, -OC (O) arilo, -OC (O) heterociclo, -OC(O) Ci - Ci0 alquilen (arilo) , -OC(O) C2 - Ci0 alquenilen (arilo) , -OC(0) C2 - Cio alquinilen (arilo) , -OC(O) Ci - Ci0 alquilen (heterociclo) , -OC (O) C2-C10 alquenilen (heterociclo) , y -OC(O)C2-C10 alquinilen (heterociclo) ; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, - CH2C=CH, -C(0)OCH3, CH(0Ac)CH3, -CN, -CH2CN y metoxirano.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, -OC(O) Ci-C10 alquilo, -OC(O)C2-C10 alquenilo, -OC(O)C2-C10 alquinilo, -OC(0) arilo, -OC (O) heterociclo, -OC (O) Cx - Cio alquilen (arilo) , -OC(O)C2 - Ci0 alquenilen (arilo) , -OC(O)C2-C10 alquinilen (arilo) , -OC(O) Ci-C10 alquilen (heterociclo) , -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (heterociclo) , y -OC(O)C2-Ci0 alquinilen (heterociclo) ; y R5 se elige del grupo que consiste de -CH2F, -CH2I, -CH2Br , y -CH2C1.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R^R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, -OC(0)Ci-Cio alquilo, -OC(O)C2-C10 alquenilo, -OC(O)C2-Ci0 alquinilo, -OC(0)arilo, -0C (O) heterociclo, -0C (O) Ci-C10 alquilen(arilo) , -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (arilo) , -OC(0)C2-Cio alquinilen (arilo) , -OC(O)Ci-Ci0 alquilen (heterociclo) , -OC (O) C2-Ci0 alquenilen (heterociclo) , y -OC(0)C2-Cio alquinilen (heterociclo) ; y R5 se elige del grupo que consiste de -CHF2, -CHBr2, y -CHC12.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada una de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, -OC(O) CX-C1Q alquilo, -OC(O)C2-C10 alquenilo, -OC(O)C2-Ci0 alquinilo, -OC (O) arilo, -OC (O) heterociclo, -OC(O)Ci-Ci0 alquilen(arilo) , -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (arilo) , -OC(0)C2-Cio alquinilen (arilo) , -OC(O)Ci-Ci0 alquilen (heterociclo) , -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (heterociclo) , y -OC (O) C2-Cio alquinilen (heterociclo) ; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3 y -CH2C=CH.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada una de Rx-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, -OC(0)Ci-Cio alquilo, -OC(O)C2-Ci0 alquenilo, -OC(O)C2-C10 alquinilo, -OC(0)arilo, -0C (0) heterociclo, -OCíOCi-Cxo alquilen (arilo) , -OC(O)C2-Ci0 alquenilen(arilo) , -OC(O)C2-Ci0 alquinilen (arilo) , -OCÍOCi-Cio alquilen (heterociclo) , -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (heterociclo) , y -OC(0)C2-Cio alquinilen (heterociclo) ; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, - (CH2)n(CN) (en donde n= 0 o 1) y -C0(0)CH3.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de Rx-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, -OC (O) CÍ-CK, alquilo, -OC(O)C2-C10 alquenilo, -OC(O)C2-C10 alquinilo, -0C(0) arilo, -0C (0) heterociclo, -OC(0)Ci-Ci0 alquilen (arilo) , -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (arilo) , -OC(O)C2-Ci0 alquinilen (arilo) , -OC (O) Ci-Ci0 alquilen (heterociclo) , OC(0)C2-Cio alquenilen (heterociclo) , y -OC(0)C2-Ci0 alquinilen (heterociclo) ,- y. R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, -CH2CN y -C0(0)CH3.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II), en donde cada uno ' de R^-R4 se elige independientemente del grupo- que consiste de -OH, -OC(0)H, -OC(0)Ci-C10 alquilo, -OC(0)C2-C10 alquenilo, OC(O)C2-Ci0 alquinilo, -OC (O) arilo, -OC (O) heterociclo, OC(0)Ci-Cio alquilen (arilo) , -OC(O)C2-C10 alquenilen (arilo) , - OC(O)C2-C10 alquinilen(arilo) , -0C (O) ?? - ??) alquilen (heterociclo) , -OC(O)C2-C10 alquenilen (heterociclo) , y -OC(O)C2-C10 alquinilen (heterociclo) ; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, -CH(OAc)CH3, -CH2CN, y -CO (0) CH3.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde R5 es como se define aquí, y cada uno de R1-R4 es hidroxilo o -0C (O) C1 - C10 alquilo.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde R5 es como se define aquí, y cada uno de R1-R4 es hidroxilo o -OAc.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -0C(0) Ci -Cio alquilo; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, -CH(0Ac)CH3, -CH2CN, -C0(0)CH3, -CH2F y -CHF2 En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -OAc ; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, CH(0Ac)CH3, -CH2CN, -C0(0)CH3, -CH2F y -CHF2 En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -0C(0) Ci-Cio alquilo; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, - CH2F y -CHF2.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R1 - !*4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -OAc; y R5 se elige del grupo que consiste de - C=CH , -CH2F y -CHF2.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de Rx - R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -00(0)0?- Cio alquilo; y R5 es - C=CH .
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R1 - R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -OAc; y R5 es - C=CH .
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene - la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R1 - R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -OC(0) Ci- Cio alquilo; y R5 es -CHF2.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II), en donde cada uno de R1 - R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -OÁc; y R5 es -CHF2.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula (I) o (II) , en donde cada uno de R1 - R4 es -OH o un éster se elige del grupo que consiste de -OC(0)H, -OC(O) Ci-C10 alquilo, -OC(O)C2-C10 alquenilo, -OC(O)C2 - Ci0 alquinilo, -OC(0)arilo, -0C (0) heterociclo, -OC(O)C!-C10 alquilen (arilo) , -OC(0)C2-C10 alquenilen (arilo) , -OC(O)C2-C10 alquinilen (arilo) , -00(0)^-0^ alquilen (heterociclo) , - OC(0) C2 - Ci0 alquenilen (heterociclo) , -OC(O)C2-C10 alquinilen (heterociclo) , -0C (O) CH20 (CH2CH20) nCH3 (en donde n es 0-5), y -0C (O) CH2CH20 (CH2CH20) nCH3 (en donde n es 0-5) ; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3 -CH2C=CH, -C(0)0CH3, -CH(0Ac)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en donde X es F, Br, Cl o I) , -CHX2 (en donde cada X es F, Br o Cl) , y metoxirano.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula ( I ) o ( I I ) , en donde cada uno de R1-!4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -0C(0) Ci-Cío alquilo; y R5 es -CH2X (en donde X es F, Br, Cl o I) .
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula ( I ) o ( II ) , en donde cada uno, de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -OAc ; y R5 es -CH2X (en donde X es F, Br, Cl o I) .
En algunas modalidades, él análogo de fucosa tiene la fórmula ( I ) o ( I I ) , en donde cada uno de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -OC(0) Ci-Cio alquilo; y R5 es -CH2Br.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene la fórmula ( I ) o ( I I ) , en donde cada uno de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, y -OAc; y Rs es -CH2Br.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene un peso molecular menor que 2000 daltons. En algunas modalidades, el análogo de fucosa tiene un peso molecular menor a 1000 daltons.
En algunas modalidades, R5 no está sustituido.
En algunas modalidades, ' cada uno de R1-R4 no está sustituido.
En algunas modalidades, R5 no es una cetona (-C (O) alquilo) .
En algunas modalidades, R5 no es -CH(CH3)OAc.
En algunas modalidades, R5 no es -CH(CH3)0Ac, cuando cada uno de R1-R4 es -OAc.
En algunas modalidades, R5 no es -C=CH.
En algunas modalidades, R5 no es -C=CH, cuando cualquiera de R1-R4 es -OAc.
En algunas modalidades, R5 no es -C=CH, cuando cualquiera de R1-R4 es -OC (0) alquilo .
En algunas modalidades, R5 no es -C=CH, cuando cada uno de R1-R4 es -OC (O) alquilo .
En algunas modalidades, R5 no es -C=CH3 cuando cada uno de R1-R4 es OH.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa es alquinil fucosa peracetato. En algunas modalidades, el análogo de fucosa es alquinil fucosa triacetato. En algunas modalidades, el análogo de fucosa es alquinil fucosa diacetato. En algunas modalidades, el análogo de fucosa es una mezcla de alquinil fucosa peracetato, alquinil fucosa triacetato y alquinil fucosa diacetato.
En algunas modalidades, el análogo de fucosa es una mezcla de alquinil fucosa peracetato, alquinil fucosa triacetato, alquinil fucosa diacetato y alquinil fucosa monoacetato .
En cualquiera de las diversas modalidades, el análogo de fucosa no es fucosa. En algunas modalidades, el análogo de fucosa' no es alquinil fucosa peracetato. En algunas modalidades, el análogo de fucosa no es galactosa o L-galactosa .
En otro grupo de modalidades, el análogo de fucosa tiene la siguiente fórmula (III) o (IV) : (III) (IV) o su sal o solvato biológicamente aceptable, en donde cada uno de la fórmula (III) o (IV) puede ser el anómero alfa o beta o la forma aldosa correspondiente; y en donde cada uno de R1-!*4 se elige independientemente del grupo que consiste de fluoro, cloro, -OH, -OC(0)H, -OC(0)Ci-Ci0 alquilo, -OC(O)C2-Ci0 alquenilo, -OC(O)C2-C10 alquinilo, -OC(0)arilo, -OC (O) heterociclo, -OC(0)Ci-Ci0 alquilen (arilo) , -OC(O)C2-Ci0 alquehilen (arilo), -OC(O)C2-Ci0 alquinil (arilo) , -OC(O)Ci-Ci0 alquilen (heterociclo), -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (heterociclo), -OC(0)C2-Cio alquinilen (heterociclo), -OCH2OC(0) alquilo, -OCH2OC(0)0 alquilo -OCH2OC(0) arilo, -0CH20C(0)0 arilo, -OC (0) CH20 (CH2CH20) nCH3 , -OC (0) CH2CH20 (CH2CH20) nCH3 , -0-tri-d.-C3 alquilsililo y -OCi-Ci0 alquilo, en donde cada n es un entero seleccionado independientemente de 0-5; y cada uno de R2a y R3a se elige independientemente del grupo que consiste de H, F y Cl; R5 se elige del grupo que consiste de -CH3, -CHF2, -CH=C=CH2, -C=CH, -C=CCH3, -CH2C=CH, -C(0)0CH3, -CH(0Ac)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en donde X es F, Br, Cl o I) , y metoxirano; cuando R5 es diferente a-CH=C=CH2, -CH2F o -CHF2, al menos uno de R1, R2, R3, R2a y R3a es fluoro o cloro. algunas modalidades de las fórmulas (III) (IV) , R1 es F.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R2 es F.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R3 es F.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , and R2 son cada uno En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R2 and R2A son cada uno F.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R1, R3 y R4 son cada uno independientemente seleccionados de -OH y -0C (O) OL-CIO alquilo; R2 es F; y R5 es -CH3.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R1, R3 y R4 son cada uno son independientemente seleccionados de -OH and -OAc; R2 es F; and R5 es -CH3.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R1, R3 and R4 son cada uno independientemente seleccionado de -OH y -OC (O) Ci-Ci0 alquilo; R2 es F; R2A y R3A son cada uno H; y R5 es -CH3.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R1, R3 y R4 cada uno independientemente se eligen de -OH y -OAc; R2 es F; R2A y R3A son cada uno H; y R5 es -CH3.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R1, R2, R3 y R4 cada uno independientemente se eligen de -OH y -OC(0)C!-Cio alquilo; R A y R3A son cada uno H; y R5 es -CHF2.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R1, R2, R3 y R4 cada uno se elige independientemente de -OH y -OAc; R2A y R3 son cada uno H; y R5 es -CHF2.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R1, R2, R3 y R4 cada uno se elige independientemente de -OH y -OCfC Cx-Cio alquilo; R2a y R3a son cada uno H; y R5 es -CH2F.
En algunas modalidades de las fórmulas (III) o (IV) , R1, R2, R3 y R4 cada uno se elige independientemente de -OH y -OAc; R2a y R3a son cada uno H; y R5 es -CH2F.
En otro grupo de modalidades, el análogo de fucosa tiene la siguiente fórmula (V) o (VI) : (V) (VI) o su sal o solvato biológicamente aceptable, en donde cada una de las fórmulas (V) o (VI) puede ser el anómero alfa o beta o la forma aldosa correspondiente; y en donde, cada uno de R1, R2, R2 , R3, R3a y R4 independientemente se elige del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, -OC(O)Ci-C10 alquilo, -OC(O)C2-Ci0 alquenilo, -OC(O)C2-Ci0 alquinilo, -OC(0)arilo, -OC (O) heterociclo, -OC(O)Ci-Ci0 alquilen (arilo) , -OC (O) C2-Cio alquenilen (arilo), -OC(O)C2-Ci0 alquinilen (arilo), -OC(O)Ci-Ci0 alquilen (heterociclo), -OC(O)C2-Ci0 alquenilen (heterociclo), -OC(O)C2-Ci0 alquinilen (heterociclo), -OCH2OC(0) alquilo, -OCH2OC(0)0 alquilo, 0CH20C(0) , arilo, -0CH20C(0)0 arilo, -OC (O) CH20 (CH2CH20) nCH3 , -OC (0) CH2CH20 (CH2CH20) nCH3 , -0- tri-d-C3 alquilsililo, -OC1-C10 alquilo, y un pequeño grupo de extracción de electrones, en donde cada n es un entero seleccionado independientemente de 0-5; R5 es un miembro seleccionado del grupo que consiste de -CH3, -CHX2, -CH2X, -CH (X 1 ) -CX-CÍ alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno, -CH (X 1 ) -C2-C4 alqueno sin sustituir o sustituido con halógeno, -CH (X ' ) -C2-C4 alquino sin sustituir o sustituido con halógeno, -CH=C (R10) (R11) , -C (CH3) =C (R12) (R13) , -C (R14) =C=C(R15) (R16) , -C3 carbociclo sin sustituir o sustituido con metilo o halógeno, -CH(X' ) -C3 carbociclo sin sustituir o sustituido con metilo o halógeno, C3 heterociclo sin sustituir o sustituido con metilo o halógeno, -CH(X' ) -C3 heterociclo sin sustituir o sustituido con metilo o halógeno, -CH2N3, -CH2CH2N3, y benziloximetilo o R5 es un pequeño grupo de extracción de electrones; en donde R10 es hidrógeno o Ci-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R11 es Ci-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R12 es hidrógeno, halógeno o C1-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R13 es hidrógeno o Ci.-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R14 es hidrógeno o metilo; R15 y R16 se eligen independientemente de metilo y halógeno; X es halógeno; X1 es halógeno o hidrógeno; y adicionalmente, cada uno de R1, R2, Ra, R3 y R3a son opcionalmente hidrógeno; opcionalmente dos R1, R2, R2a, R3 y R3 en átomos de carbono adyacentes se combinan para formar un doble enlace entre los átomos de carbono adyacentes; y siempre que al menos uno de R1, R2, R2a, R3, R3a, R4 y R5 es un pequeño grupo de extracción de electrones o R5 comprende un halógeno, sitio de insaturación, carbociclo, heterociclo o azida, excepto cuando (i) R2 y R2a son ambos hidrógeno, (ii) R3 y R3a son ambos hidrógeno, (iii) R1 es hidrógeno, (iv) un doble enlace está presente entre los átomos de carbono adyacentes o (v) R5 es benziloximetilo; y en donde la proteína, anticuerpo o derivado de anticuerpo producido in vivo tiene reducida fucosilación en comparación con la proteína, anticuerpo o derivado de anticuerpo producido in vivo en la ausencia del análogo de fucosa.
En algunas modalidades de las fórmulas (V) y (VI) , R2a y R3a son cada uno hidrógeno.
En algunas modalidades de las fórmulas (V) y (VI) , R5 es elige del grupo que consiste de -CH3, -CH2CH3, -CH2C=CH, -CH=CHCH3, -ciclopropilo, -oxirano, -oxirano sustituido con metilo, -CH2F, -CH2C1, -CH2Br, -CH2I, -CHF2, -CH=C=CH2, -CH2N3 y -CH2CH2N3.
En algunas modalidades de las fórmulas (V) y (VI) , el pequeño grupo de extracción de electrones se elige de fluoro, cloro, bromo, -CHF2, -CH=C=CH2, -C=CH, -C=CCH3, -CH2C=CH, -C02H, -C(0)OC!-C4 alquilo, -CH(OAc)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en donde X es Br, Cl o I) , y metoxirano.
En algunas modalidades de las fórmulas (V) y (VI) , R5 se elige del grupo que consiste de -CH3( -C=CH, -CH2F, -CH2Br y -CHF2. En algunas modalidades, cada uno de R1, R2 , R2a, R3, R3a y R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, y -OC(O)Ci-Ci0 alquilo.
En algunas modalidades de las fórmulas (V) y (VI) , el pequeño grupo de extracción de electrones se elige de fluoro, cloro, bromo, -CHF2, -CH=C=CH2, -C=CH, -C=CCH3, -CH2C=CH, -C02H, -C(0)OC!-C4 alquilo, -CH(OAc)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en donde X es Br, Cl o I) , y metoxirano.
En algunas modalidades de las fórmulas (V) y (VI) , al menos dos de R1, R2, R2a, R3, R3a y R4 se eligen independientemente de pequeños grupos de extracción de electrones.
En algunas modalidades de las fórmulas (V) y (VI) , el análogo fucosa se elige de compuestos de las Tablas 1, 2 ó 3.
Composiciones Farmacéuticas Los análogos de fucosa de las fórmulas I, II, III, IV, V y VI (a continuación "análogos de fucosa") pueden ser formulados para aplicaciones terapéuticas. Los análogos de fucosa pueden formularse como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéutica o profiláctica efectiva del análogo de fucosa y uno o más ingredientes farmacéuticos compatibles (aceptables) . Por ejemplo, una composición farmacéutica o no-farmacéutica, típicamente incluye uno o más portadores (por ejemplo, líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y semejantes) . El agua es un portador más típico cuando la composición farmacéutica se administra en forma intravenosa. Soluciones salinas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también pueden emplearse como portadores líquidos, particularmente de soluciones inyectables. Excipientes convenientes incluyen por ejemplo, aminoácidos, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, greda, gel de sílice, estearato de sodio, glicerol monoestearato, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propilen glicol, agua, etanol, y semejantes. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes o agentes amortiguadores de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y semejantes. Ejemplos de portadores farmacéuticos convenientes se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Estas composiciones típicamente contienen una cantidad terapéutica efectiva del análogo de fucosa, típicamente en forma purificada, junto con una cantidad conveniente de portador para proporcionar la forma para administración adecuada al paciente. Las formulaciones corresponden al modo de administración.
Las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden estar en cualquier forma que permita a la composición ser administrada a un animal (por ejemplo, un mamífero) . Las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden estar en cualquier forma que permita que la composición se administre a un mamífero. Las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden estar en cualquier forma que permita que la composición se administre a un humano.
Las composiciones pueden estar en la forma de un sólido o líquido. Rutas típicas de administración incluyen, sin limitación, oral, parenteral, sublingual, y ocular. Administración parenteral incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal . De preferencia, las composiciones se administran en forma parenteral u oral. Estas composiciones farmacéuticas pueden formularse para permitir que un análogo de fucosa sea biodisponible ante administración de la composición a un animal. Las composiciones también pueden tomar la forma de una o más unidades de dosis; en donde por ejemplo, una tableta puede ser una sola unidad de dosis, y un recipiente de un análogo de fucosa en forma sólida puede contener una pluralidad de unidades de dosis.
Materiales empleados para preparar las composiciones farmacéuticas pueden ser no- tóxicos en las cantidades empleadas. Será evidente para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad que la dosis óptima de él o los ingredientes activos en la composición farmacéutica, dependerá de una variedad de factores. Factores relevantes incluyen, sin limitación, el tipo de animal (por ejemplo, humano) , la forma particular de análogo de fucosa, la forma de administración, la composición empleada, y la severidad de la enfermedad o condición que se trata.
El portador o vehículo farmacéutico aceptable pueden ser partículas, de manera que las composiciones están por ejemplo en forma de tabletas o polvo. El o los portadores pueden ser líquidos, con las composiciones que por ejemplo son un jarabe oral o líquido inyectable.
Cuando se pretende para administración oral, la composición de preferencia está .en forma sólida o líquida, en donde formas semi-sólida, semi-líquida, suspensión y gel se incluyen dentro de las formas consideradas aquí ya sea como sólidas o líquidas.
Como una composición sólida para administración oral, la composición puede ser formulada en un polvo, gránulo, tableta comprimida, pildora, cápsula, goma de mascar, oblea o semejantes. Esta composición sólida típicamente contiene uno o más diluyentes inertes. Además, uno o más de los siguientes puede estar presente: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etil celulosa, celulosa microcristalina o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes desintegrantes tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y semejantes; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex;* deslizantes tales .como dióxido de silicio coloidal; agentes endulzantes tales como sacarosa o sacarina, un agente saborizante tal como sabor menta, metil salicilato o sabor naranja, y un agente colorante.
Cuando la composición está en la forma de una cápsula, por ejemplo una cápsula de gelatina, puede contener además de materiales del tipo anterior, un portador líquido tal como polietilen glicol, ciclodextrina o un aceite graso.
La composición puede estar en la forma de un líquido, por ejemplo, un elíxir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser útil para administración oral o para suministro por inyección. Cuando se pretende para administración oral, una composición puede comprender uno o más de un agente endulzante, conservadores, colorante/tinte y mejorador de sabor. En una composición para administración por inyección (como se describió anteriormente) , uno o más de un surfactante, conservador, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, amortiguador, estabilizante y agente isotónico también pueden incluirse.
Composiciones líquidas, ya sea que se trate de soluciones, suspensiones u otras formas semejantes, también pueden incluir uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución de salino, de preferencia salino fisiológico, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como el solvente o medio de suspensión, polietilen glicoles, glicerina, ciclodextrina, propilen glicol u otros solventes; agentes antibacterianos tales como bencil alcohol, o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ' ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiamintetraacético; amortiguadores tales como acetatos, c'itratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Salino fisiológico es un adyuvante preferido. Una composición inyectable de preferencia es estéril.
Como se anotó anteriormente, la cantidad de análogo de fucosa que es efectiva para el tratamiento de un desorden o condición particular, dependerá de la naturaleza del desorden o condición, y puede determinarse por técnicas clínicas estándar. Además, ensayos in' vitro o in vivo pueden emplearse opcionalmente para ayudar en identificar intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa para emplearse en las composiciones también dependerá de la ruta de administración, y lo serio de la enfermedad o desorden,, y habrá de decidirse de acuerdo con el juicio del especialista ' y las circunstancias de cada paciente.
Las composiciones comprenden una cantidad efectiva de un análogo de fucosa tal que se ' obtenga una dosis conveniente. Típicamente, esta cantidad es al menos aproximadmaente 0.01% de un análogo de fucosa por peso de la composición. Cuando se pretende para administración oral, esta cantidad puede variarse a un intervalo de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 80% en peso de una composición. Composiciones orales preferidas, pueden comprender de aproximadamente 4% a aproximadamente 50% del análogo de fucosa en peso de la composición. Composiciones preferidas de la presente invención se preparan de manera tal que una unidad de dosis parenteral contiene de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 2% en peso del análogo de fucosa.
Para administración, intravenosa, la composición puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 250 mg de un análogo de fucosa por kg del peso corporal del animal. En algunas modalidades, la cantidad administrada estará en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal del análogo de fucosa. De preferencia, la cantidad administrada estará en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal del análogo de fucosa.
En general, la dosis del análogo de fucosa administrada a un animal típicamente es de 0.1 mg/kg aproximadamente a 250 mg/kg aproximadamente del peso corporal del animal. De preferencia, la dosis administrada a un animal está entre aproximadamente 0.1 mg/kg y aproximadmaente 20 mg/kg del peso corporal del animal, más preferible de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del animal.
Las composiciones comprenden una cantidad efectiva de un análogo de fucosa tal que se obtenga una dosis conveniente. Típicamente, esta cantidad es al menos aproximadamente 0.01% de un análogo de fucosa en peso de la composición. Cuando se pretenden para administración oral, esta cantidad puede variarse a un intervalo de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 80% en peso de la composición. Composiciones orales preferidas pueden comprender de aproximadamente 4% a aproximadamente 50% del análogo de fucosa, en peso de la composición. Composiciones preferidas de la presente invención se preparan de manera tal que una unidad de dosis parenteral contiene de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 2% en peso del análogo de fucosa .
Para administración intravenosa, la composición puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 250 mg de un análogo de fucosa por kg del peso corporal del animal. En algunas modalidades, la cantidad administrada estará en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, del análogo de fucosa. De preferencia, la cantidad administrada estará en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, del análogo de fucosa.
En general, un análogo de fucosa o una composición farmacéutica del mismo , puede administrarse en un programa diario, semanal, quincenal o mensual, de acuerdo con el efecto deseado. Un análogo de fucosa o su composición farmacéutica puede administrarse de aproximadamente 1 a 5, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 o más ciclos, en donde cada ciclo es de un mes de duración. La dosis dentro de cada ciclo puede ser suministrada en forma diaria un día sí y un día no, dos veces a la semana, semanal, quincenalmente, una vez cada tres semanas o mensualmente . Un ciclo puede incluir opcionalmente un periodo de reposo, durante lo cual fucosilación de proteínas (por ejemplo, anticuerpos u otras proteínas) , aumenta. En forma alterna, puede incluirse un periodo de reposo entre ciclos. Este periodo de reposo puede permitir restauración de fucosilación de proteínas involucradas en funciones esenciales.
El modo de administración preferido de un análogo de fucosa o su composición farmacéutica queda a la discreción del especialista, y dependerá en parte del sitio de la condición médica (tal como el sitio de cáncer o enfermedad autoinmune) . En una modalidad, el análogo o composición de fucosa se administra en forma parenteral . En otra modalidad, el análogo o composición de fucosa se administra en forma oral .
En modalidades específicas, puede ser conveniente administrar uno o más análogos o composiciones de fucosa, localmente al área que requiere tratamiento. Esto puede lograrse por ejemplo y no a manera de limitación, por infusión local durante cirugía; aplicación tópica; por inyección; o mediante un implante, el implante es de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas tales como membranas sialásticas o fibras. En una modalidad, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de un cáncer, tumor o tejido neoplástico o pre-neoplástico .
En otra modalidad, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de una manifestación de una enfermedad autoinmune.
En otra modalidad, los análogos de fucosa pueden suministrarse en una vesícula, en particular un.liposoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., en LIPOSOMES iN THE THE APY OF INFECTIOUS DISEASE AND CÁNCER , Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, p. 353-365 (1989) ; Lopez-Berestein, ibid. , p . 317-327; ver en general ibid. ) .
Todavía en otra modalidad, los análogos o composiciones de fucosa pueden suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, puede emplearse una bomba (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987) ; Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980) ; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989) ) . En otra modalidad, pueden emplearse materiales poliméricos (ver MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELÉASE, Langer and Wise (eds.) , CRC Pres . , Boca Ratón, Fia. (1974) ; CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984) ; Ranger and Peppas, J. Macromol . Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983) ; ver también Levy et al., Science 228:190 (1985) ; During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989) ; Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989) ) . Otros sistemas de liberación controlada discutidos en la revisión por Langer {Science 249:1527-1533 (1990) ) pueden emplearse.
El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente, con el cual se administra un análogo de fucosa. Estos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y semejantes. Los portadores pueden ser salino, goma acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y semejantes. Además, agentes auxiliares estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes pueden emplearse. En una modalidad, cuando se administran a un animal, los análogos de fucosa o sus composiciones y portadores farmacéuticos aceptables, son estériles. Agua es un portador preferido cuando los análogos de fucosa se administran en forma intravenosa. Soluciones salinas y soluciones de glicerol y dextrosa acuosas también pueden emplearse como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables . Portadores farmacéuticos convenientes también incluyen excipientes tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza o greda, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca o deshidratada, glicerol, propilén glicol, agua, etanol y semejantes. Las presentes composiciones si se desea también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes o agentes amortiguadores de pH.
Métodos Terapéuticos que Utilizan Análogos de Fucosa para Reducir Fucosilacion de Otras Proteínas y Anticuerpo In Vivo Los análogos de fucosa de las fórmulas I, II, III, IV, V y VI (a continuación "los análogos de fucosa") como aquí se proporciona, son útiles para tratamiento de cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa en un animal .
Tratamiento de Cáncer Los análogos de fucosa son útiles para tratamiento de cáncer en pacientes. La administración de un análogo de fucosa a un animal (por ejemplo, un mamífero tal como un humano) que lo requiere, puede resultar en inhibición de la multiplicación de la o las células de tumor o la o las células de cáncer o el tratamiento de cáncer en un animal (por ejemplo un paciente humano) . Los análogos de fucosa pueden emplearse .de acuerdo con esto en una variedad de ámbitos para el tratamiento de cánceres en animales.
Los análogos de fucosa también son útiles para mejorar la producción in vivo de anticuerpos que carecen .de fucosilación núcleo. Incrementar la proporción de estos anticuerpos contra objetivos de cáncer en un paciente, puede resultar en inhibición de la multiplicación de la o las células de un tumor o la o las células de cáncer o tratamiento de cáncer en un animal (por ejemplo un paciente humano) . Los análogos de fucosa pueden emplearse de acuerdo con esto en una variedad de ámbitos para el tratamiento de cánceres en animales .
Tipos particulares de cánceres que pueden ser tratados con los análogos de fucosa, incluyen tumores sólidos y malignidades hematológicas . Estos cánceres incluyen pero no están limitados a: (1) tumores sólidos incluyendo pero no limitados a fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de riñon, cáncer pancreático, cáncer de huesos, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer oral, cáncer nasal, cáncer de garganta, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, carcinoma de ductos biliares, hepatoma, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de ilm, cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer testicular, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma de vejiga, cáncer pulmonar, carcinoma epitelial, glioma, glioblastoma, astrocitoma multiforme, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, cáncer de piel, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma; (2) cánceres que surgen en la sangre, incluyendo pero no limitados a leucemia linfoblástica aguda "ALL" , leucemia de células B linfoblástica aguda, leucemia de células T linfoblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda "AML" , leucemia promielocítica aguda "APL" , leucemia monoblástica aguda, leucemia eritroleucémica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia no linfocíctica aguda, leucemia no diferenciada aguda, leucemia mielocítica crónica "CML", leucemia linfocítica crónica "CLL" , leucemia de células pilosas, mieloma múltiple, leucemias agudas y crónicas, por ejemplo leucemias linfoblásticas mielogenosas y linfocíticas mielocíticas , y (3) linfornas tales como enfermedad de Hodgkin, Linforna de no-Hodgkin, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas o enfermedad de Seligmann y Policitemia vera.
Terapia de Múltiples Modalidades Para Cáncer Cáncer, incluyendo pero no limitado a un tumor, una metástasis o cualquier enfermedad o desorden caracterizado por crecimiento celular descontrolado, puede ser tratado o evitado por administración de un análogo de fucosa de cualquiera de las fórmulas I, II, III, IV, V o VI se proporcionó anteriormente, a un animal (por ejemplo un mamífero, tal como un humano) que lo requiere. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar o evitar el cáncer, que comprenden administrar a un animal que lo requiere, una cantidad efectiva de un análogo de fucosa y opcionalmente un agente quimioterapéutico . En una modalidad, el agente quimioterapéutico es aquel con el cual no se ha encontrado que es refractario al tratamiento del cáncer. En otra modalidad, el agente quimioterapéutico es aquel con el cual se ha encontrado refractario el tratamiento de cáncer. Los análogos de fucosa pueden ser administrados a un animal que también se ha sometido a cirugía como tratamiento para cáncer .
En una modalidad, el método adicional del tratamiento es terapia de radiación.
En una modalidad específica, el análogo de fucosa se administra de manera concurrente con . el agente quimioterapéutico o con terapia de radiación. En otra modalidad específica, el agente quimioterapéutico o terapia de radiación se administra antes o subsecuente a la administración de un análogo de fucosa, de preferencia al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un día, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes o varios meses (por ejemplo hasta tres meses) , antes de o subsecuente a la administración de un análogo de fucosa.
Un agente quimioterapéutico puede ser administrado sobre una serie de sesiones y puede ser cualquiera o una combinación de los agentes quimioterapéuticos que aquí se •proporcionan. Con respecto a radiación, cualquier protocolo de terapia de radiación puede emplearse dependiendo del tipo de cáncer a tratar. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, radiación de rayos x puede ser administrada; en particular puede emplearse un megavoltaje de alta energía (radiación mayor a 1 MeV. de energía) para tumores profundos, y haz de electrones o radiación de rayos x de ortovoltaje puede emplearse para cánceres de piel. Radioisótopos que emiten rayos gamma, tales como isótopos radiactivos de radio, cobalto y otros elementos, también puede administrarse.
En forma adicional, la invención proporciona métodos de tratamiento de cáncer con un análogo de fucosa como una alternativa a quimioterapia o terapia de radiación, en donde la quimioterapia o terapia de radiación ha demostrado o puede demostrar ser demasiado tóxica, por ejemplo resulta en efectos secundarios inaceptables o insoportables para el sujeto que se trata. El animal que se trata puede opcionalmente ser tratado con otro tratamiento de cáncer tal como cirugía, terapia de radiación o quimioterapia, dependiendo de qué tratamiento se encuentra que sea aceptable o soportable.
Terapia de Múltiples Fármacos Para Cáncer ha. presente invención incluye métodos para tratar cáncer, que comprenden administrar a un animal que lo requiere, una cantidad efectiva de un análogo de fucosa y un agente terapéutico que es un agente anti cáncer. Agentes anti cáncer convenientes incluyen pero no están limitados a metotrexato, taxol, L-asparaginasa, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas , cisplatina, carboplatina, mitomicina, dacarbazina, procarbizina, topotecan, mostazas de nitrógeno, citoxan, etopósido, 5-fluorouracilo, BCNU, irinotecan, una camptotecina, bleomicina, doxorubicina, idarubicina, daunorubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, asparaginasa, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel y docetaxel. En una modalidad preferida, el agente anticáncer incluye pero no está limitado a: . agentes alquilantes, mostazas de nitrógeno (ciclofosfamida, Ifosfamida, trofosfamida, Clorambucil) , nitrosoureas (carmustina (BCNU), Lomustina (CCNU) ) , alquilsulfonatos (busulfan, Treosulfan) , triazenos (Dacarbazina) , compuestos que contienen platino (cisplatina, oxaliplatina, carboplatina) , alcaloides de plantas (vinca alcaloides - vincristina, Vinblastina, Vindesina, Vinorelbina) , taxoides (paclitaxel, Docetaxol) , inhibidores de DNA topoisomerasa, Epipodofilinas (etopósido, Tenipósido, Topotecan, 9-aminocamptotecina, camptotecina), crisnatol, mitomicinas (Mitomicina C) ; Anti metabolitos tales como Anti-folatos : inhibidores de DHFR: metotrexato, Trimetrexato ,-Inhibidores de. IMP dehidrogenasa : ácido micofenólico, Tiazofurina, Ribavirina, EICAR; Inhibidores de Ribonucleótido reductasa: hidroxiurea deferoxamina; Análogos de Pirimidina: Análogos de Uracilo: 5-Fluorouracilo, Floxuridina, Doxifluridina, Ratitrexed; Análogos de citosina: citarabina (ara C) , citosina arabinósido, fludarabina; Análogos purina: mercaptopurina, Tioguanina; Terapias hormonales: Antagonistas de receptor: Anti-estrógeno : Tamoxifen, Raloxifen, megestrol; Agonistas de LHRH : goserilina, Acetato Leuprolida; Anti-andrógenos : flutamida, bicalutamida; Retinoides/Deltoides : Análogos de vitamina D3 : EB 1G89, CB 1093, KH 1060; Terapias fotodinámicas : vertoporfina (BPD-MA) , Ftalocianina, fotosensibilizante Pc4 , Demetoxi-hipocrelina A (2BA-2-DMHA) ; Citoquinas:' Interferona-alfa, Interferona-gamma; Factor de necrosis de tumor: Otros: Inhibidores de Isoprenilación: Lovastatina; Neurotoxinas Dopaminérgicas : ión l-metil-4-fenilpiridinio; Inhibidores de ciclo celular: estaurosporina; Actinomicinas : Actinomicina D, Dactinomicina,- Bleomicinas: bleomicina A2 , Bleomicina B2, Peplomicina; Antraciclinas : daunorubicina, Doxorubicina (adriamicina) , Idarubicina, Epirubicina, Pirarubicina, Zorubicina, Mitoxantrona; Inhibidores de MDR: verapamil; e Inhibidores de Ca2+ ATPasa: tapsigargina .
Terapia Adyuvante para Cáncer Los análogos de fucosa pueden emplearse como un adyuvante, en combinación con una vacuna de cáncer. La expresión "vacuna de cáncer" como se emplea aquí, significa un compuesto que daña selectivamente a células · de tumor al inducir y/o mejorar una respuesta inmune específica contra las células de tumor. Una vacuna de cáncer por ejemplo puede ser un medicamento que comprende un péptido, polipéptido o proteína de un TAA o TSA, y composiciones farmacéuticas que contienen un péptido, polipéptido o proteína de un TAA o TSA. Gomo se emplea aquí, TSA se refiere a un "antígeno específico de tumor" y TAA se refiere a un antígeno asociado a tumor. TSAs son moléculas únicas a células de cáncer. TAAs son moléculas compartidas pero expresadas en forma diferente por las células de cáncer y células normales.
Las dosis de la vacuna de cáncer pueden determinarse con modificaciones apropiadas de acuerdo con la extensión de estímulo de una respuesta inmune contra la vacuna. En general, está entre 0.01 y 100 mg/día/adulto humano, o de preferencia de entre 0.1 y 10 mg/día/adulto humano como principio activo. La vacuna de cáncer puede ser administrada desde una vez cada unos cuantos días a varios pocos meses. La administración puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos bien conocidos para administración de un péptido, polipéptido o proteína para uso médico tal como en forma subcutánea, intravenosa o intramuscular. A fin de inducir y/o mejorar lá respuesta inmune durante administración, el péptido, polipéptido o proteína puede emplearse, en la presencia o ausencia de un adyuvante apropiado, con o sin enlace a un portador. El portador no se limita siempre que no ejerza efecto nocivo por sí mismo en el cuerpo humano y sea capaz de mejorar la antigenicidad; celulosa, aminoácidos poliméricos, albúmina y semejantes pueden proporcionarse como ejemplos de portadores. Adyuvantes pueden ser aquellos empleados en general para inoculación de vacuna de péptido, y un adyuvante incompleto de Freund (FIA) , adyuvante de aluminio (ALUM) , vacuna de Bordetella pertussis, aceite mineral y semejantes pueden suministrarse como ejemplos. Además, la formulación puede seleccionarse convenientemente al aplicar un método bien conocido conveniente para formulación de un péptido, polipéptido o proteína.
De otra forma, un efecto de vacuna de cáncer efectivo puede obtenerse también al recolectar una fracción de células mononucleares de la sangre periférica de un paciente, e incubarlas con el péptido, polipéptido o proteína de la presente invención y después regresar a la sangre del paciente, la fracción de células mononucleares en donde la inducción de CTL y/o activación de CTL se observó. Un análogo de fucosa puede ser co-administrado durante o después de readministración de las células mononucleares. Condiciones de cultivo,- tales como concentración de células mononucleares, concentración del péptido, polipéptido o proteínas, tiempo de cultivo y semejantes, pueden determinarse por simples estudios de repetición. Una sustancia que tiene una capacidad para mejorar el crecimiento de linfocitos, tal como Interleucina-2 , puede agregarse durante cultivo.
Tratamiento de Enfermedades Autoinmunes Los análogos de fucosa son útiles para modular una enfermedad autoinmune o para tratar una enfermedad autoinmune, para disminuir síntomas y/o la respuesta autoinmune . Los análogos de fucosa pueden emplearse de conformidad en una variedad de ámbitos para el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un animal .
En una modalidad, los análogos de fucosa regulan a la baja o modulan a la baja un anticuerpo autoinmune asociado con una enfermedad autoinmune particular.
Tipos particulares de enfermedades autoinmunes que pueden ser tratadas con los análogos de fucosa incluyen pero no están limitados a desórdenes relacionados a Th2-linfocito (por ejemplo dermatitis atópica, asma atópico, rinoconjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis sistémica y enfermedad de injerto contra hospedero) ; desórdenes relacionados a Thl linfocito (por ejemplo artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjorgren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de egener y tuberculosis) ; desórdenes relacionados a linfocito B activado (por ejemplo lupus sistémico eritematoso, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes tipo I) ; y aquellos descritos a continuación.
Hepatitis crónica activa, enfermedad de Addison, alveolitis alérgica, reacción alérgica, rinitis alérgica, síndrome de Alport, Anafilaxis, espondilitis anquilosante, Síndrome de Anti-fosfolípidos, Artritis, ascariasis, aspergilosis, Alergia atópica, dermatitis atópica, rinitis atópica, enfermedad de Behcet, pulmones de avicultores, asma bronquial, síndrome de Caplan, cardiomiopatía, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, glomerulonefritis crónica, síndrome de Cogan, enfermedad de aglutininas frías, Infección de rubéola congénita. Síndrome de CREST, enfermedad de Crohn, crioglobulinemia, síndrome de Cushing, dermatomiositis , lupus discoide, síndrome de Dressler, Síndrome de Eaton-Lambert , infección por virus ECHO, Encefalomielitis, oftalmopatía endocrina, infección por el virus Epstein-Barr , arcadas equinas, eritematoso sistémico, síndrome de Evans, Síndrome de Felty, Fibromialgia, Ciclitis de Fuch, atrofia gástrica, alergia gastrointestinal, Arteritis de células gigantes, glomerulonefritis , síndrome de Goodpasture, Enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad de Graves, enfermedad de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schónlein, Púrpura de Atrofia Idiopática suprarrenal, fibritis pulmonar idiopática, nefropatía IgA, enfermedades inflamatorias del intestino, diabetes mellitus que depende de insulina, artritis juvenil, Diabetes Mellitus Juvenil (Tipo I), Síndrome de Lambert-Eaton, laminitis, liquen plano, Hepatitis lupoide, Linfopenia lupus, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta de tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia grave, anemia perniciosa, Síndrome poliglandular, demencia presenil, Agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, Fenómeno de Raynaud, Aborto Recurrente, Síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, síndrome de Sampter, . esquistosomiasis ,. Síndrome de Schmidt, esclerodermia, síndrome de Shulman, Síndrome de Sjorgen, Síndrome del hombre rígido o de rigidez muscular, oftalmía simpática, Lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, tiroiditis, trombocitopenia, tirotoxicosis , necrólisis epidérmica Tóxica Tipo B, diabetes mellitus resistente a insulina Tipo I, colitis ulcerativa, uveítis Vitíligo, Macroglobulemia de Waldenstrom, y granulomatosis de Wegener.
Terapia a Base de Múltiples Fármacos de Enfermedades Autoinmunes ' La presente invención también proporciona métodos para tratar una enfermedad autoinmune, que comprenden administrar a un animal (por ejemplo a un mamífero) que lo requiere, una cantidad efectiva de un análogo de fucosa y opcionalmente un agente terapéutico que se conoce para el tratamiento de una enfermedad autoinmune . En una modalidad, el agente de enfermedad anti -autoinmune incluye pero no está limitado a ciclosporina, ciclosporina A, micofenilato, mofetil, sirolimus, tacrolimus, enanercept, prednisona, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, · prednisona, ácido aminocapróico, cloroquina, hidroxicloroquina, hidrocortisona, dexametasona, clorambucil, DHEA, danazol, bromocriptina, meloxicam o infliximab.
- Tratamiento de Enfermedades Infecciosas Los análogos de fucosa son útiles para mejorar una respuesta inmune que resulta en incrementado exterminio o inhibición de la multiplicación de una célula que produce una enfermedad infecciosa o para tratar, una enfermedad infecciosa. Los análogos de fucosa pueden .emplearse de conformidad en una variedad de ámbitos para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un animal.
En una modalidad, los análogos de fucosa mejoran una inmuno-respuesta que resulta en exterminio o inhibición o incrementado exterminio o inhibición de la multiplicación de células que producen una enfermedad infecciosa particular.
Tipos particulares de enfermedades infecciosas que pueden tratarse con los análogos de fucosa incluyen pero no están limitados a, (1) enfermedades bacterianas: difteria, tosferina, bacteriemia oculta, Infección del Tracto Urinario, gastroenteritis, celulitis, epiglotitis, traqueitis, hipertrofia de adenoides, absceso retrofaríngeo, impétigo, ectima, neumonía, endocarditis, artritis séptica, neumococo, peritonitis, meningitis, Bacteremia meningitis, meningitis purulenta aguda, uretritis, cervicitis, proctitis, faringitis, salpingitis, epididimitis , gonorrea, sífilis, listeriosis, Ántrax, nocardiosis, Salmonella, fiebre tifoidea, disentería, conjuntivitis, sinusitis, brucelosis, Tullaremia, cólera, peste bubónica, tétanos, enteritis necrotizante, Actinomicosis , infecciones anaerobias mixtas, sífilis, fiebre recurrente, leptospirosis, enfermedad de Lyme, fiebre · por mordedura de rata, tuberculosis, linfadenitis, Lepra, Clamidia, neumonía por clamidia, tracoma, Conjuntivitis de Inclusión, sistémica; (2) Enfermedades fúngicas : Histoplamosis , Coccicidiodomicosis, blastomicosis, esporotricosis , Criptocosis, Candidiasis sistémica, aspergilosis , mucormicosis, micetoma, Cromomicosis , (3) Enfermedades por Ricketsias: tifo, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, ehrlichiosis, ricketsiosis de Oriente transmitida por garrapatas, ricketsiosis, fiebre Q, y bartonelosis, (4) Enfermedades parasitarias: Malaria, babesiosis, enfermedad del sueño africana, enfermedad de Chagas, leishmaniasis, fiebre Dum-Dum, Toxoplasmosis, meningoencefalitis, queratitis, · Entamoebiasis , Giardiasis, criptosporidiasis, Isosporiasis , Ciclosporiasis , Microsporidiosis , ascariasis, Infección de tricocéfalos , infección por anquilostomas , Infección por oxiuros, Larva migrans ocular, triquinosis, enfermedad del gusano de Guinea, filariasis linfática, Loiasis, oncocercosis , infección del gusano de corazón de perro, esquistosomiasis, prurito del nadador, tremátodo pulmonar oriental, tremátodo hepático oriental, fascioliasis , fasciolopsiasis, opistorquiasis , infecciones de tenia, hidatidosis, hidátide alveolar, (5) Enfermedades Virales: sarampión, panencefalitis esclerosante subaguda, resfriado común, paperas, rubéola, roséola, quinta enfermedad, varicela, infección por virus respiratorio sincitial, crup, bronquiolitis , mononucleosis infecciosa, poliomielitis, herpangina, la enfermedad de mano-pie-y-boca, Enfermedad de Bornholm, herpes genital, verrugas genitales, meningitis aséptica, Pericarditis Miocarditis, gastroenteritis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) , Síndrome de Reye, síndrome de Kawasaki, gripe, bronquitis, neumonía viral atípica, enfermedad respiratoria aguda febril, fiebre faringoconjuntival aguda, queratoconjuntivitis epidémica, virus de herpes simple 1 (HSV-1) , Virus Herpes Simplex 2 (VHS-2) , herpes zóster, enfermedad de Inclusión citomegálica, Rabia, Leucoencefalopatía multifocal progresiva, Kuru, insomnio familiar fatal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Paraparesia Espástica Tropical, encefalitis equina occidental, encefalitis de California, encefalitis de St . Louis, fiebre amarilla, dengue coriomeningitis linfocítica, fiebre de Lassa, fiebre hemorrágica, Hantvirus, Síndrome Pulmonar, Infecciones de virus Marburg, infecciones de virus Ebola y viruela.
Terapia de Múltiples Fármacos de Enfermedades Infecciosas La presente invención también proporciona métodos para tratar una enfermedad infecciosa, que comprende en administrar a ün animal (por ejemplo un mamífero) que lo requiere, un análogo de fucosa y opcionalmente un agente terapéutico que es un agente de enfermedad anti- infecciosa. En una modalidad, el agente de enfermedad anti -infecciosa es pero no está limitado a: (1) Agentes Antibacterianos: Antibióticos de ß-Lactama: Penicilina G, Penicilina V, Cloxacilina, Dicloxacilina, Meticilina, Nafcilina, Oxacilina, Ampicilina, Amoxicilina, Bacampicilina, Azlocilina, Carbenicilina, Mezlocilina, Piperacilina, Ticarcilina; Aminoglicósidos : Amicacina, Gentamicina, Canamicina, Neomicina, Netilmicina, Estreptomicina, Tobramicina; Macrólidas: Azitromicina, Claritromicina, Eritromicina, Lincomicina, Clindamicina; Tetraciclinas : Demeclociclina, Doxiciclina, Minociclina, Oxitetraciclina, Tetraciclina; Quinolonas: Cinoxacina, Ácido Nalidíxico, Fluoroquinolonas : Ciprofloxacina, Enoxacina, Grepafloxacina, Levofloxacina, Lomefloxacina, Norfloxacina, Ofloxacina, Esparfloxacina, Trovafloxicina; Polipéptidos : Bacitracina, Colistina, Polimixina B; Sulfonamidas : Sulfisoxazol , Sulfametoxazol , Sulfadiazina, Sulfametizol, Sulfacetamida; Agentes Antibacterianos Misceláneos: Trimetoprima, Sulfametazol , Cloramfenicol, Vancomicina, Metronidazol, Quinupristina, Dalfopristina, Rifampina, Espectinomicina, Nitrofurantoina; Agentes Antivirales: Agentes Antivirales Generales: Idoxuradina, Vidarabina, Trifluridina, Aciclovir, Famciciclovir, Penciciclovir, Valaciclovir, Ganciciclovir , Foscarnet, Ribavirina, Amantadina, Rimantadina, Cidofovir; Oligonucleótidos Antisentido; Inmunoglobulinas ; Interferonas ; Fármacos para infección de VIH (HIV) : Zidovudina, Didanósino, Zalcitabina, Estavudina, Lamivudina, Nevirapina, Delavirdina, Saquinavir, Ritonavir, Indinavir y Nelfinavir.
Otros Agentes Terapéuticos . Los presentes métodos además pueden comprender la administración de un análogo de fucosa y un agente terapéutico o sus sales o solvatos f rmacéuticos aceptables. El análogo de fucosa y el agente terapéutico puede actuar en forma aditiva o de forma más preferible de manera sinergística . En una modalidad preferida, una composición que comprende un análogo de fucosa se administra en forma concurrente con la administración de uno o más agentes terapéuticos, que pueden ser parte de la misma composición o de una composición diferente de aquella que comprende el análogo de fucosa. En otra modalidad, un análogo de fucosa se administra antes de o subsecuente a la administración de él o los agentes terapéuticos.
En los presentes métodos para tratamiento de cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa, el agente terapéutico también puede ser un agente antihemético . Agentes antiheméticos convenientes incluyen pero no están limitados a metoclopromida, domperidona, proclorperazina, prometazina, clorpromazina, trimetobenzamida, ondansetrona, granisetrona, hidroxizina, acetilleucina monoetanolamina, alizaprida, azasetrona, benzquinamida, bietanautina, bromoprida, buclizina, cleboprida, ciclizina, dimenhidrinato, difenidol, dolasetrona, meclizina, metallatal, metopimazina, nabilona, oxipemdil, pipamazina, escopolamina, sulpirida, tetrahidrocanabinoles, tietilperazina, tioproperazina y tropisetrona .
En otra modalidad, el agente terapéutico puede ser un factor de estímulo de colonia hematopoyética. Factores de estímulo de colonia hematopoyética convenientes incluyen pero no t están limitados a filgrastima, sargramostima, molgramostima y eritropoyetina alfa.
Todavía en otra modalidad, el agente terapéutico puede ser un agente de analgésico opioide o no opioide.
Agentes analgésicos opioides convenientes incluyen pero no están limitados a morfina, heroína, hidromorfona, hidrocodona, oximorfona, oxicodona, metopona, apomorfina, normorfina, etorfina, buprenorfina, meperidina, lopermida, anileridina, etoheptazina, piminidina, betaprodina, difenoxilato, fentanil, sufentanil, alfentanil, remifentanil , levorfanol, dextrometorfano, fenazocina, pentazocina, ciclazocina, metadona, . isometadona y propoxifeno. Agentes analgésicos no opioides convenientes incluyen pero no están limitados a aspirina, celecoxib, rofecoxib, diclofinaco, diflusinal, etodolac, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, cetoprofeno, indometacina, cetorolac, meclofenamato, ácido mefenámico, nabumetona, naprbxeno, piroxicara y sulindac.
La invención además se describe en los siguientes ejemplos, que no se pretende limiten el alcance de la invención.
Ejemplos Ejemplo 1: Producción in vivo de anticuerpos no fucosilados Mé-todos : Ratones BALB/c hembra se inmunizaron con Hemocianina de lapa californiana (KLH = Keyhole Limpet Hemocyanin) 30-60 días antes de inicio de ese estudio. Para el primer estudio, se dosificaron ratones ip con 150 mg/kg de alquinil fucosa (SGD-1887) , alquinil fucosa peracetato (SGD-1890) , 2-fluorofucosa (SGD-2083) , o 2-fluorofucosa triacetato (SGD-2084) , diariamente por 7 días o no fueron tratados. El día 2, los ratones también fueron reforzados con KLH. El día después de la última dosis ip, los ratones fueron sangrados terminalmente y se obtuvo el suero. Para el segundo estudio, a los ratones se les proporcionaron 100 mM de 2-fluorofucosa (SGD-2083) en su agua de beber, o se les da agua sin tratar por 7 días, reforzada con KLH, y continúan con 2-fluorofucosa 100 mM que contiene agua potable o. agua sin tratar por 7 días más antes de ser sangrados terminalmente. Se obtuvo entonces suero. Ningún ratón murió de cualquier estudio. Para ambos estudios, se pasó suero sobre una columna de afinidad anti-KLH comercial, para obtener anticuerpos policlonales específicos KLH. El flujo pasante de la columna de afinidad anti-KLH se pasó sobre una columna de proteína A comercial para obtener los anticuerpos restantes .
Transferencias Punto: 0.5 pg cada uno de anticuerpos de animales sin tratar y tratados, así como normas de anticuerpo cAClO que tienen cantidades conocidas de fucosilación núcleo (0 a 100% de fucosa) , se transfirieron en una membrana de nitrocelulosa. Los niveles de proteína se visualizaron por tinción de Ponceau. La transferencia se sondeó con lectina específica de L-fucosa Aspergillus oryzae biotinilada (AOL) (que liga a anticuerpos fucosilados) y desarrollaron con estreptavidina HRP y ECL. Carga de gel (visible.) y señales de fucosa (bioluminiscencia) se midieron con una cámara Alpha Innotech y cuantificarpn con el soporte lógico de la máquina.
Cromatografía de gases (GC) : 40 pg cada uno de los anticuerpos de animales sin tratar y tratados que se han dializado contra agua, se sometieron a metanólisis en HCl metanólico. Muestras de control de anticuerpo cAClO con 0 a 100% de fucosa se trataron de manera similar. Los metilglicósidos resultantes se derivatizaron por trimetilsililación de los alcoholes monosacárido utilizando un cóctel comercialmente disponible, Tri-Sil. Los trimetilsilil metilglicósidos resultantes se examinaron en un cromatógrafo de gases Hewlet Packard con detección de ionización de flama utilizando un gradiente de temperatura en. una columna Agilent J&W DB-1. Los picos relevantes se identificaron por comparación del tiempo de retención con normas de azúcar derivatizadas en paralelo con las muestras i Ab. Los picos se integraron utilizando el soporte lógico GC. Las proporciones dé área pico de fucosa/manosa se ampliaron para determinar el estado de fucosilación de los anticuerpos.
Resultados : Estudio 1: Figura 1 muestra la transferencia punto (lado izquierdo) de anticuerpos que no ligan a KLH, pero se recuperaron de columna de proteína A. Los resultados se muestran para normas cAClO (transferencia de punto inferior, rectángulo más sombreado izquierdo y columnas correspondientes de transferencia punto superior) control sin tratar (transferencia punto inferior, segundo rectángulo punteado de la izquierda y columna correspondiente de transferencia punto superior) y alquinil fucosa (SGD-1887; transferencia punto inferior, rectángulo sombreado medio y columna correspondiente de transferencia punto superior) , alquinil fucosa peracetato (SGD-1890, transferencia punto inferior, segundo rectángulo punteado de la derecha y columna correspondiente de transferencia punto superior) , y 2-fluorofucosa (SGD-2083; transferencia punto inferior, rectángulo más a la derecha y columna correspondiente de transferencia punto superior) . Normalización para nivel de carga, en por ciento de fucosilación también se muestra en la gráfica a ¦ la derecha. En promedio, los niveles de fucosilación de los anticuerpos se reducen en aproximadamente un tercio, en comparación con controles sin tratar.
La Figura 2 muestra los niveles de fucosilación tanto de anticuerpos anti-KLH (paneles A y B) y las moléculas de IgG en suero restantes aisladas de los grupos tratados (paneles C y D) . Niveles de fucosilación se muestran tanto como un por ciento de fucosilación con base en las normas de anticuerpo cAClO (paneles A y C) y el valor promedio para los grupos tratados como un porcentaje de valor promedio para el grupo de control sin tratar (paneles B y D) . En promedio, los niveles de fucosilación de los anticuerpos anti-KLH se reducen en aproximadamente la mitad por tratamiento con tres de los análogos de fucosa. Los anticuerpos recolectados restantes también exhiben una reducción en fucosilación núcleo de aproximadamente un cuarto. En este estudio, los niveles de anticuerpo totales (específicos y no específicos de KLH) aumentaron en el ratón después de exposición a KLH. Como resultado, la mayoría de los anticuerpos se sintetizaron nuevamente durante los periodos de tratamiento. Estas observaciones indican que anticuerpos recientemente producidos pueden exhibir fucosilación núcleo reducida después de administración de un análogo de fucosa.
Estudio 2 : En este estudio, el efecto de administración oral de análogos de fucose se examinó. La Figura 3 muestra los resultados de tratamiento de ratones por administración oral de análogos de fucosa. Niveles de fucosilación de anticurpo examinados fueron aquellos de los anticuerpos que no ligan a KLH, pero se recuperaron de la columna de proteína A. Resultados se muestran para normas cAClO (transferencias puntoo transferencias en mancha superior e inferior, rectángulo más a la izquierda) , control sin tratar (transferencias punto superior e inferior, segunda de los rectángulos izquierdo (superior) y derecho), y 2-fluorofucosa (transferencias punto superior e inferior, segundo del izquierdo (inferior) y segundo del srectángulo derecho (superior e inferior)) . Normalizando para el nivel de carga, el por ciento de fucosilación también se ilustra en la gráfica a la derecha. Niveles de fucosilación núcleo de anticuerpos de los animales tratados casi fueron eliminados: en promedio, niveles de fucosilación fueron 7% para animales tratados y 81% para no tratados. Estas observaciones indican que la administración oral de análogos de fucosas es un medio efectivo para disminuir los niveles de fucosilación de anticuerpo .
Ejemplo 2: Actividad de análogos de fucosa in vi-tro en cultivo celular Análogos de fucosa se han evaluado por su efecto en fucosilación núcleo de anticuerpo a concentraciones de 50 µ? y 1 m , generalmente como se describe en la Solicitud de Patente de los E.U.A. Publicada 2009-0317869. Brevemente, el protocolo fue como sigue: Una línea de células A CHO DG44 que produce un . anticuerpo monoclonal anti-CD70 IgGl humanizado, hlF6 (ver Publicación de Patente Internacional WO 06/113909) se cultivó a 7.5 x 105 células por mL en 2 mLs de medio de cultivo CHO a 37°, C02 al 5% y agitación a 100 RPM en una placa de cultivo de tejido de 6 pozos. Medio se suplementa con factor de crecimiento tipo insulina (IGF) , penicilina, estreptomicina y cualquiera de 1 mM o 50 µ? del análogo de fucosa. El día 5 posterior a inoculación, el cultivo se centrifugó a 13000 RPM por 5 minutos para nodulizar o granular las células; anticuerpos se purifican entonces a partir del sobrenadante.
Purificación de anticuerpo se realiza al aplicar el medio acondicionado a resina proteína A equilibrada previamente con salino amortiguado con fosfato IX (PBS), pH 7.4. Después de lavar la resina con 20 volúmenes de lecho de resina de IX PBS, se eluyeron anticuerpos con 5 volúmenes de lecho de resina de amortiguador de elución IgG Immunopure (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) . Un volumen de 10% de Tris 1M pH 8.0 se agrega para neutralizar la fracción eluida. Los resultados se ilustran en las siguientes tablas.
Tabla 1 "ND" significa no detectado debido a deficiente producción de anticuerpo o inhibición de crecimiento celular en la presencia del análogo de fucosa.
Tabla 2 "ND" no detectado debido a deficiente producción de anticuerpo o inhibición de , crecimiento celular en la presencia de análogo de fucosa.
Ciertos otros análogos de fucosa se probaron por su habilidad para incorporarse en anticuerpos. Estos análogos de fucosa se probaron a concentraciones de 50 µ? y 1 mM utilizando la metodología descrita anteriormente. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 3 Estos ensayos identificaron compuestos candidato para inhibición de fucosilación de anticuerpo núcleo en mamíferos.
Ejemplo 3: Producción de an-ticuerpos no-fucosilados in vivo después de administración oral En este estudio, los efectos de administración oral del análogo de fucosa, 2-fluorofucosa (SGD-2083) , se examinaron adicionalmente . Ratones BALC/c hembras se les ofrecieron 2-fluorofucosa 1, 10 y 100 mM en su agua para beber por 14 días. Ratones fueron inmunizados con TiterMAX Classic y se les ofreció 2-fluorofucosa 1, 10 y 100 mM en su agua para beber por 7 días adicionales. Los ratones se sangraron terminalmente y se obtuvo el suero. Anticuerpos endógenos se purificaron al pasar el suero sobre una columna de proteína A.
Los anticuerpos recolectados se evaluaron para niveles de fucosilación por transferencia punto como sigue. Anticuerpos de animales sin tratar y tratados (0.5 g cada uno) , así como normas de cAClO con fucosa 0 a 100% (solo estudio 1) se transfirieron en una membrana de nitrocelulosa . Los niveles de proteína se visualizaron con Ponceau S. La transferencia se sondeó con lectina AOL biotinilada y reveló con estreptavidina HRP y ECL (como se describió anteriormente) . Carga de gel (visible) y señales de fucosa (bioluminéscencia) se midieron con cámara Alpha Innotech y cuantificaron con soporte lógico de la máquina.
Resultados : Hubo una disminución dependiente de dosis en niveles de fucosilación de anticuerpos sobre las tres concentraciones de 2-fluorofucosa (SGD-2083) . Con referencia a la Figura 4, los niveles de fucosilación de anticuerpo fueron los más altos grupos de control sin tratar y de 2-fluorofucosa 1 mM (paneles izquierdo y derecho, dos rectángulos superiores) . Anticuerpos de la concentración intermedia de 2-fluorofucosa fueron casi tan agotados de fucosa como la alta concentración de 2-fluorofucosa 100 mM.
Estos resultados confirman que la administración de 2-fluorofucosa a ratones puede inhibir fucosilación de anticuerpo núcleo.
Ejemplo : Efectos de análogos de fucosa en células humanas La capacidad de diferentes análogos de fucosa para inhibir la fucosilación de anticuerpos IgG producidos por células de mieloma humano así como la fucosilación de proteínas de superficie de líneas celulares de cáncer humano, se investigó. En un primer estudio, la capacidad de análogos de fucosa para inhibir fucosilación de IgG producido por la línea celular LP-1, una línea celular de mieloma múltiple humano, se investigó. Los anticuerpos producidos por y encontrados en el medio de cultivo de células LP-1 sin tratar, se confirmaron del tipo IgG por transferencia western utilizando detección IgG anti-humana (datos no mostrados) . Esto se logró al desarrollar 20 mL de células LP-1 en un matraz de cultivo T-75 (250,000 células/mL) por 5 días a 37°C en una atmósfera humidificada de C02 al 5% en medio de cultivo de tejido agotado con IgG (90% RPMI con FBS termo inactivado agotado con IgG al 10%) . La recolección de las células fue por centrifugación (200 x g, 4°C, 5 min) , y el medio de cultivo se recolectó. El medio se filtró a través de un filtro de 0.22 µ?t? y después incubó con 1 mL de un fango de resina de proteína A MabSelect™ al 50% en PBS a 4°C con rotación durante la noche para capturar IgG. El fango de resina se dejó que sedimentara y se retiró la mayoría del medio. El fango de resina se transfirió con -0.5 mL de medio a dos copas de centrifugado con filtro de acetato de celulosa y se centrifugó a 5000 x g por 1 min. El lecho de resina después se lavó 3 veces con 0.5 mL de PBS . IgG se eluyó con 700 de amortiguador de elución IgG Pierce (con 52 µ?. de amortiguador Tris 9 M, pH 9.5 para ajustar el pH después de elución) . La elución resultante se transfirió a un concentrador centrífugo de corte 10,000 MW y la muestra se concentró a aproximadamente 20 L. 1 \i de la muestra concentrada se cargó en un gel de SOS de poliacrilamida para separación, seguido por transferencia en membrana de nitrocelulosa. La tinción de la transferencia para el total de proteína fue con Ponceau S y para identificación de isotipo con anticuerpo IgG anti -humano . La tinción de proteína total mostró bandas consistentes con pesos moleculares de cadenas pesadas y ligeras IgG y la tinción IgG anti -humana mostró reacción con la banda de proteína consistente con el peso molecular dé cadena pesada como se esperó.
Fucosilación de anticuerpo también puede determinarse utilizando lectina específica de L-fucosa de Aspergillus oryzae etiquetada con biotina (AOL) , que liga específicamente a la fucosa a-1, 6-enlazada del anticuerpo. Este método para detección de fucosa funciona tanto para proteína transferida que ya se ha separado por SDS-PAGE o para proteína que se ha aplicado a nitrocelulosa sin separación. La señal fluorescente generada utilizando el conjugado AOL-biotina con enlace de estreptavidina-HRP y detección ECL puede cuantificarse utilizando un sistema Alpha Innotech FlourChem® Q. IgG aislado del cultivo LP-1 exhibe una señal dependiente de AOL en la banda que corresponde a un Peso Molecular (MW) de la cadena pesada como se esperó (datos no mostrados). Los análogos 2 - fluorofucosa (SGD-2083) y 2-fluorofucosa peracetato (SGD-2084) no inhiben la fucosilación de anticuerpo, pero si alquinil fucosa peracetato (SGD-1890) did.
Para evaluar adicionalmente las actividades de diferentes análogos de fucosa, 48 diferentes análogos de fucosa y otros cuatro inhibidores de glicosilación se probaron por su habilidad para afectar la fucosilación de IgG generada por LP-1. Células LP-1 (250,000 células/mL, 3 raL por compuesto en placas de 6 -pozos) se incubaron con 100 µ? de cada análogo de fucosa por 5 días a 37°C con una atmósfera humidificada de C02 al 5% en medio de cultivo de tejido agotado de IgG (90% RPMI con FBS termo inactivado agotado con IgG al 10%) . IgG se aisló como se describió anteriormente utilizando solo 0.5 mL de fango de resina proteína A MabSelectMR y una copa de centrifugado por muestra con elución de 400 pL de amortiguador de elución IgG en 25 yL de amortiguador Tris 9 M, pH 9. Los eluatos se concentraron a 10-20 i~L por muestra y 2 \i de cada uno de los eluatos concentrados se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa y tiñeron con Ponceau S para estimar y ajustar la carga de muestra para tinción AOL. De este estimado de proteína total en cada muestra, aproximadamente 0.5 pg de cada muestra se transfiere sobre la membrana, seca al aire y tiñe con Ponceau S. Una imagen de esta membrana teñida se captura utilizando un sistema Alpha Innotech FlourChem® Q. La membrana después se bloqueó con Albúmina de Suero Bovino (BSA) al 5% en Salino Amortiguado con Tris (TBS) por 1 hora, lavó con TBST (TBS con Tritón) 3 veces y después se incubó con 5 g/ml de AOL biotinilada por 1 hora. La membrana se lavó de nuevo con TBST 3 veces, seguido por incubación de Estreptavidina-HRP por 30 minutos y lavados finales con TBST 3 veces. La señal bioluminescente se reveló utilizando reactivos quimioluminescentes (ECL) y se analizó utilizando el sistema Alpha Innotech FlourChem® O. y soporte lógico Alphaview®. Los resultados se muestran en la siguiente tabla. Para algunos análogos, múltiples muestras se analizaron como se indica en la tabla.
Tabla 4 Tres análogos de fucosa se seleccionaron para un análisis de transferencia estern/SDS-PAGE completo para mostrar que cambios en la señal de fucosa en la cadena pesada pueden ser detectados por esta técnica. Los tres análogos seleccionados se emplearon a una concentración de 50 µ?. Estos análisis compararon la actividad de 2-fluorofucosa (SGD-2083), 2-fluorofucosa peracetato (SGD-2084), y alquinil fucosa peracetato (SGD-1890) con anticuerpo de células sin tratar. Uso de alquinil fucosa peracetato produce IgG que no muestra reactividad con AOL biotinilado, confirmando que cambios en la señal de AOL pueden ser detectados por este método mientras que 2-fluorofucosa (SGD-2083) y 2-fluorofucosa peracetato (SGD-2084) no mostraron cambio aparente en la señal AOL. Estos resultados en general son consistentes con los resultados para estos compuestos en la Tabla 4.
Muchos de lós análogos de fucosa probados en la Tabla 4 parecen disminuir la fucosilación de anticuerpo producido por células de mieloma humano. Las transferencias punto de los compuestos mostraron que 10 de ellos fueron inhibidores potencialmente fuertes de fucosilación IgG en células humanas, utilizando dismunición en señal AOL como una indicación de inhibición. Estos análogos de fucosa son alquinil fucosa peracetato (SGD-1890) , alquinil fucosa tetrapropionato (SGD-2010) , 1-metil fucosa triacetato .(SGD-2039) , 5-etil fucosa tetraacetato (SGD-1989) , 6-fluoro fucosa tetraacetato (SGD-1988) , 6-bromo fucosa tetraacetato (SGD-1969), 6'6-difluoro fucosa tetraacetato (SGD-2046) , 6-ceto-6- etil fucosa tetraacetato (SGD-2067) , 5-epoxi fucosa tetraacetato (SGD-2020) , y 5-metilceto fucosa tetraacetato (SGD-1964) .
Para definir adicionalmente los resultados de la transferencia punto AOL, muestras de los IgGs producidos por células tratadas con los siguientes análogos de fucosa (que dieron disminuciones moderadas a fuertes en la señal AOL de transferencia punto) se aislaron y examinaron al reducir PLRP-MS para verificar el estado de fucosilación utilizando el peso molecular (MW) de la cadena pesada: Alquinil fucosa peracetato; 5-vinilfucosa tetraaceato; 5-metilcetofucosa tetraacetato; 6-bromofucosa tetraacetato; 6-fluorofucosa tetraacetato; 5-etilfucosa tetraacetato; 5-epoxifucosa tetraacetato; 616-difluorofucosa tetraacetato; 6-ceto-6-etil fucosa tetraacetato; y 2-fluorofucosa peracetato.
Muestras de 40 mL de células LP-1 (250,000 células/mL) se trataron con 100 µ? de un análogo de fucosa por 5 días como se describió anteriormente, y IgGs se purificaron como se describió utilizando resina proteína A. Los rendimientos se estimaron por espectroscopia de UV asumiendo un coeficiente de extinción de 1.4 AU/ (mg/mL) . Siete de los diez compuestos producen suficiente IgG para realizar el análisis (uso de SGD-2067, SGD-1964, y SGD-2020 produce <10 µ? de IgG, probablemene debido a toxicidad del análogo a las células) . IgGs restantes se redujeron con DTT 10 mM a 37°C por 15 min y se separaron en PLRP seguido por análisis MS utilizando un espectrómetro de masas QTOF. Los picos de cadena pesada resultante se examinaron y compararon con IgG generado por células sin tratar.
Los resultados de espectrometría de masas se ilustran en la Tabla 5 (a continuación) . Las señales de espectrometría de masas se evaluaron al comparar la altura pico de la cadena pesada contra la cadena pesada menos fucosa y cadena pesada menos fucosa más la masa del análogo de fucosa (que surgiría si se incorporara el análogo en el anticuerpo carbohidrato) . Cuatro de los diez compuestos probados fueron inhibidores parciales o completos de 1, 6-fucosilación en el anticuerpo. Alquinil fucosa peracetato (SGD-1890) proporciona inhibición completa mientras que 2-fluorofucosa peracetato (SGD-2084) fue el siguiente mejor con 70% de inhibición seguido por 6' 6-difluorofucosa tetraacetato (SGD-2046) y 6-bromofucosa tetraacetato (SGD-1969) con -33 y 20% de inhibición mixta con incorporación del análogo en el carbohidrato.
Tabla 5.
Resultados de PLRP-MS contra transferencia punto para IgG generada por LP-1 Ejemplo 5: Efectos de análogos de fucosa en fucosilación de proteina Los efectos de cuatro inhibidores parciales a completos alquinil fucosa peracetato (SGD-1890) , 2-fluorofucosa peracetato (SGD-2084), 6' 6 -difluorofucosa tetraacetato (SGD-2046) , y 6-bromofucosa tetraacetato (SGD- 1969) en fucosilación de superficie de célula de proteína se probó para células de cáncer humano por incubación de cinco líneas celulares de cáncer derivadas de humanos diferentes (Caki-1, PC-3, Ramos, LS174t, y HL60cy) . 100 µ? de cada inhibidor se emplea bajo condiciones de cultivo estándar por aproximadamente 1-2 semanas con cambios regulares de medio de cultivo incluyendo inhibidor fresco. Después del periodo de incubación, las células se analizaron por FACS utilizando cuatro reactivos de detección diferentes: aglutinina culimaris Lens biotinilada-A (LCA) , anticuerpo de anti-Lewisx (anti-SSEAl) , un anticuerpo anti-Lewisy (cBR96) y proteína de Fusión P-Selectina/CD62P/Fc Humana Recombinante . El procedimiento involucró lavado de las células con amortiguador FACS (PBS + albúmina de suero bovino al 10% + azida de sodio al 0.02%) 3 veces seguido por incubación con el reactivo de detección primario por 1 hr a 4°C, seguido por 3 lavados con amortiguador FACS y después incubación con el reactivo de detección secundario por 1 hr a 4°C. Las células finalmente se lavaron con amortiguador FACS 3 veces y resuspendieron en amortiguador FACS y examinaron utilizando un instrumento BD FACScan. El reactivo LCA reconoce secuencias que contienen residuos mañosa a-enlazados y su afinidad se mejora marcadamente por residuos fucosa a-enlazados conectados a la porción N-acetilquitobiosa del núcleo oligosacárido. La proteína de fusión P-selectina detecta ligando P-selectina presente en la superficie de las células, una interacción que involucra el epítopo de sialil Lewisx presente en el ligando P-selectina.
Todas las líneas celulares examinadas mostraron tinción con el reactivo LCA, que reconoce secuencias que contienen residuos mañosa a-enlazados, la afinidad de lo cual se mejora marcadamente por residuos fucosa a-enlazados conectados a la porción N-acetilquitobiosa del núcleo oligosacárido. La detección de LCA de este azúcar epítopo se disminuye ante tratamiento de las células con todos los inhibidores (100 µ?) . Esto sugiere que la presencia total de fucosa en la superficie celular se afecta por tratamiento con los seis análogos fucosa examinados .
La Figura 7 muestra los resultados de estos estudios. Para Lewisx, de las líneas celulares examinadas sólo sin tratar LS1745t y HL60cy tienen detectado significante Lewisx en la superficie celular (tinción anti-SSEAI) (Figura 7A) . La detección anti-SSEAI de ésta estructura se disminuye .significativamente ante tratamiento de las células con todos los análogos fucosa (100 µ?) .
Para LewisY, de las líneas celulares examinadas, sólo . sin tratar LS1745t y HL60cy' tienen detectados significante LewisY en la superficie celular (tinción cBR96) (Figura 7B) . La detección cBR96 de esta estructura se disminuye significativamente ante tratamiento de las células con todos los análogos fucosa (100 µ?) .
Para P-selectina, de las células examinadas, sólo sin tratar HL60cy tuvo ligando P-selectina significante detectado en la superficie celular. La detección de este ligando se disminuye algo por tratamiento de las células con todos los análogos de fucosa, excepto por alquinil fucosa peracetato (SGD-1890) (100 µ?) (Figura 7C) . Células Ramos sin tratar mostraron poco ligando P-selectina; sin embargo, ante tratamiento con los análogos' fucosa, la señal para este ligando se incrementa. Esto es inusual y no se observó con tratamiento previo de estas células con 2-fluorofucosa (SGD-2083) o alquinil fucosa (SGD-1887) .
Los resultados sugieren que el tratamiento con estos análogos fucosa puede afectar la presencia de fucosa en la superficie celular en general y también específicamente la fucosilación de modificaciones Lewisx y . LewisY en la superficie celular y sialil Lewisx presente en ligando P-selectina .
Ejemplo 6: Leucocitosis y enlace de E-selectina disminuido después de dosificación oral de 2-fluorofucosa Los efectos de un análogo de fucosa en leucocitosis y enlace E-selectina se examinaron en ratones. Ratones Balb/c hembra se le suministra 2-fluorofucosa oral (SGD-2083) en el agua potable o se dejan sin tratar. Ratones se sangran antes de dosificar y después semanalmente por tres semanas para estimar números de células en circulación y su capacidad para ligar a E-selectina. En un estudio, 2-fluorofucosa se formula a 1 mM, 10 mM o 100 m en el agua para beber (n=3- por grupo) . El día 14, ratones fueron tratados con adyuvante TiterMAX® Classic (Sigma) para estimular producción de anticuerpo no específico antígeno policlonal por células B y permanece en el agua que contiene 2-fluorofucosa hasta el día 21. En un segundo estudio, se suministra a los ratones 2-fluorofucosa oral formulada a 10 mM y 100 mM en el agua para beber por tres semanas sin ningunos otros tratamientos (n=6) . El día 21, un recolectado de nodos linfáticos (de axila, braquial, inguinal superficial y mesentérico) de cada uno de los tres animales se estimó además de la sangre. Nodos linfáticos se homogeneizaron en suspensiones de una sola célula, y se determinaron los números totales de células por conteo en un hemacitómetro utilizando Azul Triptano para exclusión de células muertas . Para determinar números de glóbulos blancos en total/ L en sangre, muestras de sangre de animales individuales se contaron en un hemacitómetro utilizando soluciones Turk (violeta de genciana al 0.01% en ácido acético al 3%) para excluir glóbulos rojos (RBCs = Red Blood Cells) . RBCs se eliminaron del resto de la sangre por lisis osmótica para análisis citométrico de flujo. Se incubaron células con anticuerpos anti-Gr-l-FITC (BD Biosciences) para identificar neutrófilos y proteína de fusión Fe humana-E- selectina recombinante (R&D Systems) . Las células se lavaron y después se incubaron con un anticuerpo secundario IgG-Fc antihumano cabra etiquetado con PE (Jackson Immunoresearch) para detectar E-selectina ligada. Las muestras se recolectaron en un citómetro de flujo FACSCalibur y analizaron utilizando el soporte lógico CellQuest. El por ciento de células Gr-1+ se determinó y el número absoluto de neutrófilos se calcula utilizando el número de glóbulos blancos total del recuento de hemacitómetro . Además, muestras de flujo se agruparon para células Gr-1+ para estimar enlace de E-selectina a neutrófilos por análisis de histograma. Promedio geométrico de la señal, fluorescente de E-selectina se determina del histograma.
Resultados Los resultados en las Figuras 5A y 5B muestran que la administración oral de 2 - fluorofucosa (SGD-2083) resultó en un aumento en células de glóbulos blancos en circulación y neutrófilos en una forma dependiente de dosis. 2-fluorofucosa dado a 1 mM tuvo muy poco efecto, mientras que se observó un efecto creciente al incrementar la dosis de 2-fluorofucosa 10 mM y 100 mM. Los datos mostrados en las Figuras 5A y 5B son del primer estudio, día 14. Resultados similares se obtienen los días 7 y 21 en el primer estudio así como los días 7, 14 y 21 en el segundo estudio (datos no mostrados) . Nodos linfáticos también se estimaron el día 21 en el segundo estudio y la Figura 5C muestra que la administración oral de 2-fluorofucosa resulta en una disminución marcada en celularidad en los nodos linfáticos. El efecto fue más severo en 100 mM en comparación con 10 mM.
La administración oral de 2-fluorofucosa también resulta en disminución en el enlace de E-selectina a neutrófilos (Figura 6) . Los efectos de los análogos de fucosa también dependen de dosis con 1 .mM que tiene poco efecto y 10 mM y 100 mM que tienen efectos crecientes (Figuras 5B y 5C) .
Los -incrementos observados en células de glóbulos blancos en circulación y neutrófilos (leucocitosis) son consistentes con la inhibición de enlace de E-selectina por neutrófilos. E-selectina media extravasación de glóbulos blancos en la periferia y nodos linfáticos e inhibición de enlace de E-selectina (al inhibir la fucosilación) también reducirá la extravasación y resulta en acumulación de glóbulos blancos en la sangre . Estos resultados sugieren que análogos de fucosa que inhiben fucosilación de proteína y fucosilación de E-selectina, en particular pueden actuar para inhibir autoinmunidad .
Ejemplo 7: Inhibición del crecimiento del tumor por administración de análogos de fucosa Estudio 1 Líneas celulares derivadas de humanos se evalúan por su susceptibilidad al análogo fucosa 2-fluorofucosa in vitro. Las líneas celulares fueron: adenocarcinoma de colon LS174T, adenocarcinoma de colon PC-3, leucemia mielogenosa aguda HL-60, linfoma Ramos Burkitt y carcinoma de células renales Caki-1. Las líneas celulares se cultivaron en la presencia de 2-fluorofucosa 100 µ? (SGD-2083) en medio de crecimiento, alquinilfucosa 100 µ? (SGD-1887) en medio de crecimiento o medio de crecimiento de control (sin un análogo de fucosa) por dos semanas. Los medios de crecimiento fueron MEM Eagle con FBS al 10% (LS174T) , 50:50 F12 y RPMI con FBS al 10% (PC-3), RPMI con FBS al 10% (HL-60), IMDM con FBS al 10% (Ramos) y McCoy con FBS al 10% (PC-3) . Las células se evaluaron para fucosilación de superficie celular por FACS utilizando anticuerpo CBR96 para detectar LewisY, anticuerpo SSEA-1 para detectar Lewisx, ligando P-selectina para detectar P-selectina y lectina AOL para detectar el nivel general de fucosilación.
Resultados : Los resultados de la evaluación FACS revelan niveles variables de proteínas en superficie celular fucosiladas en las diferentes líneas celulares (datos no mostrados) . D-fluorofucosa (SGD-2083) en general fue un mejor inhibidor de fucosilación de proteína que alquinil fucosa (SGD-1887) .
Estudio 2 Para evaluar adicionalmente la actividad de estos análogos fucosa, adicionales estudios se realizaron in vivo utilizando células de tumor que se han tratado previamente al cultivar en la presencia de un análogo de fucosa o utilizar células de tumor sin tratar. Células de tumor se implantaron en 10 ratones por un grupo como sigue. Para las líneas celulares LS174T, PC-3 y Caki-1, 5 x 105 células en Matrigel al 25% se implantaron en forma subcutánea en ratones desnudos hembra. Para líneas celulares HL-60 y Ramos, 5 x 106 células se implantaron subcutáneamente en ratones SCID hembra. Para ratones implantados con células de tumor sin tratar, se les proporcionó a los ratones agua para beber regular. Para ratones implantados con células de tumor pre- ratados con 2-fluorofucosa (SGD-2083) , a los ratones se les proporcionó agua para beber suplementada con 2-fluorofucosa 20 mM (SGD-2083) . Para ratones implantados con células de tumor pre-tratados con alquinil fucosa (SGD-1887) , a los ratones se proporcionó agua para beber regular. Los ratones no beben agua que contiene alquinil fucosa.
Después de 3 semanas de recibir agua para beber que contiene 2-fluorofucosa, los ratones se regresaron al agua para beber regular, excepto por ratones con tumores Caki-1. Estos últimos ratones se regresaron a agua para beber irregular por una semana. Después de la semana de recibir agua regular, los ratones se distribuyeron al azar en dos grupos de 5 cada uno para recibir agua para beber suplementada con 2-fluorofucosa 20 mM o agua para beber regular. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 1000 mm3.
Con referencia a la Figura 8A-E, la inhibición del crecimiento de tumor in vivo se vio para LS174T, PC-3 y células Caki-1 tratadas con 2 - flurofucosa (SGD-2083) . No se observó cambios en crecimiento de tumor para células HL-60 y Ramos. Para Caki-1, no se observó inhibición de crecimiento de tumor durante el primer período de tratamiento, pero se observó después de que los ratones se regresaron al tratamiento con 2-fluorofucosa. Para las otras líneas celulares, inhibición del crecimiento de tumor parece empezar cuando el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 150 mm3.
Los tumores Caki-Í de crecimiento más lento no alcanzan punto hasta segundo periodo de tratamiento con 2-fluorof cosa -2083) . Estos resultados indican que el tratamiento con análogos de fucosa puede inhibir crecimiento de tumor .
Estudio 3 En un tercer estudio, se implantaron células de tumor sin tratamiento previo con un análogo de fucosa. Células de adenocarcinoma de colon LS174T (5 x 105 células en Matrigel al 25%) fueron implantadas subcutáneamente en ratones desnudos liembra. Ratones fueron suministrados con 2- fluorofucosa 50 mM (SGD-2083) en su agua para beber de 7 días antes de implante hasta 21 días después de implante o se le suministró agua para beber regular.
Resultados Con referencia a la Figura 8F, Ratones a los que se les da 2-fluorofucosa 50 mM (SGD-2083) en su agua para beber mostraron una inhibición sustancial de crecimiento de tumor logrando un tamaño de tumor promedio de 110 mm3 contra 734 mm3 para ratones a los que se les suministra agua para beber regular. En forma colectiva, estos resultados sugieren que administración de un análogo de fucosa puede inhibir crecimiento de tumor Ejemplo 8: Modelo de vacuna de tumor Ratones Balb/c hembra se inmunizaron por implante subcutáneo de 1 millón de células de linfoma murino A20 (exterminadas por irradiación) el día -21 y día -7. A otro grupo de ratones ho se les proporciona inmunización alguna. El día 0, todos los ratones se inocularon con iv con 1.5 o 5 millones.de células A20 vivas. Los días -14 a +21, a los ratones se les proporciona 2-fluorofucosa 50 mM (SGD-2083) en su agua para beber o se les suministra agua para beber regular. Los 8 grupos de tratamiento fueron como sigue: 1. Sin inmunización, 1.5 millones de células A20 vivas , agua potable regular. 2. Sin inmunización, 5 millones de células A20 vivas, agua potable regul!ar . 3. Sin inmunización, 1.5 millones de células A20 vivas, SGD-2083 50 mM en agua,potable 4. Sin" inmunización, 5 millones de células A20 vivas, SGD-2083 50 mM en agua potable. 5. Inmunizados, 1.5 millones de células A20 vivas, agua potable regular. 6. Inmunizados, 5 millones de células A20 vivas, agua potable regular. 7. Inmunizados, 1.5 millones de células A20 vivas, SGD-2083 50 mM en agua potable. 8. Inmunizados, 5 millones de células A20 vivas, SGD-2083 50 mM en agua potable Resultados Con referencia a la Figura 9A, se muestra el diseño de estudio. Con. referencia a la Figura 9B, ratones que no reciben ninguna inmunización sucumben a la prueba A20 vivos de los días 22-35. Ratones que reciben 2-fluorofucosa (SGD-2083) sobrevivieron unos cuantos días más que aquellos que reciben agua potable regular. Dos ratones inmunizados con 5 millones de células A20 exterminadas y que reciben agua potable regular sucumbieron a la prueba con A20 vivos. Todos los ratones recibieron inmunización y 2-fluorofucosa (SGD-2083) en su agua potable todavía están vivos al tiempo de recolectar los datos .
La presente invención no se limita en alcance por las modalidades especificas aquí descritas. Diversas modificaciones de la invención además de aquellas descritas aquí serán aparentes para aquellos con destreza en la especialidad a partir de la descripción anterior y figuras acompañantes. Estas modificaciones se pretende que caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . Al menos que sea de otra forma aparente del contexto, cualquier etapa, elemento, modalidad, característica o aspecto de la invención pueden emplearse en combinación con cualquier otro. Todas las presentaciones dej patentes y publicaciones científicas, números de acceso y semejantes referidas en esta solicitud, aquí se incorporad por referencia en su totalidad para todos los propósitos e la misma medida como si se denotaran individualmente .

Claims (1)

  1. alquilsililo, -OCi-Cio alquilo, y un pequeño grupo de extracción de electrones, en donde cada n es un entero seleccionado independientemente de 0-5; R5 es un miembro seleccionado del grupo que consiste de -CH3, -CHX2, -CH2X, -CH ( 1 ) -C!-C4 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno, -CH (X 1 ) -C2-C4 alqueno sin sustituir o sustituido con halógeno, -CH (X 1 ) -C2-C4 alquino sin sustituir o sustituido con halógeno, -CH=C(R10) (R11) , -C(CH3)=C(R12) (R13) , -C(R14) =C=C(R15) (R-6 C3 carbociclo sin sustituir o sustituido con metilo o halógeno, -CH(X' ) -C3 carbociclo sin sustituir o sustituido con metilo o halógeno, C3 heterociclo sin sustituir o sustituido con metilo o halógeno, -CH(X' ) -C3 heterociclo sin suiistituir o sustituido con metilo o halógeno, •CH2N3, -CH2CH2N3, y benziloximetilo o R5 es un pequeño grupo de extracción de electrones; en donde R10 es hidrógeno o Ci-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R11 es Ci-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R12 es hidrógeno, halógeno o Ci-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R13 es hidrógeno o Ci-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R14 es hidrógeno o metilo; R15 y R16 se eligen independientemente de hidrógeno, metilo y halógeno; X es halógeno; X1 es halógeno o hidrógeno; y adicionalmente, jada uno de R1, R2, R2a, R3 y R3a son opcionalmente hidrógeno; opcionalmente dos R1, R2, R2a, R3 y R ,3a en átomos de carbono adyacentes se combinan para formar un doble enlace entrel los átomos de carbono adyacentes; y siempre que al menos uno de R1, R2, R2a, R3, R3a, R4 y R5 es un pequeño grupo de extracción de electrones o R5 comprende un halógeno, sitio de insaturación, carbociclo, heterociclo o azida, excepto cuando (i) R2 y R2a son ambos hidrógeno, (ii) R3 y R3a son ambos hidrógeno, (iii) R1 es hidrógeno, (iv) un doble enlace está presente entre los átomos de carbono adyacentes o (v) R5 es benziloximetilo; y en donde la fucosilación de proteína se reduce en al menos 10% en el mamífero respecto a la cantidad de fucosilación de proteína en la ausencia de administración del análogo de said fucosa de las fórmulas V o VI . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el análogo de fucosa es seleccionado OH, -OC(0)H, -OC (O) Ci¡-C10 alquilo, -OC(0)C2 - Ci0 alquenilo, OC(0)C2 - Cio alquinilo, -OC(0)arilo, -OC (O) heterociclo, OC(0)C! -Cio alquilen (arilo) , -OC(O)C2 - Ci0 alquenilen (arilo) , -OC(0)C2 -Cio alquinilen (arilo) , -OC(O) Ci - Ci0 alquilen (heterociclo), -OG (O) C2-C10 alquenilen (heterociclo) , -OC(0)C2-Cio alquinilen (heterociclo) , -0CH2OC(O) alquilo, -0CH20C(0)0 alquilo, -0CH20C(0)0 arilo -OC (0) CH20 (CH2CH20) nCH3 , 0C(0) CH2CH20(CH2CH20)nCH3, -0-tri-d-C3 alquil sililo, y -Od-C10 alquilo, en donde cada n es un entero seleccionado independientemente de 0-5; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, - CH2C=CH, -C(0)OCH3, -CH(0Ac)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en donde cada X es F, Br, Cl o I) , -CHX2 (en donde cada X s F, Br o Cl) y raetoxirano. 3 . El método de conformidad con las reivindicaciones ¡1 ó 2, caracterizado porque el mamífero tiene cáncer. 4 . El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el mamífero tiene un desorden autoinmune . 5 . El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque además comprende administrar antígeno asociado a cáncer o su fragmento antigénico como un mmunogeno . 6 El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque cada uno de R1-!*4 es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, -OC{0) Ci- Cio alquilo, -OC(O)C2 - Ci0 alquenilo, OC(0)C2 - Cio alquinilo, -0C(0)arilo, -0C(0) heterociclo, OC(0) Ci - Cio alquilen (arilo) , -OC(O)C2 - Ci0 alquilen (arilo) , OC(O) C2-C alquinilen (arilo) , -OC (O) Ci- Cu, alquilen (heterocicilo) , -OC(O)C2-C10 alquenilen (heterociclo) , -OC(O)C2-C10 alquileno (heterociclo) , -OC (O) CH20 (CH2CH20) nCH3 y -OC (O) CH2CH20 (CH2CH¡ 20)nCH3; y R5 se elige del grupo que consiste de -C=CH, -C=CCH3, - CH2C=CH, -C(0)0CH3, -CH(OAc)CH3, -CN, -CH2CN, -CH: X (en donde X es F, Br, Cl o I) , y metoxirano . 7 . El método de conformidad con · las reivindicaciones 1J ó 2, caracterizado porque cada uno de R1-R4 se elige independientemente del grupo que consiste de -OH - (0)H y -0C(0) Ci - Pío alquilo. 8 . El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque cada uno independientemente del grupo que consiste de -OH y -OAc 9 . El método de conformidad con las reivindicaciones 2, caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste de -C=CH y -C=CCH3. 10 . El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque R es -C=CH. 11 . El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque R5 es -CH2X, en donde X es F, Br, Cl o I . ' 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque R5 es -CH2X, en donde X es F. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque R5 es -CH2X, en donde X es Br. 1 . El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque R5 es -CHX2, en donde X es F. 15. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque R es -CHX2, en donde X es F . 16. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque R5 es -CHF2 y R1-R4 is-OAc. 17. El método de conformidad con las reivindicaciones l1 ó 2, caracterizado porque R5 es -CH2Br y Rx-R4 es -OAc. 18. El método de conformidad con las reivindicaciones l| ó 2, caracterizado porque R5 es -C=CH y R1-R4 es -OAc. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el análogo de fucosa es seleccionado delj grupo que consiste de uno de las siguientes fórmulas (III) o (IV) : -CH2X (en donde X es F, Br, Cl o I) , y metoxirano. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R1 es F. 21. El tiétodo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R2 es F. 22. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R3 es F. 23. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R2 y R2a son cada uno F. 2244.. EEll método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R1 y R2 son cada uno F. 25. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado [porque R2a y R3a son cada uno hidrógeno, 26. El método de conformidad con la reivindicación 1199,, ccaarraacctteerriizzaaddool porque R5 es seleccionado del grupo que consiste de -CH3, -CH2CH3, -C=CH, -CH2C=CH, -CH=CHCH3, -ciclopropilo, -o.irano, -oxirano sustituido con metilo, CH2F, -CH2C1, -CH2Br, -CH2I, -CHF2, -CH=C=CH2, -CH2N3 y -CH2CH2N3. 2 277.. EEll método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el pequeño grupo de extracción de electrones es seleccionado del grupo que consiste de fluoro, chloro, bromo, -CHF2, -CH=C=CH2, -C=CH, -C=CCH3, -CH2C=CH, -C02H, -C(0)OCi-C4 alquilo, -CH(OAc)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en ddoonnddee XX eess FF,, BBrr,,!¡ Cl o I) , y metoxirano. 28. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R5 es -C=CH. 29. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R5 es -CH2X, en donde X es F, Br, Cl o I. 30. El ¡método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque R5 es -CH2X, en donde X es F. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque R5 es -CH2X, en donde X es Br. 32. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado (porque R5 es -CHX2, en donde X es F. ' 33. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque R5 es -CHX2, en donde X es F. 34. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R5 es -CHF2 y R1-R4 is-OAc. 35. El método de conformidad, con la reivindicación 19, caracterizado porque R5 és -CH2Br y R^R4 is-OAc. 36. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R5 es -C=CH y R1-R4 is-OAc. 37. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque al menos dos de R1, R2, R2a, R3, R3a y R¾ es un pequeño grupo de extracción de electrones. 38. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el análogo de fucosa se elige de compuestos de las Tablas 1, 2 ó 3. seleccionado independientemente de 0-5; R5 es un miembro seleccionado del grupo que consiste de -CH3, CHX2, -CH2X, -CH (X' ) -Ci-C4 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno, -CH( X' ) -C2-C4 alqueno sin sustituir o sustituido con halógeno, -CH( X' ) -C2-C4 alquino sin sustituir o sustituido con halógeno, -CH=C(R10) (R11) , -C(CH3) =C(R12) (R13) , -C(R14) =C=C(R15) (R: , -C3 carbociclo sin sustituir o sustituido con meltilo o halógeno, -CH(X' ) -C3 carbociclo sin sustituir o sustituido con metilo o halógeno, C3 heterociclo sin sustituir o siistituido con metilo o halógeno, -CH(X' ) -C3 heterociclo sin sustituir o sustituido con metilo o halógeno, -CH2N3, •CH2CH2N3, y benziloximetilo o R5 es un pequeño grupo de extracción de Electrones; en donde R10 es hidrógeno o C1-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R11 es C1-C3 alquilo sin susoituir o sustituido con halógeno; ,12 es hidrógeno, halógeno o Ci-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; y R13 es hidrógeno o C1-C3 alquilo sin sustituir o sustituido con halógeno; R14 es hidrógeno o metilo; R15 y R16 se eligen independientemente de hidrógeno, metilo y halógeno; X es halógeno; y Ji' es halógeno o hidrógeno; y adicionalmente , cada uno de R1, R2, R2a, R3 y R3a son opcionalmente hidrógeno; opcionalmente dos R1, R2, R2a, R3 y ,3a en átomos de cárbono adyacentes se combinan para formar un doble enlace entre los átomos de carbono adyacentes; y siempre que al menos uno de R1, R2, R2a, R3, R3a, R4 y R5 es un pequeño grupo de extracción de electrones o R5 comprende un halógeno, sitio c.e insaturación, carbociclo, heterociclo o azida, excepto cuándo (i) R2 y R2a son ambos hidrógeno, (ii) RJ y R3a son ambos hidrógeno, (iii) R1 es hidrógeno, (iv) un doble enlace está presente entre los átomos de carbono adyacentes o (v) R5 es benziloximetilo,- y en donde la fucosilación de proteína se reduce en el mamífero respecto a la cantidad de fucosilación de proteína en la ausencia de administración del análogo de fucosa de las fórmulas V o VI . 40. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque cada uno de Rx-R4 independientemente se elige del grupo que consiste de -OH, -OC(0)H, -0C (0) CL- Cio alquilo, -OC(O)C2-C10 alquenilo, OC(0) C2 - Cio alquinilo, -0C(0)arilo, -0C (O) heterociclo, OC(0) Ci - Cio alquil n (arilo) , -OC(0) C2 - Ci0 alquenilen (arilo) , -OC(0) C2 - Cio al xiinilen (arilo) , -0C (O) CI-CIQ alquilen (heterociclo), -OC(O)C2-C10 alquenilen (heterociclo) , -0C(0)C2-Cio alquinile (heterociclo) , -0CH20C(0) alquilo, -0CH20C(0)0 alquilo, -0CH20C(0) arilo, -0CH20C(0)0 arilo, OC (0) CH20 (CH2CH20) rCH3 , -0C (O) CH2CH20 (CH2CH20) nCH3 , -0-tri- Ci - C3 alquil sililo, -OCi - Cio alquilo, en donde cada n es un entero seleccionado independientemente de 0-5; y R5 se elige del grupo que consists de -C=CH, -C=CCH3, - CH2C=CH, -C(0)0CH3, -CH(0Ac)CH3, -CN, -CH2CN, -CH2X (en donde X es F, Br, Cl o I) , reivindicación 39, caracterizada porque R5 es -CH2X, en donde X es F. 53. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque R5 es -CH2X, en donde X es Br. 54. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque R5 es -CHX2, en donde X es F. 55. La composición de conformidad con la reivindicación 39,¡ caracterizada porque R5 es -CHX2, en donde X es F. 56. La composición de conformidad con la reivindicación 39 caracterizada porque R5 es -CHF2 y R1-R4 es -OAc. 57. La composición de conformidad con la reivindicación 39 caracterizada porque R5 es -CH2Br y R1-R4 es -OAc. 58. La composición de conformidad con la reivindicación 39 J caracterizada porque R5 es -C=CH y R1-R4 es -OAc. 60. La composición de conformidad con la reivindicación 39 caracterizada porque al menos dos de R1, R2, Ra, R3, R3a y R4 es un pequeño grupo de extracción de electrones
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