MX2010008083A - Inhibicion de exositios selectivos de actividad papp-a contra igfbp-4. - Google Patents

Inhibicion de exositios selectivos de actividad papp-a contra igfbp-4.

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Jakob Hauge Mikkelsen
Claus Gyrup Nielsen
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Univ Aarhus
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Abstract

La presente invención se refiere a una modalidad de interactuadores de exositio(s) PAPP-A tales como anticuerpos que se enlazan a una región que comprende LNR3 de PAPP-A e inhibe eficientemente la proteólisis de IGFBP-4 pero no de -5. La región que comprende LNR3 representa un exositio de enlace al sustrato, el cual se ha dirigido para inhibición proteolítica selectiva. Consecuentemente, la presente invención se refiere a una modalidad a la inhibición diferencial de sustratos naturales de proteasa por direccionamiento de exositios.

Description

INHIBICION DE EXOSITIOS SELECTIVOS DE ACTIVIDAD PAPP-A CONTRA • : ! : ? IGFBP-4 ! ! ; ¡I CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a uno o más inhibidores de proteasa que causan inhibición general o. 'inhibición diferencial de dos o más sustratos fisiológicos dé '' una . i ¦ 'i proteasa al dirigir a uno o más exositios enlazados ¡' al sustrato. En una modalidad, la presente invención específicamente se refiere a dirigidos de los exositios en PAPP-A . - _ ¦ : ¦ ¦ ':.¦ ) - ' : "i ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN : 1 í Los factores de crecimiento tipo insulina (IGF-I y -II, 1 ' -i por sus siglas en inglés) son polipéptidos de aproximadamente :¦ 1 : ¡i 70 residuos con efectos auto- y paracrinos en ¡i la ? proliferación, migración y diferenciación celular. Los' |;IGF enlazan al receptor IGF-1 (IGFR), pero una serie dé¦ sj,eis proteínas de enlace, IGFBP-1 hasta -6, son capaces _| de secuestrar el IGF del IGFR debido a sus afinidades¦ más, altas ;i para IGF-I y -II. Sin embargo, el IGF bioactivo puéde ' : '?; liberarse de tales complejos por. medio de desdoblamiento prott.'olí tico de- la proteína enlazada, lo que causa '! la ¡ generación de fragmentos IGFBP con- afinidad disminuida para r ! después de angioplastia, lo que sugiere que promueve1 la proliferación celular neoínt im , y ha mostrado ser ; un marcador de suero de los síndromes coronarios agudos, :¾más desarrollado las estrategias pa a la inhibición directa ¡ de señalización IGF. Sin embargo, la inhibición especifica 5 de I ! : I' actividad proteolitica promotora de crecimiento puede representar una alternativa valiosa, en particular debido a que tal inhibición de la estimulación del receptor IGF es sustratos diferentes de una proteinasa dada puede no usar: el • i ; ?! mismo exositio y por lo tanto pueden inhibirse de f rma í diferente . - La literatura contiene muchos ejemplos de inhibición proteolitica por direccionamiento de exositios. Por ejémplo, el desdoblamiento de MMP-2 de gelatina tipo I y colágeno ^ tipo IV se ha · inhibido por el direccionamiento del dominio enlazado al colágeno usando un . péptido sintético, y | un bolsillo de enlace de sustrato distinto del sitio catalítico de la enzima de desdoblamiento beta-APP se ha dirigido 'por péptidos sintéticos. También, muchos inhibidores de exositio se han desarrollado hacia el Factor Vlla de enzima de coagulación, y aunque es específico para esta proteinása, todos estos varios sustratos biológicos se dirigen por tales proteasa natural por direccionamiento de exositios1. ' i ¡j ( ¡ En otra modalidad la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende, o consiste de cualquiera de una ¡ de la SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, o un fragmento,jde polipéptido de cualquiera de una de la SEQ ID N0:1, SEQ ? ID N0:2 y SEQ ID N0:3, el polipépt ido . o fragmento del mismo' es capaz. de enlazar una molécula por ello inhibiendo la actividad del polipéptido¦ o fragmento del mismo. I ¦ La presente invención también se refiere a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NQ : 3 que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQij ID N0:1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, o una variante ce i : í ¦ ¦( polipéptido de un fragmento de la SEQ ID NO:l, SEQ. ID NO:2 y í SEQ ID NO: 3. ' . ' ; j i ' í La invención también se refiere a una molécula capaz? de ! 1 ? interactuar con los po] ipépt idos derivados de ???,?-? descritos arriba. i! i . Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo, o un fragmento de enlace del mismo, que enlaza específicamente una secuencia de aminoácido seleccionada ¡.del grupo que consiste de la SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2 o SEQ.! ID NO: 3, o una variante, que se presenta naturalmente de la misma.
La invención también se refiere a un anticuerpo jque método comprende las etapas de proporcionar un polinucleótido que codifica el polipéptido y expresa el polinucleótido.- ya sea in vitro, o in vivo en un organismo hospedero apropiaclo, por ello produciendo el polipéptido. ' 'ji La presente invención se refiere además a Jj un polinucleótido que codifica cualquiera del polipéptido'! o variantes del mismo descritos arriba. Además, la inven "ci¦ón'i;) se refiere a una secuencia de nucleótido capaz de hibridizarjl al polinucleótido que codifica los polipéptidos descritos arr,iba o . un fragmento del mismo, bajo condiciones severas. . ' . í I' Adicionalmente, la. invención se refiere a una secuencia!| de ' ¡I nucleótido de acuerdo como se describe arriba, ,en donde| la ¦ de expresión descrito arriba. ; La presente invención también se refiere a; un métpdo para generar una célula hospedera de mamífero, transgénica , el método comprende las etapas de proporcionar un , ' 'j polinucleótido que codifica uno o los polipéptidos descritos ' 1 1 arriba, introducir el polinucleótido en la célula hospedera 10 . ¦ · .!. polinucleótidos descritos arriba y/o el vector descrito arriba. jj 5 La presente invención también se refiere a un método para generar una célula hospedera recombinante o transgéiiiéa, el método comprende las etapas de proporcionar uno o más de : i los polinucleótidos que codific uno o más . del polipéptido descrito arriba, introducir el polinucleótido en la célula hospedera recombinante o transgénica y opcionalmente también • ' ¡i expresar el polinucleótido en la célula hospedera recombinante o transgénica, por ello generando ' una célula hospedera recombinante o transgénica que produce, jj el polipéptido . . j En otra modalidad preferida la invención se refieré¡ a'| un organismo mamífero, transgénico que comprende la célula hospedera descrita arriba. .·' \ La invención se refiere además, a un método para gene|rar una célula de levadura recombinante, el método comprende '¡las etapas de proporcionar, uno o más polinucleótidos: ''¡que codifican uno o más de los polipéptidos descritos arriba, introducir el polinucleótido en la célula de · levadura y opcionalmente también expresar el polinucleótido en la cé-Jula de levadura, por ello generando una célula ;de levadura recombinante que produce el polipéptido. ?i; La presente invención también se refiere a una. ¡célula ii ' ¦ . ! : :¡; hospedera fúngica recombinanté que comprende uno o más dé los ? ' polipéptidos descritos arriba y/o uno o ' más de . los bajo condiciones que obtienen una respuesta de anticuerpo, identificar un anticuerpo que se enlaza específicamente! al etapas de inmunizar un sujeto mamífero con él !bajo condiciones que obtienen una respuesta de anticuerpo, • ;. .¡ ¡ ' preparar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal • ' ¦ ! ' í específico para el polipéptido, e identificar un anticuerpo que se enlaza específicamente al polipéptido. ¡i La invención se refiere además a un polipéptido capaz de .. . : í! reconocerse por el anticuerpo descrito arriba. 1 : J En otra modalidad preferida la presente invención ! |¡ se refiere a una composición que comprende uno o mas> ¿el polipéptido descrito arriba en combinación con un portaclor fisiológicamente aceptable. ! ]( Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica, que comprende uno o más del polipéptido descrito arriba en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente uno o más agentes .bioactivos ! ' i adicionales .
Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más del polipéptido descrito arriba en combinación con uno o más agentes bioacti.vos polipéptidos descritos arriba, el método comprende ¡ las etapas de extraer el polipéptido y aislar los compañeros ;de enlacé.
En otra modalidad la invención se refiere a uno o más] de ! : 5 los polipéptidos descritos arriba o la composición ¦ t farmacéutica para uso como un medicamento.
La invención también se refiere a un método p'ara r el ' : . ' i> : ¡ tratamiento de un individuo que . necesita del mismo conii un interactuador de exositio tal como interactuador de exositijios PAPP-A tal como PACI y/o PAC2 para inhibir la proteólisis" de uno o más de los sustratos de PAPP-A. ! La-- presente invención se refiere ¦ además :¾ a interactuadores de exositios que causan inhibición general i!de uno o más sustratos fisiológicos de la proteinasa ' que ; 'í -comprende al exositio al dirigir un exositio enlazado l(al sustrato . i : !¡ ? La presente invención también se refier ' !j a interactuadores de exositios que causan inhibición diferencial de dos o más sustratos fisiológicos de '! la r ; !¡ proteinasa que · comprende el exositio al dirigir un exositio enlazado al sustrato. · : ' :< ¦ ¦ : ! J ' ' l¡ PAC2 : anticuerpo de exositio PAPP-A. Todas - ¡las descripciones de PAC2 en el documento actual también se : "i refieren a cualquiera de las variantes PAC2 descritas en¡ ejste documento . : ' : , " PAC5 : anticuerpo no de exositió PAPP-A. Todas "las i; ¦ !¦ ? afección patológica, tal como infarto al miocardio',, apoplejía isquémica, angina de pecho y enfermedad arterial periférica!.
Un. "efecto de tratamiento" o "efecto terapéutico" 'jj se manifiesta si hay un cambio en la condición a' trdtarse,' :como se¦ mide por los criterios que constituyen la deifinici;ón; jj de los términos "tratar" y "tratamiento." Hay un "cambio" en¡:¡ la condición a tratarse si hay al menos 5% de mej ora , preferiblemente 10% de mejora, más preferiblemente al menos ? :l 25%, aún' más preferiblemente al menos 50%, tal como al ,menos 75%, y aún más preferiblemente al menos 100% de mejora. ''El : 1 ' ' ii cambio puede basarse en mejoras en la severidad de la afección tratada en un individuo, o en una diferencia en: la frecuencia de afecciones mejoradas en poblaciones de ¡ ( I' individuos con y sin tratamiento con el agente bioactivo,' o : ¦t con el agente "bioactivo en combinación con una composición : . ' ' ? ! G · farmacéutica . de la presente invención.
"Cantidad farmacológicamente efectiva", "can 1t·;i¦ ldiad farmacéuticamente efectiva" o "cantidad fisiológicamente efectiva de un "agente bioactivo" es la cantidad de un age'nte activo presente en una composición farmacéutica como j se describe en la presente que se necesita para proporcionar;! un nivel deseado de agente activo en el torrente sanguíneo ó!¡ en el sitio de acción en un individuo (por ejemplo, '¾los pulmones, el sistema gástrico, el sistema , colorecíal , la técnica, basado en la información proporcionada en: ¡'la presente. Una "cantidad efectiva" de un agente bioactivo, J se puede administrar en una administración, o a través ¡de Los términos "mejoramiento" y "mejora" de un efecto benéfico, y variaciones del mismo, como .se usa en'1! la presente, se refiere al efecto terapéutico del agente bioactivo contra placebo, o un incremento en el efe;cto terapéutico .de un- tratamiento médico del estado del arte anterior que normalmente se obtiene cuando una composición farmacéutica se administra sin el agente bioactivo de, ;esta invención. "Un incremento en los efectos terapéuticos" se '< de incremento en- los efectos terapéuticos cuando un agente bioactivo de la presente invención se co-administra con luna composición farmacéutica comparada con la administración;! de 'i la composición farmacéutica sola. Preferiblemente ¦ el incremento es al menos 25%, más preferiblemente al menos. 50%, I 1 ;' aún más preferiblemente al menos 75%,' más preferiblemente ;al : \ : \ menos 100% . i conejillos de indias, conejos, ratas; animales deportiyos, tal como caballos, ponis, perros, camellos, y primates:, ¾que incluyen humanos. ' : - l! Un "polipéptido" es un polímero de residuos ;! de aminoácidos preferiblemente unidos exclusivamente' por enlaces de peptido, ya sea producido naturalmente o sintéticamentje .
Un polipéptido producido por expresión de una molécula de 'ÁDN : , 1 no hospedera es- un péptido o polipéptido "heterologo" . El término "polipéptido" como se usa en la presente cubre proteínas, péptidos y polipéptidos , en donde las: proteínas, i i ? i ' i péptidos o polipéptidos pueden o no pueden haber . sido modificados posterior a la traducción. La modificación posterior a la traducción puede por ejemplo; , (ser fosforilación, metilación y glucosilación .
? . El término osteoporosis como se usa en la presente se refiere a una afección que presenta pérdida de la densidad ósea normal y. elasticidad que lleva a huesos frágiles.
El término "homólogo a por ejemplo SEQ ID NO:;l" se refiere a un polipéptido con una secuencia similar a pero i 11 diferente por ejemplo SEQ ID NO:l, en que es un polipépt'ido que comprende o consiste de .por ejemplo SEQ ID'NOil .o] un ( j fragmento del mismo. ' 1 a íí El término "variante de por ejemplo SEQ ID NO: 1" se refiere a un polipéptido con una secuencia similar ai pero \ sustituciones conservadoras o una o más sustituciones equivalentes de uno o más aminoácidos que alteran :!la secuencia, pero no la actividad biológica, del polipéptido: ¡, de por ejemplo SEQ ID N0:1.
La presente invención también se refiere- a variantes jjde los polipéptidos SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID 'NO: 3,; SEQ ' ' í ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 y SEQ ID NO:'7, o fragmentos de los mismos, en donde las sustituciones se han diseñado por ' análisis computacional que usa homología de secuencia ; para preparación de proteína y tinción de Coomassie Brílliant 1 BÍue del gel. Sin embargo, el término "aislado" no 'excluye jla presencia del mismo polipéptido en formas físicas i; alternativas, tal como dímeros . o alternativáme'rte ' . ¦ i glicosilados o formas obtenidas. ,! El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteína : ; 3 obtenida de una especie que es la contraparte funcional deji un polipéptido o proteína de una especie diferiente. , Las diferencias de secuencia entre ortólogos son el résultadoíde : j ' I I ! la especiación. . ? ' : i j|! Los "parálogos" son distintos pero estrpcturalmente relacionados a proteínas hechas por un organismo Los parálogos se cree que se presentan a través de duplicación; de gen. Por ejemplo, . alfa-globina, beta-globina, y mioglobjina i: son parálogos' uno del otro. 1 1 ! Como se usa en la presente, "ácido nucleico", o "mo' .L :é'c I-ula de ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos , tal ácido deoxiribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ASN), •j; oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción; de cadena de polimerasa (^PCR) , y fragmentos generados ;'por cualquiera de ligadura, escisión, acción de endonucle'aisáj, y . ¦ I! acción de exonucléasa. Las moléculas de acido nucleico pueden componerse de monómeros que son nucleótidos que se presentan li naturalmente, (tal como ADN y ARN) , o análogos de nucleótidos que se presentan naturalmente (por ejemplo, (formas alfa- I :¡ enantiomericas de nucleótidos que se presentan naturalmente) , o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados ; ¡i pueden tener alteraciones en porciones de azúcar y/o jen a una estructura de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser tanto de hebra sencilla como hebra doble. i El término "nucleótido natural" se refiere a cualquiera ' 'I de los cuatro deoxiribonucleótidos , dA, dG, , dT, y, 'jjdC (constituyentes de ADN) , y los cuatro ribonucleótidos , ,A,,|G, U, y C (constituyentes de ARN) son los nucleótidos naturales.
Cada nucleótido natural comprende o esencialmente consiste ¡de una porción de azúcar (ribosa o deox.iribosa) , una, porción, ¡de fosfato, y una- porción de base natural/estándar.; , ¿os nucleótidos' naturales enlazados a nucleótidos complementarios de acuerdo con reglas bien conocidas de apareamiento^ ( base (Watson and Crick) , donde la adenina (A) se empareja con ¦ ?| timina (T) o uracil (U) ; y donde guanina (G) se empareja con citosina (C) , en donde los correspondientes pares base son i ¦ !! parte del complemento, hebras de nucleótido anti-paralelás . El apareamiento base resulta en una hibridización : especifica entre nucleótidos predeterminados y complementarios;, ¡j El apareamiento base es la base por la cual las enzimaá on capaces de catalizar la síntesis de un oligonucleótido í complementario al oligonucleótido de plantilla: Enc esta síntesis, bloques de construcción- (normalmente : trifosfatos de ribo o deoxiribo derivados de A, T U, C, son dirigidos por un oligonucleótido de plantilla para formar un oligonucleótido complementario con la secuencia correcta, complementaria. El reconocimiento de una secuencia de ' .' .i.:-] oligonucleótido por su secuencia complementaria está mediado ¡i por bases correspondientes y de interacción formando pares !de bases. En la naturaleza, las interacciones especificas; que llevan a apareamiento de bases se rigen por el tamaño de las con grupos de donantes emparejados con grupos.de aceptadórés.
Un "polinucleótido de acuerdo con- la presente ' invención" o un "ácido nucleico de acuerdo con. la presente invención"! es 1 j cualquier polinucleótido que codifica un "polipéptido '), de acuerdo con la .presente invención", que incluye cualquier polipéptido citado en las reivindicaciones de la presente solicitud de patente o la patente concedida en la base de ¡las reivindicaciones de' esta solicitud de patente.
El término "'complemento de una molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido complementaria ¦ i! y orientación inversa como se compara con una secuencia ¡de ' ¦ i' nucleótido de referencia. Por ejemplo, la secuencia |¡ 5 ' ATGCACGGG 3 ' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3'. ' 1 ¡ |¡ El término "secuencia de nucleótido degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluyen uno o más codones degenerados como se compara con una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. . ¡Los codones degenerados contienen diferentes tripletas !:i de . i| nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácido (esto es, tripletes GAU y GAC cada ' uno codifica Asp). , ¡ .i; ¦ . ¦ . ' · ' i El término "gen .estructural" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se transcribe en ARN mensajero (mARN) , que se traduce luego en una secuencia de ' aminoácidos característica de un polipéptido específico. ¡ Una "molécula de ácido nucleico aislada" es una moléúula de ácido nucleico que no se integra en el ADN genómico dé un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN: genómico de una célula es una molécula de ADN aislado. Otro ejemplo1 de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula;! de ácido nucleico químicamente sintetizada que no se integra ¡¡en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie particular es más pequeña que jla molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie, i jj Un "constructo de molécula de ácido nucleico" es Una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra sencilla o' doble, que se ha modificado a través de intervención humana para contener segmentos de ácido nucleico combinado y yuxtapuesto en una conf ¦ig'urac¦ión que no existe en ·naturaleza. ¦ : :j "ADN lineal", denota moléculas de ADN no circular que tienen terminaciones libres 5' y 3'. El ADN lineal puede preparar.se de moléculas de ADN circular cerradas, tal 'como ¦ " - 'I plásmidos, por digestión enzimática o interrupción física. ' "ADN complementario (cADN) " es una molécula de ADN ! de hebra sencilla que se forma de una plantilla de rnARN por i la i l: transcriptasa inversa de enzima. Típicamente, un cebador !! complementario a porciones de rnARN se emplea para el inicio de transcripción inversa. Aquellos expertos en la técnica también usan el término "cADN" para referirse a una molécula de ADN de hebra doble que consiste de tal molécula de ADN;¡ de hebra sencilla y su hebra de ADN complementaria. El término "cADN" también se refiere a un clon de una molécula de cADN sintetizada de una plantilla de ARN. ' Un "promotor" es una secuencia de nucleótido que dir¡ige : ' (I la transcripción de un gen estructural. Típicamente,! {un ' ' ' 1 j promotor se ubica en la región sin codificación 5' de un gen, próximo al sitio de inicio de transcripción de un ; gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de, promo'tores que funcionan en el inicio de transcripción se caracterizan frecuentemente por secuencias de nucleótido de consenso. 1 Estos elementos de promotor" incluyen sitios de enlace ¡jde polimerasa de ARN, secuencias TATA, secuencias . CAAT, elementos específicos de diferenciación (DSEs; McGehee iet I al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementos de, respuesta ' í AMP cíclica, (CREs), elementos de respuesta de suero (SREs; Treisman, Seminars in Cáncer Biol. 1:47 (1990) ), elementos- ;j de respuesta glucocorticoides (GREs), y sitios de enlace; , para otros factores de transcripción, tal como CRE/AT'F (Q'Rei-íly et al., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)), AP2 (Ye 'et al.,,|j. ¦ i Biol. Chem. 269:' 25728 (1994) ), SP1, .. proteína de enlace de elemen e de respuesta cAMP (CREB; Loeken, Gene Expr. ;3:,253 (1993) ) y factores de octámero (ver, en general^ Wat-son j! et al., eds., Molecular Biology of the Gene, · 4th. ed. i (The Benj amin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), y Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)) . Si un promotor · es un promotor inducible, entonces la velocidad de transcripción incrementa en respuesta a un agente de inducccióhL ·' ;| En contraste, la velocidad de transcripción no se regula- por? un agente de induccción .si el promotor es un , promotor constitutivo. Los promotores reprimibles también sé 1 conocen!. ' : j Un "promotor de ' núcleo" contiene secuencias !· :|de independiente de la distancia u orientación del aumentador relativa al sitio de inicio de la transcripción. 'j "ADN heterologo" se refiere a una molécula de ADN, : o .tina población de moléculas de ADN, que no existen naturalmente dentro de una célula hospedera dada. Las moléculas de, AiDN heterólogas a una célula hospedera particular puede contener ADN derivado de las especies de célula hospedera (estcr es, ADN endógeno) siempre y cuando ese ADN hospedero se conibina con ADN no hospedero (esto es, ADN exógeno) . Por ejemplo una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no hospéd'ero que codifica un polipéptido ligado a un segmento de¡ ADN ' :!l hospedero que comprende un promotor de transcripción ¡¡se ' ¦ ' r considera que. es una molécula de ADN heteróíogo. ' i Inversamente, una molécula de ADN heteróíogo puede 'comprender un gen endógeno < ligado con un 'promotor exógeno. Como otra ilustración, una ¦ molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula tipo silvestre se considera que es ; DN heteróíogo si tal molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen tipo silvestre. i ' :! Un "elemento genético integrado" es un segmento de ADN que se ha incorporado en un cromosoma de una célula hospedera 1 después de que el elemento se introduce en la célula a' través 'í de la manipulación humana. Dentro de la presente 1 invención, los elementos genéticos integrados se derivan más comúnmente de plásmidos linealizados que se introducen en las células por electroporación u otras técnicas. Los elementos genéticos integrados se pasan de la célula hospedera original a jj su progenie . ; 1 í Un "vector de clonación" es una molécula de ácido ¦ -l¡ nucleico, tal como un plásmido, cósmido, o bacteriófago que tiene, la capacidad de replicar de forma autónoma en: üna : ' ; ¡ ! ¦ r célula hospedera. Los vectores de clonación típicamente i contienen uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento ; : : 1 II de endonucleasa de restricción que permiten inserción de' ; na ' ¦ 1 . : j molécula de ácido nucleico en una forma determinable- :sin 1 ¦ ! pérdida de una función biológica esencial del vector'^ ,así como secuencias de nucleótido que codifica un gen marcador que es apropiado para usar en la identificación y - selección de gen res nuc hos pro tra el "op reg ele Un "hospedero recombinante" es una célula que contiene una molécula heterologa de ácido nucleico, tal como un vector de clonación o vector de expresión. 1 :' ; ¡ ¦ '' 1 i I1 Los "transformantes integradores" son células hospederas ¡ i; recombinantes , eh las .cuales ADN heterólogo se ha t integrado, en el ADN genómico de las células.
El término "secuencia de señal' secretora" denota1 lina secuencia de. ADN que codifica un péptido secretor") que, como un componente de un p grande, dirige el polipéptido más grande a trayectoria secretora de una célula en la sintetiza. El polipéptido más grande se divide' comúnmente para remover el péptido secretor durante el transito a través de la trayectoria secretora. . ¡ j El término "variante de empalme" se usa en la presente para significar formas alternativas de ARN transcrito de'! un gen. La variación de empalme surge naturalmente a través clel uso de sitios, de empalme alternativos dentro de una molécula de ARN transcrito, o menos comúnmente entre moléculas de 'ARN ¦ í transcrito de manera separada, y puede resultar en diversos de los mARN transcritos del mismo gen. Las variantes '! de empalme pueden codificar polipéptidos qué tienen secuencia de aminoácido alterada. El término variante de empalme .se usa también en la presente para significar un , polipéptido codificado por una variante de empalme de un mARN transcrjito i de un gen . | SSC 0.2 veces y SDS al 0.1% a 50 grados C, preferiblemente a 55 grados C, más preferiblemente a 62 grados C y aún más preferiblemente a 68 grados C, se observa una. señal ; de • 'i hibridización positiva. Una secuencia de nucleótido: que CH) . Cada cadena ligera se compone de una región variable de Í cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una reg|ión ' ' ! i constante dé cadena ligera (abreviada en la presente : como : í CL) . Las regiones VH ¦ y VL se pueden además subdividiri; en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones ¡que ' i determinan ' complementariedad" (CDRs), intercaladas : cón regiones que están más conservadas, denominadas "regiones, de estructura" (FRs). Cada VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs, configurados de amino terminal a carboxi terminal en el siguiente orden: FR1 , CDR1, FR2 , CDR2 , FR3, CDR3 , FR4. j Las regiones variables de las cadenas pesada 1 y ligera ¡ ¡i contienen un dominio de enlace que interactúá co?n; -sun antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a tejidos Hospederos o factores, incluyendo varias células del sistema i:nmunita;rio [por ejemplo, células efectoras) y el primer componente : (Clq) del. sistema de complemento clásico. ¡ ^ 1 ¡' Mi El término ' "porción de' enlace de- antigeno" de ¡'un í ' ' ^ ^ < anticuerpo, como, se usa en la presente, se refiére a uñó o más frágmentos de un anticuerpo que mantienen la; capacidad i ¦ ·¦ j ¦ i1 para enlazar específicamente a un antígeno. Se 'ha mostrado que la función de ' enlace de antigeno de un anticuerpo i se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de enlaces incluidos dentro del término "porción de enlace de antígeno" ide;¡: un anticuerpo incluye (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CHi; (,?) ! I; un fragmento F(ab' )2r un fragmento bivalente que comp ende F dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en'; la región de la bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste;; de los dominios VH y CHi; (iy) un fragmento Fv que [ consiste:! de los dominios VL y VH de un brazo sencillo de un, anticuerpo, (v) un fragmento . dAb, que consiste de un dominio VH; (vi) i;una región que determina complementariedad aislada (CDR), y (vil) una combinación de dos o más los CDRs aislados que se p'ueden unir opcionalmente por una ligadura sintética.
Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fy, : !; vL y VH, se codifican por genes separados, se pueden un'i'r, usando métodos recombinantes , por una ligadura sintética que eso les permite ser hechos como una cadena de pró eóma i . ¾ sencilla en la cual los pares de regiones' VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como cadena sencilla : ; Fv ¦ 1 5 (scFv); ver por ejemplo, Bird-et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad ScL USA 85:5879-5883). Tales' anticuerpos de cadena sencilla también | se pretende que se incluyan dentro del término "porción ,' de enlace de antigeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional i- es proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de enlace que comprende (i) un dominio de enlace polipéptido . que, { se fusiona a un polipéptido de región de bisagra^ '| de • 1 " L inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región de¦ bisagra^ y (iir) una región constante' CH3 .de cadena pesada ¡i de inmunoglobulina fusionada a la región constante CH2,. , ¡, El polipéptido de dominio de enlace puede ser : una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena i' ligera. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usa¡ndo técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en. ¡,1a acuerdo con la presente invención. El término "fragmento I de anticuerpo" también incluye un polipéptido sintético']' o ' ' ! fabricado genéticamente que se enlaza a un antígeno especifico, tal como polipéptidos que consisten de la reg¡ión variable de cadena ligera, fragmentos "Fv" que consisten; de : : ¡i las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, i¦ i! moléculas de polipéptido de cadena sencilla recómbinante¦ en las que regiones variables ligeras y pesadas se conectan por una. ligadura de péptido ("proteínas scFv"), y unidades); de reconocimiento mínimo que consisten de los residuos, ,j de aminoácidos que imitan la región hipervariable . , ¡! El término "epitopo" significa una 'proteína determinante capaz de enlazar específicamente a un anticuerpo. '¡Los epítopos usualmente consisten de agrupaciones d'e superficie i , :¡í , ' 'i ; ! ¦ S que se expresa en una célula objetivo, tal como una célula! de tumor, o una célula que lleva un antígeno' de . agente infeccioso. Las células T reconocen epítopos de pépiido presentados por una molécula de complejo de mayor histocompatibilidad a un polipéptido objetivo o péptido objetivo y típicamente lisar la célula objetivo o reclutar otras células inmunitarias al sitio de la célula objetivo, asi matando la célula objetivo. 1 't : ;' ; : ; ii Un "péptido antigénico" es un péptido, que enlazará tana molécula de complejo de mayor histocompatibilidad para formar un . complejo de péptido MHC que se reconoce por una célúlajj T, ' ' ' · J por lo que inducirá una respuesta de linfocito citotóxica a I': la presentación de la célula T. Así, los péptidos antigénicos son capaces de enlazar a una molécula de complejo de ma;yor histocompatibilidad adecuada . e. inducir una respuesta » de células T citotóxicas, tal como lisis de célula o liberación 1 de citocina específica contra la célula objetivo que enlaza o ' s expresa el antígeno. El péptido antigénico se puede enlazar en el contexto de .una molécula de complejo de ; mayor histocompatibilidad de clase I o clase II, en un antígeno ? que presenta célula o en una célula objetivo. j; Un "anticuerpo¦ anti-idiotipó" es un anticuerpo ;que¡ se enlaza con . el- dominio de región variable dé- » una inmunoglobulina . En' el contexto presente, un anticue -rpo',! aníti-idiotipo se enlaza con la región variable de un anti- anticuerpo, y así, un anticuerpo anti-idiotipo imita) un epítopo de un polipéptido de acuerdo' con la presente invención. ¦ ¡i El término ' "molécula biespecifica" se pretende .'. que incluya cualquier agente, por ejemplo, una proteína:, péptido, o proteína o complejo. de péptido, que tiene \ os especificidades de enlace diferentes. Por ejemplo,, | , j¡ la molécula puede enlazarse a, o interactuar con, (a) ; un antígeno de superficie de célula y (b) un receptor Fe en ] la superficie de una célula efectora. El término "molécula multiespecí fica" · o "molécula heteroespecíf'ica" se pretende que incluya cualquier agente, por ejemplo, una prot ina, péptido, o complejo de proteína o péptido, que tiene más;! de dos especificidades de enlace diferentes. Por ¦ ejemplo,, |¡ la molécula puede enlazarse a, o interactuar con, (a) :l un antígeno de superficie de célula, (b) un receptor Fe en| la ¡i superficie de una célula efectora, y (c) al menos¡ uno de otro componente. En consecuencia, la invención incluye,,, pero; ??^ se limita a, moléculas biespecificas , triespecíficas , tetraespecíficas, y otras multiespecíficas que se diri,ge(n a PAPP-A, y a otros , antígenos de superficie , celular u objetivos, tal como receptores Fe en células efectoras.¡ ¾ Como se usa en la presente, un anticuerpo humano! se "deriva de" una secuencia de línea germinal particular si el anticuerpo se obtiene de un sistema que usa secuencias de inmunoglobulina humanas, por ejemplo, al inmunizar un ratón término "anticuerpo humano", como se usa en la presente,? no se ' pretende que incluya anticuerpos en cuyas secuencias, CUR derivadas de la linea germinal de otras especies mamífero , tal como un ratón, se han injertado en secuencias 'jjde estructura humana. ; > > ; ? r? Los "anticuerpos humanizados" son proteínas : i; recombinantes en las cuales la complementariedad de muríno humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes¦ se pueden : someter1 i; a mutagenesis m vitro (o, cuando un animal transgénico' ¡ para secuencias- de Ig humano se usa, mutagénesis somática inrviyo) y asi las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VLjj dé¬ los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientrasjj se derivan de y se relacionan con secuencias VH y .VL de , linea . . . : I , .'i germinal humana, no pueden existir naturalmente .'dentro 'jjdel repertorio dé linea germinal de anticuerpo humano in vi'j o .
Como se usa en la presente, un "anticuerpo hetérólogo"jj se define en relación l organismo no humano transgénico ' ¡Ique produ'ce tal anticuerpo. Este término se refiere 1 :a> t un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido ó ,|juna secuencia de ácido nucleico codificada que corresponde; al la encontrada en un organismo que no consiste del animal, no humano transgénico, y generalmente de una especie diferente a la del animal no humano transgénico. . ¡ , ! Un "anticuerpo aislado", como se usa en la .presente;; se pretende para referirse a un anticuerpo que <¡ es sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo,, un anticuerpo aislado que enlaza específicamente á PAPP-A es sustancialmente- libre de anticuerpos que específicamente enlazan antígenos diferentes a PAPP-A) . Un anticuerpo ais'lado que enlaza específicamente a un epítopo, isoforma o variante ¦j de PAPP-A humano pueden, sin embargo, tener reactividad cruzada a otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies [por ejemplo, homólogos de especies PAPP-A) . , íjor otra parte, un anticuerpo aislado puede ser sustancialmertte libre de otro material celular y/o productos químicos. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos ¦ . i' : : ! | monoclonales "aislados" que tienen especificidades diferén es se combinan en una composición bien definida. ' ,j Como se usa en la presente, "enlace específico" , se refiere a anticuerpo enlazado a un antígeno predeterminado. í Típicamente, el anticuerpo se enlaza con una afinidad que corresponde a un KD de alrededor de 10" 7 M o menos, tal ' como alrededor de 10~8 M o menos, tal como alrededor de 10"9 o menos, alrededor de 10"10 M o menos, o alrededor de 10"11 ,G o aun menos, cuando se mide como afinidades aparentes basadas en valores IC50 en FACS, y se . enlaza al' antígéno predeterminado con una afinidad que corresponde a un KD ¡que, ¡I es al menos diez veces menor, tal como al menos 100. veces menor que su afinidad para enlazar a un antígeno no ' I' específico (por ejemplo, BSA, caseína) diferente: al antígjeno predeterminado o un antígeno cercanamente relacionado.
Afinidad: la fuerza de enlace entre receptores y ''sus ligandos, por ejemplo entre un anticuerpo y su antígeno.' ¦; ,1 gama (?) y mu (µ) , respectivamente. Las cadenas ligeras, de anticuerpos se pueden asignar a uno de dos tipos claramente ¦ ¦ 1 1 l distintos, llamaos kapa (K) y lambda (?) , basados en—,las 1 i 'i' secuencias amino de su dominio constante. Las estructuras, de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.' . ¦ .
Sitio de Combinación de Anticuerpo: Un , sitio !¡ de combinación de anticuerpo es la porción estructural de (una molécula de anticuerpo compuesta de regiones hipervariablés y variables de una cadena pesada y ligera que érilaza i específicamente (inmunoreacciona con) un antígeno. El término nmunoreacciona en . sus varias · formas significa ' enlace Estructura de anticuerpo humano: Una molécula qué ' tiiene I un sitio enlazado al antigeno y esencialmente, todas 'las partes derivadas de inmunoglobulina restante de- la molécula ¦ !! ' f 1 derivada de una inmunoglobulina humana.' Estructura de anticuerpo humanizado: una molécula ¡¡que tiene un sitio enlazado al antigeno derivado de ¡¡ una inmunoglobulina de una especie no humana, considerando " que algunas o todas de las partes derivadas de inmunoglobulina ¡i restante de la molécula se derivan de una- inmunoglobu'lina humana. El sitio enlazado al antígeno puede comprender :¦ ¡jya sea un dominio de variable completo de la inmunoglobuíina jjn.o humana fusionada en uno o más dominios constantes1 humands';'! o una o más de las regiones que determinan complementarie|dad ; ¦ 5 (CDRs) injertadas en regiones de estructura humana adecuadas en el dominio variable. En un anticuerpo humanizado, los CDRs pueden ser de un anticuerpo monoclonal de ratón y las otras , regiones del anticuerpo son humanas. : ! 1 ¡ !!¡ Affibody: Una molécula inmunológicamente activa recombinante, seleccionada de una colección construida! por ! í" variación combinatoria de la superficie de enlace Fe de ána proteina que no es un anticuerpo, preferiblemente la próteina I A de estafilococos de 58 residuos (SPA) .
¦ ' '] Inmunoglobulina: Los anticuerpos de suero, que incluyen IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. | ;¡ ¦ ' 1 1 i ! ! Isotipos de inmunoglobulina: Los nombres dados al Ig éjue tienen diferentes cadenas H, los nombres son IgG! ( IgGi,^!, IgM, IgA (IgAi,2), slgA, IgE, IgD. : ' ' ¡ La frase "inmunológicamente distinto" se refiere a ¡! la , i capacidad para distingir entre dos polipéptidos en ') la capacidad de un anticuerpo para enlazar específicamente uno de los polipéptidos y no específicamente enlazar el oiro polipéptido. '¦¦', ] La frase' "anticuerpo monoclonal" en sus varias formas gramáticas se refiere a una población de moléculas '¡de anticuerpo que contienen solamente una especie de sitio ¡;de combinación de anticuerpo capaz de inmunoreaccionar cóh íun . ü antigeno particular. Un anticuerpo monoclonal por lo ;ta;rito . j¡ típicamente muestra una afinidad de enlace sencillo pára cualquier antígeno con el cual inmunoreacciona . Un anticuerpo , ' i monoclonal puede contener una molécula de anticuerpo |jue tiene una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpo, cada uno immunoespecífico para un. antígeno diferente1, ' , or ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecí fico . ; : ' j' "Anticuerpos policlonales" son una mezcla de moléculas de anticuerpo que reconocen un antígeno específico' dado por ¦ ' : i consiguiente anticuerpos policlonales pueden reconocer diferentes epítopos dentro del antígeno. ¡ i Anticuerpo de Cadena Sencilla, o scFv, se refiere , a j| un polipéptido sencillo que comprende uno o más sitios .' ' de e¡n!¦l-iace de antígeno. Adicionalmente, aunque, las cadenas. H y L ; de!,' un 1 i; ' !l fragmento Fv se codifican por genes separados, se puejden • ¦ ?. ligar ya sea directamente o por medio de un péptido, jpor ejemplo una ligadura sintética puede hacer que eso , ¡les permite ser hecho como una cadena de proteína sen'cilla (conocida como anticuerpo de cadena sencilla, sAb; Bird¡ et al. 1988 Science 242: 423-426; y Huston et al. 1988 PNAS '85: ? 5879-58.83) por métodos recombinantes . Tales anticuerpos], de cadena sencilla también son incluidos dentro del término "anticuerpo", y se pueden utilizar como determinantes jde enlace en el diseño e ingeniería de una molécula , de enlace multiespecí fico . ' <' 1 ' Valencia: El término valencia se refiere al número , tde sitios de enlace de antigeno potenciales, esto es , dominios ' ¦ 'i! de enlace, en un polipéptido. Un polipéptido puede ser monovalente y contener un sitio de enlace de antígeno :o, !¡ un polipéptido puede ser bivalente y contener dos sitios1!; de enlace de antígeno. Adicionalmente, un polipéptido puede ser • : : : ;.! tetravalente y contener cuatro sitios de enlace de antíigejno.
Cada sitio de enlace de antígeno específicamente enlaza!1 un antígeno. Cuando un polipéptido comprende más de un sitio1' de enlace de antígeno, cada sitio de enlace de antígeno puede específicamente enlazar los mismos o diferentes , antigenos.
Así, un polipéptido puede contener una pluralidad de simios de enlace de antígeno y por lo tanto ser multivalente, un polipéptido puede específicamente enlazar los mismos o diferentes antígenos. ¡¡ Dominio V: Los dominios variables son aquellas porciones estructurales de una molécula de anticuerpo que comprenden secuencias de. residuo de aminoácido que forman los sitios de í enlace de antigeno. Una región variable ejemplar;! de inmunoglobulina de cadena ligera es la porción de ¡ una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia ¡¡' de , '? nucleótido de un polipéptido de- acuerdo con ' la presente ' 1 i invención, o su complemento, bajo condiciones severas. ¡ Alternativamente, los genes variantes ! se pu den identificar por comparación de secuencias. Dos secuencias de aminoácidos tienen "100% de. identidad de secuencia! de aminoácido" si los residuos de aminoácido 'de la,s¦ j dos secuencias de aminoácido son los mismos cuando se alinean para correspondencia máxima. Similarmente, dos secuencias ' J de nucleotido tienen " 100 % de identidad de secuencia1 II de i nucleotido" si los residuos de nucleotido de, las díos secuencias de nucleotido son los mismos cuando se alinean , ; ;! para correspondencia máxima. Las comparaciones de secuencia ( se pueden realizar usando programas de sofware estándar al como aquellos incluidos en la suite de ¦ computación ' ·' í bioinformática LASERGENE, que se produce p;or ,DNASTAR (Madison, Wis.). Otros métodos para comparar dos . secuencias enlazar específicamente a un anticuerpo anti- (polipéptido 'de acuerdo con la invención) . . .' ' por una parte central que comprende un átomo de carbono, o ¡¡ .1 una cadena de átomos de carbono, al menos uno de los cuáles comprende al menos una cadena lateral o grupo funcional: El NH2 se refiere al grupo amino presente en el , extremoj de terminal amino de un aminoácido o péptido, y COOH se refiere al . grupo carboxi presente en el extremo de terminal carboxi de un aminoácido o péptido. El aminoácido de término genérijco comprende ambos aminoácidos naturales y no naturales. ' líos aminoácidos naturales de nomenclatura estándar como 'se enlistan en J. Biol. Chem. , 243: 3552-59 (1969) y, adoptados en 37 C.F.R., sección 1.822 (b) (2) pertenecen al grupo¦ i|de aminoácidos enlistados en la Tabla 1 en la presente abajo. Los aminoácidos no naturales son aquellos enlistados e'ri la ' 1 1 Tabla .1. Los ejemplos de aminoácidos no naturales1 son 1 .·· ' 5 aquellos enlistados por ejemplo en 37 C.F.. . sección 1.822(b) (4), todos de los cuales se incorporan en la présente i ¦ ' ' 1 por referencia. También, residuos de aminoácido no naturales j 1 . |l incluyen, pero no se limitan a, residuos de' aminoácido modificados, residuos de aminoácido L, y estereoisómerós :¡ de residuos de aminoácido D. .
Tabla 1. Aminoácidos naturales y sus códigos respécti os .
Símbolos¦ Aminoácido. 1 Letra 3 Letras Y Tyr tirosina G Gly • glicina F Phe . fenilalanina M Met metionina A Ala alanina S Ser serina I Ne isoleucina L Leu leucina T Thr treonina V Val valina P Pro prolina K Lys lisina H His histidina Q Gln . glutamina E Glu. ácido glutámico W ' Trp triptofano R Arg arginina D Asp ácido aspártico N Asn asparagina C Cys cisteina Un "residuo .de aminoácido equivalente" se refiere; a¡ un residuo de aminoácido capaz de reemplazar otro residüoj de aminoácido en un polipéptido sin alterar sustancialmentd' la : i estructura y/o funcionalidad del polipéptido. Los ,aminoácidos equivalentes por lo tanto tienen propiedades similares ; j: tal I : ¦'! como' volumen de la cadena lateral, polaridad, de ; cadena lateral (polar o no polar) , hidrofobicidad (hidrofóbico o hidrofilico) , pH -(ácido neutral o básico) y organización de cadena lateral de moléculas de carbono (aromáticas/alifáticas) . Como tal, "residuos de aminoácido equivalentes" se pueden considerar como "sustituciones .,íde vi) Aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas (Asp, Glu) vii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales bás'iicas de un polipéptido para denotar proximidad ' o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada ' en el terminal carboxilo a una secuencia de referencia dentro de un : ; 1 ' ¡ , í polipéptido se ubica próxima al terminal carboxilo de , '|la secuencia de referencia, pero no necesariamente eri 1 :iel terminal carboxilo del polipéptido completo.
; ? Una "proteína de fusión" es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencia de nucleótidos de al menos dos genes. Por ejémpío, una proteína de fusión puede comprender al menos parte 'dejj un polipéptido de acuerdo con la presente invención fusionada con un polipéptido que se enlaza a una matriz de afinidad. Tal proteína de fusión proporciona un medio para asilar grandes cantidades de un polipéptido de acuerdo cp.n jj la • ' ' ' S presente invención usando cromatografía- de afinidad. » El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de) un i producto de> gen. Por ejemplo, en el caso de un ¡gen estructural, la expresión implica transcripción del \qen estructural en mARN y la traducción de mARN en uno o (mas ' ' ? J polipéptidos . , ? El término "etiqueta de afinidad" se usa en' la presente i1 para significar un segmento de polipéptido que se puede enlazar a un segundo polipéptido para proporcionar purificación o detección del . segundo polipéptido; o proporcionar sitios para el enlace del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína , para lo cual un anticuerpo u otro agente de enlace específico 'está disponible se puede usar como una etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto de poli-histidiría , proteina A (Nilsson et al., EMBO J. 4:. 1075 (1985); ???e,e?? et . al., Methods Enzymol. 198: 3 . (1991)), glutationa ;¡ S transferasa (Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988)'), etiqueta de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Nati. Ácád. ; ' ii Sci. USA 82:7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG (Hóppl'et al., Biotechnology 6: 1204 (1988)), péptido de enlace, de estreptavidina, u otro epitopo. antigénico o dominio ¡de enlace. Ver, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95 (1991). Los ADN que codifican, , ¡las • ' ''i etiquetas de afinidad están disponibles de los provedo es comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataw¡ay, N. J. ) . ¦ ' ,¡ ? Los "factores de crecimiento tipo' insulina", o los jlGF son polipéptidos con alta similitud de secuencia , a,¡! la insulina. Los IGF son parte de un sistema complejo quejlas células usan para comunicar con su ambiente fisiológico: Este sistema complejo (frecuentemente referido como el "eje" IGF) consiste de dos receptores de superficie celular (IGFLR e IGF2R) , dos ligandos (IGF-1 e IGF-2) , una familia de 'áeis proteínas de enlace IGF de alta afinidad (IGFBP 1-6), ! así como enzimas de degradación IGFBP asociadas, .referidas colectivamente como proteasas. El factor 1 de, crecimiénto tipo insulina (IGF-1) se secreta principalmente por el hígado como un resultado de estimulación' por hormona de crecimiento (GH) . El IGF-1 es importante tanto para la regulación . ¡, de fisiología normal, así como un número de estados patológicos, que incluyen cáncer. El eje IGF se ha mostrado ( ' p¦aíra desempeñar papeles en la promoción de proliferación celular y la inhibición de muerte celular (apoptosis) . El factor : 2 |j de crecimiento tipo insulina (IGF-2) se piensa que es un facitor ·! de crecimiento primario requerido para el desarrollo . temprano mientras la . expresión IGF-1 se requiere para alcanzar el crecimiento máximo. Mientras que IGF-2 pued 'e¡' ;I l,¡ser i : -í l Ü principalmente fetal en acción, es también esencial paira1! el : ; H¡ desarrollo y la función de órganos tal como el cerebro, ¦ 1 ;!¡ ¡ i i: hígado y riñon. , Las "proteínas de enlace IGF", o IGFBP, ayudan a mo :du'ílar la acción de IGF en formas de complejo. Estas implican tanto inhibir la acción IGF al prevenir enlazar al receptor IGF-1 así como promover la acción de IGF posiblemente a través de ayudar en suministrar al receptor e incrementar la vida media 1 IGF. Actualmente, hay 6 Proteínas de Enlace ' i)! IGF caracterizadas (IGFBP1-6). Hay actualmente datos significativos que sugieren que los ' IGFBP tienen' : otras funciones además de su capacidad para regular los IGF. 1 ; ;.j¡ LNR: Repetición de Notch Linl2. PAPP-A contiene '..tres de pequeñas proteínas encontradas en la sangre, normalmente circulando como zimógenos inactivos . Cuando se estimula ii por uno de varios desencadenantes, proteasas en las prpjté-ínas específicas rotas del sistema para liberar ' citocinajs e iniciar una cascada de amplificación de divisiones J adicionales. El resultado final de esta cascada .de activación es amplificación masiva de la respuesta y activación' del complejo de ataque a la membrana que mata la célula.- Por , , i' arriba de 20 proteínas y fragmentos de proteina componen ¡el para detectar la presencia de un anticuerpo o un antígenó en una muestra. La realización de ELISA implica ' al ménds un anticuerpo con especificidad .para un antígeno particular!. La muestra con una cantidad desconocida de antígeho:j se inmoviliza en un soporte sólido (usualmente una placa de microtítulo de poliestireno) ya sea no específicamente (por f medio de adsorción a la superficie) o especí ficament , ·[ (pjjor medio de captura de otro anticuerpo especificó ' al mismo antigeno, en un ELISA "de captura") . Después el antíge 'n¦o- iJse inmoviliza, el anticuerpo de detección se agrega formando así un complejo con el antígeno. El anticuerpo de detección ¡|se que no se enlazan específicamente. Después de la etapa de i ' ¦ i lavado final la placa se desarrolla al agregar un sustrato enzimático para producir una señal visible, que indica í la i : <( , · f cantidad de antígeno en - la muestra. Los ELISA más vie'jos . il utilizan sustratos cromogénicos , aunque los análisis más ' . . i; ' nuevos emplean sustratos fluorogénicos con mucha mayor sensibilidad. El " InmunoEnsayo de Enzima", o EIA, es; un sinónimo para el ELISA. ; ¦ ¡ MM = MetaloProteinasas de Matriz son en'dopeptidasas dependientes, de zinc; otros miembros de la familia (son adamalisinas, serralisinas , y astacinas. Las MMP pertenecen a una familia más grande de proteasas conocidas como'! la superfamilia de metzincina. En conjunto son .capacés; de degradar todas las clases de proteínas de matriz extracelular, pero también pueden procesar un' número '¡de. ¦ moléculas bioactivas. Se conoce que participan en ' el í ; desdoblamiento de receptores de superficie . celular,,-' iil l a liberación de ligandos apoptóticos (tal como el ligando ' FAS ) , ! í y quimiocina en/activación. Las MMP también se cree que juegan un papel importante en comportamientos celulares tal como proliferación celular, migración (adhesión/dispersió ) , diferenciación, angiogenesis, apoptosis y defensa, . , :¡ de hospedero.
Un exositio se define como 'un sitio enlazado -l al ¦i sustrato adicional en una proteasa distinta del núcleo catalítico' . Una estrategia para facilitar enlace de sustrato y desdoblamiento posterior por los MMP es a través de sitaos de enlace de sustrato secundario especializados en dominios de enlace de sustrato discretos, o módulos funcionales .'más pequeños, ubicados- fuera del sitio activo. ¦ Al agregar dominios de enlace de proteínas y módulos incrementa j la ¦ ' i afinidad de la proteinasa para sustratos particulares y . puede modificar la especificidad de la principal función '"¦ del dominio catalítico MMP, que está para desdoblar los enlaces escindib.les . Estos sitios de especificidad secundaria' se denominan "ectodominios" o "exositios". Un dominio o módulo puede mostrar múltiples sitios de enlace para ' los mismo o diferentes sustratos. Las interacciones de sustrato; con exositios pueden influenciar el comportamiento de ' una proteinasa 'en un número de formas. Los exositios . modulan y -amplían el perfil de especificidad de sustrato d& los MMP l! al como parte del sistema de degradación MMP, puede agregar ventaja competitiva a la proteinasa para degradar sustraaos particulares. De esta manera, la función de la proteinasa! se refina y se puede hacer, en general, más específica?! o eficiente. Enlace de sustrato es frecuentemente la princijpal '. ¦ ? función de módulos especializados. Así, simplicidad a trasvés del diseño modular es un concepto atractivo donde¦ la adic¡ión de módulos y dominios al dominio catalítico de ¦ proteinasa genera nueva diversidad en preferencia de sustrato. Además para atar sustratos a la enzima para potenciar ;' el : 'i ¦ 1 . ? desdoblamiento, los exositios pueden participar, ;:¡ en ¦ "preparación de sustrato" esencial antes de i; el desdoblamiento. Por ejemplo, el "desenrollado"' ubicado; de sustratos de colágeno nativo por los MMP se ha denominado actividad de helicasa triple. Los exositios también pueden •dirigir a la enzima a sustrato en tejidos o a sustrátos substrato, el enlace de exositio también impacta en . ¡¡las propiedades cinéticas de la proteinasa de otras maneras.,' |¡ Debido a la imprecisión de métodos analíticos ¡ estándares, pesos y longitudes moleculares de polímeros- se entienden por ser valores aproximados. Cuando tal valor se expresa como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, el- valor establecido de X se entenderá para ser exactos hasta +/- 20%, tal como +/- 10%, por ejemplo +/- 5%. 1 1 '· ' : \ Descripción de los Dibujos i : " í FIGURA 1. Representación esquemática de la subun dad PAPP-A. ' ¦ i ¦ I 69 . . , :, fragmento recombinante de terminal C, usada para inmunización ¦ . ' ' ' ¡i ¦ . ? (residuos 1129-1545, de PAPP-A de murino) y para selección' ¡de •fagos (residuos 1133-1547 de PAPP-A humano), se recalca.¡ ¡j i : ¦ t FIGURAS 2A-2C. Inhibición diferencial de actividad ¦ J 1 ? proteolitica de PAPP-A por anticuerpos policlonale's. ' , ·'· Figura 2A) IGFBP-4 o -5 Radioetiquetado (10 nM') ! se . , i incubó (1 h a 37 °C) con PAPP-A humano (0.1 nM) en la ausencia (carril 1 y 3) o presencia (carril 2 y 4) de ¦ anti-P 'A'P-pi-A policlonal (20 pg/mL) . El desdoblamiento proteolitico ¦' se visualizó . por SDS-PAGE seguido por autoradiografia usa doí un formador de imágenes de fósforo. Las posiciones de sustratos : . i; intactos (i) y productos de desdoblamiento de co-mig,ración (c) se indican. Figura 2B) SDS-PAGE manchado de Cóomassiéi de ¦ 1 fragmento de terminal C purificado de PAPP-A de murino1, Íque ; i : l| representa residuos 1129-1545. La proteina se. expresqj: en células 293T y purificó por etapas sucesivas de cromatografía : '. ¡í de afinidad de níquel y cromatografía de afinidad'j de heparina. Figura 2C) IGFBP-4 o -5 radioetiquetado (10 ) se digirió (1 h a 37°C) con PAPP-A de murino (0.1 nM) , erj la ausencia (carril 1 y 3) o presencia (carril 2 y ,4); de anticuerpos de pollo policlonales (80 pg/mL IgY) elevados contra el fragmento de terminal C de PAPP-A, mostrado en B.
FIGURAS 3A-3C. Inhibición de desdoblamiento de IGFBP-4 por anticuerpos scFv específicos para la terminal P¾PP- ¦ l A. i; (0.1 nM) se analizó en diferentes concentraciones de 1 PApl. ¡i Velocidades iniciales relativas, independientemente determinadas, se trazan como una función de concentracjión PACI. Todas las concentraciones se determinaron por análisis •de aminoácido (IGFBP-4 y PACI) o ELISA (PAPP-A) . Suponiendo inhibición competitiva, una constante inhibidora1 se calculó ¦ :i (Ki .= 1.2 nM ±0.1) . Figura 3D) Sensogramas que muestran . :i enlace de PACI a PAPP-A humana inmovilizada. El, PACl purificado (0.35, 0.7, 1.4, 2.8, 5.5, y 11 nM) se inyectó; en el chip a 37°C durante 120 s seguido por disociación durante 300 s. Usando un 'modelo de enlace 1:1, parámetros cinéticos se calcularon basados en ajuste global: . ka '= 4.36 x 106 M^iS"1; FIGURA 5A) Desdoblamiento por PAPP-A humano (5 nM) de un péptido sintético (5 µ?) derivado de IGFBP-4. El péptido se derivó con un par donante/inhibidor de la fluorescencia-, ¡¡ que permite la detección de actividad de PAPP-A por el incremento en. luz emitida a 420 nm, ¦ que sigue el desdoblámiénto FIGURA' 6A) Desdoblamiento de IGFBP-4 ( 0 nM) por PAPP-A humano (0.1 nM) se analizó en diferentes concentraciones;) de i ¦ :i mAb PA-1 A, y velocidades iniciales relativas se trazan domo una función ' de concentración PA-IA. Una curva de respuesta' de i: dosis sigmoidea se ajustó a los datos. FIGURA 6B) análisis similar con IGFBP-5. · ·?? FIGURAS 7A-7B. PACI no inhibe la actividad proteoliiica dé PAPP-A2. ' ¡ í ? ' ; í FIGURA 7A, desdoblamiento de IGFBP-4 (10 nM) por PAPP-A de murino (0.1 nM) durante 1 h a 37 °C en la presencia ,de 0-750 nM PACI, como se indica arriba de cada carril. FIGURA; 7B, desdoblamiento de IGFBP-5 (10 nM) por PAPP-A2 humano (aproximadamente 0.1 nM) durante 1 h a 37 °C en la presencia de 0-1500 nM PACI, como se indica arriba de cada carril. .';E1 : ¦ 1 ;í desdoblamiento proteólítico se visualizó por SDS-PAGE seguido : 1 . íj por autoradiografia . J FIGURAS 8A-8C. Trazado de PACI y PAC2 a un ion de cálcio dependiente de epitopo de PAPP-A. ' .','] J FIGURA 8A, PACI enlazado a quimeras PAPP-A;/PAPP-A2 de humano o variantes PAPP-A de humano truncadas analizadas por ELISA. La secuencia derivada de PAPP-A se muestra por barras abiertas, y se indica ausencia de enlace (-) o 'enlace; ) . FIGURA 8B, ion de calcio dependiente de enlace de PAC1¡ ('1175 nM) para inmovilizar PAPP-A demostrado por resonancia ¡' de 1 plasmones de superficie. Las muestras con o sin EDTA (HMmM) se inyectaron (120 s) seguido por disociación (180 s) (¡líneas sólidas) . La línea discontinua muestra enlace de PACI después del re-equilibrio de la célula de flujo con el ion de calcio que contiene solución amortiguadora de funcionamiento, demostrando que, PAPP-A LNR3 enlaza calcio de , forma reversible. FIGURA 8C, enlace de PACI, PAC2 , y PACb a mutantes de PAPP-A LNR3, en los cuales los residuos Asp-lk84, Asp-1499, y Asp-1502, predicen para coordinar un ion; de calcio se substituyen individualmente con alanina, analizado por ELISA. Se índica la ausencia de enlace (-) o. enlace íj ( + ) . puede ser dependiente en iones de calcio. En una modalidad la' prbteína es una enzima. : 1 !] Uno o más interactuadores de exositios pueden ser uno o " : 1 ¦? más antagonistas de exositio y/o uno o más agonistas de exositio. En. consecuencia, uno o más interactuadores' ¡i de ¦ ¦ i' exositios pueden ser uno o más inhibidores de exositio,' «y/o ¦ 1, , . i uno o más estimuladores de exositio. ' ';' En uná modalidad preferida el inhibidor de exositio resulta en la inhibición general de proteólisis de sustrato, de sustratos conocidos o desconocidos. En otra 'modalidad ¦ í preferida el inhibidor de exositio resulta. en inhibición de proteólisis IGFBP-4. En aún otra modalidad preferídaj el inhibidor de exositio resulta en estimulación de liberación de IGF. . ] La presente invención se refiere a uno o :| más generación de cualquiera de los interactuadores de exositíos descritos arriba. El método para generación de1; un interactuador de exositio puede comprender una o más etapas I 1 de: 1) PCR, 2) clonación, 3) generación de co'nstructó de ' i' ' f! ¦ : ' ; 1 , ; ;¦ .1!t- plásmido por ejemplo que comprende una etiqueta,' ¡4) En una modalidad preferida, los interactuadores de exositios de acuerdo con la presente invención tieñen': un peso molecular en el intervalo desde 100 Da hasta 1 , 000 , 000 Da, tal como desde 100 Da hasta 500 Da, por ejemplo 5,00; Da hasta 1,000 Da, tal como desde 1,000 Da hasta 1,500 Da, ;por I! ejemplo 1, 500 , Da hasta 2, 000 Da, tal como desde 2, 000 ¡jDa hasta 2, 500 Da, por ejemplo 2,500 Da hasta 3, 000 Da'', ' tíal como desde 3, 000 Da hasta 3, 500 Da, por ejemplo 3, 50:0 ¾ Da ; i s hasta 4, 000 Da, tal como desde 4, 000 Da hasta 4, ,500 Da,1 per ejemplo 4, 500 Da hasta 5, 000 Da, tal como desdé 5, 0.00 ? Da . 1 ' ' i Í ¡i hasta 5, '500 Da, por ejemplo 5,500 Da hasta 6, 000 Da,,1 ,t:al como desde 6, 000 Da hasta 6, 500 Da, por ejemplo 6, 500,! Da hasta 7, 000 Da, tal como" desde 7, 000 Da hasta 7, 500 Da >ipor ejemplo 7, 500 Da hasta 8, 000 Da, tal 'como desde 8, 000ll Da hasta 8, 500 Da, . por ejemplo 8,500 Da hasta 9,!0Ó0 Da, ..¡tal . M i como desde 9, 000 Da hasta 9, 500 Da, por ejemplo 9, 5003 Da : : i| hasta 10,000 Da, tal como desde 10, 000 Da hasta .20, 0,00 ,»Da, por ejemplo 20, 000 Da hasta 30, 000 Da, tal como desde 30, 0C0 Da hasta 40, 000 . Da, por ejemplo 40, 000 Da hasta 50, 000, ¡Da, tal como desde 50, 000 Da hasta 60,000 Da, por ejemplo 60, 000 Da hasta '70, 000' Da, tal como desde 70, 000 Da hasta ! 80^ 000 Da, por ejemplo 80, 000 Da hasta 90, 000 Da-, tal como ! desde 90,000 Da hasta 100, 000 Da, por ejemplo 100, 000 Da ; hasta 150, 000 Da, tal como desde 150, 000 Da hasta 200,000 Da, por ejemplo 200, 000 Da hasta 250, 000 Da, tal como desde 2501, 000 Da hasta 300, 000 Da, por ejemplo 300, 000 Da hasta 350;, 000 Da, tal como desde. 350, 000 Da hasta 400, 000 Da, por ejemplo 400, 000 Da hasta 450, 000 Da, tal como desde 450, 000 Da hasta 500, 000 Da, por ejemplo 500, 000 Da hasta 550, 000 Da,¡¡ tal 78 ¦ '¦ :, como desde 550, 000 Da hasta 600, 000 Da, por ejemplo 60.0,0,00 Da hasta 650,000 Da, tal como desde 650,000 Da hasta 700,000 i, r Da, por ejemplo 700,000 Da hasta 750,000 Da, tal como desde 750,000 Da hasta 800, 000 Da, por ejemplo 800,000 Da ,'liasta 850, 000 Da, tal como desde 850,000 Da hasta 900,000 Da,: por í ejemplo 900,000 Da hasta 950,000 Da, tal como desde 950,000 i , Da hasta 1,000,000 Da. ' [ ¡; i! ; ; ; ; |; PAPP-A ; - ¦ —:— : : i La presente invención también se refiere a la protelina I ; í PAPP-A o secuencia de . ADN que comprende los exo^itiios naturales de PAPP-A o cualquier variante de los exdsitj!ios PAPP-A descritos en otra parte en este documento. ] La secuencia humana de PAPP-A se denomina SEQ ID NO': 1,1. La secuencia humana de PAPP-A (SEQ ID NO: 1 ) es: ' ¦ j! EARGATEEPS PPSRALYFSG RGEQLRVLRA DLELPRDAFT . ' , ií ' ' í LQVWLRAEGG QRSPAVITGL YDKCSYISRD RG VVGIHTI SDQDNKDPRY FFSLKTDRAR !. i QVTTINAHRS YLPGQWVYLA ATYDGQFMKL YVNGAQVATS GEQVGGIFSP LTQKCKVLML 1 ' j GGSALNHNYR GYIEHFSLWK VARTQREILS DMETHGAHTA LPQLLLQENW DNVKHAWS M ¡ í1 ¦ ¦ f KDGSSPKVEF SNAHGFLLDT SLEPPLCGQT LCDNTEVIAS YNQLSSFRQP KVVRYRVVNL ' | YEDDHKNPTV TREQVDFQHH QLAEAFKQYN IS ELDVLEV SNSSLRRRLI LANCDIS IG ' ; DENCDPECNH TLTGHDGGDC RHLRHPAFVK KQHNGVCDMD CNYERFNFDG GECCDPEITN ' · ;¡ VTQTCFDPDS PHRAYLDVNE LKNILKLDGS THLNIFFAKS SEEELAGVAT WPWDKEALMH "{ LGGIVLNPSF YGMPGHTHTM IHEIGHSLGL YHVFRGISEI QSCSDPCMET EPSFETGDLC , > NDTNPAPKHK SCGDPGPGND TCGFHSFFNT PYNNFMSYAD DDCTDSFTPN QVARMHCYLD :! LVYQGWQPSR KPAPVALAPQ VLGHTTDSVT LEWFPPIDGH FFERELGSAC HLCLEGRILV ! : QYASNASSPM PCSPSGHWSP REAEGHPDVE QPCKSSVRTW SPNSAVNPHT VPPACPEPQG CYLELEFLYP LVPESLTIWV TFVSTDWDSS GAVNDIKLLA VSGKNISLGP QNVFCDVPLT . ;i IRLWDVGEEV YGIQI YTLDE HLEIDAAMLT STADTPLCLQ CKPLKYKWR DPPLQ DVAS ILHLNRKFVD MDLNLGSVYQ YWVITISGTE ESEPSPAVTY IHGRGYCGDG IIQKDQGEQC DDMNKINGDG CSLFCRQEVS FNCIDEPSRC YFHDGDGVCE EFEQKTSI D CGVYTPQGFL DQWASNASVS HQDQQCPGWV I IGQPAASQV CRT VIDLSE GISQHAWYPC TISYPYSQLA QTTFWLRAYF SQPMVAAAVI VHLVTDGTYY GDQ QETISV QLLDTKDQSH DLGLHVLSCR ' .| NNPLIIPVVH DLSQPFYHSQ AVRVSFSSPL VAISGVALRS FDNFDPVTLS SCQRGETYSP I i | AEQSCVHFAC EKTDCPELAV ENASLNCSSS DRYHGAQCTV SCRTGYVLQI RRDDELIKSQ' ' , ·j; TGPSVTVTCT EGKWNKQVAC EPVDCSIPDH HQVYAASFSC PEGTTFGSQC SFQCRHPAQL ' 1 '?' KGNNSLLTCM EDGLWSFPEA LCELMCLAPP PVPNADLQTA RCRENKHKVG SFCKYKCKPG ! ¦ ¦' !¡ YHVPGSSRKS KKRAFKTQCT QDGSWQEGAC VPVTCDPPPP KFHGLYQCTN GFQFNSECRI |! KCEDSDASQG LGSNVIHCRK DGTWNGSFHV CQEMQGQCSV PNELNSNLKL QCPDGYAIGS ¦ i , j EGATOSCLDHN SESIILP NV TVRDI PH LN PTRVER VCT AGLKWYPHPA LIHCVKGCEP ! : { FMGDNYCDAI NNRAFCNYDG GDCCTSTVKT KKVTPFPMSC DLQGDCACRD PQAQEHSRKD LRG SHG ' ¦ ¦!( Las variantes de la SEQ ID NO:l se describen en- oitra parte en este documento. 1 '![ En otra modalidad la invención se refiere a PAPP-'A Jcon funcionalidad LNR comprometida. La funcionalidad ¡ LNR comprometida comprende funcionalidad LNR3 comprometida. ; « La presente invención también, se refiere al uso: 'dé' la 1 : f secuencia PAPP-A con o sin cualquiera de las .variantes^ de secuencia de exositios PAPP-A antes mencionadas., para • i1 generación de uno o más anticuerpos. !' f La presente invención también se refiere al uso de la secuencia PAPP-A con o sin cualquiera de las variantes de La numeración es de acuerdo con Kristensen et ¡ a'l . (1994), Biochemistry 33: 1592-8. (PMID: 7508748) . i""1! Las variantes de la SEQ ID NO:'2 parte en este documento.
La presente invención también se secuencia de exositios PAPP-A y cualqu de secuencia de exositios PAPP-A an generación de uno o más anticuerpos.
La presente invención también se refiere al uso :de'¡ la secuencia de exositios PAPP-A y cualquiera de las variantes La presente invención también se refiere al uso de\ la secuencia de exositios PAPP-A y cualquiera de las variantes ' 1 1 de secuencia de exositios PAPP-A antes mencionadas ; Fara generación de uno o más péptidos sintéticos capaces!! de interactuar con los exositios PAPP-A. ¦ ' I,''! . ' ¦ , ; : .¡i La invención se refiere además a un fragmento de ilaijSEQ ID NO:l que comprende SEQ ID NO: 2. Este fragmento comprende ' ; ' desde menos de 1547 residuos de aminoácidos consecutivos de • . ¦ i.
SEQ ID NO:l, tal como menos de 1530 residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos de 1510 residuos \ de aminoácidos consecutivos, tal como menos de 1490 residuos de ¦ !? aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos de 1470 residuos ; ! 1 ; de aminoácidos consecutivos, tal como menos de 1450 résiduos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos de 1430 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como menos de i 1410 : ¦ i residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos , (¡ de 1390 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como menos de ' ¡' ' ;i 1370 residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo ! menos de 1350 residuos de aminoácidos consecutivos, tal come menos de 1330 residuos de aminoácidos consecutivos, :por ejemplo menos de 1310 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como menos de 1290 residuos de aminoácidos consecutivos,/ 'ipor ejemplo menos de 1270 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como menos de 1250 residuos de aminoácidos consecutivos , por ejemplo menos de 1230 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como menos de 1210 residuos de aminoácidos consecutivos, por . ejemplo menos de 1190 residuo's'í de i aminoácidos consecutivos, tal como menos de 1170 residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos de 1150 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como menos de 1130 residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos de; , 1,1110 residuos de aminoácidos consecutivos , tal como menos dé 1090 residuos de aminoácidos consecutivos,' por ejemplo ménoá de 1070 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como menojs de 1050 residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos 33 de 1030 residuos de aminoácidos consecutivos, tal1 como menos de 1010 residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos de 990 residuos de aminoácidos consecutivos,' tal' como ! : í menos de 970, por ejemplo menos de 950 residuos j|de aminoácidos consecutivos, tal como menos de 930 residuos'ide residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos: de 150 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como meno-á de 130 residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo . menos de 110 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como¦ menos ' ' ¦ i ¦ ' : ¦ 1 r ! ' exositios PAPP-A comprenden uno o más fármacos de mol,écjula ; 1 ? pequeña . i En una modalidad el uno o más interactuadores¦ |¡ de exositios PAPP-A comprenden uno o más anticuerpos;! o : 'i! fragmentos de los mismos. i Aún en otra modalidad los interactuadores de exositios PAPP-A comprenden una o más proteínas. Una o más proteínas ' I pueden ser ya sea proteínas sintéticas y/o naturales. En ótra modalidad los interactuadores de exositios PAPP-A comprenden uno o más péptidos. Uno o más péptidos pueden ser ya ¡sea péptidos sintéticos y/o naturales. ¦ ' ;! En una modalidad preferida los interactuadores ;de exositios PAPP-A resultan en inhibición parcial o completa !¡de la actividad de PAPP-A hacia sustratos conocidos ;' o desconocidos. En otra modalidad preferida los interactuadores de exositios- PAPP-A resultan en inhibición de la actividad !: de PAPP-A hacia su sustrato IGFBP- . En aún otra modalidad , j , i, preferida los interactuadores de exositios PAPP-A resultan en la inhibición de la actividad de PAPP-A hacia ¦ IGFBP-4 (inhibición completa), y a una extensión menor .hacia IGFB¡P-5 ' ¡i (inhibición parcial) . ' ? '' La presente, invención se refiere además al uso ¡i de ' : 1 cualquiera de los interactuadores de exositios ' PAP;P-A ; . i! descritos arriba para uso como un medicamento. ¡ , j ¦ ¦ ' :i La presente invención también se refiere a métodos, £ara generación de un interactuador de exositios PAPP-A descrito arriba. El método para generación de un interactuador! de ; : i exositios PAPP-A puede comprender una o más etapas de:} 1) PCR, 2) clonación, 3) generación de constructo de plásmido por ejemplo, que comprende una etiqueta, 4) expresión^ de proteína en por ejemplo mamífero, bacteria o células1' de levadura, 5) expresión y purificación de proteína. i La. presente invención también se refiere a métodos para identificación de un interactuador de exositios PAPP-A, j; y/o exositios PAPP-A. El interactuador de exositios PAPP-Á; puede ser un agonista o antagonista de · exositios . En una modalidad la identificación de interactuadores de exositios comprénden separación por exclusión de colecciones de fago ^semi- 1 ' j sintéticas . .. · ; ' .« En otra modalidad la invención se refiere a¦ un método ¦ "I para modular la actividad de PAPP-A tal como inhibición1 o í estimulación de PAPP-A. La presente invención también ,1 se 1 " 1 refiere¦ a modulación de la producción de PAPP-A por ejemplo por el uso de miARN (microARN) o siARN (pegueña interferencia de ARN) . ' ' 1 '! En una modalidad preferida, los interactuadores ( « de ; ¦ I exositios PAPP-A de acuerdo con la presente invención tienen ¡i un peso molecular en el intervalo desde 100 Da há'sta 1,000,000 Da, tal como desde 100 Da hasta 500 Da, por ejemplo ' ? 500 Da hasta 1,000 Da, tal como desde 1,000 Da hasta 1 ,,500 Da, por ejemplo 1,500 Da hasta 2,000 Da, tal como, desde 2, 000 Da hasta 2,500 Da, por ejemplo 2,500 Da hasta 3,000 Da, tal como desde 3,000 Da hasta 3,500 Da, por ejemplo 3,50o1;. Da : : , : l¡ i hasta 4, 000 Da, tal como desde 4, 000 Da hasta 4,500 Da, jpor ejemplo -4,500 Da hasta 5,000 Da, tal como desde 5,000;¡ Da : ' i hasta 5,500 Da, por ejemplo 5,500 Da hasta 6,000 Da, tal como i desde 6,000 Da hasta 6,500 Da, por ejemplo 6,500 Da hasta : ¦ Í 7, 000 Da, tal como desde 7,000 Da hasta 7, 500 Da,, por ejémpló 7, 500 Da hasta 8, 000 Da, tal como desde 8, 000 Da .hasta : 8.] 500 ! , ¡í 92 ' ; !¦ :|: ; I molécula pequeña está interactuando con los exositiós ¦ ¡' de . ¦ r ; '( PAPP-A (SEQ ID NO: 2) o cualquier variante del mismo descrita en cualquier parte en este documento. Estas interacciones i ' ¦;; pueden ser dependientes en iones de calcio. ; } La presente invención se refiere además a un método , para el desarrollo de uno o más fármacos de molécula pequeña 'c¡ue interactúan con los exositiós de PAPP-A (SEQ ID N0:,2)f o cualquier variante del mismo, descrita en cualquie partier en este documento o con LNR3 de PAPP-A o con otro fragmento! de PAPP-A. Este método puede comprender una selección , de compañeros de interacción que requieren la presencia de iones de calcio. ': J La presente invención- también se refiere al uso de¡ uno o más fármacos de- molécula pequeña que interactúan con ¦'los : . ;, : i; exositiós de PAPP-A (SEQ ID NO.: 2) o cualquier variante ¦ [del mismo descrita en cualquier LNR3 de PAPP-A ó con otro medicamento .
La presente invención se aglutinantes para PAPP-A, los PACI y PAC2 en PAPP-A. Las obtener interactuadores PAPP-A tal como un inhibidor ¡son en una modalidad basada en elución especifica por interrupción d enlace de calcio. El fragmento de terminal C de PAPP-Á en ¦ mamíferos, más preferiblemente humanos. En cier¡tas modalidades preferidas, la molécula pequeña es un fármaco.
Preferiblemente, aunque no necesariamente, el fármaco, es ¡uño que ya se ha considerado seguro y efectivo para usar ' én¡' el 1 I cuerpo por la agencia gubernamental adecuada. Por- ejemplo, i¡ los fármacos .para uso humano enlistados por la FDA bajó ¡las ' i secciones 21 C.F.R. 330.5, 331 hasta 361, y 440 hasta 1 ;4<60 ; fármacos para uso veterinario enlistados por la FDA bajo 1 'ijlas secciones 21 C.F.R. 500 hasta 589, incorporadas h; la presente como referencia, todas se consideran aceptables! p¡ara usar de acuerdo con la presente invención. . , ;·, i En una · modalidad preferida, los fármacos de molécula : . ? ! , i: pequeña que interactúan con los exositios de PAPP-A (SÉQ|; ID i ' I' NO: 2) o cualquier variante del mismo descrita en cualquier t Da, tal como desde 600 Da hasta 650 Da, por ejemplo 650 !: Da hasta 700 Da, tal como desde 700 Da hasta 750 Da, por ejemplo, 750. Da hasta 800 Da, tal como desde 800 Da hasta 850 D¿r; 'por j 97 I , ;!; 98 · ; ; i, aminoácidos de la CDR, o al menos 17 residuos de aminoácidos, por ejemplo al menos 16 residuos de aminoácidos, o al. meíios 15 residuos de aminoácidos, por ejemplo al menos- 14 residuos ? de aminoácidos, o al menos 13 residuos de aminoácidos, ¡por ejemplo al menos 12 residuos de aminoácidos, o al menos'1 11 residuos de aminoácidos, por ejemplo al menos 10 residuos!! de aminoácidos de la región CDR hipervariable del anticuerpo J En una modalidad, cuando al menos 18 residuos de aminoácidos de la región CDR se conservan, entonces; 1 la secuencia de aminoácido restante de anticuerpos tal ? como i i ¡i ;!!! PACI, PAC2 y PAC5 (como se describe más adelante) o cualquier otro anticuerpo PAPP-A o cualquier otro anticuerpo ¡, de exositio puede tener al menos 99.9% de identidad de seouerícia de aminoácido al anticuerpo, o al menos 99%, por ! ej emplojj al menos 98%, o al menos 97%, por ejemplo al menos 96%,; j¦ oj al menos 95%, por ejemplo al menos 94%, o al menos 93 % j- por ejemplo al menos 92%, o al menos 91%, por ejemplo ali ¡menos 90%, o al menos 89%, por ejemplo al menos 88%, o al menos 87%, por ejemplo al menos 86%, o al menos 85%, por ejemplo al M: ¡ t menos 84%, o al menos 83%, por ejemplo al menos, 82%; : o|t al menos 81%, por ejemplo al menos 80%, o al meno's 79%i¡ ! jipor i' ejemplo al menos 78%, o al menos 77%, por ejemplo al! menos 76%, o al menos 75%, por ejemplo al menos 74%, o al: ¡menos 73%, por ejemplo al menos 72%, o al menos 71%, por ejemplo al 99 . ¦ ¦{ !s menos 70%, o al menos 69%,- por ejemplo al menos 68% ;o: al menos 67%, por ejemplo al menos 66%, o al menos 65%,; por ejemplo al menos 64%, o al menos 63%, por ejemplo al menos ¦ · i -: i í 62%, o al menos. 61%, por ejemplo al menos 60%, o al menos 58%, por ejemplo al menos 56%, o al menos 54%, por ejemplo! al menos 52%, o al menos 50%, por ejemplo al menos. 48%, ¡ ; o ¡' al menos 46%, por ejemplo al menos 44%, o al menos 42%,: por ejemplo al menos 40%, o al menos 38%, por ejemplo al, menos 36%, o al menos 34%, por ejemplo al menos 32%, o al i.méjnos 30%, por ejemplo .al menos 28%, o al menos 26%, por 1 ej emp'loj al menos 24%, o al menos 22%, por ejemplo al menos 20%,¡ o al i f menos 18%, por ejemplo al menos 16%, o al menos 14% ¡por f ejemplo al menos 12%, o al menos 10%, por ejemplo al; me'nos 8%, o al menos 6%, por ejemplo al menos 4%, o al menos; 2% o al menos 0.5% de identidad de secuencia al anticuerpo !:¡ ó un ortólogo del mismo. ; . j En un aspecto la presente invención proporciona polipéptidos aislados que tienen una identidad de sequéh'cia sustancialmente similar, a los anticuerpos de acuerdo con la presente invención, tal como PACI o PAC2, o un ortólogo del mismo . 1 ! El término "identidad de secuencia sustancialmente similar" se usa en la presente para significar polipéptidos que' tiene al menos 70%, tal como al menos 72%, por1 ejemplcl' al A que causan la inhibición general de uno o más sustratos fisiológicos de PAPP-A al dirigir a un sustrato .que .enl'aza exositios PAPP-A. 1 : I La presente invención también se refiere al' ' enla'c1é'í? de PACI y PAC2. a exositios PAPP-A que causan ¦ inhibición diferencial de. dos. ? más sustratos fisiológicos de PAPP-A al dirigir a un sustrato que enlaza exositios PAPP-A.: ' En aún otra modalidad preferida, el enlace de PACÍ y i I i; PAC2 a PAPP-A causa la inhibición ' completa de desdoblamiento ; . . J ,: : i Las variantes de la SEQ ID NO: se describen en otra parte en este documento. j ' j; En un aspecto la presente invención proporciona polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia sustancialmente similar a los anticuerpos de acuérdo con la presente invención, tal como PAC5, o un ortólogo del mismo .
El término- "identidad de secuencia sustancialmente similar" se usa en la presente para significar polipéptidos ¦ ; i i, que tienen al menos 70%, tal como al menos 72%, por e'jlemplo al menos 74%, tal como al menos 76%, por ejemplo al! menos 78%, tal como al menos 80%, por ejemplo al meno's 82%, Ítal como al menos 84%, por ejemplo al menos 86%, tal como i al : I menos 88%, por ejemplo al menos 90%, tal como al . meno'sj ?l%, por ejemplo al menos 92%, tal como al menos' 93%, por éjjemplo ¦! i i al menos 94%, tal como al menos 95%, por ejemplo al! íme'nos 96%, tal como al menos 97%, por ejemplo al menos 98%;, , ¡tal ' i : 1 ' ! ;t i'! , ! como al menos 99%, o mayor que 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 7 o un ortólogo del mismo. ' , , i La presente invención se refiere además al uso,jj de anticuerpos específicos PAPP.-A para uso como un médicamente .
: · ' ! ; ,! La presente invención también se refiere al uso de1 PAC5 para uso como un medicamento. La presente invención también se refiere a métodos para generación de PAC5. El método para generación de PAC5 puede comprender una o más etapas !de:!1 1) Kit de partes ' ' ¡ En una modalidad preferida la presente invención se ; ¦ . { ¡ i ¦ , ¦ . ' ¦ !?· refiere a un kit de partes que comprende uno p1. más interactuadores de exositio. ' j¡ En otra modalidad la presente invención se refiere,' ai; un kit de partes que comprende uno o más inhibidorejs i de-exositio . \ l t En otra modalidad la presente invención se refierei a¡: un ; < ' ?, kit de partes que comprende uno o más estimuladores, i de exositio . , ' : .!; ' ! i: -í En una' modalidad preferida la presente invenciónj se refiere a un kit de partes que comprende uno · ¡o, ;¡:más interactuadores de exositios PAPP-A.
En una modalidad preferida la presente invenciónÍ se ; ! ! refiere a un kit de partes que comprende uno k¾ |jmás inhibidores de exositios ????-?. | -f :¡ En una modalidad preferida la presente invenciónj! se refiere a un kit de partes que comprende uno jó' Imás estimuladores de exositios PAPP-A. < \ ·> En otra modalidad la presente invención se refieríe" a un kit de partes que comprende PACI y/o PAC2. ' I¦¦¦ '¡ Aún en otra modalidad la presente invención se refie're a un kit de partes que comprende una o más variantes dev PACI ' "kit de partes" descrito en la presente i para :j: la administración a un individuo que necesite del mismo. ' ?· ií 109 ; i.' . :' 1 , ? Anticuerpos ,' < f Es un aspecto de la presente invención proporcionar ; ' 'i' anticuerpos o equivalentes funcionales del , mismo específicamente reconociendo y enlazando un epítopo en SEQij ID N0:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o un homólogo funcional del mismo. El epítopo puede ser cualquiera de 'los epítopos mencionados en la présente abajo. ; ; '¦ i' , ' i! El anticuerpo o equivalente funcional del mismo j pu;ede I ser cualquier anticuerpo conocido en la técnica, por ejemiplo c , un anticuerpo policlonal o un monoclonal derivado 'd !e'! un método convencional por ejemplo los métodos indicados' en antígeno, y un residual de otro fragmento (que se denomina pFc'). Los fragmentos adicionales pueden incluir diacuerp s, metodología de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica de hibridización de célula, somática ¦ ' i1 estándar de Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975). Aunque los procedimientos de hibridización de célula somática , ¦ i '! 5, 545, 807 a Surani et al.; WO 98/24884, O 94/25585, !; WO ' '¦ '; :( 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 y WO 01/09187. : ¡ { ; ' ! ! ¡I El -ratón KM contiene un transcromosoma de cadena ip.esada control transcripciónal y translational dentro 'del !vector sirve a su función prevista de regular la transcripción y translation del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula hospedera de expresión, usada.¡j, El ? gen de anticuerpo de cadena ligera y el gen de anticuerpo;! de i ¦ ! i i 'i cadena pesada se puede insertar en vectores separados o^. más típicamente, ambos en genes se insertan en el mismo vectprji de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el ?v !e¦ cítor de expresión por métodos estándar (por ejemplo, ligaduraí de sitios de restricción complementarios en el fragmento! y vector de gen de anticuerpo, o ligadura de extrem ,os ·¦ en ip-u- n¦!tas romas si no se presentan los sitios de restricción) .1 iLas : ! 1 í regiones variables de cadena ligera y pesada de' ¡los . i ! !- !l anticuerpos descritos en la presente se puede usar,paraj jCtfear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier ijstotjipo de anticuerpo al insertarlos en los vectores de expresión^ ya que codifican regiones constantes de cadena ligera1 y constante de cadena pesada del isotipo deseado tal quej! el i : ?! segmento VH se liga operativamente a los segmentos CH ¡derttro : r , ¦ i! del vector ' y el segmento VL se liga operativamente ! al ,.¡; j segmento CL dentro del vector. Adicionalmehte '!¡ o alternativamente, el vector de expresión recombin ¦ante ¡1 u'puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción 'de la cadena de anticuerpo de una célula hospedera. El gen,' de cadena de anticuerpo se puede cloner en el vector tal ^que! el péptido de señal se liga en marco a la terminal amino deljgen etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresijóñ. de célula hospedera de mamífero incluyen elementos virales , ;que dirigen niveles altos de expresión de proteína en células] de mamífero, tal como promotores y/o aumentadores de ¦¦riv-adi-oLs:!?' de i : , biespecificas de la invención comprenden como ¡ ; ¡juna sencilla o pueden comprender al menos dos moléculas de. 'cadena sencilla. Los métodos para preparar moléculas bi-¡¡ y multiespecíficas se describen por ejemplo en US 5, 260, 2,03;j! US 5,455,030; US 4,881,175; US 5,132,405; US 5 , 091, 513; ! US 5,476,786; US 5,013,653; US 5,258,498; y US 5,482,858. i¡!r -ji ' 1 : En enlace de las moléculas multiespecí ficas y biespecíficas a sus objetivos específicos puede confnr'marse por el ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA),;1 un por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoas.says, antigeno. De esta manera, los residuos FR pue|den ¦ i- '\ seleccionarse y combinarse de las secuencias receptora|S e expresión que contiene un operon con una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo complementario; ¡en! la : ? ? '? pesada como ligera. . Las secuencias codificadas:, par!a¡t ;¡las cadenas .ligera y pesada pueden comprender cADN o ADN genpm co o ambos . ' 1 <) La célula hospedera usada para expresar el 1 anticuerpo : ¦ ? ; alterado de la invención puede ser ya sea una célula tetravalente durante la dimerización . ¡ : i Alternativamente las quimeras pueden obt nerse¡i por ligadura de las dos moléculas de proteina/polipéptido juntas : ! !: por- métodos conocidos para personas experimentadas !énj la técnica. ¡ ;: ¡ I Polipéptidos Métodos generales para la producción de polipéptidos) de acuerdo, con la presente invención ¡ ; >' Un polipéptido con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, S;EQ: ID ' 1.64 ' para introducir genes clonados de acuerdo con la . prléserite (Invitrogen Corporation; Carlsbad, Calif.), o baculovirus gp67 ( PharMingen : San Diego, Calif.) puede' usarse ; jj en constructos para reemplazar secuencias de señal secretaras nativas . .¦ ¡ i1 ' i ' : ;i El virus o bacmido recombinante se usa para 'trañsfe'ótar células hospederas. Las células hospederas de inséctos Expression Protocols, Murray (ed. ) , páginas 1 ,7 168;· ¡(The Humana Press, Inc. 1991), por Patel et al., "The baculóv rus ' I 179 ". ', }¦ tal como menos de 1130 residuos de aminoácidos cohsecu;tiv¡os , : ¡ ¦ ?; por ejemplo menos de 1110 residuos de aminoádijdos consecutivos, tal como menos de 1090 residuos de aminoáeij.dos consecutivos, por ejemplo menos de 1070 residuos ¡[ de residuos de aminoácidos consecutivos, tal como menos :deMl70 residuos de. aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos; de 150 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como meri'os ' de residuos de aminoácidos consecutivos , tal como 16 lo i ¡más i , residuos de aminoácidos consecutivos , por ejemplo 18 : 9 : ¡más í !¦, : residuos de- aminoácidos consecutivos , tal como 20 Q 'más residuos de aminoácidos consecutivos , por ejemplo 22 ! i?- 'más r residuos de aminoácidos consecutivos , tal como 24 9 ¡más ' - residuos de ¦ aminoácidos consecutivos , por ejemplo 26 o imas residuos de aminoácidos consecutivos , tal como 28 o I ;más residuos de aminoácidos consecutivos , por ejemplo 30 ¦ o mas í f j residuos de aminoácidos consecutivos de la SEQ ID. NO: 1 ¡ En una¦ modalidad, el polipéptido de acuerdo '. con SEQ ID i * ¦< 190 ! "¦ i. por ejemplo menos dé 305 residuos de aminoácidos de 200 residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo i¦ : í menos de 195 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como I í - ' i i; ¡I residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo 10, o'ímás residuos de aminoácidos consecutivos, tal como 12 ,o i más residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo 14, ¡o(!más residuos de aminoácidos residuos de aminoácidos li i-residuos v I de aminoácidos o,; ! Ima s residuos de aminoácidos residuos de aminoácidos mas residuos de aminoácidos residuos de aminoácidos residuos de aminoácidos mas residuos de aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 3^ La presente- . invención también contempla moléculas' de J ácido nucleico variantes que pueden identificarse Usando ¡'dos criterios: a) una determinación de la identidad o ¦ ' si.mil'¡jli?!jtud 1 I ' ' P entre un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido!! de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID: NO:!' 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7, y b) un ensayo de hibridación llevado bajo condiciones severas. Por eje.mplo, ciertas variantes del gen comprenden polinucleótidó , que permanecen hibridizados con un polinucleótido que codifjicai un polipéptido de acuerdo con la presente invención, taí:' cjomo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID^NO: 4, [SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7, o un complemento dej. de tal . polinucleótido, siguiendo el lavado bajo condiciones,:' de lavado estrictos, en los cuales la exigencia es equivalente a I ! ¡; I 0.5 X hasta 2 X SSC con SDS al 0.1% a 55°C hasta ; :65;!°C . de espacios introducidos en la secuencia más larga con ¡objeto de alinear las dos secuencias]) x (100). ; :i Aquellos expertos en la técnica apreciarán que j; hay ¡¦ i I' iS registro más alto. Si existen diversas regiones con registros mayores que el valor de "corte" (calculado por una fórmula azufre está sustituido por un aminoácido que contiene azuf're, en donde un aminoácido que contiene hidroxi está sustituido por un aminoácido que contiene hidroxi, en donde , un aminoácido ácido está sustituido por un aminoácido ácido, ,i en donde un aminoácido básico está sustituido por un aminoácido básico,, o en donde un aminoácido monocarboxílico dibásico está sustituido por. un aminoácido monocarboxílico dibásico! Ausubel (1995) en las páginas 810 hasta 822; y McPhe¡rson (ed.), Directed Mutagénesis: A Practical Approach! (I 1991) ) .
Los polipéptidos de acuerdo con la presente i ¦ como se describe por Stemmer, Nature 370:389 (1994) , Stemmer, ! : ,¡ tí Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994) , y Publicación Internacional No. WO 97/20078. Brevemente, las molécula^ de células hospederas y procesarse por secuencia rápidamente ; j; usando equipo moderno. Estos métodos permiten :t la determinación rápida de la importancia ' de residuos ¦ ' ? ' individuales de aminoácidos en un polipéptido de interés;; y eliminación o . codones de paro para especificar la producción de un - fragmento deseado. Alternativamente, los., particulares de un gen de acuerdo con la presente La presente invención también contempla fragmentos funcionales de un polipéptido de acuerdo con la presente ¦ i: invención que tiene una o más sustituciones de ' aminoácjido, La presente invención también proporciona fragmentaos de anticuerpo cuando la proteína completa se usa cómo i un mmunogeno. Los péptidos que portan epitopo inmunog?ei.niícos pueden identificarse usando métodos estándares; (ver1 'l'por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nat'l 'Acad. Sci. USA 81:3998 ' ' i' (1983) ) . por ejemplo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3> ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:' 6 o SEQ ID NO: 7. ; , Tales péptidos y; polipéptidos que portan epítopo ; ueden producirse al fragmentar un polipéptido de acuerdo !coh¡ la A pesar de la. secuencia de nucleótido particular! d,e un gen variante de. acuerdo con la presente invención, ¡e.'litgen codifica un polipéptido que' puede caracterizarse porj! su capacidad para enlazarse específicamente a un ; anticuerpo capaz de enlazarse específicamente por ejemplo á la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID' NO: 4,: SEQ!lDj!NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7. , ' '; Glover and Hames (Eds.), páginas 15 58 (Oxford Univérsity Press 1995). Además, están disponibles los sistem 1as'j;' de expresión comercialmente disponibles. Por ejemplo, el sistema de purificación de proteina Xa PINPOINT (Promega Corporación; i' Madison, Wis.) proporciona un método para aislar una próteína de fusión que comprende un polipéptido que se ¡ vdelve M ' i' extremo de terminal amino de la secuencia IgG, y un péptido de señal que se une covalentemente a porción de polipéptido de acuerdo con composición farmacéutica que incluye un, pórtlador ! I i¡ farmacéuticamente aceptable y un interactuador de exbsitio como geles para aplicarse intranasalmente . Las formula,C;ipn'es ; ¦ l para administración parenteral también pueden incl,uir . I; glicocolato para administración bucal. ¦ ; i ' i! Tratamiento de enfermedades í La señalización. IGF dirigida se piensa que es alt.ame'nte 'relevante en la enfermedad humana, notablemente en ! la 217 ; ;· ?|: más de los. interactuadorés de exositios descritos 1 enií la ; '. · ¡i presente invención tal- como interactuador de exositios PAPP- .·; ¦ 5 Carcinoide, Carcinoma de. Linfoma del Sistema Nervioso Central i Primario, Desconocido Primario, Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, Cáncer Cervical, Cáncer en la Niñez, Leucemia , ¦ l Linfocitica Crónica, Leucemia Mielogenosa Crónica, Trastornos Mieloproliferativos Crónicos, Cáncer, de Colon, Linfoma! de Célula T Cutánea, Cáncer Endometrial, Ependimoma (taÍ1 como Ependimoma en la Niñez), Cáncer Esofágico, Familia de Ewing de Tumores, Tumo 'r d'e Célu'la Germinal Extracranial (ta¡lHcomo¦ ¦ ¦ 1 í Metastático con Síndrome de Neoplasia Endocrino Múltiple, Primario Oculto (tal como que se presenta en 'la niñez), Mieloma Múltiple/Neoplasma de Célula de Plasma, Micosis 221 . ' . :. , Fungoide, Síndromes Mielodisplásticos, Enfermedades ! i: i j: ¦ ? Mielodisplásticas/Mieloproliferativas, Mieloma (tal ¦ c mo' ' í > Mieloma Múltiple) , trastornos mieloproliferativas crónicjos, Cáncer de la Cavidad Nasal y del Seno Paranasal, Ciáricer Nasofaríngeo, Cáncer Nasofaríngeo (tal como •C 'án 1cer Nasofaríngeo en la Niñez), Neuroblastoma , Cáncer Orofarírigeo, Osteosarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno del Hueso, Cárícer de Ovarios (tal como Cáncer de Ovarios en la Niñez) , ¡Cjánjcer l' Epitelial de Ovarios, Tumor de Célula Germinal de Ovarios, i' Tumor Potencial Maligno Bajo de Ovarios, Cáncer Pancreático, ¦ i Cáncer Pancreático, Cáncer del Seno Paranasal- y Cavidad i' ¡ i Nasal, Cáncer Paratiroide, Cáncer del Pene, Feocromocitqma, < ; i Tumores Neuroectodérmicos Primitivos de Pineoblastpma' y Supratentorial , Tumor de la Pituitaria, Blasdoma . !" ¦( Pleuropulmonar, Cáncer de Próstata, Cáncer de 1 Célula' !¡ de Transición del Uréter y Pelvis Renal, Retinoblastoma, Rabdomiosarcoma (tal como Rabdomiosarcoma en la niñez), Cáncer de la Glándula Salival, Sarcoma del tejido liso de comienzo en Adultos, Sarcoma de Tejido Liso (tal como Sarcoma de Tejido Liso en la Niñez), Sarcoma uterino, Sindromel de Sezary, Cáncer de la Piel (tal como cáncer de la piel ,| sin Melanoma) , Carcinoma de la Piel de Célula Merkel, Cáncer ¡ del i Intestino Delgado, Tumores Neuroectodérmicos ·, Primitivos Supratentoriales (tales como los que ocurren en la Niñez), 1 ? Linfoma de Célula T Cutánea, Cáncer Testiculár, Timoma y Carcinoma Timico, Cáncer de Tiroides, Cáncer de Célu 1l1a11r de Transición de la Pelvis Renal y Uréter, Tumor Trofoblá:st¾ico (tal como Tumor Trofoblástico G stacional) , Cáncer Uretral, cáncer uterino Endometrial , Sarcoma de Uterino, Cánjcer Vaginal, Trayectoria Visual y Glioma Hipotalámico (tai¡ jomo Trayectoria Visual y Glioma Hipotalámico en la Ni'ñejz), i Macroglobulinemia de Waldenstrom o Tumor de Wilms.
Tratamiento de una o más enfermedades cardiovasculares En una modalidad la presente invención se refiere ál uso de uno o más inhibidores de proteasa exositios en PAPP-A tal como PACI y/o variante de PACI y/o PAC2 descrita en este tratamiento de uno o más tipos de enfermedades cardiovasculares. J ¡. ',' Por ejemplo, el recubrimiento o impregnación^ ¦ Jdel dispositivo médico con un inhibidor PAPP-A puede ayudat a ! t prevenir el desarrollo de restenosis seguido por angiopla:stia de globo, o puede prevenir un incremento adicional en i -¿amaño f de una placa ateroesclerótica . La angioplastia coronaria con colocación de. férula es actualmente el enfoque terapéutico líder para la ateroesclerosis coronaria. Un objetivo importante de la angioplastia de la enfermedad de !¡;las incremento en la expresión de la proteasa IGFBP-4 por céiulas del músculo liso coronarias precede¦ la formación n ¦eoín.t<'i<:má¡i en respuesta a la angioplastia en humanos. En una modalidad! la presente invención se refiere al uso de uno o más inhibidores de proteasa dirigidos a los exositios en PAPP-A tal como PACI i i. < í I: antifosfolípido) (APS) , trombosis tanto en arterias cómo en venas, trastornos de plasminógeno y fibrinplijsis, ' ' íl modificable (potencialmente ) . Además, existen enfermedades y trastornos específicos en los cuales la osteoporosis ;ésíuna complicación reconocida. El uso de medicamentos .i; es heredabilidad de la fractura asi como densidad mineral ¡Edel hueso baja son relativamente altos, en el intervalo des e 25 hasta 80 por ciento. Existen al menos 30 genes asociados; con i1 el desarrollo de osteoporosis. Aquellos quienes ya tienen' luna fractura son al menos dos veces más propensos a tener!, .otra ! ' i , i t fractura comparado con alguien de la misma edad y sexo.' ¡j Potencialmente modificable: Fumar tabaco -1 El^fiiimar tabaco inhibe la actividad de osteoblastos, y es un factor de riesgo independiente para la osteoporosis. índice de! 'masa corporal bajo . - tener sobrepeso .protege contra la exceso - ejercicio excesivo puede llevar a daños constantes a los huesos lo que estructuras como se •ejemplos de corredores osteoporosis en la ve lleva a amenorrea (su 231 ; ; ? j, Malnutrición . Alcoholismo, actividad física Insuficiente, [ I , ;¦ exposición a metales pesados (por ejemplo cadmio y pltamo)., : j i : ? consumo de refrescos en exceso y el uso de medicamentos 'tal ¦ ' i 's como esteroides/glucocorticoides o barbituratos u , ¡otros antiepilépticos inducidos por enzima o inhibidores de; j.bp'mba de protón o Anticoagulantes o Tiazolidinedionas (usadas!; para diabetes ) . ' ! J Administración y régimen de dosificación ¡ . ¡ ¡, , I" ¦ i I ' Cualquier ruta adecuada de administración 1 ;!pilede ' i ¦ ; { emplearse para proporcionar a un mamífero, especialmente un humano, con una dosis efectiva de un compuesto de la presente invención. Por ejemplo, oral, rectal, vaginal, tópica, parenteral, ocular, pulmonar, nasal, y los similares ¡pueden emplearse. Otros administración intramuscularmente, cutáneamente y transdérmicaménte . En una modalidad preferida ? la administración comprende inhalación, inyeccióni o implantación. La administración del compuesto de acuerdo! con l presente invención puede resultar en un efecto local ; . ! i- i[ (tópico) o un efecto amplio corporal (sistémico) . .
Las formas de dosificación incluyen comprimijdos, ¡ 1 ¡j trociscos, dispersiones, suspensiones, soluciones, cápsujlas, 0.08 miligramo por kg de peso corporal por dosis, hasta alrededor de 12 miligramos por kg de peso corporal por ¡dosis, tal como desde alrededor de 0.1 miligramo por kg de ' eso corporal por dosis hasta alrededor de 10 miligramos por kg de peso corporal por dosisy tal como desde alrededor de 3.0 miligramos por kg de peso corporal por dosis hasta alrededor : 236 i ;. < j! i |; de 10 miligramos por kg de peso corporal por dosis',;; ipor /. ·( ' · ¡ 1 † ejemplo desde alrededor de 3.2 miligramos por kg de, ¡ peso corporal por dosis hasta alrededor de 10 miligramos por kgrde peso corporal por dosis, tal como desde alrededor' de i ¡¡ 6.2 miligramos por kg de peso corporal por dosis hasta alrededor de 10 miligramos por kg de peso corporal por dosis , fpor ejemplo desde alrededor de 6.4 miligramos por kg de. peso corporal por dosis hasta alrededor de 10 miligramos por kg de peso corporal por dosis,' tal como desde alrededor de ,6.6 miligramos por kg de peso corporal por dosis hasta alrededor de 10 miligramos por kg de peso corporal por dosi.s, j! por ejemplo desde alrededor de 6.8 miligramos por ,kg de ,peso corporal por dosis hasta ' alrededor de 10 miligramos por,, kg de • de 10 miligramos por . kg de peso corporal por dosis; , i,por I " 'i| ejemplo desde alrededor de 8.0 miligramos por kg dé: peso corporal por dosis hasta alrededor de 10 miligramos por 1 !k¡gI de¦ peso corporal por dosis, tal como desde alrededor de:!'0.2 miligramo por kg de peso corporal por dosis hasta alr 1e..deidor de · 8 miligramos por kg de peso, corporal por 'dosis/ ípor ' . i; ejemplo desde alrededor de 0.3 miligramo por kg de¡ peso corporal por dosis hasta alrededor de 8 miligramos por :ikg de peso corporal por dosis, tal como desde alrededor 'de , jj 0. i . ;l miligramo por kg de peso corporal por dosis hasta alrededor de 8 miligramos por kg de peso corporal por dosis¡, ¡¡ por ejemplo desde alrededor de 0.5 miligramo por kg d'e!; '-peso miligramos por kg de peso corporal por dosis hasta alreclejdor de 8 miligramos por kg de peso corporal por dosis',! por I I s ejemplo desde alrededor de 2.4 miligramos por kg de j p!eso corporal por dosis hasta alrededor de 8 miligramos por kg; de peso corporal por dosis, tal como desde alrededor de ' 2.6 miligramos por kg de peso corporal por dosis ' hasta alrededor de 8 miligramos por kg de peso corporal por dosis jp°r ejemplo desde alrededor de 2.8 miligramos por kg de; peso corporal por dosis hasta alrededor de 8 miligramos por :kg de peso corporal por dosis, tal como desde alrededor de ¡j3.0 miligramos por kg de peso corporal por dosis hasta alrededor de 8 miligramos por kg de peso corporal por dosisj |:por ejemplo desde alrededor de 3.2 miligramos por kg dé! peso corporal por dosis hasta alrededor de 8 miligramos por i kg de peso corporal por dosis, tal , como desde alrededor de j! 3. miligramos por kg de peso corporal por dosis hasta alrededor de 8 miligramos por kg de peso corporal por dosis!, 'ípor i i * ¡i ejemplo desde alrededor de 3.6 miligramos por kg dei peso corporal por dosis hasta alrededor de 8 miligramos por 'k 1g de peso corporal por dosis, tal como desde alrededor de 3.8 miligramos por kg de peso corporal por dosis hasta alrededor ejemplo desde alrededor de 0.7 miligramo por kg de' peso corporal por dosis hasta alrededor de 6 miligramos' por¦ kg de peso corporal por dosis, tal como desde alrededor 'de'¡¡ 0.8 miligramo por kg de peso corporal por dosis hasta alrededor de 6 miligramos por kg de peso corporal por dosis, i ¡! por ejemplo desde alrededor de 0.9 miligramo por kg de. , peso corporal por dosis hasta alrededor de 6 miligramos por ' ' kfg de peso corporal por dosis, tal como desde alrededor del: ¡1.0 miligramo por kg de peso corporal por dosis hasta alrededor ! ¡ ü de 6 miligramos por kg de peso corporal por · dosis', i; por En una modalidad la presenté invención se refiere á la co-administración de uno o más inhibidores de prptéasa dirigidos a los exositios en PAPP-A tal como PACI y/oj'PÁC2 o cualquier variante de PACI y/o PAC2 descrita en, !:este documento y uno o más fármacos anticáncer seleccionados l J ' ' 't de 1 grupo que consiste de: . ; , ,! Aldesleucina/Proleucina (Chiron Corp) ¡ : i ' I 11 1 l : i ,1 it Alemtuzumab/Campath (Millennium and ILEX Par alitretinoina/Panretina (Ligand Pharmaceutic ' alopurinol/Ziloprim (GlaxoSmithKline) altretamina/Hexalen (US Bioscience) amifostina/Etiol (US Bioscience) anastrozol/Arimidex (AstraZeneca ) trióxido arsénico/Trisenox (Cell Therapeutic Asparaginasa/Elspar (Merck & Co, Inc) BCG vivo/TICE BCG (Organon Teknika Corp) Cápsulas .de bexaroteno/Targretina nd Pharmaceuticals) bleomicina/Blenoxano (Bristol-Myers Squibb) busulfan/Busulfex (GlaxoSmithKline) calusterona/Metosarb (Pharmacia & Upjohn Com capecitabina/Xeloda (Roche) carboplatina/Paraplatina (Bristol-Myers Squi carmustina/BCNU, BiCNU (Bristol-Myers Squibb carmustina con implante de Polifeprosan 2 de Gliadel ' (Guilford Pharmaceuticals Inc.) ¦ celecoxib/Celebrex (Searle) clorambucil/Leuqueran (GlaxoSmithKline) cisplatina/Platinol (Bristol-Myers Squibb) cladribina/Leustatina, 2-CdA (R. . on Pharmaceutical Research Institute) I j ciclofosfamida Citoxan/Neosar (Bristol-Myers Squibb) citarabina/Citosar-U (Pharmacia- & Upjohn Company) i dacarbazina/DTIC-Dome (Bayer) , : ; i, dactinomicina/actinomicina D Cosmegen (Merck) 1 letrozol/Femara (Novartis) , ' f ' leucovorina Wellcovorina/Leucovorina (Immu ex Corporation) ¡ ! .! 1f ' levamisol/Ergamisol (Janssen Research Foundation) ' lomustina/CCNU/CeeBU (Bristol-Myers Squibb) l mecloretamina/mostaza de nitrógeno/Mustargen (Merck). r acetato de megestrol/Megace (Bristol-Myers Squibb) | ¡¦ :| melfalan/L-PAM/Alkeran (GlaxoSmithKüne) ; { mercaptopurina/6-?? Purinetol (GlaxoSmithKüne) ; i ¡¡ mesna/Mesnex (Asta Medica) 1 ] ¾ : ! i' ¦ 11 metotrexato . (Lederle Laboratories) , : ' ' \ metoxsalen/Uvadex (Therakos) 1 ¡: ¦ : ;' I: mitomicina C/Mutamicina (Bristol-Myers Squibb) cualquier variante de PACI y/o PAC2 descrita: en :1 i¡ e'!ste documento y uno o más fármacos con actividad anti-plaqueta¡ En una modalidad la presente invención se refiere ;>a'j:la co-administración de uno o más inhibidores de prótéása dirigidos a los exositios en PAPP-A tal como PACI y/o PAC2 o cualquier variante de PACI y/o PAC2 descrita en ' éste documentos y uno o más fármacos con actividad anti-plagu'eta i ;¦ ].¡ seleccionados del grupo que consiste de Aspirina, aloxiprina, ! :¦ ' ¡i Ditazol, Carbasalato de calcio, cloricromeno, indobufejno, picotamida, triflusal, clopidogrel, dipiridamol, ¡ prasujgrjsl, I i ticlopidina, beraprost, prostaciclina , iloprost, trepros.ti)ni , I! abciximab, eptifibatida y tirofiban. ¡ : ¦ En una modalidad la presente invención se refiere.1,1 a1 ¡ la co-administración de uno o más inhibidores dé' pr'otéjasa dirigidos a los exositios en PAPP-A tal como PACI 1 y/o PAC2 o cualquier variante de PACI y/o PAC2 descrita ¦ en : e ¡ I1st 'e documento y uno o más fármacos con actividad anti-coagulánte . ¡ i : !, En una modalidad la presente invención se refiere, ai la co-administración de uno o más inhibidores de. prbteasa dirigidos a los exositios en PAPP-A tal como PACI . y/o .PACj¡2 o cualquier variante de PACI y/o PAC2 descrita en' . este i; documentos y uno o más fármacos con actividad anti-coagula'nte seleccionados del grupo que consiste de Heparina, bemiparina, : . ! i-dalteparina, enoxaparina, nadropanna, parnapar|i.ína, • ' ¦ 254 1 : : ¡ ' v ¦ '· '', Carvedilol, Metoprolol, Atenolol, Labetálól, ' ' !' i 1 Metoprolol/Lopressor/Toprol XL y Propranolol ) ; inotrdpos positi os (por e emplo Digoxina y dobutamina ) ; bloqueádores del canal de calcio (por ejemplo Nifedipina/Adalat/Proca !i[rJdifa, Amlodipina/Norvasc,- Felodipina/Plendil , Nicardipina/Cardenlo, Nimodipina/Nimotop, Nisoldipina/Súíar, Nitrendipina/Cardi ff/Nitrepin, Lacidipina/Motens, ¡ f l í : , M' ' i Lercanidipina/Zanidip, Diltiazem/Cardizem, ' j; Verapamil/Calan/Isoptin y Gallopamil/D600 ) ; vasodil tores i i ?' ! !' alternativos (por ejemplo dinitrato de Isosorbide, Hidralazina, Diazóxido, Minoxidil, Nitroprusida, fentolamina y Teobromma) ; Agentes simpatoliticos (por ejemplo :'Clon-i¡dHinta, Guanfacina,' Metildopa, Moxonidina, Reserpina, Rilmenidina, Mecamilamina , Trimetafan, Prazosin, Guanetidina, Indoram¡iín, ¦ ' ¡i i Doxazosin y Terazosin) ; y otros antihipertensivos ( ¡' (por ! i:: !'! ejemplo antagonistas de Serotonina tales como Cetanserina, antagonistas del receptor de endotelina tales como Bosentan, Ambrisentan y Sitaxsentan) . '¦ 11,1 ·i Co-administración con uno o más adyuvantes En una modalidad la presente invención se refiere a la co-administración de uno o más inhibidores de prote sa dirigidos a los exositios en PAPP-A tal como PACI y/o PAC2 o cualquier variante de PACI y/o PAC2 descrita : eh¦ i !¡,e¡jste ¡ 1; ! |! inmunitarias en animales y humanos. Las partículas J de aluminio se han demostrado en los ganglios . linfáticos regionales de conejos siete días después de la inmunización, debido a su registro de seguridad excelente, los compuestos de aluminio son actualmente los únicos adyuvantes 'usadosj; en humanos. 1 l : Aunque las · sales de aluminio son un adyuvante sufiiciénte para inmunógenos fuertes que sólo requieren respuestas (; de anticuerpo para producir protección, estos pueden rio ¡ser siempre efectivos cuando se usan con inmunógenos débiles tales como péptidos sintéticos de malario, o para introducir respuestas ínmunitarias mediadas por la célula o isotipó ¡EgG del tipo requerido para combatir infecciones. ! 1 :¡ . ; ¦ ¡ ;: i Otro grupo grande de adyuvantes son aquellos de origen bacteriano. Los adyuvantes con orígenes bacterianos pueclen purificarse ' y sintetizarse (por ejemplo, 'dipé iiitios demuramilo, lípido A) y mediadores hospederos se han clonado ; ' i! ( interleucina 1 y 2) . La última década ha traído1 progresos importantes en la purificación química de al m :enos1 j¡: tres 1 !. .¡i adyuvantes de componentes activos de origen bacteriano: Bordetella pertussis, lipopolisacárido y Adyuvante Comple'hto de Freund (FCA). . Adicionalmente, los adyuvantes apropiados ¡j de acuerdo, con la presente invención son, por ejemplo, Titermax, ISCOMS, Quil A, ALUN, ver US 58767 y 5,554,372, derivados !: de Lípido A, derivados de coleratoxina , derivados de^HSP, consideran para inclusión en composiciones inmunogénic s de i acuerdo con la presente invención . . El lipopolisacáridó ' y ¡sus diversos derivados, incluyendo lipido A, se han encontrado para ser adyuvantes poderosos en combinación con liposomás u factor de tejido (TFPI) es una proteína 34-kDa asociado · jcon lipoproteínas' de plasma y con el endotelio vascular. antitrombiria es un inhibidor de serina . proteasá de enlace de heparina. AT-III se enlaza una secuencia! j; de sulfación de pentasacárido específica contenida 'dentro 'fdel de calcitonina, y es usado mucho más comúnmente hoy en- día.
La calcitonina se ha mostrado que disminuye la pérdida1 ós a, y también reduce eí dolor asociado con fracturas; ¡por ¦ ; i' osteoporosis . ;: ' j! Raloxifen , ' El raloxifen es una medicación más nueva ,que |se,j ha desarrollado para proporcionar alguna de las mismas ventajas del estrógeno (HRT) , sin los efectos colaterales potenciales.
El raloxifen es un tipo de medicamento llamado un modulador ¦ ;¦ ¡ del receptor de estrógeno selectivo, o SERM. Los efectos, ¡(del 1 M raloxifen han mostrado ser similares al estrógeno, incluyendo ; i : ¦ ¡i un incremento en la masa ósea y reducción del colesterol .1 ¡: Sin embargo, los SERM no tienen los mismos efectos ¦ en^ el revestimiento uterino, y por lo tanto no necesitan combinarse con progesterona . Adicionalmente, hay evidencia de qué" el raloxifen puede reducir el riesgo de cáncer de mama. | Estrógeno ¡ ¦ , ! La. terapia de reemplazo hormonal, o HRT, no sólo ayuda a 1 « í mantener, sino también incrementa la masa ósea después : de la menopausia. Múltiples estudios han mostrado los beneficios» de í : í la terapia de estrógenos, incluyendo un riesgo menor;' de osteoporosis y fracturas de huesos.' Además, otros beneficios del reemplazo de estrógeno en el paciente postmenopáusico incluye disminución de colesterol, riesgo reducido de* cáncer de colon, y algunos síntomas postmenopáusicos . La , HRT mostró que incrementa el riesgo de cáncer uterino, pero este rie;sgo se elimina cuando el estrógeno se combina con progesteró'na . Hay estudios, que muestran un riesgo incrementado de cáncer de mama en algunas poblaciones estudiadas. Los pacientes en : ¡HRT también muestran un riesgo ligeramente incrementado 1 de desarrollar coágulos sanguíneos y apoplejías. ; Hormona paratiroide (PTH) -¡ ? i ¡ La PTH estimula tanto la resorción como la formación!! de : ¦ i hueso nuevo. La administración intermitente estimula la r formación más que la resorción. Los ensayos clínicos ai, la fecha sugieren que la terapia PTH es efectiva tanto ;en!| la prevención como el tratamiento de osteoporosis, y: ¡una preparación llamada Forteo, dada por inyección diaria, ahora está aprobada por la FDA para el tratamiento de osteoporojsis 1 ? espinal muy severa. :·! !¡ : ; 1 I ' ¡I Didronel ' ' '\ El didronel (etidronato de disodio) actúa primariíam,eJn:te en el hueso. Puede inhibir la formación, crecimiento,!: y t disolución de cristales de hidroapatita y sus precursores ! amorfos por quimiosorción para superficie de fosfato ¡¡ de calcio. La inhibición de resorción de cristal ocurre a1 dójsis más bajas que las requeridas para inhibir el crecimientp | ¡del cristal . ¦ ' . i.í ' ¡! ! : 'í Co-administración con fármacos Anti-envejecimiento j En una modalidad la presente invención se refiere a la co-administración de uno o más inhibidores de pr'oteasa dirigidos al exositio en PAPP-A tal como PACI y/o PAG2 o cualquier variante de PACI y/o PAC2 descrita : en¡ -h eÜjste documento y uno o más fármacos anti-envejecimiento tales* q'omo los descritos enseguida. '!; ¦ ' i1 En una modalidad la presente invención se refieré a'¡ la co-administración de ' uno o más inhibidores de pro'tejasa dirigidos al exositio en PAPP-A tal como PACI y/o PAC2 o cualquier variante de PACI y/o PAC2 descrita en! ¡' é'ste documento y uno o más fármacos anti-envejecimie|nto seleccionados del grupo que consiste de antioxidantj'es, ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita ' ¡1 en las reivindicaciones. ' ; j.
. ! ? Ejemplo 1 . ; : , | Constructos de plásmido - Un constructo de expresión que codifica una forma etiquetada His de la porción de terminajl C Thomsen, A. R. , Laursen, L. S., Olsen, I. M., Sottrup-Jensjisn, L, Haaning, J. , Giudice, L C, Conover, C. A., y Oxvig, j c . (2002) Eur. J. Biochem. 269(8), 2247- 2256) La numeración tíel residuo 1547 de PAPP-A humano está de acuerdo„ ¿on l (Kristensen, P., and Winter, G. (1998) Fold Des 3(5), ,321 -328). Un segundo fragmento de nucleótido que codifica i ¿los Generación de anticuerpos policlonales de pollo - El :PApP-A de murino (1129-1545) se purificó del medio libre de 'suero por cromatografía de afinidad en níquel usando ; perlas. de ' i mM, CaCl2 1 mM, . pH 7.5 en ausencia (IGFBP-5) o1 presencia (IGFBP-4) de un excesó molar de 10 veces de IGF;-II (Diagnostic Systems Laboratories). Después de la incubación a 37 °C, las reacciones se apagaron por la adición de EDTAij,(10 mM) y almacenaron a -20 °C. Los productos desdoblados j¡ se separaron por 10-20% SDS-PAGE y visualizaron1 '¡por autoradiografia . El grado de desdoblamiento se determinó ; ¡por la cuantificación de intensidades de banda usando un sistema de formación de imagen Typhoon (GE Healthcare), j y1; se sustrajeron- los niveles de respaldo (señales imitadas).1: La actividad proteolitica de PAPP-A2 contra IGFBP-5 en ausencia i de. IGF.se analizó similarmente , como se detalla previamente ¦ ' ;: (26) . El análisis de actividad peptidolitica , contra. ¡j un i. péptido sintético de 26 residuos derivado de IGFBP^4 se ¡llevó a cabo como se describe previamente (46). Los residuos; erí! la : ¦ I '; •el lado de terminal N y terminal C del : sitió :t} de desdoblamiento se modificaron con ácido o-aminobenzoico, y¡ se sustituye con 3-nitrotirosina, respectivamente. La solución amortiguadora de reacción fue Tris 50 mM, pH 8.0, Tween-j'20' al i - ' : Selección de colecciones de fago semi-sintéticas | - ¡ i Se inmovilizó PAPP-A de humano (1133-1547) (1 h a 37 '°C a inmunotubos de 3.5 mL (Nunc Maxisorp) , que se cubr ¡i·e?jron¦ ¡ i' durante la noche a 4 °C con anticuerpos PAPP-A policlpnaies (5 pg/mL) contenidos en bicarbonato de sodio 100 mM, pH; 9 8 y se bloquean con leche en polvo descremada al 3% en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5 (TBS). Se uso una combinación de dos ' i colecciones de fago semi-sintético (Tomlinson I + J) (48) y se llevó a cabo la captura de fagos (1012 de cada colecciipn) pór 2 h a TA mientras se revuelve suavemente. Después de," la ' ' ' i captura, los tubos se enjuagaron 10 veces en TBS que cohtijene NaCl 10 M y Tween-20 al 0.1% (TBST) , lavando además a 4 °C con 2 L de TBST por cinco horas usando una bomba peristáltica, y finalmente se enjuaga cinco veces con TBS.:; La ¦ '¦ i elución de fagos se llevó a cabo por 10 min a TA usando ¡0.5 mL de tripsina tratada con DPPC (1 mg/mL) (Sigma) : diluido! en ¦ ; ' ¡i TBS. Alternativamente, la elución de fagos puede comprender dializó en las soluciones amortiguadoras relevantes antes ¡del análisis funcional. El análisis de e inmovilizado como se describe arriba, se placas de 96, pozos usando anticuerpo de para inmunización, esté experimento soporta la hipótesis de que. LNR3 funciona como un exositio enlazado al sustrato. Adicionalmente , el hallazgo de que tales anticuerpos póliclonales no inhiben eficientemente el desdoblamiento | de IGFBP-5, sugiere un modo diferente de enlace del sustrato; y que puede obtenerse un inhibidor que desdobla PAPP-A objetivo selectivamente de IGFBP-4. : |¡ PA 937-1547 ¦ sin enlace PA 1-599 sin enlace

Claims (1)

  1. ¦ 4'. El polipéptido de conformidad con la reivindicación . ; I 1, caracterizado porque el fragmento de polipéptido contiene menos de 99.5%, tal como menos de 98%, por ejemplo menos de 7%, tal como menos de 96%, por ejemplo menos de 95¡%;, tal como menos de 94%, por ejemplo menos de 93%, tal; como :menos ¦ ?' de 92%, por ejemplo menos de 91%, tal como menos de 90%, ¡.por ejemplo menos de 88%, tal como menos de menos de 84%, por ejemplo menos de 82%, 298 j ; , j. de aminoácidos consecutivos, tal como menos de 150 resid'üos i ¦ de aminoácidos consecutivos, por ejemplo menos de, ¡145 residuos de aminoácidos consecutivos, tal como menos, dé, ¡140 residuos de 'aminoácidos consecutivos, por ejemplo ménos de • 23. La molécula de conformidad con la reivindicación i 19, caracterizada . porque la interacción resulta en inhibición diferencial de dos o más sustratos fisiológicos de PAPP-A.¡|, 24. La molécula de conformidad con la reivindicación !l9, 63. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque uno o más grupos de bloque!ó:¡; se Congénita, Insuficiencia Cardiaca Congestiva, insuficiencia ^ i1 cardiaca, Miocarditis, Enfermedad de las Válvulas, Enfermedad ' ' ¡i ¦ de las Arterias Coronarias, Cardiomiopatia Dilatáda, I Disfunción Diastólica, Endocarditis, Alta Presión Sanguínea (Hipertensión), Cardiomiopatia Hipertrófica, Prolapso '< de. la Endocrino), Sarcoma de Kaposi, Cáncer de Riñon (Célula í Renal) , Cáncer de Laringe, Cáncer de Labio y Cavidad Bucal, ¦ ! i : ¡: Cáncer de Pulmón (Célula No Pequeña o Célula Pequeña), infoma (tal como Linfoma Relacionado con SIDA, Linfoma j' de • 361 1 , ¦!¦ ¦? Burkitt, Tumor Carcinoide, Carcinoma de Primario Descono?ci:?do, individuo que necesite de la misma. : 137. El método de conformidad con la reivindicacióin":' 1¦[36, osteoporosis causada por factores de riesgo seleccionados ¡del grupo que consiste de menopausia, envejecimiento, trastornos hormonales, deficiencia de estrógenos, reducción. :j¡ de testosterona, enfermedades crónicas, fumar tabaco,, ¡ una i !; : } predisposición genética, bajo índice de masa corporal, carboxilación, glicosilación, tal como glicosilaciónl ique resulta de exponer el polipéptido a enzimas que afectan,! la comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 155 en combinación con un portador farmacéuticám'énte aceptable . 189. Una composición de conformidad con, las reivindicaciones 187 y 188, caracterizada porque comprende además la combinación con uno o más agentes , bióa'd'tajvos adicionales . 190. Una composición de conformidad conl las reivindicaciones . 187 y 188, caracterizada porqué comprende además la combinación con uno o más agentes , bioa;c¡tavos adicionales seleccionados, del grupo que consiste , de agentes anti-plaquetas , agentes anti-coagulación, • agerites fibrinoliticos, fármacos para el tratamiento de enfermie!dades cardiovasculares, fármacos para el tratamiento de osteoporosis , y fármacos anti-cáncer para uso médico. 191. Un kit de partes, caracterizado porque comprenjdéj el polipéptido de conformidad con la reivindicación 155¡ ¡o' la composición de conformidad con las reivindicaciones ¡ ¾7 y 188, y al menos un componente adicional. 192 kit de ' partes de conformidad la reivindicación 191, caracterizado porque mas componentes adicionales comprenden un instructivo del régimen de dosis y administración deseado. ¦' . 193. El kit de partes de conformidad con ] I: la ' , j reivindicación 191, caracterizado porque al menos uno; o'rmás de los componentes adicionales son agentes bioa ¡cntivos seleccionados del grupo que consiste de agentes janti- plaquetas, agentes anti-coagulación, agentes fibrinolitlicos , fármacos ' para el tratamiento de enfermedades ! :' : |; • cardiovasculares, fármacos para el tratamiento! i; de ' )¦ ! osteoporosis, y fármacos anti-cáncer para uso médico. 1 '' ¦! , ': fi 194. El kit de partes de conformidad con t la reivindicación 193, caracterizado porque al menos, uno p ! más ' j ' ? del componente' adicional es un fármaco anticancer, seleccionado del grupo que consiste de Aldesleuq'uina/ Proleuquina (Chiron Corp) , Alemtuzumab/Campat (Millennium y ¦ ' I ; ' i¦ ILEX Partners, LP) , alitretinoina/Panretina (L.igand Pharmaceuticals) , alopurinol/Ziloprim (GlaxoSmithKljine) , i I G ' i i1 altretamina/Hexaleno (US Bioscience) , amifostina/Etio.l ( US Bioscience), anastrozol/Arimidex (AstraZeneca ) , trióxido arsénico/Trisenox (Cell Therapeutic) , Asparaginasa/Élslpar (Merck & Co, Inc) , BCG vivo/TICE BCG (Organon Teknika Corp), cápsulas de bexarotena/Targretina (Ligand Pharmaceuticaljs ) , bleomicina/Blenoxano (Bristol-Myers Squibb) , busulfano/Busulfex (GlaxoSmith line) , calusterona/Metbs'arb i (Pharmacia & Upjohn Company) , capecitabina/ Xeloda (Rpch;e) , carboplatina/Paraplatina (Bristol-Myers Squibb), carmustina/BCNU, BiCNU (Bristol-Myers Squibb), cármustina con, Difenadiona, Biscoumacetato de etilo, Fenprocóumon, Fenindiona, Tioclomarol, dabigatran, idraparinux, lepirtcíina , bivalirudina, Argatroban, desirudin, hirudin, melagatran, ximelagatran, Antitrombin'a III, rivaroxaban, Fondapa'rlinux, I " Intraocular) , Cáncer d ' Vesícula Biliar, Cáncer Gástrico (Estómago) , Tumor Carcinoide Gastrointestinal, , Tumor Extrahepático> Cáncer de Vejiga, Cáncer Óseo, Osteosarcoma/Histiocitoma Fibrosa Maligna, Glioma de: .Tallo ¦ i, Trofoblástico Gestacional, Glioma, Leucemia de Celfula Vellosa, Cáncer de Cabeza y Cuello, Cáncer Hepatocelu,lar Cáncer de Pene, Feocromocitoma, Pineoblastoma y Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Supratentoriales , Tumor Trofoblástico Gestacional, Glioma, Leucemia .de ¡Célula Vellosa, Cáncer de Cabeza y Cuello, Cáncer Hepatoqelular (Hígado)-, Linfoma de Hodgkin, Cáncer Hipofaringeal , Glíoma1 de Trayectoria Hipotalámica y Visual (tal como Gli!oma esteroides/glucocorticoides o barbituratos u 1 lOtjros 223, caracterizado porque el compañero de enlace tiene1 un ' [ peso molecular en el intervalo desde 100 Da hasta 1,000, ¡000 Da, tal como desde 100 Da hasta 500 Da, por ejemplo, 500j; Da -' ¦¦i ! ' í hasta 1,000 Da, tal como desde 1,000 Da hasta 1,500 Da', upor ejemplo 1,500 Da hasta 2,000 Da, tal como desde 2, 000| Da hasta 2,500 Da, por ejemplo 2, 500 Da hasta 3,000 Da, t'al|| como desde 3,000. Da hasta 3,500 Da, por ejemplo 3,500 Da hasta ! 1 4,000 Da, tal como desde 4,000 Da hasta 4,500 Da, por ejemplo ¦ i 4,500 Da hasta 5,000 Da, tal como desde 5,000 Da hasta 5,500 1 por ejemplo. 800,000 Da hasta 850,000 Da, tal como desde 850, 000 Da hasta 900,000 Da, por ejemplo 900,000 Da I ha|sta 950,000 Da, tal como desde 950,000 Da hasta 1,000,000
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