MX2011013013A - Secuencias de aminoacidos mejoradas dirigidas contra virus sincitial respiratorio humano y polipeptidos que comprenden las mismas para la prevencion y/o tratamiento de infecciones del tracto respiratorio. - Google Patents
Secuencias de aminoacidos mejoradas dirigidas contra virus sincitial respiratorio humano y polipeptidos que comprenden las mismas para la prevencion y/o tratamiento de infecciones del tracto respiratorio.Info
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Abstract
Se proporcionan secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra y/o que pueden enlazar específicamente proteína F de hRSV, así como a compuestos o constructos, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprenden o consisten esencialmente de una o más de tales secuencias de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos, polipéptidos y compuestos y composiciones terapéuticas proporcionadas por la invención muestran una estabilidad mejorada, menor inmunogenicidad y/o afinidad mejorada y/o avidez para la proteína F de hRSV. La invención también se refiere a los usos de tales secuencias de aminoácidos, polipéptidos, compuestos o constructos para propósitos terapéuticos y/o profilácticos.
Description
SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS MEJORADAS DIRIGIDAS CONTRA VIRUS
SINCITIAL RESPIRATORIO HUMANO Y POLIPEPTIDOS QUE COMPRENDEN
LAS MISMAS PARA LA PREVENCIÓN Y/O TRATAMIENTO DE INFECCIONES
DEL TRACTO RESPIRATORIO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a secuencias de aminoácidos que se dirigen contra y/o que pueden enlazar específicamente (como se definen en la presente) la proteína F de hRSV, así como a compuestos o constructos, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprenden o consisten esencialmente de una o más tales secuencias de aminoácidos (también referidas en la presente como "secuencia de aminoácidos (s) de la invención", "compuesto (s) de la invención", "constructo (s) de la invención" y "polipéptido ( s) de la invención", respectivamente) .
La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos (también referidas en la presente como "ácido (s) nucleico (s) de la invención" o "secuencia (s) de nucleótido (s) de la invención") ; a métodos para la preparación de tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos; a células hospederas que expresan o pueden expresar tales secuencias de aminoácidos o polipéptidos; a composiciones, y en particular a composiciones farmacéuticas, que comprenden tales secuencias de aminoácidos, polipéptidos, compuestos o constructos, ácidos nucleicos y/o células hospederas; y a usos de tales secuencias de aminoácidos, polipéptidos, compuestos o constructos, ácidos nucleicos, células hospederas y/o composiciones, en particular para propósitos terapéuticos y/o profilácticos, tales como los propósitos profilácticos y/o terapéuticos aqui mencionados.
Otros aspectos, modalidades, ventajas y aplicaciones de la invención estarán claros a partir de la descripción adicional en la presente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El virus sincitial respiratorio humano (hRSV por sus siglas en inglés) es un miembro de la familia del Paramyxoviridae y es un virus con envolvente con dos glicoproteinas de superficie principales que hacen los picos de la partícula del virus. Una de estas glicoproteinas (proteína G) es la proteína de unión que media el enlace del virus a la superficie celular. La otra glicoproteína (proteína F o de fusión) media la fusión de las membranas celulares y virales, lo que permite la entrada de la nucleocápside viral dentro del citoplasma de la célula. La inhibición de las etapas mediadas ya sea por las glicoproteinas G o F bloquea las etapas iniciales del ciclo infeccioso y neutraliza la infectividad del virus. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos contra ya sea G o F, y los cuales inhiban sus actividades respectivas, pueden neutralizar la infectividad del virus y pueden proteger contra una infección por hRSV. La proteina F está altamente conservada y forma picos triméricos que se someten a cambios en la conformación con la activación.
El hRSV es la causa principal de infecciones severas del tracto respiratorio inferior (bronquiolitis y neumonía) en recién nacidos y en niños muy jóvenes y provoca epidemias anuales durante los meses del invierno. El virus también provoca una carga sustancial de enfermedad entre los ancianos y adultos con trastornos cardiopulmonares subyacentes y/o condiciones de inmunosupresión, que están también en riesgo de una enfermedad severa por hRSV. La respuesta inmunitaria no evita las re-infecciones.
No hay ninguna vacuna disponible para impedir las infecciones por hRSV. El único producto de fármaco disponible en el mercado es un anticuerpo monoclonal humanizado (Synagis®) dirigido contra una de las glicoproteínas virales (proteína F) que se usa profilácticamente en niños que están en muy alto riesgo de padecer una infección severa por hRSV. El uso restringido de Synagis® se debe, al menos en parte, al costo elevado de este producto. Existe claramente una necesidad de agentes profilácticos y/o terapéuticos mejorados y/o más baratos para la prevención y/o tratamiento de infecciones por hRSV.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona secuencias de aminoácidos (también referidas como "secuencia (s) de aminoácidos ( s ) de la invención"), polipéptidos (también referidos como "polipéptido ( s ) de la invención") y compuestos y composiciones terapéuticas que se dirigen contra la proteina F de hRSV y que tienen propiedades profilácticas, terapéuticas y/o farmacológicas mejoradas, además de otras propiedades ventajosas (tales como, por ejemplo, facilidad mejorada de preparación y/o costos reducidos de bienes), en comparación con las secuencias de aminoácidos y anticuerpos del arte previo. Estas propiedades ventajosas y mejoradas se harán claras a partir de la descripción adicional en la presente. Sin ser limitante, las secuencias de aminoácidos, polipéptidos y compuestos y composiciones terapéuticas suministradas por la invención pueden mostrar una estabilidad mejorada, menor inmunogenicidad, enlace mejorado a proteina F de hRSV, afinidad mejorada y/o avidez para la proteina F de hRSV, eficiencia mejorada y/o potencia para neutralizar hRSV (como se define en la presente)-, una selectividad creciente para la proteina F de hRSV y/o pueden ser capaces de bloquear parcialmente o preferiblemente de forma total la interacción de proteina F de hRSV con la célula hospedera objetivo y/o su membrana. Pueden neutralizar hRSV al modular, inhibir y/o prevenir la infectividad de hRSV, al modular, inhibir y/o prevenir la fusión de hRSV con (la membrana celular de) la célula hospedera objetivo, y/o al modular, inhibir y/o evitar la entrada de hRSV en la célula hospedera objetivo (como se define en la presente) . Pueden presentar reacción cruzada con y/o pueden neutralizar cepas diferentes de hRSV y/o mutantes de escape diferentes de hRSV.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona diversas extensiones de residuos de aminoácidos (como se definen en la presente) que son particularmente adecuadas para enlace a un epitopo especifico sobre proteina F de hRSV. Estas extensiones de residuos de aminoácidos pueden estar presentes en, y/o pueden incorporarse dentro de, una secuencia de aminoácidos de la invención, en particular en una forma tal que formen (parte de) el sitio de enlace al antigeno de la secuencia de aminoácidos de la invención. Las secuencias de aminoácidos resultantes podrán enlazar un epitopo especifico sobre la proteina F de hRSV que se encuentra en, forma parte de, o se traslapa con (es decir, en la estructura primaria o terciaria) o está en proximidad cercana con (es decir, en la estructura primaria o terciaria) el sitio antigénico II sobre la proteina F de hRSV (es decir, residuos de aminoácidos 250-275 de proteina F de hRSV) .
Consecuentemente, en un aspecto, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En un aspecto preferido, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos que comprenden dos o más extensiones de residuos de aminoácidos en las cuales una extensión es elegida de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una extensión se escoge de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
tal que la extensión de residuos de aminoácidos que corresponde a uno de a) , y b) debería estar siempre presente en la secuencia de aminoácidos de la invención y tal que la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge de uno de c) , d) , e) y f) .
Incluso más preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de la invención comprenden tres o más extensiones de residuos de aminoácidos, en lo cual la primera extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia He plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos; o
la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 102;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos¦ sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y la tercera extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Secuencias de aminoácidos que comprenden una o más de estas extensiones especificas de residuos de aminoácidos han demostrado propiedades mejoradas tales como por ejemplo, características mejoradas de enlace (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente), afinidad mejorada y/o avidez mejorada para la proteína F de hRSV y/o eficiencia mejorada y/o potencia para neutralizar hRSV.
La secuencia de aminoácidos de la invención puede ser en particular un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio) , un anticuerpo de dominio sencillo (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio sencillo) , un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un dAb) o un Nanobody® (como se definen en la presente, e incluyendo pero no limitado a una secuencia VHH) ; otros dominios de variable sencilla, o cualquier fragmento adecuado de cualesquiera de los mismos.
A este respecto, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden consistir esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en lo cual CDR2 se escoge de:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Estas regiones determinantes de la complementariedad preferidas (secuencias CDR2) son también referidas como "CDR2(s) de la invención".
Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden consistir esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4 , respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente) , en lo cual CDR2 se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 102; o
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una de CDRl o CDR3 se escoge de:
CDRl elegida del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos; o y/o
CDR3 elegida del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121; o
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una . afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Incluso más preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden consistir esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR , respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en lo cual:
CDR1 se escoge del grupo que consiste de: a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y
CDR2 se escoge del grupo que consiste de: c) SEQ ID NO: 102; o
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y
CDR3 se escoge del grupo que consiste de: e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En un aspecto específico, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención comprende al menos SEQ ID NO: 102. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención comprende SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 121.
La presente invención también proporciona diversas secuencias humanizadas de aminoácidos que son particularmente adecuadas para enlazar proteina F de hRSV. Las secuencias de aminoácidos de la presente invención muestran inmunogenicidad reducida con la administración a un sujeto humano. Además, las secuencias de aminoácidos de la presente invención muestran otras propiedades mejoradas tales como por ejemplo, características mejoradas de enlace (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactivr o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) para la proteína F de hRSV, afinidad mejorada y/o avidez mejorada para la proteína F de hRSV y/o eficiencia mejorada y/o potencia para neutralizar hRSV en comparación con sus correspondientes secuencias de aminoácidos de tipo natural (como se describe en la solicitud PCT PCT/EP2009/056975 titulada "Secuencias de aminoácidos dirigidas contra proteínas de envolvente de un virus y polipéptidos que comprenden las mismas para el tratamiento de enfermedades víricas" presentada por Ablynx N.V el 5 de junio de 2009) .
Consecuentemente, en otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de RSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 60-76.
En otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de abat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Las secuencias de aminoácidos preferidas de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76.
En otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 146-153.
En otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
- SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se. mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos preferidas de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
La presente invención proporciona diversas secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® optimizados en la secuencia que muestran una estabilidad creciente con el almacenamiento durante estudios de estabilidad y que son particularmente adecuadas para enlazar proteina F de hRSV. Las secuencias de aminoácidos de la presente invención muestran modificación post-traduccional reducida al piroglutamato del N-terminal y tienen así una estabilidad aumentada de producto. Además, las secuencias de aminoácidos de la presente invención muestran otras propiedades mejoradas tales como por ejemplo, menor inmunogenicidad, características mejoradas de enlace (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) para la proteína F de hRSV, afinidad mejorada y/o avidez mejorada para la proteína F de hRSV y/o eficiencia mejorada y/o potencia para neutralizar hRSV en comparación con sus correspondientes secuencias de aminoácidos precursoras (como se describe en la solicitud PCT PCT/EP2009/056975 titulada "Secuencias de aminoácidos dirigidas contra proteínas de envolvente de un virus y polipéptidos que comprende las mismas para el tratamiento de enfermedades víricas" presentada por Ablynx N.V el 5 de junio de 2009).
Consecuentemente, en un aspecto de la presente invención, se proporcionan secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
Las secuencias de aminoácidos y Nanobodies® proporcionadas por la invención están preferiblemente en forma esencialmente aislada (como se definen en la presente) , o forman parte de una proteina o polipéptido de la invención (también referidas como "polipéptido de la invención" o "protein de la invención"), los cuales pueden comprender o consistir esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de la invención y los cuales pueden opcionalmente además comprender una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies® adicionales (todas opcionalmente ligadas por medio de una o más ligaduras adecuadas) .
Consecuentemente, en otro aspecto, la invención también se refiere a una proteina o polipéptido (también referida en la presente como un "polipéptido de la invención", respectivamente) que comprende o consiste esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención (o fragmentos adecuados de las mismas)
Por ejemplo, y sin limitación, la una o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención se pueden usar como una unidad de enlace en tal proteina o polipéptido, de manera de suministrar un polipéptido monovalente, multivalente o multiparatópico de la invención, respectivamente, todos como se describen en la presente. La presente invención asi también se refiere a un polipéptido el cual es un constructo monovalente que comprende o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos o un Nanobody® de la invención. La presente invención asi también se refiere a un polipéptido el cual es un polipéptido multivalente, tales como por ejemplo, un polipéptido bivalente o trivalente. La presente invención también se refiere a un polipéptido el cual es un polipéptido multiparatópico, tales como por ejemplo, un polipéptido bisparatópico o triparatópico .
En un aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención (como se describe anteriormente) .
En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de secuencias de aminoácidos que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente , preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de secuencias de aminoácidos que comprenden dos o más extensiones de residuos de aminoácidos en lo cual una extensión es elegida de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una extensión se escoge de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
tal que la extensión de residuos de aminoácidos que corresponde a uno de a) , y b) debería estar siempre presente en la secuencia de aminoácidos que forma parte del polipéptido multivalente y tal que la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge de uno de c) , d) , e) y f ) .
Los polipéptidos multivalentes preferidos (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de secuencias de aminoácidos que comprenden tres o más extensiones de residuos de aminoácidos, en lo cual la primera extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos; o
la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 102;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y la tercera extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que consisten esencialmente de 4 regiones de armazón ( FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en lo cual CDR2 se^escoge de:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que consisten esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente) , en lo cual CDR2 se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 102; o
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos uno de CDRl o CDR3 se escoge de:
CDRl elegida del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos; o y/o
CDR3 elegida del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121; o
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Preferiblemente, los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que consisten esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4 , respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en lo cual:
CDR1 se escoge del grupo que consiste de: a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando . se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y
CDR2 se escoge del grupo que consiste de: c) SEQ ID NO: 102; o
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y
CDR3 se escoge del grupo que consiste de: e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En un aspecto especifico, los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102, preferiblemente que comprenden SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 121.
En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente , preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de las SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos dos idénticas secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 60-76.
En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos dos idénticas secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 65 y 76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 60-76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos tres idénticas secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 65 y 76.
Un polipéptido multivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® con SEQ ID NO: 62. Otro polipéptido multivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® con SEQ ID NO: 65. Otro polipéptido multivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® con SEQ ID NO: 76.
En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 146-153.
En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con:
- SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la. numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 146-153.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de abat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® elegidos del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención es un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody elegidas del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO's: 77-79 y 158;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 77-79 y 158, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® comprendida en dicho polipéptido tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78, una Arginina (Arg, R) en la posición 83 y/o un Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos trivalentes preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 77-79 y 158.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO' s: 78 y 79;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 78 y 79, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78, una Arginina (Arg, R) en la posición 83 y/o a Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos trivalentes preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 78 o 79.
En otro aspecto especifico, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77. En otro aspecto especifico, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78. En otro aspecto especifico, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. En otro aspecto especifico, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO's: 159-161;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 159-161, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
iii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos trivalentes preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 159-161.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO' s: 159-161;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 159-161, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arqínina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando el polipéptido tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con:
SEQ ID NO: 159, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 160, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 161, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos trivalentes preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 159-161.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO's: 142-145 y 162-165;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 142-145 y 162-165, con la condición de que:
i) la primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Polipéptidos trivalentes preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 142-145 y 162-165.
Polipéptidos con estas secuencias muestran propiedades ventajosas para uso como agentes farmacológicamente activos, profilácticos y/o terapéuticos tales como por ejemplo, estabilidad mejorada, menor inmunogenicidad, características mejoradas de enlace (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor K¾ (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) , afinidad mejorada y/o avidez mejorada para la proteína F de hRSV y/o eficiencia mejorada y/o potencia para neutralizar hRSV.
La invención además se refiere a compuestos o constructos, y en particular proteínas o polipéptidos (también referidos en la presente como un "compuesto (s) de la invención") que comprenden o consisten esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y/o polipéptidos de la invención (o fragmentos adecuados de las mismas) , y opcionalmente además comprenden uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace. Como se volverán claras para la persona experta a partir de la descripción adicional en la presente, tales grupos, residuos, porciones, unidades de enlace o secuencias de aminoácidos adicionales pueden o no suministrar funcionalidad adicional a la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención (y/o al compuesto o constructo en el cual está presente) y pueden o no modificar las propiedades de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® y/o polipéptido de la invención .
También está dentro del alcance de la invención el uso de partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados de las secuencias de aminoácidos y/o polipéptidos de la invención, y/o usar proteínas o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente de una o más de tales partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados, con tal de que estos sean adecuados para los usos aquí vislumbrados. Tales partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados contendrán usualmente (al menos parte de) un sitio funcional de enlace a antigeno para enlazar contra el sitio antigénico II sobre la proteina F de hRSV; y más preferiblemente podrán enlazar específicamente al sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV, e incluso más preferiblemente capaces de enlazar al sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV con una afinidad (convenientemente medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kacti y/o una velocidad kinac iví o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) que es como se definen en la presente. Tales partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados tendrán también usualmente una eficacia y/o potencia de neutralización para hRSV como se definen en la presente. Algunos ejemplos no limitativos de tales partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos, derivados, proteínas y/o polipéptidos estarán claros a partir de la descripción adicional en la presente. Fragmentos o polipéptidos adicionales de la invención también pueden ser proporcionados al combinar adecuadamente (es decir, por ligadura o fusión genética) uno o más partes o fragmentos (más pequeños) como se describe en la presente.
La invención también se refiere a ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody® de la invención y/o un polipéptido de la invención (o un fragmento adecuado de los mismos) . Tal ácido nucleico también se referirá en la presente como "ácido (s) nucleico (s) de la invención" y puede estar por ejemplo en la forma de un constructo genético, como se describe además en la presente. Consecuentemente, la presente invención también se refiere a una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que está en la forma de un constructo genético.
La invención además se refiere a un hospedero o célula hospedera que expresa (o que bajo circunstancias adecuadas puedeexpresar) una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody® de la invención, un polipéptido de la invención y/o un compuesto o constructo de la invención; y/o que contiene un ácido nucleico de la invención. Algunos ejemplos preferidos pero no limitativos de tales hospederos o células hospederas estarán claros a partir de la descripción adicional en la presente.
La invención además se refiere a un producto o composición que contiene o que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de la invención (o un fragmento adecuado de la misma) , al menos un Nanobody® de la invención, al menos un polipéptido de la invención, al menos un compuesto o constructo de la invención, al menos un constructo monovalente de la invención y/o al menos un ácido nucleico de la invención, y opcionalmente un o más componentes adicionales de tales composiciones conocidos per se, es decir, dependiendo del uso pretendido de la composición. Tal producto o composición puede ser por ejemplo una composición farmacéutica (como se describe en la presente) o una composición veterinaria. Algunos ejemplos preferidos pero no limitativos de tales productos o composiciones estarán claros a partir de la descripción adicional en la presente.
La invención además se refiere a métodos para preparar las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, ácidos nucleicos, células . hospederas, productos y composiciones descritos en la presente.
La invención además se refiere a aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos, ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritos en la presente, asi como a métodos para la prevención y/o tratamiento de infección del tracto respiratorio provocada por hRSV. Algunas aplicaciones y usos preferidos pero no limitativos estarán claros a partir de la descripción adicional en la presente.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos , compuestos y composiciones de la presente invención pueden usarse en general para bloquear la interacción de proteina F de hRSV con la célula hospedera objetivo y/o su membrana, para neutralizar hRSV (diferentes cepas y/o mutantes de escape de hRSV) , para modular, inhibir y/o evitar la infectividad de hRSV (de diferentes cepas y/o mutantes de escape de hRSV) , para modular, inhibir y/o prevenir la fusión (de diferentes cepas y/o mutantes de escape de hRSV) con (la membrana celular de) la célula hospedera objetivo y/o para modular, inhibir y/o prevenir la entrada de hRSV en la célula hospedera objetivo (de diferentes cepas y/o mutantes de escape de hRSV) .
Como tales, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos y composiciones de la presente invención se pueden usar para la prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con infección por hRSV. Ejemplos de tales enfermedades y trastornos asociados con infección por hRSV serán claros para la persona experta con base en la descripción en la presente, y por ejemplo incluyen las siguientes enfermedades y trastornos: enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y asma .
Consecuentemente, la presente invención también se refiere a un método para la prevención y/o tratamiento de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y/o asma provocada por hRSV, dicho método que comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una secuencia de aminoácidos de la invención, Nanobody® de la invención, polipéptido de la invención, compuesto o constructo de la invención o constructo monovalente de la invención, o una composición de la invención.
La invención también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody® de la invención, un polipéptido de la invención, un compuesto o constructo de la invención o un constructo monovalente de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vias respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y/o asma; y/o para uso en uno o más de los métodos descritos en la presente.
La invención también se refiere a una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody® de la invención, un polipéptido de la invención, un compuesto o constructo de la invención o constructo monovalente de la invención para prevención y/o tratamiento de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y/o asma.
Otras aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos y compuestos y composiciones de la invención se volverán claras para la persona experta a partir de la descripción adicional en la presente .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1: CELISA de Competencia: Fab Synagis® compite con Nanobodies® de enlace RSV purificados y Fab Numax para enlazar a la proteína FTM como se describe en Ejemplo 8. El Nanobody® 202A5 es HA de enlace a Nanobody® irrelevante de influenza.
Fig. 2: Enlace de Nanobodies® monovalentes, bivalentes y trivalentes a la proteina FTM como se describe en Ejemplo 10.
Figs. 3A y 3B: Potencia (neutralización RSV) de constructos monovalentes, bivalentes y trivalentes para neutralizar cepas Larga y B-1 RSV como se describe en Ejemplo 11.
Fig. 4A-4G: Ensayo de neutralización de RSV Larga y los mutantes de escape R7C2/1; R7C2/11 y R7.936/4 por los Nanobodies® monovalentes 7B2 (4A), 15H8, (4B) NC41 (4C) en un intervalo de concentración desde alrededor de 2 µ? a 6 nM y los Nanobodies® trivalentes RSV 400 (4D), RSV404 (4E), RSV 407 (4F) y RSV 403 (4G) en un intervalo de concentración de alrededor de 20 nM a 100 pM. El ajuste de la curva de hizo solamente para los datos de los Nanobodies® monovalentes.
Fig. 5: Neutralización de cepas RSV Larga y RSV B-1 por el Nanobody® trivalente NC41 con diferentes longitudes de ligadura como se describe en Ejemplo 15.
Fig. 6: Vista esquemática de los residuos humanizados introducidos en variantes seleccionadas de NC41. Los puntos indican la presencia del residuo de tipo natural; las letras corresponden al residuo humanizado. La numeración es de acuerdo con Kabat.
Fig. 7: Alineación de secuencias de Nanobody® humanizado preferidas de la invención.
Fig. 8A-8B: Neutralización de cepa hRSV Larga y cepa B-l por variantes monovalentes y trivalentes humanizadas de NC41. En la Figura 8A, la neutralización por dos de las variantes trivalentes humanizadas NC41 (RSV414 y RSV426) se compara con sus correspondientes Nanobodies® monovalentes. La Figura 8B muestra la neutralización por las variantes trivalentes NC41 (RSV414, RSV426 y RSV427).
Fig. 9A-9B: Neutralización de cepas hRSV Larga (9A) y B- 1 (9B) por RSV407 y RSV434.
Fig. 10: Prueba de Eficacia (profiláctica) de RSV407 en modelo de rata del algodón como se describe en Ejemplo 21. Se administraron intranasalmente las ratas con diversas concentraciones de RSV407 (día -1) 24 horas previo a la infección por RSV (día 0) . La concentración del virus (izquierda, media ± sem, n=6) y el nivel viral del RNA (derecha) se determinó en lavados de pulmón al nivel pico de viremia, siendo el día 4 después de la infección (*= P<0.05 en dos pruebas de cola t de Student contra los sin tratar) .
Fig. 11A-11B: Prueba de Eficacia (terapéutica) de RSV434 en modelo de rata del algodón como se describe en Ejemplo 21. Se infectaron las ratas con RSV el día 0 y se trataron con 0, 1, 2, 4 o 20 mg/kg de RSV434 al dia 2 y 3 por instilación intranasal (n=6) . La concentración del virus en lavados nasales (11A) y de pulmón (11B) se determinó al nivel pico de viremia (dia 4 después de la infección) . Las líneas horizontals muestran los limites de detección.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En la presente descripción, ejemplos y reivindicaciones: a) A menos que se indique o se defina de otra manera, todos los términos usados tienen su significado usual en la técnica, el cual estará claro para la persona experta. Se hace referencia por ejemplo a los manuales estándar mencionados en el párrafo a) en la página 46 de WO 08/020079. b) A menos que se indique de otra manera, los términos "secuencia de inmunoglobulinas" , "secuencia", "secuencia de nucleótidos" y "ácido nucleico" son como se describen en el párrafo b) en la página 46 de WO 08/020079.
c) A menos que se indique de otra manera, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describan específicamente en detalle, se pueden efectuar y se han efectuado en una forma conocida per se, como estará claro para la persona experta. Se hace referencia por ejemplo nuevamente a los manuales estándar y al arte general de antecedentes aquí mencionado y a las referencias adicionales allí citadas; así como a por ejemplo las siguientes revisiones Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6) : 640-56; Levin y Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43, las cuales describen técnicas para ingeniería de proteínas, tales como maduración por afinidad y otras técnicas para mejorar la especificidad y otras propiedades deseadas de proteínas tales como inmunoglobulinas .
d) Los residuos de aminoácidos se indicar'na de acuerdo con el código de aminoácidos estándar de tres letras o de una letra. Se hace referencia a la Tabla A-2 en la página 48 de WO 08/020079.
e) Cuando una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos se dice que "comprende" otra secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente, o a "consisten esencialmente de" otra secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, esta tiene el significado dado en el párrafo i) en páginas 51-52 de WO 08/020079.
f) El término "en forma esencialmente aislada" tiene el significado que se le da en el párrafo j) en páginas 52 y 53 de WO 08/020079.
g) Los términos "dominio" y "dominio de enlace" tienen los significados dados a ello el párrafo k) en la página 53 de WO 08/020079.
h) Los términos "determinante antigénico" y "epitopo", los cuales se pueden usar intercambiablemente en la presente, tienen los significados dados a ello en el párrafo 1) en la página 53 de WO 08/020079.
i) Como además se describe en el párrafo m) en la página 53 de WO 08/020079, una secuencia de aminoácidos (tal como un Nanobody®, un anticuerpo, un polipéptido de la invención, o en general una proteina de enlace a antigenos o polipéptido o un fragmento de la misma) que puede enlazar (específicamente) a, que tiene afinidad para y/o que tiene especificidad para un determinante antigénico, epitopo, antígeno o proteína específico (o para al menos una parte, fragmento o epitopo del mismo) se dice que es "contra" o "dirigido contra" dicho determinante antigénico, epitopo, antígeno o proteína.
j) El término "especificidad" tiene el significado que se le da en el párrafo n) en las páginas 53-56 de WO 08/020079; y como allí se menciona se refiere al número de tipos diferentes de antígenos o determinantes antigénicos a los cuales puede enlazar una molécula particular de enlace a antígeno o una molécula de proteína de enlace a antígeno (tales como un Nanobody® o un polipéptido de la invención) . La especificidad de una proteina de enlace a antigenos se puede determinar con base en la afinidad y/o avidez, como se describe en las páginas 53-56 de WO 08/020079 (incorporadas en la presente como referencia) , las cuales también describen algunas técnicas preferidas para medir el enlace entre una molécula de enlace a antigenos (tales como un Nanobody® o polipéptido de la invención) y el antigeno pertinente. Típicamente, las proteínas de enlace a antígenos (tales como las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y/o polipéptidos de la invención) se enlazarán a su antígeno con una constante de disociación (KD) de 10"5 a 10"12 moles/litro o menos, y preferiblemente 10~7 a 10"12 moles/litro o menos y más preferiblemente 10"8 a 10~12 moles/litro (es decir, con una constante de asociación (KA) de 105 a 1012 litro/ moles o más, y preferiblemente 107 a 1012 litro/moles o más y más preferiblemente 108 a 1012 litro/moles) . Cualquier valor KD mayor de 104 mol/litro (o cualquier valor de KA menor de 104 M"1) litros/mol es en general considerado para indicar el enlace no específico. Preferiblemente, una secuencia de inmunoglobulinas monovalente de la invención se enlazará al antígeno deseado con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tales como por ejemplo, entre 10 y 5 nM. El enlace especifico de una proteina de enlace a antigenos a un antigeno o determinante antigénico se puede determinar en cualquier manera adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, análisis Scatchard y/o ensayos de enlace competitivo, tales como radioinmunooensayos (RIA) , inmunoensayos de enzimas (EIA) y ensayos de competencia intercalados, y las variantes diferentes de los mismos conocidas per se en la técnica; asi como las otras técnicas aquí mencionadas. Como estará claro para la persona experta, y como se describe en las páginas 53-56 de WO 08/020079, la constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente. Los métodos para determinar la constante de disociación estarán claros para la persona experta, y por ejemplo incluyen las técnicas mencionadas en las páginas 53-56 de WO 08/020079.
k) La vida media de una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido de la invención se puede definir en general como se describe en el párrafo o) en la página 57 de WO 08/020079 y como se menciona allí se refiere al tiempo que toma la concentración en suero de la secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido para reducirse en 50%, en vivo, por ejemplo debido a la degradación de la secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido y/o depuración o secuestro de la secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido por mecanismos naturales. La vida media in vivo de una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido de la invención se puede determinar en cualquier manera conocida per se, tales como por análisis farmacocinético . Las técnicas adecuadas estarán claras para la persona experta en la técnica, y pueden ser por ejemplo en general como se describe en el párrafo o) en la página 57 de WO 08/020079. Como también se menciona en el párrafo o) en la página 57 de WO 08/020079, la vida media se puede expresar al usar parámetros tales como el tl/2-alfa, tl/2-beta y el área bajo la curva (AUC) . Se hace referencia por ejemplo a la Parte
Experimental a continuación, así como a los manuales estándar, tales como Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals : A Handbook for Pharmacists y Peters et al, Análisis farmacocinético : A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics" , Gibaldi y D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2nd Rev. , edición (1982). Los términos "incremento en la vida media" o "vida media incrementada" como también son definidas en el párrafo o) en la página 57 de WO 08/020079 y en particular se refiere a un incremento en la tl/2-beta, ya sea con o sin un incremento en el tl/2-alfa y/o la AUC o ambos.
1) Con respect a un objetivo o antígeno, el término "sitio de interacción" en el objetivo o antígeno significa un sitio, epitopo, determinante antigénico, parte, dominio o extensión de residuos de aminoácidos en el objetivo o antigeno que es un sitio para enlazar a un receptor u otro compañero de enlace, un sitio catalítico, un sitio de escisión, un sitio para interacción alostérica, un sitio involucrado en la multimerización (tal como homomerización o heterodimerización) del objetivo o antígeno; o cualquier otro sitio, epitopo, determinante antigénico, parte, dominio o extensión de residuos de aminoácidos sobre el objetivo o antígeno que se involucra en una acción o mecanismo biológico del objetivo o antígeno. Más en general, un "sitio de interacción" puede ser cualquier sitio, epitopo, determinante antigénico, parte, dominio o extensión de residuos de aminoácidos sobre el objetivo o antígeno al cual una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la invención puede enlazar tal que el objetivo o antígeno (y/o cualquier trayectoria, interacción, señalización, mecanismo biológico o efecto biológico en lo cual el objetivo o antígeno está involucrado) se modula (como se definen en la presente) .
m) Una secuencia de aminoácidos o polipéptido se dice que es "específica para" un primer objetivo o antígeno en comparación con un segundo objetivo o antígeno cuando se enlaza a un primer antígeno con una afinidad (como se describe anteriormente, y expresado adecuadamente como un valor KD, valor KA, velocidad Kinacti y/o velocidad Kactiv) que es al menos 10 veces, tales como al menos 100 veces, y preferiblemente al menos 1000 veces, y hasta 10000 veces o más mejor que la afinidad con la cual dicha secuencia de aminoácidos o polipéptido se enlaza al segundo objetivo o antigeno. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos o polipéptido puede enlazar al primer objetivo o antigeno con un valor KD que es al menos 10 veces menor, tal como al menos 100 veces menor, y preferiblemente al menos 1000 veces menor, tales como 10,000 veces menor o incluso menor de eso, que la KD con la cual dichasecuencia de aminoácidos o polipéptido enlaza al segundo objetivo o antigeno. Preferiblemente, cuando una secuencia de aminoácidos o polipéptido es "especifica para" un primer objetivo o antigeno comparado con un segundo objetivo o antigeno, se dirige contra (como se definen en la presente) dicho primer objetivo o antigeno, pero no se dirige contra dicho segundo objetivo o antigeno. n) Los términos "bloque (cruzado)", "bloqueo (cruzado)" y "bloquear (cruzado)" se usan intercambiablemente en la presente para significar la capacidad de una secuencia de aminoácidos u otro agente de enlace (tal como un polipéptido de la invención) para interferir con el enlace de otras secuencias de aminoácidos o agentes de enlace de la invención a un obetivo dado. El grado al cual una secuencia de aminoácidos u otros agentes de enlace de la invención pueden interferir con el enlace de otro al objetivo, y por lo tanto si se puede decir que bloquean de forma cruzada de acuerdo con la invención, se puede determinar al usar ensayos de enlace de competencia. Un ensayo cuantitativo de bloqueo cruzado particularmente adecuado usa una máquina Biacore la cual puede medir el grado de las interacciones al usar tecnología de resonancia de plasmón de superficie. Otro ensayo cuantitativo de bloqueo cruzado adecuado usa un método basado en ELISA para medir la competencia entre secuencias de aminoácidos u otros agentes de enlace en término de su enlace al objetivo.
Lo siguiente describe en general un ensayo Biacore adecuado para determinar si una secuencia de aminoácidos u otro agente de . enlace bloquea de forma cruzada o puede bloquear de forma cruzada de acuerdo con la invención. Se apreciará que el ensayo se puede usar con cualquiera de las secuencias de aminoácidos u otros agentes de enlace descritos en la presente. La máquina Biacore (por ejemplo la Biacore 3000) se opera en línea con las recomendaciones del fabricante. Así en un ensayo de bloqueo cruzado, la proteína objetivo se acopla con un chip CM5 Biacore al usar química de acoplamiento estándar de aminas para generar una superficie que esté recubierta con el objetivo. Típicamente, 200-800 unidades de resonancia del objetivo se acoplarían con el chip (una cantidad que da niveles de enlace que se miden fácilmente pero que se satura fácilmente por las concentraciones del reactivo de prueba que se usa) . Dos secuencias de aminoácidos de prueba (denominadas A* y B*) a evaluarse por su capacidad para bloquear de forma cruzada una con la otra se mezclan en una relación molar uno a uno de sitios de enlace en una solución amortiguadora adecuada para crear la mezcla de prueba. Cuando se calculan las concentraciones sobre una base de sitio de enlace, el peso molecular de una secuencia de aminoácidos se asume que sea el peso molecular total de la secuencia de aminoácidos dividido entre el número de sitios de enlace objetivo en esa secuencia de aminoácidos. La concentración de cada secuencia de aminoácidos en la mezcla de prueba debe ser los suficientemente alta para saturar fácilmente los sitios de enlace para esa secuencia de aminoácidos sobre las moléculas objetivo capturadas en el chip Biacore. Las secuencias de aminoácidos en la mezcla están a la misma concentración molar (sobre una base de enlace) y esa concentración típicamente estaría entre 1.00 y 1.5 micromolar (sobre una base de sitio de enlace) . Las soluciones separadas que contienen A* solo y B* solo también se preparan. A* y B* en estas soluciones deberían estar en la misma solución amortiguadora y a la misma concentración como en la mezcla de prueba. La mezcla de prueba se pasa sobre el chip Biacore recubierto con el objetivo y la cantidad total de enlace registrada. El chip luego se trata en una forma tal como para retirar las secuencias de aminoácidos enlazadas sin dañar el objetivo de enlace al chip. Típicamente esto se hace al tratar el chip con HC1 30 mM durante 60 segundos. La solución de A* sola luego se pasa sobre la superficie recubierta en el objetivo y la cantidad de enlace registrada. El chip se trata nuevamente para retirar todas las secuencias de aminoácidos enlazadas sin dañar el objetivo enlazado al chip. La solución de B* sola luego se pasa encima de la superficie recubierta con el objetivo y la cantidad de enlace registrada. El enlace máximo teórico de la mezcla de A* y B* se calcula a continuación, y es la suma del enlace de cada secuencia de aminoácidos cuando se pasa encima de la superficie objetivo sola. Si el enlace registrado real de la mezcla es menor de este máximo teórico, luego las dos secuencias de aminoácidos se bloquean de forma cruzada una con la otra. Así, en general, una secuencia de aminoácidos de bloqueo cruzado u otro agente de enlace de acuerdo con la invención es uno el cual se enlazará al obetivo en el ensayo de bloqueo cruzado Biacore anterior tal que durante el ensayo y en la presencia de una segunda secuencia de aminoácidos u otro agente de enlace de la invención el enlace registrado está entre 80% y 0.1% (por ejemplo, 80% a 4%) del enlace máximo teórico, específicamente entre 75% y 0.1% (por ejemplo, 75% a 4%) del enlace máximo teórico, y más específicamente entre 70% y 0.1% (por ejemplo, 70% a 4%) de enlace máximo teórico (como se definió apenas arriba) de las dos secuencias de aminoácidos o agentes de enlace en combinación. El ensayo Biacore descrito anteriormente es un ensayo primario usado para determinar si las secuencias de aminoácidos u otros agentes de enlace se bloquean de forma cruzada uno con el otro de acuerdo con la invención. En raras ocasiones, las secuencias de aminoácidos en particular u otros agentes de enlace pueden no enlazarse a un objetivo acoplado por medio de la química de aminas a un chip CM5 Biacore (esto se presenta usualmente cuando el sitio de enlace relevante en el objetivo se oculta o se destruye por el acoplamiento al chip) . En tales cases el bloqueo cruzado se puede determinar al usar una versión etiquetada del objetivo, por ejemplo una versión etiquetada en His en el N-terminal. En este formato en particular, una secuencia de aminoácidos anti-His se acoplaría al chip Biacore y luego el objetivo etiquetado con His pasaría encima de la superficie del chip y se captura por la secuencia de aminoácidos anti-His. El análisis de bloqueo cruzado se llevaría a cabo esencialmente como se describe anteriormente, excepto que después de cada ciclo de regeneración del chip, se cargaría de nuevo un nuevo objetivo etiquetado con His encima de una superficie recubierta con una secuencia de aminoácidos anti-His. Además del ejemplo dado al usar el objetivo etiquetado con His en el N-terminal, el objetivo etiquetado con His en el C-terminal se podría usar alternativamente. Además, diversas otras etiquetas y combinaciones de proteínas de enlace a etiquetas que se conocen en la técnica podrían usarse para tal análisis de bloque cruzado (por ejemplo, etiqueta HA con anticuerpos anti-HA; etiqueta FLAG con anticuerpos anti-FLAG; etiqueta de biotina con estreptavidina) .
Lo siguiente describe en general un ensayo ELISA para determinar si una secuencia de aminoácidos u otro agente de enlace dirigido contra un objetivo bloquea de forma cruzada o puede bloquear de forma cruzada como se define en la presente. Se apreciará que el ensayo se puede usar con cualquiera de las secuencias de aminoácidos (u otros agentes de enlace tales como polipéptidos de la invención) descritos en la presente. El principio general del ensayo es tener una secuencia de aminoácidos o agente de enlace que se dirige contra el objetivo recubierto encima de los pozos de una placa ELISA. Una cantidad en exceso de una segunda, secuencia de aminoácidos anti-objetivo potencialmente de bloqueo cruzado se agrega en solución (es decir, no se enlaza a la placa ELISA) . Una cantidad limitada del objetivo se agrega luego a los pozos. La secuencia de aminoácidos recubierta y la secuencia de aminoácidos en solución compiten para enlazar el número limitado de moléculas objetivo. La placa se lava para remover el objetivo en exceso que no se ha enlazado por la secuencia de aminoácidos recubierta y para remover también la segunda secuencia de aminoácidos en fase de solución asi como algunos complejos formados entre la segunda secuencia de aminoácidos en fase de solución y el objetivo. La cantidad de objetivo enlazado luego se mide al usar un reactivo que sea apropiado para detectar el objetivo. Una secuencia de aminoácidos en solución que pueda bloquear de forma cruzada la secuencia de aminoácidos recubierta podrá provocar una disminución en el número de moléculas objetivo que la secuencia de aminoácidos recubierta pueda enlazar con relación al número de moléculas objetivo que la secuencia de aminoácidos recubierta pueda enlazar en ausencia de la segunda secuencia de aminoácidos, en fase de solución. En el caso en el que la primera secuencia de aminoácidos, por ejemplo, una Ab-X, se elija para ser la secuencia de aminoácidos inmovilizada, se recubre encima de los pozos de la placa ELISA, después de lo cual las placas se bloquean con una solución de bloqueo adecuada para minimizar el enlace no específico de reactivos que se añaden posteriormente. Una cantidad en exceso de la segunda secuencia de aminoácidos, es decir, Ab-Y, luego se añade a la placa ELISA tal que las moles de los sitios de enlace del objetivo Ab-Y por pozo son al menos 10 veces más altas que las moles de los sitios de enlace del objetivo Ab-X que se usaron, por pozo, durante el recubrimiento de la placa ELISA. Se agrega entonces el objetivo tal que las moles del objetivo agregado por pozo sean al menos 25 veces menores que las moles de sitios de enlace objetivo Ab-X que se usaron para recubrir cada pozo. Después de un period de incubación adecuado, la placa ELISA se lava y se añade un reactive para la detección del objetivo para medir la cantidad de objetivo específicamente enlazado por la secuencia de aminoácidos anti-objetivo recubierta (en este caso Ab-X) . La señal de respaldo para el ensayo se define como la señal obtenida en los pozos con la secuencia de aminoácidos recubierta (en este caso Ab-X) , la segunda secuencia de aminoácidos en fase de solución (en este caso Ab-Y), solamente con solución amortiguadora objetivo (es decir, sin objetivo) y reactivos de detección del objetivo. La señal positiva de control para el ensayo se define como la señal obtenida en los pozos con la secuencia de aminoácidos recubierta (en este caso Ab-X) , la segunda secuencia de aminoácidos en fase de solución solamente con solución amortiguadora (es decir, sin segunda secuencia de aminoácidos en fase de solución) , objetivo y reactivos de detección objetivo. El ensayo ELISA puede correrse en una manera tal que se tenga una señal positiva de control que sea al menos 6 veces la señal de respaldo. Para evitar que algunos artefactos (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para el objetivo) resulten de la elección de cual secuencia de aminoácidos usar como la secuencia de aminoácidos de recubrimiento y cual usar como la segunda (competidora) secuencia de aminoácidos, el ensayo de bloqueo cruzado se puede correr en dos formatos: 1) formato 1 es donde Ab-X es la secuencia de aminoácidos que se recubre encima de la placa ELISA y Ab-Y es la secuencia de aminoácidos competidora que está en solución y 2) formato 2 es donde Ab-Y es la secuencia de aminoácidos que se recubre encima de la placa ELISA y Ab-X es la secuencia de aminoácidos competidora que está en solución. Ab-X y Ab-Y se definen como de bloqueo cruzado si, ya sea en el formato 1 o en el formato 2, la secuencia de aminoácidos anti-objetivo en fase de solución puede provocar una reducción de entre 60% y 100%, específicamente entre 70% y 100%, y más específicamente entre 80% y 100%, de la señal de detección objetivo {es decir, la cantidad de objetivo enlazada por la secuencia de aminoácidos recubierta) en comparación con la señal de detección objetivo obtenida en la ausencia de la secuencia de aminoácidos anti-objetivo en fase de solución (es decir, los pozos de control positivos) .
o) Una secuencia de aminoácidos se dice que es de "reacción cruzada" para dos diferentes antigenos o determinante antigénicos (tales como por ejemplo, albúmina de suero de dos diferentes especies de mamíferos, tales como por ejemplo, albúmina de suero humana y albúmina de suero de cyno, tal como por ejemplo, proteína F de cepas diferentes de hRSV, tal como por ejemplo, proteína F de diferentes mutantes de escape de hRSV) si es específica para (como se define en la presente) ambos de estos diferentes antígenos o determinante antigénicos.
p) Como se describe además en la presente, el número total de residuos de aminoácidos en un Nanobody® puede estar en la región de 110-120, es preferiblemente 112-115, y es lo más preferiblemente 113. Deberá señalarse sin embargo, que las partes, fragmentos, análogos o derivados (como se describe además en la presente) de un Nanobody® no están limitadas particularmente a su longitud y/o tamaño, mientras tales partes, fragmentos, análogos o derivados cubran los requerimientos adicionales señalados en la presente y también sean preferiblemente adecuados para los propósitos descritos en la presente.
q) Como además se describe en el párrafo q) en las páginas 58 y 59 de WO 08/020079 (incorporadas en el presente como referencia) , los residuos de aminoácidos de un Nanobody® se enumeran de acuerdo con la numeración general para los dominios VH dados por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), cuando se aplican a los dominios VHH de los Camélidos en el articulo de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195 (ver por ejemplo Figura 2 de esta publicación) , y consecuentemente FR1 de un Nanobody® comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 1-30, CDR1 de un Nanobody® comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 31-35, FR2 de un Nanobody® comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un Nanobody® comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 50-65, FR3 de un Nanobody® comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 66-94, CDR3 de un Nanobody® comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 95-102, y FR4 de un Nanobody® comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 103-113.
r) En el contexto de la presente invención "célula hospedera objetivo (de un virus)" en general se refiere a una célula en particular, la cual es o se deriva de un sujeto vivo y la cual es susceptible a infección por dicho virus. s) El término "infectividad de un virus", como se usa en la presente, se refiere a la proporción de sujetos vivos, que cuando se exponen a dicho virus, realmente se infectan por dicho virus.
t) El término "neutralización de un virus", como se usa en la presente, se refiere a la modulación y/o reducción y/o prevención y/o inhibición de la infectividad (como se definen en la presente) de un virus por el enlace de un compuesto neutralizante al virión, cuando se mide al usar un ensayo adecuado in vitro, celular o in vivo (tales como por ejemplo, el ensayo de microneutralización descrito por Anderson et al. 1985 (J. Clin. Microbiol. 22: 1050-1052) y 1988 (J. Virol. 62: 4232-4238), modificaciones de estos ensayos tal como por ejemplo, las descritas en el Ejemplo 6; un ensayo de reducción de placas como por ejemplo descrito por Johnson et al. 1997 (J. Inf. Dis. 176: 1215-1224), y modificaciones de los mismos y aquellas allí mencionadas) . En particular, "neutralización de (un virus)" o "neutralizar (un virus)" puede significar ya sea modular, reducir, prevenir o inhibir la infectividad (como se definen en la presente) de un virus cuando se mide al usar un ensayo adecuado in vitro, celular o in vivo (tales como aquellos aquí mencionados) , por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tales como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, en comparación a la infectividad normal (es decir, que se presenta naturalmente) (como se define en la presente) de un virus, en el mismo ensayo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención.
u) El término "potencia de una secuencia de aminoácidos de la invención", "potencia de un Nanobody® de la invención", "potencia de un polipéptido de la invención", y/o "potencia de compuesto o constructo de la invención", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de dicha secuencia de aminoácidos de la invención, Nanobody® de la invención, polipéptido de la invención, y/o compuesto o constructo de la invención para neutralizar un virus en particular (tales como por ejemplo, hRSV) , para modular, inhibir y/o prevenir la infectividad de un virus, para modular, inhibir y/o prevenir la fusión de un virus con (la membrana celular de) la célula hospedera objetivo, y/o para modular, inhibir y/o prevenir la entrada de un virus dentro de la célula hospedera objetivo (como se define en la presente) . La potencia se puede medir por cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica o descrito en la presente, tales como por ejemplo, los ensayos de micro-neutralización como se describen en la sección de Ejemplos y/o los ensayos mencionados en el punto t) anterior.
v) El término "unión de virus", como se usa en la presente, es la unión de un virus (por ejemplo, hRSV) a una célula hospedera objetivo directamente (por ejemplo al interactuar con un receptor viral) o indirectamente (por ejemplo al mediar la interacción de una o más de otras proteínas o moléculas a un receptor viral) .
w) El término "fusión de virus", como se usa en la presente, es la fusión de un virus (por ejemplo, hRSV) a una célula hospedera objetivo directamente (por ejemplo al interactuar con compuestos de membrana de la célula hospedera objetivo) o indirectamente (por ejemplo al mediar la interacción de una o más de otras proteínas o moléculas con compuestos de membrana de la célula hospedera objetivo) .
x) El término "entrada vírica" usado en la presente abarca cualquier trayectoria biológica mediada por virus que se necesita para lograr la unión del virión a una célula hospedera objetivo y/o fusión viral con una célula hospedera obj etivo .
y) Una "extensión de residuos de aminoácidos" significa dos o más residuos de aminoácidos que están adyacentes uno con el otro o en proximidad cercana uno con el otro, es decir, en la estructura primaria o terciaria de la secuencia de aminoácidos. En el contexto de la presente invención, la "extensión de residuos de aminoácidos" será (al menos parcialmente) responsable de enlazar a la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, polipéptido, compuesto o constructo de la invención al sitio antigénico II sobre la proteina F de hRSV.
z) Cuando se comparan dos extensiones de residuos de aminoácidos (o dos secuencias CDR) , el término "diferencia de aminoácidos" se refiere a una inserción, eliminación o sustitución de un residuo sencillo de aminoácidos sobre una posición de la extensión de residuos de aminoácidos (o secuencia CDR) especificada en b) , d) o f ) , en comparación con la extensión de residuos de aminoácidos (o secuencia CDR) de respectivamente a) , c) o e) ; se entiende que la extensión de residuos de aminoácidos (o secuencia CDR) de b) , d) y f) pueden contener una, dos o un máximo de tres tales diferencias de aminoácidos en comparación con la extensión de residuos de aminoácidos de respectivamente a) , c) o e) .
La "diferencia de aminoácidos" puede ser cualquiera de una, dos o un máximo de tres sustituciones, inserciones y/o eliminaciones, o cualquier combinación de los mismos, que ya sea mejore las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención o que al menos no se aleje demasiado de las propiedades deseadas, o del balance o combinación de propiedades deseadas de la secuencia de aminoácidos de la invención. A este respecto, la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debería al menos enlazar a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende la una o más extensiones de residuos de aminoácidos sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, inserciones y/o eliminaciones, dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie; y/o la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debería tener al menos una potencia que es la misma, alrededor de la misma o superior en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende la una o más extensiones de residuos de aminoácidos sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, inserciones y/o eliminaciones. La persona experta en general podrá determinar y seleccionar sustituciones, inserciones y/o eliminaciones adecuadas, o combinaciones adecuadas de las mismas, con base en la descripción en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, lo cual puede por ejemplo involucrar introducir un número limitado de posibles sustituciones, eliminaciones o inserciones y determinar su influencia sobre las propiedades de las secuencias de aminoácidos asi obtenidas.
Por ejemplo, y dependiendo del organismo hospedero usado para expresar la secuencia de aminoácidos de la invención, tales eliminaciones y/o sustituciones se pueden diseñar de tal manera que se retiren uno o más sitios para modificación post-traduccional (tales como uno o más sitios de glicosilación) , como estará dentro de la capacidad de la persona experta en la técnica.
En un aspecto preferido de la invención, la "diferencia de aminoácidos" es una sustitución de aminoácidos. La sustitución de aminoácidos puede ser una, dos o un máximo de tres sustituciones ya sea que mejoren las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención o que al menos no afecten demasiado las propiedades deseadas o el balance o combinación de propiedades deseadas de la secuencia de aminoácidos de la invención. A este respecto, la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debería al menos enlazar a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende la una o más extensiones de residuos de aminoácidos sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie; y/o la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debería tener al menos una potencia que es la misma, alrededor de la misma o superior en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende la una o más extensiones de residuos de aminoácidos sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, inserciones y/o eliminaciones. La persona experta en general podrá determinar y seleccionar sustituciones adecuadas, con base en la descripción en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, que puede involucrar por ejemplo, introducir un número limitado de posibles sustituciones y determinar su influencia en las propiedades de los Nanobodies® así obtenidos.
La sustitución de aminoácidos en la una o más extensiones de residuos de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora. Las sustituciones de aminoácidos "conservadoras" son en general sustituciones de aminoácidos en las cuales un residuo de aminoácidos se reemplaza con otro residuo de aminoácidos de estructura química similar y la cual tiene poca o esencialmente ninguna influencia en la función, actividad u otras propiedades biológicas de la secuencia de aminoácidos resultante. Tales sustituciones conservadoras de aminoácidos son bien conocidas en la técnica, por ejemplo a partir de WO 04/037999, GB-A-3 357 768, WO 98/49185, WO 00/46383 y WO 01/09300; y (preferido) tipos y/o combinaciones de tales sustituciones se pueden seleccionar sobre la base de las enseñanzas pertinentes de WO 04/037999 asi como WO 98/49185 y de las referencias adicionales allí citadas.
Tales sustituciones conservadoras preferiblemente son sustituciones en lo cual un aminoácido dentro de los siguientes grupos (a) - (e) se sustituye por otro residuo de aminoácidos dentro del mismo grupo: (a) residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (b) residuos polares, cargados negativamente y sus amidas (sin carga) : Asp, Asn, Glu y Gln; (c) residuos polares, cargados positivamente: His, Arg y Lys; (d) residuos alifáticos grandes, no polares: Met, Leu, lie, Val y Cys; y (e) residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp.
Las sustituciones conservadoras particularmente preferidas son como siguen: Ala dentro de Gly o dentro de Ser; Arg dentro de Lys; Asn dentro de Gln o dentro de His; Asp dentro de Glu; Cys dentro de Ser; Gln dentro de Asn; Glu dentro de Asp; Gly dentro de Ala o dentro de Pro; His dentro de Asn o dentro de Gln; lie dentro de Leu o dentro de Val; Leu dentro de lie o dentro de Val; Lys dentro de Arg, dentro de Gln o dentro de Glu; Met dentro de Leu, dentro de Tyr o dentro de lie; Phe dentro de Met, dentro de Leu o dentro de Tyr; Ser dentro de Thr; Thr dentro de Ser; Trp dentro de Tyr;
Tyr dentro de Trp; y/o Phe dentro de Val, dentro de lie o dentro de Leu.
La sustitución de aminoácidos en la una o más extensiones de residuos de aminoácidos puede proporcionar la secuencia de aminoácidos con afinidad creciente para enlazar a la proteína F de hRSV. Esto se puede hacer por técnicas tales como mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio y/u otras técnicas para maduración por afinidad conocida per se, tales como por ejemplo, descritos en WO 09/004065, WO 05/003345, WO 06/023144, EP527809, EP397834.
Sin ser limitativo, las reglas (que se siguen parcial o totalmente) para sustituciones de residuos de aminoácidos en las CDRs pueden ser como siguen (es decir, sustitución con aminoácidos con químicas de cadena lateral similares):
- K se sustituye por R;
R se sustituye por K;
A se sustituye por S o T;
S se sustituye por A o T;
T se sustituye por A o S;
I se sustituye por L o V;
L se sustituye por I o V;
V se sustituye por I o L;
F se sustituye por Y;
Y se sustituye por F;
N se1 sustituye por D;
D se sustituye por N;
Q se sustituye por E;
E se sustituye por Q;
G se sustituye por A;
M se sustituye por L;
H, C, W y P se mantienen constantes.
Además, y también sin ser limitantes, las reglas (que se siguen parcial o totalmente) para sustituciones de residuos de aminoácidos en las CDRs pueden ser alternativamente como siguen para sustituciones en las posiciones 27 a 35 y posiciones 50 a 58 (usando el sistema de numeración de Kabat) ,
en donde para las posiciones 27 a 35:
Residuo de aminoácidos original en la posición 27 (numeración de Kabat usada) se sustituye por F; G; R; S; 2 de cada F, G, R, S; 3 de cada F, G, R, S; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 28 (numeración de Kabat usada) se sustituye por A; I; S; T; 2 de cada A, I, S, T; 3 de cada A, I, S, T; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 29 (numeración de Kabat usada) se sustituye por F; G; L; S; 2 de cada F, G, L, S; 3 de cada F, G, L, S; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 30 (numeración de Kabat usada) se sustituye por D; G; S; T; 2 de cada D, G, S, T; 3 de cada D, G, S, T; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 31 (numeración de Kabat usada) se sustituye por D; I; N; S; T; 2 de cada D, I, N, S, T; 3 de cada D, I, N, S, T; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 32 (numeración de Kabat usada) se sustituye por D; N; Y; 2 de cada D, N, Y; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 33 (numeración de Kabat usada) se sustituye por A; G; T; V; 2 de cada A, G, T, V; 3 de cada A, G, T, V; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 34 (numeración de Kabat usada) se sustituye por I; ; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 35 (numeración de Kabat usada) se sustituye por A; G; S; 2 de cada A, G, S; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Y las posiciones 50 a 58 si la secuencia de aminoácidos original tiene una secuencia de aminoácidos en posición 52a (numeración de Kabat usada) ,
Residuo de aminoácidos original en la posición 50 (numeración de Kabat usada) se sustituye por A; C; G; S; T; 2 de cada A, C, G, S, T; 3 de cada A, C, G, S, T; 4 de cada A, C, G, S, T; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 51 (numeración de Kabat usada) se sustituye por I;
- Residuo de aminoácidos original en la posición 52 (numeración de Kabat usada) se sustituye por N; R; S; T; 2 de cada N, R, S, T; 3 de cada N, R, S, T; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 52a (numeración de Kabat usada) se sustituye por R; S; T; W; 2 de cada R, S, T, W; 3 de cada R, S, T, W; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 53 (numeración de Kabat usada) se sustituye por D; G; N; S; T; 2 de cada D, G, N, S, T; 3 de cada D, G, N, S, T; 4 de cada D, G, N, S, T; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 54 (numeración de Kabat usada) se sustituye por D; G; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 55 (numeración de Kabat usada) se sustituye por D; G; S; 2 de cada D, G, S; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 56 (numeración de Kabat usada) se sustituye por I; N; R; S; T; 2 de cada I, N, R, S, T; 3 de cada I, N, R, S, T; 4 de cada I, N, R, S, T; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 57 (numeración de Kabat usada) se sustituye por T;
- Residuo de aminoácidos original en la posición 58 (numeración de Kabat usada) se sustituye por D; H; N; S; Y; 2 de cada D, H, N, S, Y; 3 de cada D, H, N, S, Y; 4 de cada D, H, N, S, Y; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
y en donde para las posiciones 50 a 58 si la secuencia de aminoácidos original no tiene una secuencia de aminoácidos en posición 52a (numeración de Kabat usada) ,
Residuo de aminoácidos original en la posición 50 (numeración de Kabat usada) se sustituye por A; G; R; S; T; 2 de cada A, G, R, S, T; 3 de cada A, G, R, S, T; 4 de cada A, G, R, S, T; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 51 (numeración de Kabat usada) se sustituye por I;
Residuo de aminoácidos original en la posición 52 (numeración de Kabat usada) se sustituye por N; S; T; 2 de cada N, S, T; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 53 (numeración de Kabat usada) se sustituye por N; R; S; T; Y; 2 de cada N, R, S, T, Y; 3 de cada N, R, S, T, Y; 4 de cada N, R, S, T, Y; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 54 (numeración de Kabat usada) se sustituye por D; G; R; S; 2 de cada D, G, R, S; 3 de cada D, G, R, S; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 55 (numeración de Kabat usada) se sustituye por G;
Residuo de aminoácidos original en la posición 56 (numeración de Kabat usada) se sustituye por G; N; R; S; T; 2 de cada D, N, R, S, T; 3 de cada D, N, R, S, T; 4 de cada D, N, R, S, T; o todos ellos, preferiblemente todos ellos;
Residuo de aminoácidos original en la posición 57 (numeración de Kabat usada) se sustituye por T;
- Residuo de aminoácidos original en la posición 58 (numeración de Kabat usada) se sustituye por D; N; T; Y; 2 de cada D, N, T, Y; 3 de cada D, N, T, Y; o todos ellos, preferiblemente todos ellos.
después de lo cual una o más de las sustituciones potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas) asi determinadas se pueden introducir dentro de dicha secuencia CDR (en cualquier manera conocida per se, como se describe además en la presente) y la secuencia de aminoácidos resultante (s) se puede probar para afinidad para la proteina F de hRSV, y/o para otras propiedades deseadas tales como por ejemplo, características mejoradas de enlace
(convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KQ (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) , afinidad mejorada y/o avidez mejorada para la proteina F de hRSV y/o eficiencia mejorada y/o potencia para neutralizar hRSV. De esta manera, por medio de un grado limitado de prueba y error, otras sustituciones adecuadas en lase CDRs (o combinaciones adecuadas de las mismas) se pueden determinar por la persona experta con base en la descripción en la presente .
Las secuencias de aminoácidos que comprenden una extensión de residuos de aminoácidos que tiene una, dos o un máximo de tres sustituciones, inserciones o eliminaciones, y secuencias de ácidos nucleicos que codifican las mismas, se pueden suministrar en cualquier manera conocida per se, por ejemplo al usar una o más de las técnicas mencionadas en las páginas 103 y 104 de WO 08/020079.
Las secuencias de aminoácidos resultantes de la invención deberían enlazar preferiblemente a la proteína F de hRSV con una afinidad (convenientemente medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv/ o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) que es como se definen en la presente; y/o neutralizar hRSV con una eficacia y/o potencia que es como se definen en la presente.
aa) Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, el término "diferencia de aminoácidos" se refiere a una inserción, eliminación o sustitución de un residuo sencillo de aminoácidos en una posición de la primera secuencia de aminoácidos, en comparación con la segunda secuencia de aminoácidos; entendiéndose que dos secuencias de aminoácidos pueden contener una, dos o un máximo de tres tales diferencias de aminoácidos.
La "diferencia de aminoácidos" puede ser cualquiera de una, cualquiera de dos o máximo cualquiera de tres sustituciones, eliminaciones o inserciones en la secuencia de aminoácidos, es decir, en una o más de las regiones de armazón o en una o más de las CDRs (las cuales pueden estar en una CDR de la invención (es decir, en CDR2) o en otra CDR (es decir, en CDR1, CDR2 o CDR3)), o cualquier combinación de los mismos, ya sea que mejoren las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención o que al menos no afecten demasiado las propiedades deseadas o el balance o combinación de propiedades deseadas de la secuencia de aminoácidos de la invención. A este respecto, la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debería al menos enlazar a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, eliminaciones o inserciones, dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie; y/o la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debería tener al menos una potencia que es la misma, alrededor de la misma o superior en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, inserciones y/o eliminaciones. La persona experta en general podrá determinar y seleccionar sustituciones, eliminaciones o inserciones adecuadas, o combinaciones adecuadas de las mismas, con base en la descripción en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, lo que puede involucrar por ejemplo introducir un número limitado de posibles sustituciones, eliminaciones o inserciones y determinar su influencia en las propiedades de la secuencia de aminoácidos asi obtenida.
En un aspecto de la invención, la "diferencia de aminoácidos" es una sustitución de aminoácidos. La sustitución de aminoácidos puede ser una, dos o un máximo de tres sustituciones en una o más de las regiones de armazón o en una o más de las CDRs (que pueden estar en una CDR de la invención (es decir, en CDR2) o en otra CDR (es decir, en CDR1, CDR2 o CDR3) ) , o cualquier combinación de los mismos, ya sea que mejoren las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención o que al menos no afecten demasiado las propiedades deseadas o el balance o combinación de propiedades deseadas de la secuencia de aminoácidos de la invención. A este respecto, la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debería al menos enlazar a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie; y/o la secuencia de aminoácidos resultante de la invención debería tener al menos una potencia que es la misma, alrededor de la misma o superior en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones. La persona experta en general podrá determinar y seleccionar sustituciones adecuadas, con base en la descripción en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, lo que puede involucrar por ejemplo introducir un número limitado de posibles sustituciones y determinar su influencia en las propiedades de las secuencias de aminoácidos asi obtenidas.
Como se indicó anteriormente, las sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden estar en una o más de las regiones de armazón y/o en una o más de las CDR's. Como se discutió anteriormente (ver el punto z) arriba), la sustitución de aminoácidos en una o más de las CDRs puede ser cualquier sustitución tales como una "sustitución conservadora" (como se define en la presente) , puede estar impulsada por determinadas reglas (como se definen en la presente), y/o puede inducir propiedades mejoradas a las secuencias de aminoácidos resultantes.
Cuando tales sustituciones, inserciones o eliminaciones se hacen en una o más de las regiones de armazón, se pueden hacer en uno o más de los residuos distintivos (como por ejemplo, definidos en O 08/020079; Tablas A-3 a A-8) y/o en una o más de las otras posiciones en los residuos de armazón, aunque sustituciones, inserciones o eliminaciones en los residuos distintivos son en general menos preferidas (a menos que estas sean sustituciones humanizantes adecuadas como se describe en la presente) . Por medio de ejemplos no limitativos, una sustitución puede ser por ejemplo una sustitución conservadora (como se describe en la presente) y/o un residuo de aminoácidos se puede reemplazar por otro residuo de aminoácidos que se presenta naturalmente en la misma posición en otro dominio VHH (ver WO 08/020079, Tablas A-5 hasta A-8), aunque la invención no se limita en general a ello.
Sustituciones, inserciones o eliminaciones hechas (preferiblemente) en una o más de las regiones de armazón pueden ser sustitución humanizante (es decir, reemplazar uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de una secuencia VHH que se presenta naturalmente (y en particular en las secuencias de armazón) por uno o más de los residuos de aminoácidos que se presentan en la correspondiente posición (s) en un dominio VH a partir de un anticuerpo convencional de 4 cadenas de un ser humano) . Algunas sustituciones humanizantes preferidas, pero no limitativas (y combinaciones adecuadas de las mismas) se volverán claras para la persona experta con base en la descripción en la presente. Las sustituciones humanizantes potencialmente útiles se pueden determinar al comparar la secuencia de las regiones de armazón de una de la secuencia de aminoácidos de la invención definida en a) con la correspondiente secuencia de armazón de una o más secuencias VH humanas cercanamente relacionadas, después de lo cual una o más de las sustituciones humanizantes potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas) asi determinadas se pueden introducir dentro de dicha secuencia de aminoácidos de la invención definida en a) (en cualquier manera conocida per se, como se describe además en la presente) y la secuencia de aminoácidos humanizada resultante se puede probar por afinidad para la proteina F de hRSV, para estabilidad, para facilidad y nivel de expresión, y/o para otras propiedades deseadas definidas en la presente. De esta manera, por medio de un grado limitado de prueba y error, otras sustituciones humanizantes adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) se pueden determinar por la persona experta con base en la descripción en la presente.
Las sustituciones humanizantes se deberían elegir tal que la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® humanizado resultante conserve todavía las propiedades favorables de Nanobodies® como se definen en la presente. Una persona experta en general podrá determinar y seleccionar sustituciones humanizantes adecuadas o combinaciones adecuadas de sustituciones humanizantes, con base en la descripción en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, lo que puede involucrar por ejemplo introducir un número limitado de posibles sustituciones humanizantes y determinar su influencia sobre las propiedades de los Nanobodies® asi obtenidos .
En general, como resultado de la humanización, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención puede hacerse más "tipo humana", mientras conserva todavía las propiedades favorables de los Nanobodies® de la invención como se describe en la presente. Como resultado, tales secuencias de aminoácidos y/o Nanobody® humanizados pueden tener varias ventajas, tales como una inmunogenicidad reducida, en comparación con el dominio VHH correspondiente que se presenta naturalmente. Nuevamente, con base en la descripción en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, la persona experta podrá seleccionar sustituciones humanizantes o combinaciones adecuadas de sustituciones humanizantes las cuales optimizan o logran un balance deseado o apropiado entre las propiedades favorables proporcionadas por las sustituciones humanizantes por una parte y por otro lado las propiedades favorables de los dominios VHH que se presentan naturalmente .
Las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención pueden humanizarse adecuadamente en cualesquiera residuo (s) de armazón, tales como en uno o más residuos distintivos (como se definen en la presente) o en uno o más de otros residuos de armazón (es decir, residuos no distintivos) o cualquier combinación adecuada de los mismos. Otra sustitución humanizante preferida para los Nanobodies® del "grupo P,R,S-103" o el "grupo KERE" (como se definen en WO 08/020079) es Q108 dentro de L108.
Dependiendo del organismo hospedero usado para expresar la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención, tales eliminaciones y/o sustituciones también se pueden diseñar de tal manera que se retiren uno o más sitios para modificación post-traduccional (tales como uno o más sitios de glicosilación) , como estará dentro de la capacidad de la persona experta en la técnica. Alternativamente, sustituciones o inserciones se pueden diseñar de manera de introducir uno o más sitios para la unión de grupos funcionales (como se describe en la presente) , por ejemplo para permitir la pegilación especifica del sitio (nuevamente como se describe en la presente) .
Como se puede observar a partir de los datos de la entropía VHH entropy y la variabilidad VHH dada en las Tablas A-5 - A-8 de WO 08/020079, algunos residuos de aminoácidos en las regiones de armazón están más conservados que otros. En general, aunque la invención en su sentido más amplio no se limita a ello, cualesquiera sustituciones, eliminaciones o inserciones se hacen preferiblemente en las posiciones que están menos conservadas. También, en general, sustituciones de aminoácidos se prefieren sobre las eliminaciones o inserciones de aminoácidos.
Cualesquiera sustituciones de aminoácidos aplicadas ' a los polipéptidos descritos en la presente también se pueden basar en el análisis de las frecuencias de las variaciones de aminoácidos entre proteínas homologas de diferentes especies desarrollado por Schulz et al., Principies of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, sobre los análisis de potenciales formadores de estructura desarrollados por Chou y Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 y Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, y sobre el análisis de los patrones de hidrofobicidad en proteínas desarrollado por Eisenberg et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981, y Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986, todas incorporadas en la presente en su totalidad como referencia. La información sobre la estructura primaria, secundaria y terciaria de Nanobodies® se proporciona en la descripción en la presente y en el artre previo general de antecedentes antes mencionado. También, para este propósito, la estructura de cristal de un dominio VHH de una llama se da por ejemplo por Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; y Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999). Además, la información alrededor de algunos de los residuos de aminoácidos que forman en dominios convencionales de VH la interfaz VH/VL y sustituciones ptenciales de camelización en estas posiciones se pueden encontrar en el arte previo anteriormente citado.
Las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con una, dos o un máximo de tres sustituciones, inserciones o eliminaciones, y secuencias de ácidos nucleicos que codifican los mismos, se pueden suministrar en cualquier manera conocida per se, por ejemplo al usar una o más de las técnicas mencionadas en las páginas 103 y 104 de WO 08/020079.
Las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® resultantes de la invención deberían preferiblemente enlazar a la proteína F de hRSV con una afinidad (convenientemente medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente), una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50/ como se describe además en la presente) que es como se define en la presente; y/o neutralizar hRSV con una eficacia y/o potencia que es como se definen en la presente.
bb) Cuando se comparan dos polipéptidos , el término "diferencia de aminoácidos" se refiere a una inserción, eliminación o sustitución de un residuo sencillo de aminoácidos en una posición del primer polipéptido, comparado con el segundo polipéptido; entendiéndose que dos polipéptidos pueden contener una, dos o un máximo de tres de tales diferencias de aminoácidos.
La "diferencia de aminoácidos" puede ser cualquiera de una, cualquiera de dos o un máximo de tres sustituciones, eliminaciones o inserciones en el polipéptido, es decir, en una o más de las regiones de armazón o en una o más de las CDRs (las cuales pueden ser una CDR de la invención (es decir, en CDR2) o en otra CDR (es decir, en CDR1, CDR2 o CDR3) ) , o cualquier combinación de los mismos, ya sea que mejoren las propiedades del polipéptido de la invención o que al menos no afecten demasiado las propiedades deseadas o el balance o combinación de propiedades deseadas del polipéptido de la invención. A este respecto, el polipéptido resultante de la invención debería al menos enlazar a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior comparado con él polipéptido sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, eliminaciones o inserciones, dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie; y/o el polipéptido resultante de la invención debería tener al menos una potencia que es la misma, alrededor de la misma o superior comparado con el polipéptido sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, inserciones y/o eliminaciones. El polipéptido resultante debería enlazar preferiblemente a la proteína F de hRSV con una afinidad (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) que es como se definen en la presente; y/o neutralizar hRSV con una eficacia y/o potencia que es como se define en la presente. La persona experta en general podrá determinar y seleccionar sustituciones, eliminaciones o inserciones adecuadas, o combinaciones adecuadas de las mismas, con base en la descripción en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, la cual puede por ejemplo involucrar introducir un número limitado de sustituciones, eliminaciones o inserciones posibles y determinar su influencia en las propiedades del polipéptido así obtenido.
En un aspecto de la invención, la "diferencia de aminoácidos" es una sustitución de aminoácidos. La sustitución de aminoácidos puede ser cualquiera de una, cualquiera de dos o máximo cualquiera de tres sustituciones en las regiones de armazón o en una o más de las CDRs (la cual puede estar en una CDR de la invención (es decir, presente en CDR2) o en otra CDR (es decir, en CDR1, CDR2 o CDR3) ) , o cualquier combinación de los mismos, ya sea que mejoren las propiedades del polipéptido de la invención o que al menos no afecten demasiado las propiedades deseadas o el balance o combinación de propiedades deseadas del polipéptido de la invención. A este respecto, el polipéptido resultante de la invención debería al menos enlazar a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior comparado con el polipéptido sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, eliminaciones o inserciones, dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie; y/o el polipéptido resultante de la invención debería tener al menos una potencia que es la misma, alrededor de la misma o superior comparado con el polipéptido sin la una, dos o un máximo de tres sustituciones, inserciones y/o eliminaciones. El polipéptido resultante debería enlazar preferiblemente a la proteína F de hRSV con una afinidad (convenientemente medida y/o expresada como un valor D (real o aparente) , un valor K¾ (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) que es como se definen en la presente; y/o neutralizar hRSV con una eficacia y/o potencia que es como se define en la presente. La persona experta en general podrá determinar y seleccionar sustituciones adecuadas, con base en la descripción en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, que puede involucrar por ejemplo introducir un número limitado de sustituciones . posibles y determinar su influencia en las propiedades de polipéptidos asi obtenido.
Como se indicó anteriormente, las sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden estar en una o más de las regiones de armazón y/o en una o más de las CDR's. Como se discutió anteriormente (ver punto z) ) , las sustituciones, inserciones o eliminaciones en las CDR' s pueden ser cualesquiera sustituciones, inserciones o eliminaciones posibles tales como "sustitución conservadora" (como se definen en la presente) , se pueden impulsar por determinadas reglas (como se definen en la presente) , y/o pueden inducir propiedades mejoradas para los polipéptidos resultantes.
Cuando tales sustituciones, inserciones o eliminaciones se hacen en una o más de las regiones de armazón, se pueden hacer en uno o más de los residuos distintivos (como por ejemplo, definidos en WO 08/020079; Tablas A-3 a A-8) y/o en una o más de las otras posiciones en los residuos de armazón, aunque sustituciones, inserciones o eliminaciones en los residuos distintivos son menos preferidas en general (al menos que estas sean sustituciones humanizantes adecuadas como se describe en la presente) . Por medio de ejemplos no limitativos, una sustitución puede ser por ejemplo una sustitución conservadora (como se describe en la presente) y/o un residuo de aminoácidos se puede reemplazar por otro residuo de aminoácidos que se presenta naturalmente en la misma posición en otro dominio VHH (ver WO 08/020079, Tablas A-5 hasta A-8) , aunque la invención no se limita a ello en general .
Sustituciones, inserciones o eliminaciones hechas (preferiblemente) en una o más de las regiones de armazón pueden ser una sustitución humanizante. Algunas sustituciones humanizantes preferidas, pero no limitativas (y combinaciones adecuadas de las mismas) se volverán claras para la persona experta con base en la descripción en la presente. Las sustituciones humanizantes potencialmente útiles se pueden determinar al comparar la secuencia de las regiones de armazón de una de las secuencias de aminoácidos abarcada en el polipéptido de la invención definidas en a) con la correspondiente secuencia de armazón de una o más secuencias VH humanas cercanamente relacionadas, después de lo cual una o más de las sustituciones humanizantes potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas) asi determinadas sé pueden introducir dentro de dicho polipéptido de la invención definidas en a) (en cualquier manera conocida per se, como se describe además en la presente) y la secuencia del polipéptido resultante se puede probar por afinidad para la proteina F de hRSV, por estabilidad, por facilidad y nivel de expresión, y/o para otras propiedades deseadas definidas en la presente. De esta manera, por medio de un grado limitado de prueba y error, otras sustituciones humanizantes adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) se pueden determinar por la persona experta con base en la descripción en la presente.
Las sustituciones humanizantes deberían elegirse tales que las secuencias de polipéptidos humanizados resultantes conserven todavía las propiedades favorables de Nanobodies® abarcadas en el polipéptido como se definen en la presente. Una persona experta en general podrá determinar y seleccionar sustituciones humanizantes adecuadas o combinaciones adecuadas de sustituciones humanizantes, con base en la descripción en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, lo cual puede por ejemplo involucrar introducir un número limitado de sustituciones humanizantes posibles y determinar su influencia sobre las propiedades de los Nanobodies® abarcadas en el polipéptido asi obtenido.
En general, como resultado de la humanización, el polipéptido de la invención se puede volver más "tipo humano", mientras conserva todavía las propiedades favorables de los Nanobodies® de la invención abarcadas en el polipéptido como se describe en la presente. Como resultado, tales polipéptidos humanizados pueden tener diversas ventajas, tales como una inmunogenicidad reducida, en comparación con los polipéptidos que abarcan los dominios VHH correspondientes que se presentan naturalmente. Nuevamente, con base en la descripción en la presente y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, la persona experta podrá seleccionar sustituciones humanizantes o combinaciones adecuadas de sustituciones humanizantes las cuales optimicen o logren un balance deseado o adecuado entre las propiedades favorables proporcionadas por las sustituciones humanizantes por una parte y las propiedades favorables de los dominios VHH que se presentan naturalmente por otro lado.
Los polipéptidos de la invención se pueden humanizar adecuadamente en cualesquiera residuo (s) de armazón, tales como en uno o más residuos distintivos (como se definen en la presente) o en uno o más de otros residuos de armazón (es decir, residuos no distintivos) o cualquier combinación adecuada de los mismos. Una sustitución humanizante preferida para los Nanobodies® del "grupo P,R,S-103" o el "grupo KERE" es Q108 dentro de L108.
Dependiendo del organismo hospedero usado para expresar el polipéptido de la invención, tales eliminaciones y/o sustituciones también se pueden diseñar de tal manera que se retiren uno o más sitios para modificación post-traduccional (tales como uno o más sitios de glicosilación) , como estará dentro de la capacidad de la persona experta en la técnica. Alternativamente, sustituciones o inserciones se pueden diseñar de manera de introducir uno o más sitios para unión de grupos funcionales (como se describe en la presente) , por ejemplo para permitir una pegilación especifica del sitio (nuevamente como se describe en la presente) .
Como se puede observar a partir de los datos sobre la entropía VHH y la variabilidad VHH dados en las Tablas A-5 -A-8 de WO 08/020079, algunos residuos de aminoácidos en las regiones de armazón están más conservados que otros. En general, aunque la invención en su sentido más amplio no se limita a ello, algunas sustituciones, eliminaciones o inserciones se hacen preferiblemente en las posiciones que están menos conservadas. También, en general, se prefieren sustituciones de aminoácidos sobre las eliminaciones o inserciones de aminoácidos.
Algunas sustituciones de aminoácidos aplicadas a los polipéptidos descritos en la presente también se pueden basar en el análisis de las frecuencias de variaciones de aminoácidos entre proteínas homologas de diferentes especies desarrolladas por Schulz et al., Principies of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, en los análisis de potenciales formadores de estructuras desarrollados por Chou y Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 y Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, y en los análisis de los patrones de hidrofobicidad en las proteínas desarrolladas por Eisenberg et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol . 157: 105-132, 198 1, y Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986, todas incorporadas en la presente en su totalidad como referencia. La información sobre la estructura primaria, secundaria y terciaria de Nanobodies® se da en la descripción en la presente y en el arte de antecedentes general antes mencionado. También, para este propósito, la estructura de cristal de un dominio VHH de una llama se da por ejemplo por Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol . 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; y Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999) . Información adicional alrededor de algunos de los residuos de aminoácidos que forman en los dominios convencionales VH la interfaz VH/VL y las sustituciones de camelización potenciales en estas posiciones se pueden encontrar en el arte previo anteriormente citado.
Los polipéptidos con una, dos o un máximo de tres sustituciones, inserciones o eliminaciones, y secuencias de ácidos nucleicos que codifican las mismas, se pueden suministrar en cualquier manera conocida per se, por ejemplo al usar una o más de las técnicas mencionadas en las páginas 103 y 104 de WO 08/020079.
Los polipéptidos resultantes de la invención deberían enlazar preferiblemente a la proteína F de hRSV con una afinidad (convenientemente medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente), una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiV, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) que es como se definen en la presente; y/o neutralizar hRSV con una eficacia y/o potencia que es como se define en la presente.
ce) Las figuras, listado de secuencias y la parte experimental/ejemplos se proporcionan solamente para ilustrar además la invención y no deberían interpretarse o constituirse como limitantes del alcance de la invención y/o de las reivindicaciones anexas de ninguna manera, a menos que se indique explícitamente de otra manera en la presente.
Para enlazar a su epítopo en la proteína F de hRSV, una secuencia de aminoácidos contendrá usualmente dentro de su secuencia de aminoácidos uno o más residuos de aminoácidos o una o más extensiones de residuos de aminoácidos (como se definen en la presente; es decir, con cada "extensión" que comprende dos o más residuos de aminoácidos que están adyacentes uno con el otro o en proximidad cercana uno con el otro, es decir, en la estructura primaria o terciaria de la secuencia de aminoácidos) por medio de lo cual la secuencia de aminoácidos de la invención se puede enlazar a su epítopo sobre la proteína F de hRSV. Estos residuos de aminoácidos o extensiones de residuos de aminoácidos así forman el "sitio" para enlazar al epítopo en la proteína F de hRSV (también referida en la presente como el "sitio de enlace al antígeno"; como se define además en la presente) .
La presente invención proporciona diversas extensiones de residuos de aminoácidos (como se definen en la presente) que son particularmente adecuadas para enlace a sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV (para una descripción de sitios antigénicos en la proteína hRSV F se hace referencia a López et al. 1998, J. virol. 72: 6922-6928). Estas extensiones de residuos de aminoácidos se pueden presentar en, y/o se pueden incorporar dentro de, una secuencia de aminoácidos de la invención, en particular en una manera tal que formen (parte del) sitio de enlace al antigeno de la secuencia de aminoácidos de la invención. Las secuencias de aminoácidos resultantes se enlazarán a un epitopo específico sobre la proteína F de hRSV que yace en, forma parte de, o se traslapa con (es decir, en la estructura primaria o terciaria) o está en proximidad cercana con (es decir, en la estructura primaria o terciaria) el sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV. También, las secuencias de aminoácidos resultantes de la invención serán preferiblemente tales que compitan con Synagis® para enlazar a la proteína F de hRSV; y/o tales que se enlacen al mismo epitopo o sitio de enlace en la proteína F de hRSV como Synagis®, o a un epitopo cercano a dicho sitio de enlace y/o que se traslape con dicho sitio de enlace.
La presente invención proporciona una extensión de residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 102) que es particularmente adecuada para enlazar a la proteína F de hRSV. Esta extensión de residuos de aminoácidos (o variantes de SEQ ID NO: 102 como se definen en la presente) puede estar presente en, y/o se pueden incorporar dentro de, una secuencia de aminoácidos de la invención, en particular en una manera tal que formen (parte del) sitio de enlace al antigeno de la secuencia de aminoácidos de la invención. La extensión de residuos de aminoácidos se ha generado como una secuencia CDR2 de un anticuerpo de cadena pesada o secuencia VHH (NC41; SEQ ID NO: 5) que se formuló contra la proteina F de hRSV y que fue modificado además en una metodología de biblioteca para generar los Nanobodies® humanizados NC41 (como se describe en la sección de Ejemplos) . Más en particular, el residuo de glicina (Gly, G) en la posición 6 de la CDR2 de NC41 se sustituyó dentro de un residuo de Ácido aspártico (Asp, D) . Sorprendentemente, las características mejoradas de enlace (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor K¾ (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50/ como se describe además en la presente) , afinidad mejorada y/o avidez mejorada para la proteína F de hRSV y/o eficiencia mejorada y/o potencia para neutralizar hRSV, se han observado para las secuencias de aminoácidos que comprenden esta extensión de residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 102) . Esta extensión de residuos de aminoácidos (o variantes de SEQ ID NO: 102, como se definen en la presente) están también referidos en la presente como "secuencias CDR2 de la invención".
Consecuentemente, en un aspecto, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En un aspecto preferido, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos que comprenden dos o más extensiones de residuos de aminoácidos en lo cual una extensión es elegida de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una extensión se escoge de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
tal que la extensión de residuos de aminoácidos que corresponde a uno de a) y b) debería estar siempre presente en la secuencia de aminoácidos de la invención y tal que la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge de uno de c) , d) , e) y f ) .
Incluso más preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de la invención comprenden tres o más extensiones de residuos de aminoácidos, en lo cual la primera extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 102;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y la tercera extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos que comprenden una o más de las extensiones de residuos de aminoácidos antes especificadas muestran propiedades mejoradas tales como por ejemplo, características mejoradas de enlace
(convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) , afinidad mejorada y/o avidez mejorada para la proteina F de hRSV y/o eficiencia mejorada y/o potencia para neutralizar hRSV.
Más en particular, las secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden una o más de las extensiones de residuos de aminoácidos antes especificadas pueden enlazar a la proteina F de hRSV con una afinidad (convenientemente medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente), una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) preferiblemente tal que:
enlacen a la proteina F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 1000 nM a 1 nM o menos, preferiblemente 100 nM a 1 nM o menos, más preferiblemente 15 nM a 1 nM o even 10 nM a 1 nM o menos;
y/o tal que:
enlacen a la proteina F de hRSV con una velocidad kactiv de entre 104 M_1s_1 hasta alrededor de 107 "1s"1, preferiblemente entre 105 M"1s"1 y 107 M"1s"1, más preferiblemente alrededor de 106 M_1s_1 o más;
y/o tal que:
enlacen a la proteina F de hRSV con una velocidad kinactiv entre 10"2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10~4 s"1 (suministrando un complejo casi irreversible con una ti2 de múltiples días), preferiblemente entre 1CT3 s~l y 10~4 s"1, o inferiores;
Algunos valores IC50 preferidos para enlazar a las secuencias de aminoácidos de la invención a la proteina F de hRSV estarán claros a partir de la descripción adicional y ejemplos en la presente.
Los ensayos para determinar los IC50 incluyen ensayos de competencia tales como ELISA de competencia (por ejemplo, competencia con Synagis® o su fragmento Fab) o más preferiblemente ensayos de neutralización tales como el ensayo de microneutralización descrito por Anderson et al. (1985, J. Clin. Microbiol. 22: 1050-1052; 1988, J. Virol. 62: 4232-4238), modificaciones de este ensayo tales como por ejemplo, descritos en el Ejemplo 6, o un ensayo de reducción de placas como por ejemplo el descrito por Johnson et al. (1997, J. Inf. Dis. 176: 1215-1224), y modificaciones de los mismos .
Por ejemplo, en un ensayo de competencia con el fragmento Fab de Synagis®, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 entre 1 nM y 100 nM, preferiblemente entre 10 nM y 50 nM, o menos.
Por ejemplo, en un ensayo de microneutralización sobre hRSV Larga (tales como por ejemplo, descritos en el Ejemplo 6) las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC5o entre 100 nM y 1000 nM, preferiblemente entre 100 nM y 500 nM, o menos.
Se debe señalar que la invención no está limitada en cuanto al origen de la secuencia de aminoácidos de la invención (o de la secuencia de nucleótidos de la invención usada para expresarla) , ni tampoco en cuanto a la manera en que la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de la invención es (o ha sido) generada u obtenida. Asi, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser secuencias de aminoácidos que se presentan naturalmente (a partir de cualquier especie adecuada) o secuencias sintéticas o semi-sintéticas de aminoácidos.
Se debe señalar que la invención en su sentido más amplio no se limita a un rol o función estructural especifico que puedan tener estas extensiones de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la invención, mientras estas extensiones de residuos de aminoácidos permitan que la secuencia de aminoácidos de la invención se enlace al sitio antigénico II sobre la proteina F de hRSV con una determinada afinidad y/o potencia (como se define en la presente) . Asi, en general, la invención en su sentido más amplio comprende cualquier secuencia de aminoácidos que es capaz de enlazar al sitio antigénico II sobre la proteina F de hRSV y que comprende una o más extensiones de residuos de aminoácidos como se definen en la presente (y en particular una combinación adecuada de dos o más tales extensiones de residuos de aminoácidos) que se ligan adecuadamente una con la otra por medio de una o más secuencias adicionales de aminoácidos, tal que la secuencia de aminoácidos completa forme un dominio de enlace y/o unidad de enlace que pueda enlazar al sitio antigénico II sobre la proteina F de hRSV.
Tal secuencia de aminoácidos puede ser, por ejemplo, un "andamiaje de proteínas" adecuado que comprenda al menos una extensión de residuos de aminoácidos como se definen en la presente (es decir, como parte de su sitio de enlace al antígeno) . Los andamiajes adecuados para presentar secuencias de aminoácidos estarán claros para la persona experta, y por ejemplo comprenden, sin limitación, a andamiajes de enlace con base o derivados de inmunoglobulinas, andamiajes de proteínas derivadas de dominios de proteína A (tales como Affibodies™) , tendamistat, fibronectina, lipocalina, CTLA-4, receptores de células T, repeticiones diseñadas de ankirina, avímeros y dominios PDZ (Binz et al. 2005, Nat . Biotech. 23: 1257), y porciones de enlace con base en ADN o ARN incluyendo pero no limitado a aptámeros de ADN o ARN (Ulrich et al. 2006, Comb. Chem. High Throughput Screen 9(8): 619-32).
Nuevamente, cualquier secuencia de aminoácidos de la invención que comprende una o más de las extensiones de secuencias de aminoácidos como se definen en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención es preferiblemente tal que se puede enlazar específicamente (como se define en la presente) a la proteína F de hRSV, y más en particular tal que puede enlazar a la proteína F de hRSV con una afinidad (convenientemente medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv/ o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente), que es como se definen en la presente. Cualquier secuencia de aminoácidos de la invención que comprende una o más de las extensiones de residuos de aminoácidos como se definen en la presente para las secuencias de aminoácidos de la invención es preferiblemente tal que puede neutralizar hRSV con una potencia (cuando se mide en un ensayo adecuado como se define en la presente) que es como se define en la presente.
Además, también estará claro para la persona experta que puede ser posible "injertar" una o más de las CDR' s aquí definidas para las secuencias de aminoácidos de la invención encima de otros "andamiajes", incluyendo pero no limitado a andamiajes humanos o andamiajes que no son de inmunoglobulinas . Los andamiajes y técnicas adecuados para tal injerto de CDR estarán claros para la persona experta y son bien conocidos en la técnica, ver por ejemplo US 7,180,370, WO 01/27160, EP 0 605 522, EP 0 460 167, US 7,054,297, Nicaise et al., Protein Science (2004), 13:1882-1891; Ewert et al., ethods, 2004 Oct; 34 (2) : 184-199; Kettleborough et al., Protein Eng. 1991 Oct; 4(7): 773-783; O'Brien y Jones, Methods Mol. Biol. 2003: 207: 81-100; y Skerra, J. Mol. Recognit. 2000: 13: 167-187, y Saerens et al., J. Mol. Biol. 2005 Sep 23 ; 352 ( 3) : 597-607 , y las referencias adicionales allí citadas. Por ejemplo, las técnicas conocidas per se para injertar CDRs de ratón o rata encima de armazones y andamiajes humanos se pueden usar de una manera análoga para proporcionar proteínas guiméricas que comprenden una o más de las secuencias CDR aquí definidas para las secuencias de aminoácidos de la invención y una o más regiones de armazón o secuencias humanas.
En un aspecto específico, pero no limitativo, la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende un pliegue de inmunoglobulinas o una secuencia de aminoácidos que, bajo condiciones adecuadas (tales como condiciones fisiológicas) puede formar un pliegue de inmunoglobulinas (es decir, mediante plegado) . Se hace referencia entre otros, a la revisión por Halaby et al. (1999, J. Protein Eng. 12: 563-71) . Preferiblemente, cuando se pliegan adecuadamente de manera de formar un pliegue de inmunoglobulinas, las extensiones de residuos de aminoácidos pueden ser capaces de formar apropiadamente el sitio de enlace al antigeno para enlazar el sitio antigénico II específico sobre la proteína F de hRSV; y más preferiblemente capaces de enlazar al sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV con una afinidad (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) que es como se define en la presente.
En otro aspecto específico, pero no limitativo, las secuencias de aminoácidos de la invención son secuencias de inmunoglobulinas. En particular, pero sin limitación, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser secuencias de aminoácidos que consisten esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente) ; o cualquier fragmento adecuado de tales secuencias de aminoácidos que enlazan todavía al sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV.
En tal secuencia de aminoácidos de la invención, las secuencias de armazón pueden ser cualesquiera secuencias de armazón adecuadas, y ejemplos de secuencias de armazón adecuadas estarán claros para la persona experta, por ejemplo sobre la base de los manuales estándar y la descripción adicional y arte previo aquí mencionados.
Las secuencias de armazón son preferiblemente (una combinación adecuada de) secuencias de armazón de inmunoglobulinas o secuencias de armazón que se han derivado de secuencias de armazón de inmunoglobulinas (por ejemplo, por humanización o camelización) . Por ejemplo, las secuencias de armazón pueden ser secuencias de armazón derivadas de un dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia VL) y/o de un dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia VH) . Cuando la secuencia de aminoácidos de la invención es una secuencia de dominio variable de cadena pesada, puede ser una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo convencional de cuatro cadenas (tales como, sin limitación, una secuencia VH que se deriva de un anticuerpo humano) o sea una secuencia denominada de VHH (como se define en la presente) que se deriva de un denominado "anticuerpo de cadena pesada" (como se define en la presente) . En un aspecto particularmente preferido, las secuencias de armazón son ya sea secuencias de armazón que se han derivado de una secuencia VHH (en lo cual dichas secuencias de armazón puede opcionalmente haber sido parcialmente o completamente humanizadas) o son secuencias convencionales VH que han sido camelizadas (como se definen en la presente) .
Para una descripción general de anticuerpos de cadena pesada y los dominios variables de los mismos, se hace referencia inter alia al arte previo allí citado, asi como al arte previo mencionado en la página 59 de WO 08/020079 y a la lista de referencias mencionadas en las páginas 41-43 de la solicitud internacional WO 06/040153, cuyo arte previo y referencias se incorporan en la presente como referencia.
Las secuencias de armazón pueden ser preferiblemente tales que la secuencia de aminoácidos de la invención sea un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio) ; es un anticuerpo de dominio sencillo (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio sencillo) ; es un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un dAb,) ; o es un Nanobody® (incluyendo pero no limitado a una secuencia VHH) · Nuevamente, las secuencias de armazón adecuadas estarán claras para la persona experta, por ejemplo sobre la base de manuales estándar y la descripción adicional y arte previo aquí mencionados.
En particular, las secuencias de armazón presentes en las secuencias de aminoácidos de la invención pueden contener uno o más de residuos distintivos (como son definidos en WO 08/020079 (Tablas A-3 hasta A-8)), tal que la secuencia de aminoácidos de la invención sea un Nanobody®. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de (combinaciones adecuadas de) tales secuencias de armazón estarán claros a partir de la descripción adicional en la presente (ver por ejemplo, Tabla A-6) . En general, los Nanobodies® (en particular secuencias VHH y Nanobodies® parcialmente humanizados) pueden caracterizarse en particular por la presencia de uno o más "residuos distintivos" en una o más de las secuencias de armazón (como por ejemplo, se describe además en WO 08/020079, página 61, linea 24 a página 98, linea 3) .
Como ya fue descrito en la presente, la secuencia de aminoácidos y estructura de un Nanobody® se puede considerar - no obstante sin limitarse a ello - para estar comprendido de cuatro regiones de armazón o "FR's", a los cuales se refieren en la técnica y en la presente como "Región de armazón 1" o "FR1"; como "Región de armazón 2" o "FR2"; como "Región de armazón 3" o "FR3"; y como "Región de armazón 4" o "FR4", respectivamente; en las cuales las regiones de armazón se interrumpen por tres regiones determinantes de la complementariedad o "CDR's", las cuales se refieren en la técnica como "Región determinante de la complementariedad 1" o "CDR1"; como "Región determinante de la complementariedad 2" o "CDR2"; y como "Región determinante de la complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. Algunas secuencias de armazón y CDR' s preferidas (y combinaciones de las mismas) que están presentes en los Nanobodies® de la invención son como se describen en la presente.
Asi, en general, un Nanobody® se puede definir como una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en lo cual FR1 a FR4 se refieren a regiones de armazón 1 a 4, respectivamente, y en lo cual CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en lo cual uno o más de los residuos distintivos son como se definen además en la presente.
A este respecto, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden consistir esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en lo cual CDR2 se escoge de:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Estas regiones determinantes de la complementariedad preferidas (secuencias CDR2) son también referidas como "CDR2(s) de la invención".
Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden consistir esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente) , en lo cual CDR2 se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ;
y al menos una de CDRl o CDR3 se escoge de:
CDRl elegida del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y/o
CDR3 elegida del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Incluso más preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden consistir esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en lo cual:
CDR1 se escoge del grupo que consiste de: a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos; o y
CDR2 se escoge del grupo que consiste de: c) SEQ ID NO: 102;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 6 1 aminoácidos;
y
CDR3 se escoge del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En un aspecto especifico, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención comprende al menos SEQ ID NO: 102.
En otro aspecto especifico, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención comprende al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia de CDR) elegida de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
c) SEQ ID NO: 121;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención comprende al menos SEQ ID NO: 102 y al menos dos extensiones de residuos de aminoácidos (secuencias de CDR) en lo cual una extensión se escoge del grupo que consiste de las extensiones de residuos de aminoácidos-definidas en a) y b) y en lo cual la otra extensión se escoge del grupo que consiste de las extensiones de residuos de aminoácidos definidas en c) y d) .
En otro aspecto especifico, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención comprende al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia de CDR) elegida de SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 121.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención comprende SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 121.
Las combinaciones preferidas de las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 también se muestran en la Tabla A-6.
Las secuencias de aminoácidos de la invención pueden consistir esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se derivan de un anticuerpo convencional de cuatro cadenas o pueden consistir esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cadena pesada. Las secuencias de aminoácidos de la invención pueden consistir esencialmente de un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso =como un anticuerpo de dominio) , de un anticuerpo de dominio sencillo (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio sencillo) , de un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un dAb) o de un Nanobody®.
Para una descripción general de anticuerpos de dominio (sencilla), se hace también referencia al arte previo antes mencionado, asi como a EP 0 368 684. Para el término "dAb's", se hace referencia por ejemplo a Ward et al. (1989, Nature 341: 544-6), a Holt et al., 2003, Trends Biotechnol. 21: 484-490; así como a por ejemplo WO 06/030220, WO 06/003388 y otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd. También se debe señalar que, aunque menos preferido en el contexto de la presente invención debido a que no son de origen mamífero, los anticuerpos de dominio sencillo o dominios variables sencillos se pueden derivar de determinadas especies de tiburones (por ejemplo, los denominados "dominios IgNAR", ver por ejemplo WO 05/18629) .
En particular, la secuencia de aminoácidos de la invención pueden consistir esencialmente de o puede ser un Nanobody® (como se define en la presente) o un fragmento adecuado de la misma. [Nota: Nanobody®, Nanobodies® y Nanoclone® son marcas registradas de Ablynx N.V.]
Un Nanobody® se puede definir como una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en lo cual FR1 a FR4 se refieren a regiones de armazón 1 a 4, respectivamente, y en lo cual CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en lo cual uno o más de los residuos distintivos son como están definidos en WO 08/020079 (Tablas A-3 hasta A-8) .
Más en particular, un Nanobody® puede ser una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en lo cual FR1 a FR4 se refieren a regiones de armazón 1 a 4, respectivamente, y en lo cual CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y las cuales:
i) tienen al menos 80% identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157 (ver Tabla A-4), en lo cual para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, los residuos de aminoácidos que forman las secuencias de CDR están descartados. A este respecto, también se hace referencia a la Tabla A-6, la cual enlista las secuencias de armazón 1 (SEQ ID NO's: 81-97 y 166), secuencias de armazón 2 (SEQ ID NO's: 99-100), secuencias de armazón 3 (SEQ ID NO's: 103-120 y 167-168) y secuencias de armazón 4 (SEQ ID NO's: 123 y 169) de los Nanobodies® de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157 (ver Tabla A-4);
y en lo cual:
ii) preferiblemente uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se escogen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla A-3 a Tabla A-8 de WO 08/020079.
Para una descripción general adicionalde Nanobodies®, se hace referencia al arte previo aquí citado, tal como por ejemplo, descrito en WO 08/020079 (página 16) .
Tales Nanobodies® se pueden derivar de cualquier manera adecuada y de cualquier fuente adecuada, y pueden por ejemplo ser secuencias VHH que se presentan naturalmente (es decir, a partir de una especie adecuada de Camélido) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semi-sintéticas .
Nuevamente, tales Nanobodies® se pueden derivar de cualquier manera adecuada y de cualquier fuente adecuada, y pueden por ejemplo ser secuencias VHH que se presentan naturalmente (es decir, a partir de una especie adecuada de Camélido) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semi-sintéticas, incluyendo pero no limitado a Nanobodies® "humanizados" (como se definen en la presente) , "camelizados" (como se definen en la presente) secuencias de inmunoglobulinas (y en particular secuencias de dominio variable de cadena pesada camelizadas) , asi como Nanobodies® que se han obtenido mediante técnicas tales como maduración por afinidad (por ejemplo, partiendo de secuencias de inmunoglobulinas sintéticas, aleatorias o que se presentan naturalmente), injerto de CDR, con residuos remplazados {veneering) , fragmentos de combinación derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulinas, ensamble de PCR al usar cebadores de traslape, y técnicas similares para preparar por ingeniería secuencias de inmunoglobulinas bien conocidas para la persona experta; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de los anteriores como se describe además en la presente. También, cuando un Nanobody® comprende una secuencia VHH, dicho Nanobody® puede ser convenientemente humanizado, como se describe además en la presente, de manera de suministrar uno o más Nanobodies® humanizados adicionales (parcialmente o completamente) de la invención. Similarmente, cuando un Nanobody® comprende una secuencia sintética o semi-sintética (tales como una secuencia parcialmente humanizada) , dicho Nanobody® puede además estar opcionalmente convenientemente humanizado, nuevamente como se describe en la presente, nuevamente de manera de suministrar uno o más Nanobodies® adicionales (parcialmente o completamente) humanizados de la invención.
En particular, los Nanobodies® humanizados pueden ser secuencias de aminoácidos que son como se definen en general para Nanobodies® en los párrafos previos, pero en lo cual al menos un residuo de aminoácidos está presente (y en particular, en al menos uno de los residuos de armazón) que es y/o que corresponde a una sustitución humanizante (como se define en la presente) . Algunas sustituciones humanizantes preferidas, pero no limitativas (y combinaciones adecuadas de las mismas) se volverán claras para la persona experta con base en la descripción en la presente. Además, o alternativamente, otras sustituciones humanizantes potencialmente útiles se pueden determinar al comparar la secuencia de las regiones de armazón de una secuencia VHH que se presenta naturalmente con la correspondiente secuencia de armazón de una o más secuencias humanas VH cercanamente relacionadas, después de lo cual una o más de las sustituciones humanizantes potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas) asi determinadas se pueden introducir dentro de dicha secuencia VHH (en cualquier manera conocida per se, como se describe además en la presente) y las secuencias VHH humanizadas resultantes se pueden probar por afinidad para el objetivo, por estabilidad, para facilidad y nivel de expresión, y/o para otras propiedades deseadas. De esta manera, por medio de un grado limitado de prueba y error, otras sustituciones humanizantes adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) se pueden determinar por la persona experta con base en la descripción en la presente. También, con base en lo anterior, (las regiones de armazón de) un Nanobody® puede estar parcialmente humanizado o completamente humanizado.
A este respecto, algunos Nanobodies® preferidos de la invención son Nanobodies® que enlazan específicamente a la (como se definen además en la presente) proteína F de hRSV y los cuales:
i) son una variante humanizada de la secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 5 (ver Tabla A-l) ; y/o
ii) tienen al menos 80% identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (ver Tabla A-l) y/o al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157 (ver Tabla A-4), en lo cual para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, los residuos de aminoácidos que forman las secuencias CDR se ignoran;
y en los cuales:
iii) preferiblemente uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla A-3 a la Tabla A-8 de O 08/020079.
La presente invención proporciona diversas secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® optimizados en la secuencia y/o humanizados que son particularmente adecuados para enlazar a proteina F de hRSV. Por lo tanto, en un aspecto de la presente invención, secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® se proporcionan elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de RSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 60-76.
En otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor' de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos ylo Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76.
La presente invención también proporciona diversas secuencias de aminoácidos optimizadas en la secuencia y/o humanizadas y/o Nanobodies® que son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-153.
En otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
Las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la presente invención muestran inmunogenicidad reducida con la administración a un sujeto humano. Además, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la presente invención muestran características mejoradas de enlace (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente), un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinacti í ° alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) para la proteina F de hRSV en comparación con sus correspondientes secuencias de aminoácidos precursoras (como se describe en la solicitud PCT PCT/EP2009/056975 titulada "Secuencias de aminoácidos dirigidas contra proteínas de envolvente de un virus y polipéptidos que comprende las mismas para el tratamiento de enfermedades víricas" presentada por Ablynx N.V el 5 de junio de 2009) .
Durante la producción de los Nanobodies de la invención, un alto nivel de piro glutamato (pGlu) sobre el terminal amino se detectó por RP-HPLC. Niveles de más de 15% pGlu se detectaron después de la fermentación y el nivel de pGlu aumentaba uniformemente con el almacenamiento durante estudios de estabilidad. Tal modificación conduce a una heterogeneidad del producto final y necesita evitarse. El control/prevención de la formación de pGlu es por lo tanto crítica para mantener las proteínas terapéuticas dentro de sus especificaciones fijadas. Se necesitan formulaciones específicas de líquidos y/o condiciones de almacenamiento para proteínas con un Ácido glutámico N-terminal minimizando así la formación de ácido piro-glutámico.
En la presente invención, la posibilidad de modificación post-traduccional del pGlu del N-terminal fue eliminada al cambiar el Ácido glutámico en el N-terminal (E) [HOOC-(CH2)2 --proteína] dentro de un Ácido aspártico (D) [H00C-CH2 — proteína] lo cual condujo a una estabilidad aumentada de producto. Consecuentemente, la presente invención también se refiere a secuencias de aminoácidos y Nanobodies como se describe anteriormente en donde el Ácido glutámico en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) se cambia dentro de un Ácido aspártico.
La presente invención proporciona diversas secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® optimizadas en la secuencia que muestran una estabilidad creciente con el almacenamiento durante estudios de estabilidad. Por lo tanto, en un aspecto de la presente invención, secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® se proporcionan elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde la posición 1 (Glu) ha sido cambiada por Asp.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 62, en donde la posición 1 (Glu) ha sido cambiada por Asp.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 65, en donde la posición 1 (Glu) ha sido cambiada por Asp.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 76, en donde la posición 1 (Glu) ha sido cambiada por Asp.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o
Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-153, en donde la posición 1 (Glu) ha sido cambiada por Asp.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprendé o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 138. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 139. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 140. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 141. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 154-157.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes:
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde la posición 1 (Glu) ha sido cambiada por Asp.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde la posición 1 (Glu) ha sido cambiada por Asp.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde la posición 1 (Glu) ha sido cambiada por Asp.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde la posición 1 (Glu) ha sido cambiada por Asp.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
- Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp;
Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
GlulAsp;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
- GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la presente invención muestran propiedades mejoradas tales como por ejemplo, estabilidad mejorada, menor inmunogenicidad, características mejoradas de enlace (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiV y/o una velocidad kinac iv/ o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente), afinidad mejorada y/o avidez mejorada para la proteína F de hRSV y/o eficiencia mejorada y/o potencia para neutralizar hRSV en comparación con sus correspondientes secuencias de aminoácidos de tipo natural (como se describe en la solicitud PCT PCT/EP2009/056975 titulada "Secuencias de aminoácidos dirigidas contra proteínas de envolvente de un virus y polipéptidos que comprende las mismas para el tratamiento de enfermedades víricas" presentada por Ablynx N.V el 5 de junio de 2009) .
Más en particular, las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención pueden enlazarse a la proteína F de hRSV con una afinidad (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinacti , o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) preferiblemente tal que estas:
enlacen a la proteína F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 1000 nM a 1 nM o menos, preferiblemente 100 nM a 1 nM o menos, más preferiblemente 15 nM a 1 nM o incluso 10 nM a 1 nM o menos;
y/o tal que estas:
enlacen a la proteína F de hRSV con una velocidad kactiv de entre 104 M'V1 a alrededor de 107 M'V1, preferiblemente entre 105 M~1s"1 y 107 M~1s"1, más preferiblemente alrededor de 106 M"1s"1 o más;
y/o tal que estas:
enlacen a la proteína F de hRSV con una velocidad kinac iv entre 10"2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10~4 s'1 (suministrando un complejo casi irreversible con una ti/2 de días múltiples) , preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10"4 s"1, o inferior;
Algunos valores preferidos de IC5o para enlazar de las secuencias de aminoácidos de la invención a la proteína F de hRSV estarán claros a partir de la descripción adicional y ejemplos en la presente.
Los ensayos para determinar la IC50 incluyen ensayos de competencia tales como ELISA de competencia (por ejemplo, competencia con Synagis® o su fragmento Fab) o más preferiblemente ensayos de neutralización tales como el ensayo de microneutralización descrito por Anderson et al. (1985, J. Clin. Microbiol. 22: 1050-1052; 1988, J. Virol. 62: 4232-4238), modificaciones de este ensayo tales como por ejemplo, descritos en el Ejemplo 6, o un ensayo de reducción de placas como por ejemplo descrito por Johnson et al. (1997, J. Inf. Dis. 176: 1215-1224), y modificaciones de los mismos.
Por ejemplo, en un ensayo de competencia con el fragmento Fab de Synagis®, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 entre 1 nM y 100 nM, preferiblemente entre 10 nM y 50 nM, o menos.
Por ejemplo, en un ensayo de microneutralización sobre hRSV Larga (tal como por ejemplo, el descrito en el Ejemplo 6) las secuencias de aminoácidos de la invención pueden tener valores IC50 entre 100 n y 1000 nM, preferiblemente entre 100 nM y 500 nM, o menos.
Las secuencias de aminoácidos y Nanobodies® proporcionadas por la invención están preferiblemente en forma esencialmente aislada (como se definen en la presente) , o forman parte de un polipéptido de la invención (también referidas como "polipéptido de la invención" o "constructo de la invención"; ambos se usan de forma intercambiable), los cuales pueden comprender o consistir esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de la invención y los cuales pueden además opcionalmente comprender una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies® adicionales (todas opcionalmente ligadas por medio de una o más ligaduras adecuadas) .
Consecuentemente, en otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido (también referido en la presente como un "polipéptido de la invención") que comprende o consiste esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de la invención (o fragmentos adecuados de las mismas) .
El proceso de diseñar/seleccionar y/o preparar un polipéptido de la invención, iniciando a partir de una secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención, es también referido en la presente como "formateo" de dicha secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención; y una secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención que se hace parte de un polipéptido de la invención se dice que está "formateada" o estará "en el formato de" dicho polipéptido de la invención. Ejemplos de maneras en las cuales una secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención se puede formatear y ejemplos de tales formatos estarán claros para la persona experta con base en la descripción en la presente; y tales secuencias de aminoácidos o Nanobodies® formateados forman un aspecto adicional de la invención.
Por ejemplo, y sin limitación, la una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de la invención se pueden usar como una unidad de enlace en tal polipéptido, el cual puede contener opcionalmente una o más secuencias adicionales de aminoácidos que pueden servir como una unidad de enlace (es decir, contra el mismo u otro epitopo en la proteína F de hRSV y/o contra uno o más de otros antígenos, proteínas u objetivos que la proteína F de hRSV) , de manera de suministrar un polipéptido monovalente, multivalente, multiparatópico o multiespecífico de la invención, respectivamente, todos como se describe en la presente. La presente invención así también se refiere a un polipéptido que es un polipéptido o constructo monovalente que comprende o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención. La presente invención asi también se refiere a un polipéptido el cual es un polipéptido o constructo multivalente, tal como por ejemplo, un polipéptido bivalente o trivalente o constructo. La presente invención también se refiere a un polipéptido el cual es un polipéptido o constructo multiespecifico, tales como por ejemplo, un polipéptido o constructo biespecifico o triespecifico . La presente invención también se refiere a un polipéptido el cual es un polipéptido o constructo multiparatópico, tal como por ejemplo, un polipéptido o constructo bisparatópico o triparatópico .
Consecuentemente, en un aspecto preferido pero no limitante, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención comprende al menos una secuencia adicional de aminoácidos o Nanobody®, de manera de suministrar un polipéptido de la invención que comprende al menos dos, tales como dos, tres, cuatro, cinco o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies®, en lo cual dichas secuencias de aminoácidos o Nanobodies® puede ligarse opcionalmente por medio de una o más secuencias de ligadura (como se definen en la presente) . Polipéptidos de la invención que comprenden dos o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies®, de los cuales al menos una, y preferiblemente todo, es/son una secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención, también se referirán en la presente como polipéptidos "multivalents" de la invención, y las secuencias de aminoácidos o Nanobodies® presentes en tales polipéptidos también se referirán en la presente como que están en un "formato multivalente" . Por ejemplo un polipéptido "bivalente" de la invención comprende dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies®, opcionalmente ligados por medio de una secuencia de ligadura, mientras que un polipéptido "trivalente" de la invención comprende tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies®, opcionalmente ligados por medio de dos secuencias de ligadura; etc.; en lo cual al menos una de las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® presente en el polipéptido, y hasta todas las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® presentes en el polipéptido, son secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención.
En un polipéptido multivalente de la invención, las dos o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies® puede ser iguales o diferentes, y se pueden dirigir contra el mismo antigeno o determinante antigénico (por ejemplo contra la misma parte (s) o epitopo(s) o contra diferentes partes o epítopos) o pueden dirigirse alternativamente contra diferentes antigenos o determinante antigénicos; o cualquier combinación adecuada de los mismos. Por ejemplo, un polipéptido bivalente de la invención puede comprender (a) dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies®; (b) una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un primer determinante antigénico de una proteina o antigeno y una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra el mismo determinante antigénico de dicha proteina o antigeno el cual es diferente de la primera secuencia de aminoácidos o Nanobody®; (c) una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un primer determinante antigénico de una proteina o antigeno y una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra otro determinante antigénico de dicha proteina o antigeno; o (d) una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra una primera proteina o antigeno y una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra una segunda proteina o antigeno (es decir, diferentes de dicho primer antigeno) . Similarmente, un polipéptido trivalente de la invención puede, por ejemplo y sin limitarse a ello, comprender (a) tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies®; (b) dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobody® contra un primer determinante antigénico de un antigeno y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un diferente determinante antigénico del mismo antigeno; (c) dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® contra un primer determinante antigénico de un antigeno y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un segundo antigeno diferente de dicho primer antigeno; (d) una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un primer determinante antigénico de un primer antigeno, una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un segundo determinante antigénico de dicho primer antigeno y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un segundo antigeno diferente de dicho primer antígeno; o (e) una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un primer antigeno, una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un segundo antigeno diferente de dicho primer antigeno, y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un tercer antigeno diferente de dicho primero y segundo antígeno .
En un aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de la invención (como se describe anteriormente) .
En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de secuencias de aminoácidos que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de secuencias de aminoácidos que comprenden dos o más extensiones de residuos de aminoácidos en lo cual una extensión es elegida de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una extensión se escoge de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
tal que la extensión de residuos de aminoácidos que corresponde a uno de a) , y b) debería estar siempre presente en la secuencia de aminoácidos que forma parte del polipéptido multivalente y tal que la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge de uno de c) , d) , e) y f ) .
Los polipéptidos multivalentes preferidos (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de secuencias de aminoácidos que comprenden tres o más extensiones de residuos de aminoácidos, en lo cual la primera extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 102;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y la tercera extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que consisten esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente) , en lo cual CDR2 se escoge de:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que consisten esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente) , en lo cual CDR2 se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 102; o
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una de CDR1 o CDR3 se escoge de:
CDR1 elegida del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
CDR3 elegida del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121; o
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Preferiblemente, los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que consisten esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en lo cual:
CDR1 se escoge del grupo que consiste de: a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
CDR2 se escoge del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 102; o
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y
CDR3 se escoge del grupo que consiste de: e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En un aspecto especifico, los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102.
En otro aspecto especifico, los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (CDR sequence) elegida de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos multivalentes preferidos (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos dos extensiones de residuos de aminoácidos (secuencias CDR) en lo cual una extensión se escoge del grupo que consiste de las extensiones de residuos de aminoácidos definidas en c) y d) y en lo cual la otra extensión se escoge del grupo que consiste de las extensiones de residuos de aminoácidos definidas en e) y f ) .
En un aspecto especifico, los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) pueden comprender o consistir esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticos) o al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegida de SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 121; o secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 121.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de la invención (como se describe anteriormente) . En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de la invención (como se describe anteriormente) . En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de la invención (como se describe anteriormente) .
La invención también proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la' secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 60-76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de SEQ ID NO' s: 65 y 76.
La invención también proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos ,o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 146-153.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV'con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Los polipéptidos preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
- Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg,
Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y
Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 60-76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 65 y 76.
La invención también proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19,
Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 146-153.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia-de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con:
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Los polipéptidos preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres (preferiblemente idénticas)- secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
- Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg,
Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; - Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
La invención también proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente como se describe anteriormente en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por un ácido aspártico .
A este respecto, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® elegidas de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody®que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Argr Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: -Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido multivalente, preferiblemente un polipéptido bivalente o trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención es un polipéptido bivalente y comprende o consiste esencialmente de dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 60-76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención es un polipéptido bivalente y comprende o consiste esencialmente de dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención es un polipéptido bivalente y comprende o consiste esencialmente de dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de SEQ ID NO's: 65 y 76.
La invención también proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención es un polipéptido bivalente y comprende o consiste esencialmente de dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 146-153.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) ' la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Los polipéptidos preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de dos secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; - Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
La invención también proporciona un polipéptido bivalente como se describe anteriormente en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por un ácido aspártico .
A este respecto, la invención también proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® elegidas de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
- GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu,
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln; GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
- GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención es un polipéptido trivalente y comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 60-76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención es un polipéptido trivalente y comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención es un polipéptido trivalente y comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 65 y 76.
La invención también proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención es un polipéptido trivalente y comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 146-153.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Árginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, la invención un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
- SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Los polipéptidos preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® elegidas de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho , nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos o Nanobodies® que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; - Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp;
Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; - Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg,
Asp85Glu y Argl05Gln.
Un polipéptido multivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® con SEQ ID NO: 62. Otro polipéptido multivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® con SEQ ID NO: 65. Otro polipéptido multivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® con SEQ ID NO: 76. Otro polipéptido multivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® con SEQ ID NO: 75. Otro polipéptido multivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® con SEQ ID NO: 147. Otro polipéptido multivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® con SEQ ID NO: 149. Otro polipéptido multivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos o Nanobodies® con SEQ ID NO: 153.
La invención también proporciona un polipéptido trivalente como se describe anteriormente en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por un ácido aspártico .
A este respecto, la invención también proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 6 1 aminoácidos .
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® elegidas de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
- GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu,
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln; GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
- GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO's: 77-79 y 158;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 77-79 y 158, con la condición de que:
i) las secuencias de aminoácidos o Nanobodies® abarcada en dicho polipéptido have a Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78, una Arginina (Arg, R) en la posición 83 y/o a Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En un aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO's: 77-79 y 158;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 77-79 y 158, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78, una Arginina (Arg, R) en la posición 83 y a Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos trivalentes preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 77-79 y 158.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO: 78 y 79;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 78 y 79, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78, una Arginina (Arg, R) en la posición 83 y/o a Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En un aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO: 78 y 79; o
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 78 y 79, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78, una Arginina (Arg, R) en la posición 83 y a Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Un polipéptido trivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 78. Otro polipéptido trivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 79.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO' s: 159-161;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de G diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 159-161, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat ) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos trivalentes preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 159-161.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO' s: 159-161;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 159-161, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO' s: 159-161;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 159-161, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando el polipéptido tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con:
SEQ ID NO: 159, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 160, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 161, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Los polipéptidos trivalentes preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 159-161.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguiéntes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres)
Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77. En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78. En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 158-161.
Durante la producción de los polipéptidos de la invención, un alto nivel de piro glutamato (pGlu) en la terminal amino se detectó por RP-HPLC. Los niveles de más de 15% pGlu se detectaron después de la fermentación y los niveles de pGlu se incrementaron escalonadamente con el almacenamiento durante estudios de estabilidad. Tal modificación lleva a heterogeneidad del producto final y necesita evitarse. El control/prevención de la formación de pGlu es por lo tanto critic para mantener proteínas terapéuticas con sus especificaciones de ajuste. Se necesitan formulaciones líquidas y/o condiciones de almacenamiento específicas para proteínas con un Ácido glutámico de terminal N minimizando así la formación de Ácido piroglutámico.
En la presente invención, la posibilidad de modificación post-traduccional pGlu de la terminal N se eliminó al cambiar el Ácido glutámico de terminal N (E) [HOOC-(CH2)2 proteína] dentro de un Ácido aspártico (D) [H00C-CH2 proteína] que llevan a una estabilidad del producto incrementada. Consecuentemente, la presente invención también se refiere a polipéptidos como se describe anteriormente en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de un Ácido aspártico.
La presente invención proporciona diversos polipéptidos optimizados en secuencia que muestran una estabilidad creciente con el almacenamiento durante estudios de estabilidad. Consecuentemente, la invención proporciona un polipéptido trivalente como se describe anteriormente, en donde el primer aminoácido (Ácido glutámico) ha sido cambiado por Ácido aspártico.
En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido trivalente elegido de los siguientes polipéptidos:
a) SEQ ID NO's: 142-145 y 162-165;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 142-145 y 162-165, con la condición de que:
i) la primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Un polipéptido trivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 142. Otro polipéptido trivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 143. Otro polipéptido trivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 144. Otro polipéptido trivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 145. Otro polipéptido trivalente preferido de la invención comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO' s: 162-165.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 77, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 78, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 79, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 158, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 159, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 160, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 161, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres)
Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres)
Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico (GlulAsp) .
En otro aspecto preferido, la invención proporciona un polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres)
Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
- GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu Glnl08Leu y
Argl05Gln;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142. En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 143. En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144. En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 145. En otro aspecto preferido, el polipéptido de la invención consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 162-165.
Los polipéptidos con las secuencias de aminoácidos y secuencias de polipéptido como se describe anteriormente han mostrado propiedades ventajosas para uso como agentes farmacológicamente activos y/o terapéuticos, profilácticos tales como por ejemplo, estabilidad mejorada, menor inmunogenicidad, características mejoradas de enlace (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor K¾ (real o aparente) , una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) , afinidad mejorada y/o avidez mejorada para la proteina F de hRSV y/o eficiencia mejorada y/o potencia para neutralizar hRSV.
Más en particular, estos polipéptidos y compuestos de la invención pueden enlazarse a la proteina F de hRSV con una afinidad (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor ?? (real o aparente) , una velocidad kactív y/o una velocidad kinactiV, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) preferiblemente tal que estos:
enlacen a la proteina F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 100 nM hasta 0.1 nM o menos, preferiblemente 10 nM hasta 0.1 nM o menos, más preferiblemente 1 nM hasta 0.1 nM o menos;
y/o tal que estos:
enlacen a la proteina F de hRSV con una velocidad activ de entre 104 M"1s"1 hasta alrededor de 107 M_1s_1, preferiblemente entre 105 M^s"1 y 107 M~1s"1, más preferiblemente alrededor de 106 M"1s-1 o más;
y/o tal que estos:
enlacen a la proteina F de hRSV con a velocidad inactiv entre 10"2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10.4 s'1 (suministrando un complejo casi irreversible con un tí/2 de días múltiples) , preferiblemente entre 10~3 s-1 y 10~4 s_1, más preferiblemente entre 5xl0"3 s_1 y 10"4 s"1, o inferior;
Algunos valores IC50 preferidos para enlazar los polipéptidos de la invención a la proteina F de hRSV estarán claros a partir de la descripción adicional y ejemplos en la presente .
Los ensayos para determinar el IC50 incluyen ensayos de competencia tales como ELISA de competencia (por ejemplo, competition con Synagis® o su fragmento Fab) o más preferiblemente ensayos de neutralización tales como el ensayo de microneutralización descrito por Anderson et al. (1985, J. Clin. Microbiol. 22: 1050-1052), modificación de este ensayo como se describe en ejemplo 6, o un ensayo de reducción de placas como el descrito por Johnson et al. (1997, J. Inf. Dis. 176: 1215-1224), y modificaciones de los mismos .
Por ejemplo, en un ensayo de competencia con Synagis®, los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC50 entre 1 nM y 100 nM, preferiblemente entre 10 nM y 50 nM, o menos .
Por ejemplo, en un ensayo de microneutralización de RSV de cepa Larga (tales como por ejemplo, descrito en el Ejemplo 6) los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC50 entre 10 p y 1000 pM, preferiblemente entre 10 pM y 250 p , más preferiblemente entre 50 pM y 200 pM o menos. En un ensayo de microneutralización, los polipéptidos de la invención pueden tener valores IC50 que son al menos iguales y preferiblemente mejores, al menos diez veces mejores, preferiblemente veinte veces mejores, más preferiblemente cincuenta veces mejores, incluso más preferiblemente sesenta, setenta, ochenta o más veces mejor en comparación con el valor IC50 obtenido con Synagis®.
La invención también se refiere a un polipéptido o constructo monovalente (también referido como "polipéptido monovalente de la invención" o "constructo monovalente de la invención") , que comprende o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención. Los constructos monovalentes preferidos de la invención comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 60-76, tales como una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, tales como por ejemplo, SEQ ID NO's: 65 o 75; una de SEQ ID NO's: 138-141; una de SEQ ID NO's: 146-153; o una de SEQ ID NO's: 154-157. Tales constructos monovalentes, asi como las secuencias de aminoácidos y Nanobodies® de la invención pueden usarse para la preparación de un polipéptido de la invención, tales como por ejemplo, los polipéptidos multivalentes de la invención descritos arriba.
Los polipéptidos de la invención pueden en general prepararse por un método que comprende al menos la etapa de ligar de forma apropiada la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o constructo monovalente de la invención a una o más secuencias adicionales de aminoácidos, Nanobodies® o constructos monovalentes de la invención, opcionalmente por medio de una o más ligaduras apropiadas, de manera de suministrar el polipéptido de la invención. Los polipéptidos de la invención también pueden prepararse por un método que en general comprende al menos las etapas de proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, expresar dicho ácido nucleico de una manera apropiada, y recuperar el polipéptido de la invención expresado. Tales métodos pueden realizarse en una forma conocida per se, que será clara para la persona experta, por ejemplo con base en los métodos y técnicas además descrito en la presente.
Un método para preparar aminoácidos multivalentes , multiparatópicos y/o multiespecificos o polipéptidos de la invención pueden comprender al menos las etapas de ligar dos o más secuencias de aminoácidos monovalentes o constructos monovalentes de la invención y por ejemplo una o más ligaduras en conjunto de una manera apropiada. Los constructos monovalentes (y ligaduras) pueden acoplarse por cualquier método conocido en la técnica y como se describe además en la presente. Las técnicas preferidas incluyen la ligadura de las secuencias de ácidos nucleicos que codifica los constructos monovalentes (y ligaduras) para preparar un constructo genético que expresa la secuencia de aminoácidos multivalente, multiparatópica y/o multiespecifica o polipéptido. Las técnicas para ligar secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos será clara para la persona experta, y se hace referencia nuevamente a los manuales estándar, tales como Sambrook et al. y Ausubel et al., mencionados arriba, asi como los siguientes Ejemplos.
Consecuentemente, la presente invención también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody® o un constructo monovalente de la invención en la preparación de un polipéptido multivalente de la invención. El método para la preparación de un polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody® o un constructo monovalente de la invención a al menos una secuencia adicional de aminoácidos, Nanobody® o constructo monovalente de la invención, opcionalmente por medio de una o más ligaduras. La secuencia de aminoácidos, Nanobody® o constructo monovalente se usa entonces como un dominio de enlace o unidad de enlace en proporcionar y/o preparar el polipéptido multivalente que comprende dos (por ejemplo, en un polipéptido bivalente), tres (por ejemplo, en un polipéptido trivalente) o más (por ejemplo, en un polipéptido multivalente) unidades de enlace. A este respecto, la secuencia de aminoácidos, Nanobody® y constructo monovalente se pueden usar como un dominio de enlace o unidad de enlace en proporcionar y/o preparar un polipéptido multivalente y preferiblemente bivalente o trivalente de la invención que comprende dos, tres o más unidades de enlace. Preferiblemente, los dominios de enlace o unidades de enlace se ligan por medio de una ligadura tal que el polipéptido multivalente preferiblemente exhibe enlace intramolecular en comparación con enlace intermolecular. También preferiblemente el polipéptido multivalente puede unir simultáneamente ambos o todos los tres sitio de enlaces en la proteina F de RSV.
Consecuentemente, la presente invención también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos o a Nanobody® de la invención (como se describe anteriormente) en la preparación de un polipéptido multivalente. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de la secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales o Nanobody® de la invención, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido multivalente . El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 60-76.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes :
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o a Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente . El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes :
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76; o
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente . El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente . El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente . El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76.
En un aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
en la preparación de un polipéptido multivalente . El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-153.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes :
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente . El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes :
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
- SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
en la preparación de un polipéptido multivalente . El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido multivalente .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, ArglOSGln; Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
en la preparación de un polipéptido multivalente .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegidas de las anteriores en donde el aminoácido (Ácido glutámico) en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente .
A este respecto, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes: a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente . El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 138. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 139. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 140. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 141. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido multivalente comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 154-157.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
- GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
en la preparación de un polipéptido multivalente .
La presente invención también se refiere al uso de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención (como se describe anteriormente) en la preparación de un polipéptido bivalente. El método para la preparación del polipéptido bivalente comprenderá la ligadura de las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de ' la invención, opcionalmente por medio de una ligadura.
Consecuentemente, en un aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 6 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido bivalente. El método para la preparación del polipéptido bivalente comprenderá la ligadura de dichas secuencias de aminoácidos una a la otra, opcionalmente por medio de una ligadura.
En un aspecto preferido, las dos secuencias de aminoácidos usadas para preparar el polipéptido bivalente comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 60-76.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición^ de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o a Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido bivalente. El método para la preparación del polipéptido bivalente comprenderá la ligadura de dichas secuencias de aminoácidos una a la otra, opcionalmente por medio de una ligadura.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con- la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido bivalente. El método para la preparación del polipéptido bivalente comprenderá la ligadura de dichas secuencias de aminoácidos una a la otra, opcionalmente por medio de una ligadura.
En un aspecto preferido, las dos secuencias de aminoácidos usadas en la preparación de un polipéptido bivalente comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido bivalente. El método para la preparación del polipéptido bivalente comprenderá la ligadura de dichas secuencias de aminoácidos una a la otra, opcionalmente por medio de una ligadura.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: : 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o 'la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido bivalente. El método para la preparación del polipéptido bivalente comprenderá la ligadura de dichas secuencias de aminoácidos una a la otra, opcionalmente por medio de una ligadura.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
en la preparación de un polipéptido bivalente. El método para la preparación del polipéptido bivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una secuencia adicional de aminoácidos, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoácidos usadas en la preparación de un polipéptido bivalente comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-153.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arqinina (Arq, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arqinina (Arq, R) en la posición 83, Ácido qlutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de abat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido bivalente. El método para la preparación del polipéptido bivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una secuencia adicional de aminoácidos, opcionalmente por medio de una o más liqaduras.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R)- en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
en la preparación de un polipéptido bivalente. El método para la preparación del polipéptido bivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoácidos usadas en la preparación de un polipéptido bivalente comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de dos (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; o
Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegidas de las anteriores en donde el aminoácido (Ácido glutámico) en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
A este respecto, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes: a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido bivalente. El método para la preparación del polipéptido bivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una de las secuencias de aminoácidos adicionales, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido bivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 138. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido bivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 139. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido bivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 140. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido bivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 141. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido bivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 154-157.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln; GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
- GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
La presente invención también se refiere al uso de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención (como se describe anteriormente) en la preparación de un polipéptido trivalente. El método para la preparación del polipéptido trivalente comprenderá la ligadura de las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® de la invención, opcionalmente por medio de una o dos ligaduras.
En un aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido trivalente. El método para la preparación del polipéptido trivalente comprenderá la ligadura de dichas secuencias de aminoácidos una a la otra, opcionalmente por medio de una o dos ligaduras .
En un aspecto preferido, las tres secuencias de aminoácidos usadas para preparar el polipéptido trivalente comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 60-76.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o a Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido trivalente. El método para la preparación del polipéptido trivalente comprenderá la ligadura de dichas secuencias de aminoácidos una a la otra, opcionalmente por medio de una o dos ligaduras .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido trivalente. El método para la preparación del polipéptido trivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos una a la otra, opcionalmente por medio de una o dos ligaduras.
En un aspecto preferido, las tres secuencias de aminoácidos usadas en la preparación de un polipéptido trivalente comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de abat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido trivalente. El método para la preparación del polipéptido trivalente comprenderá la ligadura de dichas secuencias de aminoácidos una a la otra, opcionalmente por medio de una o dos ligaduras .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: : 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido trivalente. El método para la preparación del polipéptido trivalente comprenderá la ligadura de dichas secuencias de aminoácidos una a la otra, opcionalmente por medio de una o dos ligaduras .
En un aspecto preferido, las tres secuencias de aminoácidos usadas para preparar el polipéptido trivalente comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 65. En otro aspecto preferido, las tres secuencias de aminoácidos usadas para preparar el polipéptido trivalente comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 76.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
en la preparación de un polipéptido trivalente. El método para la preparación del polipéptido trivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una secuencia adicional de aminoácidos, opcionalmente por medio de una o dos ligaduras.
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoácidos usadas en la preparación de un polipéptido trivalente comprenden o consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-153.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido trivalente. El método para la preparación del polipéptido trivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una secuencia adicional de aminoácidos, opcionalmente por medio de una o dos ligaduras.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos elegidas de las siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y/o Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
en la preparación de un polipéptido trivalente. El método para la preparación del polipéptido trivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos una secuencia adicional de aminoácidos, opcionalmente por medio de una o dos ligaduras.
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoácidos usadas en la preparación de un polipéptido trivalente comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de tres (preferiblemente idénticas) secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
- Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg,
Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; - Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 62 para preparar SEQ ID NO: 77. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 62 a al menos dos además secuencias de aminoácidos con SEQ ID NO: 62, por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 65 para preparar SEQ ID NO: 78. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 65 a al menos dos además secuencias de aminoácidos con SEQ ID NO: 65, por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 76 para preparar SEQ ID NO: 79. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 76 a al menos dos además secuencias de aminoácidos con SEQ ID NO: 76, por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 75 para preparar SEQ ID NO: 158. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 75 a al menos dos además secuencias de aminoácidos con SEQ ID NO: 75, por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 147 para preparar SEQ ID NO:
159. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 147 a al menos dos además secuencias de aminoácidos con SEQ ID NO: 147, por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128).
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 149 para preparar SEQ ID NO:
160. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 149 a al menos dos además secuencias de aminoácidos con SEQ ID NO: 149, por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128).
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 153 para preparar SEQ ID NO: 161. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 153 a al menos dos además secuencias de aminoácidos con SEQ ID NO: 153, por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128).
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegidas de las anteriores en donde el aminoácido (Ácido glutámico) en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
A este respecto, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos elegida de las siguientes: a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor, de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido trivalente. El método para la preparación del polipéptido trivalente comprenderá la ligadura de dicha secuencia de aminoácidos a al menos dos además secuencias de aminoácidos, opcionalmente por medio de una o más ligaduras.
En un aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido trivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 138. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido trivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 139. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido trivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 140. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido trivalente comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 141. En otro aspecto preferido, la secuencia de aminoácidos usada en la preparación de un polipéptido trivalente comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 154-157.
En otro aspecto preferido, la presente invención se, refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
- GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 138 para preparar SEQ ID NO: 142. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 138 a al menos dos además secuencias de aminoácidos (preferiblemente SEQ ID NO: 5) , por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 139 para preparar SEQ ID NO: 143. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 139 a al menos dos además secuencias de aminoácidos (preferiblemente SEQ ID NO: 62), por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 140 para preparar SEQ ID NO:
144. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 140 a al menos dos además secuencias de aminoácidos (preferiblemente SEQ ID NO: 65) , por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 154 para preparar SEQ ID NO: 162. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 154 a al menos dos además secuencias de aminoácidos (preferiblemente SEQ ID NO: 75), por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 155 para preparar SEQ ID NO: 163. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 155 a al menos dos además secuencias de aminoácidos (preferiblemente SEQ ID NO: 147), por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 156 para preparar SEQ ID NO:
164. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 156 a al menos dos además secuencias de aminoácidos (preferiblemente SEQ ID NO: 149) , por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
En otro aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de SEQ ID NO: 157 para preparar SEQ ID NO:
165. El método para la preparación del polipéptido multivalente comprenderá la ligadura de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 157 a al menos dos además secuencias de aminoácidos (preferiblemente SEQ ID NO: 153) , por medio de un ligador 15GS (SEQ ID NO: 128) .
Los polipéptidos de la invención que contienen al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies®, en lo cual al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® está dirigida contra un primer antigeno (es decir, contra proteina F de hRSV) y al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® está dirigida contra a segundo antigeno (es decir, diferentes de la proteina F de hRSV) , también se referirán como polipéptidos "multiespecificos" de la invención, y las secuencias de aminoácidos o Nanobodies® presentes en tales polipéptidos también se referirán en la presente como que están en un "formato multiespecifico" . Así, por ejemplo, un polipéptido "biespecífico" de la invención es un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención dirigida contra un primer antígeno (es decir, proteína F de hRSV) y al menos una secuencia adicional de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un segundo antígeno (es decir, diferentes de la proteína F de hRSV) , mientras que un polipéptido "triespecífico" de la invención es un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención dirigida contra un primer antígeno (es decir, proteína F de hRSV) , al menos una secuencia adicional de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra a segundo antígeno (es decir, diferentes de la proteína F de hRSV) y al menos una secuencia adicional de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un tercer antígeno (es decir, diferentes de tanto la proteína F de hRSV como el segundo antígeno) ; etc.
Consecuentemente, en su forma más sencilla, un polipéptido biespecífico de la invención es un polipéptido bivalente de la invención (como se definen en la presente) , que comprende una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención dirigida contra proteína F de hRSV, y una segundo secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un segundo antigeno, en lo cual dicha primera y segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody® puede ligarse opcionalmente por medio de una secuencia de ligadura (como se definen en la presente) ; mientras que un polipéptido triespecifico de la invención en su forma más sencilla es un polipéptido trivalente de la invención (como se definen en la presente) , que comprende una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención dirigida contra proteina F de hRSV, una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un segundo antigeno y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra un tercer antigeno, en lo cual dicha primera, segunda y tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody® puede ligarse opcionalmente por medio de una o más, y en particular dos, secuencias de ligadura.
En un aspecto especifico, el polipéptido de la invención es un polipéptido biespecifico, trivalente. Un polipéptido biespecifico, trivalente de la invención en su forma más sencilla puede ser un polipéptido trivalente de la invención (como se definen en la presente) , que comprende dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® contra proteina F de hRSV y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra otro antigeno, en lo cual dicha primera, segunda y tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody® puede ligarse opcionalmente por medio de una o más, y en particular dos, secuencias de ligadura.
Un ejemplo preferido, pero no limitante de un polipéptido multiespecifico de la invención comprende al menos una secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención y al menos uno Nanobody® que proporciona una vida media incrementada. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales Nanobodies® incluyen Nanobodies® dirigidos contra proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano, proteína enlazada a la tiroxina, (humano) transíerrina, fibrinógeno, una inmunoglobulina tales como IgG, igE o IgM, o una de las otras proteínas de suero enlistadas en WO 04/003019.
Por ejemplo, para experimentos en ratones, los Nanobodies® contra albúmina de suero de ratón (MSA) pueden usarse, mientras que para uso farmacéutico, los Nanobodies® contra albúmina de suero humano pueden usarse.
Otra modalidad de la presente invención es un constructo de polipéptido como se describe anteriormente en donde dicha al menos una proteína de suero (humano) es cualquiera de (humana) albúmina de suero, (humana) inmunoglobulinas de suero, (humana) proteína enlazada a la tiroxina, (humana) transíerrina, (humano) fibrinógeno, etc.
Consecuentemente, en un aspecto especifico, el polipéptido de la invención es un polipéptido biespecifico que comprende una primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención contra proteina F de hRSV y una segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra (humana) albúmina de suero, en lo- cual dicha primera y segunda secuencia de aminoácidos o Nanobody® puede ligarse opcionalmente por medio de a secuencia de ligadura.
En otro aspecto especifico, el polipéptido de la invención es un polipéptido biespecifico, trivalente, que comprende dos secuencias idénticas de aminoácidos o Nanobodies® de la invención contra proteina F de hRSV y una tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra (humana) albúmina de suero, en lo cual dicha primera, segunda y tercera secuencia de aminoácidos o Nanobody® puede ligarse opcionalmente por medio de una o más, y en particular dos, secuencias de ligadura.
En otro aspecto especifico, el polipéptido de la invención es un polipéptido biespecifico, tetravalente, que comprende tres secuencias de aminoácidos idénticas o Nanobodies® de la invención contra proteina F de hRSV y una cuarta secuencia de aminoácidos o Nanobody® dirigida contra (humana) albúmina de suero, en lo cual dicha primera, segunda, tercera y cuarta secuencia de aminoácidos o Nanobody® puede ligarse opcionalmente por medio de una o más, y en particular dos o tres, secuencias de ligadura.
De acuerdo con un aspecto especifico, pero no limitante, de la invención, los polipéptidos de la invención contienen, además de una o más secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de la invención, al menos un Nanobody® contra albúmina de suero humano. Estos Nanobodies® contra albúmina de suero humano pueden ser como se describe en general en las solicitudes por Ablynx N.V. citada arriba (ver por ejemplo WO 04/062551) . Algunos Nanobodies® particularmente preferidos que proporcionan vida media incrementada y que pueden usarse en los polipéptidos de la invención incluyen los Nanobodies® ALB-1 a ALB-10 descritos en WO 06/122787 (ver Tablas II y III) de lo cual ALB-8 (SEQ ID NO: 62 en WO 06/122787) es particularmente preferido.
En otro aspecto, la invención se refiere a un compuesto o constructo, y en particular una proteina o polipéptido (también referida en la presente como un "compuesto de la invención") que comprende o consiste esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y/o polipéptidos de la invención (o fragmentos adecuados de las mismas) , y opcionalmente además comprende uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace. Como se volverá claro para la persona experta a partir de la descripción adicional en la presente, tales grupos, residuos, porciones, unidades de enlace o secuencias de aminoácidos adicionales pueden o no suministrar además funcionalidad a la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención (y/o al compuesto, constructo o polipéptido en lo cual se presenta) y puede o no modificar las propiedades de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® y/o polipéptido de la invención .
Tales grupos, residuos, porciones o unidades de enlace pueden por ejemplo ser grupos, residuos, porciones químicas, que pueden o no por sí mismos ser biológicamente y/o farmacológicamente activos. Por ejemplo, y sin limitación, tales groups pueden ligarse a una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y/o polipéptidos de la invención de manera de suministrar un "derivado" de una secuencia de aminoácidos, Nanobody® y/o polipéptido de la invención, como se describe además en la presente.
También están dentro del alcance de la presente invención compuestos o constructos que comprenden o consisten esencialmente de uno o más derivados como se describe en la presente, y opcionalmente además comprenden uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace, opcionalmente ligados por medio de una o más ligaduras.
Preferiblemente, dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son secuencias de aminoácidos.
En los compuestos, constructos o polipéptidos descritos arriba, la una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y/o polipéptidos de la invención y el uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de enlace pueden ser ligados directamente una a la otra y/o por medio de una o más ligaduras o espaciadores apropiados. Por ejemplo, cuando el uno o más grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son secuencias de aminoácidos, las ligaduras también pueden ser secuencias de aminoácidos, de manera que el compuesto, constructo o polipéptido resultante es una (proteina) de fusión o (polipéptido) de fusión.
El compuesto o constructo de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención, que se fusiona en su extremo de terminal amino, en su extremo de terminal carboxi, o ambos en su extremo de terminal amino y en su extremo de terminal carboxi a al menos una secuencia adicional de aminoácidos, es decir, de manera de suministrar una proteina de fusión que comprende dicha secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención y la una o más secuencias de aminoácidos adicionales.
La una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden ser cualquiera de las secuencias de aminoácidos apropiadas y/o deseadas. Las secuencias de aminoácidos adicionales pueden o no cambiar, alterar o de otra manera influenciar las propiedades (biológicas) de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención, y pueden o no agregar además funcionalidad a la secuencia de • aminoácidos, Nanobody® o el polipéptido de la invención. Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos adicionales son tales que confieren una o más propiedades o funcionalidades deseadas a la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o el polipéptido de la invención.
Ejemplo de tales secuencias de aminoácidos será claro para la persona experta, y pueden comprender en general todas las secuencias de aminoácidos que son usadas en fusiones de péptido basadas en anticuerpos convencionales y fragments de los mismos (incluyendo pero no limitado a ScFv' s y anticuerpos de dominio sencillo) . Se hace referencia por ejemplo a la revisión por Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005) .
Por ejemplo, tal secuencia de aminoácidos puede ser una secuencia de aminoácidos que incrementa la vida media, la solubilidad, o la absorción, reduce la inmunogenicidad o la toxicidad, elimina o atenúa efectos colaterales indeseables, y/o confiere otras propiedades ventajosas a y/o reduce las propiedades indeseadas de los compuestos de la invención, en comparación con la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención per se. Algunos ejemplos no limitativos de tales secuencias de aminoácidos son proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano (ver por ejemplo WO 00/27435) o moléculas apténicas (por ejemplo haptenos que se reconocen por anticuerpos circulantes, ver por ejemplo WO 98/22141) .
Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden proporcionar un segundo sitio de enlace, cuyo sitio de enlace puede ser dirigido contra cualquier proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo deseado (incluyendo pero no limitado a la misma proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo contra la cual la secuencia de aminoácidos o Nanobody® de la invención se dirige, o a diferentes proteínas, polipéptidos, antígenos, determinante antigénicos o epítopos) . Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos adicionales pueden proporcionar un segundo sitio de enlace que está dirigido contra una proteína de suero (tales como, por ejemplo, albúmina de suero humano o otro proteína de suero tales como IgG) , de manera de suministrar vida media incrementada en el suero. Tales secuencias de aminoácidos por ejemplo incluyen Nanobodies®, así como los péptidos pequeños y proteínas enlazadas como se describe en WO 91/01743, WO 01/45746 y WO 02/076489 y los dAb descritos en WO 03/002609 y WO 04/003019. También se hace referencia a Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42, 2005, así como a EP 0 368 684, así como a WO 08/028977, WO 08/043821, WO 08/043822 por Ablynx N.V. y WO 08/068280.
Tales secuencias de aminoácidos pueden ser en particular dirigidas contra albúmina de suero (y más en particular albúmina de suero humano) y/o contra IgG (y más en particular human IgG) . Por ejemplo, tales secuencias de aminoácidos puede ser secuencias de aminoácidos que son dirigidas contra (humana) albúmina de suero y secuencias de aminoácidos que pueden enlazarse a residuos de aminoácidos en (humana) albúmina de suero que que no están involucrados en el enlace de albúmina de suero a FcRn (ver por ejemplo WO 06/0122787) y/o secuencias de aminoácidos que son capaces de enlazar a residuos de aminoácidos en albúmina de suero que no forman parte del dominio III de albúmina de suero (ver nuevamente por ejemplo WO 06/0122787); secuencias de aminoácidos que tienen o pueden proporcionar una vida media incrementada (ver por ejemplo WO 08/028977); secuencias de aminoácidos contra albúmina de suero humano que son de reactividad cruzada con albúmina de suero de al menos una especie de mamífero, y en particular con al menos una especie de primate (tales como, sin limitación, monos del género Macaca (tales como, y en particular, monos cynomolgus {Macaca fascicularis) y/o monos rhesus [Macaca mulatta) ) y babuinos {Papio ursinus) , se hace referencia nuevamente a WO 08/028977); secuencias de aminoácidos que pueden enlazarse a albúmina de suero en una manera independiente del pH (ver por ejemplo WO 08/043821) y/o secuencias de aminoácidos que son agentes de enlace acondicionadores (ver por ejemplo WO 08/043822).
De acuerdo con otra modalidad, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender una o más partes, fragmentos o dominios de anticuerpos de 4 cadenas convencionales (y en particular anticuerpos humanos) y/o de anticuerpos de cadena pesada. Por ejemplo, aunque usualmente menos preferidos, una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención pueden ligarse a un dominio VH o VL (preferiblemente humano) convencional o a un análogo natural o sintético de un dominio VH o VL, nuevamente opcionalmente por medio de una secuencia de ligadura (incluyendo pero no limitado a otros anticuerpos de dominio (sencillo), tales como los dAb descritos por Ward et al.).
Consecuentemente, en el compuesto o constructo de la invención, dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace pueden ser elegidos del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio sencillo, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio sencillo, "dAb", secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un dAb, o Nanobodies®.
En un aspecto específico de la invención, el compuesto, constructo o polipéptido de la invención que comprende al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención pueden tener una vida media incrementada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente, Nanobody® o polipéptido de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales compuestos, constructos y polipéptidos se volverán claros para la persona experta con base en la descripción adicional en la presente, y por ejemplo comprenden secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos de la invención que se han modificado químicamente para incrementar la vida media de los mismos (por ejemplo, por medio de pegilación) ; o compuestos de la invención que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención que se liga con al menos una porción (y en particular al menos una secuencia de aminoácidos) que incrementa la vida media de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención. Ejemplos de compuestos de la invención que comprenden tales porciones que extienden la vida media se volverán claras para la persona experta con base en la descripción adicional en la presente; y por ejemplo incluyen, sin limitación, compuestos en los cuales una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos de la invención se ligan apropiadamente a una o más proteínas de suero o fragmentos de los mismos (tales como albúmina de suero o fragmentos apropiados de los mismos) o a una o más unidades de enlace que pueden enlazarse a proteínas de suero (tales como, por ejemplo, Nanobodies® o anticuerpos de dominio (sencillos) que pueden enlazarse a proteínas de suero tales como albúmina de suero, inmunoglobulinas de suero tales como IgG, o transíerrina ) ; compuestos en los cuales una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención están ligados a una porción Fe (tales como una Fe humana) o una parte apropiada o fragmento de los mismos; o compuestos en los cuales una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos de la invención se ligan apropiadamente a una o más proteínas o péptidos pequeños que pueden enlazarse a proteínas de suero (tales como, sin limitación, las proteínas y péptidos descritos en WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489) .
Al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido también pueden ser ligados a uno o más (preferiblemente humanos) dominios CH1, CH2 y/o CH3, opcionalmente por medio de una secuencia de ligadura. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido ligados a un dominio CH1 apropiado pudiera por ejemplo usarse - junto con cadenas ligeras apropiadas - para generar fragmentos/estructuras de anticuerpo análogas a fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2 convencionales, pero en lo cual uno o (en el caso de un fragmento F(ab')2) uno o ambos de los dominios VH convencionales se han reemplazado por una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención. También, dos secuencias de aminoácidos o Nanobodies® pudieran ligarse a un dominio CH3 (opcionalmente por medio de una ligadura) para proporcionar un constructo con vida media incrementada in vivo.
De acuerdo con un aspecto especifico, una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos de la invención pueden ser ligados (opcionalmente por medio de un ligador apropiado o región de visagra) a uno o más dominios constantes (por ejemplo, 2 o 3 dominios constantes que pueden usarse como parte de/para formar una porción Fe) , a una porción Fe y/o a una o más partes de anticuerpo, fragmentos o dominios que confieren una o más funciones efectoras para la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención y/o pueden conferir la capacidad para enlazarse a uno o más receptores Fe. Por ejemplo, para este propósito, y sin limitarse a esto, una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender uno o más dominios CH2 y/o CH3 de un anticuerpo, tales como de un anticuerpo de cadena pesada (como se describe en la presente) y más preferiblemente de un anticuerpo de 4 cadenas humano convencional; y/o puede formar (parte de) y región Fe, por ejemplo de IgG (por ejemplo, de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4), de IgE o de otro Ig humano tales como IgA, IgD o IgM. Por ejemplo, O 94/04678 describe anticuerpos de cadena pesada que comprenden un dominio Camélido VHH o un derivado humanizado de los mismos (es decir, un Nanobody®) , en lo cual el dominio CH2 y/o CH3 camélido se han reemplazado por dominios CH2 y CH3 humanos, de manera de suministrar una inmunoglobulina que consiste de 2 cadenas pesadas cada una de las cuales comprende un Nanobody® y dominios CH2 y CH3 humanos (pero no dominio CH1), cuya inmunoglobulina tiene la función efectora proporcionada por los dominios CH2 y CH3 y cuya inmunoglobulina puede funcionar sin la presencia de ninguna de las cadenas ligeras. Otras secuencias de aminoácidos que pueden ligarse apropiadamente a las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos de la invención de manera de suministrar una función efectora serán claras para la persona experta, y pueden elegirse con base en las funciones efectoras deseadas. Se hace referencia por ejemplo a WO 04/058820, WO 99/42077, WO 02/056910 y WO 05/017148, asi como la revisión por Holliger y Hudson, supra; y a WO 09/068628. El acoplamiento de una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención a una porción Fe también puede llevar a una vida media incrementada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente, Nanobody® o polipéptido de la invención. Para algunas aplicaciones, el uso de una porción Fe y/o de dominios constantes (es decir, dominios CH2 y/o CH3) que confiere vida media incrementada sin ninguna función efectora biológicamente importante también pueden ser apropiada o aún preferida. Otros constructos apropiados que comprenden una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos y uno o más dominios constantes con vida media incrementada in vivo serán claros para la persona experta, y pueden por ejemplo comprenden secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos ligados a un dominio CH3, opcionalmente por medio de una secuencia de ligadura. En general, cualquier proteina de fusión o derivados con vida media incrementada tendrán preferiblemente un peso molécular de más de 50 kD, el valor de punto limite para absorción renal.
En otro aspecto especifico, pero no limitante, con objeto de formar un compuesto de la invención, una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos de la invención puede ser ligados (opcionalmente por medio de un ligador apropiado o región de visagra) a dominios constantes que se presentan naturalmente, sintéticos o semisintéticos (o análogos, variantes, mutantes, partes o fragmentos de los mismos) que tienen una tendencia reducida (o esencialmente no tienen) a auto-asociarse dentro de dimeros (es decir, en comparación con dominios constantes que se presentan naturalmente en anticuerpos de 4 cadenas convencionales) . Tales variantes de cadena Fe monoméricos (es decir, no auto-asociados) , o fragmentos de los mismos, será clara para la persona experta. Por ejemplo, Helm et al., J Biol Chem 1996 271 7494, describe variantes monoméricas de cadena Fe que pueden usarse en las cadenas de polipéptido de la invención.
También, tales variantes monoméricas de cadena Fe son preferiblemente tales que estos son todavía capaces de enlazar a los receptores Fe relevantes o el complemento (dependiendo de la porción Fe de la cual se derivan) , y/o tal que estos todavía tienen algo o todas las funciones efectoras de la porción Fe de la cual se derivan (o en un nivel reducido todavía apropiadas para el uso pretendido) . Alternativamente, en tal cadena de polipéptido de la invención, la cadena Fe monomérica puede ser usada para conferir vida media incrementada sobre la cadena de polipéptido, en cuyo caso la cadena Fe monomérica también puede no tener, o esencialmente no, funciones efectoras.
En general, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos de la invención (o compuestos, constructos o que comprende los mismos) con vida media incrementada preferiblemente tienen una vida media que es al menos 1.5 vez, preferiblemente al menos 2 veces, tales como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, más grande que la vida media de la secuencia de aminoácidos correspondiente, Nanobody® o polipéptido de la invención per se. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos o polipéptidos de la invención con vida media incrementada pueden tener una vida media que es incrementada con más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tales como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente, Nanobody® o polipéptido de la invención per se.
En un aspecto preferido, pero no limitante, de la invención, tales secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuesto, constructos o polipéptidos de la invención exhiben una vida media en suero en humanos de al menos alrededor de 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la invención pueden tener una vida media de al menos 5 días (tales como alrededor de 5 a 10 días) , en preferiblemente al menos 9 días (tales como alrededor de 9 a 14 días) , más preferiblemente al menos alrededor de 10 días (tales como alrededor de 10 a 15 días), o al menos alrededor de 11 días (tales como alrededor de 11 a 16 días), más preferiblemente al menos alrededor de 12 días (tales como alrededor de 12 a 18 días o más), o más de 14 días (tales como alrededor de 14 a 19 días) .
Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden formar una secuencia de señal o secuencia líder que dirige la secreción de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o el polipéptido de la invención de una célula hospedera durante la síntesis (por ejemplo para proporcionar una pre-, pro- o prepro-forma del polipéptido de la invención, dependiendo de la célula hospedera usada para expresar el polipéptido de la invención) .
Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden formar una secuencia o señal que permite que la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención sea dirigida hacia y/o penetre o entre dentro de órganos específicos, tejidos, células, o partes o compartimientos de células, y/o que permite que la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención penetre o cruce una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de células epiteliales. Ejemplos apropiados de tales secuencias de aminoácidos serán claros para la persona experta, y por ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los vectores "Peptranos" mencionados arriba, las secuencias descritas por Cardinale et al. y las secuencias de aminoácidos y fragmentos de anticuerpo conocidos per se que pueden usarse para expresar o producir los Nanobodies® y polipéptidos de la invención como los llamados "intracuerpos", por ejemplo como se describe en WO 94/02610, WO 95/22618, US 7,004,940, WO 03/014960, WO 99/07414; WO 05/01690; EP 1 512 696; y en Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; y en Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170, y las referencias adicionales descritas en la presente.
Tal proteina, polipéptido, compuesto o constructo también pueden estar en forma esencialmente aislada (como se definen en la presente) .
Los compuestos o polipéptidos de la invención pueden en general prepararse por un método que comprende al menos la etapa de ligar de forma apropiada una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, constructos monovalentes y/o polipéptidos de la invención a uno o más grupos adicionales, residuos, porciones o unidades de enlace, opcionalmente por medio de una o más ligaduras apropiadas, de manera de suministrar el compuesto o polipéptido de la invención. Los polipéptidos de la invención también pueden prepararse por un método que en general comprende al menos las etapas de proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, expresar dicho ácido nucleico de una manera apropiada, y recuperar el polipéptido de la invención expresado. Tales métodos pueden realizarse en una forma conocida per se, que será clara para la persona experta, por ejemplo con base en los métodos y técnicas adicionales descrito en la presente.
Los espaciadores o ligaduras apropiados para usarse en polipéptidos o constructos multivalentes y/o multiespecificos serán claros para la persona experta, y pueden ser en general cualquier ligador o espaciador usados en la técnica para ligar secuencias de aminoácidos. Preferiblemente, dicho ligador o espaciador es apropiado para usarse en la construcción de proteínas o polipéptidos que se pretenden para uso farmacéutico.
Algunos espaciadores particularmente preferidos incluyen los espaciadores y ligaduras que son usados en la técnica para ligar fragmentos de anticuerpo o dominios de anticuerpo.
Estos incluyen las ligaduras mencionadas en la técnica anterior general citada arriba, asi como por ejemplo ligaduras que son usadas en la técnica para construir diacuerpos o fragmentos ScFv (a este respecto, sin embargo, debiera notarse que, mientras que en los diacuerpos y en fragmentos ScFv, la secuencia de ligadura usada debiera tener una longitud, un grado de flexibilidad y otras propiedades que permiten que los dominios VH y VL pertinentes se junten para formar el sitio enlazado al antigeno completo, no hay limitación particular en la longitud o la flexibilidad del ligador usadas en el polipéptido de la invención, ya que cada secuencia de aminoácidos o Nanobody® por si misma forma un sitio enlazado al antigeno completo) .
Por ejemplo, un ligador puede ser una secuencia de aminoácidos apropiada, y en particular secuencias de aminoácidos de entre 1 y 50, preferiblemente entre 1 y 30, tal como entre 1 y 10 residuos de aminoácidos. Algunos ejemplos preferidos de tales secuencias de aminoácidos incluyen ligaduras gly-ser, por ejemplo del tipo (glyxsery)2, tales como (por ejemplo (gly4ser) 3 o (gly3ser2 ) 3 , como se describe en WO 99/42077, regiones tipo bisagra tales como las regiones de bisagra de anticuerpos de cadena pesada que se presentan naturalmente o secuencias similares (tales como descritos en WO 94/04678).
Algunos otros ligadores particularmente preferidos son poly-alanina (tales como AAA) , asi como los ligadores mencionados en la Tabla A-7, de los cuales GS15 es particularmente preferido.
Otras ligaduras apropiadas en general comprenden compuestos o polímeros orgánicos, en particular aquellos apropiados para usarse en proteínas para uso farmacéutico. Por ejemplo, las porciones poli (etilenglicol) se han usado para ligar dominios de anticuerpo, ver por ejemplo O 04/081026.
Se abarca dentro del alcance de la invención que la longitud, el grado de flexibilidad y/o otras propiedades de las ligaduras usadas (aunque no son críticas, como usualmente es para ligaduras usadas en fragmentos ScFv) pueden tener algunas influencias en las propiedades del polipéptido final de la invención, incluyendo pero no limitado a la afinidad, especificidad o avidez para la proteína F de hRSV, o para uno o más de los otros antígenos. Con base en la descripción en la presente, la persona experta será capaz de determinar las ligaduras óptimas para usarse en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
También está dentro del alcance de la invención que las ligaduras usadas confieren una o más de otras propiedades o funcionalidad favorable a los polipéptidos de la invención, y/o proporcionan uno o más sitios para la formación de derivados y/o para la unión de grupos funcionales (por ejemplo, como se describe en la presente para los derivados de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos y polipéptidos de la invención) . Por ejemplo, las ligaduras que contienen uno o más residuos de aminoácidos cargados pueden proporcionar propiedades hidrofilicas mejoradas, mientras que las ligaduras que forman o contienen epitopos o etiquetas pequeños pueden usarse para los propósitos de detección, identificación y/o purificación. Nuevamente, con base en la descripción en la presente, la persona experta será capaz de determinar las ligaduras óptimas para usarse en un polipéptido especifico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
Finalmente, cuando dos o más ligaduras son usadas en los polipéptidos de la invención, estas ligaduras pueden ser iguales o diferentes. Nuevamente, con base en la descripción en la presente, la persona experta será capaz de determinar las ligaduras óptimas para usarse en un polipéptido especifico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
Usualmente, para facilidad de expresión y producción, un polipéptido de la invención será un polipéptido lineal. Sin embargo, la invención en su sentido más amplio no se limita a esto. Por ejemplo, cuando un polipéptido de la invención comprende tres de más secuencias de aminoácidos o Nanobodies®, es posible ligarlas por el uso de un ligador con tres o más "brazos", con cada "brazo" siendo ligado a una secuencia de aminoácidos o Nanobody®, de manera de suministrar un constructo en "forma de estrella". También es posible, aunque usualmente menos preferido, usar constructos circulares .
Como también será claro a partir de la descripción en la presente, también está dentro del alcance de la invención usar partes o fragmentos, o combinaciones de dos o más partes o fragmentos, de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos de la invención como se definen en la presente, y en particular partes o fragmentos de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157 o los polipéptidos de SEQ ID NO's: 77-79, 142-145 y 158-165. Asi, de acuerdo con una modalidad de la invención, el término "secuencia de aminoácidos de la invención", "Nanobody® de la invención" y "polipéptido de la invención" en su sentido más amplio también cubren tales partes o fragmentos.
En general, tales partes o fragmentos de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos de la invención (incluyendo variantes de los mismos como se definen en la presente) tienen secuencias de aminoácidos en lo cual, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa correspondiente o Nanobody® de la invención, uno o más de los residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal, uno o más residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal, uno o más residuos de aminoácidos internos contiguos, o cualquier combinación de los mismos, se han eliminado y/o removido.
Las partes o fragmentos son preferiblemente tal que estos pueden enlazarse al sitio antigénico II sobre la proteina F de hRSV, con una afinidad (convenientemente medidas y/o expresadas como un valor KD (real o aparente) , un valor KA (real o aparente) , una velocidad kactiV y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC50, como se describe además en la presente) que es como se definen en la presente.
En particular, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos y partes o fragmentos son preferiblemente tal que estos:
enlacen a la proteína F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 1000 nM hasta 1 nM o menos, preferiblemente 100 nM hasta 1 nM o menos, más preferiblemente 10 nM hasta 1 nM o menos;
y/o tal que estos:
enlacen a la proteina F de hRSV con una velocidad kactiv de entre 104 M^s"1 hasta alrededor de 107 M_1s_1, preferiblemente entre 105 M_1s_1 y 107 M~1s~1, más preferiblemente alrededor de 106 M_1s_1 o más;
y/o tal que estos:
enlacen a la proteína F de hRSV con una velocidad kinactiv entre 10"2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10~4 s' 1 (suministrando un complejo casi irreversible con a ti/2 de días múltiples) , preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10"4 s"1, o inferior.
Las afinidad de las partes o fragmentos contra proteína F de hRSV, se puede determinar en una forma conocida per se, por ejemplo usando el ensayo descrito en la presente.
Tales partes o fragmentos usualmente también tendrán una eficacia y/o potencia de neutralización hRSV como se definen en la presente.
Cualquier parte o fragmento es preferiblemente tal que comprende al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, más preferiblemente al menos 30 residuos de aminoácidos contiguos, tales como al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa correspondiente, Nanobody® o polipéptido de la invención.
También, cualquier parte o fragmento es tal preferiblemente que comprende al menos uno de las CDR (y preferiblemente al menos CDR3 o parte de la misma) y al menos otra CDR (es decir, CDR1 o CDR2) o al menos parte de las mismas, preferiblemente conectada por secuencias de estructura apropiadas o al menos parte de las mismas. Más preferiblemente, cualquier parte o fragmento es tal que comprende al menos una de las CDR (y preferiblemente al menos CDR3 o parte de la misma) y al menos parte de las dos CDR restantes, nuevamente preferiblemente conectada por secuencias de estructura apropiadas o al menos parte de las mismas .
De acuerdo con otra modalidad particularmente preferida, pero no limitante, tal parte o fragmento comprende al menos CDR3, tales como FR3, CDR3 y FR4 del Nanobody® de longitud completa correspondiente de la invención, es decir, como por ejemplo los descritos en la solicitud internacional O 03/050531 (Lasters et al.).
Como ya se menciona arriba, también es posible combinar dos o más de tales partes o fragmentos (es decir, de la misma o diferentes secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de la invención) , es decir, para proporcionar además partes o fragmentos (como se definen en la presente) de una secuencia de aminoácidos, a Nanobody® o un polipéptido de la invención.
También es posible por ejemplo combinar una o más partes o fragmentos de una secuencia de aminoácidos, a Nanobody® o un polipéptido de la invención con una o más partes o fragmentos de un dominio VH humano.
De acuerdo con una modalidad preferida, las partes o fragmentos tienen un grado de identidad de secuencia de al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, incluso más preferiblemente al menos 80%, tales como al menos 90%, 95% o 99% o más con una de las secuencias de aminoácidos o Nanobodies® de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157 o con uno de los polipéptidos de SEQ ID NO's: 77-79, 142-145 y 158-165.
Las partes y fragmentos, y secuencias de ácidos nucleicos que codifican las mismas, se pueden suministrar y opcionalmente combinarse en cualquier manera conocida per se. Por ejemplo, tales partes o fragmentos pueden obtenerse al insertar un codón de paro en un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de tamaño completo, Nanobody® o polipéptido de la ' invención, y luego expresar el ácido nucleico asi obtenido en una forma conocida per se (por ejemplo, como se describe en la presente) . Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican tales partes o fragmentos pueden obtenerse al restringir de forma apropiada el ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de tamaño completo, Nanobody® o polipéptido de la invención o al sintetizar tal ácido nucleico en una forma conocida per se. Las partes o fragmentos también pueden proporcionarse usando técnicas para síntesis de péptido conocidas per se.
La invención en su sentido más amplio también comprende derivados de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o polipéptidos de la invención. Tales derivados pueden en general obtenerse por modificación, y en particular por modificación química y/o biológica (por ejemplo, enzimática) , de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o polipéptidos de la invención y/o de uno o más de los residuos de aminoácidos que forman las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o polipéptidos de la invención .
Los ejemplos de tales modificaciones, así como ejemplos de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos, secuencia de Nanobody®, compuesto o secuencias de polipéptido que pueden modificarse de tal manera (es decir, ya sea en la columna de la proteína pero preferiblemente en una cadena lateral) , métodos y técnicas que pueden usarse para introducir tales modificaciones y los usos y ventajas potenciales de tales modificaciones serán claros para la persona experta.
Por ejemplo, tal modificación puede involucrar la introducción (por ejemplo, por ligadura covalente o de otra manera apropiada) de uno o más grupos funcionales, residuos o porciones dentro de o sobre la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención, y en particular de uno o más grupos funcionales, residuos o porciones que confieren una o más propiedades o funcionalidades deseadas a la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención. Los ejemplos de tales grupos funcionales serán claros para la persona experta.
Por ejemplo, tal modificación puede comprender la introducción (por ejemplo, por enlace covalente o en cualquiera otra manera apropiada) de uno o más grupos funcionales que incrementan asi la vida media, la solubilidad y/o la absorción de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención, que reduce la inmunogenicidad y/o la toxicidad de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención, que elimina o atenúa cualquiera de los efectos colaterales indeseables de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención, y/o que confiere otras propiedades ventajosas para y/o reduce las propiedades indeseadas de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención; o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. Los ejemplos de tales grupos funcionales y de técnicas para introducirlos será clara para la persona experta, y puede en general comprender todos los grupos funcionales y técnicas mencionados en la técnica anterior general citada anteriormente asi como los grupos funcionales y técnicas conocidos per se para la modificación de proteínas farmacéuticas, y en particular para la modificación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (incluyendo ScFv' s y anticuerpos de dominio sencillo) , para los cuales se hace referencia por ejemplo a Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Tales grupos funcionales pueden por ejemplo ser ligados directamente (por ejemplo covalentemente ) a una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención, u opcionalmente por medio de un ligador apropiado o espaciador, como nuevamente será claro para la persona experta .
Una de las técnicas más ampliamente usadas para incrementar la vida media y/o reducir la inmunogenicidad de proteínas farmacéuticas comprende la unión de un polímero farmacológicamente aceptable apropiado, tales como poli (etilenglicol) (PEG) o derivados de los mismos (tales como metoxipoli (etilenglicol ) o mPEG) . En general, cualquier forma apropiada de pegilación pueden usarse, tales como la pegilación usada en la técnica para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero no limitado a anticuerpos de dominio (sencillos) y ScFv' s) ; se hace referencia a por ejemplo Chapman, Nat. Biotechnol . , 54, 531-545 (2002); por Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), por Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) y en WO 04/060965. Varios reactivos para pegilación de proteínas están también comercialmente disponibles, por ejemplo de Nektar Therapeutics, EUA.
Preferiblemente, se usa pegilación dirigida al sitio, en particular por medio de un residuo de cisteína (ver por ejemplo Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003) . Por ejemplo, para este propósito, PEG puede enlazarse a un residuo de cisteína que se presenta naturalmente en una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención, una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención puede modificarse de manera que introduce apropiadamente uno o más residuos de cisteína para enlace de PEG, o una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más residuos de cisteína para enlace de PEG puede fusionarse la N- y/o C-terminal de una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención, todas usando técnicas de procesamiento de ingeniería de proteína conocidos per se para la persona experta .
Preferiblemente, para las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o polipéptidos de la invención de la invención, se usa un PEG con un peso molécular de más de 5000, tal como más de 10, 000 y menor de 200,000, tal como menos de 100, 000; por ejemplo en el intervalo de de 20,000-80, 000.
Otra modificación, usualmente menos preferida comprende glicosilación ligada a N o ligada a O, usualmente como parte de co-traducción y/o modificación post-traduccional, dependiendo de la célula hospedera usada para expresar la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención.
Aún otra modificación puede comprender la introducción de una o más etiquetas detectables u otros grupos o porciones que generan señal, dependiendo del uso pretendido de la secuencia de aminoácidos etiquetada, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención. Las etiquetas y técnicas apropiadas para unirlas, usarlas y detectarlas será clara para la persona experta, y por ejemplo incluyen, pero no se limitan a, etiquetas fluorescentes (tales como fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, y fluorescamina y metales fluorescentes tales como 152Eu u otros metales de la serie de lantánido) , etiquetas fosforescentes, etiquetas quimioluminiscentes o etiquetas bioluminiscentes (tales como luminal, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sales de acridinio, éster de oxalato, dioxetano o GFP y su análogos), radio-isótopos (tales como 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36C1, 57Co, 58Co, 59Fe, y 75Se) , metales, metales quelados o cationes metálicos (por ejemplo cationes metálicos tales como 99mTc, 123I, niln, 131I, 7Ru, 67Cu, 67Ga, y 68Ga u otros metales o cationes metálicos que son particularmente apropiados para usarse en diagnóstico y formación de imágenes in vivo, in vitro o in situ, tales como (157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, y 56Fe) , asi como cromóforos y enzimas (tales como malato deshidrogenasa, nucleasa estafilococal, isomerasa delta-V-esteroide, deshidrogenasa de alcohol de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, biotinavidina peroxidasa, peroxidasa de rábano gigante, alcalina fosfatasa, asparaginasa, glucosa oxidasa, ß-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-VI-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina esterasa) . Otras etiquetas apropiadas serán claras para la persona experta, y por ejemplo incluyen porciones que pueden detectarse usando NMR o espectroscopia ESR.
Tales secuencias de aminoácidos etiquetadas, Nanobodies®, compuestos o polipéptidos de la invención pueden por ejemplo usarse para ensayos in vitro, in vivo o in situ (incluyendo inmunoensayos conocidos per se tales como ELISA, RIA, EIA y otros "ensayos de intercalado", etc.) asi como propósitos de formación de imágenes y diagnóstico in vivo, dependiendo de la elección de la etiqueta especifica.
Como estará claro para la persona experta, otra modificación puede involucrar la introducción de un grupo quelante, por ejemplo para quelar uno de los metales o cationes metálicos referidos arriba. Los grupos quelantes apropiados por ejemplo incluyen, sin limitación, ácido dietil-enetriaminapentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) .
Aún otra modificación puede comprender la introducción de un grupo funcional que es una parte de un par de enlace especifico, tales como el par de enlace biotina- (estrept ) avidina . Tal grupo funcional puede ser usado para ligar la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención a otra proteína, polipéptido o compuesto químico que se une a la otra mitad del par de enlace, es decir, a través de la formación del par de enlace. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención puede conjugarse a biotina, y ligarse a otra proteina, polipéptido, compuesto o portador conjugado a avidina o estreptavidina . Por ejemplo, tal secuencia de aminoácidos conjugada, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención se pueden usar como un reportero, por ejemplo en un sistema de diagnóstico donde un agente que produce la señal detectable es conjugado a avidina o estreptavidina. Tales pares de enlace pueden por ejemplo también usarse para unir la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención a un portador, incluyendo portadores apropiados para propósitos farmacéuticos. Un ejemplo no limitante son las formulaciones liposomales descritas por Cao and Suresh, Journal of Drug Targeting, 8, 4, 257 (2000). Tales pares de enlace también pueden ser usados para ligar un agente terapéuticamente activo a la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención.
Otras modificaciones químicas y enzimáticas potenciales serán claras para la persona experta. Tales modificaciones también pueden introducirse para propósitos de investigación (por ejemplo, para estudiar las relaciones función-actividad) . Se hace referencia por ejemplo a Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl . Biochem. , 26, 143-151 (1997).
Preferiblemente, los derivados son tal que estos enlazan a la proteína F de hRSV, con una afinidad (convenientemente medida y/o expresada como un valor KD (real o aparente) , un valor K¾ (real o aparente), una velocidad kactiv y/o una velocidad kinactiv, o alternativamente como un valor IC5o, como se describe además en la presente) que es como se define en la presente (es decir, como se define para las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos o compuestos per se) . Tales derivados usualmente también tendrán una eficacia y/o potencia de neutralización hRSV como se definen en la presente .
Como se mencionó anteriormente, la invención también se refiere a proteínas o polipéptidos que consisten esencialmente de o comprenden de al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención. Por "consisten esencialmente de" significa que la secuencia de aminoácidos de la proteina o polipéptido de la invención ya sea es exáctamente igual como la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención o corresponde a la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención que tiene un número limitado de residuos de aminoácidos, tales como 1- 20 residuos de aminoácidos, por ejemplo 1-10 residuos de aminoácidos y preferiblemente 1-6 residuos de aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 residuos de' aminoácidos, agregados en el extremo de terminal amino, en el extremo de terminal carboxi, o tanto en el extremo de terminal amino como el extremo de terminal carboxi de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido.
Dichos residuos de aminoácidos pueden o no cambiar, alterar o de otra manera influenciar las propiedades (biológicas) de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención y pueden o no agregar además funcionalidad a la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido. Por ejemplo, tales residuos de aminoácidos:
a) pueden comprender un residuo Met N-terminal, por ejemplo como resultado de la expresión en una célula hospedera heteróloga o organismo hospedero.
b) puede formar una secuencia de señal o secuencia líder que dirige la secreción de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido desde una célula hospedera durante la síntesis. Los péptidos líder secretores apropiados serán claros para la persona experta, y pueden ser como se describe además en la presente. Usualmente, tal secuencia líder será ligada a la terminal N de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido, aunque la invención en su sentido más amplio no se limita a esto;
c) puede formar una secuencia o señal que permite que la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido sea dirigida hacia y/o penetre o entre dentro de órganos específicos, tejidos, células, o partes o compartimientos de células, y/o que permite que la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido penetre o cruce una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de células epiteliales, un tumor incluyendo tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica . Ejemplos de tales secuencias de aminoácidos serán claros para la persona experta. Algunos ejemplos no limitativos son los vectores péptidos pequeños ("vectores Pep-trans") descritos en WO 03/026700 y en Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001); Temsamani and Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (004) y Rousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001), y la secuencia de transubicación de membrana descrita por Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003) . Las secuencias de aminoácidos C-terminal y N-terminal para dirección intracelular de fragmentos de anticuerpo son por ejemplo descritas por Cardinale et al., ethods, 34, 171 (2004). Otras técnicas apropiadas para dirección intracelular involucra la expresión y/o uso de los llamados "intracuerpos". que comprende una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido de la invención, como se menciona abajo;
d) puede formar una "etiqueta", por ejemplo una secuencia de aminoácidos o residuo que permite que o facilita la purificación de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido, por ejemplo usando técnicas de afinidad dirigidas contra dicha secuencia o residuo. De aquí en adelante, dicha secuencia o residuo puede removerse (por ejemplo, por escisión química o enzimática) para proporcionar la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o polipéptido (para este propósito, la etiqueta puede opcionalmente ligarse a la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o secuencia de polipéptido por medio de una secuencia de ligadura que se puede fragmentar o que contiene una porción que se puede fragmentar) . Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales residues son residuos de histidina múltiples, residuos de glutationa y a myc-tag tales como AAAEQKLISEEDLNGAA (SEQ ID NO: 111);
e) pueden ser uno o más residuos de aminoácidos que se han funcionalizado y/o que pueden servir como un sitio para enlace de grupos funcionales. Los residuos de aminoácidos apropiados y grupos funcionales serán claros para la persona experta e incluyen, pero no se limitan a, los residuos de aminoácidos y grupos funcionales mencionados en la presente para los derivados de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o polipéptidos de la invención.
La invención además se refiere a métodos para preparar las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos, ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descritos en la presente.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos y ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse en una forma conocida per se, como estará claro para la persona experta a partir de la descripción adicional en la presente. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y polipéptidos de la invención pueden prepararse en cualquier manera conocida per se para la preparación de anticuerpos y en particular para la preparación de fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero no limitado a anticuerpos de dominio (sencillos) y fragmentos ScFv) . Algunos métodos preferidos, pero no limitantes para preparar las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos y ácidos nucleicos incluyen los métodos y técnicas descrito en la presente.
El método para producir una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody® de la invención, un polipéptido de la invención, o un constructo monovalente de la invención puede comprender las sigueintes etapas:
la expresión, en una célula hospedera apropiada o organismo hospedero (también referida en la presente como un "hospedero de la invención") o en otro sistema de expresión apropiado de un ácido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención (también referida en la presente como a "ácido nucleico de la invención") ,
opcionalmente seguido por:
aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención asi obtenido.
En particular, tal método pueden comprender las etapas de:
cultivar y/o mantener un hospedero de la invención bajo condiciones que son tal que dicho hospedero de la invención expresa y/o produce al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody® y/o polipéptido de la invención;
opcionalmente seguido por:
aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención asi obtenido.
Consecuentemente, la presente invención también se refiere a una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos, a Nanobody®, un polipéptido o un constructo monovalente de la invención (también referidos como "ácido nucleico de la invención" o "secuencia de nucleótidos de la invención") . Un ácido nucleico de la invención puede estar en la forma de ADN o ARN de hebra sencilla o doble, y está preferiblemente en la forma de ADN de hebra doble. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de la invención puede ser ADN genómico, cADN o ADN sintético (tales como ADN con un codón de uso que se ha adaptado específicamente para expresión en la célula hospedera o organismo hospedero pretendido) .
De acuerdo con una modalidad de la invención, el ácido nucleico de la invención está en forma esencialmente aislada, como se definen en la presente. El ácido nucleico de la invención también pueden estar en la forma de, presentarse en y/o ser parte de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido o YAC, que nuevamente puede estar en forma esencialmente aislada.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse u obtenerse en una forma conocida per se, con base en la información en las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y/o polipéptidos de la invención dados en la presente, y/o pueden aislarse de una fuente natural apropiada. También, como estará claro para la persona experta, para preparar un ácido nucleico de la invención, también varias secuencias de nucleótidos, tales como al menos una secuencia de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos o Nanobody® y por ejemplo ácidos nucleicos que codifican una o más ligaduras pueden ligarse en conjunto de una manera apropiada.
Las técnicas para generar los ácidos nucleicos de la invención serán claras para la persona experta y pueden por ejemplo incluir, pero no se limitan a, síntesis de ADN automatizada; mutagénesis dirigida al sitio; combinar dos o más secuencias sintéticas y/o que se presentan naturalmente (o dos o más partes de las mismas) , introducción de mutaciones que lleva a la expresión de un producto de expresión truncado; introducción de uno o más sitios de restricción (por ejemplo, para crear casetes y/o regiones que pueden digerirse y/o ligarse fácilmente usando enzimas de restricción apropiadas), y/o la introducción de mutaciones por medio de una reacción PCR usando uno o más cebadores "no alineados". Estas y otras técnicas serán claras para la persona experta, y se hace referencia nuevamente a los manuales estándar, tales como Sambrook et al. y Ausubel et al., mencionados arriba, así como los siguientes Ejemplos.
El ácido nucleico de la invención también pueden estar en la forma de, presentarse en y/o ser parte de un constructo genético, como estará claro para la persona experta en la técnica. Tales constructos genéticos en general comprenden al menos uno ácido nucleico de la invención que está opcionalmente ligado a uno o más elementos de constructos genéticos conocidos per se, tales como por ejemplo uno o más elementos reguladores apropiados (tales como promotores, potenciadores , terminadores apropiados, etc.) y los elementos adicionales de constructos genéticos referidos en la presente. Tales constructos genéticos que comprenden al menos uno ácido nucleico de la invención también se referirán en la presente como "constructos genéticos de la invención".
Los constructos genéticos de la invención pueden ser ADN o ARN, y son preferiblemente ADN de hebra doble. Los constructos genéticos de la invención también pueden estar en una forma apropiada para transformación de la célula hospedera o organismo hospedero pretendido, en una forma apropiada para integración dentro del ADN genómico de la célula hospedera pretendida o en una forma apropiada para replicación independiente, mantenimiento y/o herencia en el organismo hospedero pretendido. Por ejemplo, los constructos genéticos de la invención puede estar en la forma de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido, YAC, un vector virico o transposon. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir, un vector que se puede proporcionar para expresión in vitro e/o in vivo (por ejemplo, en una célula hospedera apropiada, organismo hospedero y/o sistema de expresión) .
En una modalidad preferida pero no limitante, un constructo genético de la invención comprende
a) al menos un ácido nucleico de la invención; conectado operablemente a
b) uno o más elementos reguladores, tales como un promoter y opcionalmente un terminador apropiado;
y opcionalmente también
c) uno o más elementos adicionales de constructos genéticos conocidos per se;
en lo cual los términos "elementos reguladores", "promotor", "terminador" y "conectados operablemente" tienen su significado usual en la técnica (como se describe además en la presente) ; y en lo cual dichos "elementos adicionales" presentes en los constructos genéticos pueden por ejemplo ser secuencias 3'- o 5'-UTR, secuencias líderes, marcadores de selección, marcadores de expresión/genes reporteros, y/o elementos que pueden facilitar o incrementar (la eficacia de) transformación o integración. Estos y otros elementos apropiados para tales constructos genéticos serán claros para la persona experta, y pueden por ejemplo depender del tipo de constructo usado; la célula hospedera u organismo hospedero pretendido; la manera en lo cual las secuencias de nucleótidos de la invención de interés se expresan (por ejemplo, por medio de expresión constitutiva, transitoria o inducible) ; y/o la técnica de transformación a usarse. Por ejemplo, las secuencias reguladoras, promotores y terminadores conocidos per se para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero no limitado a anticuerpos de dominio (sencillos) y fragmentos ScFv) puede ser usadas en una manera esencialmente análoga.
Preferiblemente, en los constructos genéticos de la invención, dicho al menos uno ácido nucleico de la invención y dichos elementos reguladores, y opcionalmente dicho uno o más elementos adicionales, son "ligados operablemente" uno al otro, por lo cual significa en general que estos están en una relación funcional uno con el otro. Por ejemplo, un promotor se considera "ligado operablemente" a una secuencia de codificación si dicho promotor es capas de iniciar o de otra manera controlar/regular la transcripción y/o la expresión de una secuencia de codificación (en lo cual dicha secuencia de codificación debiera entenderse como que es "bajo el control de" dicho promotor) . En general, cuando dos secuencias de nucleótidos son ligados operablemente, estas estarán en la misma orientación y usualmente también en el mismo marco de lectura. Usualmente también serán esencialmente contiguos, aunque también puede no requerirse.
Preferiblemente, los elementos reguladores y adicionales de los constructos genéticos de la invención son tal que estos son capaces de proporcionar su función biológica pretendida en la célula hospedera o organismo hospedero pretendido .
Por ejemplo, un promotor, potenciador o terminador debiera ser "operable" en la célula hospedera u organismo hospedero pretendido, por lo cual significa que (por ejemplo) dicho promotor debiera ser capaz de iniciar o de otra manera controlar/regular la transcripción y/o la expresión de una secuencia de nucleótidos - por ejemplo, una secuencia de codificación - a la cual se liga operablemente (como se definen en la presente) .
Algunos promotores particularmente preferidos incluyen, pero no se limitan a, promotores conocidos per se para la expresión en las células hospederas mencionadas en la presente; y en promotores particulares para la expresión en las células bacterianas, tales como aquellas aquí mencionadas y/o aquellas usadas en los Ejemplos.
Un marcador de selección debiera ser tal que permite -es decir, bajo condiciones de selección apropiadas - células hospederas y/u organismo hospederos que se han transformado (exitosamente) con la secuencia de nucleótidos de la invención a distinguirse de células hospederas/organismos que no se han transformado (exitosamente) . Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales marcadores son genes que proporcionan resistencia contra antibióticos (tales como canamicina o ampicilina) , genes que proporcionan resistencia a la temperatura, o genes que permiten que la célula hospedera u organismo hospedero se mantenga en la ausencia de ciertos factores, compuestos y/o (alimento) componentes en el medio que son esenciales para sobrevivir de las células u organismos no transformados.
Una secuencia líder debiera ser tal que - en la célula hospedera u organismo hospedero pretendido - permite las modificaciones post-traducción deseadas y/o tal que dirige el mARN transcrito a la parte u organelo deseado de una célula. Una secuencia líder también puede permitir la secreción del producto de expresión de dicha célula. Como tal, la secuencia líder puede ser cualquier pro-, pre-, o prepro-secuencia operable en la célula hospedera u organismo hospedero. Las secuencias líderes pueden no requerirse para expresión en una célula bacteriana. Por ejemplo, las secuencias líderes conocidas per se para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero no limitado a anticuerpos de dominio sencillo y fragmentos ScFv) pueden ser usadas en una manera esencialmente análoga.
Un marcador de expresión o gen reportero debiera ser tal que - en la célula hospedera u organismo hospedero - permite la detección de la expresión de (un gen o secuencia de nucleótidos presente en) el constructo genético. Un marcador de expresión también puede permitir opcionalmente la localización del producto expresado, por ejemplo, en una parte específica u organelo de una célula y/o en (a) células, tejidos, órganos o partes específicas de un organismo multicelular. Tales genes reporteros también pueden expresarse como una fusión de proteína con la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos incluyen proteínas fluorescentes tales como GFP.
Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de promotores apropiados, terminador y elementos adicionales incluyen aquellos que pueden usarse para la expresión en las células hospederas mencionadas en la presente; y en particular aquellas que son apropiadas para expresión en células bacterianas, tales como aquellas aquí mencionadas y/o aquellas usadas en los siguientes Ejemplos. Para algunos (adicionales) ejemplos no limitativos de los promotores, marcadores de selección, secuencias líderes, marcadores de expresión y elementos adicionales que pueden presentarse/usarse en los constructos genéticos de la invención - tales como terminadores, potenciadores de transcripción y/o traducción y/o factores de integración - se hace referencia a las guías generales tales como Sambrook et al. y Ausubel et al. mencionados arriba, así como a los ejemplos que se dan en WO 95/07463, WO 96/23810, O 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US-A-7, 207, 410, ÜS-A- 5,693,492 y EP 1 085 089. Otros ejemplos serán claros para la persona experta. También se hace referencia a la técnica anterior general citada arriba y las referencias adicionales citadas en la presente.
Los constructos genéticos de la invención pueden en general proporcionarse para ligar de forma apropiada las secuencias de nucleótidos de la invención a uno o más elementos adicionales descritos arriba, por ejemplo usando las técnicas como se describe en las guias generales tales como Sambrook et al. y Ausubel et al., mencionados arriba.
A menudo, los constructos genéticos de la invención serán obtenidos al insertar una secuencia de nucleótidos de la invención en un vector apropiado (expresión) conocidos per se. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de vectores de expresión apropiados son aquellos usados en los siguientes Ejemplos, así como aquellos mencionados en la presente.
Los ácidos nucleicos de la invención y/o los constructos genéticos de la invención pueden ser usados para transformar una célula hospedera u organismo hospedero, es decir, para expresión y/o producción de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención. Los hospederos o células hospederas apropiados serán claros para la persona experta, y pueden por ejemplo ser cualquier célula de hongos, procariótica o eucariótica apropiada o linea celular o cualquier organismo de hongos, procariótico o eucariótico apropiado, por ejemplo:
una cepa bacteriana, incluyendo pero no limitado a cepas gram-negativa tales como cepas de Escherichia coli; de Proteus, por ejemplo de Proteus mirabilis; de Pseudomonas, por ejemplo de Pseudomonas fluorescens; y cepas gram-positiva tales como cepas de Bacillus, por ejemplo de Bacillus subtilis o de Bacillus brevis; de Streptomyces, por ejemplo de Streptomyces lividans; de Staphylococcus, por ejemplo de Staphylococcus carnosus; y de Lactococcus, por ejemplo de Lactococcus lactis;
- una célula de hongos, incluyendo pero no limitado a células de especies de Trichoderma, por ejemplo de Trichoderma reesei; de Neurospora, por ejemplo de Neurospora crassa; de Sordaria , por ejemplo de Sordaria macrospora ; de Aspergillus, por ejemplo de Aspergillus niger o de Aspergillus sojae; o de otros hongos filamentosos;
una célula de levadura, incluyendo pero no limitado células de especies de Saccharomyces, por ejemplo de Saccharomyces cerevisiae; de Schizosaccharomyces, por ejemplo de Schizosaccharomyces pombe; de Pichia, por ejemplo de Pichia pastoris o de Pichia methanolica; de Hansenula, por ejemplo de Hansenula polimorpha; de Kluyveromyces, por ejemplo de Kluyveromyces lactis; de Arxula, por ejemplo de Arxula adenínivorans; de Yarrowia , por ejemplo de Yarrowia lipolitica;
una célula de anfibio o linea celular, tales como Xenopus oocytes;
una célula derivada de insecto o linea celular, tales como células/lineas celulares derivadas de lepidoptera, incluyendo pero no limitado a Spodoptera SF9 y células Sf21 o células/lineas celulares derivadas de Drosophila , tales como células Schneider y Kc;
una planta o célula de planta, por ejemplo en plantas de tabaco; y/o
- una célula de mamífero o línea celular, por ejemplo una célula o línea celular derivadas de un humano, una célula o una línea celular de mamíferos incluyendo pero no limitado a células CHO, células BHK (por ejemplo células BHK-21) y células humanas o líneas celulares tales como HeLa, COS (por ejemplo COS-7) y células PER.C6;
así como todos los otros hospederos o células hospederas conocidos per se para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero no limitado a anticuerpos de dominio (sencillos) y fragmentos ScFv) , que serán claros para la persona experta. También se hace referencia a la técnica anterior general citada en la presente arriba, asi como a por ejemplo WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), supra; Riechmann and uyldermans , (1999), supra; van der Linden, (2000), supra; Thomassen et al., (2002), supra; Joosten et al., (2003), supra; Joosten et al., (2005), supra; y las referencias adicionales citadas en la presente.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y polipéptidos de la invención también pueden introducirse y expresarse en una o más células, tejidos u órganos de un organismo multicelular, por ejemplo para propósitos terapéuticos y/o profilácticos (por ejemplo, como una terapia de genes). Para este propósito, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden introducirse dentro de las células o tejidos en cualquier manera apropiada, por ejemplo como tales (por ejemplo, usando liposomas) o después de que se han insertado dentro de un vector de terapia de genes apropiado (por ejemplo derivados de retrovirus tales como adenovirus, o parvovirus tales como virus asociados con adeno) . Como también será claro para la persona experta, tal terapia de genes puede realizarse in vivo e/o in situ en el cuerpo de un paciente al administrar un ácido nucleico de la invención o un vector de terapia de genes apropiado que codifican el mismo al paciente o a células especificas o un tejido u órgano especifico del paciente; o células apropiadas (a menudo tomadas del cuerpo del paciente a tratarse, tales como linfocitos explantados, aspirados de médula ósea o biopsias de tejido) pueden tratarse in vitro con una secuencia de nucleótidos de la invención y luego apropiadamente (re-) introducirse dentro del cuerpo del paciente. Todo esto pueden realizarse usando terapia de vectores de genes, técnicas y sistemas de suministro que son bien conocidos para la persona experta, y por ejemplo descritos en Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y); Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992) , 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 ( 1996) , 370-37 ; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995) , 1077-1086; Onodera, Blood 91; (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 ( 1998 ), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. : 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 ( 1996) , 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; US 5,5895466; o Schaper, Current Opinión in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Por ejemplo, la expresión in situ de fragmentos ScFv (Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) y de diacuerpos (Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003)) se han descritos en el campo.
Para expresión de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos en una célula, también pueden expresarse como los llamados "intracuerpos", como por ejemplo descritos en WO 94/02610, WO 95/22618 y US-A-7004940; WO 03/014960; en Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; y en Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y polipéptidos de la invención pueden por ejemplo también producirse en la leche de mamíferos transgénicos, por ejemplo en la leche de conejos, vacas, cabras u ovejas (ver por ejemplo US 6,741,957, US 6,304,489 y US 6,849,992 para técnicas generales para introducir transgenes dentro de mamíferos), en plantas o partes de plantes incluyendo pero no limitado a sus hojas, flores, frutas, semillas, raíces o turbérculos (por ejemplo en tabaco, maíz, fríjol de soya o alfalfa) o en por ejemplo crisálidas del gusano de seda Bombix mori .
Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y polipéptidos de la invención también pueden expresarse y/o producidos en sistemas de expresión libres de células, y ejemplos apropiados de tales sistemas será claro para la persona experta. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos incluyen expresión en el sistema de germen de trigo; en lisados de reticulocito de conejo; o en el sistema Zubay E. coli.
Como se mencionó anteriormente, una de las ventajas del uso de Nanobodies® es que los polipéptidos basados en estos pueden prepararse a través de la expresión en un sistema bacteriano apropiado, y sistemas de expresión bacterianos apropiados, vectores, células hospederas, elementos reguladores, etc., serán claros para la persona experta, por ejemplo de las referencias citada arriba. Debiera sin embargo notarse que la invención en su sentido más amplio no se limita a expresión en sistemas bacterianos.
Preferiblemente, en la invención, un (in vivo o in vitro) sistema de expresión, tales como un sistema de expresión bacteriano, se usa de manera que proporciona los polipéptidos de la invención en una forma que es apropiada para uso farmacéutico, y tales sistemas de expresión nuevamente serán claros para la persona experta. Como también será claro para la persona experta, los polipéptidos de la invención apropiados para uso farmacéutico pueden prepararse usando técnicas para síntesis de péptido.
Para producción en escala industrial, los hospederos heterólogos preferidos para la (industrial) producción de Nanobodies® o terapéuiticos de proteina que contienen Nanobody® incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae que son apropiados para expresión/producción/fermentación a gran escala, y en particular para expresión/producción/fermentación farmacéutica a gran escala. Los ejemplos apropiados de tales cepas serán claros para la persona experta. Tales cepas y sistemas de producción/expresión también se ponen disponibles por compañías tales como Biovitrum (Uppsala, Suecia) .
Alternativamente, las líneas celulares de mamífero, en particular Células de ovarios de hámster chino (CHO) , pueden usarse para expresión/producción/fermentación a gran escala, y en particular para expresión/producción/fermentación farmacéutica a gran escala. Nuevamente, tales sistemas de expresión/producción también se hacen disponibles por algunas de las compañías mencionadas arriba.
La elección del sistema de expresión específico dependería en parte del requerimiento para ciertas modificaciones post-traducción, más específicamente glicosilación . La producción de una proteína recombinante qué contiene Nanobody® para la cual la glicosilación se desea o requiere necesitaría el uso de hospederos de expresión mamíferos que tienen la capacidad para glicosilar la proteína expresada. A este respecto, será claro para la persona experta que el patrón de glicosilación obtenido (es decir, el tipo, número y posición de los residuos enlazados) dependerá de la célula o línea celular que es usada para la expresión. Preferiblemente, ya sea una célula humana o línea celular se usa (es decir, lleva a una proteína que tiene esencialmente un patrón de glicosilación humano) u otra línea celular de mamífero se usa de manera que puede proporcionar un patrón de glicosilación que es esencialmente y/o funcionalmente el mismo como la glicosilación humana o al menos imita la glicosilación humana. En general, los hospederos procarióticos tales como E. coli no tienen la capacidad para glicosilar proteínas, y el uso de eucariótas inferiores tales como levadura usualmente lleva a un patrón de glicosilación que difiere de la glicosilación humana. No obstante, debiera entenderse que todas las anteriores células hospederas y sistemas de expresión pueden usarse en la invención, dependiendo de la secuencia de aminoácidos deseada, Nanobody® o polipéptido a obtenerse.
Así, de acuerdo con una modalidad no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención es glicosilada. De acuerdo con otra modalidad no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención no es glicosilada .
De acuerdo con una modalidad preferida, pero no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención se produce en una célula bacteriana, en particular una célula bacteriana apropiada para producción farmacéutica a gran escala, tales como células de las cepas mencionadas arriba.
De acuerdo con otra modalidad preferida, pero no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención se produce en una célula de levadura, en particular una célula de levadura apropiada para producción farmacéutica a gran escala, tales como células de las especies mencionadas arriba.
De acuerdo con aún otra modalidad preferida, pero no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención se produce en una célula de mamífero, en particular en una célula humana o en una célula de una línea celular humana, y más en particular en una célula humana o en una célula de una línea celular humana que es apropiada para la producción farmacéutica a gran escala, tales como las líneas celulares mencionadas en la presente arriba.
Cuando la expresión en una célula hospedera es usada para producir las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y los polipéptidos de la invención, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y polipéptidos de la invención pueden producirse ya sea intracelularmente (por ejemplo, en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusión) y luego aislarse de las células hospederas y opcionalmente purificarse de forma adicional; o pueden producirse extracelularmente (por ejemplo, en el medio en lo cual las células hospederas se cultivan) y luego aislarse del medio de cultivo y opcionalmente purificarse de forma adicional. Cuando las células hospederas eucarióticas se usan, usualmente se prefiere la producción extracelular ya que esta facilita considerablemente el aislado adicional y procesamiento cadena abajo de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos y proteínas obtenidos. Las células bacterianas tales como las cepas de E. coli mencionadas arriba normalmente no secretan proteínas extracelularmente, excepto por algunas clases de proteínas tales como toxinas y hemolisina, y la producción secretora en E. coli se refiere a la transubicación de proteínas a través de la membrana interior al espacio periplásmico . La producción periplásmica proporciona varias ventajas sobre la producción citosólica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos N-terminal del producto secretado puede ser idéntico al producto de gen natural después de la escisión de la secuencia de secreción de señal por una peptidasa de señal especifica. También, parece haber mucha menos actividad de proteasa en el periplasma que en el citoplasma. Además, la purificación de proteina es más sencilla debido a algunas proteínas contaminantes en el periplasma. Otra ventaja es que se pueden formar enlaces disulfuro correctos debido a que el periplasma proporciona un ambiente más oxifante que el citoplasma. Las proteínas sobreexpresadas en E. coli a menudo se encuentran en agregados insolubles, los llamados cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión pueden localizarse en el citosol o en el periplasma; la recuperación de proteínas biológicamente activas de estos cuerpos de inclusión requiere un proceso de desnaturación/replegado. Muchas proteínas recombinantes, incluyendo proteínas terapéuticas, se recuperan de cuerpos de inclusión. Alternativamente, como estará claro para la persona experta, las cepas de bacteria recombinantes que se han modificado genéticamente de manera que secretan una proteína deseada, y en particular una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o un polipéptido de la invención, pueden usarse.
Así, de acuerdo con una modalidad no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención es una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido que se ha producido intracelularmente y que se ha aislado de la célula hospedera, y en particular de una célula bacteriana o de un cuerpo de inclusión en una célula bacteriana. De acuerdo con otra modalidad no limitante de la invención, la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención es una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido que se ha producido extracelularmente, y que se ha aislado del medio en lo cual la célula hospedera se cultiva.
Algunos promotores preferidos, pero no limitantes para uso con estas células hospederas incluyen,
para expresión en E. coli: promotor lac (y derivados de los mismos tales como el promotor lacUV5); promotor de arabinosa; promotor hacia la izquierda (PL) y derecha (PR) de fago lambda; promotor del operón trp; promotores lac/trp híbridos (tac y trc) ; promotor T7 (más específicamente el del gen 10 del fago T7) y otros promotores del fago T; promotor del gen de resistencia a tetraciclina TnlO; variantes producidos por ingeniería de los promotores anteriores que incluyen una o más copias de una secuencia de operador reguladora extraña;
para expresión en S. cerevisiae: constitutivo: ADHl (alcohol deshidrogenasa 1) , ENO (enolasa) , CYC1 (citocromo c iso-1) , GAPDH (gliceraldehidos-3-fosfato deshidrogenasa) , PGK1 (fosfoglicerato cinasa) , PYK1 (piruvato cinasa) ; regulada: GAL1,10,7 (enzimas metabólicas de galactosa), ADH2 (alcohol deshidrogenasa 2), PH05 (fosfatasa ácida) , CUP1 (metalotioneina de cobre); heterólogo: Ca V (promotor 35S del virus de mosaico de la coliflor) ;
para expresión en Pichia pastoris: el promotor A0X1 (alcohol oxidasa I) ;
para expresión en célula de mamíferos: potenciador/promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hC V) ; variante del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV) ' que contiene dos secuencias operadoras de tetraciclina de tal manera que el promotor puede regularse por el represor Tet; promotor de timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple; potenciador/promotor de la repetición de terminal larga del virus de sarcoma de Rous (RSV LTR) ; promotor del factor de alargado la (hEF-la) de humano, chimpancé, ratón o rata; el promotor temprano SV40; promotor de repetición de terminal larga del VIH-1; promotor de ß-actina;
Algunos vectores preferidos, pero' no limitantes para uso con estas células hospederas incluyen:
vectores para expresión en células de mamíferos: pMAMneo (Clontech) , pcDNA3 (Invitrogen) , pMClneo (Stratagene) , pSG5 (Stratagene) , EB0-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199) , pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y 1ZD35 (ATCC 37565), así como sistemas de expresión basados en virus, tales como aquellos con base en adenovirus;
vectores para expresión en células bacterianas: vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen) ;
vectores para expresión en levadura u otras células de hongos: pYES2 (Invitrogen) y vectores de expresión Pichia (Invitrogen) ;
vectores para expresión en células de insectos: pBlueBacII (Invitrogen) y otros vectores de baculovirus
vectores para expresión en plantas o células de planta: por ejemplo vectores con base en virus de mosaico de la coliflor o virus de mosaico del tabaco, cepas apropiadas de Agrobacterium, o vectores basados en plásmido Ti.
Algunas secuencias secretoras preferidas, pero no limitantes, para uso con estas células hospederas incluyen:
para uso en células bacterianas tales como E. coli: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StlI, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB, y similares; péptido de señal TAT, señal de secreción de C-terminal de hemolisina;
para uso en levadura: secuencia prepro del factor de alineado fosfatasa (phol), invertasa (Suc) , etc . ;
para uso en célula de mamíferos: señal indígena en el caso de que la proteína objetivo sea de origen eucariótico; péptido de señal V-J2-C de cadena Ig de murino; etc.
Las técnicas apropiadas para transformar un hospedero o célula hospedera de la invención serán claras para la persona experta y pueden depender de la célula hospedera pretendida/organismo hospedero y el constructo genético a usarse. Se hace referencia nuevamente a las guías y solicitudes de patente mencionados arriba.
Después de la transformación, puede realizarse una etapa para detectar y seleccionar aquellas células hospederas u organismo hospederos que se han transformado exitosamente con la secuencia de nucleótidos/constructo genético de la invención. Esto puede por ejemplo ser una etapa de selección con base en un marcador seleccionable presente en el constructo genético de la invención o una etapa que involucra la detección de la secuencia de aminoácidos de la invención, por ejemplo, usando anticuerpos específicos.
La célula hospedera transformada (que puede estar en la forma o una línea celular estable) u organismos hospederos (que pueden estar en la forma de una linea mutante estable o cepa) forma además aspectos de la presente invención.
Preferiblemente, estas células hospederas u organismos hospederos son tal que expresan, o son (al menos) capaces de expresar (por ejemplo, bajo condiciones adecuadas) , una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención (y en caso de un organismo hospedero: en al menos una célula, parte, tejido u órgano de los mismos). La invención también incluye generaciones, progenie y/o carnadas adicionales de la célula hospedera u organismo hospedero de la invención, que pueden por ejemplo obtenerse por división celular o por reproducción sexual o asexual.
Para producir/obtener expresión de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® o polipéptidos de la invención, la célula hospedera transformada u organismo hospedero transformado puede en general cuidarse, mantenerse y/o cultivarse bajo condiciones tal que la secuencia de aminoácidos (deseada), Nanobody® o polipéptido de la invención se expresa/produce. Las condiciones apropiadas serán claras para la persona experta y usualmente dependerán de la célula hospedera/organismo hospedero usado, asi como en los elementos reguladores que controlan la expresión de la secuencia de nucleótidos (relevante) de la invención. Nuevamente, se hace referencia a las guias y solicitudes de patente mencionados arriba en los párrafos en los constructos genéticos de la invención.
En general, las condiciones apropiadas pueden incluir el uso de un medio apropiado, la presencia de una fuente apropiada de alimento y/o nutrientes apropiados, el uso de una temperatura apropiada, y opcionalmente la presencia de un factor o compuesto inductor apropiado (por ejemplo, cuando las secuencias de nucleótidos de la invención están bajo el control de un promotor inducible) ; todos los cuales pueden seleccionarse por la persona experta. Nuevamente, bajo tales condiciones, las secuencias de aminoácidos de la invención puede expresarse en una manera constitutiva, en una manera transitoria, o sólo cuando se induce apropiadamente.
También estará claro para la persona experta que la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención puede (primero) generarse en una forma inmadura (como se mencionó anteriormente) , que puede entonces someterse a modificación post-traduccional , dependiendo de la célula hospedera/organismo hospedero usado. También, la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención puede glicosilarse, nuevamente dependiendo de la célula hospedera/organismo hospedero usado.
La secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención puede entonces aislarse de la célula hospedera/organismo hospedero y/o del medio en lo cual dicha célula hospedera u organismo hospedero se cultivó, usando aislado de proteina y/o técnicas de purificación conocidos per se, tales como cromatografía (preparativa) y/o técnicas de electroforesis, técnicas de precipitación diferencial, técnicas de afinidad (por ejemplo, usando una secuencia de aminoácidos escindióle, específica, fusionada con la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención) y/o técnicas inmunológicas preparativas (es decir, usando anticuerpos contra la secuencia de aminoácidos a aislarse) .
La invención además se refiere a un producto o composición que contienen o que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de la invención (o un fragmento adecuado de la misma) , al menos un Nanobody® de la invención, al menos un polipéptido de la invención, al menos un compuesto o constructo de la invención, al menos un constructo monovalente de la invención y/o al menos un ácido nucleico de la invención, y opcionalmente uno o más componentes adicionales de tales composiciones conocidos per se, es decir, dependiendo del uso pretendido de la composición. Tal producto o composición puede por ejemplo ser una composición farmacéutica (como se describe en la presente) , una composición veterinaria o un producto o composición para uso de diagnóstico (como también se describe en la presente) . Algunos ejemplos preferidos pero no limitativos de tales productos o composiciones estarán claros a partir de la descripción adicional en la presente.
En general, para uso farmacéutico, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y polipéptidos de la invención pueden formularse como una preparación farmacéutica o composiciones que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención y al menos un portador, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Por medio de ejemplos no limitativos, tal formulación puede estar en una forma apropiada para administración oral, para administración parenteral (tales como por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa) , para administración tópica, para administración por inhalación, por un parche de la piel, por un implante, por un supositorio, etc. Tales formas de administración apropiadas - que pueden ser sólidas, semi-sólidas o liquidas, dependiendo de la manera de administración - asi como métodos y portadores para usarse en la preparación de los mismos, será clara para la persona experta, y son además descritos en la presente.
Así, en a además aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al menos un aminoácido de la invención, al menos un Nanobody® de la invención, al menos un compuesto o constructo de la invención o al menos un polipéptido de la invención y al menos un portador, diluyente o excipiente apropiado (es decir, apropiados para uso farmacéutico) , y opcionalmente una o más sustancias activas adicionales .
En general, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención se pueden formular y administrar en cualquier manera adecuada conocida per se, para lo cual se hace referencia por ejemplo a la técnica anterior general citada arriba (y en particular a WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 y WO 08/020079) así como a las guías estándar, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Mack Publishing Company, EUA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Lippincott Williams and Wilkins (2005) ; o la Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (ver por ejemplo páginas 252-255) .
Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención pueden formularse y administrarse en cualquier manera conocida per se para anticuerpos convencionales y fragmentos de anticuerpo (incluyendo ScFv' s y diacuerpos) y otras proteínas farmacéuticamente activas. Tales formulaciones y métodos para preparar las mismas serán claras para la persona experta, y por ejemplo incluyen preparaciones apropiadas para administración parenteral (por ejemplo administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraluminal , intra-arterial o intratecal) o para administración tópica (es decir, transdérmica o intradérmica) .
Las preparaciones para administración parenteral puede por ejemplo ser soluciones, suspensiones, dispersiones o emulsiones estériles que son apropiadas para infusión o inyección. Los portadores o diluyentes adecuados para tales preparaciones por ejemplo incluyen, sin limitación, aquellos mencionados en la página 143 de O 08/020079. Usualmente, serán preferidas las soluciones o suspensiones acuosas.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención también pueden administrarse usando métodos de suministro de terapia de genes. Ver, por ejemplo, Patente E.U.A. No. 5,399,346, que se incorpora para referencia en su totalidad. Usando un método de suministro de terapia de genes, las células primarias transíectadas con el gen que codifica una secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención puede transfectarse adicionalmente con promotores específicos de tejido a órganos específicos objetivo, tejidos, injertos, tumores, o células y pueden transfectarse adicionalmente con secuencias de señal y estabilización para expresión localizada subcelularmente .
Así, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo, oralmente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Pueden encerrarse en cápsulas de geletina de concha dura o suave, pueden comprimirse en tabletas, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para administración terapéutica oral, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención pueden combinarse con uno o más excipientes y usarse en la forma de comprimidos ingeribles, comrpimidos bucales, pastillas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obléas, y similares. Tales composiciones y preparaciones debieran contener al menos 0.1% de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto, constructo o polipéptido de la invención. Su porcentaje en las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variar y puede convenientemente estar entre alrededor de 2 hasta alrededor de 60% del peso de una forma de dosificación unitaria dada. La cantidad de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto, constructo o polipéptido de la invención en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de dosificación efectivo.
Los comprimidos, pastillas, pildoras, cápsulas, y similares también pueden contener agentes de enlace, excipientes, agentes desintegrantes, lubricantes y agentes endulzantes o saborizantes, por ejemplo aquellos mencionados en las páginas 143-144 de WO 08/020079. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un portador liquido, tal como un aceite vegetal o un polietilen glicol. Pueden presentarse varios otros materiales como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de la forma de dosificación unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, pildoras, o cápsulas pueden recubrirse con gelatina, cera, laca o azúcar y similares. Un jarabe o elíxir puede contener las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención, sacarosa o fructosa como un agente endulzante, metil y propilparabenos como conservadores, un tinte y sabrizantes tales como sabrizante de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado para preparar cualquier forma de dosificación unitaria debiera ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención pueden incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida .
Las preparaciones y formulaciones para administración oral también pueden proporcionarse con un recubrimiento entérico que permitirá que los constructos de la invención resistan el ambiente gástrico y pasen a los intestinos. Más en general, las preparaciones y formulaciones para administración oral pueden formularse apropiadamente para suministro en parte deseada del tracto gastrointestinal. Además, pueden usarse supositorios apropiados para suministro dentro del tracto gastrointestinal.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención también pueden administrarse intravenosamente o intraperitonealmente por infusión o inyección, como se describe además en las páginas 144 y 145 de WO 08/020079.
Para administración tópica, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención se pueden aplicar en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, en general será deseable administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un portador dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido, como se describe además en la página 145 de WO 08/020079.
En general, la concentración de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención en una composición líquida, tal como una loción, será desde alrededor de 0.1-25 p-%, preferiblemente desde alrededor de 0.5-10 p-%. La concentración en una composición sólida o semi-sólida tal como un gel o un polvo será alrededor de 0.1-5 p-%, preferiblemente alrededor de 0.5-2.5 p-%.
En un aspecto preferido, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención y/o composiciones que comprenden el mismo se administran al tejido pulmonar. En el contexto de la presente invención, "tejido pulmonar" es para los propósitos de esta invención equivalente con tejido pulmonar o pulmón. El pulmón comprende 2 zonas distintas: una zona de conductividad y una respiratoria, dentro de la cual están las vías respiratorias y los compartimientos vasculares (ver por ejemplo, "Pulmonary Drug Delivery", Editado por Karoline Bechtold-Peters and Henrik Luessen, 2007, ISBN 978-3-87193-322-6 páginas 16-28) .
Para suministro pulmonar, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención se pueden aplicar en forma pura, es decir, cuando son líquidos o un polvo seco. Sin embargo, se preferirá administrarlos al tejido pulmonar como composición o formulación que comprende una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto, constructo y/o polipéptido de la invención y un portador adecuado para suministro pulmonar. Consecuentemente la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto, constructo y/o polipéptido de la invención y un portador adecuado para suministro pulmonar. Los portadores apropiados para suministro pulmonar se conocen en la técnica.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención también pueden administrarse como micro- o nanopartículas de fármacos puros con tamaños de partícula y distribuciones favorables para suministro pulmonar.
Consecuentemente la presente invención también se refiere a un dispositivo farmacéutico apropiado para el suministro pulmonar de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos ylo polipéptidos de la invención y apropiado en el uso de una composición que comprende el mismo. Este dispositivo puede ser un inhalador para líquidos (por ejemplo, una suspensión de partículas sólidas finas o gotitas) que comprende la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto, constructos y/o polipéptido de la invención. Preferiblemente este dispositivo es un aerosol que comprende la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto, constructo y/o polipéptido de la invención. El dispositivo también puede ser un inhalador de polvo seco que comprende la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto, constructo y/o polipéptido de la invención en la forma de un polvo seco.
En un método preferido, la administración al tejido pulmonar se realiza al inhalar las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención y/o la composición que comprende el mismo en una nebulización en aerosol. De acuerdo con la invención, la inhalación de la nebulización en aerosol pueden realizarse por un dispositivo inhalador. El dispositivo debiera generar de una formulación que comprende las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención (y/o composición que comprende el mismo) una nebulización en aerosol del tamaño de partícula deseado (distribución) en el momento apropiado del ciclo de inhalación del mamífero, que contienen la dosis correcta de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención ("Pulmonary drug delivery", Bechtold-Peters and Luessen, eds . , ISBN 978-3-87193-322-6, página 125) .
En el contexto de la presente invención, "aerosol" significa una suspensión de partículas sólidas finas o gotitas líquidas (o combinación de los mismos) en un gas en donde para los propósitos de esta invención las partículas y/o gotitas comprenden las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención .
El dispositivo debiera generar de la formulación una nebulización en aerosol del tamaño de partícula deseado (distribución) en el momento apropiado del ciclo de inhalación del mamífero, que contienen la dosis correcta de secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención. Los siguientes 4 requerimientos (formulación, tamaño de partícula, tiempo y dosis) debieran considerarse ("Pulmonary Drug Delivery", Bechtold-Peters and Luessen, eds., supra, páginas 125 y 126):
Las formulaciones que son usadas en los dispositivos pueden variar desde soluciones o suspensiones acuosas usadas en nebulizadores a las soluciones o suspensiones basadas en propelente usadas en inhaladores de dosis medidas o aún mezclas en polvo especialmente producidas por ingeniería para los inhaladores de polvo seco. Todas estas diferentes formulaciones requieren diferentes principios para generación de aerosol, que enfatiza la dependencia mutua del dispositivo y formulación;
Ya que el sitio de deposición de partículas en aerosol depende de su tamaño (aerodinámico) y velocidad, el tamaño de partícula deseado de la nebulización en aerosol varía dependiendo del sitio de deposición deseado en el pulmón, que está relacionado con el fin terapéutico de la administración;
Como la nebulización en aerosol puede afinarse para liberarse en diferentes momentos durante el ciclo de inhalación generado por el mamífero, se prefiere que para los agentes de la invención (a depositarse en las partes periféricas del pulmón) el aerosol se libera al inicio del ciclo de inhalación;
Las dosis pueden variar considerablemente y pueden, por ejemplo, variar por ejemplo, para un humano desde algunos microgramos hasta varios cientos de microgramos o aún miligramos, por ejemplo, alrededor de hasta alrededor de 10 a 100 miligramos.
Varios sistemas de inhalación son por ejemplo, descritos en páginas 129 a 148 en la revisión ("Pulmonary Drug Delivery", Bechtold-Peters and Luessen, eds., supra) e incluyen, pero no se limitan a, nebulizadores, inhaladores de dosis medidas, inhaladores de liquido de dosis medida, e inhaladores de polvo seco. Los dispositivos que toman en cuenta el patrón de respiración optimizado e individualizado para funcionamientos de inhalación controlada también pueden usarse (ver tecnología AKITA® en la página 157 de "Pulmonary Drug Delivery", Bechtold-Peters and Luessen, eds., supra).
Sin embargo, no sólo el dispositivo es importante para el suministro pulmonar de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención sino también la formulación correcta es crítica para alcanzar un suministro efectivo. Esto puede en principio alcanzarse usando uno de los siguientes enfoques:
Administración de soluciones o suspensiones acuosas que comprende las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención (por ejemplo, gotas nasales) dentro de las cavidades nasales;
Nebulización de soluciones o suspensiones acuosas que comprenden las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención;
Atomización por medio de propelentes licuados; y Dispersión de polvo secos.
Por lo tanto las formulaciones de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención se han adoptado y ajustado para la elección del dispositivo de inhalación. Las formulaciones apropiadas, es decir, los excipientes además de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y/o polipéptidos de la invención, son por ejemplo, descritos en el capitulo IV de "Pulmonary Drug Delivery", Bechtold-Peters and Luessen, eds . , supra. A este respecto, también se hace referencia a la solicitud provisional EUA No. US 61/303,447 titulada "Methods and compositions for the preparation of aerosols" presentada por Ablynx N.V. el 12 de febrero de 2010.
La cantidad de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención requerida para usarse en el tratamiento variará no sólo con la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuestos, constructos o polipéptido particular seleccionado sino también con la ruta de administración, la naturaleza de la afección a tratarse y la edad y condición del paciente y finalmente estará a discreción del médico o profesional del cuidado de la salud que atiende. También la dosificación de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos, constructos y polipéptidos de la invención varia dependiendo de la célula hospedera objetivo, tumor, tejido, injerto, u órgano .
La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una dosis sencilla o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por día. La sub-dosis por si misma puede además dividirse, por ejemplo, dentro de diversas administraciones espaciadas aproximadamente discretas; tales como inhalaciones múltiples de un insuflador o por la aplicación de una pluralidad de gotas dentro del ojo.
Un régimen de administración pudiera incluir tratamiento diario, de larga duración. Por "de larga duración" significa al menos dos semanas y preferiblemente, varias semanas, meses, o años de duración. Pueden determinarse modificaciones necesarias en este intervalo de dosificación por alguien de habilidad ordinaria en la técnica usando sólo experimentación de rutina dadas las enseñanzas en la presente. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E. ., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. La dosificación también puede ajustarse por el médico individual en el evento de cualquier complicación.
La invención además se refiere a aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos, ácidos nucleicos, células hospederas, productos y composiciones descrito en la presente, asi como a métodos para la prevención y/o tratamiento de infección del tracto respiratorio provocada por hRSV. Algunas aplicaciones y usos preferidos pero no limitantes estarán claros a partir de la descripción adicional en la presente.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos , compuestos y composiciones de la presente invención pueden en general usarse para bloquear la interacción de proteina F de hRSV con la célula hospedera objetivo y/o su membrana, para neutralizar hRSV (diferentes cepas y/o mutantes de escape de hRSV) , para modular, inhibir y/o prevenir infectividad de hRSV (de diferentes cepas y/o mutantes de escape de hRSV) , para modular, inhibir y/o prevenir la fusión (de diferentes cepas y/o mutantes de escape de hRSV) con (la membrana celular de) la célula hospedera objetivo y/o para modular, inhibir y/o prevenir la entrada de hRSV en la célula hospedera objetivo (de diferentes cepas y/o mutantes de escape de hRSV) .
En un aspecto, las secuencias de aminoácidos,
Nanobodies®, polipéptidos, compuestos y composiciones de la presente invención pueden bloquear la interacción de proteina F de hRSV con la célula hospedera objetivo y/o su membrana por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tales como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, en comparación con la interacción de proteína F de hRSV con la célula hospedera objetivo y/o su membrana bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención, medida en cualquier manera adecuada conocida per se, por ejemplo usando uno de los ensayos descritos en la presente.
En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos y composiciones de la presente invención neutralizan la infectividad de hRSV por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tales como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, en comparación con, la neutralización de hRSV bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención, medida en cualquier manera adecuada conocida per se, por ejemplo usando uno de los ensayos descritos en la presente.
En el contexto de la presente invención, "al modular" o "para modular" en general significa ya sea reducir, prevenir o inhibir infectividad vírica, fusión y/o entrada vírica y/o reducir, prevenir o inhibir las trayectorias biológicas que son mediadas por la proteína F de hRSV, cuando se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo apropiado (tales como aquellos aquí mencionados) . En particular, "al modular" o "para modular" puede significar ya sea reducir, prevenir o inhibir infectividad vírica, fusión y/o entrada vírica y/o reducir, prevenir o inhibir las trayectorias biológicas que son mediadas por proteína F de hRSV cuando se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo apropiado (tales como aquellos aquí mencionados), por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tales como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, en comparación con normal (es decir, que se presenta naturalmente) infectividad vírica, fusión y/o entrada vírica y/o normal (es decir, que se presenta naturalmente) las trayectorias biológicas que son mediadas por proteína F de hRSV en el mismo ensayo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención.
En un aspecto, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos y composiciones de la presente invención puede modular, inhibir y/o prevenir la infectividad de hRSV por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tales como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, en comparación con la infectividad bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención, medida en cualquier manera adecuada conocida per se, por ejemplo usando uno de los ensayos descritos en la presente.
El término "entrada vírica" usado en la presente abarca cualquier trayectoria biológica mediada por virus que es necesario para realizar unión del virión a una célula hospedera objetivo y/o fusión vírica con una célula hospedera objetivo. Se abarca en la presente invención que la entrada vírica, que puede ser cualquier trayectoria biológica mediada por virus que es necesario para realizar unión del virión a la célula hospedera objetivo y/o fusión vírica con una célula hospedera objetivo, puede modularse y/o reducirse y/o prevenir e/o inhibir por el enlace específico de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos y/o compuestos de la invención, cuando se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo apropiado (tales como aquellos aquí mencionados) . En particular, la entrada vírica, que puede estar mediada por la proteína F de hRSV, puede modularse, reducirse, prevenirse o inhibirse por el enlace específico de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos y/o compuestos de la invención a la proteína F de hRSV, cuando se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo apropiado (tales como aquellos aquí mencionados) , por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tales como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, en comparación con normal (es decir, que se presenta naturalmente) entrada vírica (como se definen en la presente) , que puede mediarse por la proteína F de hRSV, en el mismo ensayo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, polipéptido ylo compuesto de la invención. Así, también está abarcado que tal unión vírica y/o fusión vírica puede modularse y/o reducirse y/o prevenir e/o inhibir por el enlace específico de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos y/o compuestos de la invención a la proteína F de hRSV, cuando se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo apropiado (tales como aquellos aquí mencionados) . En particular, la unión vírica y/o fusión vírica, que pueden mediarse por la proteína F de hRSV, pueden modularse, reducirse, prevenirse o inhibirse por el enlace específico de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos y/o compuestos de la invención a la proteína F de hRSV, cuando se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo apropiado (tales como aquellos aquí mencionados) , por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tales como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, en comparación con normal (es decir, que se presenta naturalmente) unión vírica y/o fusión vírica, que puede mediarse por proteína F de hRSV en el mismo ensayo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, polipéptido y/o compuesto de la invención .
A este respecto, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos y composiciones de la presente invención puede modular, inhibir y/o prevenir la entrada de hRSV en la célula hospedera objetivo por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tales como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, en comparación con la entrada en la célula hospedera objetivo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención, por ejemplo usando uno de los ensayos descritos en la presente.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos y composiciones de la presente invención también pueden madular, inhibir y/o prevenir la fusión de hRSV con (la membrana celular de) la célula hospedera objetivo por al menos 1%, preferiblemente al menos 5%, tales como al menos 10% o al menos 25%, por ejemplo por al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o 90% o más, en comparación con la fusión de hRSV con (la membrana celular de) la célula hospedera objetivo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody® o polipéptido de la invención, medida en cualquier manera adecuada conocida per se, por ejemplo usando uno de los ensayos descritos en la presente.
Los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) de la invención han mostrado afinidad mejorada y/o reactividad cruzada mejorada para diferentes genotipos, subtipos, mutantes de escape víricos y/o cepas de hRSV en comparación con la secuencia de aminoácidos monovalente o Nanobody®. En un aspecto, los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) de la invención pueden unir cepas diferentes de RSV (tales como por ejemplo, Larga, A-2 y/o B-l) . Todavía en otro aspecto, los polipéptidos multivalentes (tales como bivalentes o trivalentes) de la invención pueden unir diferentes mutantes de escape de hRSV (tales como por ejemplo, descritos en López et al. 1998, J. Virol. 72: 6922-6928) y/o mutantes de escape específicos para el sitio de antígeno II, sitio de antígeno IV-VI o la combinación de ambos sitios antigénicos.
Consecuentemente, la invención también se refiere al uso de un polipéptido multivalente (por ejemplo, trivalente, bivalente) de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo para enlace y/o neutralización de cepas diferentes de un hRSV. En un aspecto preferido, se usa un Nanobody® NC41 que optimiza la secuencia y/o humanizado bivalente (tales como por ejemplo, un polipéptido bivalente que comprende dos Nanobodies® seleccionados de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157). En otro aspecto preferido, se usa un Nanobody® NC41 que optimiza la secuencia y/o humanizado trivalente (tales como por ejemplo, un polipéptido trivalente que comprende tres Nanobodies® seleccionados de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157). En otro aspecto preferido, se usa una de SEQ ID NO's: 77-79, 142-145 y 158-165.
La invención también se refiere al uso de un polipéptido multivalente (por ejemplo, trivalente, bivalente) de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo para enlace y/o neutralización de uno o más mutantes de escape de a hRSV. En un aspecto preferido, se usa un Nanobody® NC41 humanizado bivalente (tales como por ejemplo, un polipéptido bivalente que comprende dos Nanobodies® seleccionados de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157). En otro aspecto preferido, se usa un Nanobody® NC41 humanizado trivalente (tales como por ejemplo, un polipéptido trivalente que comprende tres Nanobodies® seleccionados de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157) . En otro aspecto preferido, se usa una de SEQ ID NO's: 77-79, 142-145 y 158-165.
La invención también se refiere a un método para la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad vírica, dicho método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody® de la invención, de un polipéptido de la invención, de un compuesto o constructo de la invención y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
Como tal, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos y composiciones de la presente invención pueden usarse para la prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con infección por h SV. Ejemplos de tales enfermedades y trastornos asociados con infección por hRSV serán claros para la persona experta con base en la descripción en la presente, y por ejemplo incluyen las siguientes enfermedades y trastornos: enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y asma .
Consecuentemente, la presente invención también se refiere a un método para la prevención y/o tratamiento de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y/o asma provocada por hRSV, dicho método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una secuencia de aminoácidos de la invención, Nanobody® de la invención, polipéptido de la invención, compuesto o constructo de la invención o constructo monovalente de la invención, o una composición de la invención.
La invención también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody® de la invención, un polipéptido de la invención, un compuesto o constructo de la invención o constructo monovalente de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para prevención y/o tratamiento de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y/o asma; y/o para uso en uno o más de los métodos descritos en la presente.
La invención también se refiere a una secuencia de aminoácidos de la invención, un Nanobody® de la invención, un polipéptido de la invención, un compuesto o constructo de la invención o constructo monovalente de la invención para prevención y/o tratamiento de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y/o asma.
En el contexto de la presente invención, el término "prevención y/o tratamiento" no sólo comprende prevenir y/o tratar la enfermedad, sino también en general comprende prevenir el inicio de la enfermedad, hacer más lento o revertir el progreso de la enfermedad, prevenir o hacer más lento el inicio de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir y/o aliviar uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir la severidad y/o la duración de la enfermedad y/o de cualquiera de los síntomas asociados con esta y/o prevenir un incremento adicional en la severidad de la enfermedad y/o de cualquiera de los síntomas asociados con esta, prevenir, reducir o revertir cualquier daño fisiológico provocado por la enfermedad, y en general cualquier acción farmacológica que es benéfica al paciente a tratarse.
El sujeto a tratarse puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero es en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Como estará claro para la persona experta, el sujeto a tratarse será en particular una persona que padece de, o está en riesgo de, las enfermedades y trastornos mencionados en la presente.
Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método que comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un poliéptido multivalente (por ejemplo, trivalente o bivalente) o compuesto de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un compuesto bivalente o polipéptido de la invención. Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanobody® NC41 optimizado por secuencia y/o humanizado bivalente (tales como por ejemplo, un polipéptido bivalente que comprende dos Nanobodies®. seleccionados de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157) . Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un compuesto trivalente o polipéptido de la invención. Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanobody® NC41 humanizado trivalente (tales como por ejemplo, un polipéptido trivalente que comprende tres Nanobodies® seleccionados de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157). Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una de SEQ ID NO's: 77-79, 142-145 y 158-165.
Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV dicho método comprende administrar al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody® de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para inmunoterapia, y en particular para inmunoterapia pasiva, cuyo método comprende administrar, a un sujeto que padece de o está en riesgo de las enfermedades y trastornos mencionados en la presente, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody® de la invención, de un polipéptido de la invención, de un compuesto o constructo de la invención y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
En los métodos anteriores, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden el mismo puede administrarse en cualquier manera apropiada, dependiendo de la formulación o composición farmacéutica especifica a usarse. Asi, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies® y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden el mismo pueden por ejemplo administrarse oralmente, intraperitonealmente (por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intramuscularmente , o por medio de cualquier otra ruta de administración que rodea el tracto gastrointestinal), intranasalmente, transdérmicamente, tópicamente, por medio de un supositorio, por inhalación, nuevamente dependiendo de la formulación o composición farmacéutica especifica a usarse. El profesional del cuidado de la salud será capaz de seleccionar una ruta de administración apropiada y una formulación o composición farmacéutica apropiada a usarse en tal administración, dependiendo de la enfermedad o trastorno a prevenirse o tratarse y otros factores bien conocidos para el profesional del cuidado de la salud.
Asi, en general, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos y polipéptidos de acuerdo con la invención y/o las composiciones que comprenden el mismo pueden administrarse en cualquier manera apropiada; por ejemplo pero no limitado a esto, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos y polipéptidos de acuerdo con la invención y composiciones que comprende el mismo pueden administrarse intranasalmente y/o por inhalación y/o por cualquier otra forma apropiada de suministro pulmonar; los métodos para suministro pulmonar y/o suministro intranasal y/o suministro por inhalación de un Nanobody®, secuencia de aminoácidos, compuesto o constructo y/o polipéptido de la invención serán conocidos para la persona experta y son por ejemplo, descritos en la guia "Drug Delivery: Principies and Applications" (2005) por Binghe Wang, Teruna Siahaan and Richard Soltero (Eds. Wiley Interscience (John Wiley & Sons)); en la solicitud internacional WO 08/049897 de Ablynx N.V. titulada " Intranasal delivery of polypeptid.es and proteins" ; en "Pharmacology . PreTest™ Self-Assessment and Review" (IIa Edición) por Rosenfeld G.C., Loose-Mitchell D.S.; y en "Pharmacology" (3a Edición) por Lippincott Williams & Wilkins, New York; Shlafer M. cGraw-Hill Medical Publishing División, New York; Yang K.Y., Graff L.R., Caughey A.B. Blueprints Pharmacology, Blackwell Publishing.
Consecuentemente, la presente invención también se refiere a un método para administrar una cantidad efectiva de una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo y/o polipéptido de la invención y/o una composición que comprende el mismo, en donde dicho método comprende la etapa de administrar la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo y/o polipéptido y/o composición que comprende el mismo al tejido pulmonar. En tal método, la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo y/o polipéptido y/o una composición que comprende el mismo puede administrarse por cualquier método conocido en la técnica para suministro pulmonar tal como por ejemplo, por uso de un inhalador o dispositivo de suministro intranasal o aerosol.
En un aspecto preferido de la invención, la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo ylo polipéptido unirá y/o neutralizará virus presente en el tejido pulmonar. Preferiblemente en tal método para suministro pulmonar al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, más preferiblemente al menos 50%, 60%, 70%, e incluso más preferiblemente al menos 80% o más de la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo y/o polipéptido de la invención es estable en el tejido pulmonar por al menos 24 horas, preferiblemente al menos 48 horas más preferiblemente al menos 72 horas.
Se ha encontrado sorprendentemente que las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos y/o polipéptidos de la invención tienen una estabilidad de larga duración en el tejido pulmonar. Por ejemplo, se ha encontrado que un Nanobody® dirigido contra hRSV se mantiene funcional en el pulmón por al menos 48 horas (ver PCT/EP2009/056975 titulada Secuencias de aminoácidos dirigidas contra proteínas de envolvente de un virus y polipéptidos que comprenden las mismas para el tratamiento de enfermedades víricas presentada por Ablynx N.V. el 5 de junio de 2009) . Así, las modalidades de la invención con intervalos de tratamiento tales como una vez al día, una vez cada 2do, 3er, 4to, 5to, 6to o una vez cada semana se piensa que es posible que tomen la estabilidad de larga duración de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos y/o polipéptidos de la invención .
Consecuentemente, la invención se refiere a un método para suministrar una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo y/o polipéptido de la invención al tejido pulmonar de un sujeto sin inactivarse, dicho método comprende la etapa de administrar pulmonarmente dicha secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo y/o polipéptido de la invención a dicho sujeto.
La invención también se refiere a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody® de la invención, de un polipéptido de la invención, de un compuesto o constructo de la invención y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
Más en particular, la invención se refiere a un método para la prevención y/o tratamiento de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y/o asma, dicho método que comprende administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la invención, de un Nanobody® de la invención, de un polipéptido de la invención, de un compuesto o constructo de la invención y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido multivalente (por ejemplo, trivalente, bivalente) o compuesto de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un compuesto bivalente o polipéptido de la invención. Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanobody® NC41 humanizado bivalente (tales como por ejemplo, un polipéptido bivalente que comprende dos Nanobodies® seleccionados de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157). Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de a compuesto trivalente o polipéptido de la invención. Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanobody® NC41 humanizado trivalente (tales como por ejemplo, un polipéptido trivalente que comprende tres Nanobodies® seleccionados de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157). Más en particular, la presente invención puede referirse a un método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método comprende administrar, al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una de SEQ ID NO's: 77-79, 142- 145 y 158-165.
También por ejemplo pero no limitado a esto, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos, y polipéptidos de acuerdo con la invención y composiciones que comprende el mismo, pueden administrarse intramuscularmente y/o por cualquier forma apropiada de suministro al cerebro, tales como cualquier forma apropiada de suministro que permite que dichas secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, compuestos o constructos y composiciones que comprenden los mismos a transportarse a través de la barrera hematoencefálica . Tales métodos para suministro intramuscular y/o cualquier forma apropiada de suministro al cerebro de un Nanobody®, secuencia de aminoácidos y/o polipéptido de la invención serán conocidos para la persona experta y son por ejemplo, descritos en la guía "Drug Delivery: Principies and Applications" (2005) por Binghe Wang, Teruna Siahaan and Richard Soltero (Eds. iley Interscience (John Wiley & Sons) ) ; en "Pharmacology PreTestTM Self-Assessment and Review" (11a Edición) por Rosenfeld G.C., Loose-Mitchell D.S.; y en "Pharmacology" (3a Edición) por Lippincott Williams & Wilkins, New York; Shlafer M. McGraw-Hill Medical Publishing División, New York; Yang K.Y., Graff L.R., Caughey A.B. Blueprints Pharmacology, Blackwell Publishing.
Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden el mismo son administradas de acuerdo con un régimen de tratamiento que es apropiado para prevenir y/o tratar la enfermedad o trastorno a prevenirse o tratarse. El profesional del cuidado de la salud en general podrá determinar un un régimen de tratamiento apropiado, dependiendo de factores tales como la enfermedad o trastorno a prevenirse o tratarse, la severidad de la enfermedad a tratarse y/o la severidad de los síntomas de los mismos, la secuencia de aminoácidos específica, Nanobody®, compuesto o constructo o polipéptido de la invención a usarse, la vía de administración específica y formulación farmacéutica o composición a usarse, la edad, género, peso, dieta, condición general del paciente, y factores similares bien conocidos para el profesional del cuidado de la salud.
En general, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos y/o polipéptidos de la invención, o de una o más composiciones que comprenden el mismo, en una o más cantidades o dosis farmacéuticamente efectivas. Las cantidades o dosis específicas a administrarse se pueden determinar por el profesional del cuidado de la salud, nuevamente con base en los factores citados arriba.
En general, para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en la presente y dependiendo de la enfermedad o trastorno específico a tratarse, la potencia de la secuencia de aminoácidos especifica, Nanobody®, compuesto o constructo y polipéptido de la invención a usarse, la vía de administración especifica y la formulación o composición farmacéutica especifica usada, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos y polipéptidos de la invención en general se administrarán en una cantidad entre 1 gramo y 1 microgramo por kg de peso corporal por día, preferiblemente entre 0.1 gramo y 10 microgramos por kg de peso corporal por dia, lo más preferiblemente entre 0.01 gramo y 100 microgramos por kg de peso corporal por dia tales como alrededor de 0.1, 0.5, 1, 2, 5 o 10 miligramos por kg de peso corporal por dia, ya sea continuamente (por ejemplo, por infusión), como una dosis diaria sencilla o como dosis divididas múltiples durante el dia. Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos y polipéptidos de la invención que contienen una porción que extiende la vida media pueden administrarse en una cantidad entre 1 miligramo y 100 miligramos por kg de peso corporal, preferiblemente entre 1 miligramo y 50 miligramo por kg de peso corporal, tales como alrededor de 10, 15, 20 o 30 miligramo por kg de peso corporal una vez o dos veces al mes. El profesional del cuidado de la salud en general podrá determinar una dosis diaria apropiada, dependiendo de los factores mencionados en la presente.
También será claro que en casos específicos, el profesional del cuidado de la salud puede elegir desviarse de estas cantidades, por ejemplo con base en los factores citados arriba y su juicio experto. En general, alguna guía en las cantidades a administrarse puede obtenerse de las cantidades usualmente administradas por anticuerpos convencionales comparables o fragmentos de anticuerpo contra el mismo objetivo administrados por medio de esencialmente la misma ruta, tomando en cuenta sin embargo diferencias en afinidad/avidez, eficacia, biodistribución, vida media y factores similares bien conocidos para la persona experta.
Cuando la secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo y/o polipéptido y/o una composición que comprende el mismo se administra al tejido pulmonar el régimen de tratamiento puede ser una vez o dos veces al día, preferiblemente una vez al día, o una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, o 7 días.
Usualmente, en el método anterior, una secuencia de aminoácidos sencilla, Nanobody®, compuesto o constructo, o polipéptido de la invención se usará. Sin embargo está dentro del alcance de la invención usar dos o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos y/o polipéptidos de la invención en combinación.
Los Nanobodies®, secuencias de aminoácidos, compuestos o constructos y polipéptidos de la invención también pueden ser usados en combinación con uno o más compuestos o principios farmacéuticamente activos adicionales, es decir, como un régimen de tratamiento combinado, que puede o no llevar a un efecto sinérgico. Nuevamente, el profesional del cuidado de la salud será capaz de seleccionar tales compuestos o principies adicionales, asi como un régimen de tratamiento combiando adicional, con base en los factores citados arriba y su juicio experto.
En particular, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos, y polipéptidos de la invención pueden ser usados en combinación con otros compuestos o principios farmacéuticamente activos que son o pueden usarse para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades y trastornos citados en la presente, como resultado de lo cual un efecto sinérgico puede o no obtenerse. Ejemplos de tales compuestos y principios, asi como rutas, métodos y formulaciones o composiciones farmacéuticas para administrarse serán claros para el profesional del cuidado de la salud.
Cuando dos o más sustancias o principios son para usarse como parte de un régimen de tratamiento combinado, pueden administrarse por medio de la misma ruta de administración o por medio de diferentes rutas de administración, esencialmente al mismo tiempo o en tiempos diferentes (por ejemplo, esencialmente de forma simultánea, consecutivamente, o de acuerdo con un régimen alternante) . Cuando las sustancias o principios son a administrarse de forma simultánea por medio de la misma ruta de administración, pueden administrarse como diferentes formulaciones o composiciones farmacéuticas o parte de una formulación o composición farmacéutica combinada, como será claro para la persona experta.
También, cuando dos o más sustancias o principios activos son para usarse como parte de un régimen de tratamiento combinado, cada una de las sustancias o principios puede administrarse en la misma cantidad y de acuerdo con el mismo régimen como se usa cuando el compuesto o principio se usa como es, y tal uso combinado puede o no llevar a un efecto sinérgico. Sin embargo, cuando el uso combinado de las dos o más sustancias o principios activos lleva a un efecto sinérgico, también es posible reducir la cantidad de una, más o todas las sustancias o principios a administrarse, mientas todavía se alcanza la acción terapéutica deseada. Esto puede ser útil por ejemplo para evitar, limitar o reducir cualquiera de los efectos colaterales indeseados que son asociados con el uso de una o más de las sustancias o principios cuando son usadas en sus cantidades usuales, mientras todavía se obtiene el efecto farmacéutico o terapéutico deseado.
La efectividad del régimen de tratamiento usado de acuerdo con la invención puede determinarse y/o seguirse en cualquier manera conocida per se para la enfermedad o trastorno involucrado, como estará claro para el profesional del cuidado de la salud. El profesional del cuidado de la salud también será capaz, donde sea apropiado y en una base caso por caso, de cambiar o modificar un régimen de tratamiento particular, de manera que se alcanza el efecto terapéutico deseado, para evitar, limitar o reducir efectos colaterales indeseados, y/o para alcanzar un balance apropiado entre alcanzar el efecto terapéutico deseado por un lado y evitar, limitar o reducir efectos colaterales indeseados por otro lado.
En general, el régimen de tratamiento se seguirá hasta que el efecto terapéutico deseado se alcanza y/o mientras el efecto terapéutico deseado se mantenga. Nuevamente, esto se puede determinar por el profesional del cuidado de la salud.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo, o polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad vírica; y/o para uso en uno o más de los métodos de tratamiento mencionados en la presente.
El sujeto a tratarse puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero es en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Como estará claro para la persona experta, el sujeto a tratarse será en particular una persona que padece de, o está en riesgo de, las enfermedades y trastornos mencionados en la presente.
La invención también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo o polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de al menos uno enfermedad o trastorno que puede prevenirse y/o tratarse al administrar una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo o polipéptido de la invención a un paciente.
Más en particular, la invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody®, compuesto o constructo o polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de enfermedades víricas, y en particular para la prevención y tratamiento de una o más de las enfermedades y trastornos enlistados en la presente.
Nuevamente, en tal composición farmacéutica, la una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, compuestos o constructos o polipéptidos de la invención también pueden combinarse apropiadamente con uno o más de otros principios activos, tales como aquellos aquí mencionados.
Usos adicionales de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies®, polipéptidos, ácidos nucleicos, constructos genéticos y hospederos y células hospederas de la invención serán claros para la persona experta con base en la descripción en la presente. Por ejemplo, y sin limitación, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ligarse a un portador apropiado o soporte sólido a manera de suministrar un medio que puede usarse en una forma conocida per se para purificar una proteina envuelta de un virus a partir de composiciones y preparaciones que comprenden el mismo. Los derivados de las secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden una etiqueta detectable apropiada también pueden usarse como marcadores para determinar (cualitativamente o cuantitativamente) la presencia de una proteina envuelta de un virus en la composición o preparación o como un marcador para detectar selectivamente la presencia de una proteina envuelta de un virus en la superficie de una célula o tejido (por ejemplo, en combinación con técnicas de clasificación de célula apropiadas) .
La invención será ahora además descrita por medio de los siguientes aspectos preferidos no limitantes, ejemplos y figuras :
Los contenidos completos de todas las referencias (incluyendo referencias a la literatura, patentes expedidas, solicitudes de patente publicadas, y solicitudes de patente co-pendientes) citadas a través de esta solicitud se incorporan expresamente por ello para referencia, en particular para las enseñanzas que se hacen referencia anteriormente .
ASPECTOS
Aspecto A-l. Secuencia de aminoácidos que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV y que comprende al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) / y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto A-2. Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto A-l, que comprende dos o más extensiones de residuos de aminoácidos en lo cual una extensión es elegida de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una extensión se escoge de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
tal que la extensión de residuos de aminoácidos que corresponde a uno de a) y b) debería estar siempre presente en la secuencia de aminoácidos de la invención y tal que la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge de uno de c) , d) , e) y f ) .
Aspecto A-3. Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto A-l o A-2, que comprende tres o más extensiones de residuos de aminoácidos, en lo cual la primera extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de: a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 102;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y la tercera extensión de residuos de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto A-4. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-3, que enlaza específicamente el sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV y/o que compite con Synagis® para enlazar la proteína F de hRSV.
Aspecto A-5. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-4, que es una secuencia de aminoácidos que se presenta naturalmente (de cualquier especie apropiada) o una secuencia de aminoácidos sintética o semi-sintética .
Aspecto A-6. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-5, que comprende un pliegue de inmunoglobulinas o que bajo condiciones adecuadas es capaz de formar un pliegue de inmunoglobulinas.
Aspecto A-7. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-6, que es una secuencia de inmunoglobulinas.
Aspecto A-8. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-7, que es una secuencia de inmunoglobulinas que se presenta naturalmente (de cualquier especie apropiada) o una secuencia de inmunoqlobulinas sintética o semi-sintética .
Aspecto A-9. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-8, que es una secuencia de inmunoglobulinas humanizada, una secuencia de inmunoglobulinas camelizada o una secuencia de inmunoglobulinas que se ha obtenido por técnicas tales como maduración por afinidad.
Aspecto A-10. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-9, que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia VH) .
Aspecto A-11. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-10, que consiste esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es derivada de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o que consisten esencialmente de una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es derivada de anticuerpo de cadena pesada.
Aspecto A-12. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-11, que consiste esencialmente de un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio) , de un anticuerpo de dominio sencillo (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un anticuerpo de dominio sencillo) , de una "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como a dAb) o de un Nanobody® (incluyendo pero no limitado a una secuencia VHH) ·
Aspecto A-13. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-12, que consiste esencialmente de 4 regiones de armazón (FRl a FR4 , respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente) , en lo cual CDR2 se escoge de:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto A-14. Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto A-13, que consiste esencialmente de 4 regiones de armazón (FR1 a FR , respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente) , en lo cual CDR2 se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 102; o
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una de CDRl o CDR3 se escoge de:
CDRl elegida del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y/o
CDR3 elegida del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto A-15. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-13 o A-14, que consiste de 4 regiones de armazón (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDRl a CDR3, respectivamente), en lo cual:
CDR1 se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y
CDR2 se escoge del grupo que consiste de: c) SEQ ID NO: 102;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y
CDR3 se escoge del grupo que consiste de: e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto A-16. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-15, que comprende al menos SEQ ID NO: 102.
Aspecto A-17. Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto A-16, que comprende al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) ylo la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto A-18. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-16 o A-17, que comprende al menos SEQ ID NO: 102 y una secuencia CDRl elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98; y
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad . cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y una secuencia CDR3 eleqida de:
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto A-19. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-16 hasta A-18, que comprende al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegidas de SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto A-20. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-16 hasta A-19, que comprende SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto A-21. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos. A-1 hasta A-20, que consiste esencialmente de un Nanobody® que:
a) tiene al menos 80% identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157, en lo cual para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, los residuos de aminoácidos que forman las secuencias CDR se ignoran;
y en lo cual:
b) preferiblemente uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se escogen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla A-3 a la Tabla A-8 de WO 08/020079.
Aspecto A-22. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-21, que consiste esencialmente de un Nanobody® humanizado.
Aspecto A-23. Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto A-22, que consiste esencialmente de un Nanobody® humanizado que puede enlazarse (como se define además en la presente) a la proteina F de hRSV y que:
i) es una variante humanizada de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (ver Tabla A-1); y/o
ii) tiene al menos 80% identidad de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (ver Tabla A-1) y/o al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157 (ver Tabla A-4), en lo cual para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, los residuos de aminoácidos que forman las secuencias CDR se ignoran;
y en lo cual:
iii) preferiblemente uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se escogen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla A-3 a la Tabla A-8 de WO 08/020079.
Aspecto A-24. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-23, que está en forma esencialmente aislada.
Aspecto A-25. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-24, para administración a un sujeto, en donde dicha secuencia de aminoácidos no se presenta naturalmente en dicho sujeto.
Aspecto A-26. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-25, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 1000 nM hasta 1 nM o menos, preferiblemente 100 nM hasta 1 nM o menos, más preferiblemente 10 nM hasta 1 nM o menos.
Aspecto A-27. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-26, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kactiV de entre 104 M'V1 hasta alrededor de 107 M-1s" x, preferiblemente entre 105 M"1s"1 y 107 M_1s_1, más preferiblemente alrededor de 106 M_1s_:L o más.
Aspecto A-28. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-27, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kinactiv entre 10"2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"4 s"1 (suministrando un complejo casi irreversible con un ti/2 de días múltiples) , preferiblemente entre 10~3 s"1 y 10~4 s"1, o inferior .
Aspecto A-29. Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-28, que puede neutralizar hRSV (por ejemplo, cuando se mide en un ensayo de microneutralización en hRSV Largo (tales como por ejemplo, descrito en el Ejemplo 6) con un valor IC50 entre 100 nM y 1000 nM, preferiblemente entre 100 nM y 500 nM, o menos.
Aspecto B-l. Nanobody® que está dirigido contra y/o que se enlaza específicamente a la proteína F de hRSV, en lo cual CDR2 se escoge de:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto B-2. Nanobody® de acuerdo con el aspecto B-l, en lo cual CDR2 se escoge del grupo que consiste de:
a) SEQ ID NO: 102; o
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una de CDRl o CDR3 se escoge de:
CDRl elegida del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y/o
CDR3 elegida del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto B-3. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l o B-2, en lo cual:
CDR1 se escoge del grupo que consiste de: a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y
CDR2 se escoge del grupo que consiste de: c) SEQ ID NO: 102;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y
CDR3 se escoge del grupo que consiste de: e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto B-4. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-3, que comprende al menos SEQ ID NO: 102.
Aspecto B-5. Nanobody® de acuerdo con el aspecto B-4, que comprende al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una secuencia CDR elegida de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto B-6. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-4 o B-5, que comprende al menos SEQ ID NO: 102 y una secuencia CDR1 elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98; y
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 6 1 aminoácidos;
y una secuencia CDR3 elegida de:
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto B-7. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-4 hasta B-6, que comprende al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una secuencia CDR elegida de SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto B-8. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-4 hasta B-7, que comprende SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto B-9. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-8, que es en forma esencialmente aislada .
Aspecto B-10. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-9, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 1000 nM hasta 1 nM o menos, preferiblemente 100 nM hasta 1 nM o menos, más preferiblemente 10 nM hasta 1 nM o menos.
Aspecto B-ll. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-10, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kactiv de entre 104 M'V1 hasta alrededor de 107 M_1s_1, preferiblemente entre 105 M~1s"1 y 107 M"1s"1, más preferiblemente alrededor de 106 M"1s"1 o más.
Aspecto B-12. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-ll, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kinactiv entre 10"2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10-4 s"1 (suministrando un complejo casi irreversible con un ti 2 de días múltiples), preferiblemente entre 10~3 s"1 y 10"4 s"1, o inferior.
Aspecto B-13. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-12, que puede neutralizar hRSV (por ejemplo, cuando se mide en un ensayo de microneutralización en hRSV Largo (tales como por ejemplo, descrito en . el Ejemplo 6) con un valor IC50 entre 100 nM y 1000 nM, preferiblemente entre 100 nM y 500 nM, o menos.
Aspecto B-14. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-13, que es un Nanobody® que se presenta naturalmente (de cualquier especie apropiada) o un Nanobody® sintético o semi-sintético .
Aspecto B-15. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-14, que es una secuencia Vm , una secuencia VHH parcialmente humanizada, una secuencia VHH completamente humanizada, un dominio variable de cadena pesada camelizado o un Nanobody® que se ha obtenido por técnicas tales como maduración por afinidad.
Aspecto B-16. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-15, que es un ¦ Nanobody® parcialmente humanizado.
Aspecto B-17. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-16, que es un Nanobody® completamente humanizado.
Aspecto B-18. Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-17, que consiste esencialmente de un Nanobody® humanizado que puede enlazarse (como se define además en la presente) a la proteína F de hRSV y que:
i) es una variante humanizada de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (ver Tabla A-l); y/o
ii) tiene al menos 80% identidad de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (ver Tabla A-l) y/o al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157 (ver Tabla A-4), en lo cual para los propósitos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, los residuos de aminoácidos que forman las secuencias CDR se ignoran;
y en lo cual:
iii) preferiblemente uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se escogen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla A-3 a la Tabla A-8 de WO 08/020079.
Aspecto C-l: Secuencia de aminoácidos que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto C-2 : Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-l, que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 60-76.
Aspecto C-3: Secuencia de aminoácidos que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto C- : Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-3, que es elegida de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó .1 aminoácidos .
Aspecto C-5: Secuencia de aminoácidos de. conformidad con cualesquiera de los aspectos C-3 o C-4, que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Aspecto C-6: Secuencia de aminoácidos que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV elegida de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto C-7 : Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-6, que es elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: : 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto C-8: Secuencia de aminoácidos que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto C-9: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-8, que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-153.
Aspecto C-10: Secuencia de aminoácidos que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto C-ll: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-10, que es elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
- SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto C-12: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos C-10 o C-11, que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO' s : 146-149 y 151-153.
Aspecto C-13: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-14: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-13, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual dos o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-15: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-14, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual tres o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-16: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-15, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual cuatro o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-17: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-16, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual cinco o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-18: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-17, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual seis o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-19: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-18, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual siete o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-20: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-19, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual ocho o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-21: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-20, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual nueve o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-22: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-21, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual diez o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-23: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-22, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto C-24: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-13, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto C-25: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-13, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto C-26: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-25, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto C-27: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, lle20Leu y Glnl08Leu.
Aspecto C-28: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Árg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
Aspecto C-29: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto C-8, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, ~ Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y
Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto C-30: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62.
Aspecto C-31: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65.
Aspecto C-32: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76.
Aspecto C-33: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de any de SEQ ID NO's: 146-153: 76
Aspecto C-34: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos C-l hasta C-33, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 1000 nM hasta 1 nM o menos, preferiblemente 100 nM hasta 1 nM o menos, más preferiblemente 10 nM hasta 1 nM o menos.
Aspecto C-35: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos C-l hasta C-34, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kactiv de entre 104 M_1s_1 hasta alrededor de 107 M_1s~ 1, preferiblemente entre 105 ^s-1 y 107 M~1s~1, más preferiblemente alrededor de 106 M"1s"1 o más.
Aspecto C-36: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos C-l hasta C-35, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con a velocidad kinactiv entre 10"2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"4 s"1 (suministrando un complejo casi irreversible con a ti/2 de días múltiples), preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10~4 s"1, o inferior .
Aspecto C-37: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos C-l hasta C-36, que puede neutralizar hRSV (por ejemplo, cuando se mide en un ensayo de microneutralización en hRSV Largo (tales como por ejemplo, descrito en el Ejemplo 6) con un valor IC50 entre 100 nM y 1000 nM, preferiblemente entre 100 nM y 500 nM, o menos.
Aspecto C-38: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos C-l hasta C-37, que enlaza específicamente sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV y/o que compite con Synagis® para enlazar proteína F de hRSV .
Aspecto D-l: Nanobody® que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV, elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón dé superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto D-2 : Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-l, que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 60-76.
Aspecto D-3: Nanobody® que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto D-4: Nanobody® de acuerdo con cualquiera de aspecto D-3, que es elegido de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto D-5: Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos D-3 o D-4, que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Aspecto D-6: Nanobody® que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV elegidos de los siguientes :
a) ' SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto D-7: Nanobody® de acuerdo con cualquiera de aspecto D-ß, que es elegido de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: : 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto D-8: Nanobody® que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto D-9: Nanobody de acuerdo con el aspecto D-8, que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-153.
Aspecto D-10: Nanobody que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 6 1 aminoácidos.
Aspecto D-ll: Nanobody de acuerdo con el aspecto D-10, que es elegido de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto D-12: Nanobody de conformidad con cualesquiera de los aspectos D-10 o D-ll, que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO' s : 146-149 y 151-153.
Aspecto D-13: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-14: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-13, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual dos o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-15: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-14, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual tres o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-16: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D- 150, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual cuatro o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-17: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-16, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual cinco o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-18: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-17, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual seis o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4P.ro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-19: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-18, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual siete o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-20: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-19, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual ocho o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-21: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-20, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual nueve o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-22: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-21, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual diez o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-23: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-22, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto D-2 : Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-13, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, ArglOSGln y Gly54D.
Aspecto D-25: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-8, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto D-26: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-20, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto D-27: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
Aspecto D-28: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
Aspecto D-29: Nanobody® de acuerdo con el aspecto D-13, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
- Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg,
Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; - Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leuf Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto D-30: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62.
Aspecto D-31: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65.
Aspecto D-32: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76.
Aspecto D-33: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de cualquiera de SEQ ID NO's: 146-153.
Aspecto D-34: Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos D-l hasta D-33, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 1000 nM hasta 1 nM o menos, preferiblemente 100 nM hasta 1 nM o menos, más preferiblemente 10 nM hasta 1 nM o menos.
Aspecto D-35: Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos D-l hasta D-34, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kact v de entre 104 M"1s"1 hasta alrededor de 107 M"1s"1, preferiblemente entre 105 M~1s~1 y 107 M"1s"1, más preferiblemente alrededor de 106 M"1s"1 o más.
Aspecto D-36: Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos D-l hasta D-35, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kinactiv entre 10"2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10~4 s"1 (suministrando un complejo casi irreversible con a ti/2 de días múltiples), preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10~4 s"1, o inferior.
Aspecto D-37 : Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos D-l hasta D-36, que puede neutralizar hRSV (por ejemplo, cuando se mide en un ensayo de microneutralización en hRSV Largo (tales como por ejemplo, descrito en el Ejemplo 6) con un valor IC50 entre 100 nM y 1000 nM, preferiblemente entre 100 nM y 500 nM, o menos.
Aspecto D-38: Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos D-l hasta D-37, que enlaza específicamente sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV y/o que compite con Synagis® para enlazar proteína F de hRSV.
Aspecto W-l: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29 y C-l hasta C-38, que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV, en donde la secuencia de aminoácidos tiene Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) .
Aspecto W-2: Secuencia de aminoácidos que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto W-3: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-2, que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
Aspecto W-4: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto W-5: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto W-6: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-7: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto W-8: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto W-9: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto W-10: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-ll: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto W-12: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-13: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-12, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual dos o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-14: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto -13, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual tres o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-15: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-14, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual cuatro o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-16: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-15, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual cinco o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-17: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto -16, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual seis o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto -18: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-17, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual siete o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto -19: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-18, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual ocho o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-20: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-19, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual nueve o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-21: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-20, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual diez o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-22: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-21, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-23: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-12, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto -24: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-12, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto W-25: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-24, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-26: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-27: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto W-28: Secuencia de aminoácidos de acuerdo con el aspecto W-2 o W-3, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
- GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu,
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln; GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto W-29: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 138.
Aspecto W-30: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 139.
Aspecto W-31: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 140.
Aspecto W-32: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 141.
Aspecto W-33: Secuencia de aminoácidos que comprende o consiste esencialmente de any de SEQ ID NO's: 154-157.
Aspecto W-34: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos -l hasta W-33, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 1000 nM hasta 1 nM o menos, preferiblemente 100 nM hasta 1 nM o menos, más preferiblemente 10 nM hasta 1 nM o menos.
Aspecto W-35: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos W-l hasta W-34, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kactiv de entre 104 M_1s_1 hasta alrededor de 107 M_1s" 1, preferiblemente entre 105 M"1s"1 y 107 M~1s~1, más preferiblemente alrededor de 106 M~1s"1 o más.
Aspecto W-36: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos W-l hasta W-35, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kinactiv entre 10"2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10~4 s'1 (suministrando un complejo casi irreversible con un ti 2 de días múltiples), preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10"4 s^1, o inferior .
Aspecto W-37: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos W-l hasta W-36, que puede neutralizar hRSV (por ejemplo, cuando se mide en un ensayo de microneutralización en hRSV Largo (tales como por ejemplo, descrito en el Ejemplo 6) con un valor IC50 entre 100 nM y 1000 nM, preferiblemente entre 100 nM y 500 nM, o menos.
Aspecto W-38: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos W-l hasta -37, que enlaza específicamente sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV y/o que compite con Synagis® para enlazar proteína F de hRSV.
Aspecto X-l: Nanobody que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18 y D-l hasta D-38, en donde el Nanobody tiene Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) .
Aspecto X-2: Nanobody® que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV, elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto X-3: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-2, que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
Aspecto X-4 : Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-5: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-6: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-7 : Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-8 : Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-9: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-10: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-ll: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-12: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-13: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-12, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual dos o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-14: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-13, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual tres o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-15: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-14, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual cuatro o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-16: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-15, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual cinco o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-17: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-16, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual seis o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-18: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-17, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual siete o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-19: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-18, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual ocho o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-20: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-19, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual nueve o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-21: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-20, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual diez o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-22: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-21, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln; Glnl08Leu y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-23: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-12, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto X-24: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-12, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-25: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-24, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto X-26: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto X-27: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto X-28: Nanobody® de acuerdo con el aspecto X-2, que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en donde los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto X-29: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 138.
Aspecto X-30: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 139.
Aspecto X-31: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 140.
Aspecto X-32: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 141.
Aspecto X-33: Nanobody® que comprende o consiste esencialmente de cualquiera de SEQ ID NO's: 154-157.
Aspecto X-34: Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos X-l hasta X-33, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 1000 nM hasta 1 nM o menos, preferiblemente 100 nM hasta 1 nM o menos, más preferiblemente 10 nM hasta 1 nM o menos.
Aspecto X-35: Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos X-l hasta X-34, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kactiv de entre 104 M-1s-1 hasta alrededor de 107 M"1s"1, preferiblemente entre 105 M^s"1 y 107 M"1s"1, más preferiblemente alrededor de 106 M_1s_1 o más.
Aspecto X-36: Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos X-l hasta X-35, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kinactiv entre 10"2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10"4 s"1 (suministrando un complejo casi irreversible con una ti 2 de días múltiples) , preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10""3 s_1, o inferior.
Aspecto X-37: Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos X-l hasta X-36, que puede neutralizar hRSV (por ejemplo, cuando se mide en un ensayo de microneutralización en hRSV Largo (tales como por ejemplo, descrito en el Ejemplo 6) con un valor IC50 entre 100 nM y 1000 nM, preferiblemente entre 100 nM y 500 nM, o menos.
Aspecto X-38: Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos X-l hasta X-37, que enlaza específicamente sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV y/o que compite con S.ynagis® para enlazar proteína F de hRSV.
Aspecto E-l: Polipéptido que comprende o consiste esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-1 hasta C-38 y W-1 hasta W-38 y/o uno o más Nanobodies® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, y opcionalmente además comprende una o más de otras unidades de enlace de aminoácido, opcionalmente ligados por medio de una o más ligaduras péptidas.
Aspecto E-2: Polipéptido de acuerdo con el aspecto E-1, en lo cual dicha una o más de otras unidades de enlace son secuencias de inmunoglobulinas .
Aspecto E-3: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l o E-2, en lo cual dicha una o más de otras unidades de enlace son elegidas del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio sencillo, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio sencillo, "dAb's", secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un dAb, o Nanobodies®.
Aspecto E- : Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-3, en lo cual dicha una o más secuencias de aminoácidos son secuencias de inmunoglobulinas .
Aspecto E-5: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-4, en lo cual dicha una o más secuencias de aminoácidos son elegidas del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio sencillo, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio sencillo, "dAb's", secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un dAb, o Nanobodies®.
Aspecto E-6: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-5, que comprende o consiste esencialmente de uno o más Nanobodies® de conformidad con cualesquiera de los . aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-8 y X-l hasta X-38 y en lo cual dicha una o más de otras unidades de enlace son Nanobodies®.
Aspecto E-7 : Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-6, que es un constructo multivalente .
Aspecto E-8: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-7, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29 y C-l hasta C-38 y/o Nanobodies® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18 y D-l hasta D-38 y/o al menos una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos W-l hasta W-38 y/o al menos uno Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos X-1 hasta X-38.
Aspecto E-9: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-8, en donde dicho al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-10: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-9, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-ll: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-10, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos ylo Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una extensión se escoge de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 6 1 aminoácidos.
tal que la extensión de residuos de aminoácidos que corresponde a uno de a) y b) debería estar siempre presente en la secuencia de aminoácidos de la invención y tal que la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge de uno de c) , d) , e) y f ) .
Aspecto E-12: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-ll, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
a segunda extensión de residuos de aminoácidos elegida del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 102;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y una tercera extensión de residuos de aminoácidos elegida del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-13: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-12, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102.
Aspecto E-14: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-13, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, *o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-15: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-14, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID-NO: 102 y una secuencia CDR1 elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y una secuencia CDR3 elegida de:
c) SEQ ID NO: 121;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-16: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-15, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegidas de SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto E-17: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-16, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto E-18: Polipéptido multivalente de acuerdo con cualquiera del aspecto E-8 hasta E-17, en donde dicha al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas .
Aspecto E-19: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-9, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-20: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-19, en donde dicho al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-21: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-20, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 60-76.
Aspecto E-22: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-9, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-23: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-22, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-24: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-22 o E-23, en donde dicho al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas .
Aspecto E-25: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-24, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Aspecto E-26: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-9, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-27: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-26, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-28: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-26 o E-27, en donde dicho al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas .
Aspecto E-29: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-28, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de SEQ ID NO's: 65 y 76.
Aspecto E-30: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-9, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-31: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-30, en donde dicho al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-32 : Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-31, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 146-153.
Aspecto E-33: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-9, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-34: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-33, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-35: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-33 o E-34, en donde dicho al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas .
Aspecto E-36: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-35, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias idénticas de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75, 76, 147, 149 y 153.
Aspecto E-37: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once, o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
Aspecto E-38: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-37, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto E-39: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-37, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-40: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-37, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-41: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-40, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-42: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
Aspecto E-43: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
Aspecto E-44: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-37, que comprende o consiste esencialmente de al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg,
Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto E-45: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-7, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38 y/o Nanobodies® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38.
Aspecto E-46: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-45, en donde dicho al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-47: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 o E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-48: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 o E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una extensión se escoge de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
tal que la extensión de residuos de aminoácidos que corresponde a uno de a) y b) debería estar siempre presente en la secuencia de aminoácidos de la invención y tal que la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge de uno de c) , d) , e) y f ) .
Aspecto E-49: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 o E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos eleqidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO: 98; y
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
una segunda extensión de residuos de aminoácidos elegida del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 102; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y una tercera extensión de residuos de aminoácidos elegida del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-50: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 hasta E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102.
Aspecto E-51: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 hasta E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-52: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 hasta E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprende al menos SEQ ID NO: 102 y una secuencia CDRl elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98; y
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que- comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y una secuencia CDR3 elegida de:
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-53: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 hasta E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegidas de SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto E-54: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 hasta E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto E-55: Polipéptido multivalente de acuerdo con any de aspecto E-47 hasta E-53, en donde dicho al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-56: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 o E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-57: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-56, en donde dicho al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-58: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-57, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 60-76.
Aspecto E-59: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 o E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) / y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-60: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-59, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-61: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-59 o E-60, en donde dicho al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas .
Aspecto E-62: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-61, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Aspecto E-63: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 o E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de abat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-64: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-63, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 6 1 aminoácidos .
Aspecto E-65: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-63 o E-64, en donde dicho al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas .
Aspecto E-66: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-65, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas y/o Nanobodies® elegidas de SEQ ID NO' s : 65 y 76.
Aspecto E-67: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 o E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-68: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-67, en donde dicho al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-69: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-68, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 146-153.
Aspecto E-70: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-45 o E-46, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-71: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto ?-7?, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-72: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-70 o E-71, en donde dicho al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas .
Aspecto E-73: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-72, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos idénticas y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75, 76, 147, 149 y 153.
Aspecto E-74: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once, o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
Aspecto E-75: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-74, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto E-76: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-74, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-77: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-74, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-78: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-77, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-79: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
Aspecto E-80: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID' NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
Aspecto E-81: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-74, que comprende o consiste esencialmente de al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, lle20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto E-82: Polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-9, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 6 1 aminoácidos .
Aspecto E-83: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-82, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® elegidas de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
Aspecto E-84: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto E-85: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 62, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto E-86: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 65, en lo cual el Ácido glutámico en la* posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-87: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 76, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-88: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 75, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto E-89: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 147, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto E-90: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 149, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto E-91: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 153, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto E-92: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Le y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto E-93: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-92, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-94: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-92, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-95: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-92, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-96: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-95, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-97: Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-98 : Polipéptido multivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-99: Polipéptido multivalente de acuerdo con el aspecto E-92, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto E-100: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-7, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38 y/o Nanobodies® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38.
Aspecto E-101: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-100, en donde dichas dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-102: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID. O: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-103: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una extensión se escoge de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la' secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
tal que la extensión de residuos de aminoácidos que corresponde a uno de a) y b) debería estar siempre presente en la secuencia de aminoácidos de la invención y tal que la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge de uno de c) , d) , e) y f ) .
Aspecto E-104: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
una segunda extensión de residuos de aminoácidos elegida del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 102;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y una tercera extensión de residuos de aminoácidos elegida del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121;
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-105: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102.
Aspecto E-106: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-107: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y una secuencia CDRl elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98; y
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y una secuencia CDR3 elegida de:
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-108: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegidas de SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto E-109: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto E-110: Polipéptido bivalente de acuerdo con cualquiera del aspecto E-102 hasta E-109, en donde dicho al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas .
Aspecto E-lll: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s : 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-112: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-lll, en donde dichas dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-113: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-112, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias idénticas de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 60-76.
Aspecto E-114: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de RSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-115: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-114, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-116: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-114 o E-115, en donde dichas dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-117: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-116, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias idénticas de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Aspecto E-118: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-119: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-118, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-120: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-118 o E-119, en donde dichas dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-121: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-120, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias idénticas de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de SEQ ID NO's: 65 y 76.
Aspecto E-122: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-123: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-122, en donde dichas dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-124: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-123, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias idénticas de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 146-153.
Aspecto E-125: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-126: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-125, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen . en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-127: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-125 o E-126, en donde dichas dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-128: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-127, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias idénticas de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75, 76, 147, 149 y 153.
Aspecto E-129: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
Aspecto E-130: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-129, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto E-131: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-129, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-132: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-129, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-133: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-132, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-134: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
Aspecto E-135: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
Aspecto E-136: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-129, que comprende o consiste esencialmente de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto E-137: Polipéptido bivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-100 o E-101, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-138: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-137, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® elegidas de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
Aspecto E-139: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico .
Aspecto E-140: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 62, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico.
Aspecto E-141: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 65, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico.
Aspecto E-142: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 76, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico.
Aspecto E-143: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 75, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico.
Aspecto E-144: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 147, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico .
Aspecto E-145: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 149, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico .
Aspecto E-146: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 153, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico .
Aspecto E-147: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico .
Aspecto E-148: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-147, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico.
Aspecto E-149: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-147, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico.
Aspecto E-150: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-147, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico.
Aspecto E-151: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-150, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico.
Aspecto E-152: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico.
Aspecto E-153: Polipéptido bivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico.
Aspecto E-154: Polipéptido bivalente de acuerdo con el aspecto E-147, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
- GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu,
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln; GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
- GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto E-155: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-7, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta -38 y/o Nanobodies® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38.
Aspecto E-156: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-155, en donde dichas tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-157: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-158: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 102;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y al menos una extensión se escoge de:
c) SEQ ID NO: 98;
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
tal que la extensión de residuos de aminoácidos que corresponde a uno de a) y b) debería estar siempre presente en la secuencia de aminoácidos de la invención y tal que la segunda extensión de residuos de aminoácidos se escoge de uno de c) , d) , e) y f ) .
Aspecto E-159: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos una extensión de residuos de aminoácidos elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO: 98; y
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
a segunda extensión de residuos de aminoácidos elegida del grupo que consiste de:
c) SEQ ID NO: 102; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 102, con la condición de que:
i) dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 6 (posición 54 determinada de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y una tercera extensión de residuos de aminoácidos elegida del grupo que consiste de:
e) SEQ ID NO: 121; y
f) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-160: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102.
Aspecto E-161: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98;
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-162: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprende al menos SEQ ID NO: 102 y una secuencia CDRl elegidas de:
a) SEQ ID NO: 98; y
b) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 98, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos;
y una secuencia CDR3 elegida de:
c) SEQ ID NO: 121; y
d) una extensión de residuos de aminoácidos que no tiene más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 121, con la condición de que la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos enlace a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos que comprende dicha extensión de residuos de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-163: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden al menos SEQ ID NO: 102 y al menos una extensión de residuos de aminoácidos (secuencia CDR) elegidas de SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto E-164: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® que comprenden SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 121.
Aspecto E-165: Polipéptido trivalente de acuerdo con cualquiera del aspecto E-157 hasta E-164, en donde dicho al menos tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas .
Aspecto E-166: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2 , más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o. una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la. secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-167: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-166, en donde dichas tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-168: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-167, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos idénticas y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 60-76.
Aspecto E-169: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-170: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-169, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-171: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-169 o E-170, en donde dichas tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-172: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-171, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos idénticas y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Aspecto E-173: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
' a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-174: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-173, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-175: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-173 o E-174, en donde dichas tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-176: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-175, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos idénticas y/o Nanobodies® elegidas de SEQ ID NO's: 65 y 76.
Aspecto E-177: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-178: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-177, en donde dichas tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-179: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-178, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos idénticas y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 146-153.
Aspecto E-180: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de tres acid sequences y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) * secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-181: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-180, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con:
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-182: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-180 o E-181, en donde dichas tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® son idénticas.
Aspecto E-183: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-182, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos idénticas y/o Nanobodies® elegidas de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75, 76, 147, 149 y 153.
Aspecto E-184: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
Aspecto E-185: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-184, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto E-186: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-184, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-187: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-184, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-188: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-187, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-189: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y GlnlOSLeu.
Aspecto E-190: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
Aspecto E-191: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-184, que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
- Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg,
Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp;
Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto E-192: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 62.
Aspecto E-193: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 65.
Aspecto E-194: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 76.
Aspecto E-195: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 75.
Aspecto E-196: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 147.
Aspecto E-197: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 149.
Aspecto E-198: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies® con SEQ ID NO: 153.
Aspecto E-199: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-155 o E-156, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
Aspecto E-200: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-199, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® elegidas de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
Aspecto E-201: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico .
Aspecto E-202: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 62, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico .
Aspecto E-203: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 65, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico .
Aspecto E-204: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 76, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico .
Aspecto E-205: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 75, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico .
Aspecto E-206: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 147, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico .
Aspecto E-207: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 149, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico .
Aspecto E-208: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 153, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico.
Aspecto E-209: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico.
Aspecto E-210: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-209, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico.
Aspecto E-211: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-209, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico.
Aspecto E-212: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-209, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico.
Aspecto E-213: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-212, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se ha cambiado en Ácido aspártico.
Aspecto E-214: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-209, que comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; - GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
- GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto E-215: Polipéptido trivalente que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV, elegidos de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO's: 77-79 y 158;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 77-79 y 158, con la condición de que:
i) las secuencias de aminoácidos o Nanobodies® abarcada en dicho polipéptido have a Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78, una Arginina (Arg, R) en la posición 83 y/o a Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-216: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-215, elegidos de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO's: 77-79 y 158;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 77-79 y 158, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78, una Arginina (Arg, R) en la posición 83 y a Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-217: Polipéptido trivalente que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV, elegidos de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO: 78 y 79;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 78 y 79, con la condición de que :
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78, una Arginina (Arg, R) en la posición 83 y/o a Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-218: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-217, elegidos de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO: 78 y 79; o
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 78 y 79, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78, una Arginina (Arg, R) en la posición 83 y un Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-219: Polipéptido trivalente que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteina F de hRSV, elegidos de los siguientes polipéptidos:
a) SEQ ID NO' s: 159-161;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 159-161, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat ) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-220: Polipéptido trivalente de acuerdo con el aspecto E-219, elegidos de los siguientes polipéptidos:
a) SEQ ID NO's: 159-161;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 159-161, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-221: Polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-219 o E-220, elegidos de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO' s: 159-161;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 159-161, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando el polipéptido tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con:
SEQ ID NO: 159, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 160, la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 161, la secuencia de aminoácidos o
Nanobody® abarcada en dicho polipéptido preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-222: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
Aspecto E-223: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D.
Aspecto E-224: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-225: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-226: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D.
Aspecto E-227: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu.
Aspecto E-228: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu.
Aspecto E-229: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp;
Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; - Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
Aspecto E-230: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 77.
Aspecto E-231: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 78.
Aspecto E-232: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 79.
Aspecto E-233: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 159-161.
Aspecto E-234: Polipéptido trivalente que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV, elegidos de los siguientes polipéptidos :
a) SEQ ID NO's: 142-145 y 162-165;
b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 142-145 y 162-165, con la condición de que:
i) la primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1; y
ii) el polipéptido enlazado a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
Aspecto E-235: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-236: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 77, en lo cual el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-237: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 78, en lo cual el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-238: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 79, en lo cual el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-239: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 158, en lo cual el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-240: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 159, en lo cual el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-241: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 160, en lo cual el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-242: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 161, en lo cual el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-243: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto E-244: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-245: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-246: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto E-247: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico .
Aspecto E-248: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-249: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-250: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
- Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp;
Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; - Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y
Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Glnf
y en donde el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico.
Aspecto E-251: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 142.
Aspecto E-252: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 143.
Aspecto E-253: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 144.
Aspecto E-254: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 145.
Aspecto E-255: Polipéptido trivalente que comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 162-165
Aspecto E-256: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-255, que pueden enlazar específicamente a la proteina F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 100 nM hasta 0.1 nM o menos, preferiblemente 10 nM hasta 0.1 nM o menos, más preferiblemente 1 nM hasta 0.1 nM o menos.
Aspecto E-257: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-256, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kactiV de entre 104 M"1s"1 hasta alrededor de 107 M_1s~ 1, preferiblemente entre 105 M_1s_1 y 107 M"1s"1, más preferiblemente alrededor de 106 M~1s"1 o más.
Aspecto E-258: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-257, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con a velocidad kinactiv entre 10~2 s-1 (ti/2=0.69 s) y 10"4 s'1 (suministrando un complejo casi irreversible con a ti 2 de días múltiples) , preferiblemente entre 10~3 s'1 y 10~4 s_1, más preferiblemente entre 5xl0~3 s"1 y 10~4 s-1, o inferior.
Aspecto E-259: Polipéptido y de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-258, que puede neutralizar hRSV (por ejemplo, cuando se mide en un ensayo de microneutralización en hRSV Largo (tales como por ejemplo, descrito en el Ejemplo 6) con un valor IC50 entre 10 pM y 1000 pM, preferiblemente entre 10 pM y 250 pM, más preferiblemente entre 50 pM y 200 pM o menos.
Aspecto E-260: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-259, que puede neutralizar hRSV (por ejemplo, cuando se mide en un ensayo de microneutralización en hRSV Largo (tales como por ejemplo, descrito en el Ejemplo 6) con un valor IC50 que es al menos iguales y preferiblemente mejores, al menos diez veces mejores, preferiblemente veinte veces mejores, más preferiblemente cincuenta veces mejores, incluso más preferiblemente sesenta, setenta, ochenta o más veces mejor en comparación con el valor IC50 obtenido con Synagis®.
Aspecto E-261: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-260, que es un constructo multiespecífico .
Aspecto F-l: Constructo monovalente, que comprende o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y w-1 hasta W-38 y/o un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38.
Aspecto F-2: Constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-l, en lo cual dicha secuencia de aminoácidos se escoge del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de . dominio, anticuerpos de dominio sencillo, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio sencillo, "dAb's", secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un dAb, o Nanobodies®.
Aspecto F-3: Constructo monovalente, que comprende o consiste esencialmente de one Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38.
Aspecto F-4 : Constructo monovalente, que se escoge del grupo que consiste de SEQ ID NO's: 60-76, SEQ ID NO's: 138-141 y SEQ ID NO's: 146-157.
Aspecto F-5: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4, en la preparación de un polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-261.
Aspecto F-6: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-5, en donde el constructo monovalente es usado como un dominio de enlace o unidad de enlace para preparar un constructo multivalente que comprende dos o más unidades de enlace.
Aspecto F-7 : Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 o F-6, en la preparación de un polipéptido multivalente que preferiblemente exhibe enlace intramolecular en comparación con enlace intermolecular.
Aspecto F-8 : Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-7, como un dominio de enlace o unidad de enlace para preparar un constructo multivalente, en donde los dominios de enlace o unidades de enlace se ligan por medio de una ligadura tal que el polipéptido multivalente preferiblemente exhibe enlace intramolecular en comparación con enlace intermolecular y/o el polipéptido multivalente puede unir simultáneamente todos los sitios de enlace en la proteina F de hRSV.
Aspecto F-9: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente es elegido de los siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia dé plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-10: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-9, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 60-76.
Aspecto F-ll: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente es elegido de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o a Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha, afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-12: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-ll, en donde el constructo monovalente es elegido de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76; o
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-13: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-ll o F-12, en donde el monovalente consiste esencialmente de una de SEQ ID NO: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Aspecto F-14: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente es elegido de los siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-15: Uso de un constructo monovalente according aspecto F-14, en donde el constructo monovalente es elegido de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-16: Uso de un constructo monovalente consisten esencialmente de SEQ ID NO: 62 en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-17: Uso de un constructo monovalente consisten esencialmente de SEQ ID NO: 65 en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-18: Uso de un constructo monovalente consisten esencialmente de SEQ ID NO: 76 en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-19: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente es elegido de los siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
íi) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-20: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-19, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-153.
Aspecto F-21: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente es elegido de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-22: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-21, en donde el constructo monovalente es elegido de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con :
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-23: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-21 o F-22, en donde el monovalente consiste esencialmente de una de SEQ ID NO: 146-149 y 151-153.
Aspecto F-24: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-25: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-24, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-26: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-24, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-27: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-24, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-28: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-27, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-29: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-30: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-31: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-24, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
- Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg,
Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
en la preparación de un polipéptido multivalente .
Aspecto F-32: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente es elegido de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Gln, Q) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido multivalente .
Aspecto F-33: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-32, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
Aspecto F-34 : Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-35: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-36: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente .
Aspecto F-37: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-38 : Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-39: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-40: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente .
Aspecto F-41: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-42: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-43: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-42, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Serf Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-44: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-42, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente .
Aspecto F-45: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-42, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-46: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-42, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente .
Aspecto F-47: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesguiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente.
Aspecto F-48: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-5 hasta F-8, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido multivalente .
Aspecto F-49: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-42, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y ArglOSGln;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
para preparar un constructo multivalente .
Aspecto F-50: Uso de dos constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4 en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-51: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-50, en preparar un constructo bivalente que preferiblemente exhibe enlace intramolecular en comparación con enlace intermolecular.
Aspecto F-52: Uso de dos constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-51, como un dominio de enlace o unidad de enlace en la preparación de un polipéptido bivalente, en donde los dominios de enlace o unidades de enlace se ligan por medio de una ligadura tal que el polipéptido bivalente preferiblemente exhibe enlace intramolecular en comparación con enlace intermolecular y/o el polipéptido bivalente puede unir simultáneamente ambos sitios de enlace en la proteína F de hRSV.
Aspecto F-53: Uso de dos constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-54: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-53, en donde las dos constructos monovalentes son idénticos.
Aspecto F-55: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-53 o F-54, en donde las dos constructos monovalentes consisten esencialmente de una de SEQ ID NO' s: 60-76.
Aspecto F-56: Uso de dos constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o a Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-57: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-56, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) .SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-58: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-56 o F-57, en donde las dos constructos monovalentes son idénticos.
Aspecto F-59: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-58, en donde las dos constructos monovalentes consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Aspecto F-60: Uso de dos constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO' s : 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de abat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-61: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-60, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-62: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-60 o F-61, en donde las dos constructos monovalentes son idénticos.
Aspecto F-63: Uso de dos constructos monovalentes consisten esencialmente de SEQ ID NO: 62 en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-64: Uso de dos constructos monovalentes consisten esencialmente de SEQ ID NO: 65 en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-65: Uso de dos constructos monovalentes consisten esencialmente de SEQ ID NO: 76 en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-66: Uso de dos constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-67: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-66, en donde las dos constructos monovalentes son idénticos.
Aspecto F-68: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-66 o F-67, en donde las dos constructos monovalentes consisten esencialmente de una de SEQ ID NO' s: 146-153.
Aspecto F-69: Uso de dos constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes :
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-70: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-69, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con:
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
- SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
- SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-71: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-69 o F-70, en donde las dos constructos monovalentes son idénticos.
Aspecto F-72: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-71, en donde las dos constructos monovalentes consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
Aspecto F-73: Uso de dos constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-74: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-73, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-75: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-73, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-76: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-73, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-77: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-76, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-78: Uso de dos constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-79: Uso de dos constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-80: Uso de dos constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-73, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; - Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Asp85Glu;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-81: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente es elegido de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2 , más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene a Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-82: Uso de un constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-81, en donde el constructo monovalente consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
Aspecto F-83: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-84: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-85: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-86: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de- los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-87: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-88: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-89: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-90: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-91: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-92: Uso de un constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-91, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-93: Uso de un constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-91, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-94: Uso de un constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-91, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-95: Uso de , un constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-94, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente .
Aspecto F-96: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-97: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-50 hasta F-52, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido bivalente .
Aspecto F-98: Uso de un constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-91, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu; GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln; GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
- GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
GlulAsp y Gly54Asp;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Asp85Glu;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu, Argl05Gln; o
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
en la preparación de un polipéptido bivalente.
Aspecto F-99: Uso de tres constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-1 hasta F-4 en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-100: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-99, en preparar un constructo trivalente que preferiblemente exhibe enlace intramolecular en comparación con enlace intermolecular.
Aspecto F-101: Uso de tres constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-100, como un dominio de enlace o unidad de enlace en la preparación de un polipéptido trivalente, en donde los dominios de enlace o unidades de enlace se ligan por medio de una ligadura tal que el polipéptido trivalente preferiblemente exhibe enlace intramolecular en comparación con enlace intermolecular y/o el polipéptido trivalente puede unir simultáneamente all tres sitio de enlace en la proteina F de hRSV.
Aspecto F-102: Uso de tres constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 60-76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 60-76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-103: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-102, en donde los tres constructos monovalentes son idénticos.
Aspecto F-104: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-102 o F-103, en donde los tres constructos monovalentes consisten esencialmente de una de SEQ ID NO' s: 60-76.
Aspecto F-105: Uso de tres constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o a Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-106: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-105, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-107: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-105 o F-106, en donde los tres constructos monovalentes son idénticos.
Aspecto F-108: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-107, en donde los tres constructos monovalentes consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 62, 65, 67, 68, 75 y 76.
Aspecto F-109: Uso de tres constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s : 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y/o una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-110: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-109, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: : 65 y 76;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 65 y 76, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 54, una Glutamina (Gln, Q) en la posición 105, una Leucina (Leu, L) en la posición 78 y una Arginina (Arg, R) en la posición 83 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-lll: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-109 o F-110, en donde los tres constructos monovalentes son idénticos.
Aspecto F-112: Uso de tres constructos monovalentes consisten esencialmente de SEQ ID NO: 62 en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-113: Uso de tres constructos monovalentes consisten esencialmente de SEQ ID NO: 65 en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-114: Uso de tres constructos monovalentes consisten esencialmente de SEQ ID NO: 76 en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-115: Uso de tres constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO' s: 146-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat); y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-116: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-115, en donde los tres constructos monovalentes son idénticos.
Aspecto F-117: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-115 o F-116, en donde los tres constructos monovalentes consisten esencialmente de una de SEQ ID NO' s: 146-153.
Aspecto F-118: Uso de tres constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-119: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-118, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 de manera que cuando la secuencia de aminoácidos tiene no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con:
SEQ ID NO: 146, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 147, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 148, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 149, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y Glutamina (Gln, Q) en la posición 105;
SEQ ID NO: 151, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83;
SEQ ID NO: 152, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
SEQ ID NO: 153, la secuencia de aminoácidos preferiblemente tiene Arginina (Arg, R) en la posición 83 y Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85;
(dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-120: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-118 o F-119, en donde los tres constructos monovalentes son idénticos.
Aspecto F-121: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-120, en donde los tres constructos monovalentes consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 146-149 y 151-153.
Aspecto F-122: Uso de tres constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-123: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-122, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-124: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-122, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-125: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-122, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-126: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-125, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-127: Uso de tres constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-128: Uso de tres constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-129: Uso de tres constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-122, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
- Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54Asp; Gly54Asp;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y
Argl05Gln;
Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y
Argl05Gln;
- Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg,
Asp85Glu y Argl05Gln,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-130: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 62 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 77, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 62 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 62, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-131: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 65 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 78, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 65 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 65, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-132: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 76 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 79, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 76 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 76, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-133: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 75 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 158, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 75 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 75, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-134: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 147 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 159, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 147 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 147, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-135: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 149 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 160, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 149 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 149, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-136: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 153 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 161, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 153 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 153, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-137: Uso de un constructos monovalentes de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde los constructos monovalentes son elegidos de los siguientes:
a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157;
b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que:
i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y
ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos ,
en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-138: Uso de un constructos monovalentes de acuerdo con el aspecto F-137, en donde el constructo monovalente consisten esencialmente de una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157.
Aspecto F-139: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-140: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 62, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-141: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 65, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-142: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 76, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-143: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 75, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-144: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 147, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-145: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 149, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-146: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 153, en lo cual el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-147: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, once o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-148: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el' aspecto F-147, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en preparar un constructo trivalente .
Aspecto F-149: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-147, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o ocho) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Serl9R, Ile20Leu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-150: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-147, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-151: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-150, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-152: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres o cuatro) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-153: Uso de un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-99 hasta F-101, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 se cambia dentro de Ácido aspártico, en la preparación de un polipéptido trivalente.
Aspecto F-154: Uso de un constructo monovalente de acuerdo con el aspecto F-147, en donde el constructo monovalente consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5, en lo cual los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado:
GlulAsp;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
- GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y Glnl08Leu;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln;
GlulAsp, Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp;
GlulAsp, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y
Gly54Asp;
GlulAsp, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln y
Gly54Asp;
- GlulAsp y Gly54Asp;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Ala83Arg;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y
Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu;
- GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu,
Ala83Arg y Argl05Gln;
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o
GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln,
para preparar un constructo trivalente.
Aspecto F-155: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 138 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 142, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 138 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 5, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-156: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 139 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 143, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 139 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 62, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-157: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 140 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 144, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 140 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 65, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-158: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 141 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 145, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 141 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 76, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-159: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 154 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 162, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 154 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 75, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-160: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 155 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 163, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 155 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 147, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-161: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 156 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 164, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 156 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 149, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto F-162: Uso de una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 157 en la preparación de un polipéptido trivalente con SEQ ID NO: 165, en donde una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 157 está ligada a al menos dos secuencias de aminoácidos adicionales con SEQ ID NO: 153, por medio de una ligadura 15GS.
Aspecto E-262: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-261, que tiene un vida media incrementada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38 per se o Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38 per se, respectivamente.
Aspecto E-263: Polipéptido de acuerdo con el aspecto E-262, en lo cual una o más de otras unidades de enlace proporcionan el polipéptido con vida media incrementada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38 per se o Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38 per se, respectivamente.
Aspecto E-264: Polipéptido de acuerdo con el aspecto E-262 o E-263, en lo cual dicha una o más de otras unidades de enlace that provide el polipéptido con vida media incrementada se escoge del grupo que consiste de proteínas de suero o fragmentos de los mismos, unidades de enlace que pueden enlazarse a proteínas de suero, una porción Fe, y small proteínas o peptides que pueden enlazarse a proteínas de suero.
Aspecto E-265: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-262 hasta E-264, en lo cual dicha una o más de otras unidades de enlace que proporcionan el polipéptido con vida media incrementada se escoge del grupo que consiste de albúmina de suero humano o fragmentos de los mismos.
Aspecto E-266: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-262 hasta E-265, en lo cual dicha una o más de otras unidades de enlace que proporciona el polipéptido con vida media incrementada son elegidas del grupo que consiste de unidades de enlace que pueden enlazarse a albúmina de suero (tales como albúmina de suero humano) o inmunoglobulina de suero (tales como IgG) .
Aspecto E-267: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-262 hasta E-266, en lo cual dicha una o más de otras unidades de enlace que proporciona el polipéptido con vida media incrementada son elegidas del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio sencillo, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio sencillo, "dAb's", secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un dAb, o Nanobodies® que pueden enlazarse a albúmina de suero (tales como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina de suero (tales como IgG) .
Aspecto E-268: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-262 hasta E-267, en lo cual dicha una o más de otras unidades de enlace que proporciona el polipéptido con vida media incrementada es un Nanobody® que puede enlazarse a albúmina de suero (tales como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina de suero (tales como IgG) .
Aspecto E-269: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-262 hasta E-268, que tiene una vida media en suero que es al menos 1.5 vez, preferiblemente al menos 2 veces, tales como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, más grande que la vida media de la secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta -38 per se o Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38 per se, respectivamente.
Aspecto E-270: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-262 hasta E-269, que tiene una vida media en suero que es incrementada con más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tales como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38 per se o Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38 per se, respectivamente.
Aspecto E-271: Polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-262 hasta E-270, que tiene una vida media en suero en humanos de al menos alrededor de 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más; por ejemplo, de al menos 5 días (tales como alrededor de 5 hasta 10 días) , preferiblemente al menos 9 días (tales como alrededor de 9 hasta 14 días), más preferiblemente al menos alrededor de 10 días (tales como alrededor de 10 hasta 15 días) , o al menos alrededor de 11 dias (tales como alrededor de 11 hasta 16 días) , más preferiblemente al menos alrededor de 12 dias (tales como alrededor de 12 hasta 18 dias o más) , o más de 14 dias (tales como alrededor de 14 hasta 19 dias) .
Aspecto G-l: Compuesto o constructo, que comprende o consiste esencialmente de una o más secuencias de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-1 hasta C-38 y W-1 hasta W-38 y/o uno o más Nanobodies® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38 y/o one o más polipéptidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-271, y opcionalmente además comprende uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace, opcionalmente ligados por medio de una o más ligaduras.
Aspecto G-2: Compuesto o constructo de acuerdo con el aspecto G-1, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son secuencias de aminoácidos .
Aspecto G-3: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 o G-2, en lo cual dicho una o más ligaduras, si se presenta, son una o más secuencias de aminoácidos .
Aspecto G- : Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-3, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son secuencias de inmunoglobulinas .
Aspecto G-5: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-4, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son elegidas del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio sencillo, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio sencillo, "dAb's", secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un dAb, o Nanobodies®.
Aspecto G-6: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-5, en lo cual dicha una o más secuencias de aminoácidos de la invención son secuencias de inmunoglobulinas .
Aspecto G-7: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-6, en lo cual dicha una o más secuencias de aminoácidos de la invención son elegidas del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio sencillo, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio sencillo, "dAb's", secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un dAb, o Nanobodies®.
Aspecto G-8: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-7, que comprende o consiste esencialmente de uno o más Nanobodies® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, y en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son Nanobodies®.
Aspecto G-9: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-8, que es un constructo multivalente .
Aspecto G-10: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-9, que es un constructo multiespecifico .
Aspecto G-11: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-10, que tiene un vida media incrementada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38 per se o Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38 per se, o polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271 per se, respectivamente.
Aspecto G-12: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-11, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace provide el compuesto o constructo con vida media incrementada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38 per se o Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38 per se, o polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271 per se, respectivamente.
Aspecto G-13: Compuesto o constructo de acuerdo con el aspecto G-12, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace que proporcionan el compuesto o constructo con vida media incrementada se escoge del grupo que consiste de proteínas de suero o fragmentos de los mismos, unidades de enlace que pueden enlazarse a proteínas de suero, una porción Fe, y small proteínas o peptides que pueden enlazarse a proteínas de suero.
Aspecto G-14: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-12 o G-13, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace que proporcionan el compuesto o constructo con vida media incrementada se escoge del grupo que consiste de albúmina de suero humano o fragmentos de los mismos.
Aspecto G-15: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-12 hasta G-14, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace que proporcionan el compuesto o constructo con vida media incrementada son elegidas del grupo que consiste de unidades de enlace que pueden enlazarse a albúmina de suero (tales como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina de suero (tales como IgG) .
Aspecto G-16: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-12 hasta G-15, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace que proporciona el compuesto o constructo con vida media incrementada son elegidas del grupo que consiste de anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio sencillo, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un anticuerpo de dominio sencillo, "dAb"'s, secuencias de aminoácidos que son apropiadas para uso como un dAb, o Nanobodies® que pueden enlazarse a albúmina de suero (tales como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina de suero (tales como IgG) .
Aspecto G-17: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-12 hasta G-16, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace que proporciona el compuesto o constructo con vida media incrementada es un Nanobody® que pueden enlazarse a albúmina de suero (tales como albúmina de suero humano) o una inmunoglobulina de suero (tales como IgG) .
Aspecto G-18: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-ll hasta G-17, que tiene una vida media en suero que es al menos 1.5 vez, preferiblemente al menos 2 veces, tales como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, más grande que la vida media de la secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y -l hasta W-38 per se o Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-30 y X-l hasta X-38 per se, o polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271 per se, respectivamente.
Aspecto G-19: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-ll hasta G-18, que tiene una vida media en suero que es incrementada con más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tales como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38 per se o Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38 per se, o polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271 per se, respectivamente.
Aspecto G-20: Compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-ll hasta G-19, que tiene una vida media en suero en humanos de al menos alrededor de 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más; por ejemplo, de al menos 5 días (tales como alrededor de 5 hasta 10 días) , preferiblemente al menos 9 dias (tales como alrededor de 9 hasta 14 días) , más preferiblemente al menos alrededor de 10 dias (tales como alrededor de 10 hasta 15 dias), o al menos alrededor de 11 dias (tales como alrededor de 11 hasta 16 dias), más preferiblemente al menos alrededor de 12 dias (tales como alrededor de 12 hasta 18 dias o más), o más de 14 dias (tales como alrededor de 14 hasta 19 dias) .
Aspecto M-l: Secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos, que codifica una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-30 y W-l hasta W-38, a Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-30 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-20, que es tal que puede obtenerse por la expresión de una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifican el mismo, o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-1 hasta F-4.
Aspecto M-2: Secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de acuerdo con el aspecto M-l, que está en la forma de un constructo genético.
Aspecto M-3: Uso de una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de acuerdo con el aspecto M-l, que codifica un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4, para la preparación de un constructo genético que codifica un polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-271.
Aspecto M-4: Uso de una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de acuerdo con el aspecto M-2, en donde el constructo genético codifica un constructo multivalente (tales como uno bivalente) .
Aspecto N-l: Hospedero o célula hospedera que expresa, o que bajo circunstancias apropiadas es capaz de expresar, una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-l hasta G-20, que es tal que puede obtenerse por la expresión de una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifican el mismo, o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4; y/o que comprende una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de acuerdo con el aspecto M-l o M-2.
Aspecto 0-1: Composición, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-l hasta G-20, constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4, o secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de acuerdo con el aspecto M-l o M-2.
Aspecto 0-2: Composición de acuerdo con el aspecto 0-1, que es una composición farmacéutica.
Aspecto 0-3: Composición de acuerdo con el aspecto 0-1 o 0-2, que es una composición farmacéutica, que además comprende al menos un portador, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y que opcionalmente comprende uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales.
Aspecto P-l: Método para producir una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-l hasta G-20, que es tal que puede obtenerse por la expresión de una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifican el mismo, o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4, o una composición de conformidad con cualesquiera de los aspectos 0-1 hasta 0-3, dicho método al menos que comprende las etapas de:
a) expresar, en una célula hospedera apropiada u organismo hospedero o en otro sistema de expresión apropiado, una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de acuerdo con el aspecto -l o M-2,
opcionalmente seguido por:
b) aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-2-9, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, el Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, el polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271, el compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-20, que es tal que puede obtenerse por la expresión de una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifican el mismo, o el constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4, asi obtenido.
Aspecto P-2 : Método para producir una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-1 hasta C-38 y W-1 hasta W-38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l a K-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-l hasta G-20, que es tal que puede obtenerse por la expresión de una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifican el mismo, o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4, o una composición de conformidad con cualesquiera de los aspectos 0-1 hasta 0-3, dicho método al menos que comprende las etapas de:
a) cultivar y/o mantener un hospedero o célula hospedera de acuerdo con el aspecto N-1 bajo condiciones que son tal que dicho hospedero o célula hospedera expresa y/o produce al menos una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-1 hasta C- 38 y W-1 hasta W-38, Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-271, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-20, que es tal que puede obtenerse por la expresión de una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifican el mismo, o constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-1 hasta F-4, o composición de conformidad con cualesquiera de los aspectos 0-1 hasta 0-3,
opcionalmente seguido por:
b) aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, el Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, el polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-271, el compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-20, que es tal que puede obtenerse por la expresión de una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifican el mismo, o el constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-1 hasta F-4, o la composición de acuerdo con el aspecto 0-1 hasta 0-3, asi obtenido .
Aspecto P-3: Método para preparar un polipéptido bivalente o trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-261, dicho método que comprende al menos las etapas de ligar dos o más secuencias de aminoácidos monovalentes o constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4 y por ejemplo una o más ligaduras.
Aspecto P-4 : Método de acuerdo con el aspecto P-3, que comprende las etapas de:
a) ligar dos o más secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con el aspecto M-l, que codifican a constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4 (y también por ejemplo ácidos nucleicos que codifican una o más ligaduras y además uno o más elementos adicionales de constructos genéticos conocidos per se) para obtener un constructo genético de acuerdo con el aspecto M-2; b) expresar, en una célula hospedera apropiada u organismo hospedero o en otro sistema de expresión apropiado, el constructo genético obtenido en a)
opcionalmente seguido por:
c) aislar y/o purificar el polipéptido bivalente o trivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-261, asi obtenido.
Aspecto Q-l: Método para cribado secuencias de aminoácidos dirigidas contra proteina F de hRSV, dicho método que comprende al menos las etapas de:
a. proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos ;
b. cribado de dicho conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos para secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que pueden enlazarse a y/o tiene afinidad por una proteina envuelta de un virus y que está bloqueada de forma cruzada o bloquea de forma cruzada un Nanobody® de la invención, por ejemplo, una de SEQ ID NO's: 60-76, 138-141 y 146-157 (Tabla A-4), o un polipéptido o constructo que comprende al menos un Nanobody® de la invención, por ejemplo, un polipéptido o constructo que comprende al menos una de SEQ ID NO: 77-99, 142-145 y 158-165 (ver Tabla A-5) ; y
c. aislar dicha secuencia de ácido nucleico, seguido por expresar dicha secuencia de aminoácidos.
Aspecto R-l: Método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método que comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-30 y W-l hasta w-38, Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-20, constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-1 hasta F-4 y/o composición de acuerdo con el aspecto 0-1 hasta 0-3.
Aspecto R-2: Método para la prevención y/o tratamiento de al menos uno de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y asma, dicho método que comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B- 18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-l hasta G-20, constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-1 hasta F-4 y/o composición de acuerdo con el aspecto 0-1 hasta 0-3.
Aspecto R-3: Método para la prevención y/o tratamiento de al menos uno enfermedad o trastorno que puede prevenirse y/o tratarse al administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta -38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18,D-1 hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-l hasta G-20, a constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-1 hasta F-4 y/o una composición de acuerdo con el aspecto 0-1 hasta 0-3, dicho método que comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-20, constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-1 hasta F-4 y/o composición de acuerdo con el aspecto 0-1 hasta 0-3.
Aspecto R-4 : Método para inmunoterapia, dicho método que comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18,D-1 hasta D-38 y X-l hasta X-38, polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-l hasta G-20, constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-1 hasta F-4 y/o composición de acuerdo con el aspecto 0-1 hasta 0-3.
Aspecto R-5: Uso de una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, a Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-20, a constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-1 hasta F-4 y/o composición de acuerdo con el aspecto 0-1 hasta 0-3 en la preparación de una composición farmacéutica para prevención y/o tratamiento de infección por hRSV; y/o para uso en uno o más de los métodos de acuerdo con el aspecto R-l hasta R-4.
Aspecto R-6: Secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-271, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-l hasta G-20, constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4 y/o composición de acuerdo con el aspecto 0-1 hasta 0-3 para prevención y/o tratamiento de al menos uno de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y asma.
Aspecto S-l: Parte o fragmento de una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-1 hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, y/o un polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-271.
Aspecto S-2: Parte o fragmento de acuerdo con el aspecto S-l, que pueden enlazar específicamente un Antigenico II sobre la proteína F de hRSV y/o compite con Synagis® para enlazar proteína F de hRSV.
Aspecto S-3: Parte del fragmento de conformidad con cualesquiera de los aspectos S-l hasta S-2, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una constante de disociación (KD) de 1000 nM hasta 1 nM o menos, preferiblemente 100 nM hasta 1 nM o menos, más preferiblemente 10 nM hasta 1 nM o menos.
Aspecto S-4: Parte o fragmento de conformidad con cualesquiera de los aspectos S-2 hasta S-3, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kactj.v de entre 104 M_1s_1 hasta alrededor de 107 M_1s" 1, preferiblemente entre 105 M^s"1 y 107 M"1s"1, más preferiblemente alrededor de 106 M"1s~1 o más.
Aspecto S-5: Parte o fragmento de conformidad con cualesquiera de los aspectos S-2 hasta S-4, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kinactiv entre 10"2 s"1 (ti 2=0.69 s) y 10"4 s"1 (suministrando un complejo casi irreversible con una ti/2 de días múltiples) , preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10"4 s"1, o inferior .
Aspecto S-6: Compuesto o constructo, que comprende o consiste esencialmente de una o más partes o fragmentos de conformidad con cualesquiera de los aspectos S-1 hasta S-5, y opcionalmente además comprende uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace, opcionalmente ligados por medio de una o más ligaduras.
Aspecto S-7 : Compuesto o constructo de acuerdo con el aspecto S-6, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son secuencias de aminoácidos.
Aspecto S-8 : Compuesto o constructo de acuerdo con el aspecto S-6 o S-7, en lo cual dicho one o más ligaduras, si se presenta, son una o más secuencias de aminoácidos.
Aspecto S-9: Secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos, que codifica a parte o fragmento de conformidad con cualesquiera de los aspectos S-1 hasta S-5 o a compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos S-6 hasta S-8.
Aspecto S-10: Composición, que comprende al menos uno parte o fragmento de conformidad con cualesquiera de los aspectos S-1 hasta S-5, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos S-6 hasta S-8, o secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de acuerdo con el aspecto S-9.
Aspecto T-l: Derivado de una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38 o de un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38.
Aspecto T-2: Derivado de acuerdo con el aspecto T-l, que pueden enlazar específicamente al sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV y/o compete con Synagis® para enlazar proteína F de hRSV.
Aspecto T-3: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-l hasta T-2, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kactiv de entre 104 M~1s~1 hasta alrededor de 107 M~1s"1, preferiblemente entre 105 M"1s"1 y 107 M"1s"1, más preferiblemente alrededor de 106 M"1s"1 o más.
Aspecto T-4: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-2 hasta T-3, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kactiv de entre 104 M^s'1 hasta alrededor de 107 _1s~\ preferiblemente entre 105 M'V1 y 107 M^s"1, más preferiblemente alrededor de 106 M"1s~1 o más.
Aspecto T-5: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-2 hasta T-4, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kinactiv entre 10~2 s"1 (ti/2=0.69 s) y 10-4 s"1 (suministrando un complejo casi irreversible con una ti 2 de días múltiples) , preferiblemente entre 10"3 s"1 y 10~4 s"1, o inferior.
Aspecto T-6: Derivado de a compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-20 o un polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-271.
Aspecto T-7: Derivado de acuerdo con el aspecto T-6, que pueden enlazar específicamente al sitio antigénico II sobre la proteína F de hRSV y/o compete con Synagis® para enlazar proteína F de hRSV.
Aspecto T-8 : Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-6 hasta T-7, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una constante de disociación ( D) de 100 nM hasta 0.1 nM o menos, preferiblemente 10 nM hasta 0.1 nM o menos, más preferiblemente 1 nM hasta 0.1 nM o menos.
Aspecto T-9: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-6 hasta T-8, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con una velocidad kactiv de entre 104 M~1s~1 hasta alrededor de 107 M"1s"1, preferiblemente entre 105 ^s"1 y 107 M-1s_1, más preferiblemente alrededor de 106 M"1s"1 o más.
Aspecto T-10: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-6 hasta T-9, que pueden enlazar específicamente a la proteína F de hRSV con a velocidad kinactiv entre 10"2 s-1 (ti/2=0.69 s) y 10~4 s"1 (suministrando un complejo casi irreversible con una ti 2 de días múltiples), preferiblemente entre 10~3 s"1 y 10~4 s"1, más preferiblemente entre 5xl0"3 s"1 y 10~4 s"1, o inferior.
Aspecto T-ll: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-6 hasta T-10, que puede neutralizar hRSV, por ejemplo, en un ensayo de microneutralización de RSV de cepa Larga (tales como por ejemplo, descrito en el Ejemplo 6) , con un valor IC50 entre 10 pM y 1000 p , preferiblemente entre 10 pM y 250 pM, más preferiblemente entre 50 pM y 200 pM o menos.
Aspecto T-12: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-6 hasta T-ll, que puede neutralizar hRSV, por ejemplo, en un ensayo de microneutralización de RSV de cepa Larga (tales como por ejemplo, descrito en el Ejemplo 6) , con un valor IC50 que es al menos iguales y preferiblemente mejores, al menos diez veces mejores, preferiblemente veinte veces mejores, más preferiblemente cincuenta veces mejores, incluso más preferiblemente sesenta, setenta, ochenta o más veces mejor en comparación con el valor IC50 obtenido con Synagis®.
Aspecto T-13: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-l hasta T-12, que tiene una vida media en suero que es al menos 1.5 vez, preferiblemente al menos 2 veces, tales como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, más grande que la vida media de la secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y -l hasta W-38 per se, Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38 per se, polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-l hasta E-261, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-1 hasta G-20 per se, o constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4 per se, respectivamente .
Aspecto T-14: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-l hasta T-13, que tiene una vida media en suero que es incrementada con más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tales como más de 12 horas, o aún más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualesquiera de los aspectos A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38 per se, Nanobody® de conformidad con cualesquiera de los aspectos B-1 hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38 per se, polipéptido de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-1 hasta E-261, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos G-l hasta G-20 per se, o constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos F-l hasta F-4 per se, respectivamente.
Aspecto T-15: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-l hasta T-14, que tiene una vida media en suero en humanos de al menos alrededor de 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más; por ejemplo, al menos 5 días (tales como alrededor de 5 hasta 10 días) , preferiblemente al menos 9 dias (tales como alrededor de 9 hasta 14 dias), más preferiblemente al menos alrededor de 10 dias (tales como alrededor de 10 hasta 15 días), o al menos alrededor de 11 días (tales como alrededor de 11 hasta 16 días) , más preferiblemente al menos alrededor de 12 días (tales como alrededor de 12 hasta 18 días o más), o más de 14 días (tales como alrededor de 14 hasta 19 días) .
Aspecto T-16: Derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-l hasta T-15, que es un derivado pegilado.
Aspecto T-17: Compuesto o constructo, que comprende o consiste esencialmente de uno o más derivados de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-l hasta T-16, y opcionalraente además comprende uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace, opcionalmente ligados por medio de una o más ligaduras.
Aspecto T-18: Compuesto o constructo de acuerdo con el aspecto T-17, en lo cual dicho uno o más de otros grupos, residuos, porciones o unidades de enlace son secuencias de aminoácidos .
Aspecto T-19: Compuesto o constructo de acuerdo con el aspecto T-17 o T-18, en lo cual dicha una o más ligaduras, si se presenta, son una o más secuencias de aminoácidos.
Aspecto T-20: Secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos, que codifica un derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-1 hasta T-16 o un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-17 hasta T-19.
Aspecto T-21: Composición, que comprende al menos un derivado de conformidad con cualesquiera de los aspectos T-1 hasta T-16, compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera' de los aspectos T-17 hasta T-19, o secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de acuerdo con el aspecto T-20.
Aspecto U-l: Un método para administrar una cantidad efectiva de una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, a Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, a compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-1 hasta G-20 y/o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-l hasta F-4, y/o una composición que comprende el mismo, en donde dicho método comprende la etapa de administrar la secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29,C-1 hasta C-38 y W-l hasta W-38, el Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, el polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, el compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-1 hasta G-20 y/o el constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-l hasta F-4, y/o una composición que comprende el mismo al tejido pulmonar.
Aspecto U-2 : El método de acuerdo con el aspecto U-l, en donde la secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, el Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, el polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, el compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-1 hasta G-20 y/o el constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-l hasta F-4, y/o una composición que comprende el mismo se administra por el uso de un inhalador, dispositivo de suministro intranasal o aerosol.
Aspecto U-3: Método de conformidad con cualesquiera de los aspectos U-l o U-2, en donde al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, más preferiblemente al menos 50%, 60%, 70%, e incluso más preferiblemente al menos 80% o más de la secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y -l hasta W-38, el Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, el polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, el compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-1 hasta G-20 y/o el constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-l hasta F-4, y/o una composición que comprende el mismo es estable en el tejido pulmonar por al menos 24 horas, preferiblemente al menos 48 horas más preferiblemente al menos 72 horas.
Aspecto U-4: Método de conformidad con cualesquiera de los aspectos U-l hasta U-3, en donde la secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, el Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, el polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, el compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-l hasta G-20 y/o el constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-l hasta F-4, y/o una composición que comprende el mismo se aplican en forma pura, es decir, cuando son liquidas o un polvo seco.
Aspecto U-5: Método de conformidad con cualesquiera de los aspectos U-l hasta U-3, en donde la secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, el Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, el polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, el compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-l hasta G-20 y/o el constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-l hasta F-4, y/o una composición que comprende el mismo son administradas al tejido pulmonar como composición o formulación que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-1 hasta G-20 y/o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-l hasta F-4, y un portador adecuado para suministro pulmonar.
Aspecto U-6: Composición farmacéutica que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-1 hasta G-20 y/o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-l hasta F-4, y un portador adecuado para suministro pulmonar.
Aspecto U-7: Dispositivo farmacéutico apropiado para el suministro pulmonar de una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta -38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-l hasta G-20 y/o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-l hasta F-4 y/o apropiado en el uso de una composición que comprende el mismo.
Aspecto U-8 : Dispositivo farmacéutico de acuerdo con el aspecto U-7 que es un inhalador para líquidos (por ejemplo, una suspensión de partículas sólidas finas o gotitas) que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-l hasta G-20 y/o a constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-1 hasta F-4.
Aspecto U-9: Dispositivo farmacéutico de acuerdo con el aspecto U-7 que es un aerosol que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta ?-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-l hasta G-20 y/o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-1 hasta F-4.
Aspecto U-10: Dispositivo farmacéutico de acuerdo con el aspecto U-7 que es un inhalador de polvo seco que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta W-38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-l hasta G-20 y/o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-1 hasta F-4 en la forma de un polvo seco.
Aspecto U-ll: Método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método que comprende administrar al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29, C-l hasta C-38 y W-l hasta -38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-l hasta G-20 y/o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-1 hasta F-4 y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
Aspecto U-12: Método para la prevención y/o tratamiento de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y asma, dicho método que comprende administrar al tejido pulmonar de un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones A-l hasta A-29,C-1 hasta C-38 y W-l hasta W-38, un Nanobody® de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones B-l hasta B-18, D-l hasta D-38 y X-l hasta X-38, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones E-l hasta E-271, un compuesto o constructo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones G-l hasta G-20 y/o un constructo monovalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones F-l hasta F-4, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
Aspecto V-l: Método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, dicho método que comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los. aspectos E-7 hasta E-261, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
Aspecto V-2 : Uso de un polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-261, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo para enlace y/o neutralización de hRSV.
Aspecto V-3: Uso de un polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-261, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo para enlace y/o neutralización de cepas diferentes de hRSV.
Aspecto V- : Uso de un polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-261, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo para enlace y/o neutralización de uno o más mutantes de escape de un virus.
Aspecto V-5: Método o Uso de conformidad con cualesquiera de los aspectos V-l hasta V-4, en donde el polipéptido multivalente es bivalente.
Aspecto V-6: Método o uso de conformidad con cualesquiera de los aspectos V-l hasta V-4, en donde el polipéptido multivalente es trivalente.
Aspecto V-7 : Método o uso de conformidad con cualesquiera de los aspectos V-l hasta V-6, en donde dicho polipéptido multivalente se administra de acuerdo con cualquiera de los métodos de las reivindicaciones U-l hasta U-5 y/o U-ll hasta U-12.
Aspecto v-8: Método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV virus, dicho método que comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-261 y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
Aspecto V-9: Método de acuerdo con el aspecto V-8 en donde el compuesto o constructo multivalente es seleccionado de Tabla A-5 (SEQ ID NO's: 77-99, 138-141 y 146-157).
Aspecto V-10: Método de conformidad con cualesquiera de los aspectos V-8 o V-9, en donde se trata la infección por uno o más RSV mutantes de escape.
Aspecto V-ll: Método de acuerdo con el aspecto V-10, en donde el mutante de escape es un mutante de escape especifico para sitio antigénico II.
Aspecto V-12: Uso de un compuesto o constructo multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-261, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo para enlace y/o neutralización uno o más diferentes mutantes de escape de RSV.
Aspecto V-13: Uso de acuerdo con la reivindicación V-12 en donde el mutante de escape es un mutante de escape especifico para sitio antigénico II.
Aspecto V-14: Método de conformidad con cualesquiera de los aspectos V-8 o V-9, en donde se trata la infección por una o más cepas de hRSV.
Aspecto V-15: Método de acuerdo con el aspecto V-14, en donde la cepa RSV strain es Larga.
Aspecto V-16: Método de acuerdo con el aspecto V-14, en donde la cepa RSV es A-2.
Aspecto V-17: Método de acuerdo con el aspecto V-14, en donde la cepa RSV es B-l.
Aspecto V-18: Método de acuerdo con el aspecto V-14, en donde el polipéptido multivalente enlaza y/o neutraliza la cepa RSV Larga y A-2.
Aspecto V-19: Método de acuerdo con el aspecto V-14, en donde el polipéptido multivalente enlaza y/o neutraliza la cepa RSV Larga y B-l.
Aspecto V-20: Método de acuerdo con el aspecto V-14, en donde el polipéptido multivalente enlaza y/o neutraliza la cepa RSV B-l y A-2.
Aspecto V-21: Método de acuerdo con el aspecto V-14, en donde el polipéptido multivalente enlaza y/o neutraliza la cepa RSV Larga, A-2 y B-l.
Aspecto V-22: Uso de un compuesto o constructo multivalente de conformidad con cualesquiera de los aspectos E-7 hasta E-261, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo para enlace y/o neutralización de cepas diferentes de hRSV.
Aspecto V-23: Uso de acuerdo con el aspecto V-22, en donde las cepas de RSV son Larga y A-2.
Aspecto V-24: Uso de acuerdo con el aspecto V-22, en donde las cepas de RSV son Larga y B-l.
Aspecto V-25: Uso de acuerdo con el aspecto V-22, en donde las cepas de RSV son A-l y B-l.
Aspecto V-26: Uso de acuerdo con el aspecto V-22, en donde las cepas de RSV son Larga, A-2 y B-l.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Inmunizaciones
Dos llamas (156 y 157) se inmunizaron de acuerdo con los protocolos estándar con 6 estímulos de hRSV FTM- (forma menos anclada de membrana de la proteína de fusión, 70 kDa; Corrall T. et al. 2007, BMC Biotechnol. 7: 17). Se recolectó sangre de estos animales 7 días después del estímulo 6 y 10 días después del estímulo 6.
Dos llamas (212 y 213) se inmunizaron intramuscularmente en el cuello con 1 mg de RSV de cepa inactivada con ARN Larga A (Hytest, Turku Finlandia; #8RSV79) , seguido por 4 estímulos de 0.5 mg RSV en un régimen quincenal. Dos llamas (206 y 207) se inmunizaron intramuscularmente con 1 mg de RSV de cepa inactivada con ARN Larga A, estimularon con 0.25 mg de RSV después de 2 semanas, seguido por 3 estímulos con 50 ]iq de hRSV FTM-NN recombinante (forma menos anclada de membrana de la proteína de fusión, 70 kDa: Corral et al. 2007; BMC Biotechnol. 7: 17) en un régimen quincenal. Para todas las inmunizaciones los antigenos se prepararon como emulsiones de aceite-PBS con Stimune como adyuvante. Se recolectó sangre de estos animales 4 días y 10 días después de la cuarta inmunización, aunque también se tomó una biopsia del ganglio linfático 4 días después de la cuarta inmunización. Para el procedimiento Nanoclon, se recolectó 100 mL de sangre 11 días después de del estimulo final de llamas 206 y 207.
Ejemplo 2 : Construcción de la biblioteca
Se prepararon células mononucleares de sangre periférica de muestras de sangre usando Ficoll-Hypaque de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después, se extrajo el ARN total de estas células asi como de las células arqueadas de ganglio linfático y usadas como material de partida para RT-PCR para amplificar Nanobody® que codifica los fragmentos del gen. Estos fragmentos se clonaron dentro del vector de fagémido derivados de pUCH9 que contienen el promotor LacZ, una secuencia de codificación de proteina colifago pIII, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de clonación múltiple y la secuencia líder gen3. En estructura con la secuencia de codificación Nanobody®, el vector se codifica para una etiqueta c-myc de terminal C y una etiqueta (His)6. Se preparó el fago de acuerdo con métodos estándares y almacenó a 4°C para uso adicional, haciendo las colecciones de fago 156, 157, 206, 207, 212 y 213.
Ejemplo 3: Selección de Nanobody® con la proteina F de hRSV
Para identificar Nanobodies® que reconocen la proteina de fusión de RSV, las bibliotecas 156, 157, 206, 207, 212 y 213 se usaron para selección en FTM-NN (forma menos anclada de membrana de la proteina de fusión Larga, 70 kDa, ; Corral T. et al. 2007, BMC Biotechnol. 7: 17). La proteina FTM" (25 ng/pozo) se inmovilizó en placas Nunc Maxisorp ELISA. Se incluyó un control con 0 g/ml FTM- . Se eluyeron los fagos de enlace del FTM- usando tripsina y Synagis® ( Palivizumab, Medlmmune, anticuerpo monoclonal humanizado, descrito en Zhao y Sullender 2005, J. Virol. 79: 3962) en la primera y segunda ronda de selecciones. Se usó remicade (Infliximab, anti-TNF; Centocor) como un control para Synagis®. Un exceso de 100 molar de Synagis® se usó con objeto de identificar Nanobodies® que enlazan específicamente al sitio de enlace Synagis® en RSV. Las salidas de las primeras selecciones de ronda, eluídas con Synagis® se usaron para las segundas selecciones de ronda.
Además, las selecciones se hicieron usando hRSV de cepa Larga inactivada (Hytest #8RSV79) . La proteína FTM-NN (25 ng/pozo) o RSV (5 hasta 50 µ?/????) se inmovilizó en placas Nunc Maxisorp ELISA, después de un control A con 0 µg/ml de antígeno. Se eluyeron los fagos de enlace del FTM-NN usando tripsina, Synagis® ( Palivizumab, anticuerpo monoclonal humanizado, descrito en Zhao y Sullender 2005, J. Virol. 79: 396), o 101F Fab (WO 06/050280, anticuerpo monoclonal humanizado) en la primera ronda de selección. Las salidas de las primeras selecciones de ronda eluídas con Synagis® o 101F Fab se usaron para las segundas selecciones de ronda, usando ya sea Numax Fab ( otavizumab o MEDI-524, un producto de anticuerpo monoclonal humanizado de tercera generación evolucionado de palivizumab; WO 06/050166), Synagis® o 101F Fab para elución. Se usó remicade (Infliximab, anti-TNF, ver también WO 09/068625) como un control para Synagis®, mientras que Omnitarg Fab (anti-Her2; producido en casa) sirve como control para Numax Fab y 101F Fab. Un exceso 100 molar de Synagis®, Numax Fab o 101F Fab se usó con objeto de identificar Nanobodies® que enlazan específicamente a sitios antigénicos II o epítopos IV-VI en la proteína RSV F. Para obtener Nanobodies® específicos para el sitio antigénico IV-VI, se realizaron segundas selecciones de ronda usando dos péptidos biotinilados : al principio, un péptido que comprende 422-436 residuos de la proteína F (Larga) (Abgent, San Diego, CA) que abarcan el epítopo de enlace 101F (Wu et al. 2007, J. Gen. Virol. 88: 2719-2723), en segundo lugar, un imitador de péptido del epítopo de Mabl9 (HWSISKPQ-PEG4-K-biotina) (Chargelegue et al. 1998, J. Virol.72: 2040-2056).
Las salidas de ambas rondas de selecciones se analizaron para el factor de enriquecimiento (fago presente en el eluído con relación a los controles) . Con base en estos parámetros las mejores selecciones se eligieron para análisis adicional. Las colonias individuales se seleccionaron e hicieron crecer en placas de 96 pozos profundos (1 mL de volumen) e indujeron al agregar IPTG para expresión de Nanobody®. Los extractos periplásmicos (volumen: ~ 80 µ?) se prepararon de acuerdo con métodos estándares.
Para prueba de clones seleccionados en ensayos de neutralización RSV, los extractos periplasmáticos de cultivos de 10 mi se purificaron parcialmente al usar IMAC PhyTips (Phynexus Inc, San José, CA) . En esto se cargaron 800 µ? de extractos periplasmáticos en columnas Phytips 200+ preempacadas con resina de cromatografía de afinidad de metal inmovilizada, seguido por elución de Nanobodies® etiquetados His en 30 µ? de glicina-HCl 0. l /NaCl 0.15 (pH3) , después de lo cual los eluídos se neutralizaron con 5 µ? de Tris-HCl 0.5 M pH 8.5.
E emplo 4 : Selección de Nanobody® con FJM-NN de RSV usando Tecnología de Nanoclon
Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de muestras de sangre usando Ficoll-Hypaque de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células B especificas de antigeno que expresan anticuerpos de cadena pesada en su superficie se aislaron de los PBMCs por medio de clasificación FACS (para una descripción de la Tecnología de Nanoclon se hace referencia a WO 06/079372). A esto, la proteína FTM- NN se etiquetó con pigmento de Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA; cat . nr. A20000) y posteriormente se desaló para remover el pigmento Alexa Fluor 488 no conjugado residual de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
PBMC pre-inmunitario (control de antecedentes) e inmunitario de una llama se tiñeron con IgGl conjugado de pigmento fluorescente (inmunoglobulinas de cadena pesada+ligera convencionales) , anticuerpos monoclonales de ratón específicos de IgG2 e IgG3 (clases de inmunoglobulina de cadena pesada) , anticuerpo DH59B fluorescentemente etiquetado (CD172a) (VMRD, Inc. Pullman, WA; Cat No. DH59B; Davis et al. 1987, Vet . Immunol . Immunopathol . 15: 337-376) y antígeno etiquetado Alexa 488. TOPR03 se incluyó como un pigmento discriminador de célula viva/muerta. Los linfocitos B de IgGl+, monocitos, neutrófilos y células muertas se desconectaron y por lo tanto se rechazaron de la clasificación. Las células B positivas IgG2 o IgG3 especificas de antigeno (A488+) fueron células sencillas clasificadas individualmente dentro de los pozos de placa PCR separados que contienen solución amortiguadora RT-PCR.
Para la llama 206, se obtuvieron células positivas de antigeno al 1.9% de la cantidad total de células vivas positivas IgG2/IgG3 (1.0% en muestra de referencia pre-inmunitaria) , para llama 207 se obtuvieron células positivas al 4.2% (0.7% en muestra de referencia pre-inmunitaria) . Los genes de región variable de cadena pesada se amplificaron directamente de estas células B por RT-PCR de célula sencilla y PCR anidado. Los productos PCR se clonaron posteriormente dentro de un vector de expresión adaptado TOPO derivado de pUC119 que contiene el promotor LacZ, un gen de resistencia para arnpicilina o carbenicilina, un sitio de clonación múltiple y la secuencia líder gen3. En estructura con la secuencia de codificación Nanobody®, el vector se codifica para una etiqueta c-myc de terminal C y una etiqueta (His)6. Los constructos clonados se transformaron en células de Escherichia coli TOP10 por medio de electroporación de alto desempeño. Se hicieron crecer clones sencillos en placas de 96 pozos profundos (1 mi de volumen) e indujeron al agregar IPTG para expresión Nanobody®. Los extractos periplásmicos (volumen: ~ 80 µ?) se prepararon por medio de choque osmótico y analizaron para enlazar a FTM- en un ELISA de enlace.
En corto, 2 g/ml de FTM- se inmovilizó directamente en placas de microtitulación Maxisorp (Nunc) . Los sitios de enlace libres se bloquearon usando Marvel al 4% en PBS . Después, 10 µ? de extracto periplásmico que contiene Nanobody® de los diferentes clones en 100 µ? de Marvel PBST al 2% se permitieron para enlazar al antigeno inmovilizado. Después de la incubación y una etapa de lavado, el enlace Nanobody® se reveló usando un anticuerpo secundario anti-VHH de conejo (para las fracciones periplásmicas) . Después de una etapa de lavado los Nanobodies® en las fracciones periplásmicas se detectaron con un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado HRP. La especificidad de enlace se determinó con base en valores OD en comparación con controles que no han recibido Nanobody®.
En total, 8 agentes de enlace FTM_ NN positivos (4 de llama 206, 4 de llama 207) se obtuvieron de cada 52 VHHs clonados .
E emplo 5 : Cribado para Nanobodies® que enlazan al sitio antigénico II o IV-VI
Los extractos periplásmicos que contienen Nanobodies® sencillos se analizaron para enlazar al sitio de antigeno II o IV-VI, usando un ensayo Alphascreen® (Perkin Elmer; Waltham, MA) (García-Barreno et al. 1989, J. Virol. 63: 925-932; Lopeze et al. 1998, J. Virol. 72: 6922-6928). En esta situación FTM-NN se enlaza de forma simultánea por Fabs de Synagis® y 101F, permitiendo la detección de Nanobodies® que interfiere con el enlace de cada uno de los sitios antigénicos II y IV-VI respectivos. En este, los extractos periplásmicos se agregaron a la proteína FTM-NN (0.3 nM) e incubaron durante 15 minutos. Posteriormente se agregaron Fab Synagis® biotinilado (0.3 nM) y perlas aceptoras conjugadas con Fab 101F (10 pg/ml) y esta mezcla se incubó durante 1 hora. Finalmente las perlas donadoras recubiertas de estreptavidina (10 pg/ml) se agregaron y después de 1 hora de incubación la placa se leyó en el lector de microplaca Envision. Los extractos periplásmicos se diluyeron 25 veces que corresponden aproximadamente una concentración final de 40 nM. El ensayo se validó por titulación de los competidores conocidos de Synagis®, mabs 18B2 (Argene, Varilhes, Francia; 18042 N1902) y 2F7 (Abcam, Cambridge, RU; ab43812) . También se analizaron Synagis® Fab, Numax Fab, y 101F Fab, con Numax Fab que tiene el valor más bajo IC50 (8.6 E-ll M) seguido por Synagis® Fab (5.97 E-10 M) y 101F Fab (1.12 E-9 M) . Para el cribado de extractos periplasmáticos (en dilución 1/25) tanto Numax Fab (40 n ) como 101F Fab (40 nM) se usaron como controles positivos, aunque los extractos periplasmáticos irrelevantes sirven como controles negativos. Los clones que interfieren con el enlace a la proteina FTM~NN en el Alphascreen® más de 75% con relación a los controles negativos se identificaron como linea. En total 341 lineas se identificaron de cada 1856 clones, derivados de las 6 llamas pero la mayoría viene de las llamas 206 y 207. Además, de cada 8 clones obtenidos de las selecciones de Nanoclon 3 clones muestran competencia.
El sitio de antígeno correcto (II o IV-VI) de los competidores se desconvolucionó por medio de un ELISA de competencia con Synagis® Fab biotinilado (2 nM) o 101F Fab biotinilado (3 nM) para enlazar a la proteína FTM-NN (1 g/ml). En corto, la proteína FTM- NN se inmovilizó en placas de microtitulación Maxisorp (Nunc) y los sitios de enlace libres se bloquearon usando Marvel al 4% en PBS. Los extractos periplasmáticos se diluyeron 1/10 y mezclaron con el Fab biotinilado antes del enlace a la proteína FTM~ NN inmovilizada. Las fracciones periplásmicas de control seleccionadas contra otras proteínas de cubierta vírica se incluyeron. El anticuerpo de competencia se permitió para enlazar al antígeno inmovilizado con o sin Nanobody®. Después de incubación y una etapa de lavado, la detección ocurre por medio de anticuerpos secundarios conjugados con Extravidin-HRP (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO; Cat. No. E2886) . La especificidad de enlace se determinó con base en valores OD en comparación con controles que no han recibido Nanobody®.
Todos las lineas se sometieron a análisis de secuencia y se clasificaron dentro de familias de acuerdo con sus secuencias CDR3 (ver Tabla C-4 y A-l en la solicitud PCT PCT/EP2009/056975 titulada "Secuencias de aminoácidos dirigidas contra proteínas de envolvente de un virus y polipéptidos que comprende las mismas para el tratamiento de enfermedades víricas" presentada por Ablynx N.V el 5 de junio de 2009) .
Ejemplo 6: Cribado para Nanobodies® neutralizantes de RSV
De las seis bibliotecas hRSV se analizaron 163 secuencias únicas (160 identificadas de las bibliotecas de fagos, 3 derivadas de Nanoclon) para capacidad neutralizada con RSV Larga en un ensayo de micro-neutralización como proteínas parcialmente purificadas. Las células Hep2 se sembraron a una concentración de 1.5 x 104 células/pozo dentro de placas de 96 pozos en medio DMEM que contiene suero de becerro fetal al 10% (FCS) complementado con Penicilina y Estreptomicina (100 U/ml y 100 g/ml, respectivamente) e incubaron durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera C02 al 5%. La solución madre de virus usada se refiere como cepa de hRSV Larga, Larga LM-2 y Larga M2 (usada intercambiablemente) y es una solución madre de virus derivada de ATCC VR-26 de la cual la secuencia de la proteína F corresponde a P12568 o M22643. La solución madre de virus se ha pasado varias veces de la solución madre de ATCC. La secuencia de la proteína F se confirmó para ser idéntica a P12568 (ver ejemplo 9) . Una cantidad estándar de hRSV de cepa Larga LM-2 se pre-incubó con varias diluciones de un volumen fijo de Nanobodies® purificado con Phytips (20 µ?) en un volumen total de 50 µ? durante 30 minutos a 37 °C. El medio de las células Hep2 se reemplazó con la premezcla para permitir la infección durante 2 horas, después de lo cual se agregó 0.1 mi de medio de ensayo. El ensayo se realizó en medio DMEM complementado con suero de becerro fetal al 2.5% y Penicilina y Estreptomicina (100U/ml y 100 ug/ml, respectivamente) . Las células se incubaron durante unas 72 horas adicionales a 37 °C en una atmósfera C02 al 5%, después de lo cual las células se lavaron dos veces con Tween-20 al 0.05% en PBS y una vez con PBS solo, después de lo cual las células se fijaron con acetona fría al 80% ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en PBS (100 µ?/????) durante 20 minutos a 4°C y se dejaron secar completamente. Después la presencia de la proteína F en la superficie celular se detectó en un ensayo tipo ELISA. A esto, las células Hep2 fijadas se bloquearon con solución de Albúmina de suero de Bovino al 2% (BSA) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, que se incubaron durante 1 hora con Synaqis® (2 µ?/???) . Para la detección de IgG anti-humano de cabra, se usó HRP especifico de fragmento Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) , después de lo cual el ELISA se desarrolló de acuerdo con procedimientos estándares.
Además de los Nanobodies® 191D3 neutralizantes de RSV previamente identificados (SEQ ID NO: 9) y 192C4 (SEQ ID NO: 11), los cuales se incluyeron como controles positivos en el cribado, 5 clones del sitio antigénico II muestran la actividad neutralizada con RSV Larga fuerte: 1E4 (también referida como 207D1; SEQ ID NO: 1), 7B2 (SEQ ID NO: 2), NC23 (SEQ ID NO: 3), y dos miembros de la misma familia 15H8 (SEQ ID NO: 4) y NC41 (SEQ ID NO: 5) (Tabla A-l) . Ninguno de los Nanobodies® específicos del sitio antigénico IV-VI muestra más de la actividad neutralizada muy débil para cepa hRSV Larga LM-2.
Ejemplo 7: Producción de Nanobodies® hRSV
Además de los Nanobodies® 191D3 neutralizantes de RSV previamente identificados (SEQ ID NO: 9) y 191E4 (SEQ ID NO: 10), los cuales se incluyeron como controles positivos en el cribado, cinco nuevos Nanobodies® neutralizados seleccionados del cribado descritos arriba (1E4, 7B2, 15H8, NC23 y NC41) asi como 1 sitio antigénico IV-VI Nanobodies® (15B3; SEQ ID NO: 7) se expresaron, purificaron y caracterizaron además. A esto las secuencias de codificación se volvieron a clonar en un vector de expresión derivado de pUC119 que contiene el promotor LacZ, un gen de resistencia para canamicina, un sitio de clonación múltiple y la secuencia de péptido de señal OmpA. En estructura con la secuencia de codificación Nanobody®, el vector se codifica para una etiqueta c-myc de terminal C y una etiqueta (His)6.
La expresión ocurrida en células TG-1 de E. coli como proteínas etiquetadas c-myc, His6 en un volumen de cultivo de 1 L. Se indujo la expresión por adición de IPTG 1 mM y se permitió continuar durante 3 horas a 37 °C. Después del hilado de los cultivos celulares, se prepararon los extractos periplásmicos al congelar-descongelar los peletizados y la resuspensión en dPBS. Estos extractos se usaron como material de partida para cromatografía de afinidad de metal inmovilizada (IM7AC) usando columnas crudas Histrap FF (GE healthcare, Uppsala, Suecia) . Los Nanobodies® se eluyeron de la columna con imidazol 250 mM y posteriormente se desalaron hacia dPBS.
Ejemplo 8: Caracterización de Nanobodies® hRSV
Enlace a proteína F en ELISA
Todos los Nanobodies® purificados se mostraron para enlazar a la proteina F en un ELISA de enlace a la proteina FTM- NN y a hRSV. Los resultados para enlace hRSV se muestran en la Tabla B-l. En corto, 1 yg/ml de FTM-NN o 5 pg/ml de hRSV (Hytest Turku, Finlandia) se inmovilizaron directamente en placas de microtitulación Maxisorp. Los sitios de enlace libres se bloquearon con caseína al 1%. Varias diluciones de Nanobodies® purificados se permitieron para enlazar el antígeno durante 1 hora. El enlace de Nanobody® se reveló usando un anticuerpo secundario anti-VHH de conejo, y detección final con un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con HRP. La especificidad de enlace se determinó con base en valores OD en comparación con controles Nanobody® irrelevantes .
Enlace a la proteína F en Biacore
Para determinar las afinidades de enlace precisas de los Nanobodies® purificados, un análisis cinético se realizó usando análisis de resonancia de Plasmón de Superficie en la proteína FTM-NN . Para preincubación del Sensorchip CM5, 10 g/ml de proteína hRSV FTM- se dejó durante 120 segundos. Para inmovilización por acoplamiento de amina, EDC/NHS se usó para activación y HC1 de etanolamina para desactivación (Biacore, kit de acoplamiento de amina) . Se agregó Synagis® 100 nM y luego 100 nM de los Nanobodies®. La evaluación de las constantes de disociación se realizó al ajustar un modelo de interacción 1:1 (modelo de enlace Langmuir) por software Biacore T100 vl.l. Las constantes de disociación y constantes de afinidad se muestran en la Tabla B-l.
Competencia con Synagis®
La capacidad de Nanobodies® purificados para competir con Synagis® Mab o Synagis® Fab biotinilado para enlazar a FTM-NN se determinó en ELISA de competencia siguiendo el procedimiento como esencialmente se describe en el Ejemplo 5. La Figura 1 muestra un ejemplo representativo de un ELISA de competencia en donde los Nanobodies® purificados compiten con Synagis® Fab biotinilado para enlazar a FTM-NN. Los valores EC50 se resumen en la Tabla B-l.
Ejemplo 9: Micro neutralización zn v tro de cepas distintas hRSV
La potencia de Nanobodies® purificados en neutralización de diferentes cepas RSV tipo A y B se probó por el ensayo de micro neutralización in vitro (ver Ejemplo 6) . Las soluciones madre víricas de RSV Larga LM-2 (No. de Acceso P12568; ATCC VR-26), RSV A-2 (ATCC VR-1540; lote nr. 3199840) y RSV B-l (ATCC VR-1580; lote nr. 5271356) se prepararon dentro de células Hep2 y posteriormente se titularon para determinar la dosis infecciosa óptica para usarse en el ensayo de micro neutralización. Los resultados de potencias de neutralización de los diferentes Nanobodies® purificados se muestran en la Tabla B-l. Aunque los seis Nanobodies® que reconocen el epítopo Synagis® pueden eficientemente neutralizar cepas Largas tipo A y A-2, fallan para neutralizar la infección con la cepa B-l o lo hacen en concentraciones > 1 µ?. Los competidores 101F 15B3 y 191E4 muestran neutralización potencia muy débil en la cepa B-l sólo cuando se administran a concentraciones en µ?.
Las secuencias de las proteínas F respectivas de las diferentes cepas RSV se verificaron por medio de PCR de transcriptasa inversa y análisis de secuencia posterior. Brevemente, el ARN total se aisló de células Hep2 infectadas con RSV usando mini kit RNeasy (Qiagen, Venlo, Países Bajos) , después de lo cual se preparó ADN complementario usando kit de transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La proteína F de cepas RSV A se amplificó y procesó por secuencia usando los cebadores descritos en Kimura et al. 2004 (Antiviral Research 61: 155-171). Para amplificación de la proteina F de cepa B-1 RSV los siguientes cebadores se usaron: FBl_exterior_para : cttagcagaaaaccgtga (SEQ ID NO: 13); FBl_exterior_rev : tgggttgatttgggattg (SEQ ID NO: 14); FBl_seq_1123-para : ggactgatagaggatggta (SEQ ID NO: 15); FBl_seq_1526-rev: gctgacttcacttggtaa (SEQ ID NO: 16). La secuencia de cepa B-1 RSV corresponde a no. de acceso P13843, con una mutación de punto adicional Ser540Leu. La secuencia para la cepa 2 Larga RSV corresponde completamente a la secuencia reportada (no. de acceso M22643) . La secuencia para la cepa RSV A-2 corresponde a no. de acceso M11486. Ver también Tabla A-2.
Ejemplo 10: Construcción, producción y caracterización de Nanobodies® hRSV multivalentes
Los constructos de Nanobody® multivalentes conectados por ligaduras Gly-Ser de diferentes largaitudes y composición se generaron por medio de reacciones PCR separadas (1 para la terminal N, 1 para la mitad (en caso de trivalente) y 1 para la subunidad de Nanobody® de terminal C) usando diferentes conjuntos de cebadores que abarcan sitios específicos de restricción. Similarmente, se generaron los constructos multivalentes conectados por la ligadura Ala-Ala-Ala. Todos los constructos se clonaron dentro de un vector de expresión derivado de pUC119 que contiene el promotor LacZ, un gen de resistencia para canamicina, un sitio de clonación múltiple y la secuencia de péptido de señal OmpA. En estructura con la secuencia de codificación Nanobody®, el vector se codifica para una etiqueta c-myc de terminal C y una etiqueta (His)6. En el caso de que una ligadura 35 Gly-Ser se presentara en el constructo multivalente, un vector de expresión se usó derivado de pUC119 que contiene el promotor LacZ, un gen de resistencia para canamicina y la secuencia de péptido de señal OmpA. Directamente corriente abajo del péptido de señal se presentó un sitio de clonación múltiple para inserción de Nanobody®, seguido por una ligadura 35Gly-Ser que codifica la secuencia de ADN y un segundo sitio de clonación múltiple para clonación de una segunda secuencia Nanobody®. En estructura con la secuencia de codificación Nanobody®-35Gly-Ser-Nanobody® resultante, el vector se codifica para una etiqueta c-myc de terminal C y una etiqueta (His)6. La Tabla B-2 enlista los -constructos multivalentes generados con Nanobodies® específicos de RSV. Las secuencias de los constructos multivalentes se muestran en la Tabla A-3.
Los constructos Nanobody® RSV multivalentes se expresaron, purificaron y además caracterizaron. La producción se hizo en células TG1 de E. coli, seguido por purificación de la fracción periplásmica por medio de la etiqueta His por IMAC y desalación, esencialmente como se describe en Ejemplo 7. Para ciertos constructos trivalentes (por ejemplo, RSV401, RSV404, RSV406) se hizo la producción en P. pastoris seguido por purificación de la fracción media. Todos los Nanobodies® trivalentes se sometieron a filtración de gel como una etapa final para remover productos de degradación monovalentes y bivalentes posibles.
El enlace de Nanobodies® multivalentes purificados a la proteina F hRSV se confirmó en ELISA en tanto proteina FTM-como en hRSV (ver Ejemplo 8) . Para la mayoría de Nanobodies® el formateo dentro de constructos bivalentes y trivalentes resultando en un claro pero limitado (hasta 10 veces en incremento) de efecto de avidez, con la excepción de multivalents de 7B2 y NC23 que muestran valores EC50 similares como sus contrapartes monovalentes (como se muestra para 7B2 en la Figura 2).
Ejemplo 11: Potencia de constructos bivalentes y trivalentes para neutralizar hRSV
La potencia de los constructos Nanobody® se evaluó en el ensayo de neutralización RSV en diferentes cepas RSV (ver ejemplos 6 y 9) . El sitio antigénico II de enlace a los Nanobodies® bivalentes muestra incrementos marcados en potencias de 100 hasta 1000 veces (es decir, mucho mayores que el incremento en afinidad) en neutralización de Largo con relación a sus contraparte monovalentes, con valores IC50 en el intervalo desde 50-380 pM, siendo mejor o similar a Numax Fab. En las cepas B-l RSV sin embargo, el incremento en potencia fue mucho menos fuerte, y ningunos de los constructos diméricos fue más potente que Synagis®. Sorprendentemente, esto podría ser superado por la generación de constructos trivalentes, como se muestra en la Figura 3. Los constructos trivalentes con tres Nanobodies® que enlazan al sitio antigénico II fueron al menos 1000 veces neutralizadores más potentes en cepas B-l RSV que sus contrapartes monovalentes.
Ejemplo 12 : Reactividad de Nanobodies® monovalentes con mutantes de escape de la cepa Larga
Diversos mutantes de escape, descritos en López et al.
1998 (J. Virol. 72: 6922-6928), y específicos para el sitio antigénico II (R47F/4, R47F/7, RAK13/4, R7C2/11, R7C2/1) o IV-VI (R7.936/1, R7.936/4, R7.936/6, R7.432/1) o la combinación de ambos (RRA3) , se seleccionaron para probar su reactividad con 10 Nanobodies® monovalentes, incluyendo Nanobody® 191C7 (SEQ ID NO: 8) previamente identificados como no enlazados a sitios antigénicos II o IV-VI.
Este ensayo se realizó de acuerdo con López et al. 1998 (J. Virol. 72: 6922-6928). En breve, cada Nanobody® se probó a 0.2 pg/ml en ELISA usando extractos de antígeno de células HEp-2 infectadas con los diferentes mutantes de escape. Los resultados de absorbancia se normalizaron para reactividad en la cepa de virus de referencia, la cepa (Larga de tipo natural) asi como en el Nanobody® 191C7 de control. Los resultados se muestran en la Tabla B-3.
Una reactividad de >75% se indica como un cuadrado negro relleno, los cuadrados con trama oscura corresponde a una reactividad entre 75 y 50%, los cuadrados con trama ligera corresponde a una reactividad de 25-50% y menor de 25% reactividad se indica por un cuadrado negro. En general los Nanobodies® ya identificados como agentes de enlace de sitio antigénico II previamente (192C4, 191D3, 191F2, NC23, 15H8, 7B2 y NC41) se encontraron para ser sensibles a mutaciones típicas en el sitio antigénico II, mientras que otros Nanobodies® ya identificados como agentes de enlace de sitio antigénico iv-vi se sensibilizó efectivamente para mutaciones en estos sitios.
Ejemplo 13: Reactividad de Nanobodies® multivalentes con mutantes de escape de la cepa Larga
Posteriormente diversos constructos multivalentes se analizaron en un panel limitado de virus de escape para evaluar el enlace. Este ensayo se realizó de acuerdo con López et al. 1998 (J. Virol . 72: 6922-6928). En breve, cada Nanobody® se probó en 0.1 µ?/p?? para Nanobodies® monovalentes y en 0.05 ug/ml para Nanobodies® bi y trivalentes en ELISA usando extractos de antigeno de células HEp-2 infectadas con los diferentes mutantes de escape. Los resultados de absorbancia se normalizaron para reactividad en la cepa de virus de referencia, la cepa (Larga de tipo natural) asi como en el Nanobody® de control (191E4; SEQ ID NO: 10, en este ensayo particular) . Los resultados se muestran en la Tabla B-4.
Una reactividad de >75% se indica como un cuadrado negro relleno, los cuadrados con trama oscura corresponde a una reactividad entre 75 y 50%, los cuadrados con trama ligera corresponden a una reactividad de 25-50% y menor de 25% reactividad se indica por un cuadrado negro. Extraordinariamente, los constructos multivalentes muestran enlace mejorado en comparación con su contraparte monovalente, para el virus R7C2/11 mutante. Además el constructo biparatópico RSV403 no fue sensible a ninguno de los mutantes.
Ejemplo 14: Neutralización de mutantes de escape de la cepa Larga por Nanobodies® multivalentes
En los ejemplos 12 y 13, se ha descrito el enlace de Nanobodies® monovalentes al sitio antigénico II típico y/o mutantes de escape RSV IV-VI . El enlace de Nanobodies® específicamente que reconoce estos sitios antigénicos fue casi perdido o se redujo significativamente. El formateo de estos Nanobodies® dentro de constructos bi o trivalentes parcialmente restaura la actividad de enlace pero no para los tres virus mutantes de escape. El enlace al mutante de escape R7C2/1 (mutación K272E en el sitio antigénico II) permanece debajo del nivel de 25% para cualquier constructo bi o trivalente que consiste únicamente de los Nanobodies® de enlace al sitio antigénico II. Los Nanobodies® 15B3 y 191E4, que son enlazados al sitio antigénico IV-VI, donde sólo los Nanobodies® (como tales o en constructos biparatópicos ) son capaces de enlazar este mutante en un nivel de 75% o más.
El análisis más detallado de los datos indicó que el enlace hacia R7C2/1 ligeramente incrementa cuando la valencia del Nanobody® se incrementó. El enlace de los constructos 7B2 fue 0, 4.4 y 13% respectivamente para los formatos monovalentes, bivalentes (RSV106) y trivalentes (RSV400) . Se espera tal nivel bajo de enlace residual para resultar en pérdida muy alta de potencia para neutralizar RSV.
La potencia neutralizada de Nanobodies® se evaluó en el mismo conjunto seleccionado de mutantes de escape como se describe en el ejemplo 13. Para este propósito los Nanobodies® monovalentes 7B2, 15H8 y NC41 estuvieron en comparación con sus contrapartes trivalentes respectivas, RSV400, RSV 404 y RSV 407. Cabe mencionar, en el ejemplo 13 sólo RSV400 se evaluó para enlazar estos mutantes de escape. Además también la molécula trivalente biparatópica RSV403 (7B2-15B3-7B2) se analizó para su actividad neutrali zada .
El ensayo de micro neutralización hRSV se realizó esencialmente como se describe en el ejemplo 6. En breve, las células Hep2 se sembraron a una concentración de 1.5 x 104 células/pozo dentro de placas de 96 pozos en medio DMEM que contiene suero de becerro fetal al 10% (FCS) complementado con Penicilina y Estreptomicina (100 U/ml y 100 µ?/p??, respectivamente) e incubaron durante 24 horas a 3 °C en una atmósfera de C02 al 5%. Las soluciones madre víricas de diferentes virus se prepararon dentro de las células Hep2 y posteriormente se titularon para determinar la dosis infecciosa óptica para usarse en el ensayo de micro neutralización. Una cantidad estándar de la cepa hRSV específica se pre-incubó con varias diluciones de Nanobodies® purificados en un volumen total de 50 µ? durante 30 minutos a 37°C. El medio de las células Hep2 se reemplazó con la premezcla para permitir la infección durante 2 horas, después de lo cual se agregó 0.1 mi de medio de ensayo. El ensayo se realizó en medio D EM complementado con suero de becerro fetal al 2.5% y Penicilina y Estreptomicina (100U/ml y 100 pg/ml, respectivamente) . Las células se incubaron durante unas 72 horas adicionales a 37°C en una atmósfera C02 al 5%, después de lo cual las células se lavaron dos veces con Tween-20 al 0.05% en PBS y una vez con PBS solo, después de lo cual las células se fijaron con acetona fría al 80% (Sigma-Aldrich, St . Louis, O) en PBS (100 µ?/????) durante 20 minutos a 4°C y se dejaron secar completamente. Después la presencia de la proteina F en la superficie celular se detectó en un ensayo tipo ELISA. A esto, las células Hep2 fijadas se bloquearon con solución de albúmina de suero porcina al 5% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, que se incubaron durante 1 hora con suero de conejo policlonal de proteina anti-F (Corral et al. 2007, BMC Biotechnol. 7:17) o Synagis® (2 pg/ml). Para la detección de anticuerpos conjugados HRP anti-conejo de cabra o IgG antihumano de cabra, se usó HRP especifico de fragmento Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) , después de lo cual el ELISA se desarrolló de acuerdo con procedimientos estándares .
Como se muestra en las Figuras 4A-4C, los Nanobodies® monovalentes casi no tienen potencial neutralizado hacia los virus R7C2/11 y R7C2/1 mutantes de escape del sitio antigénico II. La potencia para neutralizar la variante del sitio antigénico IV-VI R7.936/4 fue comparable con la potencia para neutralizar la cepa Larga de tipo natural. Estos datos están en linea con los datos de enlace del ejemplo 12 y el mapeo de epitopo como se describe para estos Nanobodies® en el ejemplo 5.
Los constructos Nanobody® trivalentes sin embargo, neutralizaron potentemente a los 3 mutantes de escape (Figuras 4D-G) . La inhibición máxima se observó en concentraciones tan bajas como alrededor de 20 nM mientras que este nivel de inhibición no se observó para los Nanobodies® monovalentes en concentraciones hasta 2 µ?. La neutralización potente de R7C2/1, casi equivalente a la neutralización de R7C2/11, es más sorpresiva ya que el ejemplo 13 muestra una pérdida muy importante de actividad de enlace para la molécula trivalente RSV400 que se esperó para resultar en una pérdida muy alta de potencia de neutralización. La IgG Synagis® Palivizumab bivalente, que también reconoció el sitio antigénico II no fue capaz de bloquear la replicación de R7C2/1 o R7C2/11 significativamente en concentraciones de alrededor de 0.2 µ?. A esta concentración un IC50 no se alcanzó mientras que R7.936/4 y virus Larga de tipo natural se neutralizaron con un IC50 de unos pocos n (datos no mostrados) .
Ejemplo 15: Análisis de impacto de la longitud de ligadura en potencia de trivalentes NC41
Para determinar el impacto de la longitud de ligadura de trivalentes de NC41, se generaron diferentes constructos con ligaduras en el intervalo desde ligaduras 3Ala, 9GS, 15GS, hasta 20GS (RSV408, RSV409, RSV407 y RSV410 resp.). Todos los cuatro trivalentes NC41 fueron capaces de neutralizar completamente tanto cepas RSV B-l como Larga (Figura 5) . No se observó efecto de longitud de ligadura en la neutralización de RSV Larga, ya que todos los constructos fueron igualmente potentes. En contraste, los constructos con ligaduras 9GS y 3Ala ha incrementado los valores IC50 en la cepa B-l, indicando que se requiere una longitud de ligadura mínima de 15GS para potencia máxima. Esto puede explicarse por la observación de que los constructos NC41 bivalentes ya son neutralizadores muy potentes en Larga, mientras que en la cepa B-l la diferencia de potencia entre NC41 bivalente y trivalente es mucho más grande (ver Ejemplo 11). En RSV408 y RSV409 la accesabilidad del Nanobody® media puede ser menos óptima .
Ejemplo 16: Humanización de Nanobody® NC41
La secuencia de Nanobody® NC41 se alineó a la línea germinal humana VH3-23 para permitir selección de residuos apropiados para humanización adicional de la secuencia Nanobody®. Además, el análisis in silico se hizo para identificar residuos que son potencialmente propensos a modificaciones post-traduccionales, tales como isomerización Asp, y para identificar mutaciones que pueden mejorar la estabilidad química. Las regiones CDR y los llamados residuos distintivos, que son conocidos para ser esenciales para la estabilidad y potencia de Nanobodies® se excluyeron para modificación .
Para NC41 en 11 posiciones totales se seleccionaron para mutación al residuo humano correspondiente: cuatro mutaciones se introdujeron simultaneas (Val5Leu, Alal4Pro, Glu44Gly, Glnl08Leu) , ya que estos residuos no se esperaron para afectar dramáticamente la función de Nanobody® (basados en datos de otros Nanobodies®) . En esta variante básica, siete residuos de los cuales se desconoció si la mutación a la contraparte humana se permitió (Serl9Arg, Ile201eu, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln) se mutaron usando un enfoque de colección, permitiendo ya sea el aminoácido humano de tipo natural o correspondiente en cada posición. La colección resultante, con una diversidad teórica de 128, se generó por ensamble del gen usando oligosecuencias de nucleótidos traslapadas que contiene uso de codón degenerado, y posteriormente se clonó dentro de un vector de expresión derivado de pUC119 que contiene el promotor LacZ, un gen de resistencia para canamicina, un sitio de clonación múltiple y la secuencia líder OmpA. En estructura con la secuencia de codificación Nanobody®, el vector se codifica para una etiqueta c-myc de terminal C y una etiqueta (His)6. Los Nanobodies® se produjeron en el periplasma de E. coli (ver Ejemplo 7). La diversidad de la colección se confirmó por análisis de secuencia.
Los extractos periplásmicos de 368 variantes NC41 individuales y NC41 de tipo natural se generaron y sometieron a una cascada de cribado funcional para identificar la variante NC41 mejor humanizada, en términos de tanto potencia como estabilidad. En una primera etapa, el enlace RSV de variantes NC41 humanizadas a RSV Larga se determinó en ELISA (Hytest, Turku Finlandia; #8RSV79) (ver Ejemplo 8) .
Por lo tanto, los agentes de enlace positivos se analizaron para enlazar a las células Hep2 infectadas con cepa B-l RSV. En esto, las células Hep2 se sembraron dentro de placas de 96 pozos e infectaron con cepa B-l RSV, esencialmente siguiendo el procedimiento descrito para el ensayo de neutralización (ver Ejemplo 6) . Tres días después las células se fijaron con acetona enfriada con hielo y las placas se usaron en un ensayo ELISA usando extractos periplásmicos en diferentes diluciones. El enlace de Nanobody® a células infectadas Hep2-Bl se detectó usando anticuerpo policlonal de conejo anti-VHH, seguido por anticuerpos conjugados anti-conej o-HRP de cabra, después de lo cual el ELISA se desarrolló de acuerdo con procedimientos estándares .
Adicionalmente, con objeto de verificar si las mutaciones introducidas afectan la estabilidad de temperatura, los extractos periplasmáticos de todos los agentes de enlace se calentaron hasta 74 °C durante 2 horas, que es 5°C arriba de la temperatura de fusión de NC41 de tipo natural. El enlace a RSV larga antes y después del calentamiento se analizó en ELISA, y la relación de señal de enlace después contra antes del calentamiento se tomó como medida para estabilidad de temperatura.
Finalmente, las constantes de disociación cinética de las variantes se determinaron en ensayo Biacore en la proteina FTM-NN, como se describe en Ejemplo 8.
Todos los agentes de enlace se procesaron por secuencia y están en el rango de acuerdo con su capacidad para enlazar la proteina F de RSV. Cuando se analizan las secuencias de los agentes de enlace más fuertes, una preferencia clara para Glnl05 (residuo humano) se observó en todos los casos. Mientras que la mutación Ile20Leu aparece subrepresentada , para todas las otras posiciones no hubo preferencia clara para ya sea la secuencia humana o de tipo natural, con variantes que contienen hasta 10 mutaciones en comparación con NC41 de tipo natural. Notablemente, se observó en una variante una mutación de punto adicional (Gly54Asp) dentro de la región CDR2. Esta variante, la variante NC41 6, muestra la constante de disociación más baja de todas las variantes y NC41 de tipo natural, resultando en un incremento de afinidad .
Con base en la secuencia y datos funcionales, 18 variantes (Tabla A-4) se seleccionaron para caracterización adiciona como proteínas purificadas (Figuras 6 y 7). Todas las variantes se produjeron y purificaron, y las potencias neutralización de RSV Larga y B-1 se determinaron en el ensayo de micro neutralizaciones. Aunque la mayoría de las variantes muestran actividad muy similar a NC41 de tipo natural, diversas variantes muestran potencia incrementada en tanto Larga (2 veces) como B-1 (6 veces), con los neutralizadores más fuertes siendo variantes NC41 6, 8, 9 17, y 18. Notablemente, la variante 18 se humanizó de forma máxima en todas las 11 posiciones, con la introducción adicional de Asp54 en la región CDR2. Las variantes 10 y 11 fueron más potentes al neutralizar la cepa B-1 que NC41, pero no en la cepa Larga.
Para un panel selecto de variantes NC41 los parámetros de enlace cinético se determinaron en Biacore en la proteina FTM-NN (Tabla B-5) como se describe en Ejemplo 8. No se observaron diferencias importantes en los datos calculados para NC41 y las variantes NC41 humanizadas 6, 8 y 17. Se debe señalar que las constantes de asociación de todas las variantes NC41 estuvieron en el limite de detección del instrumento, pero las constantes de disociación pueden estar en el rango como v06 < vl7<NC41<v08. El impacto de la mutación Gly a Asp en CDR2 (posición 54) puede demostrarse claramente cuando se comparan vl7 y vl8 ya que esta es la única diferencia en estas variantes humanizadas de forma máxima. La neutralización se probó para tanto la cepa Larga como la cepa B-1 en dos ensayos independientes en comparación con la NC41 de tipo natural como se muestra en la Tabla B-5. En ambos ensayos NC41vl8 fue más potente que NC41 en tanto virus como en ambos ensayos NC41vl8 fue más potente que NC41vl7 en la cepa Larga. La neutralización mejorada de NC41vl8 también se observó para la cepa B-1 en el segundo ensayo .
Todas las variantes NC41 se sometieron a desplegado inducido por calor para evaluar el efecto de las mutaciones introducidas en la estabilidad de la proteina. A esto la temperatura de fusión (Tm) se determinó por incremento en etapa en la temperatura en presencia de Sypro Orange, un pigmento que enlaza a los residuos Trp que se están expuestos en el desplegado de la proteina. Todas las variantes muestran que tienen Tm incrementada con relación a NC41 de tipo natural (69°C), hasta 9°C para la variante 18.
Ejemplo 17 : Optimización de secuencia adicional de NC41 para expresión
La secuencia de Nanobody® NC41 se analizó además con el objetivo de optimizar la expresión en Pichia pastoris . Las variantes NC41 19-26 se diseñaron al combinar posiciones humanizadas que se mostraron para permitirse sin pérdida en potencia en el ensayo de micro-neutralización (Ejemplo 16) . Cuatro mutaciones se introdujeron simultáneas (Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu) , mientras que tres mutaciones fueron tanto individuales como en cada combinación posible examinada (Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln) (ver Tabla A-4) . Todos los constructos se clonaron dentro de un vector de expresión e introdujeron dentro de la cepa Pichia pastoris XL-33, después de lo cual el número de incorporaciones en el genoma Pichia se evaluó por PCR en tiempo real cuantitativa. De cada constructo un clon con 1-2 copias y uno con cuatro o más copias se seleccionaron para producciones a escala pequeña, y el rendimiento de expresión de las variantes NC41 con relación al tipo natural se estimó por electroforesis en gel en geles SDS-PAGE. Las variantes NC41 20, 22, 24, 25 y 26 muestran la expresión más alta, con niveles de expresión similares como NC41 de tipo natural ya en número de copia baja .
Las variantes NC41 22 y 26 se volvieron a clonar en un vector de expresión para E. coli para producción y purificación de Nanobodies etiquetados Myc-His (ver ejemplo 7). La potencia de ambas variantes para neutralización de RSV Larga se probó en el ensayo de micro neutralización, como se describe en ejemplo 6. Ambas variantes fueron igualmente potentes como NC41 de tipo natural (IC50 de 126 y 310 nM para v22 y v26, respectivamente) .
Ejemplo 18: Optimización de secuencias de RSV407 para estabilidad química
Durante la producción de los Nanobodies y polipéptidos de la invención, se observó piro glutamato (pGlu) en la terminal amino (por medio de RP-HPLC) . Los niveles de más de pGlu al 15% se detectaron después de la fermentación y el nivel de pGlu se incrementó regularmente con el almacenamiento durante estudios de estabilidad. Por lo tanto, el Glutamato de terminal N (E) se cargó dentro de un Aspartato (D) . Esto debe eliminar la posibilidad de modificación post-traduccional pGlu de la terminal N y por lo tanto lleva a estabilidad de producto incrementada.
La secuencia de aminoácidos de la variante Nanobody® optimizada de secuencia se da en la Tabla A-5 ( SV434; SEQ ID NO: 142) respectivamente. Para la producción de este Nanobody® un sistema de expresión Pichia se desarrolló con base en el sistema comercialmente disponibles de Invitrogen usando X-33 como una cepa hospedera. El sistema hace uso del promotor AOXl para conducir la producción del Nanobody® y usa el péptido de secreción de unión alfa para secreción del Nanobody® dentro del medio.
La secuencia optimizada RSV434 se analizó para los niveles de expresión, por medio de RP-HPLC, SE-HPLC y en comparación con la molécula precursora (RSV407) con respecto a neutralización RSV.
No hubo diferencia importante en el nivel de expresión en comparación con RSV407 y tanto los clones de número de copia alto como bajo se produjeron más de lg/L de medio clarificado (libre de célula) .
Muestras de un mi se capturaron en una columna MEP
Hypercel de lml, eluyó y analizó por medio de SE-HPLC y RP-HPLC. El análisis SE-HPLC muestra material monomérico, mientras que el análisis RP-HPLC, como se espera, claramente muestra la ausencia del pico posterior pGlu.
El RSV434 se purificó de forma adicional del medio, capturado en EP HyperCell y pulido por medio de cromatografía de intercambio de aniones.
Un ensayo de micro neutralización hRSV se realizó esencialmente como se describe en el ejemplo 6. La Figura 9 muestra la neutralización en tanto cepas RSV Larga como B-l por tanto RSV407 como su RSV434 de variante optimizada de secuencia .
Ejemplo 19: Preparación de constructos multivalentes de Nanobody® NC41 optimizados de secuencia y/o humanizados
Las variantes humanizadas NC41 del Ejemplo 16 se formatearon como constructos trivalentes usando ligaduras 15GS (las secuencias se muestran en la Tabla A-5) . Los trivalentes se produjeron y purificaron como se describe en el Ejemplo 10. La Figura 8A muestra la neutralización en tanto cepas RSV Larga como B-l de dos de las variantes NC41 humanizadas trivalentes con sus Nanobodies® monovalentes correspondientes. La Figura 8B muestra la neutralización en tanto cepas RSV Larga como B-l de las variantes NC41 trivalentes. Los valores IC50 para neutralización de cepas RSV Larga y B-l por las variantes NC41 trivalentes se muestran en la Tabla B-7. Similar como el trivalente NC41 precursor (RSV407), los trivalentes de las variantes NC41 humanizadas fueron alrededor de 60 veces más neutralizadores potentes de Larga que Synagis®. En los trivalentes de cepa B-1 fueron neutralizadores más potentes que Synagis, pero aquí también ligeramente se potencian en comparación con el trivalente de NC41 RSV407 precursor en el siguiente orden RSV427>RSV426>RSV414. La potencia incrementada de variantes monovalentes para B-l asi aparece para resultar en trivalentes ligeramente mejorados.
Con base en la optimización de secuencia adicional mostrada en los Ejemplos 17 y 18, diversos constructos trivalentes adicionales (Tabla B-6) se generaron. Todos los constructos se clonaron en un vector de expresión Pichia pastoris, transformaron dentro de Pichia y sometieron a fermentación para probar los niveles de expresión, estabilidad y potencia. Tanto en expresiones de matraz de agitación a escala pequeña como fermentación RSV440 (variante 26) y RSV441 (variante 22) muestran niveles de expresión altos .
Ejemplo 20: Eficacia in vitro de los constructos multi alentes
La capacidad neutralizante de Nanobody RSV434 y Synagis se evaluó en un ensayo de reducción de placas contra aislados clínicos 31 RSV/A y 30 RSV/B. Tanto los compuestos anti-RSV así como Synagis se probaron en una concentración sencilla de 40 yg/ml.
Synagis y RSV434 ambos se realizan eficientemente con respectivamente 87% y 97% de las cepas que se reducen en titulaciones de virus por al menos 100 veces en comparación con control de PBS (Tabla B-8) . Además, RSV434 muestra mayor capacidad neutralizante en comparación con Synagis. La mayoría de las cepas RSV (84%) se inhibieron completamente por RSV434 mientras que significativamente menos cepas (20%) se inhibieron completamente por Synagis (Tabla B-8) .
Ejemplo 21: Eficacia in vitro de los constructos muí ivalen es
El modelo de rata del algodón es el modelo estándar de oro para RSV. En este modelo, las ratas del algodón se infectan con la cepa RSV/Tracy (día 0) y 4 días después de la infección, las titulaciones víricas y ARN vírico se evalúan en lavados de pulmón y lavados nasales. En una situación profiláctica, una disminución importante y dependiente de dosis en carga vírica se observó en la administración intranasal de RSV407, 24 horas antes de la infección RSV (Figura 10) .
Además, un enfoque terapéutico se exploró en el cual las ratas del algodón infectadas se trataron con los Nanobodies después de 24h o 48h de infección por ello imitan la situación de humanos infectados con RSV. En ambos casos se observó inhibición importante de replicación vírica (Tabla B-9 y Figura 11) .
En todos los estudios realizados a la fecha, el Nanobody se suministró intranasalmente como un imitador para suministro pulmonar. Usando esta ruta de administración 9-41% de Nanobody estuvo disponible en los pulmones como se evalúa por ELISA en lavado bronquial tomado poco después de administración .
En un intento por superar la interferencia posible de Nanobody residual en los lavados de pulmón, la detección vírica se retrasó al día 7 después de la inoculación. Un estudio farmacocinético separado realizado en ratas Sprague Dawley permite estimar la vida media del Nanobody en el pulmón para ser de alrededor de 10.8. En el día 7 que es 5-6 días después de la última administración, el Nanobody está suficientemente despejado del pulmón para no interferir más tiempo en el ensayo. La carga vírica de animales de control positivo cae desde 10E5 hasta 10E2 pfu/ml. No obstante todavía fue posible mostrar una reducción de alrededor de 0.6 log por tratamiento con RSV407 (Tabla B-9) .
Como un enfoque alternativo se desarrolló un PCR cuantitativo para detectar ARN vírico. Tanto en experimentos profilácticos como terapéuticos se observó una reducción importante en ARN RSV (Tabla B-9) .
Ejemplo 22: Generación de mutantes de escape RSV
Con objeto de identificar los residuos de contacto críticos con la proteína F, la generación de mutantes de escape RSV Larga se analizó después de cultivar RSV Larga en presencia de Nanobodies en alrededor de sus concentraciones IC90 respectivas. Tanto NC41 monovalente (en 5 pg/ml) y su RSV407 trivalente (en 2.5 ng/ml) se usaron, así como el RSV413 trivalente específico (NC41-15B3-NC41 ) para verificar si un constructo que reconoce dos diferentes epítopos deben afectar el mismo cuadro de tiempo del comienzo de escape vírico. Después de 12 pasajes de incubación sucesiva de Larga en células Hep2 en presencia de Nanobodies, se observó crecimiento vírico para las condiciones con NC41 monovalente pero sorprendentemente no con los Nanobodies trivalentes. Las soluciones madre sencillas de virus se purificaron de placas para rondas repetitivas, después de las cuales la secuencia de la proteína F de la variante de escape potencial puede determinarse. Dos variantes de escape distintas se identificaron para NC41, NC41/13 con la mutación de N262Y, y NC41/17 que contienen mutación N276Y.
TABLAS
Tabla A-l : Secuencias de Nanobodies® monovalentes que enlazan la proteina RSV F
Nanobody® SEQ ID NO: Secuencia
1E4 1 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTFSSYGMGWFRQAPG EREF 207D1 VAAVSRLSGPRTVYADSV GRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAV
YTCAAELTNRNPGAYYYTWAYDYWGQGTQVTVSS
7B2 2 EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREF
VAAIS SDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVY YCAADLTSTNPGSYIYIWAYDY GQGTQVTVSS
NC23 3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSIAMGWFRQAPG EREF
VAAISWSRGRTFYADSVKGRFIISRDDAANTAYLQMNSLKPEDTAVY YCAVDTASWNSGSFIYD AYDHWGQGTQVTVSS
15H8 4 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPG EREF 19C4 VAAISFRGDSAIGAPSVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLVPDDTAVY
YCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS
NC 1 5 EVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG EREF
VAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVY YCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS
NC39 6 EVQLVESGGGWVQAGGSLRLSCAASGRAFSSYAMGWIRQAPGKEREF
VAGIDQSGESTAYGASASGRFIISRDNAKNTVHLLMNSLQSDDTAVY YCVADGVLATTLN DY GQGTQVTVSS
15B3 7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPG EREG
VSCISSSDHSTTYTDSVKGRFTISWDNAKNTLYLQMNSL PGDTAVY YCAADPALGCYSGSYYPRYDYWGQGTQVTVSS
191C7 8 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSGVINAMA HRQAPGKEREL
VAHISSGGSTYYGDFVKGRFTISRDNAKDTVYLQMNSLKPEDTAVYY CHVPWMDYNRRDYWGQGTQVTVSS
191D3 9 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYG GWFRQAPGKEREF 1G3 VAAVSRLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAV
YTCAAELTNRNSGAYYYA AYDY GQGTQVTVSS
191E4 10 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGPTFSADTMGWFRQAPGKEREF 1B2 VATIP SGGIAYYSDSVKGRFT SRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTALY
YCAGSSRIYIYSDSLSERSYDYWGQGTQVTVSS
192C4 11 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTFSSYAMVGWFRQAPGKERE
FVAAVTRWSGARTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTA VYTCAADSTNRNSGAVYYS AYDYWGQGTQVTVSS
192F2 12 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTFSPIAMGWFRQAPGKEREF
VAVVTRWSGARTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAV
YTCAADSTNRNSGAIYYT AYDYWGQGTQVTVSS
Tabla A-2 : Secuencias de proteina F
Proteina F SEQ ID NO: Secuencia
RSV LONG 17 MELPILKANAITTILAAVTFCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKG
M-2 YLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKY
KNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKKTNVTL SKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGTAVSKVLHLEGEVNKIKSALL STNKAVVSLSNGVSVLTS VLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCRIS NIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELL
SLI DMPITNDQKKL SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVV QLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCD NAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDT NSLTLPSEVNLCNVDIF NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRG IIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYV GEP IINFYDPLVFPSDEFDASISQVNE INQSLAFIRKSDELLHHV NAGKSTT IMITTI I IVI IVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTL S DQLSGINNIAFSN
RSV A-2 18 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQ ITEE YQSTCSAVS G
YLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLI QELDKY KNAVTELQLLMQSTQATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTL SKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALL
STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIS NIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELL SLI DMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVV QLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCD NAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIF NPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRG IIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEP IINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV NAGKSTTNIMITTII IVI IVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTL SKDQLSGINNIAFSN
RSV B-l 19 MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGY
FSALRTG YTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKN
AVTELQLL QNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKK RKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNK AVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETV IEFQQMNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDM PITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSI IKEEVLAYVVQLPIYGV IDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFF PQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIM TSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCD YVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFP SDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMIT TI I IVIIVVLLLLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAF
SK
Tabla A-3 : Secuencias de aminoácidos de constructos monovalentes que enlazan hRSV
Constructo SEQ ID NO: Secuencia
RSV101 20 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKEREFVAAVS
RLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAAELTNR NSGAYYYA AYDY GQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQ AGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKEREFVAAVSRLSGPRTVYADSV KGRFTISRDNAENTVYLQMNSL PEDTAVYTCAAELTNRNSGAYYYAWAYDY WGQGTQVTVSS
RSV102 21 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKEREFVAAVS
RLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAAELTNR NSGAYYYAWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQ LVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKEREFVAAVSRLS GPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAAELTNRNSG AYYYAWAYDYWGQGTQVTVSS
RSV103 22 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMG FRQAPGKEREFVAAVS
RLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAAELTNR NSGAYYYAWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKER EFVAAVSRLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTC AAELTNR SGAYYYAWAYDYWGQGTQVT SS
RSV104 23 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKEREFVAAVS
RLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAAELTNR NSGAYYYAWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLR LSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKEREFVAAVSRLSGPRTVYADSVKGRFTI SRDNAENTVYLQM SLKPEDTAVYTCAAELTNRNSGAYYYAWA DYWGQGTQ VTVSS
RSV105 24 EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPG EREFVAAIS
WSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAK TVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADLTSTN PGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGDSLRL SCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSDGSTYYADSV GRFTISR DNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADLTSTNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVT VSS
RSV106 25 EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPG EREFVAAIS
WSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADLTSTN PGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQA GDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSDGSTYYADSVKG RFTI SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADLTSTNPGSYIYIWAYDYWG QGTQV VSS
RSV107 26 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAIS
FRGDSAIGAPSVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLVPDDTAVYYCGAGTPLNP GAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLS CAASGRSFSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAISFRGDSAIGAPSVEGRFTISRD NAK TGYLQMNSLVPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVS S
RSV108 27 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAIS
FRGDSAIGAPSVEGRFTISRDNAK TGYLQMNSLVPDDTAVYYCGAGTPLNP GAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAG GSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAISFRGDSAIGAPSVEGR FTISRDNAKNTGYLQMNSLVPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRG TQVTVSS
RSV109 28 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSIAMGWFRQAPG EREFVAAIS
WSRGRTFYADSVKGRFIISRDDAANTAYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDTASWN SGSFIYDWAYDHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGRTFSSIAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSRGRTFYADSVKGRFIISR DDAANTAYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDTASWNSGSFIYDWAYDHWGQGTQVT VSS
Tabla A-3 : Continuación
Constructo SEQ ID NO: Secuencia
RSV110 29 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSIAMGWFRQAPGKEREFVAA
ISWSRGRTFYADSVKGRFI ISRDDAANTAYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDT ASWNSGSFIYDWAYDHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESG GGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSIAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSRGRT FYADSVKGRFIISRDDAANTAYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDTASWNSGSF IYDWAYDHWGQGTQVTVSS
RSV113 30 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPG EREGVSC
ISSSDHSTTYTDSVKGRFTIS DNAKNTLYLQMNSL PGDTAVYYCAADP ALGCYSGSYYPRYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALG FRQAPGKEREGVSCISSSDHSTT YTDSVKGRFTISWDNAKNTLYLQMNSLKPGDTAVYYCAADPALGCYSGSY YPRYDYWGQGTQVTVSS
RSV114 31 EVQLVESGGGWVQAGGSLRLSCAASGRAFSSYAMGWIRQAPG EREFVAG
IDQSGESTAYGASASGRFIISRDNAKNTVHLLMNSLQSDDTAVYYCVADG VLATTLNWDY GQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GWVQAGGSLRLSCAASGRAFSSYAMGWIRQAPGKEREFVAGIDQSGESTA YGASASGRFI ISRDNAKNTVHLLMNSLQSDDTAVYYCVADGVLATTLNWD YWGQGTQVTVSS
RSV115 32 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGPTFSADTMGWFRQAPGKEREFVAT
IPWSGGIAYYSDSVKGRFTMSRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTALYYCAGSS RIYIYSDSLSERSYDY GQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGGGGSEVQLV ESGGGLVQAGGSLRLSCAASGPTFSADTMGWFRQAPGKEREFVATIPWSG GIAYYSDSVKGRFTMSRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTALYYCAGSSRIYIY SDSLSERSYDY GQGTQVTVSS
RSV116 33 EVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG EREFVAA
INWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGT PLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAIN RGDITI GPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIY D SYDY GRGTQVTVSS
RSV201 34 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKEREFVAA
VSRLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAAE LTNRNSGAYYYAWAYDY GQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQ AGGSLRLSCAASGPTFSADTMGWFRQAPG EREFVATIP SGGIAYYSDS VKGRFTMSRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTALYYCAGSSRIYIYSDSLSERS YDYWGQGTQVTVSS
RSV202 35 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPG EREFVAA
VSRLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAAE LTNRNSGAYYYAWAYDY GQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVES GGGLVQAGGSLRLSCAASGPTFSADTMGWFRQAPGKEREFVATIPWSGGI AYYSDSVKGRFTMSRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTALYYCAGSSRIYIYSD SLSERSYDYWGQGTQVTVSS
RSV203 36 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKEREFVAA
VSRLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAAE LTNRNSGAYYYA AYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGPTFSADTMGWFRQAPGKEREF VATIPWSGGIAYYSDSVKGRFTMSRDNAKNTVDLQMNSL PEDTALYYCA GSSRIYIYSDSLSERSYDYWGQGTQVTVSS
RSV204 37 EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAA
ISWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADL TSTNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESG GGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAISFRGDSA IGAPSVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLVPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYI YDWSYDYWGRGTQVTVSS
Tabla A-3 : Continuación
Construoto SEQ ID NO: Secuencia
RSV205 38 EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYA GWFRQAPGKEREF
VAAISWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVY YCAADLTSTNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGG SEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPG ERE GVSCISSSDHSTTYTDSVKGRFTISWDNAKNTLYLQMNSLKPGDTAV YYCAADPALGCYSGSYYPRYDYWGQGTQVTVSS
RSV206 39 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPGKEREF
VAAISFRGDSAIGAPSVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLVPDDTAVY YCGAG PL PGAYIYD SYDY GRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYA GWFRQAPGKEREF VAAISWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVY YCAADLTSTNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSS
RSV207 40 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPGKEREF
VAAISFRGDSAIGAPSVEGRF ISRDNAKNTGYLQMNSLVPDDTAVY YCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREF VAAIS SDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL PEDTAVY YCAADLTSTNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSS
RSV301 41 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGPTFSADTMGWFRQAPGKEREF
VATIPWSGGIAYYSDSVKGRFTMSRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTALY YCAGSSRIYIYSDSLSERSYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLV ESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKEREFVAAVS RLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAA ELTNRNSGAYYYAWAYDYWGQGTQVTVSS
RSV302 42 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGPTFSADTMGWFRQAPGKEREF
VATIPWSGGIAYYSDSVKGRFTMSRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTALY YCAGSSRIYIYSDSLSERSYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGG SEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPGKERE FVAAVSRLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTA VYTCAAELTNRNSGAYYYAWAYDYWGQGTQVTVSS
RSV303 43 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGPTFSADTMGWFRQAPGKEREF
VATIPWSGGIAYYSDSVKGRFTMSRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTALY YCAGSSRIYIYSDSLSERSYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGW FRQAPGKEREFVAAVSRLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQ MNSLKPEDTAVYTCAAELTNRNSGAYYYAWAYDYWGQGTQVTVSS
RSV305 44 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPGKEREG
VSCISSSDHSTTYTDSVKGRFTISWDNAKNTLYLQMNSLKPGDTAVY YCAADPALGCYSGSYYPRYDY GQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREF VAAISWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVY YCAADLTSTNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSS
RSV306 45 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPGKEREG
VSCISSSDHSTTYTDSVKGRFTISWDNAKNTLYLQMNSLKPGDTAVY YCAADPALGCYSGSYYPRYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPGKEREF VAAISFRGDSAIGAPSVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLVPDDTAVY YCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS
Tabla A-3 : Continuación
Constructo SEQ ID NO: Secuencia
RSV400 46 EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFV
AAISWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNA NTVYLQMNSL PEDTAVYYC AADLTSTNPGSYIYIWAYDY GQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEV QLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAA ISWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA DLTSTNPGSYIYI AYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQL
VESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAIS WSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADL TSTNPGSYIYI AYDY GQGTQVTVSS
RSV401 47 EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYA GWFRQAPGKEREFV
AAISWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC AADLTSTNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEV QLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAA ISWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA DLTSTNPGSYIYI AYDY GQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQL VESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPG EREGVSCIS SSDHSTTYTDSVKGRFTISWDNAKNTLYLQMNSLKPGDTAVYYCAADP ALGCYSGSYYPRYDYWGQGTQVTVSS
RSV402 48 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPGKEREGV
SCISSSDHSTTYTDSVKGRFTIS DNAKNTLYLQMNSL PGDTAVYYC AADPALGCYSGSYYPRYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQ LVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMG FRQAPGKEREFVAAI SWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQ NSLKPEDTAVYYCAAD LTSTNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLV ESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISW SDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL PEDTAVYYCAADLT STNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSS
RSV403 49 EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMG FRQAPGKEREFV
AAISWSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC AADLTSTNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEV
QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPGKEREGVSC ISSSDHSTTYTDSVKGRFTISWDNAKNTLYLQMNSLKPGDTAVYYCAA DPALGCYSGSY.YPRYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLV ESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAIS SDGSTYYADSV GRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADLT STNPGSYIYIWAYDYWGQGTQVTVSS
RSV404 50 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPG EREFV
AAISFRGDSAIGAPSVEGRFTISRDNA NTGYLQMNSLVPDDTAVYYC GAG PLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQ LVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAI SFRGDSAIGAPSVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLVPDDTAVYYCGAG TPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVE
SGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAISFR GDSAIGAPSVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLVPDDTAVYYCGAGTPL NPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS
RSV405 51 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYG GWFRQAPGKEREFV
AAVSRLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYT CAAELTNRNSGAYYYAWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSE VQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPG EREFVA AVSRLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTC AAELTNRNSGAYYYAWAYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEV QLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTYSRYGMGWFRQAPG EREFVAA VSRLSGPRTVYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYTCA AELTNRNSGAYYYAWAYDYWGQGTQVTVSS
Tabla A-3: Continuación
Constructo SEQ ID NO: Secuencia
RSV406 52 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSIAMGWFRQAPGKEREFV
AAISWSRGRTFYADSVKGRFIISRDDAAN AYLQMNSLKPEDTAVYYC AVDTASWNSGSFIYDWAYDH GQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEV QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSIAMGWFRQAPGKEREFVAA ISWSRGRTFYADSVKGRFI ISRDDAANTAYLQMNSLKPEDTAVYYCAV DTASWNSGSFIYDWAYDHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQL VESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSIAMGWFRQAPGKEREFVAAIS WSRGRTFYADSVKGRFI ISRDDAANTAYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDT ASWNSGSFIYDWAYDHWGQGTQVTVSS
RSV407 53 EVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFV
AAIN RGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQ LVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAI NWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAG TPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVE SGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWR GDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPL NPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS
RSV408 54 EVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFV
AAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQAG GSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPN VEGRFTISRDNAKNTGYLQ NSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDW SYDYWGRGTQVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLS NYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNT GYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS
RSV409 55 EVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFV
AAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGG GLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDI TIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQ NSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPG AYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSL SISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEG RFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYD YWGRGTQVTVSS
RSV 10 56 EVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFV
AAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKERE FVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVY YCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKE REFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTA VYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS
Tabla A-3 : Continuación
Constructo SEQ ID NO: Secuencia
RSV 11 57 EVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAA
INWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGT PLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLG FRQAPGKEREFVAAINWRGDITI GPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIY D SYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL RLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPGKEREGVSCISSSDHSTTYTDSVKGRF TISWDNAKNTLYLQMNSLKPGDTAVYYCAADPALGCYSGSYYPRYDYWGQ GTQVTVSS
RSV412 58 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPGKEREGVSC
ISSSDHSTTYTDSVKGRFTISWDNAKNTLYLQMNSLKPGDTAVYYCAADP ALGCYSGSYYPRYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITI GPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPL PGAYIY DWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSL SISCAASGGSLSNYVLG FRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRF TISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGR GTQVTVSS
RSV413 59 EVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAA
I WRGDITIGPPNVEGRF ISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGT PLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGLTLDYYALGWFRQAPGKEREGVSCISSSDHSTT YTDSVKGRFTISWDNAKNTLYLQMNSLKPGDTAVYYCAADPALGCYSGSY YPRYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSL SISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRF TISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGR GTQVTVSS
Tabla A-4: Secuencias de variantes NC41 optimizados
secuencia y/o humanizados
Nanobody® SEQ ID Secuencia
NC41v01 60 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLAPEDTAVYYCGA GTPL PGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v02 61 EVQLLESGGGLVQPGGSLRISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLAPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v03 62 EVQLLESGGGLVQPGGSLRISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v04 63 EVQLLESGGGLVQPGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQ NSLRPDDTAVYYCGA GTPL PGAYIYDWSYDYWGQG LVTVSS
NC41v05 64 EVQLLESGGGLVQPGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLAPEDTAVYYCGA GTPL PGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v06 65 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRDDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGA G PLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v07 66 EVQLLESGGGLVQPGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLAPDDTAVYYCGA G PLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v08 67 EVQLLESGGGLVQPGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGRE VA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v09 68 EVQLLESGGGLVQPGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPDDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41vlO 69 EVQLLESGGGLVQPGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGRE VA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGA G PLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41vll 70 EVQLLESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41V12 71 EVQLLESGGGLVQPGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41vl3 72 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41vl4 73 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLAPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41vl5 74 EVQLLESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLAPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41vl7 75 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41vl8 76 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRDDITIGPPNVEGRF ISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41vl9 146 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
Tabla A- : Continuación
Nanobody® SEQ ID Secuencia
NC41v20 147 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPDDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v21 148 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v22. 149 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AI WRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v23 150 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AI WRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTLVTVSS
NC41v24 151 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG EREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPDDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTLVTVSS
NC41v25 152 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQ NSLAPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTLVTVSS
NC41v26 153 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTLVTVSS
NC41 E1D 138 DVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS
NC41v03 E1D 139 DVQLLESGGGLVQPGGSLRISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVAA
INWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGT PLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v06 E1D 140 DVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAAI
NWRDDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTP LNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41vl8 E1D 141 DVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAA
INWRDDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGT PLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41vl7 E1D 154 DVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v21 E1D 155 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v22 E1D 156 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
NC41v26 E1D 157 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVA
AINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQ NSLRPEDTAVYYCGA GTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTLVTVSS
Tabla A-5 : Secuencia de aminoácidos de constructos optimizados de secuencia y/o humanizados muí ivalentes que enlazan hRSV
Nanobody® SEQ ID NO: Secuencia
RSV414 77 EVQLLESGGGLVQPGGSLRISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVAAI
NWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNS NTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL NPGAYIYD SYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLV QPGGSLRISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVAAINWRGDITIGPPN VEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYD YWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRISCAA SGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
RSV426 78 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVAAI
N RDDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL NPGAYIYD SYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVAAIN RDDITIGPPN VEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYD YWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAAIN RDDITIGPPNVEGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
RSV427 79 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLG FRQAPGKGREFVAAI
NWRDDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL NPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAAINWRDDITIGPPN VEGRFTISRDNS NTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL PGAYIYDWSYD YWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGGSLSNYVLG FRQAPGKGREFVAAINWRDDITIGPPNVEGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
RSV442 158 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAAI
NWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNS NTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL NPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLG FRQAPGKGREFVAAINWRGDITIGPPN VEGRFTISRDNS NTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL PGAYIYDWSYD YWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL PGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
RSV436 159 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG EREFVAAI
NWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPDDTAVYYCGAGTPL NPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPN VEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPDDTAVYYCGAGTPL PGAYIYDWSYD YWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGG5L3NYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNA NTGYLQMNSLRPDDTAVYYCGAGTPL PGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
RSV438 160 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAI
NWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL NPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPN VEGRFTISRDNA NTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL PGAYIYDWSYD YWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNA KNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL PGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS Tabla A-5 : Continuación
Nanobody® SEQ ID NO: Secuencia
RSV439 161 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWR
GDITIGPPNVEGRFTISRDNA NTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYI YD SYDY GRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNA KNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGAG PLNPGAYIYDWSYDYWGRGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG KEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTLVTVSS
RSV434 142 DVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWR
GDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAG PLNPGAYI YDWSYDYWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSIS CAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNA NTGYLQMNSLAPDDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDY GRGTQVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG KEREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLAPDDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTQVTVSS
RSV443 143 DVQLLESGGGLVQPGGSLRISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVAAINWR
GDITIGPPNVEGRFTISRD SKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYI YD SYDY GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRIS CAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNS NTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDY GQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRISCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNS NTLYLQMNSLRPEDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
RSV444 144 DVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVAAINWR
DDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL PGAYI YDWSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLS CAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAAINWRDDITIGPPNVEGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG KGREFVAAINWRDDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTLYLQ NSLRPEDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
RSV445 145 DVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVAAINWR
DDITIGPPNVEGRF ISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAV CGAGT LNPGAYI YDWSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLS CAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAAINWRDDI IGPPNVEGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG KGREFVAAINWRDDITIGPPNVEGRFTISRDNS NTLYLQMNSLRPEDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
RSV435 162 DVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG GREFVAAINWR
GDI IGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPLNPGAYI YDWSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLS CAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKGREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL PGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG KGREFVAAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSS
Tabla A-5 : Continuación
Nanobody® SEQ ID NO: Secuencia
RSV437 163 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG EREFV
AAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPDDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQ LVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAI NWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNA NTGYLQ NSLRPDDTAVYYCGAG TPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVE
5 SGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAIN R
GDITIGPPNVEGRFTISRDNA NTGYLQMNSLRPDDTAVYYCGAGTPL
RSV441 164 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFV
AAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYC GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQ LVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLG FRQAPGKEREFVAAI NWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNA NTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGAG TPLNPGAYIYDWSYDY GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFVAAINWR GDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL
RSV440 165 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPGKEREFV
10 AAINWRGDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYC
GAGTPLNPGAYIYDWSYDYWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQ LVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLG FRQAPGKEREFVAAI N RGDITIGPPNVEGRFTISRDNA NTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGAG TPLNPGAYIYD SYDYWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSLSNYVLGWFRQAPG EREFVAAINWR
GDITIGPPNVEGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCGAGTPL
15
t
20
Tabla A-6: Combinaciones preferidas de secuencias CDR
Nanobody® SEQ FR1 SEQ CDR 1 SEQ FR2 SEQ CDR 2 SBQ FR3 SEQ CDR 3 SEQ FR4 SE n> ID ID ID ID ID ID ID
NC 1 5 EVQLVESGGGLVQAGG 80 NYVLG 98 WFRQAPG 99 AINWRGDITI 101 RFTISRDNAKNTGYLQ 103 GTPLNPGAYI 121 WGRGTQVTVSS 122
SLSISCAASGGSLS KEREFVA GPPNVEG MNSLAPDDTAVYYCGA YDWSYDY
NC41v01 60 evqllesggglvqpgg 81 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnakntlylq 104 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slrlscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslapedtavyycga YDWSYDY
NC41v02 61 evqllesggglvqpgg 82 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnskntlylq 105 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slriscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslapedtavyycga YDWSYDY
NC41v03 62 evqllesggglvqpgg 83 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnskntlylq 106 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slriscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslrpedtavyycga YDWSYDY
NC41v04 63 evqllesggglvqpgg 84 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnskntlylq 107 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slsiscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslrpddtavyycga YDWSYDY
NC41v05 64 evqllesggglvqpgg 85 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnskntlylq 108 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slsiscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslapedtavyycga YDWSYDY
NC41v06 65 evqllesggglvqpgg 86 NYVLG 98 wf qapg 100 AINWRDDITI 102 rftisrdnakntlylq 109 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slrlscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslrpedtavyycga YDWSYDY
NC41v07 66 evqllesggglvqpgg 87 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnakntlylq 110 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slsiscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslapddtavyycga YDWSYDY
NC41v08 67 evqllesggglvqpgg 88 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnakntlylq 111 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slsiscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslrpedtavyycga YDWSYDY
NC41v09 68 evqllesggglvqpgg 89 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnskntlylq 112 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slsiscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslrpddtavyycga YDWSYDY
NC41vlO 69 evqllesggglvqpgg 90 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnakntgylq 113 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slsiscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslapddtavyycga YDWSYDY
NC41vll 70 evqllesggglvqagg 91 NYVLG S8 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnakntgylq 114 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slsiscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslapddtavyycga YDWSYDY
NC41vl2 71 evqllesggglvqpgg 92 NYVLG 98 wfrqapg 99 AINWRGDITI 101 rftisrdnakntgylq 115 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slsiscaasggsls kerefva GPPNVEG mnslapddtavyycga YDWSYDY
NC41V13 72 evqllesggglvqpgg 93 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnakntgylq 116 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slrlscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslapedtavyycga YDWSYDY
NC41V14 73 evqllesggglvqpgg 94 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnskntlylq 117 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slrlscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslapedtavyycga YDWSYDY
NC41vl5 74 evqllesggglvqagg 95 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnakntlylq 118 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slrlscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslapedtavyycga YDWSYDY
NC 1vl7 75 evqllesggglvqpgg 96 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRGDITI 101 rftisrdnskntlylq 119 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 123 slrlscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslrpedtavyycga YDWSYDY
Tabla A-6: Continuación
Nanobody® SEQ FR1 SEQ CDR 1 SEQ FR2 SEQ CDR 2 SEQ FR3 SEQ CDR 3 SEQ FR4 SE
ID JD ID ID ID ID ID ID
NC41vl8 76 evqllesggglvqpgg 97 NYVLG 98 wfrqapg 100 AINWRDDITI 102 rftisrdnskntlylq 120 GTPLNPGAYI 121 wgqgtlvtvss 12 slrlscaasggsls kgrefva GPPNVEG mnslrpedtavyycga YDWSYDY
NC41vl9 146 EVQLVESGGGLVQPGG 166 NYVLG 98 WFRQAPG 99 AINWRGDITI 101 RFTISRDNAKNTGYLQ 103 GTPLNPGAYI 121 WGQGTLVTVSS 12
SLRLSCAASGGSLS KEREFVA GPPNVEG MNSLAPDDTAVYYCGA YDWSYDY
NC41v20 147 EVQLVESGGGLVQPGG 166 NYVLG 98 WFRQAPG 99 AINWRGDITI 101 RFTISRDNAKNTGYLQ 167 GTPLNPGAYI 121 WGQGTLVTVSS 12
SLRLSCAASGGSLS KEREFVA GPPNVEG MNSLRPDDTAVYYCGA YDWSYDY
NC41v21 148 EVQLVESGGGLVQPGG 166 NYVLG 98 WFRQAPG 99 AINWRGDITI 101 RFTISRDNAKNTGYLQ 116 GTPLNPGAYI 121 WGQGTLVTVSS 12
SLRLSCAASGGSLS KEREFVA GPPNVEG MNSLAPEDTAVYYCGA YDWSYDY
NC41v22 149 EVQLVESGGGLVQPGG 166 NYVLG 98 WFRQAPG 99 AINWRGDITI 101 RFTISRDNAKNTGYLQ 168 GTPLNPGAYI 121 WGQGTLVTVSS 12
SLRLSCAASGGSLS KEREFVA GPPNVEG MNSLRPEDTAVYYCGA YDWSYDY
NC41v23 150 EVQLVESGGGLVQPGG 166 NYVLG 98 WFRQAPG 99 AINWRGDITI 101 RFTISRDNAKNTGYLQ 103 GTPLNPGAYI 121 WGRGTLVTVSS 16
SLRLSCAASGGSLS KEREFVA GPPNVEG MNSLAPDDTAVYYCGA YDWSYDY
NC41v24 151 EVQLVESGGGLVQPGG 166 NYVLG 98 WFRQAPG 99 AINWRGDITI 101 RFTISRDNAKNTGYLQ 167 GTPLNPGAYI 121 WGRGTLVTVSS 16
SLRLSCAASGGSLS KEREFVA GPPNVEG MNSLRPDDTAVYYCGA YDWSYDY
NC41v25 152 EVQLVESGGGLVQPGG 166 NYVLG 98 WFRQAPG 99 AINWRGDITI 101 RFTISRDNAKNTGYLQ 116 GTPLNPGAYI 121 WGRGTLVTVSS 16
SLRLSCAASGGSLS KEREFVA GPPNVEG MNSLAPEDTAVYYCGA YDWSYDY
NC41v26 153 EVQLVESGGGLVQPGG 166 NYVLG 98 WFRQAPG 99 AINWRGDITI 101 RFTISRDNAKNTGYLQ 168 GTPLNPGAYI 121 WGRGTLVTVSS 16 SLRLSCAASGGSLS KEREFVA GPPNVEG MNSLRPEDTAVYYCGA YDWSYDY
Tabla A-7 : Secuencias de ligadura
Ligadura SEQ ID NO: Secuencias
5GS 124 GGGGS
7GS 125 SGGSGGS
9GS 126 GGGGSGGGS
10GS 127 GGGGSGGGGS
15GS 128 GGGGSGGGGSGGGGS
18GS 129 GGGGSGGGGSGGGGGGGS
20GS 130 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS 131 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS 132 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS 133 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
Bisagra Gl 134 EPKSCDKTHTCPPCP
Bisagra 135 GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP
9GS-G1
Bisagra G3 136 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP
EPKSCDTPPPCPRCP
3Ala 137 AAA
Tabla B-l : Características de Nanobodies® que enlazan proteina F hRSV
hRSV Competencia
Neutralización RSVIC50 de Synagis® Análisis cinético
(nM)(n=2)
Clon Familia Epitopo enlace Fab
EC50 EC50 ka (1/Ms) kd(1/s) KD Larga A-2 B1
191D3 LG 3sub2 11 1.5E-10 5.9E-09 1.5E+06 2.8E-03 1.9E-09 253 227 - 1 E4 LG 3sub2 11 6.6E-11 4.5E-09 8.0E+05 1.3E-03 1.6E-09 380 298 ND
7B2 16 11 9.0E-11 1.9E-09 5.7E+05 6.5E-04 1.1E-09 91 177 2690
NC23 34 11 1.0E-10 2.3E-09 8.0E+05 7.4E-04 9.2E-10 144 109 - 15H8 29 11 8.3E-10 3.9E-08 1.2E+06 2.1E-02 1.6E-08 200 218 2340
NC41 29 11 4.1E-10 3.2E-08 8.2E+05 6.7E-03 8.1E-09 58 26 4000
15B3 4sub1 IV-VI 5.8E-11 - 4.1E+05 2.7E-04 6.7E-10 - - 1274
191E4 LG 21 IV-VI 8.3E-11 - 5.7E+05 1.5E-04 2.7E-10 - - 4327
Syragfe® II 2.8E+05 1.8E-04 6.4E-10 4 2.5 1.7
Tabla B-2 : Nomenclatura para constructos de Nanobodies® multivalentes dirigidos contra proteina F hRSV
Tipo Nombre Constructo SEQ ID NO
Bivalente RSV101 191D3-15GS-191D3 20
RSV102 191D3-25GS-191D3 21
RSV103 191D3-35GS-191D3 22
RSV104 191D3-9GS-191D3 23
RSV105 7B2-9GS-7B2 24
RSV106 7B2-15GS-7B2 25
RSV107 15H8-9GS-15H8 26
RSV108 15H8-15GS-15H8 27
RSV109 NC23-9GS-NC23 28
RSV110 NC23-15GS-NC23 29
RSV113 15B3-15GS-15B3 30
RSV114 NC39-20GS-NC39 31
RSV115 191E4-18GS-191E4 32
RSV116 NC41-15GS-NC41 33
Biparatopo RSV201 191D3-9GS-191E4 34
RSV202 191D3-15GS-191E4 35
RSV203 191D3-25GS-191E4 36
RSV204 7B2-15GS-15H8 37
RSV205 7B2-15GS-15B3 38
RSV206 15H8-15GS-15B3 39
RSV207 15H8-15GS-7B2 40
RSV301 191E4-9GS-191D3 41
RSV302 191E4-15GS-191D3 42
RSV303 191E4-25GS-191D3 43
RSV305 15B3-15GS-7B2 44
RSV306 15B3-15GS-15H8 45
Trivalente RSV400 7B2-15GS-7B2-15GS-7B2 46
RSV401 7B2-15GS-7B2-15GS-15B3 47
RSV402 15B3-15GS-7B2-15GS-7B2 48
RSV403 7B2-15GS-15B3-15GS-7B2 49
RSV404 15H8-15GS-15H8-15GS-15H8 50
RSV405 191D3-15GS-191D3-15GS-191D3 51
RSV406 NC23-15GS-NC23-15GS-NC23 52
RSV407 NC41-15GS-NC41-15GS-NC41 53
RSV408 NC41-AAA-NC41-AAA-NC41 54
RSV409 NC41-9GS-NC41-9GS-NC41 55
RSV410 NC41-20GS-NC41-20GS-NC41 56
RSV411 NC41-15GS-NC41-15GS-15B3 57
RSV412 15B3-15GS-NC41-15GS-NC41 58
RSV413 NC41-15GS-15B3-15GS-NC41 59
Tabla B-3 : Reactividad de Nanobodies® monovalentes con extractos de antigeno de células HEp-2 infectadas con mutantes de escape diferentes de la cepa Larga
Tabla B-4 : Reactividad de Nanobodies monovalentes bivalentes con extractos de antigeno de células HEp-infectados con mutantes de escape diferentes de cepa Larga
Sustitución aa
1- UJ - G? G? m
1^
( (
2>¿ 1¿
Tabla B-5: Neutralización y parámetros de enlace cinéticos en Biacore en proteina FTM- NN para variantes NC41 selectas
IC50 de Neutralización (nM) Biacore (Ftm.NN)
Nombre
Larga B-l Larga B-l ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
NC41 202 4707 122 3291 1.7E+06 6.70E-03 4.00E-09
NC41v03 255 1507 nd nd nd nd nd
NC41v06 111 806 nd nd 2.0E+06 4.80E-03 2.50E-09
NC41vl7 249 677 149 346 1.9E+06 5.90E-03 3.20E-09
IMC41vl8 116 728 98 194 nd nd nd
Synagis 7.3 2.1 6.0 2.9
15
Tabla B-6: Variantes optimizados de secuencia y/o humanizados trivalentes de NC41
Nombre Constructo SEQ ID NO
RSV414 NC41v03-15GS-NC41v03-15GS-NC41v03 77
RSV426 NC41v06-15GS-NC41v06-15GS-NC41v06 78
RSV427 NC41vl8-15GS-NC41vl8-15GS-NC41vl8 79
RSV434 NC41 E1D-15GS-NC41 -15GS-NC41 142
RSV435 NC41 v17E1D-15GS-NC 1 v17-15GS-NC41 v17 162
RSV436 NC41v20-15GS-NC41v20-15GS-NC41v20 159
RSV437 NC41 v20E1D-15GS-NC41 V20-15GS-NC41 v20 163
RSV438 NC41 V22-15GS-NC41 v22- 15GS-NC 1 v22 160
oo
10 RSV439 NC41v26-15GS-NC41v26-15GS-NC41v26 161
RSV440 NC41 v26E1D-15GS-NC41 26-15GS-NC41 v26 165
RSV441 NC41v22E1D-15GS-1A4v22-15GS-1A4v22 164
RSV442 NC41v17-15GS-1A4v17-15GS-1A4v17 158
RSV443 NC41v03 E D -15GS-NC41v03-15GS-NC41v03 143
RSV444 NC41v06 E1D -15GS-NC41v06-15GS-NC41v06 144
15
RSV445 NC41V18 E1D -15GS-NC41vl8-15GS-NC41vl8 145
Tabla B-7 : Neutralización de Larga y B-l por variante NC41 trivalentes
Larga B-l
ID Trivalente IC50 [M] Relación a Synagis IC50 [M] Relación a Synagis
RSV407 NC41 9.41E-11 59 6.6 E-10 3
RSV414 NC41v03 7.81E-11 72 1.61E-10 11
RSV426 NC41v06 8.98E-11 63 9.32E-11 20
RSV427 NC41vl8 9.13E-11 62 4.61E-11 40
Tabla B-8: Capacidad de neutralización de RSV434 y Synagis en ensayo de placa contra varios aislados clínicos
Número con 100 veces Comparación Número con inhibición Comparación de reducción o mayor entre los de virus completa (%) entre los
(%) fármacos del fármacos del estudio estudio
Grupo Synagis RSV434 Valor P Synagis RSV434 Valor P RSV
27/31 31/31 1/31 29/31
RSV/A (87.1%) (100%) 0.11 (3.2%) (93.5%) <0.0001
26/30 28/30 11/30 22/30
RSV/B (86.7%) (93.3%) 0.67 (36.7%) (73.3%) 0.009
53/61 59/61 12/61 51/61
Total (86.9%) (96.7%) 0.09 (19.7) (83.6%) <0.0001
Tabla B- 9 : Tabla de visión general de todos los experimentos de rata algodón realizados que muestran tanto la detección de virus competentes de replicacion como ARN vírico en el dia 4 después de la inoculación (en el experimento 3 también se realizó la detección en el dia 7 )
Dosis de Régimen de tratamiento Diferente de carga Veces de reducción
Nanobody vírica contra control de ARN vírico (2?(GG)
(log10 pfu)
Exp 1 RSV407
5 mg/kg Día profiláctico -1 -2.59* 286.7*
Día terapéutico +1, 2, +3 -2.88* 4.4*
Día terapéutico +2, +3 -2.83* 4.6*
Exp 2 RSV407
5 mg/kg Día profiláctico -1 -3.01* 79.2*
1 mg/kg -2.37* 61.3*
0.2 mg/kg -1.43* 28.1*
0.04 mg/kg -0.37 11.7*
Exp 3 RSV407
5 mg/kg Día terapéutico +1 -2.04* 2.9*
(Read out at day 7) (0.63*) (1.8)
Día terapéutico +l,+2 -2.47* 2.5*
(Leído en el día 7) (0.57) (4.5*)
Exp 4 RVS407
0.2 mg/kg Día profiláctico -1 -0.75* 29.8*
RSV503
1 mg/kg -1.27* 31.4*
0.2 mg/kg -0.71* 30.4*
0.04 mg/kg -0.22* 15.5*
Exp 5 RSV434
20 mg/kg Día terapéutico +2, +3 -2.89* 10.2*
4 mg/kg -1.76* 1.9
2 mg/kg -1.81* 5.5*
1 mg/kg -1.66* 3.9*
Exp 6 RSV434
5mg/ml Día terapéutico +2, +3 -3.15* 10*
20mg/ml -2.64* 2.4*
80mg/ml -3.30* 4.3*
* p < 0.05
Claims (30)
1. Polipéptido caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o uno o más Nanobody® que se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV, y opcionalmente comprende además una o más de otras unidades de enlace de aminoácidos, opcionalmente ligadas por medio de una o más ligaduras peptídicas, en donde al menos una secuencia de aminoácidos y/o uno o más Nanobody® se elige de lo siguiente: a) SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157; b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 138-141 y 154-157, con la condición de que: i) la secuencia de aminoácidos tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1 (dicha posición determinada de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad como se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una secuencia de aminoácidos y/o uno o más Nanobody® se elige de los siguientes: a) SEQ ID NO's: 140-141 y 154-157; b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 140-141 y 154-157, con la condición de que: i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad como se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
3. El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque al menos una secuencia de aminoácidos y/o uno o más Nanobody® se eligen de los siguientes: a) SEQ ID NO's: 140-141 y 154-157; b) secuencias de aminoácidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 140-141 y 154-157, con la condición de que: i) la secuencia de aminoácidos tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y ii) la secuencia de aminoácidos se enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad como se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o la secuencia de aminoácidos tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos .
4. El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en lo cual uno o más residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54D, y en donde el Ácido glutámico en la posición 1 ha sido cambiado por Ácido aspártico.
5. El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® con SEQ ID NO: 5, en donde los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: GlulAsp; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; - GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Argl05Gln; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
6. El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado porque es un polipéptido multivalente.
7. El polipéptido multivalente de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque es un polipéptido bivalente o trivalente.
8. El polipéptido trivalente de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque se dirige contra y/o se enlaza especificamente a la proteína F de hRSV, elegidos de los siguientes polipéptidos : a) SEQ ID NO's: 142-145 y 162-165; b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 142-145 y 162-165, con la condición de que: i) la primera secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene un Ácido aspártico (Asp, D) en la posición 1; y ii) el polipéptido enlaza a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad como se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
9. El polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque se dirige contra y/o se enlaza específicamente a la proteina F de hRSV, elegidos de los siguientes polipéptidos : a) SEQ ID NO's: 144-145 y 162-165; b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 144-145 y 162-165, con la condición de que: i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108 (dichas posiciones determinadas de acuerdo , con la numeración de Kabat) ; y ii) el polipéptido enlazado a la proteina F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) en comparación con la secuencia de aminoácidos sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
10. El polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 hasta 9, caracterizado porque se dirige contra y/o se enlaza específicamente a proteína F de hRSV, elegidos de los siguientes polipéptidos : a) SEQ ID NO's: 144-145 y 162-165; b) polipéptidos que tienen no más de 3, preferiblemente no más de 2, más preferiblemente no más de 1 diferencia de aminoácidos con una de SEQ ID NO's: 144-145 y 162-165, con la condición de que: i) la secuencia de aminoácidos o Nanobody® abarcada en dicho polipéptido tiene una Prolina (Pro, P) en la posición 14, Arginina (Arg, R) en la posición 19, Leucina (Leu, L) en la posición 20 y Leucina (Leu, L) en la posición 108; y además Arginina (Arg, R) en la posición 83, Ácido glutámico (Glu, E) en la posición 85 y/o Glutamina (Gln, Q) en la posición 105 (dichas posiciones determinadas de acuerdo con la numeración de Kabat) ; y ii) el polipéptido enlaza a la proteína F de hRSV con la misma, alrededor de la misma, o una afinidad superior (dicha afinidad cuando se mide por resonancia de plasmón de superficie) y/o el polipéptido tiene la misma, alrededor de la misma, o una potencia superior (como se definen en la presente) comparado con el polipéptido sin la diferencia de 3, 2 ó 1 aminoácidos.
11. El polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 hasta 10, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en donde el primer Ácido glutámico ha sido cambiado por Ácido aspártico, y en lo cual opcionalmente en al menos uno (preferiblemente en dos, más preferiblemente en los tres) Nanobody®/Nanobodies® que forma parte de SEQ ID NO: 53, uno o más (tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve, diez, una vez o doce) residuos de aminoácidos se han mutado seleccionados de los siguientes: Val5Leu, Alal4Pro, Serl9R, Ile20Leu, Glu44Gly, Ala74Ser, Gly78Leu, Ala83Arg, Asp85Glu, Argl05Gln, Glnl08Leu y Gly54Asp.
12. El polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 hasta 11, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de SEQ ID NO: 53, en lo cual en al menos uno Nanobody® que forma parte de SEQ ID NO: 53, los siguientes residuos de aminoácidos se han mutado: GlulAsp; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu y Glnl08Leu; - GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Ala83Arg; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Asp85Glu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu y Argl05Gln; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Asp85Glu; GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg y Argl05Gln; - GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Asp85Glu y Argl05Gln; o GlulAsp, Alal4Pro, Serl9Arg, Ile20Leu, Glnl08Leu, Ala83Arg, Asp85Glu y Argl05Gln.
13. El polipéptido trivalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 hasta 12, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de una de SEQ ID NO's: 142-145 y 162-165.
14. La secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® que se dirige contra y/o especificamente enlaza a la proteina F de hRSV, como se describe de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13.
15. El constructo monovalente, caracterizado porque comprende o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos y/o un Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14.
16. El uso de un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15, en la preparación de un polipéptido multivalente, tales como un polipéptido bivalente o trivalente, de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 hasta 13.
17. La secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos, caracterizada porque codifica un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, un secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15.
18. El uso de una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 17, que codifica un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15, para la preparación de un constructo genético que codifica un polipéptido multivalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta
19. El hospedero o célula hospedera caracterizado porque expresa, o que bajo circunstancias adecuadas es capaz de expresar, un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con cualquiera de la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15; y/o que comprende una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 17.
20. La composición, caracterizada porque comprende un polipéptido conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con cualquiera de la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15, o secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 1 .
21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque es una composición farmacéutica.
22. La composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15, y un portador adecuado para suministro pulmonar.
23. El método caracterizado porque produce un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15, o una composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 20 hasta 22, dicho método al menos comprende las etapas de: a) expresar, en una célula hospedera apropiada u organismo hospedero o en otro sistema de expresión apropiado, una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 17, o cultivar y/o mantener un hospedero o célula hospedera de conformidad con la reivindicación 19 bajo condiciones que son tal que dicho hospedero o célula hospedera expresa y/o produce un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15, o composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 20 hasta 22, opcionalmente seguido por: b) aislar y/o purificar el polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, la secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o el constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15, asi obtenido.
24. El método para preparar un polipéptido bivalente o trivalente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, caracterizado porque dicho método qcomprende al menos las etapas de ligar dos o más secuencias de aminoácidos monovalentes o constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15 y por ejemplo una o más ligaduras.
25. El método para la prevención y/o tratamiento de infección por hRSV, caracterizado porque dicho método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15 y/o una composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 20 hasta 22.
26. El método para la prevención y/o tratamiento de al menos una de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y asma, caracterizado porque dicho método comprende administrar, a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15 y/o composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 20 hasta 22.
27. El uso de un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15 y/o una composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 20 hasta 22 en la preparación de una composición farmacéutica para prevención y/o tratamiento de infección por hRSV; y/o para uso en uno o más de los métodos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 25 o 26.
28. Un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15 y/o composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 20 hasta 22 caracterizado porque es para la prevención y/o tratamiento de al menos una de enfermedad respiratoria, infección del tracto respiratorio superior, infección del tracto respiratorio inferior, bronquiolitis (inflamación de las vías respiratorias pequeñas en el pulmón) , neumonía, disnea, tos, (recurrente) sibilancia y asma.
29. El dispositivo farmacéutico caracterizado porque es apropiado para el suministro pulmonar de un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15 y/o apropiado en el uso de una composición que comprende el mismo.
30. El dispositivo farmacéutico de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque es un inhalador para líquidos (por ejemplo, una suspensión de partículas sólidas finas o gotitas) , un aerosol o un inhalador de polvo seco, que comprende un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody® de conformidad con la reivindicación 14, o un constructo monovalente de conformidad con la reivindicación 15.
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