MX2012012564A - Dispositivos medicos para la entrega de arn de interferencia corta. - Google Patents

Dispositivos medicos para la entrega de arn de interferencia corta.

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Abstract

Están descritos los dispositivos médicos que incorporan el ARN de interferencia corta. En adición a una o más construcciones de ARN de interferencia corta, los dispositivos incluyen nanoestructuras fabricadas sobre una superficie para formar una nanotopografía. Un patrón al azar o no al azar de estructuras puede ser fabricado de manera como un patrón complejo incluyendo estructuras de diferentes tamaños y/o formas. Las microagujas pueden ser incorporadas en los dispositivos. El patrón incluyendo nanoestructuras puede ser formado sobre la superficie de las microagujas.

Description

DISPOSITIVOS MEDICOS PARA LA ENTREGA DE ARN DE INTERFERENCIA CORTA REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad a la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América serie No. 61/328,723 que tiene una fecha de presentación del 28 de Abril del 2010 y de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América serie No. 61/416,057 que tiene una fecha de presentación del 22 de noviembre del 2010, ambas de las cuales son incorporadas aqui en su totalidad por referencia.
ANTECEDENTES Muchos factores afectan la expresión de gen en los organismos. Por ejemplo, los ARN pequeños, generalmente de 20 a 25 nucleótidos de longitud, han emergido como reguladores importantes de la expresión de gen eucariótico. Una clase de ARN pequeña es el ARN de interferencia corta ( siARN) . El ARN de interferencia corta juega un papel en la trayectoria de interferencia de ARN (ARNi) , y particularmente en el silenciado de ARN, un proceso de degradación de ARN de secuencia específica que es activado por el ARN de cadena doble (dsARN) . Los ARN de interferencia corta son de doble cadena con sobre colgados 3 ' y derivan de precursores de ARN de cadena doble más largos que inducen en el silenciar. Esto sirve como guías para dirigir la destrucción de un ARN de objetivo y se han implicado como imprimadores en la amplificación de los ARN de cadena doble a través de la actividad de una polimerasa ARN es dependiente de ARN celular.
Dado este descubrimiento, los ARN de interferencia corta sintética se han producido los cuales pueden inducir una interferencia de ARN en las células de mamíferos a través de silenciar o de otra manera suprimir la transcripción de genes múltiples sin embargo, a pesar de los resultados provisorios, aún existen problemas con la utilización exitosa de la tecnología de ARN de interferencia corta, entre los cuales los métodos de entrega juegan Unipapel grande. Típicamente, el ARN de interferencia corta se ha entregado ya sea por inyección directa, electroporación, o mediante el complejar con un agente de transfectar. Sin embargo, el ARN de interferencia corta sigue estando activamente presente por solo una materia de horas después de la entrega. A fin de obtener una efectividad de una duración más prolongada, los métodos de entrega mejorados deben ser encontrados los cuales puedan proporcionar una entrega a largo plazo y estable del ARN de interferencia corta.
Los dispositivos de entrega transdérmicos , que proporcionan una ruta para el ARN de interferencia corta que van a ser entregados en un estado activo a concentraciones estables y efectivas sobre un período de tiempo mediante un gran beneficio. Muchas dificultades deben ser superadas para alcanzar este objetivo. Por ejemplo, el cuerpo humano ha desarrollado muchos sistemas para evitar el influjo de sustancias extrañas tal como la degradación enzimática en el tracto gastrointestinal, los componentes estructurales que evitan la absorción a través del epitelio, el despejado hepático, y la respuesta inmune y la respuesta al cuerpo extraño .
Los dispositivos transdérmicos han desarrollado para la entrega sostenida de ciertas drogas incluyendo aquellas para tratamiento de vértigo, la anticoncepción, y la adicción a fumar. A fin de ser exitoso, un dispositivo transdérmico debe entregar una agente a través de la epidermis la cual ha evolucionado con una función primaria de mantener afuera a las sustancias extrañas. La capa mas inferior de la epidermis, el estrato corneo, tiene una estabilidad estructural proporcionada por los corneocitos traslapantes y las fibras de queratina entrecruzadas mantenidas juntas por los coreodesmosomas y embebidas ahí dentro de una matriz de lípido, todo lo cual proporciona una función de barrera excelente. Debajo del estrato corneo esta el estrato granuloso, dentro del cual son formadas las juntas apretadas entre los queratinocitos . Las juntas apretadas son estructuras de barrera que incluyen una red de proteínas transmembrana en bebidas en membranas de plasma adyacentes (por ejemplo, claudinas, ocludina y molécula de adhesión de junta) así como múltiples proteínas de placa (por ejemplo, ZO-1, ZO-2, ZO-3, cingulina, simplequina) . Las juntas apretadas se encuentran en el epitelio interno (por ejemplo el epitelio intestinal, la barrera de sangre-cerebro) así como en el estrato granuloso de la piel. Debajo de ambos el estrato corneo y el estrato granuloso yace en el estrato espinoso. El estrato espinoso incluye las células Langerhans, las cuales son células dendríticas que pueden superar las células que presentan antígeno completamente funcionantes y pueden instituir una respuesta inmune y/o una respuesta a cuerpo extraño a un agente invasor.
Desafortunadamente, los métodos de entrega transdérmicos están actualmente limitados a la entrega de agentes de peso molecular bajo que tienen una lipofilicidad moderada y ninguna carga. Aún con el cruzamiento exitoso del límite natural, existen aún problemas con respecto al mantenimiento de nivel de actividad de los agentes entregados y evitar la respuesta de cuerpo extraño en la respuesta inmune.
La utilización de los métodos complementarios para facilitar la entrega transdérmica de los agentes activos ha mejorado esta ruta de entrega. Por ejemplo, los dispositivos de microagujas se han encontrado que son útiles para transportar los materiales adentro o a través de la piel. En general, un dispositivo de microaguja incluye un arreglo de agujas que puede penetrar el estrato corneo de la piel y alcanzar una tapa subyacente. Los ejemplos de los dispositivos de microagujas se han descrito en la patente de los Estados Unidos de América No. 6,334,856 otorgado a Alien y otros y en la patente de los Estados Unidos de América No. 7,226,439 otorgada a Prausnitz y otros, ambas de las cuales son incorporadas aquí por referencia.
Aún cuando lo anterior describe mejoras en el arte, aún existe lugar para mejoras adicionales.
SÍNTESIS De acuerdo con una incorporación de la presente invención, un dispositivo para la entrega de una construcción de ARN de interferencia corta a través de una barrera dérmica. El dispositivo comprende una microaguja y una pluralidad de nanoestructura fabricadas sobre una superficie la misma aguja, las nanoestructuras están arregladas en un patrón predeterminado. Una construcción ARN de interferencia corta está en comunicación de fluido con la microaguja.
De acuerdo con otra incorporación de la presente invención, se presenta un método para entregar una construcción de ARN de interferencia corta a través de la barrera dérmica. El método comprende el penetrar el estrato corneo con una microaguja. La microaguja comprende una pluralidad de nanoestructuras formadas sobre una superficie de la microaguja y arregladas en un patrón. El ARN de interferencia corta esta en comunicación de fluido con las raicroagujas, la construcción de ARN de interferencia corta siendo transportadas a través del estrato corneo después de la penetración del estrato corneo por la microaguja.
De acuerdo con otra incorporación aún de la presente invención, esta descrito un método para formar un dispositivo para la entrega de una construcción de ARN de interferencia corta a través de una barrera dérmica. El método comprende el fabricar un arreglo de microagujas, fabricar un patrón de la nanoestructura sobre una superficie de por lo menos de una de las microagujas; y asociar una construcción de ARN de interferencia corta con las microagujas de manera que la construcción de ARN de interferencia corta esta en comunicación de fluido con las microagujas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Una descripción completa y habilitante de la materia específica, incluyendo el mejor modo de la misma dirigido a uno con una habilidad ordinaria en el arte, se establecen mas particularmente en el resto de la descripción, la cual hace referencia a las figuras anexas en las cuales: La figura 1 ilustra una incorporación de un dispositivo de microagujas.
La figura 2 ilustra otra incorporación de un dispositivo de microaguja.
La figura 3 ilustra una incorporación de una microaguja que incluye una superficie que define una nanotopografía que puede interactuar con una matriz extra celular (ECM) .
La figura 4 ilustra una incorporación de un patrón complejo que puede ser formado sobre una superficie de microagujas .
La figura 5 ilustra un patrón que incluye repeticiones múltiples del patrón complejo de la figura 4.
La figura 6 ilustra un fractal de triángulo Sierpinski .
Las figuras 7A-7D ilustran nanotopografías fractal y de tipo fractal.
La figura 8 ilustra otro patrón completo que puede ser formado sobre una superficie de microagujas.
La figura 9 ilustra densidades de empaque de ejemplo como pueden ser utilizadas para las estructuras nanodimensionadas como se describen aquí incluyendo un diseño de empaque cuadrado (figura 9A) , un diseño de empaque hexagonal (figura 9B) , y un diseño de empaque de círculo (figura 9C) .
Las figuras 10A-10C ilustran esquemáticamente un método de nanoimpresión como puede ser utilizado en una incorporación en la formación de un dispositivo.
La figura 11 ilustra esquemáticamente una incorporación del dispositivo.
La figura 12 es una vista en perspectiva de una incorporación de un parche transdérmico antes de la entrega de un compuesto de droga.
La figura 13 es una vista frontal del parche de la figura 12.
La figura 14 es una vista en perspectiva del parche de la figura 12 en el cual el miembro de liberación está parcialmente retirado del parche.
La figura 15 es una vista frontal del parche de la figura 12.
La figura 16 es una vista en perspectiva del parche transdérmico de la figura 122 después de la remoción del miembro de liberación y durante el uso.
La figura 17 es una vista frontal del parche de la figura 16.
La figura 18 es una vista en perspectiva de una incorporación de un parche transdérmico antes de la entrega de un compuesto de droga.
La figura 19 es una vista frontal del parche de la figura 18.
La figura 20 es una vista en perspectiva del parche de la figura 19 en la cual el miembro de liberación esta parcialmente pelado hacia afuera del parche.
La figura 21 es una vista frontal del parche de la figura 20.
La figura 22 es una vista en perspectiva del parche de la figura 18 en la cual el miembro de liberación esta completamente pelado hacia afuera del parche.
La figura 23 es una vista en perspectiva del parche transdérmico de la figura 18 después de la remoción del miembro de liberación y durante el uso.
Las figuras 24A-24E ilustran varios patrones nanotopograflas como se describen aquí.
La figura 25 es una microscopía de exploración electrónica de una película incluyendo una superficie con un nanopatrón .
Las figuras 26A-26B son 2 microscopías de exploración electrónica de una película que incluye otra superficie con nanopatrón.
La figura 27 es una microscopía de exploración electrónica de una película incluyendo otra superficie con nanopatrón .
La figura 28 es una microscopía de exploración electrónica de una película incluyendo otra superficie con nanopatrón .
La figura 29 es una microscopía de exploración electrónica de una película incluyendo otra superficie con nanopatrón .
La figura 30 es una microscopía de exploración electrónica de una película incluyendo otra superficie con nanopatrón.
La figura 31 es una microscopía de exploración electrónica de una película incluyendo otra superficie con nanopatrón.
La figura 32 es una microscopía de exploración electrónica de una película incluyendo otra superficie con nanopatrón .
La figura 33 es una microscopía de exploración electrónica de una película incluyendo otra superficie con nanopatrón.
La figura 34 ilustra gráficamente los efectos sobre la permeabilidad de la albúmina de suero bovino (BSA) en una monocapa de células sobre películas de poliestireno formadas con patrón con nanopatrones como se describe aquí.
La figura 35 ilustra gráficamente los efectos sobre la permeabilidad a la inmunoglobulina-G (lgG) en una monocapa de células sobre películas de poliestireno formadas con patrón con nanopatrones como se describe aquí.
La figura 36A y la figura 36B son imágenes de manchado de fluoresceína vivas/muertas 3D mostrando el transporte paracelular de la inmunoglobulina-G (lgG) a través de una monocapa de células sobre una superficie con patrón de poliestireno como se describe aquí.
La figura 37 ilustra gráficamente los efectos de la permeabilidad de la albúmina de suero bovino en una monocapa de células sobre películas de polipropileno con patrón con nanopatrones como se describió aquí.
La figura 38 ilustra gráficamente los efectos sobre la permeabilidad a la inmunoglobulina-G en una monocapa de células sobre películas de polipropileno con patrón con nanopatrones como se describió aquí.
Las figuras 39A y 39B son imágenes de manchado de fluoresceína vivas/muertas 3D mostrando el transporte paracelular de inmunoglobulina-G a través de una monocapa de células sobre una superficie con patrón de polipropileno como se describió aquí .
Las figuras 40A y 40F son imágenes de microscopía de exploración electrónica (SEM) de células cultivadas sobre superficies con nanopatrón como se describió aquí.
La figura 41 es un arreglo de microagujas incluyendo una capa de superficie que define un patrón pero en estructura sobre el mismo.
La figura 42 es una microaguja única del arreglo de la figura 41.
La figura 43 ilustra gráficamente los efectos sobre la permeabilidad el ARN de interferencia corta en una monocapa de células sobre una película de polipropileno formada con patrón como se describió aquí .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS INCORPORACIONES REPRESENTATIVAS Se hará ahora referencia en detalle de las incorporaciones de la materia específica descrita, uno o más ejemplos de la cual se establecen abajo. Cada ejemplo se proporciona por vía de explicación y no de limitación. De hecho, será evidente para aquellos expertos en el arte el que puedan hacerse varias modificaciones y variaciones en la presente descripción sin departir del alcance o espíritu de la materia específica. Por ejemplo, las características ilustradas o descritas como parte de una incorporación pueden ser usadas sobre otra incorporación para dar aún una incorporación adicional. Por tanto, se intenta que la presente descripción cubra tales modificaciones y variaciones como caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y de sus equivalentes.
En general, está descrito un dispositivo para la entrega de construcciones de ARN de interferencia corta. Más específicamente, el dispositivo puede incluir una pluralidad de microagujas en una superficie-patrón de estructuras fabricadas sobre las microagujas. Por lo menos una parte de las estructuras son fabricadas sobre una escala de nanómetro . El dispositivo está también asociado con una o más construcciones de ARN de interferencia corta, por ejemplo en una capa de dispositivo o en un dispositivo que esta en comunicación de fluido con la superficie que incluye las microagujas.
Sin desear de estar limitado en materia en particular, se cree que el patrón de nanoestructuras , por ejemplo la nanotopografía, de un dispositivo, puede mejorar la entrega del ARN de interferencia corta mientras que se minimiza la respuesta de cuerpo extraño y la respuesta inmune a través de la utilización de un dispositivo, el ARN de interferencia corta puede ser especificado para la entrega en un sitio específico, por ejemplo un tejido específico o un tipo de célula específica en un área de entrega específica, o este puede ser entregado en una forma sistémica, por ejemplo a través del sistema cardiovascular.
Los agentes de ARN de interferencia corta de los dispositivos son suficientemente cortos de manera que estos no activan una respuesta de interferón no específica perjudicial en las células de mamífero normales. Por tanto, la administración de una composición incluyendo uno o más agentes ARN de interferencia corta puede ser usada para afectar la transcripción de un gen de objetivo, mientras que se da vuelta a una respuesta de interferón así como se minimiza la respuesta de cuerpo extraño. El ARN de interferencia corta de un dispositivo puede generalmente incluir una región dúplex de menos de 50, de menos de 40, ó menos de 30 pares de nucleótidos, por ejemplo dentro de alrededor de 20 pares y alrededor de 25 pares. En general, un polinucleótido de ARN de interferencia corta comprende un ARN de cadena doble (dsARN) pero no se intenta el estar limitado puede comprender un ARN de cadena única.
Un ARN de interferencia corta puede ser formado de acuerdo a cualquier proceso conocido. Por ejemplo un ARN de interferencia corta puede ser sintetizado sintéticamente o a través de transcripción de una construcción de ADN ya sea en vivo o en Vitro. En general, una molécula de ARN de interferencia corta puede ser sintetizada usando los métodos, los reactivos y el equipo disponible por un experto en el arte. Por vía de ejemplo, el ARN de interferencia corta puede ser designado y sometido en ingeniería usando un software de computadora disponible comercialmente de varios vendedores, por ejemplo OligoEngine (de Seattle, Washington Estados Unidos de América); Dharmacon, Inc. (Lafayette, Colorado Estados Unidos de América); Ambion, Inc., (Austin, Texas Estados Unidos de América; y QIAGEN, Inc. (Valencia, California). También vea Elbashir y otros, 2000 Genes de Desarrollo 15:188-200; Elbashir y otros, 2001 Naturaleza 411:494-98.
De acuerdo a tales métodos una secuencia de cADN puede ser escaneada para secuencia de objetivo que tienen dinocleotidos AA. Los oligonucleótidos sentido y anti-sentido pueden ser generados para esos objetivos que contienen un contenido G/C de por ejemplo de alrededor de 35 a 55%. Estas secuencias pueden entonces ser comparadas a otras en la base de datos del genoma humano para minimizar la gemología a otras secuencias de codificación conocidas (por ejemplo mediante el llevar a cabo una búsqueda BLAST usando la información disponible a través de la base de datos NCBI) .
Una molécula de oligonucleótido de ARN de interferencia corta puede ser generada mediante transcripción in Vitro o en vivo de secuencias de ADN adecuadas (por ejemplo secuencias de polinucleótido codificando un polipéptido de objetivo, o una parte deseada del mismo) . El AND puede ser incorporado en un vector con un promotor de polimerasa ARN adecuado (tal como por ejemplo T7, U6 , Hl, ó SP6 aún cuando otros promotores pueden ser igualmente útiles) . Las polimerasas ARN endógenas dentro de una célula pueden mediar la transcripción en vivo, la polimerasa ARN clonada puede ser usada para la transcripción en vivo o en Vitro. Para la transcripción de un transgen o una construcción de expresión, una región reguladora puede ser usada para transcribir las cadenas de ARN de interferencia corta.
Un vector puede ser entregado a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (patente de los Estados Unidos de América No. 5,328,470 otorgada a Nabel y otros) o mediante inyección esterotáctica (vea por ejemplo, Chen y otros , Proc . Nati, Acad. Sei. USA 91:30543057, 1994) . Una plantilla ADN puede incluir dos unidades de transcripción, una que produce una transcripción que incluye la cadena de sentido de un agente ARN de interferencia corta y una que produce una transcripción que incluye la cadena anti-sentido de un ARN de interferencia corta. Cuando las plantillas son transcritas después de la entrega, puede ser producido un agente ARN de interferencia corta .
Los polinucleotidos que comprenden un ARN de interferencia corta pueden ser derivados de un polinucleotido de cadena única que comprende un fragmente de oligonucleótido de cadena única (por ejemplo de alrededor de 18-30 nucleótido) y su complemento inverso, típicamente separado por una secuencia espaciadora. El desdoblamiento o descomposición del espaciador puede proporcionar un fragmento de oligonucleótido de cadena única y su complemento inverso, y estos pueden templar para formar como opcionalmente con pasos de procesamiento adicionales que pueden resultar en la edición o remoción de uno, dos, tres o más nucleótidos desde el extremo 3' y del extremo 5' de cualquiera o ambas cadenas, un polinucleotido ARN de interferencia corta de doble cadena. El espaciador puede ser en una longitud que permita al fragmento en su complemento inverso el templar y formar una estructura de cadena doble (por ejemplo un polinucleotido de orquilla) antes del desdoblamiento del espaciador, y opcionalmente , los pasos de procesamiento subsecuentes que pueden resultar en la edición o remoción de uno, dos, tres, cuatro, ó mas nucleótidos desde el extremo 3' y/o desde el extremo 5' de cualquiera o de ambas cadenas. La secuencia de espaciador puede por tanto ser cualquier secuencia de polinucleotido que esta situado entre dos regiones de secuencia de polinucleotido complementarias las cuales, cuando se templan en un ácido nucleótido de doble cadena, resultan en un polinucleotido ARN de interferencia corta.
Un polinucleotido ARN de interferencia de corta formado puede tener extremos rombos. Opcionalmente, por lo menos una cadena de polinucleotido de ARN de interferencia corta puede tener uno o mas nucleótidos colgando sobre el extremo 3' . Por ejemplo, cada cadena de un dúplex polinucleotido ARN de interferencia corta puede tener dos nucleótidos colgando sobre el extremo 3'. Los dos nucleótidos colgando pueden ser una dinucleotido tiamidina (TT) pero también puede comprender otras bases, por ejemplo, un dinocleotido TC o un dinoclotido TG o cualquier otro dinocleotido . El dinocleotido colgante puede ser también complementario para los dos nucleótidos en el extremo 5' de la secuencia del polinucleotido que es especificado para la interferencia. Para la discusión de los extremos 3' de los polinucleotidos ARN de interferencia corta, vea, por ejemplo, WO 01/75164 de Tuschi y otros, la cual se incorpora aquí por referencia. Una estructura ARN de interferencia corta de doble cadena puede ser formada por una cadena de ARN autocomplementaria única o dos cadenas ARN complementarias .
Un polinucleotido de ARN de interferencia corta puede comprender otro polímeros que ocurren naturalmente, recombinantes o polímeros de cadena única o de cadena doble sintéticos recombinantes de nucleótidos (ribonucleótidos o deoxiribonucleotidos o una combinación de ambos) y/o análogos de nucleótido (por ejemplo un oligonucleótido o un polinucleotido o similar, típicamente, un enlace fosfodiester 5' a 3' ) .
La inhibición es específica de secuencia en que la secuencia de nucleótido que corresponde a la región dúplex del ARN son especificados para la inhibición genética. Por tanto, las secuencias de nucleótido conteniendo ARN de interferencia corta idénticas a una parte del gen de objetivo pueden ser preferidas para la inhibición. Sin embargo las secuencias de ARN de interferencia corta con inserciones, supresiones y mutaciones de punto único en relación a la secuencia de objetivo también pueden ser efectivas para la inhibición y están abarcadas aquí. Por ejemplo, una ARN de interferencia corta puede incluir modificaciones a cualquiera la columna del fosfato y el azúcar o el nucleósido.
Un compuesto de ARN de interferencia corta puede exhibir variabilidad mediante el diferir (por ejemplo mediante sustitución de nucleótidos, incluyendo la transición a la transversión) en un nucleótido, dos, tres o cuatro nucleótidos desde una secuencia particular. Estas diferencias pueden ocurrir en cualquiera de las posiciones de nucleótido el ARN de interferencia corta particulares, dependiendo de la longitud de la molécula, ya sea situada en una cadena de sentido o en una cadena de sentido en contra del polinucleotido de doble cadena. La diferencia de nucleótido puede ser encontrada sobre la cadena de un polinucleotido de doble cadena, en donde el nucleótido complementario con el cual el nucleótido sustituto formará típicamente una base de enlace de hidrógeno emparejada puede no necesariamente ser sustituida correspondientemente .
La identidad de secuencia puede ser utilizada mediante a la alineación de algoritmos conocidos en el arte y calcular la diferencia de por ciento entre las secuencias de nucleótido. Alternativamente, la región dúplex del ARN puede ser definida funcionalmente como una secuencia de nucleótido que es capaz de hibridizar con una parte de la transcripción de gen de objetivo.
Después de la formación, un polinucleotido ARN de interferencia corta puede ser probado respecto de la habilidad para interferir con la expresión de un polipéptido de objetivo de acuerdo a los métodos conocidos en el arte. La determinación de la efectividad de un polinucleotido ARN de interferencia corta incluye no solo la consideración de su habilidad para interferir con la expresión del polipéptido de objetivo, sino también si el polinucleotido ARN de interferencia corta es tóxico al ser una anfitriona. Por ejemplo, el ARN de interferencia corta deseable puede exhibir actividad de interferencia ARN y puede también no exhibir una secuencia biológica no deseada. Un ejemplo de una consecuencia biológica no deseada es la apoptosis de una célula respecto de la cual la muerte de célula no es deseada como resultado de la introducción del ARN de interferencia corta adentro de la célula anfitriona.
Las propiedades del agente de ARN de interferencia corta incluyendo sus propiedades farmacológicas pueden ser influenciadas y confeccionadas, por ejemplo mediante la introducción de ligarlos, por ejemplo, ligarlos, atados o vectores, por ejemplo vectores virales, al agente de ARN de interferencia corta. En adición, las propiedades farmacológicas de un ARN de interferencia corta pueden ser mejoradas mediante el incorporar un ligando en una formulación de un ARN de interferencia corta cuando el agente ARN de interferencia corta tiene un ligando atado.
Una amplia variedad de ligando pueden ser atados a un agente ARN de interferencia corta y puede ser usada como un aditivo o conjugado de formulación por ejemplo al portador de una subunidad de monomero conjugando con ligando. Los ejemplos están inscritos abajo en el contexto de una subunidad de monomero conjugada con ligando pero deberá entenderse que los ligandos pueden ser acoplados en otros puntos a un agente ARN de interferencia corta.
Los ligandos pueden ser acoplados, covalentemente o no covalentemente, ya sea directamente o indirectamente a través de un atado interviniente al portador. Un ligando o un ligando atado puede estar presente sobre un monomero conjugando con ligando cuando el monomero conjugando con ligando es incorporado dentro de una cadena en crecimiento. En una incorporación, un ligando puede ser incorporado en una subunidad de monomero conjugado con ligando "precursoras" después de que una subunidad de monomero conjugado con ligando "precursor" se ha incorporado dentro de la cadena creciente. Por ejemplo, un monomero teniendo un atado terminado amino por ejemplo, TAP- (CH2) 11NH2 pueden ser incorporado dentro de una cadena de sentido o anti-sentido creciente. En una operación subsecuente, por ejemplo después de la incorporación de la subunidad de monomero precursor adentro de la cadena, un ligando teniendo un grupo electrofílico, por ejemplo un grupo de aldehido o éster pentafluorofenilo, puede subsecuentemente ser sujetado a el monomero conjugado con ligando precursor mediante el acoplar el grupo electrofílico de ligando con el grupo nucleofílico terminal del atado de subunidad del monómero conjugando con ligando precursor.
Un ligando puede alterar la distribución, el objetivo tiempo de vida de un agente ARN de interferencia corta adentro del cual este es incorporado. Por ejemplo, un ligando puede proporcionar una afinidad mejorada para un objetivo seleccionado, por ejemplo, una molécula, una célula o un tipo de célula, compartimiento, por ejemplo un compartimento de órgano o celular, un tejido, un órgano o región del cuerpo. Un ligando puede mejorar un transporte, la hibridización, en las propiedades específicas que pueden mejorar también la resistencia nucleasa del oligoribonucleotido modificado natural resultante .
Un ligando puede actuar como un modificador terapéutico, por ejemplo, para mejorar la toma; un compuesto de diagnóstico o un grupo reportero, por ejemplo, para vigilar la distribución; un agente de enlace cruzado; una mitad de concesión de resistencia nucleasa; y/o una nucleobase natural o no usual; entre otros usos. Los ejemplos no limitantes pueden incluir las moléculas lipofílicas, los lípidos, las peptinas, los esteroides (por ejemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina) , terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo, sarsaogenina, Friedelina, ácido litocolico derivado de epifriedalanol) , vitaminas, carbohidratos (por ejemplo un dextran, pululan, quitina, quitosana, polímeros sintéticos (por ejemplo, Oligo Lactato 15-mer) y naturales (por ejemplo, de peso molecular bajo y medio) insulina, ciclodextrina o ácido hialurónico) , proteínas, agentes de unión de proteína, moléculas de objetivo de integrina, policatiónicos , péptidos, poliaminas, e imitadores de péptido. Otros ejemplos incluyen el ácido fólico o los ligandos receptores de célula epitelial tal como la transferina.
Un ligando puede ser una molécula que ocurre naturalmente o recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo un ácido poliamino sintético. Los ejemplos de los ácidos poliamina incluyen polilisina (PLL) , poli L-ácido aspártico, poli L-ácido glutámico, copolímero de anhídrido de ácido maleico-estireno, copolímero de poli(L-ácido-co-glicolido) , copolímero de anhídrido maleico-éter divinilo, copolímero de N- (2-hidroxipropil) metacrilamida (HMPA) , polietileno glicol (PEG) , alcohol de polivinilo (PVA) , poliuretano, poli(2-ácido etilacrílico) , N-polímeros de isopropilacrilamida, o polifosfazina . Los ejemplos de las poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina, (PLL) , espermina, espermidina, poliaminas, seudopéptido-poliamina, poliaminas peptodomimetica, poliaminas de dendrímero, arginina, amidina, protamina, mitades catiónicas, por ejemplo lípido catiónico, porfirina catiónico, sal cuaternaria de una poliaminas o un péptido helicoidal alfa.
Un ligando puede incluir un grupo de objetivo, por ejemplo una célula o un agente de objetivo de tejido, por ejemplo una célula o un agente de objetivo de tejido por ejemplo una tirotropina, me1anotropina, proteína A surfactante, carbohidrato de mocina, un poliamino ácido glicosilatado, transferina, bisfosfonato, poligutanato, poliaspartato, o un péptido Arg-Gly-Asp (RGD) o un imitador de péptido RGD.
Un ligando puede ser una proteína, por ejemplo, glicoproteínas , lipoproteínas, por ejemplo lipoproteínas de baja densidad (LDL) o albúminas, por ejemplo albúmina de suero humano (HSA) , o péptidos, por ejemplo, moléculas teniendo una afinidad específica para un co- ligando, o anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo que aglutina a un tipo de célula especificado tal como una célula de cáncer, una célula endotelial o una célula de hueso. Un ligando puede ser una hormona o un receptor de hormona. Estos pueden también incluir especies no peptídicas, tal como los cofactores, la lactosa multivalente , la galactosa multivalente , la N-acetil-galactosamina, la N-acetil-glocosamina, la mañosa multivalente, o la mucosa multivalente.
Un ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, una droga la cual puede aumentar la toma del agente ARN de interferencia corta adentro de una célula, por ejemplo, mediante el interrumpir el cito esqueleto de la célula, por ejemplo, mediante el interrumpir los micro tubos de célula, los micro filamentos y/o los filamentos intermedios. Un ligando puede ser, por ejemplo taxon, vinicristina, viniblastina, citoquelastina, nocodazole, japlaquinolido, latruculina A, faloidina, swinholido A, indanocina, mioservina, tetraciclina .
Un ligando puede ser un lípido o una molécula a base de lípido que puede aglutinar a una proteína de suero, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA) . Un ligando aglutinante de albúmina de suero humano puede permitir la distribución del conjugado al tejido de objetivo, por ejemplo el tejido de hígado, incluyendo las células paraenzimales del hígado. Otras moléculas que pueden aglutinar a la albúmina de suero humano también pueden ser usadas como ligandos. Por ejemplo, la naproxina o la aspirina pueden ser usadas. Un lípido o un ligando a base de lípido puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el objetivo transporte adentro de la célula de objetivo o la membrana de célula, y/o (c) puede ser usado para ajustar la unión a una proteína de suero, por ejemplo albúmina de suero humano. Un ligando a base de lípido puede ser usado para modular, por ejemplo, controlar el aglutinamiento del conjugado a un tejido de objetivo. Por ejemplo, un lípido o un ligando a base de lípido que aglutina a la albúmina de suero humano más fuertemente será menos factible de ser el objetivo para los ríñones y por tanto menos posible que sea despejada del cuerpo.
Los vectores virales y no virales pueden ser utilizados como vehículos de entrega en la entrega de construcciones ARN de interferencia corta como se conoce en el arte, cualquiera de los cuales puede ser incorporado aquí. Como se usó aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual este enlazado. Un tipo de vector es un plásmido, el cual se refiere a un enlaza ADN de cadena doble circular dentro del cual los segmentos de ácido nucleico adicionales pueden ser ligados. Otro tipo de vector es un vector viral en donde los segmentos de ácido nucleico adicionales pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de una duplicación autónoma en una célula anfitriona dentro de la cual estos se han introducido (por ejemplo, los vectores bacteriales teniendo un origen bacterial de duplicación y vectores de mamífero episomales) . Otros vectores (por ejemplo vectores de mamífero no episomales) son integrados dentro del genoma de una célula anfitriona con la introducción adentro de la célula anfitriona, y por tanto son duplicados junto con el genoma anfitrión. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales estos están enlazados operativamente. Tales vectores son mencionados como vectores de expresión recombinante o más simplemente vectores de expresión. En general, los vectores de expresión de utilidad pueden estar en la forma de plásmidos . En la presente descripción, el plásmido y el vector pueden ser usados intercambiablemente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada del vector, tal como los vectores virales (por ejemplo, los retrovirus es defectuosos de duplicación, los lentiviruses, los adenoviruses y los virases adeno-asociados) los cuales sirven a funciones equivalentes. En una incorporación, los lentiviruses pueden ser usados para entregar una o más moléculas ARN de interferencia corta a una célula, por ejemplo o un macrófago, una celda T, una célula dendrítica, o una célula de vastago hematopoyético .
Los varios componentes de una construcción pueden ser enlazados operablemente unos a otros, de acuerdo a prácticas conocidas. Dentro de un vector "enlazado operablemente" se intenta que signifique que una secuencia de nucleótido de interés esta enlazada a una secuencia o a secuencias reguladoras en una manera la cual permite la expresión de la secuencia de nucleótido (por ejemplo, en una célula de objetivo cuando el vector es introducido dentro de la célula de objetivo). El término "secuencia reguladora", se intenta que incluya promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión, (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Tales secuencias reguladoras están descritas, por ejemplo, en la tecnología de expresión de gel de Goeddel; métodos en simbología 185, prensa académica San Diego California (1990). Las secuencias reguladores incluyen aquellas las cuales dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótido y muchos tipos de ser una anfitriona y aquellas las cuales dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células anfitrionas (por ejemplo las secuencias reguladoras específicas de tejido). Será apreciado por aquellos expertos en el arte que el diseño de vector de expresión puede depender de tales factores como la elección de la célula de objetivo, el nivel de expresión del ARN de interferencia corta deseado y similares.
Una construcción de ARN de interferencia corta puede ser incorporada dentro de un vehículo de entrega, por ejemplo un liposoma, o una nanopartícula o micropartícula . Por ejemplo, un ARN de interferencia corta puede ser encapsulado en un liposoma como se describió en Tecnología de Liposoma, volumen II, incorporación de drogas, proteínas y material genético, trenza CRC. Un ARN de interferencia corta dependiendo de su solubilidad, puede estar presente en ambas la capa acuosa y en la capa tipidica, o en lo que es generalmente llamado una suspensión liposómica. La capa hidrofóbica generalmente pero no exclusivamente, puede incluir los fosfolípidos tal como la lecitina y esfingomelin, los asteroides tal como el colesterol, los surfactantes iónicos tal como diacetilfosfato, estearilamina, o ácido fosfatídico, y/u otros materiales de naturaleza hidrofóbica.
Dependiendo de la secuencia particular utilizada y de la dosis de material ARN de interferencia corta de doble cadena entregado, un ARN de interferencia corta puede proporcionar una pérdida de función parcial o completa para el fin de objetivo. Una reducción o pérdida de la expresión de gen en por lo menos 99% de las células de objetivo es demostrado por ejemplo para los genes de la patente de los Estados Unidos de América No. 6,506,559 de Fire y otros. Dosis más bajas de material entregado y los tiempos más prolongados después de la administración de dicho ARN de interferencia corta seleccionado puede resultar en la inhibición de una fracción más pequeña de células .
Un dispositivo de entrega puede ser usado para entregar el ARN de interferencia corta a un gen para inhibición. Por ejemplo, un gen que es esencial para la replicación de un patógeno, la transmisión de un patógeno, o el mantenimiento de una infección pueden ser inhibidos usando un dispositivo de entrega. Como otro ejemplo, los genes de célula en riesgo para detección por un patógeno o células ya infectadas pueden ser el objetivo. El gen de objetivo puede ser un patógeno o un gen anfitrión responsable por la entrada de un patógeno adentro de su anfitrión, el metabolismo de droga por el patógeno no anfitrión, la duplicación o integración del genoma del patógeno, el establecimiento o extensión de una infección en el anfitrión, o el ensamble de la siguiente generación de patógenos. Los métodos de profilaxis (por ejemplo, la prevención o el riesgo disminuido de infección) así como la reducción en las frecuencias o severidad de los síntomas asociados con la infección, son abarcados. El dispositivo puede ser usado en combinación con otros regímenes de tratamiento, incluyendo los agentes virostáticos y virotóxicos, los agentes antibióticos, los agentes antifungales , los agentes en contra de la inflamación, así como las terapias de combinación, y similares.
Un dispositivo puede ser usado para inhibir la expresión de gen de genes relacionados al cáncer. Por vía de ejemplo, un A de interferencia corta de un dispositivo puede silenciar un gen de un cáncer, incluyendo tumores sólidos y leucemias, incluyendo: apudoma, coristoma, brancloma, síndrome carcinoide maligno, enfermedad del corazón carcinoide, carcinoma (por ejemplo alker, célula basal, basoscuamos, Brown-Pearce , ductual, tumor Ehrilich, en situ, Krebs 2, célula Merkel, micinos, pulmón de célula no pequeño, célula diodeno, papilar, escirus, bronquiolar, broncogénico, célula escamosa, y célula transicional) , los desordenes histiociticos , leucemia (por ejemplo célula B, célula mezclada, célula nula, célula T, célula T crónica, HTLV-II- linfocitico asociado agudo, linfocitico crónico, célula mástil, y mieloide) , histiocitosis maligna, enfermedad de Hodgkin, inmunoproliferativo pequeño, linfoma de no Hodgkin, plasmocitoma, reticulendoteliosis , melanoma, condroblastoma, condroma, condrosarcoma, fribroma, fibrosarcoma, tumores de célula gigante, histiocitoma, lipoma, liposarcoma, mesotelioma, mixoma, mixosarcoma, osteoma, osteosarcoma, sarcoma Ewing, sinovioma, adenofibroma, adenolimforna, carcinosarcoma, cordoma, cranio-faringioma, disgerminoma, hamartoma, mesenquimoma, mesonefroma, miosarcoma, amelobastoma, cementoma, odontoma, teratoma, tirimoma, tumor trofoblastico, adenocarcinoma, adenoma, colangioma, colesteatoma, cilindroma, cistadenocarcinoma, cistadenoma, tumor célula de granuloso, ginandro lastoma, hepatoma, hidradenoma, tumor de célula islet, tumor de célula de Leydig, papiloma, tumor de célula de Sertoli, tumor de célula teca, leiomioma, leiomiosarcoma, mioblastoma, mioma, miosarcoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, ependimoma, ganglioneuroma, glioma, medulbastoma, meningloma, neurilemoma, neuroblastoma, neuroepitelioma, neurofibroma, neuroma, paraganglioma noncroamafina, angioqueratoma, anglolimfoide hiperplasia con eosinofilia, esclerosing angloma, anglomatosis , glomangloma, hemangloendotelioma, hermangioma, hermangiopericitoma, hemangiosarcoma, linfagioma, linfangiomioma, linfangiosarcoma, pinealoma, carcinosarcoma, condrosarcoma, cistosarcoma filodes, fibrosarcoma, hemangiosarcoma, leiomiosarcoma, leucosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, miosarcoma, mixosarcoma, carcinoma ovario, rabdomiosarcoma, sarcoma (por ejemplo, Ewing, experimental, Kaposi y célula master) , neoplasmas (por ejemplo, hueso, seno, sistema digestivo, colorrectal, hígado, pancreático, pituitario, testicular, orbital, cabeza y cuello, sistema nervioso central, acústico, pélvico, tracto respiratorio, y urogenital) neurofibromatosis y displasia cervical, y para el tratamiento de otras condiciones en las cuales las células sean inmortalizado o transformado. El dispositivo puede ser usado en combinación con otras modalidades de tratamiento tal como la quimioterapia, crioterapia, hipertermia, terapia de ion radial, y similares.
Un dispositivo no esta limitado a ningún tipo de gen objetivo o secuencia de nucleótido. Sin embargo, las clases siguientes de genes de objetivo posibles están listadas para propósitos ilustrativos como genes de objetivo: genes de desarrollo (por ejemplo, moléculas de adhesión, inhibidores de ciclin sinasa, miembros de la familia Wnt, miembros de la familia Pax, miembros de la familia hélice alada, miembros de la familia Hox, citosinas/linfosinas y sus receptores, factores de crecimiento/diferenciación y sus receptores neurotransmisores y sus receptores); encógenos (por ejemplo, ABL1, BCL1, BCL2, BCL6 , CBFA2, CBL, CSF1R, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS1, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS , JU , KRAS, LCK, LYN, DM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1 , PML, RET, SRC, TALI, TCL3, y SI) genes supresores de tumor (por ejemplo, APC, BRCA1, BRCA2, MADH4 , MCC, NF1, NF2 , RB1, TP53, y WT1) ; y enzimas (por ejemplo oxidasas y sintasas ACC, desaturasas e hidroxilases ACP, pirofrilases glucosas ADP, ATPases, dehidrogenasas de alcohol, amilasas, amiloglucosidasas, cetalasas, celulasas, sintasas calcona, citinasas, ciclooxigenasas, decarboxilasas , dextrinasas, polimerasas de ARN y ADN, galactosidasas , glucanasas, gluco oxidasas, sintasas de almidón unidas de gránulo, helicasas GTPases, hemicelulosas , integrasas, inulinasas, invertasas, isomerasas, sinasas, lactasas, lipasas, lipoxigenasas , lisozimas, sintasas nopalina, sintasas octapina, pectinesteras , peroxidasas, fosfatasas, fosfolipasas , fosforilasas , fitasas, sintasas reguladoras de crecimiento de plantas, poligalacturonasas , proteinasas y peptidasas, pulanasas, recombinasas , transcriptasas reversas, RUBISCOs, topisomerasas y xilanasas) .
El dispositivo incluye, una adición a la construcciones ARN de interferencia corta, las microagujas sobre las cuales se han fabricado una pluralidad de estructuras nanodimensionadas . Como se utilizó aquí el término "fabricadas", generalmente se refieren a estructuras que se han diseñado específicamente, se ha sometido a ingeniería y/o se ha construido como para salir en una superficie del dispositivo y no se va a igualar con una característica de superficie que es meramente un producto incidental de un proceso de formación del dispositivo. Por tanto, habrá un patrón predeterminado de nanoestructuras sobre la superficie de las microagujas.
Durante el uso el dispositivo, específicamente las estructuras nanodimensionadas sobre la superficie las microagujas, pueden interactuar con el tejido dérmico y los componentes del mismo. Esta interacción puede regular o modular (por ejemplo cambiar la transducción de señal intracelular y/o intercelular asociada con las interacciones de célula/célula la endocitosis, la repuesta inflamatoria y otros. Por ejemplo, a través de la interacción entre la nanotopografía sobre una superficie y las estructuras son materiales biológicas circundantes, el dispositivo puede regular y/o modular el potencial de membrana, las proteínas de membrana y/o las juntas intercelulares (por ejemplo, las juntas apretadas, las juntas de separación y/o demasomas) . Esto puede alertar la entrega transdérmica de las construcciones de ARN de interferencia corta. Además, las construcciones de ARN de interferencia corta pueden ser entregadas a través de la barrera dérmica sin instigar una respuesta de cuerpo extraño o una respuesta inmune .
El dispositivo puede ser construido de una variedad de materiales, incluyendo los metales, la cerámica, los semiconductores, los orgánicos, los polímeros, etc., así como los compuestos de los mismos. Por vía de ejemplo, el acero inoxidable de clase farmacéutica, el titanio, el níquel, el hierro, el oro, el estaño, el cromo, el cobre, las aleaciones de estos u otros metales, silicio, bióxido de silicio y polímeros pueden ser utilizados en la formación de dispositivo. Típicamente, las microagujas del dispositivo son formadas de un material biocompatible que es capaz de llevar un patrón de estructuras nanodimensionadas sobre una superficie. El término "biocompatible" generalmente se refiere a un material que no afecta en forma esencialmente adversa las células o tejidos en el área donde el dispositivo va a ser entregado. También se intenta que los materiales no provoquen ningún efecto no deseable médicamente en forma esencial en cualquier otras áreas del sujeto viviente utilizando un dispositivo. Los materiales biocompatibles pueden ser sintéticos o naturales . Algunos ejemplos de los materiales biocompatibles adecuados, los cuales son también biodegradables , incluyen los polímeros de ácido hidroxi tal como ácido láctico y polilactido de ácido glicólico, poliglicolido, polilactido-co-glicolido, copolímeros con PEG, polianhidridos , poli (orto) estéres , poliuretanos , poli (ácido butírico); poli (ácido valérico) , y poli (láctico-co-caprolactona) . Otros materiales adecuados pueden incluir, sin limitación, el policarbonato, el ácido polimetacrílico, el acetato de etilenovinilo, el politetrafluoroetileno y poliésteres. Los varios componentes de un dispositivo (por ejemplo las microagujas, la base, la parte superior, las áreas de contacto de droga, etc.) pueden no ser porosas o pueden ser porosas de naturaleza, pueden ser homogéneas o pueden ser heterogéneas a través del dispositivo con respecto a los materiales, a la geometría, a la solides y otros y pueden tener una forma fija rígida o una forma casi rígida.
La figura 1 ilustra un dispositivo transdérmico de microagujas típico 10. Como puede verse, el dispositivo incluye un arreglo de agujas individuales 12; cada una esta formada a un tamaño y forma como para penetrar toda una parte de la barrera dérmica sin el rompimiento de las microagujas individuales. Las microagujas pueden ser sólidas como en la figura 1, porosas o pueden incluir una parte hueca. Una microaguja puede incluir una parte hueca, por ejemplo un orificio anular que puede ser extendido a través de toda o una parte de la aguja, que puede extenderse paralelo a la dirección de la aguja o ramificación o salir en el lado de la aguja como se ha apropiado. La figura 2 ilustra un arreglo de microagujas 14 cada una incluyendo un canal 16 y en un lado de la aguja como puede ser utilizado para la entrega de una construcción de ARN de interferencia corta a una ubicación sudérmica. Por ejemplo, un canal 16 puede estar en por lo menos una alineación parcial con una abertura en la base 15 como para formar una junta entre la abertura y el canal 16 permitiendo el paso de una sustancia a través del canal 16.
Las dimensiones del canal 16, cuando está presente, pueden ser específicamente seleccionadas para inducir un flujo capilar de un compuesto de droga. El flujo capilar generalmente ocurre cuando las fuerzas adhesivas de un fluido a las paredes de un canal son mayores que las fuerzas cohesivas entre las moléculas de líquido. Específicamente, la presión capilar es proporcional inversamente a las dimensiones de sección transversal del canal 16 y directamente proporcional a la atención de superficie del líquido, multiplicada por el coseno del ángulo de contacto del fluido en contacto con el material que forma el canal. Por tanto para facilitar el flujo capilar en el parche, la dimensión de sección transversal (por ejemplo, el ancho, el diámetro, etc.) del canal 16 puede ser controlado selectivamente con las dimensiones mas pequeñas generalmente resultando en una presión capilar más alta. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, la dimensión de sección transversal del canal típicamente varía de desde alrededor del micrómetro de alrededor de 100 micrómetros, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 5 micrómetros a alrededor de 50 micrómetros, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 10 micrómetros alrededor de 30 micrómetros. La dimensión puede ser constante o esta puede variar como una función de longitud del canal 16. La longitud del canal puede también variar para acomodar diferentes volúmenes, tasa de flujo, y tiempos de permanencia para el compuesto de droga. Por ejemplo, para la longitud del canal puede ser de desde alrededor de 10 micrómetros a alrededor de 800 micrómetros, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 50 micrómetros a alrededor de 500 micrómetros, y en algunas incorporaciones de desde alrededor de 100 micrómetros a alredor de 300 micrómetros . El área de sección transversal del canal también puede variar. El área de sección transversal puede ser de desde alrededor de 50 micrómetros a alrededor de 1000 micrómetros cuadrados, y en algunas incorporaciones de desde alrededor de 100 micrómetros cuadrados a alrededor de 500 micrómetros cuadrados, y en algunas incorporaciones de desde alrededor de 150 micrómetros cuadrados a alrededor 350 micrómetros cuadrados. Además, la proporción de aspecto (dimensión en sección transversal/longitud) del canal puede variar de desde alrededor de 1 a alrededor de 50, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 5 alrededor de 40,. en algunas incorporaciones de desde alrededor de 10 a alrededor de 20. En los casos en donde la dimensión de sección transversal (por ejemplo, el ancho, diámetro, etc.) y/o la longitud varia como una función de la longitud, la proporción de aspecto puede ser determinada de las dimensiones promedio.
Deberá entenderse que el número de microagujas mostrado en las figuras es para propósitos ilustrativos solamente. El número actual de microagujas usada en un conjunto de microagujas puede, por ejemplo, variar de desde alrededor 500 microagujas a alrededor de 10,000 microagujas, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 2,000 microagujas a alrededor de 8,000 microagujas y en algunas incorporaciones de desde alrededor de 4,000 microagujas a alrededor de 6,000 microaguj as .
Una microaguj individual puede tener un eje recto o uno ahusado. En una incorporación, el diámetro de una microaguj a puede ser más grande que el extremo de base de la microaguj a y ahusar a un punto el extremo distal a la base. Una microaguj a puede también ser fabricada para tener una flecha que incluye ambos una parte recta (no ahusada) y una parte ahusada.
Una microaguj a puede ser formada con un eje que es circular no circular en sección transversal. Por ejemplo, la sección transversal de una aguja puede ser poligonal (por ejemplo en forma de estrella, cuadrada, triangular) oblonga o de cualquier otra forma. La flecha puede ser que tenga 1 o más orificios y/o o canales.
El tamaño de las agujas individuales puede ser optimizado dependiendo de la profundidad de objetivo deseada, los requerimientos de resistencia de la aguja para evitar el rompimiento en una ubicación de entrega particular, etc. Por ejemplo, la dimensión de sección transversal de una microaguja transdérmica puede ser de entre alrededor de 10 nanómetros (nm) y de 1 milímetro (mm) , o de entre alrededor del micrómetro (µp\) y alrededor de 200 micrómetros, o de entre alrededor de 10 micrómetros y alrededor de 100 micrómetros. Y el diámetro interior de una aguja hueca puede ser de entre alrededor de 3 micrómetros y alrededor de 80 micrómetros. La punta típicamente tiene un radio que es menor o igual alrededor a 1 micrómetro. La longitud de una microaguja generalmente dependerá de la aplicación deseada. Por ejemplo, una microaguja puede ser de entre alrededor de 1 micrómetro y alrededor de 1 milímetro y longitud, por ejemplo de alrededor de 500 micrómetros o menos, o dentro de alrededor de 10 micrómetros y alrededor de 500 micrómetros, o dentro de alrededor de 30 micrómetros a alrededor de 200 micrómetros.
Un arreglo de microagujas no necesita incluir microagujas que sean todas idénticas unas a otras. Un arreglo puede incluir una mezcla de microagujas teniendo varias longitudes, varios diámetros exteriores, varios diámetros interiores, varias formas en sección transversal, varias superficies nanoestructuradas , y/o espaciamiento entre las microagujas. Por ejemplo, las microagujas pueden estar espaciadas y separadas en una manera uniforme tal como en una rejilla rectangular cuadrada o en círculos concéntricos. El espaciamiento puede depender de numerosos factores, incluyendo la altura y el ancho de las microagujas así como la cantidad y el tipo de cualquier sustancia que se intenta que sea movida a través de las microagujas. Cuando una variedad de arreglos de microagujas es útil un arreglo particularmente útil de microagujas es un espaciamiento de "punta a punta" entre las microagujas de alrededor de 50 micrómetros o más, en algunas incorporaciones de alrededor de 100 micrómetros a alrededor de 800 micrómetros, y en algunas incorporaciones, de desde alrededor de 200 micrómetros a alrededor de 600 micrómetros.
Refiriéndonos de nuevo a la figura 1, las microagujas pueden ser mantenidas sobre el sustrato 20 (por ejemplo sujetadas a o en forma unitaria con los sustratos) de manera que estas están orientadas perpendiculares a un ángulo del sustrato. En una incorporación, las microagujas pueden ser orientadas perpendiculares al sustrato y puede proporcionarse una densidad más grande de microagujas por área de unidad de sustrato. Sin embargo, un arreglo de microagujas puede incluir una mezcla de orientaciones de microaguja, alturas como materiales u otros parámetros. El sustrato 20 puede ser construido en una hoja de metal tejida flexible, de cerámica, de plástico u otro material. El sustrato 20 puede variar en el grosor para satisfacer las necesidades del dispositivo, tal como de alrededor de 1,000 micrómetros o menos, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 1 micrómetro a alrededor de 500 micrómetros, y en algunas incorporaciones de desde alrededor de 10 micrómetros a alrededor de 200 micrómetros.
El dispositivo puede definir una nanotopografía sobre la superficie de una microaguja en un patrón al azar u organizado. El dispositivo puede adicionalmente definir una nanotopografía sobre la superficie del sustrato desde la cual se extienden las microagujas, aún cuando esto no es un requerimiento. La figura 3 esquemáticamente ilustra los extremos de 2 microagujas representativas 22. Las microagujas 22 definen un orificio central 24 como puede ser usado para la entrega de una construcción de ARN de interferencia corta a través de las microagujas 22. La superficie 25 de las microagujas 22 puede definir la nanotopografía 26. En esta incorporación particular, la nanotopografía 26 define un patrón al azar sobre la superficie 25 de la microaguja 22.
Una microaguja puede incluir una pluralidad de estructuras idénticas formadas en una superficie o puede incluir diferentes estructuras formadas de varios tamaños, formas y combinaciones de los mismos . Un patrón predeterminado de estructuras puede incluir una mezcla de estructuras teniendo varias longitudes, diámetros, formas en sección transversal y/o espaciamiento entre las estructuras. Por ejemplo, las estructuras pueden estar espaciadas y separadas en una manera uniforme, tal como en una rejilla rectangular o en una rejilla cuadrada o en círculos concéntricos. En una incorporación, las estructuras pueden variar con respecto al tamaño y/o a la forma y pueden ser de una nanotopografía compleja. En una incorporación, una nanotopografía compleja puede definir una geometría fractal o una geometría de tipo fractal.
Como se utilizó aquí, el término "fractal", generalmente se refiere a una estructura geométrica o física que tiene una forma fragmentada en todas las escalas de medición entre una escala más grande y una escala más pequeña de manera que ciertas propiedades matemáticas o físicas de la estructura se comportan como si las dimensiones de la estructura fueron mayores que las dimensiones espaciales. Las propiedades matemáticas o físicas de interés pueden incluir, por ejemplo el perímetro de una curva o la tasa de flujo en un medio poroso. La forma geométrica de un fractal puede dividirse en partes, cada una de las cuales definen una auto-similitud. Adicionalmente, un fractal tiene una definición recursiva y tiene una estructura fina de escalas arbitrariamente pequeñas.
Como se utilizó aquí, el término "tipo fractal" generalmente se refiere a una estructura geométrica o física que tiene una o más, pero no todas las características de un fractal. Por ejemplo, una estructura de tipo fractal puede incluir una forma geométrica que incluye partes auto-similares, pero que no incluye una estructura fina a una escala arbitrariamente pequeña. En otro ejemplo, una forma geométrica de tipo fractal o una estructura física puede no disminuir (aumentar) en una escala igualmente entre las repeticiones de escala, como puede un fractal, aún cuando este aumentará o disminuirá entre las repeticiones recursivas de. una forma geométrica del patrón. Un patrón de tipo fractal puede ser tan simple que un fractal. Por ejemplo, este puede ser regular y relativamente más fácil descrito un lenguaje geométrico Euclidiano tradicional, mientras que un fractal no lo puede ser.
Una superficie de microagujas que define una nanotopografía compleja puede incluir estructuras de la misma forma general (por ejemplo pilares) y los pilares pueden estar formados de diferentes escalas de medición (por ejemplo pilares de nanoescala así como pilares de microescala) ; en otra incorporación, una microaguja puede incluir en las estructuras de superficie que varían en ambos en tamaño y la forma de escala o que varían solo en forma mientras que están formadas para la misma escala nanodimensionada . Adicionalmente, las estructuras pueden ser formadas en un arreglo organizado o en una distribución al azar. En general, por lo menos una parte de las estructuras pueden ser nanoestructuras formadas sobre una escala nanodimensionada, por ejemplo definiendo una dimensión en sección transversal de menos de alrededor de 500 nanómetros, por ejemplo de menos de alrededor de 400 nanómetros de menos de alrededor de 250 nanómetros, o de menos de alrededor de 100 nanómetros. La dimensión en sección transversal de las nanoestructuras puede generalmente ser mayor de alrededor de 5 nanómetros, por ejemplo mayor de alrededor de 10 nanómetros, o mayor de alrededor de 20 nanómetros. Por ejemplo las nanoestructuras pueden definir una dimensión en sección transversal de entre alrededor de 5 nanómetros y alrededor de 500 nanómetros, de entre alrededor de 20 nanómetros y alrededor de 400 nanómetros, o de entre alrededor de 100 nanómetros y alrededor de 300 nanómetros. En los casos en donde la dimensión en sección transversal de una nanoestructura varía como una función de la altura de la nanoestructura, la dimensión en sección transversal puede ser determinada, como el promedio entre la base a la punta de las nanoestructuras, o como la dimensión en sección transversal máxima de la estructura, por ejemplo la dimensión en sección transversal en la base de una nanoestructura en forma de cono.
La figura 4 ilustra una incorporación de una nanotopografía compleja como puede ser formada sobre una superficie. Este patrón particular influye un pilar grande central 100 y los pilares circundantes 102, 104 de dimensiones más pequeñas proporcionados en un patrón regular. Como puede verse, este patrón incluye una repetición de pilares, cada uno de los cuales es formado con la misma forma general, pero que varía con respecto a la dimensión horizontal. Este patrón complejo particular es un ejemplo de un patrón de tipo fractal que no incluye la repetición idéntica en escala entre sucesivas repeticiones recursivas. Por ejemplo, cuando los pilares 102 son las primeras nanoestructuras que definen una definición horizontal que es de alrededor de un tercio de aquélla del pilar más grande 100, el cual es una microestructura, los pilares 104 son las segundas nanoestructuras que definen una dimensión horizontal que es de alrededor de una mitad de aquella de los pilares 102.
Un patrón que incluye las nanoestructuras de diferentes tamaños puede incluir estructuras mas grandes teniendo una dimensión en sección transversal formada sobre una escala mas grande, por ejemplo las microestructuras teniendo una dimensión en sección transversal mayor de alrededor de 500 nanómetros en combinación con la nanoestructuras más pequeñas. En una incorporación, las microestructuras de una nanotopografía compleja pueden tener una dimensión en sección transversal de entre alrededor de 500 nanómetros y alrededor de 10 micrómetros, dentro de alrededor de 600 nanómetros y alrededor 1.5 micrómetros, o dentro de alrededor de 650 nanómetros de alrededor de 1.2 micrómetros. Por ejemplo, la nanotopografí compleja de la figura 4 incluye los pilares microdimensionados 100 teniendo una dimensión de sección transversal de alrededor de 1.2 micrómetros.
Cuando un patrón incluye 1 o más microestructuras más grandes, por ejemplo, teniendo una dimensión de sección transversal mayor de 500 nanómetros, determinada ya sea como el promedio de las dimensiones de sección transversal de la estructura o como la dimensión de sección transversal más grande de la estructura, la nanotopografía compleja incluirá también las nanoestructuras , por ejemplo las primeras nanoestructuras, las segundas nanoestructuras de un tamaño y/o formas diferentes, etc. Por ejemplo, los pilares 102 de la nanotopografía compleja de la figura 4 tienen una dimensión en la sección transversal de alrededor 400 nanómetros y los pilares 104 tienen una dimensión en sección transversal de alrededor de 200 nanómetros.
Una nanotopografía puede ser formada de cualquier número de elementos diferentes. Por ejemplo, un patrón de elementos puede incluir dos elementos diferentes, tres elementos diferentes, un ejemplo de la cual se ilustra la figura 4, cuatro elementos diferentes o más. Las proporciones relativas de la recurrencia de cada elemento diferente también pueden variar. En una incorporación, los elementos más pequeños de un patrón estarán presentes en números más grandes que los elementos más grandes. Por ejemplo, en el patrón de la figura 4, hay ocho pilares 104 para cada pilar 102 y hay ocho pilares 102 para el pilar central 100. Al aumentar los elementos en tamaño, puede haber generalmente más pocas recurrencias del elemento en la nanotopografía . Por vía de ejemplo, un primer elemento que es alrededor de 0.5 por ejemplo de entre alrededor de 0.3 y alrededor de 0.7 en la dimensión de sección transversal como un segundo elemento más grande puede ser que éste presente en la topografía por alrededor de cinco veces o más que el segundo elemento. Primer elemento que es aproximadamente de 0.5 o de entre alrededor de 0.15 y alrededor de 0.3 en sección transversal como un segundo elemento más grande puede estar presente en la topografía por alrededor de diez veces o más que el segundo elemento.
El espaciamiento de los elementos individuales también puede variar. Por ejemplo, el espaciamiento de centro a centro de las estructuras individuales puede ser de entre alrededor de 50 nanómetros y alrededor de 1 micrómetro, por ejemplo dentro de alrededor de 100 nanómetros y alrededor de 500 nanómetros. Por ejemplo, el espaciamiento de centro a centro entre las estructuras puede estar sobre una escala nanodimensionada . Por ejemplo, cuando se considera el espaciamiento de las estructuras nanodimensionadas , el espaciamiento de centro a centro de las estructuras puede ser menor de 500 nanómetros. Esto no es un requerimiento de la topografía, sin embargo y las estructuras individuales pueden estar espaciadas y separadas. El espaciamiento de centro a centro de las estructuras puede variar de dependiendo del tamaño de las estructuras. Por ejemplo, la proporción del promedio de la dimensiones en sección transversal de dos estructuras adyacentes al espaciamiento de centro a centro entre estas dos estructuras puede ser entre alrededor de 1:1 (por ejemplo, tocando) y alrededor de 1:4, dentro de alrededor de 1:1.5 y de alrededor de 1:3.5, o de entre alrededor de 1:2 y alrededor de 1:3. Por ejemplo, el espaciamiento de centro a centro puede ser aproximadamente del doble del promedio de las dimensiones en sección transversal de dos estructuras adyacentes. En una incorporación, las dos estructuras adyacentes cada una teniendo una dimensión en sección transversal de alrededor de 200 nanómetros puede tener un espaciamiento de centro a centro de alrededor de 400 nanómetros. Por tanto, la proporción del promedio de los diámetros del espaciamiento de centro a centro en éste caso es de 1:2.
El espaciamiento de estructura puede ser el mismo por ejemplo, de aquí distante o éste puede variar para las estructuras en un patrón. Por ejemplo, las estructuras más pequeñas de un patrón pueden estar espaciadas y separadas por una primera distancia, y el espaciamiento entre estas estructuras más pequeñas y las estructuras más grande del patrón o entre dos estructuras más grandes del patrón pueden ser las mismas o diferentes que esta primera distancia.
Por ejemplo, en el patrón de la figura 4, las estructuras más pequeñas 104 tienen un espaciamiento de centro a centro de alrededor de 200 nanómetros. La distancia entre los pilares más grandes 102 y cada pilar circundante 104 es menor de alrededor, de 100 nanómetros. La distancia entre el pilar más grande 100 y cada pilar circundante 104 también es menor que el espaciamiento de centro a centro entre los pilares más pequeños 104, y alrededor de 100 nanómetros . Desde luego, esto no es un requerimiento, y las estructuras pueden ser aquí distantes unas de otras o cualquier variación en distancias. En una incorporación, las estructuras diferentes pueden estar en contacto unas con otras, por ejemplo arriba unas de otras, como se discutió además abajo o a un lado unas de otras y contacto unas con otras .
Las estructuras de una topografía pueden todas ser formadas a la misma altura, generalmente de entre alrededor de 10 nanómetros y alrededor de 1 micrómetro, pero esto no es un requerimiento, y las estructuras individuales de un patrón pueden variar en tamaño en una, dos ó tres dimensiones. En una incorporación, algunas o todas las estructuras de una topografía pueden tener una altura de menos de alrededor de 20 micrómetros, de menos de alrededor de 10 micrómetros, o de menos de alrededor de 1 micrómetro, por ejemplo de menos de alrededor de 750 nanómetros, de menos de alrededor de 680 nanómetros, teniendo alrededor de 500 nanómetros. Por ejemplo, las estructuras pueden tener una altura de entre alrededor de 50 nanómetros y alrededor de 20 micrómetros o dentro de alrededor de 100 nanómetros de alrededor de 700 nanómetros. Por ejemplo, las nanoestructuras o las microestructuras pueden tener una altura de entre alrededor de 20 nanómetros y alrededor de 500 nanómetros, de entre alrededor de 30 nanómetros y alrededor de 300 nanómetros, o dentro de alrededor de 100 nanómetros y alrededor de 200 nanómetros, aún cuando deberá entenderse que las estructuras pueden ser nanodimensionadas en la dimensión en sección transversal y pueden tener una altura que puede ser medida sobre una escala microdimensionada, por ejemplo mayor de alrededor de 500 nanómetros. Las estructuras microdimensionadas pueden tener una altura que es la misma o diferente de las estructuras nanodimensionadas del mismo patrón. Por ejemplo las estructuras microdimensionadas pueden tener una altura de entre alrededor de 500 nanómetros y alrededor de 20 micrómetros o dentro de alrededor de 1 micrómetro y alrededor de 10 micrómetros, en otra incorporación. Las estructuras microdimensionadas también pueden tener una dimensión en sección transversal sobre una microescala mayor de alrededor de 500 nanómetros, y pueden tener una altura que es a una escala nanodimensionada de menos de alrededor de 500 nanómetros.
La proporción de aspecto de las estructuras (la proporción de la altura de una estructura a la dimensión de sección transversal de la estructura) puede ser de entre alrededor de 0.15 y alrededor de 30, de entre alrededor de 0.2 y alrededor de 5 de entre alrededor de 0.5 y alrededor de 3.5, o dentro de alrededor de 1 y alrededor de 2.5. Por ejemplo, las nanoestructuras pueden tener una proporción de aspecto que cae dentro de cualquiera de estos rangos.
La superficie del dispositivo puede incluir una un caso único de un patrón, como se mostró en la figura 4, o puede incluir múltiples repeticiones de los mismos patrones o de patrones diferentes. Por ejemplo la figura 5 ilustra un patrón de superficie que incluye un patrón de la figura 4 en repeticiones múltiples o de una superficie.
La formación de la nanotopografia sobre una superficie de microaguja puede aumentar el área de superficie de la microaguja en un aumento correspondiente en el volumen. El aumento en la proporción de área de superficie o volumen se cree que mejora la interacción de la superficie de microaguja con los materiales biológicos circundantes. Por ejemplo, el aumento en la proporción de la superficie o volumen se cree que alienta la interacción mecánica entre la nanotopografía y las proteínas circundantes, por ejemplo las proteínas de matriz extracelular (ECM) y/o las proteínas de membrana de plasma. Como se utilizó aquí, el término "proteínas", se refiere generalmente a una cadena molecular de aminoácidos que es capaz de interactuar estructuralmente, enzimáticamente o de otra manera con otras proteínas, polipéptidos o cualquier otra molécula orgánica o inorgánica.
En general, la proporción del área de superficie o volumen de una superficie con nanopatrón puede ser mayor de alrededor de 10,000 era-1 o mayor de alrededor de 150,000 cm-1 o mayor de alrededor de 750,000 cm-1 . La determinación de la proporción del área de superficie volumen puede llevarse a cabo de acuerdo a cualquier metodología estándar como se conoce en el arte. Por ejemplo, el área de superficie especifica de una superficie puede ser obtenida por el método de adsorción legal físico (método de B.E.T.) con nitrógeno como el gas de adsorción, como se conoce generalmente en el arte y se describe por Brunauer, Emmet, y Teller (diario de la Sociedad Química Americana, Volumen 60, Febrero de 1938, página 309-319) incorporado aquí por referencia. El área de superficie BET puede ser de menos de alrededor de 5 metros cuadrados por gramo en una incorporación, por ejemplo de entre alrededor de 0.1 metros cuadrados por gramo y alrededor de 4.5 metros cuadrados por gramo, o dentro de alrededor de 0.5 metros cuadrados por gramo y alrededor de 3.5 metros cuadrados por gramo. Los valores para el área de superficie volumen también pueden ser estimados de la geometría de los moldes usados para formar una superficie de acuerdo a los cálculos geométricos estándar. Por ejemplo, el volumen puede ser estimado de acuerdo al volumen calculado para cada elemento de patrón y el número total de elementos de patrón en un área dada, por ejemplo sobre la superficie de una microagu a única.
Para un dispositivo que define una nanotopografía con patrón de tipo fractal o fractal en una superficie, la nanotopografía puede ser caracterizada a través de la determinación de la dimensión fractal del patrón. La dimensión fractal es estadísticamente la cantidad que da a una invitación de cómo aparece completamente un fractal para llenar espacio al continuar las repeticiones recursivas a una escala más pequeña y más pequeña. La dimensión fractal de la estructura de dos dimensiones puede ser representada como: log N(e) D= log (e) En donde N(e)es el número de estructuras auto-similares necesarias para cubrir el objeto completo cuando el objeto es reducido por 1/e en cada dirección espacial.
Por ejemplo, cuando se consideran la 2 dimensión fractal conocida como el triángulo Sierpenski ilustrado en la figura 6( en el cual las partes medias de los tres lados de un triángulo equilátero están conectadas y el triángulo interior resultante es removido, la dimensión fractal es calculada como sigue : log N(e) D=- log (e) log3 Log2 D*1.585 Por tanto, el fractal de triángulo Sierpenski exhibe un aumento en la longitud sobre el triángulo equilátero de 2 dimensiones inicial. Adicionalmente , este aumento en la longitud de línea no se acompaña por un aumento correspondiente en el área. La dimensión fractal del patrón ilustrados en la figura 4 es de aproximadamente de 1.84. En una incorporación, la nanotografía de una superficie del dispositivo puede exhibir una dimensión fractal de más de alrededor de 1, por ejemplo dentro de alrededor de 1.2 y alrededor de 5, dentro de alrededor de 1.5 y alrededor de 3 , o dentro de alrededor 1.5 y alrededor de 2.5.
La figura 7A y la figura 7B ilustran imágenes de amplificación en aumento de otro ejemplo de una nanotopografía compleja. La nanotopografía de la figura 7A y la figura 7B incluye un arreglo de pilares de tipo fibroso 70 localizados sobre un sustrato. En el extremo distal de cada pilar individual, el pilar se divide en múltiples fibras más pequeñas 60. En el extremo distal de cada una de estas fibras más pequeñas 60, cada fibra se divide de nuevo en múltiples filamentos (no visibles en la figura 7A y en la figura 7B) las estructuras formadas sobre una superficie que tiene una proporción de aspecto mayor de alrededor de 1 pueden ser flexibles, como lo son las estructuras ilustradas en la figura 7A y en la figura 7B o pueden ser rígidas.
La figura 7C y la figura 7D ilustran otro ejemplo de una nanotopografía compleja. En esta incorporación, una pluralidad de pilares 72 cada una incluyendo un hueco anular a través de los mismos 71 son formados sobre un sustrato. En el extremo distal de cada pilar hueco, es formada una pluralidad de pilares más pequeños 62. Como puede verse, los pilares de la figura 7C y de la figura 7D mantienen su rigidez y su orientación vertical. Adicionalmente , en contraste a los patrones previos, los pilares más pequeños 62 de esta incorporación difieren en la forma de los pilares más grandes 72. Específicamente, los pilares más pequeños 62 no son huecos, sino que son sólidos. Por tanto, la nanotopografía incluyendo las estructuras formadas a una escala diferente no requieren tener todas las estructuras formadas con la misma forma, las estructuras pueden variar en ambos el tamaño y la forma de las estructuras de una escala diferente.
La figura 8 ilustra otro patrón incluyendo las estructuras nanodimensionadas como pueden ser formadas sobre una superficie de microaguja. Como puede verse, en esta incorporación, las estructuras de patrón individuales pueden ser formadas al mismo tamaño general, pero con orientaciones diferentes y formas diferentes unas de otras.
En adición a o en forma alterna al examen de la proporción del área de superficie volumen y/o dimensión fractal, las microagujas de los dispositivos de entrega ARN de interferencia corta pueden ser caracterizadas por otros métodos incluyendo sin limitación, aspereza de superficie, módulo elástico y energía de superficie.
Los métodos para determinar la aspereza de superficie son generalmente conocidos en el arte. Por ejemplo un proceso de microscopio de fuerza atómica el modo de contacto o de no contacto pueden ser utilizados de acuerdo a la práctica estándar para determinar la aspereza de superficie de un material. La aspereza de superficie que puede ser utilizada para caracterizar una microaguja puede incluir la aspereza promedio (RA) , la aspereza de raíz media cuadrada, el sesgado y/o la curtosis. En general, la aspereza de superficie promedio (por ejemplo la altura media aritmética de la superficie es el parámetro de aspereza como se definió en la serie ISO 25178) de una superficie que define una nanotopografía fabricada sobre la misma puede ser de menos de alrededor de 200 nanómetros, de menos de alrededor de 180 nanómetros, de menos de alrededor 100 nanómetros, o de menos de alrededor de 50 nanómetros. Por ejemplo, la aspereza de superficie promedio puede ser de entre alrededor de 10 nanómetros y alrededor de 200 nanómetros, o dentro de alrededor de 50 nanómetros y alrededor de 190 nanómetros .
La superficie de microagujas puede ser caracterizada por el módulo elástico de la superficie, por ejemplo por el cambio en módulo elástico con la adición de una nanotopografía a la superficie. En general, la adición de una pluralidad de estructuras que forman la nanotopografía sobre la superficie de microagujas puede disminuir el módulo elástico de un material, ya que la adición de las estructuras nanodimensionales sobre la superficie llevará una reducción en la continuidad de la superficie y a un cambio relacionado en el área de superficie. Como se comparó a una microaguja similar formada de acuerdo al mismo proceso y de los mismos materiales, pero para el patrón de nanotopografía sobre la superficie, una microaguja incluyendo la nanotopografía sobre la misma puede exhibir una disminución en el módulo elástico dentro de alrededor de 35% y alrededor de 99%, por ejemplo dentro de alrededor de 50% y alrededor de 99%, o dentro de alrededor de 75% y alrededor de 80%. Por vía de ejemplo, el módulo de comprensión efectiva de una superficie con nanopatrón puede ser de menos de alrededor de 50 megapascales o de menos de alrededor de 20 megapascales. En una incorporación el módulo de compresión efectivo puede ser de entre 0.2 megapascales y alrededor de 50 megapascales, de entre alrededor de 5 megapascales y alrededor de 35 megapascales, o dentro de alrededor de 10 megapascales y alrededor de 20 megapascales. El módulo de corte efectivo puede ser de menos de alrededor 320 megapascales o de menos de 220 megapascales. Por ejemplo el módulo de corte efectivo puede ser de entre alrededor de 4 megapascales y alrededor de 320 megapascales o dentro de alrededor de 50 megapascales y alrededor de 250 megapascales en una incorporación.
Una raicroaguja incluyendo una nanotopografía sobre la misma también puede exhibir un aumento en la energía de superficie en comparación de una microaguja similar que no tiene el patrón de nanotopografía sobre el mismo. Por ejemplo, la microaguja incluyendo una nanotopografía formada sobre la misma puede exhibir un aumento en la energía de superficie en comparación a una microaguja similar de los mismos materiales y formados de acuerdo a los mismos métodos, salvo por la inclusión del patrón de nanotopografía sobre la superficie. Por ejemplo, el ángulo de contacto de agua de una superficie incluyendo una nanotopografía sobre la misma puede ser mayor de alrededor de 80 grados, mayor de alrededor de 90 grados, mayor de alrededor de 100 grados, o mayor de alrededor de 110 grados. Por ejemplo, el ángulo de contacto de agua de una superficie puede ser de entre alrededor de 80 grados de alrededor de 150 grados, de entre alrededor de 90 grados y alrededor de 130 grados, o dentro de alrededor de 100 grados y alrededor de 120 grados, en una incorporación.
Cuando se forman nanoestructuras sobre la superficie el dispositivo, la densidad del empaque de las estructuras puede ser maximizada. Por ejemplo, el empaque cuadrado (figura 9A) el empaque hexagonal (figura 9B) o alguna variación del mismo puede ser utilizada para dar el patrón a los elementos sobre la microaguja. Cuando se diseña un patrón en el cual varios elementos dimensionados en áreas de sección transversal A, B y C están adyacentes unos a otros sobre la microaguja, el empaque de círculo como es indicado en la figura 9C puede ser utilizado. Desde luego, las variaciones en la densidad de empaque y la determinación de las alteraciones asociadas en las características de la superficie están bien dentro de las capacidades de uno con habilidad en el arte.
Las microagujas incluyendo una nanotopografía fabricada sobre la superficie de las microagujas pueden ser formadas de acuerdo o a un proceso de pasa único, por ejemplo las microagujas son formadas con las nanoestructuras sobre la superficie en un momento de la formación. Alternativamente, un proceso de pasos múltiples puede ser usado, en el cual un patrón de nanoestructuras son fabricadas sobre una microaguja preformada. Por ejemplo, un arreglo de microagujas puede ser primero formado y después un patrón al azar o un patrón no al azar de nanoestructuras puede ser fabricado sobre la superficie de las microagujas formadas. En cualquiera el proceso de paso único o el proceso de dos pasos las estructuras nanodimensionadas pueden ser fabricadas sobre la superficie de una microaguja o sobre una superficie de molde de acuerdo a cualquier método de fabricación de nanotopografía adecuado incluyendo, sin limitación, la nanoimpresión, el moldeado por inyección, la litografía, el moldeado grabado y otros.
Un arreglo de microagujas puede ser formado de acuerdo a cualquier técnica de microfabricación estándar incluyendo, sin limitación, la litografía; las técnicas de decapado, tal como químico húmedo, seco y remoción de fotoresistencia; la oxidación térmica de silicio, el electro recubrimiento y recubrimiento electrolítico; el proceso de difusión, tal como de boro, de fósforo, de arsénico y la difusión de antimonio; la implantación de ión, el depósito de película tal como la evaporación (filamento, rayo electrónico, centelleo, y sombreado y paso de coberturas) , chisporroteo, depósito de vapor químico (CVD) , epitaxia (fase de vapor, fase líquida y rayo molecular) , electrorecubrimiento, impresión de rejilla, y laminación; estereolitografía; máquina de láser; y ablación láser (incluyendo la ablación de proyección) .
Un proceso de decapado electroquímico puede ser utilizado en el cual el decapado electroquímico de silicio sólido a silicio poroso es usado para crear redes de silicio extremadamente finas (sobre el orden de 0.01 micrómetros) que pueden ser usadas como estructuras de perforación. Este método puede usar anodización electrolítica de silicio en un ácido hidrofluórico acuoso, potencialmente en combinación con la luz, para recapar canales dentro del silicio. Mediante el variar la concentración de drogado de dicha oblea de silicio que va a ser decapada, el potencial electrolítico durante el decapado, la intensidad de los incidentes y la concentración de electrolito, el control sobre la estructura de poro final puede ser lograda. El material no decapado (por ejemplo el silicio restante) forma las microagujas.
El decapado de plasma también puede ser utilizado, en el cual el decapado de plasma profundo de silicio se lleva a cabo para crear las microagujas con los diámetros sobre el orden de 0.01 micrómetros o más grandes. Las agujas pueden ser fabricadas indirectamente mediante el controlar el voltaje (como en el decapado electroquímico) .
Las técnicas de litografía, incluyendo la fotolitografía, la litografía de rayo-e, la litografía de rayo-EX, y otras pueden ser utilizadas para la definición de patrón primario de una matriz maestra. La duplicación puede entonces llevarse a cabo para formar un dispositivo incluyendo un arreglo de microagujas. Los métodos de duplicación común incluyen, sin limitación el micromoldeado ayudado con solvente y el fraguado, el moldeado con grabado, el moldeado con inyección y otros. Las tecnologías de autoensamble incluyendo el copolímero de bloque separado de fase, las técnicas de desmezclado de polímero y de litografía coloidal pueden ser utilizadas en la formación de una nanotopografía sobre una superficie .
Las combinaciones de los métodos pueden ser usadas como se conocen. Por ejemplo, los sustratos con patrón con coloides pueden ser expuestos a un decapado de ión reactivo (RIE, también conocido como decapado seco) como para refinar las características de una nanoestructura fabricada tal como de diámetro nanopilar, de perfil, de altura, de inclinación y otros . El decapado húmedo también puede ser empleado para producir perfiles alternos para nanoestructuras fabricadas inicialmente formadas de acuerdo a un proceso diferente, por ejemplo las técnicas de desmezclado de polímero.
El diámetro de estructura, la forma y la inclinación pueden ser controlados a través de la selección de los materiales y métodos apropiados. Por ejemplo, el decapado de metales inicialmente evaporados sobre un sustrato con patrón coloidal seguido por el levantamiento coloidal generalmente resulta en pilares en forma de prisma. Un proceso de decapado puede entonces ser utilizado para completar las estructuras como se desee. Las nanoestructuras poliméricas ordenadas también pueden ser fabricadas a través de las técnicas de sinterización controlada con temperatura, las cuales forman la variedad de características nanométricas trigonales en los intersticios coloidales seguido por la disolución selectiva de la nanopartículas poliméricas. Estos y otros procesos de formación adecuados son generalmente conocidos en el arte (vea por ejemplo Wood, Interfase de la Sociedad Real 2007, Febrero 22; 4(12): 1-17, incorporado aquí por referencia).
Otros métodos como pueden ser utilizados en la formación de una microaguja incluyendo una nanotopografía fabricada sobre una superficie incluyen los métodos de litografía nanoimpresa utilizando las técnicas del maquinado láser de ultra alta precisión, cuyos ejemplos se han descrito por Hunt y otros (Patente de los Estados Unidos de América No. 6,995,336) y Guo y otros (Patente de los Estados Unidos de América No. 7,374,864) ambos de las cuales son incorporadas aquí por referencia. La litografía nanoimpresa es una técnica de litografía a nanoescala la cual un molde híbrido es tilizado el cual actúa como ambos un molde de litografía nanoimpresa y una máscara de fotolitografía. Un esquema de una técnica de litografía nanoimpresa está ilustrado en las figuras 10A-10C. Durante la fabricación, un molde híbrido 30 imprime sobre un sustrato 32 a través de la presión aplicada para formar características (por ejemplo las microagujas definiendo nanotopografías) sobre una capa de resistencia (figura 10A) . En general, la superficie del sustrato 32 puede ser calentada antes del contacto con el molde 30 a una temperatura arriba de su temperatura de transición del vidrio (Tg) . Mientras el molde híbrido 30 esta en contacto con el sustrato 32, un flujo de polímero . viscoso puede ser forzado dentro de las cavidades de molde para formar las características 34 (figura 10B) . El molde y el sustrato pueden entonces ser expresados a luz ultravioleta. El molde híbrido es generalmente transmisivo de la radiación ultravioleta salvo por ciertas áreas obstruidas. Por tanto, la radiación ultravioleta pasa a través de las partes transmisivas de adentro de la capa de resistencia. La presión es mantenida durante el. enfriamiento del molde y el sustrato. El molde híbrido 30 es entonces removido del sustrato enfriado 32 a una temperatura debajo de la temperatura de transmisión del vidrio del sustrato y del polímero (figura 10C) .
Para facilitar la liberación del sustrato nanoimpreso 32 incluyendo las características fabricadas 34 desde el molde 30 como se mostró en la figura 10A, es ventajoso el tratar el molde 30 con un recubrimiento de energía bajo para reducir la adhesión con el sustrato 32, ya que la energía de superficie más baja del molde 30 y la diferencia de energía de superficie mayor resultante entre el molde 30, el sustrato 32 y el polímero puede facilitar la liberación entre los materiales. Por vía de ejemplo, un recubrimiento de molde de silicio puede ser usado tal como trideca- (1, 2, 2, 2-tetrahidro) -octitricloro silano (F13-TCS) .
Un proceso de nanoimpresión es uno dinámico el cual incluye el llenado de un molde seguido por el desprendimiento de un polímero formado desde el molde. Para llenar las características de molde, en la temperatura del polímero debe de ser elevada a un nivel alto suficiente para iniciar el flujo bajo la presión aplicada. Entre más alta la temperatura, más baja la viscosidad del polímero, y más rápido y más fácil se llenará el molde. Una presión asalta también mejorará la tasa de llenado y el llenado general para una mejor duplicación de molde.
Para liberar los sustratos nanoimpresos desde el molde, la temperatura del sustrato puede ser bajada a un punto en donde la resistencia al rendimiento excede las fuerzas de adhesión ejercidas por el molde. Mediante el variar la temperatura es posible el llevar las características de polímero durante el desprendimiento para obtener diferentes estructuras, por ejemplo estructuras como se ilustró en la figura 8.
Las nanoestructuras también pueden ser formadas sobre la microaguja de acuerdo a los procesos de adición química. Por ejemplo, el depósito de película, el chisporroteo el depósito de vapor químico (CVD) , la epitaxia (fase de vapor, la fase líquida y el radio molecular) el electrorecubrimiento, y otros pueden ser utilizados para construir las estructuras sobre una superficie.
Los procesos de monocapa autoensamblada, como son conocidas en el arte pueden ser utilizados para formar las estructuras sobre la superficie de microaguja. Por ejemplo, la capacidad de los copolímeros de bloque para autoorganizarse puede ser usada para formar un patrón de monocapa sobre la superficie. El patrón puede entonces ser usado como una plantilla para el crecimiento o cultivo de las estructuras deseadas, por ejemplo coloides, de acuerdo al patrón de la monocapa. Por vía de ejemplo una red de polímero enlazado en forma cruzada en forma de dos dimensiones puede ser producida de monómeros con dos o más sitios reactivos. Tales monocapas enlazadas en forma cruzada se han hecho usando una monocapa de autoemsable (SAM) (por ejemplo el sistema de oro/alquiltiol) unas técnicas de monocapa Langmuir-Blodgett (LB) (Ahmed y otros, películas sólidas delgadas 187:141-153 (1990) como se conoce en el arte. La monocapa puede ser enlazada en forma cruzada lo cual lleva la formación de una monocapa estructuralmente más robusta.
Los monómeros usados para formar la monocapa con patrón pueden incorporar todas la mitades estructurales necesarias para afectar la técnica de polimerización deseada y/o la técnica de formación de capa, así como para influenciar tales propiedades como la solubilidad general, los métodos de dicha asociación y los métodos litográficos. Un monómero puede contener por lo menos un grupo o más frecuentemente por lo menos dos grupos funcionales reactivos.
Una molécula usada para formar una monocapa orgánica puede incluir cualquiera de una variedad de grupos funcionales orgánicos intercalados con cadenas de grupos de metileno. Por ejemplo una molécula puede ser una estructura de carbón de cadena larga conteniendo cadenas de metileno para facilitar el empaque. El empaque entre los grupos de metileno puede permitir que ocurra la unión Van der Waals débil, mejorando la estabilidad de la monocapa producida y contraatacando las penalidades entrópicas asociadas con la formación de una fase ordenada. En adición, las diferentes mitades terminales, tal como las mitades de unión de hidrógeno, pueden estar presentes en un término de las moléculas, a fin de permitir el crecimiento de estructuras sobre la monocapa formada, en cuyo caso las mitades químicas polimerizables pueden ser colocadas en la mitad de la cadena o en el término opuesto. Cualquier química de reconocimiento molecular puede ser usada en la formación del conjunto. Por ejemplo, las estructuras pueden ser ensambladas sobre una monocapa con base en la interacción electrostática, la interacción Van Van der Waals, la quelación de metal, la unión de coordinación (por ejemplo, las interacciones de base/ácido Lewis) , la unión iónica, la unión covalente o la unión de hidrógeno .
Cuando se utiliza un sistema base de monocapa autoensamblada, una molécula adicional puede ser utilizada para formar la plantilla. Esta molécula adicional puede tener una funcionalidad apropiada en uno de sus términos a fin de formar una monocapa autoensamblada. Por ejemplo, sobre una superficie de oro, un tiol terminal puede ser incluido. Hay una amplia variedad de moléculas orgánicas que pueden ser empleadas para efectuar la duplicación. Las mitades topoquímicamente polimerizables, tal como los dienos y los diacetilenos, son particularmente deseables como los componentes polimerizantes . Estos pueden ser interpuestos con varias longitudes de enlazadores de metileno.
Para una monocapa Langmuir-Blodgett , solo una molécula de monómero es necesaria debido a que la mitad de reconocimiento molecular también puede servir como el grupo funcional polar para los propósitos de la formación Langmuir-Blodgett. La litografía puede llevarse a cabo sobre una monocapa Langmuir-Blodgett transferida a un sustrato o directamente en la artesa. Por ejemplo, una monocapa Langmuir-Blodgett de monómeros de diacetileno puede ser formada con patrón mediante exposición ultravioleta a través de una máscara o mediante formación de patrón de rayo electrónico.
La formación de monocapa puede ser facilitada mediante el utilizar las moléculas que sufren una polimerización topoquímica en la fase de monocapa. Mediante el exponer la película de ensamble a un catalizador de polimerización, la película puede ser cultivada en el lugar y cambiada de un conjunto molecular dinámico a un conjunto polimerizado más robusto.
Cualquiera de las técnicas conocidas en el arte para la formación de patrón de monocapa puede ser usada. Las técnicas útiles la formación de patrón de la monocapa incluye, pero no se limita a la fotolitografía, a las técnicas de rayo-e, a las técnicas de rayo-ión enfocado y litografía suave. Varios esquemas de protección tal como fotoresistencia pueden ser usados para un sistema base de monocapa autoensamblada . En forma similar, los patrones de copolímero de bloque pueden ser formados sobre oro y selectivamente decapados para formar los patrones. Para un sistema de dos componentes, la formación con patrón también puede ser lograda con técnicas fácilmente disponibles.
Las técnicas de litografía suave pueden ser utilizadas para formar el patrón en la monocapa en el cual la luz ultravioleta y la máscara pueden ser usadas para la formación del patrón. Por ejemplo, una monocapa de base sin patrón puede ser usada como una plataforma para el ensamble de una monocapa de monómero de reactivo de rayo particular/ultravioleta. La monocapa de monómero puede entonces ser formada con patrón mediante fotolitografía ultravioleta, litografía de rayo electrónico o litografía de rayo ión, aún cuando la monocapa fue ensamblada de base no tenga un patrón.
El crecimiento de las estructuras sobre la monocapa con patrón puede ser logrado por varios mecanismos de crecimiento, tal como a través de una química de reducción apropiada de una sal de metal y el uso de semilla o de nucleación mediada con plantilla. Usando los elementos de reconocimiento sobre la monocapa, el crecimiento inorgánico puede ser catalizado en esta interfase por una variedad de métodos. Por ejemplo pueden ser formados los compuestos inorgánicos en la forma de coloides llevando la forma de la monocapa orgánica con patrón. Por ejemplo las estructuras de carbonato de calcio de sílice pueden ser templadas por varias funcionalidades de carbonilo tal como ácido carboxílico y amidas. Mediante el controlar las condiciones de crecimiento cristal, como es posible el controlar el grosor y la morfología cristal del crecimiento mineral. El dióxido de titanio también puede ser templado.
Las técnicas de recubrimiento electrolítico templadas pueden ser usadas para sintetizar metales usando los grupos funcionales orgánicos existentes. En particular, mediante el quelatar los átomos de metal a las mitades carbonilo del patrón orgánico, el depósito de metal electrolítico puede ser catalizado sobre el patrón, formando coloide.s metálicos con patrón. Por ejemplo, Cu, Au, Ni, Ag, Pd, Pt y muchos otros metales doblables mediante condiciones de recubrimiento electrolítico pueden ser usados para formar las estructuras de metal en la forma de la monocapa orgánica. Mediante el controlar las condiciones de recubrimiento electrolítico, es posible el controlar el grosor de las estructuras de metal recubiertas.
Otros métodos de crecimiento de tipo "fondo-parte superior" son conocidos en el arte y pueden ser utilizados, por ejemplo un método como se describe en la patente de los Estados Unidos de América No. 7,189,435 otorgada a Tuominen y otros, la cual se incorpora aquí con referencia pueden ser utilizados. De acuerdo a éste método, un sustrato conductor o casi conductor (un metal tal como el oro) puede ser recubierto con una película de copolímero de bloque (por ejemplo un copolímero de bloque de metilmetacrilato y estireno) en donde un componente del copolímero forma cilindros nanoscópicos en una matriz de otra componente del copolímero. Una capa conductora puede entonces ser colocada sobre la parte superior del copolímero para formar una estructura compuesta. Con la orientación vertical de la estructura compuesta algo del primer componente puede ser removido, por ejemplo mediante exposición a la radiación ultravioleta, al rayo electrónico, al ozono o la degradación o similar para formar poros nanoscópicos en esa región del segundo componente. En otra incorporación, descrita en la patente de los Estados Unidos de América No. 6,926,953 otorgada a Nealey y otros, incorporada aquí por referencia, las estructuras de copolímero pueden ser formadas mediante el exponer un sustrato con una capa de formación de imagen sobre el mismo, por ejemplo un alquilsiloxano o una monocapa autoensamblada en octadeciltriclorosilano, a dos o más rayos de longitudes de ondas seleccionadas para formar los patrones de interferencia en la capa de formación de imagen para cambiar la humectabilidad de la capa de formación de imagen de acuerdo con los patrones de interferencia. Una capa de un copolímero de bloque seleccionado, por ejemplo un copolímero de poliestireno y de poli (metil metacrilato) puede entonces ser depositada sobre la capa de formación de imagen expuesta y templada para separar los componentes del copolímero de acuerdo con el patrón de humectabilidad y para duplicar el patrón de la capa de formación de imagen en la capa de copolímero. Las tiras o regiones aisladas de los componentes separados pueden por tanto ser formadas con dimensiones periódicas en el rango de 100 nanómetros o menos.
La superficie de microaguja puede incluir una distribución al azar de nanoestructuras fabricadas. Opcionalmente, la superficie de microagujas puede incluir materiales adicionales, en conjunción con las nanoestructuras fabricadas. Por ejemplo, la microaguja puede tener fabricado sobre la misma una capa fibrosa electrohilada y un patrón al azar o un patrón no al azar las nanoestructuras pueden ser fabricadas sobre la capa electrohilada.
El electrogirado incluye el uso de un proveedor de voltaje alto para aplicar un campo eléctrico a un derretido de polímero o solución mantenida en un tubo capilar, induciendo una carga sobre las moléculas de polímero individual. Con la aplicación del campo eléctrico, una carga y/o una orientación bipolar será inducida en la interfase de aire- superficie . La inducción provoca una fuerza que se opone a la tensión de superficie. A la resistencia de campo crítico, las fuerzas electrostáticas superarán las fuerzas de tensión de superficie, y un chorro de material de polímeros será expulsado desde el tubo capilar hacia una superficie a tierra conductora. Un chorro es alargado y acelerado por el campo eléctrico externo al dejar el tubo capilar. Al desplazarse el chorro en el aire, algo del solvente puede ser evaporado, dejando atrás de fibras de polímero cargadas las cuales pueden ser recolectadas sobre la superficie. Al ser recolectadas las fibras, las fibras individuales y aún mojadas pueden adherirse unas a otras, formando una tela no tejida sobre la superficie. Un patrón de nanoestructuras puede entonces ser fabricado sobre la superficie de electrohilado, por ejemplo a través de una técnica de grabado utilizando un molde que define las nanoestructuras deseadas. La aplicación del molde a la superficie de microaguja a una temperatura y presión adecuadas puede transferir el patrón a la superficie de microaguja. Una superficie de fibras nanodimensionadas electrohiladas al azar puede además mejorar las características deseables de una superficie de microagujas, por ejemplo, una o más de la proporción diaria de superficie volumen, aspereza de superficie, energía de superficie y otros y puede proporcionar beneficios asociados.
En adición a las nanopartículas , la superficie de microaguja puede ser químicamente funcionalizada para mejorar la interacción con los tejidos o células individuales. Por ejemplo, una o más biomoléculas tal como polinucleótidos , polipétidos, proteínas completas, polisacaridos y similares pueden ser unidos a la superficie de microaguja antes del uso.
En algunas incorporaciones, la superficie de microaguja puede incluir la reactividad adecuada de manera que la funcionalidad deseada adicional puede espontáneamente sujetarse a la superficie sin un tratamiento previo de la superficie siendo necesario. Sin embargo, en otras incorporaciones el tratamiento previo de la superficie estructurada antes de la sujeción del compuesto deseado puede llevarse a cabo. Por ejemplo, la reactividad de una superficie la estructura puede ser aumentada a través de la misión o creación de amina, ácido carboxílico, hidroxi, aldehido, tiol, o grupo de ésteres sobre la superficie. En una incorporación representativa, una superficie de microaguja incluyendo un patrón de nanoestructuras formadas sobre la misma puede ser aminatado a través del contacto con el compuesto que contiene amina tal como 3 -aminopropiltrietoxi silano a fin de aumentar la funcionalidad amina de la superficie y aglutinar una o más moléculas a la superficie a través de la funcionalidad amina agregada .
Los materiales como pueden ser deseablemente unidos a la superficie de un dispositivo con patrón pueden incluir las proteínas de matriz extracelular tal como laminina, tropoelastina, o elastina. El Tropocolágeno o el colágeno, la fibronectina, y similares. Los fragmentos de polipétidos cortos pueden ser unidos a la superficie de un dispositivo con patrón tal como una secuencia RGD, la cual es parte de la secuencia de reconocimiento de la unión de integrina a muchas proteínas de matriz extracelular. Por tanto, la funcionalización de una superficie de microagu as con RGD puede alentar la interacción del dispositivo con las proteínas de matriz extracelular y además limitar la respuesta de cuerpo extraño al dispositivo durante el uso.
La construcción de ARN de interferencia corta para la entrega a través del dispositivo puede estar asociada con el mismo de acuerdo a cualquier metodología adecuada. Por ejemplo, un parche de agujas transdérmica puede ser utilizada para la entrega de materiales debajo del estrato corneo al estrato espinoso o al estrato germinativo, o aún más profundo dentro de la dermis. El ARN de interferencia corta ya sea libre en la composición o mantenido en un estado protegido dentro de la composición, puede ser contenido sobre el parche o alimentarse al parche como para ser transportado a través del estrato corneo en asociación con la microaguja, por ejemplo dentro de la microaguja o en la superficie de la microaguja.
El parche transdérmico de microagujas puede incluir un depósito, por ejemplo, un recipiente, una matriz porosa, etc., que puede almacenar la construcción de ARN de interferencia corta y proporcionar la construcción de ARN de interferencia corta para la entrega. El dispositivo puede incluir un depósito dentro de dicho dispositivo mismo, por ejemplo el dispositivo puede incluir poros huecos o poros múltiples que pueden llevar una o más construcciones de ARN de interferencia corta para la entrega. La construcción de ARN de interferencia corta puede ser liberada del dispositivo a través de la degradación de una parte o del dispositivo completo o a través de la disposición de la gente desde el dispositivo.
La figura 11A y la figura 11B son vistas en perspectiva del dispositivo incluyendo un depósito. El dispositivo 110 incluye un dispositivo 112 definido por una capa de respaldo impermeable 114 y un arreglo de microaguja 116. La capa de respaldo y el arreglo de microaguja 116 están unidos juntos alrededor de la periferia exterior del dispositivo, como se indicó en el punto 118. La capa de respaldo impermeable 114 puede ser unida por un adhesivo, o sello de calor ó similar. El dispositivo 110 también incluye una pluralidad de microaguja 120. Un foro de liberación 122 puede ser removido antes del uso del dispositivo para exponer las microagujas 120.
Una formulación incluyendo una o más construcciones ARN de interferencia corta puede ser retenida dentro del depósito 112. Los materiales adecuados para usarse como una capa de respaldo impermeable 114 pueden incluir los materiales tales como poliésteres, polietileno, polipropileno y otros polímeros sintéticos. El material es generalmente sellable con calor o de otra manera sellable a la capa de respaldo para proporcionar una barrera al flujo transversal de los contenidos del depósito.
El depósito 112, definido por el espacio o separación entre la capa de respaldo impermeable 14 el arreglo de microagujas 16, proporciona una estructura de almacén en la cual retener la suspensión de las construcciones de ARN de interferencia corta que van a ser administradas . El depósito puede ser formado de una variedad de materiales que son compatibles con un agente que va a ser contenido ahí . Por vía de ejemplo, los polímeros naturales y los polímeros sintéticos, los metales, la cerámica, los materiales semiconductores, los compuestos de los mismos pueden formar el depósito.
En una incorporación, el depósito puede ser sujetado al sustrato sobre el cual están localizadas las microagujas. De acuerdo a otra incorporación, el depósito puede ser separado y conectado removiblemente al arreglo de microagujas o en comunicación del fluido con el arreglo de microagujas, por ejemplo a través de un tubo apropiado, cerraduras leur, etc.
El dispositivo puede incluir uno o una pluralidad de depósitos para almacenar agentes que van a ser entregados . Por ejemplo, el dispositivo puede incluir un depósito único que almacena una formulación que contiene una construcción de ARN de interferencia corta única o una o múltiples formulaciones que mantienen construcciones de ARN de interferencia corta, o el dispositivo puede incluir múltiples depósitos, cada uno de los cuales almacena uno o más agentes para la entrega a toda o una parte de microagujas. Los depósitos múltiples pueden cada uno almacenar un material diferente que puede ser combinado para la entrega. Por ejemplo, un primer depósito puede contener una construcción de ARN de interferencia corta y un segundo depósito puede contener un vehículo por ejemplo agua salada o una segunda construcción de ARN de interferencia corta. Los diferentes agentes pueden ser mezclados antes de la entrega. El mezclado puede ser activado por cualquier medio incluyendo, por ejemplo, la interrupción mecánica (por ejemplo, la perforación, la degradación, o el rompimiento) cambiando la porosidad, o la degradación electroquímica de las paredes o membranas que separan las cámaras. Los depósitos múltiples pueden contener diferentes agentes activos para la entrega que pueden ser entregados en conjunción unos con otros o en secuencia.
En una incorporación, el depósito puede estar en comunicación de fluido con una o mas microagujas del dispositivo transdérmico, y las microagujas pueden definir una estructura (por ejemplo un orificio central o lateral) para permitir el transporte de los agentes entregados debajo de la capa de barrera.
En las incorporaciones alternas, un dispositivo puede incluir un conjunto de microagujas y un conjunto de depósito con prevención de flujo entre las dos antes del uso. Por ejemplo, el dispositivo puede incluir un miembro de liberación colocado a un lado de ambos un depósito y un arreglo de microaguja. El miembro de liberación puede ser separado del dispositivo antes del uso de manera que durante el uso el depósito y el arreglo de microagujas están en comunicación de fluido uno con otro. La separación puede ser lograda a través del desprendimiento parcial o completo del miembro de liberación. Por ejemplo, refiriéndonos a las figuras 12-17, una incorporación del miembro de liberación está mostrado que está configurada para ser desprendida de un parche transdérmico para iniciar el flujo de un compuesto de droga. Más particularmente, la figura 12 y la figura 13 muestran un parche transdérmico 300 que contiene un conjunto de entrega de droga 370 un conjunto de microaguja 380. El conjunto de entrega de droga 370 incluye un depósito 306 colocado a un lado de una membrana de control de tasas 308.
La membrana de control de tasa puede ayudar a desacelerar la tasa de flujo de compuesto de droga con su liberación. Específicamente, los compuestos de droga fluídicos que pasan desde el depósito de droga al conjunto de microaguja a través de los canales microfluídicos pueden experimentar una caída en presión que resulta en una reducción en la tasa de flujo. Si esta diferencia es muy grande, alguna presión de regreso que puede ser creada que pueda impedir el flujo de compuesto y potencialmente superar la presión capilar del fluido a través de los canales microfluídicos . Por tanto, el uso de la membrana de control de tasa puede aminorar esta diferencia en presión y permitir el compuesto de droga al ser introducido adentro de la microaguja a una tasa de flujo más controlada. Los materiales particulares, el grosor, etc., de la membrana de control de tasa pueden ser variados sobre múltiples factores, tal como la viscosidad del compuesto de droga, en tiempos de entrega deseado etc .
La membrana de control de tasa puede ser fabricada de materiales permeables, materiales casi permeables o materiales microporosos que son conocidos en el arte para controlar la tasa de los compuestos de droga que tienen permeabilidad al mejorador de permeación más baja que aquella del depósito de droga. Por ejemplo, el material usado para formar la membrana de control de tasa puede tener un tamaño adecuado promedio de desde alrededor de 50 nanometros, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 100 nanometros a alrededor de 2 micrómetros, en algunas incorporaciones, de desde alrededor de 300 nanometros a alrededor de 1 micrómetro (por ejemplo, a alrededor de 600 nanometros) . Los materiales de membrana adecuados incluyen un ejemplo, los tejidos fibrosos (por ejemplo, tejidos o no tejidos), las películas perforadas, las espumas, las esponjas, etc., las cuales son formadas de polímeros tales como polietileno, polipropileno, acetato de polivinilo, acetato de etileno n-butilo y copolímeros de etileno vinilo acetato. Tales materiales de membrana también están descritos en mayor detalle en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 3,797,494, 4,031,894, 4,201,211, 4,379,454, 4,436,741, 4,588,580, 4,615,699, 4661,105, 4,681,584, 4,698,062, 4,725,272, 4,832,953, 4,908,027, 5,004,610, 5,310,559, 5342,623, 5,344,656, 5,364,630 y 6,375,978, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia para todos los propósitos relevantes. Un material de membrana adecuado particular esta disponible de Lohmann Therapie-Systeme .
Refiriéndonos a las figuras 12-13, aún cuando es opcional el conjunto 370 también contiene una capa adhesiva 304 que está colocada a un lado del depósito 306. El conjunto de microagujas 380 en forma similar incluye un soporte 312 desde el cual se extiende una pluralidad de microagujas 330 teniendo los canales 331, como se describió anteriormente. Las capas del conjunto de entrega de droga 370 y/o del conjunto de microagujas 380 pueden ser sujetadas juntas si se desea usando cualquier técnica de unión conocida, tal como a través de la unión adhesiva, la unión térmica, la unión ultrasónica, etc.
Sin importar la configuración particular empleada, el parche 300 también contiene un miembro de liberación 310 que es colocado entre el conjunto de entrega de droga 370 y el conjunto de microagujas 380. Aún cuando el miembro de liberación 310 puede opcionalmente ser unido al soporte adyacente 312 y/o a la membrana de control de tasa 308, se desea típicamente que solo se unan ligeramente, si lo es del todo de manera que el miembro de liberación 310 pueda fácilmente ser retirado del parche 300. Si se desea el miembro de liberación 310 también puede contener una parte de apéndice 371 (figura 12 y figura 13) que se extiende por lo menos parcialmente más allá del perímetro del parche 300 para facilitar la capacidad del usuario para agarrar sobre el miembro y jalarlo en la dirección deseada. En su configuración "inactiva" como se mostró en la figura 12 y en la figura 13, el conjunto de entrega de droga 370 del parche 300 retiene seguramente un compuesto de droga 307 de manera que éste no fluye a ninguna extensión significante adentro de las microagujas 330. El parche puede ser "activado" mediante el simplemente aplicar una fuerza al miembro de liberación de manera que este es desprendido del parche.
Refiriéndonos a las figuras 14-15, una incorporación para activar el parche 300 esta mostrada en la cual el miembro de liberación 310 es jalado en una dirección longitudinal. El miembro de liberación completo 310 puede ser removido como se mostró en las figuras 16 y 17, o este simplemente puede ser desprendido parcialmente como se mostró en las figuras 14-15. En cualquier caso, sin embargo, el sello previamente formado entre el miembro de liberación 310 y la abertura (no mostrado) del soporte 312 es roto. En esta manera, un compuesto de droga 107 puede comenzar a fluir desde el conjunto de entrega de droga 370 y adentro de los canales 131 de las microagujas 130 a través del soporte 112. Una ilustración de ejemplo de cómo el compuesto de droga 307 fluye desde el depósito 306 y adentro de los canales 331 está mostrada en las figuras 16-17. En forma notable, el flujo de compuesto de droga 307 es iniciado pasivamente y no requiere ningún mecanismo de desplazamiento activo (por ejemplo, bombas) en las incorporaciones mostradas en las figuras 12-17, el desprendimiento de liberación inmediatamente inicia el flujo del compuesto de droga a las microagujas debido a que el conjunto de entrega de droga esta ya colocado en comunicación de fluido con el conjunto de microaguja. En ciertas incorporaciones, sin embargo, puede ser deseado el proporcionar al usuario con un grado mayor de control sobre el tiempo de liberación del compuesto de droga. Esto puede ser logrado mediante el usar una configuración de parche en la cual el conjunto de microaguja no esta inicialmente en comunicación de fluido con el conjunto de entrega de droga. Cuando se desea usar el parche, el usuario puede físicamente manipular los dos conjuntos separados a una comunicación de fluido. El miembro de liberación puede ser separado ya sea antes o después de que ocurra tal manipulación física.
Refiriéndonos a las figuras 18-23, por ejemplo, esta mostrada una incorporación particular de .un parche 200. Las figuras 18-19 ilustran el parche 200 antes del uso, y muestran una primera sección 250 formada por un conjunto de microaguja 280 y una segunda sección 260 formada por el conjunto de entrega de droga 270. El conjunto de entrega de droga 270 incluye un depósito 206 colocado a un lado de una membrana de control de tasa 208 como se describió arriba. Aún cuando es opcional, el conjunto 270 también contiene una capa adhesiva 204 que está colocada a un lado del depósito 206. El conjunto de microaguja 280 en forma similar incluye un soporte 212 desde el cual se extiende una pluralidad de microaguja 230 que tienen los canales 231, tal como se describió arriba.
En está incorporación, el soporte 212. y la membrana de control de tasa 208 están inicialmente colocados horizontalmente al lado una de otra, y el miembro de liberación 210 se extiende sobre el soporte 212 y el miembro de control de tasa 208. En esta incorporación particular, es generalmente deseado que el miembro de liberación 210 sea sujetado en forma liberable al soporte 212 y la membrana de control de tasa 208 con un adhesivo (por ejemplo, adhesivo sensible a la presión) . En su configuración "no activa" como se mostró en las figuras 18-19, el conjunto de entrega de droga 270 del parche 200 retiene en forma segura un compuesto de droga 207 de manera que éste no fluye a ninguna extensión significante adentro de las microagujas 230. Cuando se desea el "activar" el parche el miembro de liberación 210 puede ser pelado hacia fuera y removido tal como se ilustró en las figuras 20-21, para romper el sello previamente formado entre el miembro de liberación 210 y la abertura "no mostrada" del soporte 212. Después la segunda sección 260 puede ser doblada alrededor de la línea de doblez "F" como se mostró por la flecha direccional en la figura 22 de manera que el miembro de control de tasa 208 este colocado verticalmente a un lado del soporte 212 y en comunicación de fluido con el mismo. Alternativamente, la primera sección 250 puede ser doblada. Sin importar el doblez de las secciones 250 y/o 260 inicia el flujo de un compuesto de droga 207 desde el conjunto de entrega de droga 270 y adentro de los canales 231 de las microagujas 230 a través del soporte 212 (vea la figura 23) .
El dispositivo puede entregar un agente a una tasa como para ser terapéuticamente útil. De acuerdo con éste objetivo, el dispositivo transdérmico puede incluir una caja con microelectrónicos y otras estructuras micromaquinadas para controlar la tasa de entrega ya sea de acuerdo a un programa establecido previamente o través de una interfase activa con el paciente, un profesional del cuidado de la salud o un biosensor. El dispositivo puede incluir un material que tiene una tasa de degradación predeterminada como para controlar la liberación de una construcción de ARN de interferencia corta contenido dentro del dispositivo. La tasa de entrega puede ser controlada mediante el manipular una variedad de factores, incluyendo las características de la formulación que va a ser entregada (por ejemplo la viscosidad, la carga eléctrica y/o la composición química) ; las dimensiones del dispositivo (por ejemplo el diámetro exterior y el volumen de cualquier abertura) ; el número de microagujas sobre el parche transdérmico; el número de dispositivos individuales en una matriz portadora; la aplicación de una fuerza de impulsión (por ejemplo un gradiente de concentración un gradiente de voltaje) ; el uso de una válvula y otros.
El transporte de los agentes a través del dispositivo puede ser controlado vigilado usando, por ejemplo, varias combinaciones de válvulas, bombas, sensores, accionadores y microprocesadores . Estos componentes pueden ser producidos usando técnicas de fabricación estándar o de técnicas de fabricación. Los accionadores que pueden ser útiles con un dispositivo pueden incluir las microbombas, las microválvulas y los colocadores . Por ejemplo, un microprocesador puede ser programado para controlar una bomba o una válvula, controlando por tanto la tasa de entrega.
El flujo de un agente a través del dispositivo puede ocurrir basado sobre la difusión o la acción capilar, o éste puede ser inducido usando unas bombas mecánicas convencionales o fuerzas de impulsión no mecánicas, tal como la electroósmosis , o la electroforesis o la convección. Por ejemplo, en la electroósmosis, los electrodos están colocados sobre la superficie biológica (por ejemplo la superficie de la piel) una microaguja y/o un sustrato adyacente a una microaguja, para crear un flujo convectivo el cual lleva las especies iónicas cargadas supuestamente y/o las moléculas neutrales hacia o adentro del sitio de entrega.
El flujo de un agente puede ser manipulado mediante la selección del material que forma la superficie de la microaguja. Por ejemplo, una o más ranuras grandes adyacentes a la superficie de microaguja del dispositivo pueden ser usadas para dirigir el paso de la construcción de ARN de interferencia corta. Alternativamente, los materiales que forman la superficie nanoestructurada pueden ser manipulados para ya sea promover o inhibir el transporte del material a lo largo de la superficie tal como mediante el controlar la hidrofilicidad o la hidrofobicidad.
El flujo de un agente puede ser regulado usando las válvulas o compuertas como se conoce en el arte. Las válvulas pueden ser repetidamente abiertas y cerradas o estas pueden ser válvulas de uso único. Por ejemplo una barrera que puede ser rota o una compuerta de una vía pueden ser instalados en el dispositivo entre un dispositivo y la superficie con patrón. Cuando está listo para usarse, la barrera puede ser rota o la compuerta puede ser abierta para permitir el flujo a través de la superficie de microaguja. Otras válvulas o compuertas usadas en el dispositivo pueden ser activadas térmicamente, electroquímicamente, mecánicamente, o magnéticamente para iniciar selectivamente, o modular o detener el flujo de las moléculas a través del dispositivo. En una incorporación, el flujo es controlado mediante el uso de una membrana de limitación de tasa como una "válvula" .
En general, cualquier sistema de control de entrega de agente, incluyendo los depósitos, los sistemas de control de flujo, los sistemas de percepción, como se conocen en el arte pueden ser incorporados con los dispositivos. Por vía de ejemplo, las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 7,250,037, 7,315,758, 7,429,258, 7,582,069 y 7,611,481 describe un depósito de sistemas de control como pueden ser incorporados en los dispositivos.
Durante el uso, la presencia de la superficie nanoestructurada de las microagujas dentro de la piel puede afectar la formación y mantenimiento de las juntas de célula/célula incluyendo las juntas apretadas y las desmosomas. Como se mencionó previamente, las juntas apretadas se han incorporado en el estrato granuloso y la abertura de las juntas apretadas puede proporcionar una ruta paracelular para la entrega mejorada de las construcciones ARN de interferencia corta.
La presente descripción puede además ser entendida con referencia a los ejemplos que se proporcionan abaj o .
EJEMPLO 1 Varios modos diferentes fueron preparados usando las técnicas de fotolitografía similares a aquellas empleadas en el diseño y fabricación de los circuitos eléctricos. Los pasos de proceso individual son generalmente conocidos en el arte y se han descrito.
Inicialmente, los sustratos de silicio se han preparado mediante la limpieza con acetona, metanol y alcohol isopropilo, y después se ha recubierto con una capa de 258 nanómetros (nm) de dióxido de silicio de acuerdo a un proceso de depósito de vapor químico.
Un patrón fue entonces formado sobre cada sustrato a través de una formación de patrón de litografía de rayo electrónico como se conoce con el arte usando el sistema JEOL JBX- 9300FSEBL . Las condiciones de procesamiento fueron como sigue: Corriente de rayo = 11 nA Voltaje de aceleración= lOOkV Inclinación de tiro= 14nm Dosis= 260uC/cm2 Resistencia^ ZEP520A, 330 nm grosor Revelador=n-amil acetato Revelado= 2 minutos, inmersión, seguido por 30 segundos de enjuague de alcohol de isopropilo.
Un decapado de dióxido de silicio fue entonces llevado a cabo por un decapado de óxido avanzado STS (AOE) . El tiempo de decapado fue de 50 segundos utilizando 55 centímetros cúbicos estándar por minuto (sccm) He, 22 centímetros cúbicos estándar por minuto CF4, 20 centímetros cúbicos estándar por minuto de C4F8 a 4 mTorr, bovina de 400 W, 200 W RIE y una presión DC de 404-411 V.
Después, un decapado de silicio fue llevado a cabo con decapado de óxido de silicio STS (SOE) . El tiempo de decapado fue de 2 minutos utilizando 20 centímetros cúbicos estándar por minuto CI2 y 5 centímetros cúbicos estándar por minuto de Ar a 5 mTorr, bovina de 600 , 50 W RIE y una presión DC de 96-102 V. La profundidad de decapado de silicio fue de 500 nanómetros .
Un decapante de óxido amortiguado (BOE) fue usado para la remoción de óxido restante que incluyó una inmersión de decapante de óxido amortiguado de 3 minutos seguido por el enjuague de agua deionizada.
Una nanoimpresora Obducat NIL-Eitre®6 fue usada para formar los nanopatrones sobre una variedad de sustratos de polímero. El agua externa fue usada como un enfriador. El módulo ultravioleta utilizó una lámpara pulsada única a una longitud de onda de 200 nanómetros y 1000 nanómetros a 1.8 W/centímetro cuadrado. Fue usado un filtro ultravioleta de 250-400 nanómetros . El área de exposición fue de 6 pulgadas con una temperatura máxima de 200 grados centígrados y 80 Bar. La nanoimpresora incluyó una unidad de separación casi automática y un desmoldador controlado automático.
Para facilitar la liberación de las películas nanoimpresas de los moldes, los moldes fueron tratados con Trideca- (1,1,2,2-tetrahidro) -octitriclorisilano (F13TCS) . Para tratar un molde, el molde de silicio fue primero limpiado con un lavado de acetona, metanol y de alcohol isopropilo y se secó con un gas de nitrógeno. Un plato Petri fue colocado sobre la placa caliente en una atmósfera de nitrógeno y 1-5 mililitros de F13-TCS fue agregado al plato Petri. Un molde de silicio fue colocado en el plato Petri y se cubrió por 10-15 minutos para permitir al vapor de F13-TCS el mojar el molde de silicio antes de la remoción del molde.
Cinco polímeros diferentes se dan en la Tabla 1, abajo, y fueron utilizados para formar varios diseños de nanotopografía .
Tabla 1 Varios patrones de nanotopografía diferentes fueron formados, las representaciones esquemáticas de los cuales están ilustradas en las figuras 24A-24D. El patrón de nanotopografía ilustrada en la figura 24E fue una superficie de un sustrato plano comprado de NTT Advanced Technology de Tokio, Japón. Los patrones fueron designados DN1 (Figura 24A) , DN2 (Figura 24B) , DN3 (Figura 24C) , DN4 (Figura 24D) y NTTAT2 (Figura 24E) . Las imágenes de incroscopia de exploración electrónica de los moldes están mostradas en las figuras 24A, 24B y 24C y las imágenes de las películas están mostradas en la figura 24B en la figura 24E. La figura 8 ilustra una película con nanopatrón formada por el uso del molde de la figura 24A (DNl) . En esta película en particular, las características del polímero fueron llevadas por la variación de temperatura como se discutió previamente. La aspereza de superficie de patrón de la figura 24E se encontró como que fue de 34 nanometros.
El patrón ilustrado en la figura 7C y en la figura 7D también fue formado de acuerdo a éste proceso de nanoimpresión . Este patrón incluyó los pilares 72 y los pilares 62, como se mostró. Los pilares más grandes 72 fueron formados con un diámetro de 3.5 micrómetros (µp?) y alturas de 30 micrómetros con un espaciamiento de centro a centro de 6.8 micrómetros. En los pilares 62 fueron de 500 nanometros en altura y de 200 nanometros en diámetro y un espaciamiento de centro a centro de 250 nanometros.
Las condiciones de proceso de nanoimpresión usadas con las películas de polipropileno se proporcionan abajo en la tabla 2.
Tabla 2 EJEMPLO 2 Las películas fueron formadas como se describió arriba en el ejemplo 1 incluyendo varios patrones diferentes y se formaron de ya sea poliestireno (PS) o de polipropileno (PP) . El sustrato subyacente varió en grosor. Los patrones utilizados fueron ya sea DN2 , DN3 ó DN4 formados utilizando los procesos de formación como se describió en el ejemplo 1. Los moldes de patrón fueron variados con respecto a la profundidad de orificio y al espaciamiento de característica para formar una variedad de características dimensionadas en forma diferente teniendo los patrones designados. La muestra número ocho (designada BB1) fue formada por el uso de un filtro de policarbonato milipore de 0.6 micrómetros como un molde. Una película de polipropileno de 25 micrómetros fue colocada sobre la parte superior del filtro y fue entonces calentada para derretir de manera que el polipropileno pudo fluir adentro de los poros del filtro. El molde fue entonces enfriado y el molde de policarbonato fue disuelto por el uso de un solvente de cloruro de metileno.
Las microscopías de exploración electrónica de las películas formadas están ilustradas en las figuras 25-33 y las características de las películas formadas están resumidas en la tabla 3 dada abajo. ro (-1 o en o OI Tabla 3 'Caracterísitcas de patrón como se mostró en las figuras. 2Las palabras en dimensiones en sección transversal fueron derivadas del molde e igualaron como una aproximación de la dimensión máxima de la estructura, aún cuando deberá entenderse que la dimensión actual de cualquier estructura individual dada puede variar ligeramente como pueden verse en las figuras. 3Alturas de características se proporcionan como el promedio de varias alturas de características determinadas individualmente Para cada muestra la microscopía de fuerza atómica fue utilizada para caracterizar la película. Las caracterizaciones incluyeron la formación de una micrografía de exploración electrónica (SEM) , la determinación de la aspereza de superficie, la determinación de la altura de característica de medida máxima, y la determinación de la dimensión fractal.
La sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM) utilizada fue una serie de 16 ondas de silicio y voladizo disponible yMasch. El voladizo tuvo una frecuencia disonante de 170 kilohertz, una constante de resorte de 40 N/m, una longitud de 230 + 5 micrómetros, o un ancho de 40 + 3 micrómetros y un grosor de 7.0 + 0.5 micrómetros . La punta de una sonda de silicio drogada con fósforo tipo-n, con un radio de punta de sonda típico de 10 nanómetros, un ángulo de cono de punta completa de 40 grados, una altura de punta total de 20 micrómetros a 25 micrómetros, y una resistividad de volumen de 0.01-0.05 ohm-cm.
El valor de aspereza de superficie dado en la tabla 3 es la altura media aritmética del parámetro de aspereza área de superficie como se definió en la serie ISO 25178.
La dimensión fractal fue calculada para los diferentes ángulos mediante el analizar el espectro de amplitud Fourier; para diferentes ángulos el perfil de amplitud Fourier fue extraído y el logaritmo de la frecuencia y coordinadas de amplitud se calcularon. La dimensión fractal, D, para cada dirección es entonces calculada como} D=6+s) /2, En donde s es la inclinación (negativa) de las curvas log - log. La dimensión fractal reportada es el promedio para todas las direcciones.
La dimensión fractal también puede ser evaluada del espectro Fourier 2D mediante la aplicación de la función Log Log. Si la superficie es fractal la gráfica Log Log debe ser altamente lineal, con la inclinación negativa (vea por ejemplo superficies fractal, John C. Russ, Springer-Verlag Nueva York, Estados Unidos de América LLC. Julio de 2008) .
EJEMPLO 3 Las células epiteliales de piel humana HaCaT fueron cultivadas en DMEM, 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina a 37 grados centígrados, 5% de CO2 por 24 horas a una concentración de 25,000 células/centímetros cuadrados en placas de 6 pozos . Las placas tuvieron ya sea películas con nanopatrón de polipropileno formadas come se describió arriba en el ejemplo 1 y designadas de DN1, DN2 (muestra 4 de la tabla 3) , DN3 o superficie no tratada en el fondo del pozo. Las películas con nanopatrón fueron adheridas en el lugar con cianoacrilato .
Las células fueron desprendidas de las superficies con un mL de tripsina por pozo en 10 minutos se enfriaron con un mL de medio de crecimiento (el mismo que se indicó anteriormente) , después se transfirieron a un tubo de microfuga y se paletizaron a 1,200 revoluciones por minuto por 7 minutos .
El ARN fue aislado de las células en pelotillas usando el estuche de miniprep R easy de Qlagen usando el protocolo del fabricante. Brevemente, las células fueron lisadas, se mezclaron con el etanol y se hilaron abajo en una columna. Los lisados fueron entonces lavados tres veces, se trataron con DNase y se elutaron con 40 µ? volúmenes.
El cADN fue creado del ARN aislado usando el estuche de primera cadena RT de SA Biosciences. Brevemente, el ARN fue tratado con DNase de nuevo a 42 grados centígrados por 5 minutos. Los imprimadores al azar y la enzima de transcriptasa inversa fue entonces agregada y se incubaron a 42 grados centígrados por 15 minutos, después se incubaron a 95 grados centígrados por 15 minutos, después se incubaron a 42 grados centígrados por 15 minutos, después se incubaron a 95 grados centígrados por 5 minutos para detener la reacción.
El qDCR fue entonces llevado a cabo sobre las muestras de cADN usando el arreglo PCR mayúsculas a la medida perfilador RT de SA Biosciences con los imprimadores para lLl-ß, 1L6, 1L8, 1L10, 1L1R1 , TNFa, ?TG -?, PDGFA, GAPDH, HDGC , RTC y PPC. Brevemente, el cADN fue mezclado con el verde SYBR y agua, y después se agregó a una placa PCR prefijada con el par imprimador de sentido y antisentido correcto para el gen de interés . La placa fue entonces corrida sobre una máquina ABI StepOnePlus PCR calentada a 95 grados centígrados por 10 minutos, después por 45 ciclos: de 15 segundos a 95 grados centígrados y 1 minuto a 60 grados centígrados.
El análisis CT Delta delta se llevó a cabo usando GAPDH como el control interno. Los niveles HDGC, RTC y PPC fueron usados como controles internos adicionales para la actividad y contaminación ADN genómica.
La prueba de 2 puntos Tukey y A OVA de una vía fueron entonces usadas para determinar el significado estadístico en las diferencias entre las superficies.
La tabla 4, dada abajo, presenta las expresiones de proteína obtenidas con el cambio de doblez en expresión sobre estructuras nanoimpresas producidas sobre las películas de polipropileno en contra de la expresión sobre una película no estructurada .
Tabla 4 EJEMPLO 4 Las células epiteliales de piel humana HaCaT fueron cultivadas en DMEM, 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina a 37 grados centígrados, 5% de C02 por 24 horas a una concentración de 25,000 células por centímetro cuadrado en 6 placas de pozo. Las placas ya sea tuvieron una película de polipropileno formada como se describe arriba en el ejemplo 1 con la designación DNl, DN" (muestra 4 de la tabla 3) D3 o una superficie no tratada en el fondo del pozo. Las películas fueron adheridas en el lugar con cianoacrilato .
Los medios fueron recolectados de cada pozo y se realizaron para la producción de citosina con un estuche de mapa Milliplex de Millipore. Fueron usadas las perlas para detectar lLl-ß, 1L1RA, 1L6, 1L8, 1L10, PDGF-AA, PGGF-AB/BB y TNF-a. Las lecturas se hicieron sobre una máquina BioRAD BioPlex. Brevemente, los medios fueron colocados en pozos de microplaca con filtros. Las perlas primarias fueron agregadas y se incubaron a la temperatura ambiente por una hora con agitación. Las placas entonces fueron lavadas e incubadas con anticuerpos de detección por 30 minutos a la temperatura ambiente con agitación. El Estrepavidina-ficoertrina fue entonces agregado y se incubó a la temperatura ambiente por 30 minutos adicionales. Las placas entonces fueron lavadas, las perlas fueron resuspendidas en un amortiguador de ensayo y la intensidad de fluorescencia media fue realizada en el BioPlex.
EJEMPLO 5 Los efectos de la permeabilidad de las películas con patrón como se describieron aquí fue determinada sobre una monocapa de células Caco- 2 (células adenocarcinoma colorrectal epitelial humano) .
Las películas formadas como se describió anteriormente en el ejemplo 1 fueron utilizadas incluyendo las películas formadas con los patrones diseñados como DN2 , Dn3 y Dn4. Una cuarta película designada BBl (descrita en el ejemplo 2 arriba) también fue usada. El protocolo fue corrido con múltiples ejemplos de cada tipo de película.
El protocolo general seguido por cada película fue como sigue: Materiales Insertos de cultivo de célula de membrana HDPET de poro de 0.4 micrómetros (Falco BD) Placa de 24 pozos (Falcon BD) Media Caco-2 Membranas nanoestructuradas como se describió arriba lgG-FITC (Sigma Aldrich) BSA-FITC (Sigma Aldrich) Medio esencial mínimo sin rojo fenol (Invitrogen) Voltímetro TEER PBS calentado Placa de 96 pozos negro Hoja de aluminio Protocolo 1. Las células de semilla Caco-2 sobre insertos de pozo recubierto con colágeno dos semanas antes de que ensayo de permeabilidad pueda llevarse a cabo.
Las placas recubiertas de colágeno se hacen mediante el fabricar 1:1 volumen de 100% de etanol a colágeno. Las superficies secas en cubierta estéril durante la noche hasta que se secaron. 2. Hacer una solución de 0.1 mg/mL de molécula FITC- conjugada (BSA, IgG, etc.) de interés en medio Alfa MEM libre rojo fenol. Envuelta en hoja de aluminio para proteger de la luz .
Verificar para la confluencia de células Caco-2 midiendo la resistencia. La resistencia debe estar arriba de 600 Ohms para confluencia.
Aspirar el medio viejo de los insertos de cultivo de célula sobre los lados apical y basolateral . Enjuagar con PBS para remover cualquier tinte rojo-fenol residual.
Agregar 0.5 mL de solución FITC-conj ugado sobre el lado apical de cada inserto.
En otra placa de 24 pozos con insertos de cultivo de célula, agregar 0.5 mL de PBS calentado.
Transferir insertos a la placa con PBS. Secar el fondo del inserto sobre un limpiador Kim para remover el rojo fenol residual. t=0 -punto de tiempo: muestra 75 µL del lado basolateral del inserto y transferir a una placa de 96 pozos de fondo negro. Reemplazar el volumen con 75 L de PBS calentado. Registrar la resistencia de cada pozo usando los electrodos "chopstick" .
Cuidadosamente agregar la membrana al pozo etiquetado apropiadamente. Los controles son las membranas no impresas y las células solas. Verificar bajo un microscopio que las membranas hacen contacto directo con las células . Usted debe ser capaz de ver el círculo afilado, indicando el contacto con las células. t=0 punto de tiempo: repetir el paso 7 y después colocar en la incubadora por una hora. t=l punto de tiempo: repetir el paso 7 y después colocar en la incubadora por una hora. t=2 punto de tiempo: repetir el paso 7.
Medir la señal de fluorescencia usando un lector de placa de espectrofluorometro .
FITC (excitación=490 nm, emisión= 520 nanómetros) Las películas utilizadas y los resultados obtenidos están resumidos en la tabla 5 dada abajo.
Tabla 5 Los módulos fueron determinados de acuerdo a los métodos estándar como son conocidos en el arte como se describió por Schubert y otros (adhesión inducida Deslizante de arreglos de microfibra de polímero rígido: 2. Comportamiento de microescala, diario de interfase de Sociedad Real, Enero 22, de 2008. 10.1098/rsif .2007.1309) .
Los ángulos de contacto fueron medidos mediante el colocar una gota de agua sobre la superficie de acuerdo a una práctica estándar (Vea por ejemplo Woodward, Los primeros diez Anstroms, Portsmouth, Virgina Estados Unidos de América) .
La figura 34 ilustra gráficamente los efectos sobre la permeabilidad, de albúmina de suero bovino (BSA) en una monocapa de células sobre películas de poliestireno con patrón con nanopatrones como se describió aquí . Los patrones de película incluyeron un patrón DN2 (muestra no. 3) , un patrón DN3 (muestra no. 5) , y un patrón DN4 (muestra no. 6) , como se indicó. También están mostrados los resultados para la película sin patrón (membrana de polietileno no impresa marcada sobre la figura 34) y una capa de células sin película adyacente (marcado "células" sobre la figura 22) .
La figura 35 ilustra gráficamente los efectos sobre la permeabilidad a la inmunoglobulina-G (IgG) en una monocapa de células sobre películas de poliestireno formados con patrón con nanopatrones como se describió aquí . Los patrones de película incluyeron un patrón DN2 (muestra no. 3) un patrón DN3 (muestra no. 5) y un patrón DN4 (muestra no. 6) como se indicó. También esta mostrado los resultados para una película sin patrón (marcada membrana de no impresa sobre la figura 35) y una capa de células sin una película adyacente (marcada células sobre la figura 35) .
La señal BSA fue leída sobre un fluorómetro y la señal de hemonoglubina-G fue leída sobre un espectrofotómetro .
La figura 36A y la figura 36B son imágenes de manchado de fluoresceína vivas y aún hay muertas 3D mostrando el transporte paracelular de la inmunoglobulina-G a través de una monocapa de células sobre una superficie con patrón DN4 de poliestireno (muestra no. 6) .
La figura 37 ilustra gráficamente los efectos sobre la permeabilidad a albúmina de suero bovino en una monocapa de células sobre películas de polipropileno conformadas con patrón con nanopatrones como se describió aquí.
Los patrones incluyeron BB1 (muestra no. 8) , DN2 (muestra no. 4) , y DN4 (muestra no. 7) , como se indicó. También están mostrados los resultados para una película sin patrón (marcada membrana de poliestireno no impresa sobre la figura 37) y una capa de células sin una película adyacente (marcada células sobre la figura 37) .
La figura 38 ilustra gráficamente los efectos sobre la permeabilidad a la inmunoglobulina-G en una monocapa de células sobre películas de polipropileno formadas con patrón con nanopatrones como se describió aquí . Los patrones incluyeron BB1 (muestra no.8), DN2 (muestra no.4) y DN4 (muestra no.7) como se indicó. También están mezclados los resultados para la película sin patrón (marcada membrana de poliestireno no impresa sobre la figura 38 y una capa de células sin una película adyacente) marcada "células" de la figura 38.
La figura 39A y la figura 39B son imágenes de manchado de fluoresceína vivas/muertas 3D que muestran el transporte paracelular de la inmunoglobulina-G a través de una monocapa de células sobre una superficie con patrón DN2 de polipropileno (muestra no. 4) .
Las figuras 40A-40F son imágenes de microscopía de exploración electrónica (SEM) de células Caco-2 cultivadas sobre superficies con nanopatrón. Específicamente, la figura 40A y la figura 40B ilustran las células Caco-2 sobre una película de control de poliestireno plana. La figura 40C y la figura 40D ilustran las células Caco-2 sobre una película de poliestireno con un patrón DN2 (muestra no .3 ) como se describió arriba, y las figuras 40E y 40F ilustran las células Caco-2 sobre película de poliestireno con un patrón DN3 (muestra no. 5) como se describió arriba.
EJEMPLO 6 Fue formado un arreglo de microagujas incluyendo una superficie de nanopatrón. Inicialmente , un arreglo de microagujas como se ilustró en la figura 2 fue formado sobre una oblea de silicio a través de un proceso de fotolitografía. Cada aguja incluyo dos canales laterales colocados supuestamente, alineados uno a través del orificio de matriz en la base de la aguja (no visible en la figura 2) .
Las microagujas fueron formadas de acuerdo al proceso de micromaquinado típico sobre una oblea a base de silicio. Las obleas fueron puestas en capas con capas de resistencia y/o de óxido seguidos por el decapado selectivo (decapado de óxido, decapado de RI, decapado iso) , desvestido de resistencia, desvestido de óxido y técnicas de la litografía (por ejemplo litografía iso como litografía de edificio, litografía de hendiduras) de acuerdo a métodos estándar para formar el arreglo de microagujas.
Siendo la información del arreglo de microagujas, una película de polipropileno de 5 µ?a incluyendo un patrón DN2 formados sobre la misma como se describió arriba en el ejemplo 1, cuyas características están descritas en la muestra 2 en la tabla 3, fue colocado sobre el arreglo de microagujas. La estructura de oblea/película se ha mantenido sobre una caja de vacío calentada (3 pulgadas vacío H2O) a temperatura elevada (130 grados centígrados) por un período de una hora para jalar suavemente la película sobre la superficie de las microagujas mientras que se mantiene la superficie con nanopatrón de la película.
La figura 41 ilustra la película sobre la parte superior de un arreglo de microagujas, y la figura 42 es una vista más cercana de una aguja única del arreglo incluyendo la película con nanopatrón colocada sobre la parte superior de la aguja.
EJEMPLO 7 Los métodos como se describieron en el ejemplo 5 fueron utilizados para determinar los efectos de permeabilidad de las películas con patrón como se describió aquí sobre una monocapa de células Caco-2 cuando se considera la permeabilidad de la capa de célula al ARN de interferencia corta.
El ARN de interferencia corta utilizado fue un BLOCK-iT™ Oligo Fluorescente disponible de Invitrogen. El ARN de interferencia corta es un oligómero ARN de doble cadena. El protocolo fue el mismo como se describió en el ejemplo 5. La película estructurada usada incluyó el patrón DN2 sobre una película de polipropileno (muestra 4 de la tabla 3) así una película sin patrón (PPUI) y una capa de células sin película (células) . Los resultados de permeabilidad sobre el tiempo están mostrados en la figura 43.
Aún cuando la materia específica se ha descrito en detalle con respecto a las incorporaciones específicas de la misma, se apreciará por aquellos expertos en el arte al lograr un entendimiento de lo anterior que puede fácilmente concebirse alteraciones, variaciones equivalentes de estas incorporaciones. Por tanto, el alcance de la presente descripción debe ser evaluado como aquel de las reivindicaciones anexas y de cualesquiera equivalentes de las mismas.

Claims (23)

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. Un dispositivo para la entrega de una construcción de ARN de interferencia corta a través de una barrera dérmica, el dispositivo comprende: una microaguja y una pluralidad de nanoestructuras fabricadas en la superficie de la microaguja, las nanoestructuras estando arregladas en un patrón predeterminado; y una construcción ARN de interferencia corta en comunicación de fluido con la microaguja.
2. El dispositivo tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque el patrón además incluye microestructuras, en donde las nanoestructuras tienen una dimensión en sección transversal más pequeña que las microestructuras .
3. El dispositivo tal y como se reivindica en la cláusula 2 caracterizado además porque comprende las segundas nanoestructuras que tienen una dimensión en sección transversal menor que la dimensión en sección transversal de las microestructuras y mayor que la dimensión en sección transversal de las primeras nanoestructuras.
4. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque por lo menos una parte de las nanoestructuras tienen una dimensión en sección transversal de menos de alrededor de 500 nanómetros y demás de alrededor de 5 nanómetros .
5. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque por lo menos una parte de las nanoestructuras tienen un espaciamiento de centro a centro de desde alrededor de 50 nanómetros a alrededor de 1 micrómetro.
6. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque por lo menos una parte de las nanoestructuras tienen una altura de desde alrededor de 10 nanómetros a alrededor de 20 micrómetros .
7. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque por lo menos una parte de las nanoestructuras tienen una proporción de aspecto de desde alrededor de 0.15 y alrededor de 30.
8. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque el agente ARN de interferencia corta incluye una región dúplex de entre alrededor de 20 pares y alrededor de 30 pares.
9. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque por lo menos una cadena del ARN de interferencia corta incluye un 3' sobre colgado de dos o tres nucleótidos.
10. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque un agente ARN de interferencia corta comprende nucleótidos adicionales o un análogo nucleótido.
11. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque el agente ARN de interferencia corta comprende una secuencia de nucleótido que es idéntica a una parte de un gen de objetivo.
12. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque el agente de ARN de interferencia corta incluye inserciones, supresiones, o mutaciones de punto único en comparación a una parte de un gen de objetivo.
13. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque el agente de ARN de interferencia corta es un ARN de interferencia corta de cadena única.
14. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque el ARN de interferencia corta comprende un ligando unido al ARN de interferencia corta por ejemplo, un modificador terapéutico, un compuesto de diagnóstico, un grupo reportero, un agente de lanzamiento cruzado, una nucleobase, una molécula lipofílica o una proteína.
15. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque el agente ARN de interferencia corta es incorporada en el vehículo de entrega por ejemplo un liposoma.
16. El dispositivo médico tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque la construcción de ARN de interferencia corta comprende un vector, por ejemplo un vector viral.
17. Un método para entregar una construcción de ARN de interferencia corta a través de una barrera dérmica, el método comprende : penetrar el estrato corneo con una microaguja, la microaguja comprende una pluralidad de nanoestructuras formadas sobre la superficie de la microaguja y arregladas en un patrón, la construcción de ARN de interferencia corta estando en comunicación de fluido con la microaguja, la construcción ARN de interferencia corta siendo transportada a través del estrato corneo después de la penetración del estrato corneo por la microaguja .
18. El método tal y como se reivindica en la cláusula 17 caracterizado porque la construcción de ARN de interferencia corta es transportado a través del estrato corneo dentro de un orificio anular o un canal de la microaguja.
19. El método tal y como se reivindica en las cláusulas 17 ó 18 caracterizado porque la construcción ARN de interferencia corta es transportada a través del estrato corneo a una concentración estable sobre un período de tiempo.
20. Un método para formar un dispositivo para la entrega de una construcción ARN de interferencia corta a través de una barrera dérmica, el método comprende: fabricar un arreglo de microagujas; fabricar un patrón de nanoestructuras sobre la superficie por lo menos una de las microagujas; asociar una construcción de ARN de interferencia corta con las microagujas de manera que la construcción de ARN de interferencia corta esté en comunicación de fluido con las microagujas .
21. El método tal y como se reivindica en la cláusula 20 caracterizado porque el método además comprende retener la construcción de ARN de interferencia corta dentro del depósito que está en comunicación de fluido con el arreglo de microagujas .
22. El método tal y como se reivindica en la cláusula 20 caracterizado porque el depósito está sujetado a un sustrato sobre el cual el arreglo de microagujas esta localizado.
23. El método tal y como se reivindica en la cláusula 20 caracterizado porque el depósito es removiblemente conectado al arreglo de microagujas. R E S U M E Están descritos los dispositivos médicos que incorporan el ARN de interferencia corta. En adición a una o más construcciones de ARN de interferencia corta, los dispositivos incluyen nanoestructuras fabricadas sobre una superficie para formar una nanotopografía . Un patrón al azar o no al azar de estructuras puede ser fabricado de manera como un patrón complejo incluyendo estructuras de diferentes tamaños y/o formas. Las microagujas pueden ser incorporadas en los dispositivos. El patrón incluyendo nanoestructuras puede ser formado sobre la superficie de las microagujas.
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