WO2012147918A1

WO2012147918A1 - ヒトテロメレース逆転写酵素に対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: WO2012147918A1
Application number: PCT/JP2012/061360
Authority: WO
Inventors: 健吉増富; 麻美安川; 奈緒子岡本; 静衣大岡; 圭太木下
Original assignee: 株式会社医学生物学研究所; 独立行政法人国立がん研究センター
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2012-11-01
Also published as: JP2014139139A

Abstract

　配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を作製することに成功した。さらに、該抗体は、ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に検出することができ、特にウェスタンブロット法、細胞免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降法等の検出方法において、内在性ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に検出することができることを見出した。さらに、前記抗体を細胞内に導入することにより、Ｍ期にて細胞周期を停止することができ、またアポトーシスを誘導できることも見出した。

Description

ヒトテロメレース逆転写酵素に対するモノクローナル抗体

　本発明は、ヒトテロメレース逆転写酵素を特異的に認識するモノクローナル抗体並びにその製造方法に関する。また、本発明は、前記モノクローナル抗体を含有する細胞周期をＭ期にて停止させるための組成物、並びに細胞周期をＭ期にて停止させるための方法に関する。

　染色体末端に存在するテロメアを維持する酵素であるテロメレースは、発がん過程においてがん細胞の不死化を司る重要な酵素である。不死化とはがん細胞の持つ特徴の一つであり、細胞がいつまでも分裂することのできる能力である。テロメレースの重要な役割ががん細胞の不死化能の維持であったことから、がん治療の戦略上、ヒトテロメレースは非常に重要な分子として認識されてきた。大きな複合体を形成するヒトテロメレースの触媒活性タンパク質は、ヒトテロメレース逆転写酵素（ｈｕｍａｎ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ｈＴＥＲＴ）であることが知られている。ヒトテロメレース逆転写酵素（以下、「ｈＴＥＲＴ」とも称する）の遺伝子は１９９７年に初めて同定・報告された(非特許文献１～２)。ｈＴＥＲＴは、がん診断又は治療の標的として非常に重要な分子であるため、その遺伝子がクローニングされて以来、タンパク質の発現精製、抗体の作製等に関して、多くの研究者や企業が精力的に研究を推進してきた。

　しかしながら、非特許文献３～４に記載されているように、ｈＴＥＲＴのタンパク質精製は困難である。また、非特許文献５～７に記載されているように、これまで信頼度が高いと考えられていたｈＴＥＲＴに対する抗体ですら、実は異なる分子を認識していた。さらには、これまでに作製、販売されたｈＴＥＲＴに対する抗体を詳細に評価した結果、信頼性の高い抗体がなかったことが非特許文献５に報告されている。このように、ｈＴＥＲＴ遺伝子配列の特定以来、そのタンパク質の発現精製やモノクローナル抗体作製は非常に困難を極めている。また、現時点でウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡにおいて唯一ｈＴＥＲＴを検出することができるとされている抗体は、ポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、ウサギ由来抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体、カタログ番号：６００－４０１－２５２）であるため、ポリクローナル抗体であるが故の製品ロット間の不安定性等の問題点を有している。

　がんの診断や治療において重要な標的となることから科学的にも商業的にも、長年の間、そのモノクローナル抗体作製の成功が待ち望まれてきているにもかかわらず、遺伝子同定からタンパク質精製、モノクローナル抗体作製へと順調に進む、多くの他のタンパク質における科学の進歩とは異なり、ｈＴＥＲＴタンパク質の発現等を十分に検出できるモノクローナル抗体は未だ提供されていない。

Ｍｅｙｅｒｓｏｎ　Ｍら、Ｃｅｌｌ、１９９７年、９０巻、４号、７８５～７９５ページＮａｋａｍｕｒａ　ＴＭら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、２７７巻、５３２８号、９５５～９５９ページＭａｓｕｔｏｍｉ　Ｋら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２０００年、２７５巻、２９号、２２５６８～２２５７３ページＭｉｋｕｎｉ　Ｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ、２００２年、２９８巻、１号、１４４～１５０ページＷｕ　ＹＬら、Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ、２００６年、１１９巻、１３号、２７９７～２８０６ページＹａｎ　Ｐら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、２００４年、１２１巻、５号、３９１～３９７ページＺｅｎｄｅｈｒｏｋｈ　Ｎら、Ａｃｔａ　Ｃｙｔｏｌ、２００７年、５１巻、６号、８８６～８９２ページ

　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体並びにその製造方法を提供することを目的とする。本発明は、特に、ウェスタンブロット法、細胞免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降法等の検出方法において、内在性ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することを目的とする。

　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ね、ｈＴＥＲＴのＮ末側領域（ｈＴＥＲＴタンパク質の１８０～４６０アミノ酸）が抗原として適した部位であると推測した。また、合成オリゴペプチドを免疫抗原とした抗体作製の成功例はなかったため、前記Ｎ末側領域を大腸菌で発現させたリコンビナントタンパク質を抗原として用いることを解決策として考えた。そして、前記Ｎ末側領域をコードする塩基配列のコドン使用頻度を大腸菌に適したものに置換して、前記リコンビナントタンパク質の発現・精製を試みた。しかしながら、様々な条件検討を行ったものの、このｈＴＥＲＴタンパク質の１８０～４６０アミノ酸からなるリコンビナントタンパク質の発現・精製をすることはできなかった。

　そこで、本発明者らは更なる研究を進めた結果、ｈＴＥＲＴタンパク質の３０４～４６０アミノ酸からなるリコンビナントタンパク質については、大腸菌にて発現・精製させることが可能であることを見出し、該リコンビナントタンパク質を抗原として用いることにより、ｈＴＥＲＴに対するモノクローナル抗体を作製することに成功した。

　さらに、本発明者らは、作製したモノクローナル抗体のスクリーニングを多段階的に種々の方法を用いて行うことにより、特異性が高く、種々の検出方法（ウェスタンブロット法、細胞免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法及びＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降法）に適用可能な極めて優良なモノクローナル抗体を調製することにも成功した。また、現時点で唯一ｈＴＥＲＴタンパク質を検出することができるとされているウサギ由来抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）より、前記いずれの検出方法においても、前記モノクローナル抗体の検出感度は優れていた。さらに、該モノクローナル抗体を用いると、これまで極めて困難であった内在性ｈＴＥＲＴタンパク質の免疫沈降も極めて効率良くでき、近年報告された新規ｈＴＥＲＴ結合ＲＮＡであるＲＭＲＰ（Ｍａｉｄａ　Ｙ、Ｍａｓｕｔｏｍｉ　Ｋ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２０１１年、３９２巻、４号、２９９～３０４ページ、Ｍａｉｄａ　Ｙら、Ｎａｔｕｒｅ。２００９年、４６１巻、７２６１号、２３０～２３５ページ　参照）を含むｈＴＥＲＴ結合ＲＮＡを網羅的に検出できるという特性を持ち合わせていることも見出した。

　また、前記モノクローナル抗体をＨｅｌａ細胞に導入したところ、細胞周期がＭ期において停止し、またアポトーシスの誘導が生じることも見出した。

　さらに、このようにして得られたモノクローナル抗体について、可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列を同定することに成功した。

　また、このようにして得られたモノクローナル抗体について、エピトープの同定を試みたところ、これらモノクローナル抗体は、ｈＴＥＲＴタンパク質の３０４～３２３アミノ酸配列からなるポリペプチドを認識していることが明らかになった。さらに、より短いエピトープの同定を試みたところ、ｈＴＥＲＴタンパク質の３１０～３１９アミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する抗体が見出された。

　すなわち、本発明は、ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体並びにその製造方法に関し、より詳しくは以下の発明を提供するものである。
＜１＞　配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体。
＜２＞　配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドで免疫することを特徴とする、ヒトテロメレース逆転写酵素に対するモノクローナル抗体の製造方法。
＜３＞　＜１＞に記載のモノクローナル抗体を含有する、細胞周期をＭ期にて停止させるための組成物。
＜４＞　＜１＞に記載のモノクローナル抗体を細胞内に導入する工程を含む、細胞周期をＭ期にて停止させるための方法。

　本発明によれば、ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に検出することが可能となる。特に、ウェスタンブロット法、細胞免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降法等の検出方法において、内在性ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に検出することが可能となる。さらに、本発明によれば、Ｍ期にて細胞周期を停止させ、またアポトーシスを誘導することが可能となる。

ｈＴＥＲＴタンパク質（１～１００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（１０１～２００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（２０１～３００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（３０１～４００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（４０１～５００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（５０１～６００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（６０１～７００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（７０１～８００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（８０１～９００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（９０１～１０００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（１００１～１１００アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。ｈＴＥＲＴタンパク質（１１０１～１１３２アミノ酸）における予想抗原性を分析した結果を示す、配列及びグラフである。大腸菌におけるｈＴＥＲＴタンパク質（１８０～４６０アミノ酸）の発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色（図中Ａ）及びウェスタンブロット法（図中Ｂ）にて分析した結果を示す写真である。ｈＴＥＲＴタンパク質（１８０～４６０アミノ酸）を発現させた大腸菌を前培養を含む通常の大量培養法により培養し、得られた培養菌体の破砕上清をＮｉキレートカラムにて精製してＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色にて分析した結果を示す写真である。ｈＴＥＲＴタンパク質（１８０～４６０アミノ酸）を発現させた大腸菌をコロニーピックアップ法により培養し、得られた培養菌体の破砕上清をＮｉキレートカラムにて精製してＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色にて分析した結果を示す写真である。ｈＴＥＲＴタンパク質（１８０～４６０アミノ酸）を発現させた大腸菌をコロニーピックアップ法により培養し、得られた培養菌体の破砕上清をＮｉキレートカラムにて精製してウェスタンブロット法にて分析した結果を示す写真である。大腸菌におけるｈＴＥＲＴタンパク質（１８０～３２０アミノ酸）の発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色（図中Ａ）及びウェスタンブロット法（図中Ｂ）にて分析した結果を示す写真である。大腸菌におけるｈＴＥＲＴタンパク質（３０４～４６０アミノ酸）の発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色（図中Ａ）及びウェスタンブロット法（図中Ｂ）にて分析した結果を示す写真である。培養菌体の破砕上清をＮｉキレートカラムにて精製して得られた精製ｈＴＥＲＴタンパク質（３０４～４６０アミノ酸）の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色（図中Ａ）及びウェスタンブロット法（図中Ｂ）にて分析した結果を示す写真である。ウェスタンブロッティングにより、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体をスクリーニングした結果を示す写真である。なお、図中のＡはＢＪ細胞（陰性対照）及びＢＪ－ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞（陽性対照）を用いたウェスタンブロッティングにより分析した結果を示し、図中のＢは２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞（陽性対照）及びＢＪ－ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞（陽性対照）を用いたウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す。ＧＦＰ－ｈＴＥＲＴ発現Ｈｅｌa細胞を用いた蛍光免疫染色により、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体をスクリーニングした結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、「ＤＡＰＩ」は細胞の核をＤＡＰＩにて染色した結果を示し、「ＧＦＰ－ｈＴＥＲＴ」はｈＴＥＲＴタンパク質に融合しているＧＦＰのシグナルを検出した結果を示し、「抗ｈＴＥＲＴ抗体」は各抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体によって蛍光免疫染色した結果を示す。ｈＴＥＲＴの全長及びトランケーション変異体を用いて、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体の認識部位を分析した結果を示す図である。なお図中Ａは、２９３Ｔ細胞に過剰発現させたＦＬＡＧ－ｈＴＥＲＴタンパク質の全長（Ｆｕｌｌ）及びトランケーション変異体（ＨＴ１、ＥＢ、ＥＸ）の模式図を示す。各模式図の右側に付された数値は各々の変異体のアミノ酸数を示す。また、図中Ｂは、２９３Ｔ細胞にＦＬＡＧタグを付加したｈＴＥＲＴタンパク質の全長又はトランケーション変異体を一過性に過剰発現した細胞をサンプルとし、ウェスタンブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ：ＩＢ）を行なった結果を示す写真である。左のパネルは、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（９Ｂ１０－１０）を用いたウェスタンブロッティングによる分析の結果を示し、右のパネルは、抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）抗体を用いたウェスタンブロッティングによる分析の結果を示す。２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞及びＢＪ－ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞をサンプルとし、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体又はＲｏｃｋｌａｎｄ社製抗ｈＴＥＲＴポリクロ―ナル抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった結果を示す写真である。上のパネルは抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（２Ｅ４－２）を用いてブロット（ＩＢ）し検出されたバンドを、下のパネルはＲｏｃｋｌａｎｄ社製抗ｈＴＥＲＴポリクロ―ナル抗体を用いてブロットを行ない検出されたバンドを示す。トリプルネガティブ乳がん細胞株をサンプルとし、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった結果を示す写真である。上のパネルは抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（２Ｅ４－２）を用いてブロットし検出されたバンドを、下のパネルはウェスタンブロッティングに使用したトリプルネガティブ乳がん細胞株から抽出したＲＮＡを用いて行なったＲＴ－ＰＣＲの結果であり、検出されたバンドはｈＴＥＲＴのｍＲＮＡの発現量を示す。なお、いずれの細胞でもＲＮＡの発現量とタンパク質の発現量とは相関が見られた。ＦＬＡＧタグを付加したｈＴＥＲＴタンパク質を過剰発現した２９３Ｔ細胞を使用し、プロテインＡ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体又は抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（１０Ｅ９－２）を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行ない、免疫沈降後のビーズをサンプルとしてウェスタンブロッティングを行なった結果を示す写真である。また、抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）抗体を用いてウェスタンブロッティングを行ない、ｈＴＥＲＴに付加しているＦＬＡＧタグを検出することによって免疫沈降の効率を評価し、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体によって得られたバンドを１００とした時の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体によって得られたバンドの相対的な量をパネル下部の数値に示す。ＨｅＬａ細胞を使用し、プロテインＡ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体又は抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（１０Ｆ３－１０）を用いて免疫沈降を行ない、免疫沈降後のビーズから抽出したＲＮＡをサンプルとしてＲＴ－ＰＣＲを行なった結果を示す写真である。なお、ｈＴＥＲＴに結合するＲＮＡ　ＲＭＲＰ及びｈＴＥＲＣを検出することで免疫沈降の効率を評価し、上のパネルにはＲＭＲＰの配列に特異的なプライマーを使用して検出したバンドを、下のパネルにはｈＴＥＲＣの配列に特異的なプライマーを使用して検出したバンドを示す。また、各パネル下部の数値はＲｏｃｋｌａｎｄ社製抗ｈＴＥＲＴポリクロ―ナル抗体によって得られたバンドを１００とした時の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体によって得られたバンドの相対的な量を示す。ＨｅＬａ細胞を用いてクロマチン免疫沈降を行ない、テロメア末端配列を検出するプローブ（ＴＲＦプローブ）を用いたドットブロット法により評価した結果を示す写真である。上のパネルは抗体なし（抗体（－））でクロマチン免疫沈降した画分、中央のパネルはＲｏｃｋｌａｎｄ社製抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体でクロマチン免疫沈降した画分、下のパネルは抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（１０Ｅ９－２）でクロマチン免疫沈降した画分を示す。ＧＦＰ－ｈＴＥＲＴ発現ＨｅＬａ細胞を、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体及びＤＡＰＩを用いた蛍光免疫染色によって分析した結果を示す顕微鏡写真である。一番上の４枚のパネルは、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（１０Ｅ９－２）及びＤＡＰＩで、中央の４枚のパネルは、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体及びＤＡＰＩで、一番下の４枚のパネルは、１次抗体無しで染色した結果を各々示す。また、一番左の列はＤＡＰＩ染色像、左から二列目はＧＦＰ－ｈＴＥＲＴ像、左から３列目は抗ｈＴＥＲＴ抗体染色像、一番右の列はＤＡＰＩ染色像、ＧＦＰ－ｈＴＥＲＴ像、抗ｈＴＥＲＴ抗体染色像の重ね合わせ画像である。スケールバーは２０μｍを示す。ＢＪ細胞及びＢＪ－ｐＢＨ－ｈＴＥＲＴ細胞を、抗ｈＴＥＲＴ抗体及びＤＡＰＩを用いた蛍光免疫染色によって分析した結果を示す顕微鏡写真である。上の６枚のパネルはＢＪ細胞、下の６枚のパネルはＢＪ－ｐＢＨ－ｈＴＥＲＴ細胞で、左から１、２列目がＤＡＰＩ及びＲｏｃｋｌａｎｄ社製抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体染色像、左から３、４列目がＤＡＰＩ及び抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（１０Ｅ９－２）染色像、左から５、６列目がＤＡＰＩ及び１次抗体無しの染色像を示す。スケールバーは２０μｍを示す。本発明の抗体（２Ｅ４－２、２Ｅ４－１０又は１０Ｅ９－１０由来のモノクローナル抗体）を導入してから２４時間経過後のＨｅｌａ細胞におけるＭ期細胞の比率を示すグラフである。本発明の抗体（２Ｅ４－２又は１０Ｅ９－２由来のモノクローナル抗体）を導入してから４８時間経過後のＨｅｌａ細胞において、アポトーシスが誘導された細胞の比率を示すグラフである。なお、１撮影パネル（１観察視野）を１サンプルとして統計処理し、「コントロールＩｇＧ　ｖｓ　１０Ｅ９－２」においては、０．０５以下というＰ値を得（図中「＊」で示す）、「コントロールＩｇＧ　ｖｓ　２Ｅ４－２」においては、０．０１以下というＰ値を得た（図中「＊＊」で示す）。本発明の抗体（２Ｅ４－２又は１０Ｅ９－２由来のモノクローナル抗体）を導入してから２４時間経過後のＨｅｌａ細胞において、アポトーシスが誘導された細胞の比率を示すグラフである。なお、１撮影パネルを１サンプルとして統計処理し、「コントロールＩｇＧ　ｖｓ　１０Ｅ９－２」においては、０．０００３以下というＰ値を得（図中「＊＊＊」で示す）、「コントロールＩｇＧ　ｖｓ　２Ｅ４－２」においては、０．０００１以下というＰ値を得た（図中「＊＊＊」で示す）。本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体のエピトープを絞り込むために用いた５種のポリペプチド（ｈＴＥＲＴ３０４－３８３、ｈＴＥＲＴ３２４－４０３、ｈＴＥＲＴ３４４－４２３、ｈＴＥＲＴ３６４－４４３及びｈＴＥＲＴ３８４－４６０）と、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体の作製に免疫原として用いたｈＴＥＲＴタンパク質の３０４～４６０アミノ酸配列からなるポリペプチドとの位置関係を示す概略図である。各ポリペプチドの名称中の数字は、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿９３７９８３．２で特定されるタンパク質におけるアミノ酸の位置を示す。図３３に記載の５種のポリペプチドを発現させた大腸菌を培養し、得られた培養菌体の破砕上清をウェスタンブロット法にて分析した結果を示す写真である。図３３に記載の５種のポリペプチドと、本発明のモノクローナル抗体（２Ｅ４－２、２Ｅ４－５、２Ｅ４－１０、１０Ｅ９－２及び１０Ｅ９－１０由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体）との反応性を、ウェスタンブロット法にて分析した結果を示す写真である。図３３に記載の５種のポリペプチドと、本発明のモノクローナル抗体（９Ｂ１０－７、１０Ｃ１０－５、１０Ｆ３－１０及び１０Ｆ３－１－１１由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体）との反応性を、ウェスタンブロット法にて分析した結果を示す写真である。本発明のモノクローナル抗体（１０Ｅ９－２、２Ｅ４－２及び２Ｅ４－１０由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体）と、その免疫原であるポリペプチドを７５に分けて合成したポリペプチド（表１４参照）との反応性を、メンブレンペプチドアレイにて分析した結果を示す写真である。図中、メンブレンを囲む数字（Ｎｏ．）は、表１４に記載のペプチド（Ｐｅｐ．）Ｎｏ．で特定されるポリペプチドがスポットされている各々の位置を示す。

　本発明は、配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を提供する。

　本発明にかかる「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。また、本発明にかかる「モノクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物であるポリクローナル抗体とは対照的に、抗原上の単一の決定基を認識するものである。

　また、本発明の「モノクローナル抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスを含み、さらに、抗体の機能的断片の形態も含む意である。

　本発明にかかる「配列番号：２」に記載のアミノ酸配列は、ヒトテロメレース逆転写酵素（ｈｕｍａｎ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ｈＴＥＲＴ）に由来するものであり、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿９３７９８３．２で特定されるタンパク質、すなわちＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿１９８２５３．２で特定される塩基配列がコードするタンパク質の１８０位（アラニン残基）～４６０位（グルタミン残基）に記載のアミノ酸配列である。従って、「本発明にかかる配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列」は、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿９３７９８３．２で特定されるタンパク質、すなわちＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿１９８２５３．２で特定される塩基配列がコードするタンパク質の３０４位（ヒスチジン残基）～４６０位（グルタミン残基）に記載のアミノ酸配列である。

　本発明の抗体は、好ましくは、配列番号：２のアミノ酸番号１２５～１４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿９３７９８３．２で特定されるタンパク質の３０４～３２３位に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体）であり、より好ましくは、配列番号：２のアミノ酸番号１２９～１４２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿９３７９８３．２で特定されるタンパク質の３０８～３２１位に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体）であり、さらに好ましくは、配列番号：２のアミノ酸番号１３１～１４０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿９３７９８３．２で特定されるタンパク質の３１０～３１９位に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体）であり、特に好ましくは、配列番号：２のアミノ酸番号１３３～１３８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿９３７９８３．２で特定されるタンパク質の３１２～３１７位に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体）である。

　本発明のモノクローナル抗体の好ましい態様は、後述の実施例に記載の、９Ｂ１０－１０、１０Ｆ３－１０、２Ｅ４－２、２Ｅ４－１０及び１０Ｅ９－２（１０Ｅ９－１０）からなる群より選択される少なくとも１のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体である。

　また、本発明のモノクローナル抗体の好ましい別の態様は、前記ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域とを保持する抗体又はそれらのアミノ酸配列変異体である。具体的には、以下の抗体である。

　「２Ｅ４－２のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲを含む可変領域を保持する抗体」
　（ａ）配列番号：２２～２４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３２～３４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、配列番号：１５３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、または
　（ｂ）配列番号：２７～２９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３２～３４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、配列番号：１５３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体。

　「２Ｅ４－１０のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲを含む可変領域を保持する抗体」
　（ｃ）配列番号：３７～３９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４２～４４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、配列番号：１５４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体。

　「１０Ｅ９－２（１０Ｅ９－１０）のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲを含む可変領域を保持する抗体」
　（ｄ）配列番号：４７～４９（５７～５９）に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：５２～５４（６２～６４）に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、配列番号：１５２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体。

　「２Ｅ４－２のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の可変領域を保持する抗体」
　（ｅ）配列番号：２６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、配列番号：１５３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、または
　（ｆ）配列番号：３１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、配列番号：１５３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体。

　「２Ｅ４－１０のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の可変領域を保持する抗体」
　（ｅ）配列番号：４１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、配列番号：１５４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体。

　「１０Ｅ９－２（１０Ｅ９－１０）のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の可変領域を保持する抗体」
　（ｅ）配列番号：５１（６１）に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：５６（６６）に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、配列番号：１５２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体。

　なお「ＣＤＲ」とは、相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）とも称され、抗体を構成する可変領域において、抗原に対する結合を担う部位のことである。また、ＣＤＲは、可変領域中の極めて変異度の高い領域のことであり、抗体（免疫グロブリン）を構成する重鎖及び軽鎖の可変領域中に各々３ヶ所（ＣＤＲ１～３）ずつ存在する。

　さらに、本発明のモノクローナル抗体の好ましい別の態様は、後述の実施例６に記載のＥＬＩＳＡにおいて、吸光度（測定波長４５０ｎｍ）が０．２以上（より好ましくは０．５以上、特に好ましくは１．０以上）であるモノクロ―ナル抗体である。

　また、本発明のモノクローナル抗体の好ましい別の態様は、後述の実施例９に記載の免疫沈降において、ｈＴＥＲＴタンパク質を沈降させる活性が、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製　抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（ウサギ由来、カタログ番号：６００－４０１－２５２）と比較して、２倍以上（より好ましくは５倍以上）であるモノクロ―ナル抗体である。

　さらに、本発明のモノクローナル抗体の好ましい別の態様は、後述の実施例９に記載のＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降において、ｈＴＥＲＴタンパク質に結合しているＲＮＡ（ＲＭＲＰ又はｈＴＥＲＣ）を共沈降させる活性が、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製　抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（ウサギ由来、カタログ番号：６００－４０１－２５２）と比較して、２倍以上（より好ましくは３倍以上）であるモノクロ―ナル抗体である。

　また、本発明のモノクローナル抗体の好ましい別の態様は、後述の実施例９に記載のクロマチン免疫沈降において、ｈＴＥＲＴタンパク質に結合している末端制限フラグメント（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＴＲＦ）を共沈降させる活性を有するモノクロ―ナル抗体である。

　さらに、本発明のモノクローナル抗体の好ましい別の態様は、Ｍ期にて細胞周期を停止させる活性を有するモノクロ―ナル抗体である。

　また、本発明のモノクローナル抗体の好ましい別の態様は、アポトーシスを誘導する活性を有するモノクロ―ナル抗体である。

　本発明のモノクローナル抗体は、後述するように、研究用試薬としての利用の他、診断薬や治療薬等の医薬として利用することが可能である。従って、本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びこれら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、特に、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が望ましい。

　本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平７－１９４３８４号公報、特許３２３８０４９号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体のＣＤＲの遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、特許２９１２６１８号、特許２８２８３４０号公報、特許３０６８５０７号公報、欧州特許２３９４００号公報、欧州特許１２５０２３号公報、国際公開９０／０７８６１号公報、国際公開９６／０２５７６号公報参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５－２５８（１９９２）、Ｉｎｔｅｒｎ．　Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：６５－９３（１９９５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１－５９７（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６－１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２－７２７（２０００）、特開平１０－１４６１９４号公報、特開平１０－１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１－２０６３８７号公報、特表平８－５０９６１２号公報、特表平１１－５０５１０７号公報）。

　本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。

　ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。

　「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。

　本発明のモノクローナル抗体には、望ましい活性（例えば、ウェスタンブロット法、細胞免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降法等の検出方法において、ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に検出する活性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明のモノクローナル抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、又はペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明のモノクローナル抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６－８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５－４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０－２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５－３５１（２００８））。

　改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。

　アミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対象抗体（代表的には、本実施例に記載の抗体、すなわち、９Ｂ１０－１０、１０Ｆ３－１０、２Ｅ４－２、２Ｅ４－１０及び１０Ｅ９－２（１０Ｅ９－１０）からなる群より選択される少なくとも１のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体）と同等であることが好ましい。抗原への結合活性は、例えば、配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いたＥＬＩＳＡによって評価することができる（後述の実施例６　参照）。また、ｈＴＥＲＴタンパク質が発現している細胞を用いた、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降、クロマチン免疫沈降、細胞免疫染色によっても評価することができる（後述の実施例９　参照）。

　また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数、位置、種類を変化させるなどの抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ－結合又はＯ－結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる（特開２００８－１１３６６３号公報、特許４３６８５３０号公報、特許４２９０４２３号公報、米国特許第５０４７３３５号公報、米国特許第５５１０２６１号公報、米国特許第５２７８２９９号公報、国際公開第９９／５４３４２号公報）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。

　また、本発明の抗体の抗原であるｈＴＥＲＴタンパク質は、細胞の核内において発現している。従って、細胞内にて本発明の抗体を効率良くｈＴＥＲＴタンパク質と結合させるために、本発明の抗体は、核移行シグナルが付加又は挿入されているものであっても良い。

　本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法によって作製することができる。

　ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。

　組換えＤＮＡ法は、上記本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば、哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７　ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０））。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。本発明のモノクローナル抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。

　従って、本発明は、配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドで免疫することを特徴とする、ヒトテロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）に対するモノクローナル抗体の製造方法をも提供する。

　また、後述の実施例において示す通り、かかる製造方法にて得られたモノクローナル抗体のエピトープは、配列番号：２のアミノ酸番号１２５～１４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号：２のアミノ酸番号１２９～１４２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号：２のアミノ酸番号１３１～１４０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、特に配列番号：２のアミノ酸番号１３３～１３８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに集中していることが明らかになった。

　故に、本発明は、好ましくは、配列番号：２のアミノ酸番号１２５～１４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（より好ましくは、配列番号：２のアミノ酸番号１２９～１４２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、さらに好ましくは、配列番号：２のアミノ酸番号１３１～１４０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、特に好ましくは、配列番号：２のアミノ酸番号１３３～１３８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）で免疫する、ヒトテロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）に対するモノクローナル抗体の製造方法をも提供する。

　また、本発明は、上記本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ＤＮＡを保持する宿主細胞、及び該宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む抗体の生産方法をも提供することができる。

　本発明のモノクローナル抗体は後述の実施例において示す通り、ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に認識して結合することができ、特に、ウェスタンブロット法、細胞免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降法等において、内在性ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に認識して結合することができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、クロマチン免疫沈降法、ＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降法において、ｈＴＥＲＴタンパク質に結合しているＲＮＡやＤＮＡも共沈降させることができる。従って、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を有効成分とする、ｈＴＥＲＴタンパク質を検出及び/又は精製するための組成物を提供する。また、ｈＴＥＲＴタンパク質に結合している分子（核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）、タンパク質等）を検出及び/又は精製するための組成物を提供する。

　さらに、本発明のモノクローナル抗体は、後述の実施例１２に示す通り、細胞周期をＭ期において停止させることができる。従って、上記本発明のモノクローナル抗体を含有する、細胞周期のＭ期において細胞を停止させるための組成物を、本発明は提供する。

　また、本発明のモノクローナル抗体は、後述の実施例１２に示す通り、アポトーシスを誘導することができる。従って、上記本発明のモノクローナル抗体を含有する、アポトーシスを誘導するための組成物を、本発明は提供する。

　本発明の組成物は、研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）で、ｈＴＥＲＴタンパク質を検出及び/又は精製するための試薬、ｈＴＥＲＴタンパク質に結合している分子を検出及び/又は精製するための試薬の形態であり得る。特に、本発明のモノクローナル抗体は、後述の実施例９に示す通り、内在性レベルでｈＴＥＲＴタンパク質を免疫沈降することができることから、既存のｈＴＥＲＴタンパク質に結合しているＲＮＡ（ＲＭＲＰ、ｈＴＥＲＣ）のみならず、ｈＴＥＲＴタンパク質に結合している新規ＲＮＡを網羅的に解析するための試薬の形態でもあり得る。また、本発明のモノクローナル抗体は、後述の実施例１２に示す通り、細胞周期をＭ期において停止させることができることから、細胞周期のＭ期において細胞を停止させるための試薬の形態でもあり得る。さらに、細胞にアポトーシスを誘導できることから、細胞にアポトーシスを誘導するための試薬の形態でもあり得る。また、本発明のモノクローナル抗体がアンタゴニスト活性を有している場合には、テロメレース活性を阻害するための試薬、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を阻害するための試薬又はｉＰＳ細胞等の幹細胞の分化を阻害するための試薬の形態でもあり得る。一方、本発明のモノクローナル抗体がアゴニスト活性を有している場合には、テロメレース活性を促進するための試薬、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を促進するための試薬、ＲＮＡ干渉作用を増幅するための試薬又はｉＰＳ細胞等の幹細胞の分化を促進するための試薬の形態でもあり得る。

　また、ｈＴＥＲＴの重要な役割は、がん細胞の不死化能の維持又はがん幹細胞の機能維持であることから、本発明の組成物は、各種がん（胃がん、肺がん、大腸がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、腹膜がん、肝臓がん、前立腺がん、原発不明がん、悪性リンパ腫、白血病等）及び/又はこれらのがん種のがん幹細胞に対する診断薬の形態であり得る。

　本発明の組成物としては、本発明のモノクローナル抗体の他、試薬又は診断薬として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩が挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。さらに、本発明の抗体を細胞内に導入するために、後述の細胞内導入用担体等を本発明の組成物が他の成分として含んでいても良い。

　また、本発明のモノクローナル抗体を研究目的におけるｈＴＥＲＴタンパク質の検出や、癌等の診断に用いる場合、本発明のモノクローナル抗体は、標識したものであってもよい。かかる標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能であり、具体的には、ラジオアイソトープ、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、ビオチン／アビジン等が挙げられる。

　さらに、本発明のモノクローナル抗体をｈＴＥＲＴタンパク質の精製や、ｈＴＥＲＴタンパク質に結合している分子（核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）、タンパク質等）の検出及び/又は精製に用いる場合、本発明のモノクローナル抗体は、担体に直接固定化したものであってもよい。かかる担体としては、アガロース、多孔性シリカ、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、磁性ビーズが挙げられる。

　また、本発明の組成物の製品（試薬、診断薬）又はその説明書は、ｈＴＥＲＴタンパク質の検出等に用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。

　さらに、本発明の抗体又は組成物を細胞内に導入する方法としては特に制限はなく、例えば、細胞内導入用担体（リポソーム等の脂質系担体（例えば、ＯＺ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の「Ａｂ－ＤｅｌｉｖｅｒＩｎ」）、炭酸アパタイトナノ粒子等の非脂質系担体）を利用する導入法、インジェクション法、エレクトロポレーション法、不活化センダイウィルス等を利用する膜融合法が挙げられる。また、本発明の抗体をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを、トランスフェクション試薬を利用する導入法、エレクトロポレーション法、インジェクション法等により、細胞内に導入した上で、該細胞内にて本発明の抗体を発現させてもよい。

　さらに、本発明の抗体、該抗体をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクター又は組成物を生体内に投与して細胞内に導入するために、公知の薬物送達方法を利用することができる。かかる薬物送達方法としては特に制限はないが、例えば、ヒドロキシセルロース、ゼラチン、ポリ(メタクリル酸メチル)、エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ酢酸、キトサン、シクロデキストリン等の化合物からなるマイクロカプセルに本発明の抗体等を封入する方法、本発明の抗体等をヒドロキシセルロース、ゼラチン、ポリ(メタクリル酸メチル)、エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ酢酸、キトサン、シクロデキストリン等の化合物によりコーティングする方法、又は本発明の抗体等を、マイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル、リポソーム等の化合物と混合する方法が挙げられる。

　さらに、本発明の組成物は、本発明の抗体がアンタゴニスト活性（テロメーレス活性阻害能、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性阻害能、幹細胞の分化に対する阻害能、Ｍ期において細胞周期を停止させる活性、アポトーシスを誘導する活性等）を有している場合には、各種がん（胃がん、肺がん、大腸がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、腹膜がん、肝臓がん、前立腺がん、原発不明がん、悪性リンパ腫、白血病等）、原発性肺線維症を治療するための医薬組成物又はがん幹細胞を治療標的とする医薬組成物の形態もとり得る。

　一方、本発明の抗体がアゴニスト活性を有している場合には、再生不良性貧血、先天性角化異常症（ｄｙｓｋｅｒａｔｏｓｉｓｉ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａ）、原発性肺線維症を治療するための医薬組成物の形態もとり得る。また、本発明の抗体がアゴニスト活性を有している場合には、ｈＴＥＲＴはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしてＲＮＡ干渉作用の増幅を促進することができることから、ＲＮＡ干渉を利用する医薬組成物の形態もとり得る。さらに、ＲＭＲＰはその遺伝子変異が軟骨毛髪低形成症候群の発症と関連し、またＲＭＲＰの発現制御にｈＴＥＲＴが関与していることから、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体は軟骨毛髪低形成症候群を治療するための医薬組成物の形態もとり得る。

　本発明のモノクローナル抗体は、後述の実施例１２に示す通り、細胞周期をＭ期において停止させることができる。従って、上記本発明のモノクローナル抗体を細胞内に導入する工程を含む、細胞周期をＭ期にて停止させるための方法を本発明は提供する。かかる方法において、本発明の抗体を細胞内に導入する方法としては特に制限はなく、前述のリポソーム等の脂質系担体を利用する方法等が挙げられる。

　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

　（実施例１）
　［抗原部位の選定］
　ヒトテロメレース逆転写酵素（ｈｕｍａｎ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ｈＴＥＲＴ、ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿９３７９８３．２（ＮＭ＿１９８２５３．２））に対する抗体を作製するため、先ず抗原として適した部位の探索を行なった。すなわち、免疫動物として用いるマウス由来のＴＥＲＴとｈＴＥＲＴとのアミノ酸配列における相同性、ｈＴＥＲＴタンパク質の二次構造予測、親水性、抗原性等の複数のパラメーターを算出・数値化し、候補として適当な部位を検討した。得られた結果を図１～１２に示す。なお、図１～１２において、「ロブソン　ガミエル（Ｒｏｂｓｏｎ　ａｎｄ　Ｇａｍｉｅｒ）」はアミノ酸配列から予測した二次構造を示し、「Ｈ」はαへリックス構造、「Ｅ」はβストランド構造、「Ｃ」はランダムコイル構造、「Ｔ」はターン構造をとり得ることを示す。また、「二次構造（Ｓｅｃｏｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」は構造既知のタンパク質とのマルチプルアライメントから予測した二次構造を示し、「Ｈ」はαへリックス構造、「Ｅ」はβストランド構造、「Ｌ」はループ構造をとり得ることを示す。さらに、「接触率（Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）」は溶媒との接触率を示し、「ｅ」は溶媒との接触率が高いこと、「ｂ」は溶媒との接触率が低いことを示す。また、「トータル（Ｔｏｔａｌ）」は、二次構造予測、接触率、柔軟性（Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）、表面への露出のし易さ（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｅｒｍａｂｉｌｉｔｙ）、抗原性（Ａｎｔｉｇｅｎｅｃｉｔｙ）、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）、極性（Ｄｉｐｏｌｅ）の全ての要素を統合して算出した、トータルの予想抗原性を示す。

　図１～１２に示した結果から、ｈＴＥＲＴタンパク質は５５０～９３５アミノ酸中に、テロメレース特異的なＴモチーフ（Ｔ　ｍｏｔｉｆ）を含めた逆転写酵素ドメイン（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ｄｏｍａｉｎ）を有しており、この領域はＤＮＡ結合等により立体障害となる可能性が示唆された。

　なお、これまでの試み（「Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ　Ｌら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、１９９７年、１１巻、２３号、３１０９～３１１５ページ」、Ｍａｒｔｉｎ－Ｒｉｖｅｒａ　ｅｔ　ａｌ，１９９８；「Ｎａｋａｙａｍａ　Ｊら、Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ、１９９８年、１８巻、１号、６５～６８ページ」、「Ｍａｒｔｉｎ－Ｒｉｖｅｒａ　Ｌら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、１９９８年、９５巻、１８号、１０４７１～１０４７６ページ」、「国際公開第９９／０５０４０７号」）においては、抗体作製のための抗原として、ｈＴＥＲＴタンパク質の５５０～６３０アミノ酸の部位から抽出された合成オリゴペプチドが用いられてきた。

　また、ｈＴＥＲＴタンパク質の９３５アミノ酸以降のＣ末側領域は露出度の低いαへリックスの繰り返し構造を取ると予想され、全体的に数値が低値で推移するなど、抗原としてはあまり適した部位ではないと考えられた。なお、現時点でウェスタンブロッティング等において唯一ｈＴＥＲＴを検出することができるとされているウサギ由来抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、カタログ番号：６００－４０１－２５２）は、ｈＴＥＲＴタンパク質（Ａｃｃｅｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＡＣ５１７２４．１（ＡＦ０１８１６７．１））のＣ末側付近の領域から抽出された合成オリゴペプチドを抗原として調製されている。さらに、図には示さないが、本発明者らの分析により、当該ポリクロ―ナル抗体の認識部位はｈＴＥＲＴタンパク質の８３２アミノ酸以降であることも明らかになっている。

　一方、Ｎ末側領域は露出しやすい長いループ構造を取ると予想される部位が多く、抗原性の高さを示す数値も高値で推移していた。さらにマウスＴＥＲＴタンパク質に対する配列特異性も良好であったため、その点でも抗原性が高いと予想した。そこで、ｈＴＥＲＴのＮ末側領域のリコンビナントタンパク質（ｈＴＥＲＴタンパク質の１８０～４６０アミノ酸）を抗原として、抗体を作製することとした。なお、抗原には発現確認・精製用にＨｉｓ－ｔａｇを付加した。

　（実施例２）
　［人工遺伝子の合成］
　ｈＴＥＲＴタンパク質１８０～４６０アミノ酸の配列（配列番号：２）から塩基配列を設計した。設計の際には、大腸菌での発現効率を上げる為、大腸菌で使用されやすいコドンにアミノ酸配列が変化しないよう置き換えた。また、５’側と３’側に発現ベクターへ導入する為の制限酵素部位（５’側：ＮｄｅＩ制限部位（ｃａｔａｔｇ）、３’側：ＸｈｏＩ制限部位（ｃｔｃｇａｇ））を付加した。設計した塩基配列を配列番号：１に示す。そして、このようにして設計した塩基配列を基に、人工遺伝子を合成した。すなわち先ず、目的配列（設計した塩基配列）をバイオインフォマティクス的に解析し、合成方法を設計した。次いで、２００～２５０塩基の１本鎖を複数本作製し、アニーリングして直鎖２本鎖を作製した。そして、得られた直鎖２本鎖をプラスミドベクター（ｐＩＤＴＳｍａｒｔ－ＫＡＮ、ＩＤＴ社製）に挿入し、大腸菌に導入した。次に、得られた形質転換体（大腸菌コロニー）に入っているプラスミドベクターの塩基配列を確認し、その後、シークエンスを行い、目的配列を有する人工遺伝子が合成されていることを確認した。

　（実施例３）
　［抗原（ｈＴＥＲＴタンパク質の１８０～４６０アミノ酸）の調製］
　＜３－１　大腸菌発現ベクターの構築＞
　前記人工遺伝子を含むプラスミドベクター及び大腸菌発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を、制限酵素ＮｄｅＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）及びＸｈｏＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）にて切断した。Ｍｕｐｉｄ－２ｐｌｕｓサブマリン型電気泳動装置（ＡＤＶＡＮＣＥ社製）を用いたアガロース電気泳動によって、制限酵素による切断を確認し、目的のバンドをアガロースゲルより切り出して精製した。精製にはＱＩＡクイックゲル抽出キット（ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いた。そして、精製した目的配列及び大腸菌発現ベクターをライゲーション反応液（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）に加え、１６℃にて３０分間ライゲーション反応を行った。次いで、得られたプラスミドベクターを大腸菌ＤＨ５αに導入し、この大腸菌をカナマイシンを含んだＬＢ寒天培地にプレーティングし、３７℃にて一晩培養した。

　培養後、得られたコロニーは、ｐＥＴ－３０ａ（＋）のシークエンスプライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的遺伝子が含まれているかどうかを確認した。なお、シークエンスプライマーはＴ７　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒの配列（配列番号：３　５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）、Ｔ７　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｐｒｉｍｅｒの配列（配列番号：４　５’－ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ－３’）を用いた。そして、コロニーＰＣＲの結果、目的遺伝子が含まれていると思われる菌体を２～３ｍＬのカナマイシン入りＬＢ培地で一晩培養し、翌日、菌体を回収した。次いで、回収した菌体からＱＩＡプレップスピンミニプレップキット（ＱＩＡ　ｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、プラスミドを精製した。

　そして、精製プラスミドの組み込み部位の塩基配列を確認し、目的遺伝子が正しく大腸菌発現ベクターに組み込まれていることを確認した。なお、シークエンスプライマーは前記と同じく、配列番号：３及び４に記載の塩基配列からなるプライマーを用いた。

　＜３－２　小スケールでの発現試験＞
　前記にて得られた発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１派生株のコンピテントセルに導入した。この大腸菌の形質転換は１０μＬの前記コンピテントセルに前記発現プラスミドを加え、氷上に３０分間静置した後、ＳＯＣ培地を添加して３７℃にて培養を行ない、その後、カナマイシン入りのＬＢ寒天培地にプレーティングし、一晩培養することによって行った。

　このようにして形質転換した大腸菌のシングルコロニーを、２～３ｍＬのカナマイシンを加えたＬＢ培地にて対数増殖中期（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．６）になるまで培養し、Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．６付近となった時点で１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し、３７℃培養については２時間かけ、２０℃培養については４時間かけ、発現誘導を行った。

　そして、発現誘導後の菌体溶液を１ｍＬずつ２本のチューブに回収し、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心して培地を除いた。その後、菌体に２００μＬの溶菌バッファー（Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ、ＭＢＬ社製）を加え、超音波破砕を行なった。破砕後、１本のチューブは２００μＬの２×サンプルバッファー（ＭＢＬ社製）を添加し、沸騰浴中で３分間煮沸した。これを全部（Ｗｈｏｌｅ）サンプルとした。また、残り１本は破砕後に遠心分離（１５，０００ｒｐｍにて５分間）を行った。遠心分離後の上清を回収し、その上清に２００μＬの２×サンプルバッファーを加え、沸騰浴中で３分間煮沸した。これを上清（ｓｕｐ．）サンプルとした。また、遠心分離後に残ったペレットは４００μＬの１×サンプルバッファー（ＭＢＬ社製）を加え、沸騰浴中で３分間煮沸した。これを沈殿物（ｐｐｔ．）サンプルとして調製した。

　そして、このように調製した各サンプルについて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとＨｉｓ－Ｔａｇに対する抗体（ＭＢＬ社製）を用いたウエスタンブロット法により目的タンパク質の発現の有無、発現画分、発現量を確認した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット法は１５％アクリルアミドゲルを用いて実施し、１レーンあたり培養液２５μＬ分の菌体に相当するタンパク質量を泳動した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥはＣＢＢ染色を行なった後、脱色を行なった。ウエスタンブロット法では、先ずサンプルの泳動が終了した後、ブロッティング装置により、１００Ｖにて１時間かけて、ＰＶＤＦ膜（イモビロンＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ）、ミリポア社製、孔径：０．４５μｍ）への転写を行った。転写終了後、５％スキムミルク／ＰＢＳにてブロッキングを行ない、１次抗体として抗Ｈｉｓ　ｔａｇモノクローナル抗体（ＭＢＬ社製、クローン　６Ｃ４）を１，０００倍希釈したものを、２次抗体として抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ標識抗体（ＭＢＬ社製）を４，０００倍希釈したものを使用して、検出を行なった。検出は、発色基質としてスーパーシグナルウエスト・ピコ・ケミルミネッセント・サブストレート（ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ　ＷＥＳＴ　ＰＩＣＯ　ＣＨＥＭＩＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ　ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ、ＰＩＥＲＣＥ社（現　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）製）を、現像用のフィルムとしてアマシャムハイパーフィルムＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ　ＥＣＬ、ＧＥヘルスケア社製）を使用して行なった。得られた結果を図１３に示す。なお、図１３において、レーン１は「３７℃で２時間かけて発現誘導したもの全部を泳動」、レーン２は「３７℃で２時間かけて発現誘導したものの沈殿物を泳動」、レーン３は「３７℃で２時間かけて発現誘導したものの上清を泳動」、レーン４は「２０℃で４時間かけて発現誘導したもの全部を泳動」、レーン５は「２０℃で４時間かけて発現誘導したものの沈殿物を泳動」、レーン６は「２０℃で４時間かけて発現誘導したものの上清を泳動」、レーン７は「１％グルコース添加培地にて３７℃で２時間かけて発現誘導したもの全部を泳動」、レーン８は「１％グルコース添加培地にて３７℃で２時間かけて発現誘導したものの沈殿物を泳動」、レーン９は「１％グルコース添加培地にて３７℃で２時間かけて発現誘導したものの上清を泳動」した結果を各々示す。また、図１３のＡにおいて、レーン１０は「ＢＳＡ　０．５μｇを泳動」、レーン１１は「ＢＳＡ　１μｇを泳動」、レーン１２は「ＢＳＡ　２μｇを泳動」した結果を各々示し、図１３のＢにおいて、レーン１０は「陰性対照を泳動」、レーン１１は「陽性対照を泳動」した結果を各々示す。

　図１３に示した結果から明らかなように、ウエスタンブロット法にて３２ｋＤａのタンパク質の発現が確認できた（図１３のＢ）。しかし、発現量が少なく、通常の発現条件（３７℃にて２時間かけてのＩＰＴＧ誘導）では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて目的のバンドが確認できなかった（図１３のＡ）。そこで、発現条件の至適化を行ない、１％グルコース添加培地による発現・誘導によって目的タンパク質の発現量が増加することを確認し、これを発現条件として設定した。ただし、それでも発現量は１～２ｍｇ／Ｌ程度と推測され、抗体作製のために必要な量を得るためには大スケールで培養する必要がある事も分かった。

　＜３－３　大量培養＞
　カナマイシン入りのＬＢ寒天培地上の前記コロニーをピックアップし、１００ｍＬの１％グルコース含有ＬＢ培地に植菌して、３７℃にて一晩培養（種母培養）した。そして、翌日に、８Ｌ（１Ｌ×８本）のグルコース含有ＬＢ培地に２％の前記種母培養菌体を添加し、対数増殖期（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．６）まで３７℃にて撹拌培養を行なった。次いで、Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．６付近となった時点で１ｍＭ　ＩＰＴＧを加え、３７℃にて２時間かけて培養し、発現誘導を行ない、菌体を回収した。

　＜３－４　Ｎｉ－キレートカラムによる精製＞
　回収した菌体を溶菌バッファー（ＭＢＬ社製）に懸濁後、超音波破砕を行なった。破砕後、遠心分離により菌体破砕上清と不溶性画分に分離した。結果、目的タンパク質は不溶性画分にて多く確認されたため、不溶性画分にタンパク質変性剤含有可溶化バッファー（ＭＢＬ社製）を加え、溶解後、遠心分離を行ない上清を回収した。回収した上清はＡＫＴＡｐｒｉｍｅプラス（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）に繋げたＮｉキレートカラム（Ｎｉ　キレーティング・セファロースＦＦ（Ｎｉ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ）、ＧＥヘルスケア社製）１０ｍＬにアプライし、吸光度（Ａ２８０ｎｍ）が０．０５以下となるまで洗浄バッファー（ＭＢＬ社製）にて洗浄した。洗浄後、イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を含むバッファー（ＭＢＬ社製）によりステップワイズ溶出を行ない、各フラクション（画分）を回収した。回収したフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動し、目的タンパク質の確認を行なった。泳動の際のゲルや染色は、＜３－２＞と同様の方法にて実施した。得られた結果を図１４に示す。なお図１４中、レーン１は「Ｎｉキレートカラムにアプライする前のサンプルを泳動」、レーン２は「Ｎｉキレートカラムを素通りした画分を泳動」、レーン３～１０は「３５ｍＭイミダゾールによる洗浄画分を泳動」、レーン１１～１９は「６０ｍＭイミダゾールによる洗浄画分を泳動」、レーン２０～２４は「２５０ｍＭイミダゾールによる洗浄画分を泳動」した結果を各々示す。

　図１４に示した結果から明らかなように、８Ｌの培養菌体の破砕上清から精製を行なったが、目的の３２ｋＤａ付近にはバンドが見られず、精製タンパク質を得ることができなかった。目的タンパク質が得られなかった原因として、８Ｌ培養での大量発現ではスケールアップによる発現低下が起きていることが考えられた。８Ｌ培養と小スケールの発現試験とで異なる部分としては、８Ｌスケールではストック菌株を一旦１００ｍＬスケールで前培養を行ない、その後８Ｌへと引き上げる、二段階での培養になっている点が挙げられる。この二段階培養が発現低下の原因である可能性を考え、前培養を行なわないコロニーピックアップ法を検討することとした。

　＜３－５　コロニーピックアップ法での大量培養＞
　先ず、培養量１Ｌの系でコロニーピックアップ法での発現試験を行なった。その結果、ウエスタンブロットで＜３－２＞に記載の小スケールでの発現試験と同等の発現量しか確認できなかったが、寒天培地上のコロニーから直接１ＬのＬＢ培地８本に植菌するコロニーピックアップ法での大量培養を行なった。

　すなわち、カナマイシン入りのＬＢ寒天培地上の前記コロニーをピックアップし、１Ｌのグルコース含有ＬＢ培地８本（計８Ｌ）に植菌し、対数増殖期（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．６）まで３７℃にて撹拌培養を行ない、Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．６付近となった時点で１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加して３７℃にて２時間培養し、発現誘導を行った。以降の操作は＜３－３＞に記載した方法で実施した。得られた結果を図１５及び１６に示す。なお、図１５中、レーン１は「Ｎｉキレートカラムにアプライする前のサンプルを泳動」、レーン２は「Ｎｉキレートカラムを素通りした画分を泳動」、レーン３～１１は「３５ｍＭイミダゾールによる洗浄画分を泳動」、レーン１２～１９は「６０ｍＭイミダゾールによる洗浄画分を泳動」、レーン２０～２５は「２５０ｍＭイミダゾールによる洗浄画分を泳動」した結果を各々示す。また、図１６中、レーン１は「Ｎｉキレートカラムにアプライする前のサンプルを泳動」、レーン２は「Ｎｉキレートカラムを素通りした画分を泳動」、レーン３は「３５ｍＭイミダゾールによる洗浄画分を泳動」、レーン４は「６０ｍＭイミダゾールによる溶出画分を泳動」、レーン５は「２５０ｍＭイミダゾールによる洗浄画分を泳動」、レーン６は「陰性対照を泳動」、レーン７は「陽性対照を泳動」した結果を各々示す。さらに、これらの図において、矢印は３２ｋＤａのタンパク質の位置を示す。

　図１５及び１６に示した結果から明らかなように、前培養を行なわない培養菌体からの精製では、２５０ｍＭイミダゾールによる溶出（洗浄）にて目的の３２ｋＤａのバンドを確認することができた。しかしながら、バンドから推定される目的タンパク質の８Ｌ培養での収量は０．１ｍｇ以下とごく微量であり、更に目的タンパク質以外の大腸菌由来のタンパク質が不純物として多く含まれていた。

　以上の大量培養の結果から、リコンビナントタンパク質（ｈＴＥＲＴタンパク質の１８０～４６０アミノ酸）の大量調製は非常に難しいと判断せざるを得ない状況となった。このリコンビナントタンパク質のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ）は大腸菌に合わせたものを使用しているため、種の違いによる発現量の低下が原因ではなく、タンパク質そのものの性質による低発現の可能性が高いと推測された。しかしながら、発現量の低下に１８０～４６０アミノ酸の中のどの部分が影響しているかは不明であるため、複数の部位を試す必要があると考えた。そこで、次に１８０～４６０アミノ酸を２分割した、Ｎ末側（１８０～３２０アミノ酸）とＣ末側（３０４～４６０アミノ酸）のそれぞれについてタンパク質発現を試みた。

　（実施例４）
　［抗原（ｈＴＥＲＴタンパク質の１８０～３２０アミノ酸）の調製］
　＜４－１　大腸菌発現ベクターの構築＞
　ｈＴＥＲＴタンパク質の１８０～４６０アミノ酸をコードする人工遺伝子を含むプラスミドベクターから配列特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法によって１８０～３２０アミノ酸をコードする領域を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ　ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて行ない、反応は９９℃で２分間、その後、「９９℃で２０秒、５９℃で３０秒，６８℃で５０秒」のサイクルを３５回実施した後、６８℃で１分間、４℃にて一晩（Ｏ／Ｎ）という条件にて行なった。また、プライマーは５’側として配列番号：５　５’－ｇｇａａｔｔｃＣＡＴＡＴＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＣＧＴＣ－３’（つくばオリゴサービス株式会社製）、３’側として配列番号：６　５’－ｃｃｇＣＴＣＧＡＧＡＧＧＧＧＴＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧ－３’（つくばオリゴサービス株式会社製）を用いた。

　そして、増幅したバンドをＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで制限酵素処理し、同様の酵素で処理した大腸菌発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）とライゲーション反応液中でライゲーションを行なった。以降の操作は＜３－１＞に記載した方法に準じて行ない、目的遺伝子が正しく大腸菌発現ベクターに組み込まれていることを確認した。

　＜４－２　小スケールでの発現試験＞
　＜４－１＞で得られた発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１派生株のコンピテントセルに導入した。そして、形質転換した大腸菌のシングルコロニーを２～３ｍＬのカナマイシンを加えたＬＢ培地で対数増殖期まで培養した後、１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加して２時間かけ発現誘導を行った。次いで、誘導後の菌体を回収して、＜３－２＞に記載の方法に準じて、各サンプルを調製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとＨｉｓ－Ｔａｇに対する抗体を用いたウエスタンブロット法により目的タンパク質の発現の有無、発現画分、発現量を確認した。得られた結果を図１７に示す。なお、図１７において、レーン１は「誘導せずに３７℃で一晩培養したもの全部を泳動」、レーン２は「誘導せずに３７℃で一晩培養したものの沈殿物を泳動」、レーン３は「誘導せずに３７℃で一晩培養したものの上清を泳動」、レーン４は「誘導せずに３７℃で２時間培養したもの全部を泳動」、レーン５は「３７℃で２時間かけて発現誘導したもの全部を泳動」、レーン６は「３７℃で２時間かけて発現誘導したものの沈殿物を泳動」、レーン７は「３７℃で２時間かけて発現誘導したものの上清を泳動」した結果を各々示し、矢印は１６．１ｋＤａのタンパク質の位置を示す。また、図１７のＡにおいて、レーン８は「ＢＳＡ　０．５μｇを泳動」、レーン９は「ＢＳＡ　１μｇを泳動」、レーン１０は「ＢＳＡ　２μｇを泳動」した結果を各々示し、図１７のＢにおいて、レーン８は「陰性対照を泳動」、レーン９は「陽性対照を泳動」した結果を各々示す。

　図１７に示した結果から明らかなように、予想される分子量１６．１ｋＤａのタンパク質が発現していることは確認できたが、発現量が少なく、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで目的のバンドは確認できなかった（図１７のＡ）。そこで、これまでの経緯から発現条件を変更しても大きな改善が見込めないと考え、大量培養は行なわなかった。

　（実施例５）
　［抗原（ｈＴＥＲＴタンパク質の３０４～４６０アミノ酸）の調製］
　＜５－１　大腸菌発現ベクターの構築＞
　ｈＴＥＲＴタンパク質の１８０～４６０アミノ酸をコードする人工遺伝子を含むプラスミドベクターから配列特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法によって３０４～４６０アミノ酸をコードする領域を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ　ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて行ない、反応は９９℃で２分間、その後、「９９℃で２０秒、５９℃で３０秒，６８℃で５０秒」のサイクルを３５回実施した後、６８℃で１分間、４℃にて一晩（Ｏ／Ｎ）という条件にて行なった。また、プライマーは５’側として配列番号：７　５’－ｇｇａａｔｔｃＣＡＴＡＴＧＣＡＣＧＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣ－３’、３’側として配列番号：８　５’－ｃｃｇＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＣＡＣＧＧＧＣＴＴＧＡＡＴＧＴＴＧ－３’を用いた。

　そして、＜３－１＞に記載した方法に準じて、増幅したバンドと大腸菌発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）とのライゲーションを行ない、得られた発現プラスミドについても目的遺伝子が正しくに組み込まれていることを確認した。

　＜５－２　小スケールでの発現試験＞
　＜５－１＞で得られた発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１派生株のコンピテントセルに導入した。そして、＜４－２＞に記載の方法に準じて、培養、発現誘導、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法による目的タンパク質の発現の有無、発現画分、発現量の確認を行った。得られた結果を図１８に示す。なお、図１８において、レーン１は「誘導せずに３７℃で一晩培養したもの全部を泳動」、レーン２は「誘導せずに３７℃で一晩培養したものの沈殿物を泳動」、レーン３は「誘導せずに３７℃で一晩培養したものの上清を泳動」、レーン４は「誘導せずに３７℃で２時間培養したもの全部を泳動」、レーン５は「３７℃で２時間かけて発現誘導したもの全部を泳動」、レーン６は「３７℃で２時間かけて発現誘導したものの沈殿物を泳動」、レーン７は「３７℃で２時間かけて発現誘導したものの上清を泳動」した結果を各々示す。また、図１８のＡにおいて、レーン８は「ＢＳＡ　０．５μｇを泳動」、レーン９は「ＢＳＡ　１μｇを泳動」、レーン１０は「ＢＳＡ　２μｇを泳動」した結果を各々示し、図１８のＢにおいて、レーン８は「陰性対照を泳動」、レーン９は「陽性対照を泳動」した結果を各々示す。

　図１８に示した結果から明らかなように、予想される分子量１８．９ｋＤａ付近にバンドが確認でき、発現量も十分であった。かかる結果から、抗体作製に必要な量は取得できると判断し、大量培養を実施した。

　＜５－３　大量培養＞
　カナマイシン入りの寒天培地上の＜５－２＞で得られたコロニーをピックアップし、３ＬのＬＢ培地２本に植菌後、３７℃で対数増殖期（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．６）になるまで撹拌培養を行った。そして、Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．６付近となった時点で１ｍＭ　ＩＰＴＧを加え、３７℃で２時間培養して発現誘導を行ない、菌体を回収した。

　＜５－４　Ｎｉ－キレートカラムによる精製＞
　回収した菌体を溶菌バッファー（Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ、ＭＢＬ社製）に懸濁後、超音波破砕を行なった。破砕後、遠心分離により菌体破砕上清と不溶性画分に分離した。目的タンパク質は不溶性画分で多く確認されたため、不溶性画分にタンパク質変性剤含有可溶化バッファー（ＭＢＬ社製）を加え、溶解後、遠心分離を行ない上清を回収した。その後の精製操作は＜３－４＞に記載の方法に準じて行なった。

　そして、精製後のフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分析した結果、目的タンパク質の精製が確認されたため、回収されたフラクションをプールした。次いで、プールした精製タンパク質の濃度をプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて測定した後、免疫に適した濃度（１ｍｇ／ｍＬ程度）になるまで濃縮作業を行なった。濃縮後の精製タンパク質について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｈｉｓ－Ｔａｇに対する抗体を用いたウエスタンブロット法を行ない、分子量・精製度を確認した。得られた結果を図１９に示す。なお、図１９のＡにおいて、レーン１は「精製タンパク質（精製抗原）１μｇを泳動」、レーン２は「ＢＳＡ　０．５μｇを泳動」、レーン３は「ＢＳＡ　１μｇを泳動」、レーン４は「ＢＳＡ　２μｇを泳動」した結果を各々示す。また、図１９のＢは、精製タンパク質（精製抗原）０．５μｇを泳動し、Ｈｉｓ－Ｔａｇに対する抗体で検出した結果を示す。

　図１９に示した結果から明らかなように、目的タンパク質（抗原）は純度よく精製されている事が確認された。なお、３７ｋＤａ付近のバンドは、ＣＢＢ染色のみならず、ウェスタンブロット法においても確認できた事から目的タンパク質由来のものと考えられる。また、最終収量は１０．５ｍｇ（４Ｍ　ウレア入りのバッファー（ｐＨ７．４）に溶解）であり、１ｍｇ／ｍＬに調整した。そして、精製タンパク質を免疫１回分（２００μＬ）毎に分注し、液体窒素を用いて急速凍結した後、－８０℃で保存した。

　（実施例６）
　［抗原（ｈＴＥＲＴタンパク質の３０４～４６０アミノ酸）に対する抗体の作製］
　＜６－１　免疫＞
　＜５－４＞にて調製した精製リコンビナント蛋白質を、免疫原として１ｍｇ／ｍＬになるように調製し、アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ（ＦＲＥＵＮＤ）、三菱化学ヤトロン社製、ＲＭ６０６－１）と等量で混和し、エマルジョンにして、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ　４週齢　雌）の足の裏に５０μＬずつ免疫した。免疫は３回行ない、最終免疫の３日後に次に示す細胞融合を行った。

　＜６－２　細胞融合＞
　以下に示す細胞融合においては下記試薬類を用いて行った。
ミエローマ細胞：Ｐ３Ｕ１
ＰＥＧ：ＰＥＧ４０００（ＭＥＲＣＫ社製、カタログ番号：１０９７２７０１００）
ＨＡＴ：ＨＡＴサプリメント（５０ｘ）（ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号：２１０６０－０１７）
ＲＰＭＩ：ＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号：Ｒ８７５８）
サプリメント：ＢＭコンディムド（Ｒｏｃｈｅ社製、カタログ番号：６６３５７３）。

　先ず、前記の通り免疫したマウス（最終免疫の３日後のマウス）からリンパ節由来細胞を抽出した。すなわち、免疫したマウスの足から肥大したリンパ節を取り出し、リンパ節に切込みを入れて、ピンセット等で細胞をたたき出し、遠心してリンパ節由来細胞を回収した。

　また、培養フラスコで増殖させたミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１、培地：１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ）を回収し、回収したリンパ節由来細胞とミエローマ細胞とを２：１～１０：１の割合になるよう混和し、遠心した。そして、ペレットに５０％ＰＥＧ（ＲＰＭＩで等量希釈）を加え、細胞融合を行った。

　次いで、細胞融合させたハイブリドーマをＲＰＭＩ血清無添加培地にて洗浄した後、１５％ＦＢＳ－ＨＡＴ培地８０ｍＬでサスペンドし、９６穴プレート３枚に播種した。なお、１５％ＦＢＳ－ＨＡＴ培地には、初期の不安定なハイブリドーマのためにサプリメントが添加してある。

　そして、播種より３日後に培地を交換し、ハイブリドーマのコロニー形成が確認された段階（約２週間後）で、９６穴プレートから培養上清をサンプリングし、１次スクリーニングを行った。

　＜６－３　１次スクリーニング（ＥＬＩＳＡ）＞
　前記免疫原をＰＢＳにて１μｇ／ｍＬに希釈した後、ＥＬＩＳＡプレートに５０μＬ／ウェル分注し、４℃にて一晩（ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔ）静置した。このようにして抗原を感作させた後、抗原溶液を除去し、ブロッキングバッファー（ＭＢＬ社製）を１００μＬ／ウェル分注し、４℃にて一晩静置した。

　そして、サンプリングしたハイブリドーマの培養上清をＥＬＩＳＡプレートに５０μＬ／ウェル加え、室温で６０分間反応させた。反応後、ＰＢＳにて３回洗浄した後、ヤギ由来抗マウスＩｇＧ－ＰＯＤ標識抗体（ＭＢＬ社製、コード番号：３３０）を希釈バッファー（ＭＢＬ社製）にて１０，０００倍希釈したものを５０μＬ／ウェル加え、室温で６０分間反応させた。そして、３回洗浄した後、発色液（ＭＢＬ社製）を５０μＬ／ウェル加え５分間発色させ、１．５ｍｏｌ／Ｌ　リン酸を１００μＬ／ウェル加え、反応を停止させた。反応停止後、吸光度測定器（テカン社）を用いて、測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍにて吸光度を測定した。また、前記同様に、免疫原に付加されているＨｉｓＴａｇに反応する培養上清を除外するために、ＨｉｓＴａｇプレートを用いたＥＬＩＳＡも行った。そして、細胞融合後、継代培養しながら何度か、かかるＥＬＩＳＡによって反応性を確認して１次スクリーニングを行った。得られた結果を表１～３に示す。なお、表１には免疫原プレートにおいて測定された測定波長４５０ｎｍにおける吸光度が示されており、吸光度が０．２以上のサンプルにはラベルが付されている。表２にはＨｉｓＴａｇプレートにおいて測定された測定波長４５０ｎｍにおける吸光度が示されている。また、表３には各サンプル番号（１～１２４）が示されており、免疫原プレートにおける吸光度が０．２以上であり、且つＨｉｓＴａｇプレートにおける吸光度が０．２以下であるサンプルにはラベルが付されている。

　表１～３に示した結果から明らかなように、最終的に免疫原プレートに対する反応性がＯＤ４５０ｎｍで０．２以上、ＨｉｓＴａｇプレートに対する反応性が０．２以下のサンプルが７２種類確認された。

　＜６－４　２次スクリーニング（インセルアナライザーを用いた染色スクリーニング等）＞
　二次スクリーニングは、ＢＪ　ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞又はＢＪ細胞を用いた蛍光免疫染色によって行った。なお、ＢＪ細胞はヒト由来の正常繊維芽細胞であり、ＢＪ　ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞はＦＬＡＧペプチド及びＨＡペプチドで標識したｈＴＥＲＴが安定的に発現しているＢＪ細胞である。

　二次スクリーニングに際して、先ず、これら細胞を９６穴プレートに５，０００細胞数／１００ｍＬ／ウェル播種し、播種した日を０日として２日間培養した。２日後、洗浄バッファーにて洗浄して４％　パラホルムアルデヒドを添加し、室温にて１０分間反応させた。洗浄後、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社製、３５５０１－１５）を添加し、室温にて１０分間反応させた。ブロッキングバッファー（５％　ＢＳＡ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製、ＢＡＣ６２）、２％　ＦＣＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製））を添加して室温にて１時間反応させた。

　その後、前記ハイブリドーマの培養上清を１サンプル／ウェル添加した。また、アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ１（ＭＢＬ社製、Ｍ０７５－３）、ＩｇＧ２ａ（ＭＢＬ社製、Ｍ０７６－３）、ＩｇＧ２ｂ（ＭＢＬ社製、Ｍ０７７－３）を、各々１μｇ／ｍＬずつ１ウェルに添加した。さらに、陰性対照として、培地のみを１ウェルに添加した。また、陽性対照として、１μｇ／ｍＬ及び２μｇ／ｍＬの抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ社製、Ｈ３６６３－２００ＵＬ）を各々１ウェルに添加した。従って、９６穴プレート１枚あたり、陰性対照について１ウェル、陽性対象について２ウェル、アイソタイプコントロールについて３ウェル、前記ハイブリドーマの培養上清９０クローンについて９０ウェル添加して室温にて１時間反応させた。

　そして、これら抗体等を洗浄した後、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、ＩＭ０８５５）を添加し、室温にて１時間反応させた。この時ヘキスト３３２５８も同時に添加し、染色像をインセルアナライザー（ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて測定した。そして、ヘキスト３３２５８で核染色された細胞数に対して、前記培養上清等で染色された細胞数の割合を％にて算出し、全体の８５％染まったもの又は染色像にて反応性が確認されたサンプルを陽性として選別した。

　以上の操作を９６穴プレート１０枚（プレート１～１０）を用いて、前記ハイブリドーマの培養上清９００サンプルについて、これらのｈＴＥＲＴに対する反応性や特異性を評価した。

　かかるＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いたスクリーニング又は目視による染色像の確認の結果、ＢＪ　ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞に反応し、ＢＪ細胞に反応しない候補　下記４７サンプルを選抜した。
プレート１においては、１Ｂ８、１Ｂ１２、１Ｃ１２、１Ｅ７、
プレート２においては、２Ｂ４、２Ｂ８、２Ｄ９、２Ｄ１０、２Ｅ９、２Ｆ６、２Ｆ１１、２Ｇ２
プレート３においては、３Ｃ１、３Ｄ１２、３Ｆ７、３Ｇ４、３Ｇ６、３Ｈ７
プレート４においては、４Ｂ３、４Ｇ２、４Ｇ７
プレート５においては、５Ａ９、５Ａ１２、５Ｄ８、５Ｄ１２
プレート６においては、６Ａ９、６Ａ１２、６Ｃ１２
プレート７においては、７Ａ７、７Ａ１２、７Ｂ４、７Ｂ６、７Ｂ１２、７Ｃ１２、７Ｅ７
プレート８からは選抜せず
プレート９においては、９Ｂ４、９Ｂ１０、９Ｆ４
プレート１０においては、１０Ｂ５、１０Ｃ１、１０Ｃ２、１０Ｃ７、１０Ｃ９、１０Ｃ１０、１０Ｄ１２、１０Ｆ３、１０Ｆ６。

　＜６－５　１次スクリーニング（ウェスタンブロット法及び細胞免疫染色による確認試験）＞
　１次、２次スクリーニングで取得したサンプルによる反応性確認を行った。なお再度評価したサンプルは下記の通りである。
１次スクリーニング（ＥＬＩＳＡ法を利用）のみで陽性と評価された６１サンプル
２次スクリーニングのみで陽性と評価された３６サンプル
１次、２次スクリーニングの両方で陽性と評価された１１サンプル。

　前記サンプルの内、１次、２次スクリーニングの両方で陽性と評価された１１サンプルに関して、ＢＪ細胞、ＢＪ　ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞を用いてウェスタンブロッティングを行ない、ＢＪ－ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞にｈＴＥＲＴのバンドが特異的に検出されるクローンを候補クローンとして選定した。得られた結果を図２０のＡに示す。また、２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞及びＢＪ－ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞を用いてウェスタンブロッティングを行ない、過剰発現したｈＴＥＲＴのバンドが両方の細胞において検出されるクローンを候補クローンとして選定した。得られた結果を図２０のＢに示す。なお、２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞は、ヒト腎臓形質転換株２９３ＴにＦＬＡＧ－ｈＴＥＲＴ（全長又はトランケーション変異体）を一過性に過剰発現させた細胞である。

　さらに、１次スクリーニングにおいて強陽性と評価されながら、２次スクリーニングにおいて陰性と評価された１０サンプル（２Ｅ４、５Ｈ４、７Ｃ２、７Ｈ２、７Ｄ６、８Ｄ９、９Ｃ１、９Ｈ３、９Ａ８、１０Ｅ９）に関してはスクリーニングでの見落としを避けるため、細胞免疫染色にて再検討した。すなわち、ＧＦＰ－ｈＴＥＲＴ発現ＨｅＬａ細胞を前記１０サンプルから得た抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体及びＤＡＰＩにて染色した。そして、目視にて発現強度及び発現パターン（ＧＦＰのシグナルとの重なり具合も含めて）を確認し、ＧＦＰのシグナルと抗ｈＴＥＲＴ抗体とのシグナルの染色パターンが類似しているかどうかを中心に判断した。得られた結果を図２１に示す。

　図２０に示した結果から明らかなように、１次、２次スクリーニングの両方で陽性と評価された１１サンプルのうち３サンプル（９Ｂ１０，１０Ｆ３及び１０Ｃ１０）で有意なシグナルが検出された（図２０のＡ）。また、２Ｅ４及び１０Ｅ９に関してはウェスタンブロッティングでもｈＴＥＲＴを特異的に認識していることが確認され（図２０のＢ）、また図２１に示した細胞免疫染色での再検討の結果から、これらサンプルはｈＴＥＲＴを良好に認識している可能性が示唆された。そこで、以上の結果から、９Ｂ１０、１０Ｆ３、１０Ｃ１０、２Ｅ４、１０Ｅ９を選定し、これらクローンについてシングルクローンの確立を行った。

　（実施例７）
　［シングルクローンの確立］
　＜６－３＞～＜６－５＞に記載の評価にて選択されたハイブリドーマについて培養を行ない、対数増殖期に入った状態の良い時に細胞をパスツールピペットでピペッティングして採取し、培地にて希釈した後、１ウェルあたりの細胞数が１個から３２，０００個になるように細胞濃度をふって９６穴プレートに播種した。そして、ハイブリドーマのシングルコロニーの形成が確認された段階（１～２週間後）で９６穴プレートから培養上清をサンプリングし、＜６－３＞に記載の方法に従い、活性を確認した。得られた結果を表４～６に示す。

　表４～６に示した結果から明らかなように、ＥＬＩＳＡレベルで反応性を維持しているサブクローンとして、９Ｂ１０においては１６クローン、１０Ｆ３においては１０クローン、１０Ｃ１０においては５クローン、２Ｅ４においては８クローン、１０Ｅ９においては８クローンをそれぞれ確立した。

　また、前記限界希釈（ＬＤ：ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）によりシングルクローン化されたハイブリドーマは、９６穴プレート１穴から、４８穴プレート、２４穴プレート、１２穴プレートまで継代培養した。そして、十分増殖した段階で１ウェル（１穴）の細胞を遠心回収し、ストック用溶液５００μＬに懸濁し、ストックチューブ１本に入れ－８０℃にて保存した。なお、ストック用溶液はセルバンカー（十慈フィールド社製、カタログ番号：ＢＬＣ－１）を用い、ストックチューブは１ｍＬセラムチューブ（ＳＵＭＩＬＯＮ社製、カタログ番号：ＭＳ－４６０１Ｗ）を用いた。

　（実施例８）
　［サブクラスの決定］
　実施例７において確立したシングルクローン（サブクローン）由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体のサブクラスを以下に示す方法にて決定した。

　＜ＥＬＩＳＡ法＞
　ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＢＬ社製）を１０μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ／ウェル分注し、４℃にて一晩（ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔ）感作させた。感作後、抗体溶液を除き、ブロッキングバッファーを加えて４℃にて一晩ブロッキングを行った。次に、前記ハイブリドーマ由来の各培養上清を５０μＬ加え、室温にて１時間反応させた。反応後、プレートを洗浄した後、抗マウスＩｇ特異的抗体（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製、マウス－タイパー
アイソタイピングパネル（Ｍｏｕｓｅ－Ｔｙｐｅｒ　Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｐａｎｅｌ）、カタログ番号：１７２－２０５５）を室温にて１時間反応させた。反応後、プレートを洗浄した後、抗ウサギＰＯＤ標識抗体（ＭＢＬ社製）を室温にて１時間反応させ、最後に発色液を加えて発色させた。そして、反応を停止させた後に吸光度測定を行った。

　＜イムノクロマト法＞
　Ｉｓｏ　Ｓｔｒｉｐ　マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。すなわち、前記ハイブリドーマ由来の培養上清をＰＢＳにて１００倍希釈したものをディベロップメントチューブに滴下し、着色ラテックスビーズを再懸濁した。次いで、チューブにアイソタイプ用ストリップを浸漬し、５分間おきに特定のサブクラス部分に検出されたバンドを確認した。

　以上の分析方法にて、９Ｂ１０及び１０Ｆ３のサブクローン由来の抗体の一部と、２Ｅ４及び１０Ｅ９の全てのサブクローン由来の抗体についてクラスチェックを行った。得られた結果を表７～９に示す。なお、表中「―」を付したサブクローン由来の抗体は、今回サブクラスを決定していないクローン由来の抗体である。

　（実施例１１）
　［限界希釈後のシングルクローンを用いた反応性の評価］
　実施例７において確立したシングルクローン（サブクローン）由来の抗体を用いて、以下の実験方法（ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、ＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降法（ＲＩＰ）、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、細胞免疫染色）にて、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体の反応性を評価した。

　＜ウェスタンブロッティング＞
　以下に示す細胞、
ヒト腎臓形質転換株２９３ＴにＦＬＡＧ－ｈＴＥＲＴ（全長又はトランケーション変異体）を一過性に過剰発現した２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞　７．５×１０^６細胞、
ヒトトリプルネガティブ乳がん細胞株：ＭＤＡ－ＭＢ１５７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＢＴ２０、ＢＴ５４９、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ１９３７、Ｈｓ５７８Ｔ細胞　１×１０^７細胞、
ヒト繊維芽細胞ＢＪにＴＡＰ（ＦＬＡＧ－ＨＡ）－ｈＴＥＲＴを安定発現させたＢＪ－ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞　３×１０^６細胞
に、２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞及びトリプルネガティブ乳がん細胞株に対しては５００μＬ、ＢＪ－ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞に対しては２００μｌＬのＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　ＮＰ－４０）を加え、１０秒間の超音波処理により細胞を破壊した。次いで、１５０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間、遠心処理した後、２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴにおいては上清３０μｇを、トリプルネガティブ乳がん細胞株及びＢＪ－ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞においては上清１００μｇに、２×ＳＤＳサンプルバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、４％　ＳＤＳ、２０％　グリセロール、２％　２－メルカプトエタノール、ブロモフェノールブルー）を加え、９５℃、５分間の熱処理によりタンパク質を変性させ、ウエスタンブロッティング用サンプルとした。２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞及びＢＪ－ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞に関しては、得られたサンプルを８％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分画し、トリプルネガティブ乳がん細胞株に関しては、得られたサンプルを６％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分画した。そして、分画後、各々のポリアクリルアミドゲルをニトロセルロース膜にブロットした。次いで、５％スキムミルク／０．１％ＴＢＳＴにて、室温下、３０分間ブロッキングした後、前記シングルクローン由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体又は２．５％スキムミルク／０．１％ＴＢＳＴによって１０００倍に希釈したウサギ由来抗ｈＴＥＲＴポリクロ―ナル抗体（抗テロメレース触媒サブユニット（ウサギ）抗体（Ａｎｔｉ－Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｓｕｂｕｎｉｔ（Ｒａｂｂｉｔ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、カタログ番号：６００－４０１－２５２）と室温下で１時間反応させた。そして、０．１％　ＴＢＳＴでよく洗浄した後、二次抗体として２．５％スキムミルク／０．１％ＴＢＳＴによって５０００倍に希釈したＥＣＬ
抗マウスＩｇＧ,西洋ワサビぺルオキシダーゼ結合種特異的全抗体（ＥＣＬ　Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ，Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｓｐｅｃｉｅｓ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｗｈｏｌｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）又はＥＣＬ
抗ウサギＩｇＧ,西洋ワサビぺルオキシダーゼ結合種特異的全抗体（ＥＣＬ　Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ，Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｓｐｅｃｉｅｓ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｗｈｏｌｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）と室温下で１時間反応させた。次いで、０．１％　ＴＢＳＴでよく洗浄した後、検出はルミ－ライトプラス－ウェスタン
ブロッティングサブストレート(Ｌｕｍｉ－ＬｉｇｈｔＰｌｕｓ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行ない、Ｘ線フィルム上に感光させた。以上のウェスタンブロッティングによって分析した結果を図２２～２４に示す。

　＜免疫沈降法＞
　２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞７．５×１０^６個に１ｍＬの溶解バッファーＡ（Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　Ａ：２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％　ＮＰ－４０）を添加し、１０秒間の超音波処理により細胞を破壊し、４℃、１５０００ｒｐｍにて１５分間、遠心処理を行なった。得られた上清に３０μＬのイムノピュアイモビライズドプロテインＡ（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅＩｍｍｏｂｌｉｚｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ、ＰＩＥＲＣＥ社製）と１００μＬの前記シングルクローン由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体又は１０μｇのウサギ由来抗ｈＴＥＲＴポリクロ―ナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を加え４℃にて、１６時間インキュベートを行なった。１ｍＬの溶解バッファーＡによりビーズを３回洗浄し、洗浄後のビーズに２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、９５℃、５分の熱処理によりタンパク質を変性させてウエスタンブロッティング用サンプルとした。サンプルは８％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロース膜にブロットした。５％スキムミルク／０．１％ＴＢＳＴで室温、３０分間ブロッキング後、２．５％スキムミルク／０．１％ＴＢＳＴによって５０００倍に希釈した抗ＦＬＡＧ　Ｍ２モノクローナル抗体（ＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ　Ｍ２　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＳＩＧＭＡ社製）を室温で１時間反応させた。０．１％ＴＢＳＴでよく洗浄した後、二次抗体として２．５％スキムミルク／０．１％ＴＢＳＴによって４０００倍に希釈したマウス
トゥルーブロットウルトラ：西洋ワサビぺルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ　ＴｒｕｅＢｌｏｔ　ＵＬＴＲＡ：Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を室温で１時間反応させた。０．１％ＴＢＳＴでよく洗浄した後、検出はルミ－ライトプラス－ウェスタン
ブロッティングサブストレート（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行ない、Ｘ線フィルム上に感光させた。以上の免疫沈降法によって分析した結果を図２５に示す。

　＜ＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降法（ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ：ＲＩＰ）＞
　５×１０^７細胞のヒト子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａに１ｍＬの溶解バッファーＡ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％　ＮＰ－４０）を添加し、氷上で３０分放置後、４℃、１５０００ｒｐｍにて１５分間、遠心処理を行なった。得られた上清に３０μＬのイムノピュアイモビライズドプロテインＡ（ＰＩＥＲＣＥ社製）と、１００μＬの前記シングルクローン由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体又は１０μｇのウサギ由来抗ｈＴＥＲＴポリクロ―ナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を加え４℃、１６時間インキュベートを行なった。１ｍＬの溶解バッファーＡによりビーズを３回洗浄し、４回目の洗浄は１時間４℃において回転させた。洗浄後のビーズにトリゾル試薬（登録商標、ＴＲＩｚｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５００μＬを加えてＲＮＡを抽出し、１２μＬの滅菌水を用いてＲＮＡを溶出した。溶出後のＲＮＡを５μＬ用いてｈＴＥＲＣはＲｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ、ＲＭＲＰはＲＴ　ｐｒｉｍｅｒにより４２℃、６０分ＲＴ反応を行なった。ＰＣＲ反応には表１０に示すそれぞれのＲＮＡに対するＦｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ、反応サイクルを用いて行なった。

　ＰＣＲ後のｃＤＮＡはエチジウムブロマイド０．１μｇ／ｍＬを添加した１％アガロースゲルを用いた電気泳動によって分画し、電気泳動撮影装置ＦＡＳ－III（東洋紡社製）を用いて撮影した。以上のＲＩＰによって分析した結果を図２６に示す。

　＜ＲＴ－ＰＣＲ＞
　１×１０^７細胞のヒトトリプルネガティブ乳がん細胞株　ＭＤＡ－ＭＢ１５７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＢＴ２０、ＢＴ５４９、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ１９３７、Ｈｓ５７８Ｔ細胞に１ｍＬのトリゾル試薬を加えてＲＮＡを抽出した。抽出後のＲＮＡを０．８μｇ用いてオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により４２℃にて６０分間、ＲＴ反応を行なった。そして、得られたｃＤＮＡを用いて、表１１に示すＦｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ、反応サイクルを用いて、ＰＣＲ反応を行なった。

　ＰＣＲ後のｃＤＮＡはエチジウムブロマイド０．１μｇ／ｍＬを添加した１％アガロースゲルを用いた電気泳動によって分画し、電気泳動撮影装置ＦＡＳ－III（東洋紡社製）を用いて撮影した。このＲＴ－ＰＣＲによって得られた結果を、前記ウェスタンブロッティングによって分析した結果と共に図２４に示す。

　＜クロマチン免疫沈降（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｉｍｍｕｎｏ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　：ＣｈＩＰ　ａｓｓａｙ）＞
　培養細胞はヒト子宮頸癌由来細胞株であるＨｅＬａ細胞を用いた。ＨｅＬａ細胞の培養培地をアスピレートし、１％パラホルムアルデヒドを含む培養培地を加え、常温にて１０分間静置し、その後、２００ｍＭグリシンを含む培養培地に置換し常温で５分静置した。そして、ＰＢＳで１度洗浄し、ＮＰ－４０バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％　ＮＰ－４０）を加えセルリフター（Ｃｅｌｌ　Ｌｉｆｔｅｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）により細胞を剥がして回収した。回収したＨｅＬａ細胞に１００μＬのＳＤＳ溶解バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１％　ＳＤＳ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）と４００μＬのＣｈＩＰ希釈バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１６７ｍＭ　ＮａＣｌ、１．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．１１％　デオキシコール酸ナトリウム）を加え、密閉式超音波細胞破砕装置（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ　ＵＣＤ－３００、コスモ・バイオ社製）により２５０Ｖソニケーションｏｎ　１２秒／ソニケーションｏｆｆ　３０秒のサイクルを６回繰り返す設定でソニケーションを行った。ソニケーションしたサンプルを４℃、２０，０００ｇにて１０分遠心し、上清を回収した。上清の一部をインプット画分として保存し、残りの上清に６０μＬのプロテインＧセファロース４ファーストフロー（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を加え４℃で２時間プレクリーンした後に、４℃、１０，０００ｒｐｍにて１０秒遠心し、プロテインＧセファロースを含まない上清を回収した。回収した上清にｈＴＥＲＴモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ培養上清を１００μＬ加え、４℃で一晩ローテーションした。ネガティブコントロールとしてｈＴＥＲＴモノクローナル抗体を含まないハイブリドーマ培養上清を１００μＬ加え、同様に４℃で一晩処理した。

　翌日、ハイブリドーマ培養培地でブロッキングしたプロテインＧセファロースを２０μＬ加え、さらに２時間、４℃でローテーションした。その後プロテインＧセファロースを１ｍＬの１ｘＲＩＰＡバッファー　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．１％　デオキシコール酸ナトリウム）で１回、１ｍＬの１ｘＲＩＰＡバッファー５００ｍＭ　ＮａＣｌ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、０．１％　デオキシコール酸ナトリウム）で１回、１ｍＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で２回洗浄した。洗浄したプロテインＧセファロースにＣｈＩＰ溶出バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％　ＳＤＳ）を２００μＬ加え、６５℃で一晩、熱処理した。インプット画分にはＣｈＩＰ溶出バッファーを１００μＬ加え、同様に６５℃で一晩、熱処理した。

　翌日、ＲＮａｓｅ　Ａ（４μｇ／μＬ、インビトロジェン社製）を１μＬ加え、３７℃で３０分熱処理をした後、プロテアーゼＫ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｋ、２０μｇ／μＬ、タカラ社製）を１μＬ加え、５５℃で１時間熱処理をした。その後、サンプルをフェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール　２５：２４：１（ｐＨ７．９、ナカライテスク株式会社製）を用いてフェノール・クロロホルム処理を行い、エタノール沈殿により沈殿を得た。得られた沈殿物は自然乾燥させ、２０μＬのＴＥバッファーで溶解し、使用までは－８０℃で保存した。

　上記過程で得られたサンプル１０μＬにＨ_２Ｏを４０μＬ、ＮａＯＨ、ＥＤＴＡ（終濃度：０．４Ｎ　ＮａＯＨ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）を添加し、軽く撹拌後、１００℃で１０分間処理し、急冷した。メンブレンはハイボンド－ＸＬ（Ｈｙｂｏｎｄ－ＸＬ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、ドットブロッティングはバイオ－ドット　マイクロフィルトレーション装置（Ｂｉｏ－Ｄｏｔ　Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ、ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いた。変性させたサンプル全量をメンブレンにブロットした後に、２ｘＳＳＣ（３００ｍＭ　ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で３０秒リンスし、８０℃で３０分乾燥させ、ＵＶクロスリンカーＣＬ－１０００（ＣＬ－１０００　ＵＶ　ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＥＲ、ＵＶＰ社製）により７０ｍＪ／ｃｍ^２の強度のＵＶを照射した。

　そして、このメンブレンをＨ_２Ｏで湿らせ、次に０．５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．２、２８ｍＭ　ＮａＨ_２ＰＯ_４、７２ｍＭ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４）で湿らせた後に１５ｍＬのチャーチバッファー（０．５Ｍ　ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、７％　ＳＤＳ）により３７℃にて１時間のプレハイブリを行った。プレハイブリのチャーチバッファーを捨て、ＲＩ標識（^３２Ｐ）した末端制限フラグメントプローブ（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔプローブ（ＴＲＦプローブ）：５’－ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ－３’、配列番号：１６）を含んだ新たな１５ｍＬのチャーチバッファーを加え、３７℃にて一晩ハイブリした。

　次いで、ＴＲＦプローブを含んだチャーチバッファーを捨て、１０ｍＬの２ｘＳＳＣ，０．１％　ＳＤＳバッファーで２回リンスした。その後、５０ｍＬの２ｘＳＳＣ，０．１％　ＳＤＳバッファーで３７℃にて１０分間、２回洗浄し、５０ｍＬの１ｘＳＳＣ，０．１％　ＳＤＳバッファーで３７℃にて１０分間、２回洗浄し、５０ｍＬの０．１ｘＳＳＣ，０．１％　ＳＤＳバッファーで３７℃にて５分間、４回洗浄した。洗浄後のメンブレンをハイブリバッグにはさみ、コダック
バイオマックスＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ　ＢｉｏＭａｘ　ＭＳ　ｆｉｌｍ、シグマアルドリッチ社製）を用いて現像した。以上のＣｈＩＰによって分析した結果を図２７に示す。

　＜細胞免疫染色＞
　ＧＦＰ融合ｈＴＥＲＴをレトロウイルスを用いて安定的に発現させたヒト子宮頸がん（ＨｅＬａ）細胞、又はヒト正常線維芽細胞（ＢＪ細胞）にレトロウイルスを用いてｈＴＥＲＴを安定的に発現させたＢＪ－ｐＢＨ－ｈＴＥＲＴ細胞を８ウェルカルチャースライド（８ｗｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｌｉｄｅ、ＢＤ、Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種した。翌日、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）（ニッスイ、塩化ナトリウム８ｇ、リン酸一水素ナトリウム（無水）１．１５ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、リン酸二水素カリウム（無水）０．２ｇ／Ｌ）で２回洗浄後、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）を添加し、３７℃にて２０分間固定・浸透処理を行った。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）で５分間４回洗浄した後、１００　ｍＭグリシン含有ＰＢＳ（－）で室温にて３０分間処理した。そして、液を５％　ＢＳＡ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）に入れ替え、４℃にて一晩ブロッキングを行った。必要に応じて１％　ＢＳＡ含有　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）で希釈した一次抗体液（ウサギ由来抗ｈＴＥＲＴポリクロ―ナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）：１．３μｇ／ｍＬ、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体：原液）、又は一次抗体無しのものは１％　ＢＳＡ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）にて、４℃で一晩反応させた。次いで、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）で５分間４回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）で希釈した二次抗体液に入れ替え、室温にて９０分間反応させた。そして、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）で５分間４回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有ベクタシールド・マウンティングメディウム（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ　Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩ、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）で封入した。次いで、封入後のカルチャースライドの蛍光観察を共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｋ．Ｋ．製，ＴＣＳ　ＳＰ２）を用いて行った。以上の細胞免疫染色によって分析した結果を図２８～２９に示す。

　＜ウェスタンブロッティングによる分析結果＞
　図２２に示した結果から明らかなように、ウェスタンブロッティングにて、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（９Ｂ１０－１０）と、２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞において発現しているｈＴＥＲＴ全長（Ｆｕｌｌ）及びｈＴＥＲＴトランケーション変異体（ＨＴ１（ｈＴＥＲＴタンパク質の５３２～１１３２アミノ酸）、ＥＢ（ｈＴＥＲＴタンパク質の１～８３１アミノ酸）、ＥＸ（ｈＴＥＲＴタンパク質の１～６５５アミノ酸）との反応性を確認したところ、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体は、ｈＴＥＲＴのＦｕｌｌ、ＥＢ及びＥＸを認識する一方で、ＨＴ１は認識しなかった。従って、抗体を作製する際に抗原として用いた精製タンパク質（ｈＴＥＲＴタンパク質の１８０～４６０アミノ酸）を含む全長及びトランケーション変異体（Ｆｕｌｌ、ＥＢ及びＥＸ）のみを認識することが確認された。

　なお、図２２のＡにおいて示す通り、前記ｈＴＥＲＴ全長及びｈＴＥＲＴトランケーション変異体のいずれにもＮ末端側にＦＬＡＧタグペプチドが付加されているため、前記ｈＴＥＲＴ全長及びｈＴＥＲＴトランケーション変異体の２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞における発現は抗ＦＬＡＧ抗体によって確認することができ、実際、図２２のＢ（右側）において示す通り、各々の発現は確認されている。

　また、図２３に示した結果から明らかなように、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（２Ｅ４－２）は、２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞及びＢＪ－ＴＡＰ－ｈＴＥＲＴ細胞において発現しているｈＴＥＲＴ全長を認識できることも確認された。さらに、市販品　Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製　抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（ウサギ由来）よりも良好にｈＴＥＲＴを認識することが明らかになった。

　また、図２４に示した結果から明らかなように、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（２Ｅ４－２）を用いて内在性ｈＴＥＲＴタンパク質の発現レベルを確認したところ、ＲＴ－ＰＣＲによって確認された内在性ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの発現レベルと相関して、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体は内在性ｈＴＥＲＴタンパク質の発現を検出することが可能であった。

　＜免疫沈降法による分析結果＞
　図２５に示した結果から明らかなように、２９３Ｔ－ｈＴＥＲＴ細胞を用いた免疫沈降において、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（１０Ｅ９－２）はＲｏｃｋｌａｎｄ社製　抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（ウサギ由来）と比較して、約５．３倍、効率良くＦＬＡＧ－ｈＴＥＲＴを免疫沈降できることが明らかになった。

　＜ＲＩＰによる分析結果＞
　図２６に示した結果から明らかなように、ＨｅＬａ細胞において内在性ｈＴＥＲＴタンパク質の免疫沈降を行い、内在性ｈＴＥＲＴタンパク質に結合するＲＮＡを回収したところ、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（１０Ｆ３－１０）はＲｏｃｋｌａｎｄ社製　抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（ウサギ由来）よりも効率的に内在性ｈＴＥＲＴタンパク質を免疫沈降できることが明らかになった。すなわち、これまでに知られているｈＴＥＲＴに結合する２種類の異なるＲＮＡ（ＲＭＲＰ及びｈＴＥＲＣ、Ｍａｉｄａ　Ｙ，ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、４６１巻、７２６１号、２３０～２３５ページ　参照）を指標に内在性ｈＴＥＲＴタンパク質の回収率を計算したところ、ＲＭＲＰを指標とした場合は約３．６倍、ｈＴＥＲＣを指標とした場合は約２．５倍、内在性ｈＴＥＲＴタンパク質をＲｏｃｋｌａｎｄ社製　抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（ウサギ由来）よりも効率的に本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体は回収できることが明らかになった。

　＜ＣｈＩＰによる分析結果＞
　図２７に示した結果から明らかなように、クロマチン免疫沈降法にてより自然に近い状態（ｈＴＥＲＴタンパク質が機能構造体として染色体上に存在する状態）における細胞内での内在性ｈＴＥＲＴタンパク質の回収状況を確認したところ、既存の抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製　抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（ウサギ由来））ではほとんど回収されなかったのに対し、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（１０Ｅ９－２）は非常に効率良く、より自然な状況での内在性ｈＴＥＲＴタンパク質を回収できることが明らかになった。

　＜免疫染色による分析結果＞
　抗体を用いずにｈＴＥＲＴを検出するために、ＧＦＰ融合ｈＴＥＲＴを安定的に発現させているＨｅＬａ細胞を用いて細胞免疫染色を行なったところ、図２８に示した結果から明らかなように、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（１０Ｅ９－２）によるシグナルとＧＦＰのシグナルとは殆ど共局在していた。一方、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製　抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（ウサギ由来）により検出されるシグナルとＧＦＰのシグナルとの共局在の比率は、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体に比べると有意に低かった。

　また、ＢＪ－ｐＢＨ－ｈＴＥＲＴ細胞を用いて細胞免疫染色を行なったところ、図２９に示した結果から明らかなように、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（１０Ｅ９－２）はＲｏｃｋｌａｎｄ社製　抗ｈＴＥＲＴポリクローナル抗体（ウサギ由来）よりも効率的にｈＴＥＲＴタンパク質を認識できた。

　（実施例１２）
　［本発明の抗体の細胞への影響］
　本発明の抗体の細胞への影響を調べるため、先ず、Ｈｅｌａ細胞を、８ウェルカルチャースライド（ＢＤ社製）上に各ウェル２．８×１０^４個になるよう播種し、１０％熱非動化ウシ胎児血清（ＩＦＳ）添加ＤＭＥＭにて培養した。その翌日、本発明の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体（２Ｅ４－２、２Ｅ４－１０、１０Ｅ９－１０若しくは１０Ｅ９－２由来のモノクローナル抗体）又は、対照としてマウスＩｇＧを１μｇずつ、Ａｂ－ＤｅｌｉｖｅｒＩｎ（ＯＺ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と共に各ウェルに、そのメーカーの使用説明書に従って添加した。抗体を添加してから２４時間後又は４８時間後に、１ｍＭ　ヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）含有ＰＢＳ（－）にて、室温下、２０分間処理し、次いで、ＰＢＳ（－）にて２回洗浄した。このようにして抗体を導入したＨｅｌａ細胞を、スピニングディスク共焦点顕微鏡（ＤＳＵを備えたＩＸ－８１、オリンパス株式会社製）にて観察し、ヘキスト３３３４２によって染色された生細胞中、１視野（１撮影パネル）内の凝縮したクロマチンを有する細胞数（Ｍ期の細胞数）及び生細胞数を計測することにより、分裂指数（（Ｍ期の細胞数／生細胞数）×１００％）を算出した。また、前記抗体を導入したＨｅｌａ細胞について、ＴＵＮＥＬ法により、１視野（１撮影パネル）内の断片化されたＤＮＡが生じている細胞数（ＴＵＮＥＬ陽性細胞数）及び全細胞数を計測することにより、アポトーシスが誘導された細胞の比率（（ＴＵＮＥＬ陽性細胞数／全細胞数）×１００％）を算出した。得られた結果を、図３０～３２に示す。

　図３０に示す通り、本発明の抗体（２Ｅ４－２、２Ｅ４－１０又は１０Ｅ９－１０由来のモノクローナル抗体）を導入してから２４時間経過後のＨｅｌａ細胞においては、対照であるマウスＩｇＧを導入した細胞と比して、有意に分裂指数が高い、すなわち細胞周期のＭ期にて停止している細胞が増加していることが明らかになった。

　なお、図には示さないが、ｈＴＥＲＴに対するｓｈＲＮＡをＨｅｌａ細胞に導入したところ、Ｍ期のマーカーであるヒストンＨ３の１０番目のセリンのリン酸化が亢進されることも本発明者らは確認している。

　また、図３１及び３２に示す通り、本発明の抗体（２Ｅ４－２又は１０Ｅ９－２由来のモノクローナル抗体）を導入してから２４時間及び４８時間経過後のＨｅｌａ細胞において、対照と比して、有意にアポトーシス細胞数の割合が増加していることも明らかになった。

　以上の結果により、本発明の抗体によれば、細胞周期をＭ期に停止させることができ、またアポトーシスを誘導することもできることが明らかになった。さらに、本発明の抗体によってＭ期の停止が生じ、かかる細胞周期の停止という異常に応じてアポトーシスが誘導される可能性が考えられる。

　（実施例１３）
　［ＣＤＲの決定］
　実施例７において確立したサブクローン（２Ｅ４－２、２Ｅ４－１０，１０Ｅ９－２及び１０Ｅ９－１０）由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体の可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列と塩基配列とを、以下に示す方法にて同定した。

　＜抗体産生ハイブリドーマ細胞からのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出＞
　先ず、凍結されたハイブリドーマ細胞を融解し、滅菌ＰＢＳ　５ｍＬに懸濁後、１４００ｒｐｍ、５分遠心して細胞を回収した。回収した細胞を再度、滅菌ＰＢＳ　１ｍＬで懸濁後、１．５ｍＬチューブに移し、１４００ｒｐｍで５分遠心した。

　ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ(ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ）抽出にはＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用した。すなわち、回収した細胞にＲＬＴ（ＲＮｅａｓｙミニキットの構成品）６００μＬ及び２－メルカプトエタノール６μｌを加え、２１ケージ針と１ｍＬシリンジとを用いて懸濁した。８０％エタノール６００μＬを加え転倒混和し、スピンカラム（ＲＮｅａｓｙミニキットの構成品）に入れ１００００ｒｐｍで１分遠心した。フロースルーを捨てた後、スピンカラムにＲＷ（ＲＮｅａｓｙミニキットの構成品）７００μＬを加え１００００ｒｐｍで１分遠心した。この操作を２回繰り返した。フロースルーを捨て、ＲＰＥ（ＲＮｅａｓｙミニキットの構成品）５００μＬを加え１００００ｒｐｍで１分遠心した。この操作を２回繰り返した。フロースルーを捨てた後、カラムを１００００ｒｐｍで数秒間遠心し、乾燥させた。スピンカラムを１．５ｍＬチューブに移し、ＤＥＰＣ水３０μＬを加え，１０分静置後１００００ｒｐｍで１分遠心しＲＮＡを回収した。これをフラクション１とした。続けて、カラムを１．５ｍＬチューブに移し、ＤＥＰＣ水２０μＬを加え１０分静置後１００００ｒｐｍで１分遠心しＲＮＡを回収した。これをフラクション２とした。

　得られた各フラクションのＲＮＡ濃度はナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定し、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ収量を算出した。

　＜完全長ｍＲＮＡの抽出及び逆転写によるｃＤＮＡの作製＞
　前記にて調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、完全長ｍＲＮＡを抽出し、該完全長ＲＮＡを鋳型とする逆転写によってｃＤＮＡを作製するために、ジーンレーサーキット（Ｇｅｎｅ　Ｒａｃｅｒ　ｋｉｔ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。

　すなわち、先ず、前記ＲＮＡに脱リン酸化処理を施すために、前記ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　フラクション１の５μｇ分のＲＮＡと、１０×ＣＩＰ　Ｂｕｆｆｅｒ　（ジーンレーサーキットの構成品）と、ＣＩＰ（ジーンレーサーキットの構成品）と、ＲＮａｓｅＯｕｔ（ジーンレーサーキットの構成品）、ＤＥＰＣ水（ジーンレーサーキットの構成品）とを混合し、５０℃、１時間インキュベートした。１時間後、ＤＥＰＣ水（ジーンレーサーキットの構成品）９０μＬを加え、更にフェノール／クロロホルム溶液（ジーンレーサーキットの構成品）８０μＬを加えた。ボルテックスで攪拌後、１３５００ｒｐｍで５分遠心した。

　このようにして得られた上清を、３Ｍ　酢酸ナトリウム（ジーンレーサーキットの構成品）及びイガイ（Ｍｕｓｓｅｌ）由来のグリコーゲン（ジーンレーサーキットの構成品）を入れた１．５ｍＬチューブに移して混合し、更に氷冷した１００％エタノール　２５０μＬを加え混合した。溶液を－８０℃で５分冷却後、１３５００ｒｐｍで２５分遠心し、ＲＮＡを回収した。次いで上清を捨て８０％エタノール５００μＬを入れ攪拌し、１３５００ｒｐｍで５分遠心した。上清を捨て２分程度ＲＮＡを乾かした後７μｌのＤＥＰＣ水に回収したＲＮＡを溶解した。

　次に、このようにして脱リン酸化処理を施したＲＮＡから、Ｃａｐ構造を除去するため、当該ＲＮＡと、１０×ＴＡＰバッファー（ジーンレーサーキットの構成品）と、ＴＡＰ（ジーンレーサーキットの構成品）と、ＲＮａｓｅＯｕｔ（ジーンレーサーキットの構成品）とを混合し、３７℃にて、１時間インキュベート後、ＤＥＰＣ水（ジーンレーサーキットの構成品）９０μＬを加えた。さらにフェノール／クロロホルム溶液（ジーンレーサーキットの構成品）８０μＬを加えボルテックスで攪拌し、１３５００ｒｐｍで５分遠心した。上清を３Ｍ　酢酸ナトリウム（ジーンレーサーキットの構成品）及びイガイ由来のグリコーゲン（ジーンレーサーキットの構成品）を入れた１．５ｍＬチューブに移して混合した。氷冷した１００％エタノール　２５０μＬを加えさらに混合した。溶液を－８０℃で５分冷却後、１３５００ｒｐｍで２５分遠心しＲＮＡを回収した。上清を捨て８０％エタノール５００μＬを入れ攪拌し、１３５００ｒｐｍで５分遠心した。上清を捨て２分程度ＲＮＡを乾かした後７μｌのＤＥＰＣ水にＲＮＡを溶解した。

　次に、このようにしてキャップ（Ｃａｐ）構造を除去したＲＮＡにオリゴＲＮＡ（ＲＮＡ　Ｏｌｉｇｏ）を付加するために、ジーンレーサーＲＮＡオリゴ（ジーンレーサーキットの構成品）に当該ＲＮＡの溶液を加えて混合し、６５℃で５分インキュベートした。その後氷上に２分置いた。このＲＮＡとＲＮＡＯｌｉｇｏとの混合溶液に１０×ライゲースバッファー（ジーンレーサーキットの構成品）、１０ｍＭ　ＡＴＰ（ジーンレーサーキットの構成品）、ＲＮａｓｅＯｕｔ（ジーンレーサーキットの構成品）、Ｔ４　ＲＮＡ　ライゲース（ジーンレーサーキットの構成品）を加えて混合し、３７℃で１時間インキュベート後、ＤＥＰＣ水（ジーンレーサーキットの構成品）９０μＬを加えた。さらにフェノール／クロロホルム溶液（ジーンレーサーキットの構成品）８０μＬを加えボルテックスで攪拌し、１３５００ｒｐｍで５分遠心した。上清を３Ｍ　酢酸ナトリウム（ジーンレーサーキットの構成品）、イガイ由来のグリコーゲン（ジーンレーサーキットの構成品）を入れた１．５ｍｌチューブに移して混合した。氷冷した１００％エタノール　２５０μＬを加えさらに混合した。溶液を－８０℃で５分冷却後、１３５００ｒｐｍで２５分遠心し、ＲＮＡを回収した。上清を捨て８０％エタノール５００μＬを入れ攪拌し、１３５００ｒｐｍで５分遠心した。上清を捨て２分程度ＲＮＡを乾かした後６μＬのＤＥＰＣ水にＲＮＡを溶解した。

　次に、このようにしてオリゴＲＮＡを付加したＲＮＡを逆転写反応に供し、ｃＤＮＡを作製するため、当該ＲＮＡと、オリゴｄＴプライマー（ジーンレーサーキットの構成品）と、ｄＮＴＰｓ（ジーンレーサーキットの構成品）とを混合し、６５℃で５分インキュベートした。その後氷上に２分置いた。混合液にＤＥＰＣ水（ジーンレーサーキットの構成品）、５×ファーストストランド（Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ）バッファー（ジーンレーサーキットの構成品）、０．１Ｍ　ＤＴＴ（ジーンレーサーキットの構成品）、ＲＮａｓｅＯｕｔ（ジーンレーサーキットの構成品）、スーパースクリプトIII　ＲＴ（ジーンレーサーキットの構成品）を加え５０℃で１時間インキュベート後、７０℃で１５分更にインキュベートした。その後氷上に２分置いた。最後にＲＮａｓｅＨ（ジーンレーサーキットの構成品）を加え３７℃、３０分インキュベートし、ｃＤＮＡ溶液を調製した。

　＜ｃＤＮＡからのＨ鎖及びＬ鎖遺伝子の増幅＞
　次に、前記にて調製したｃＤＮＡを鋳型とし、Ｈ鎖、Ｌ鎖遺伝子の増幅を行った。すなわち、先ず、前記ｃＤＮＡの溶液を１倍、１０倍、１００倍に希釈した溶液を調整した後、各希釈系列の溶液に１０×バッファー　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、２５ｍＭ　ＭｇＳＯ_４（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、１０μＭ　ジーンレーサー５’プライマー（ジーンレーサーキットの構成品）と、１０μＭ　Ｈ鎖又はＬ鎖に対する３’プライマー、ＫＯＤプラス（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、滅菌水とを加え、９９℃　２分、次いで９９℃　２０秒、５７℃　３０秒及び６８℃　５０秒のサイクルを３５回繰り返して、ＰＣＲ反応を行った。使用したプライマー配列は下記の通りである
　ジーンレーサー５’プライマー（ジーンレーサーキットの構成品）：
５’－ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ－３’
　Ｈ鎖（ＩｇＧ１）３’プライマー
５’－ＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧ－３’（配列番号：１７）
　Ｈ鎖（ＩｇＧ２ｂ）３’プライマー
５’－ＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＧＴ－３’（配列番号：１８）
　Ｌ鎖（ｋ）３’プライマー
５’－ＣＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ－３’（配列番号：１９）
　ＰＣＲ反応後、０．７％アガロースゲルを用いた電気泳動にて増幅産物の確認を行った。その結果、Ｈ鎖、Ｌ鎖ともに８００ｂｐ程度のバンドを確認することができたため、正しく増幅できていることが確認された。

　＜ＰＣＲ産物の抽出＞
　前記にて得られたＰＣＲ産物の抽出には、ゲル抽出キット（Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用した。すなわち、ＰＣＲ産物の入ったチューブにその液量の５倍量のＰＢ液（ゲル抽出キットの構成品）を入れ懸濁した。懸濁液をスピンカラム（ゲル抽出キットの構成品）に移し、１３０００ｒｐｍで数秒間遠心した。フロースルーを捨てた後、ＰＥ液（ゲル抽出キットの構成品）５００μＬを入れ１３０００ｒｐｍで数秒間遠心した。これは２回行った。フロースルーを捨てた後、スピンカラムを１３０００ｒｐｍで数秒間遠心し、乾燥した。カラムを１．５ｍＬチューブに移し、滅菌水２０μＬを入れ１分静置した。その後１３０００ｒｐｍで３分遠心し、ＰＣＲ産物溶液を回収した。

　＜ＴＡ　クローニング＞
　前記ＰＣＲ産物溶液に、１０×ＴａｑバッファーＭｇ＋（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、ｒＴａｑ　ＤＮＡポリメラ―ゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、滅菌水とを加え７２℃、３０分インキュベートした。その後、０．７％アガロースゲルを用いた電気泳動にてＤＮＡを確認後、ゲル抽出キットを用いて目的バンドの切り出し精製を行った。

　アガロースゲルから目的のバンド部分を切り出し、１．５ｍＬチューブに入れた。ゲル重量の３倍量のＱＧ液（ゲル抽出キットの構成品）を入れ、ゲルが溶けるまで数分間ボルテックスで攪拌した。ゲル溶解後、溶液をスピンカラム（ゲル抽出キットの構成品）に移し、１３０００ｒｐｍで数秒間遠心した。フロースルーを捨てた後、ＰＥ液（ゲル抽出キットの構成品）５００μＬを入れ１３０００ｒｐｍで数秒間遠心した。これを２回行った。フロースルーを捨てた後、スピンカラムを１３０００ｒｐｍで数秒間遠心し、乾燥させた。カラムを１．５ｍＬチューブに移し、滅菌水１５μＬを入れ１分静置した。その後１３０００ｒｐｍで３分遠心しＤＮＡ溶液を回収した。

　そして、該ＤＮＡ溶液と、ｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と、ライゲ―ションハイ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ、ＴＯＹＯＢＯ社製）とを混合し、１６℃、２時間インキュベートすることにより、ＴＡクローニングを行った。

　＜ＤＨ５αへの形質転換＞
　前記にて調製したＴＡクローニングの反応液に、大腸菌ＤＨ５α　５０μＬを加え、氷上で２５分静置した。ＬＢ／Ａｍｐプレートに５０ｍＭ　ＩＰＴＧ（ナカライテスク社製）及びＸ－ｇａｌ（ナカライテスク社製）を塗布し、さらに、ＴＡクローニングの反応液とＤＨ５αとの混合液を塗布し、３７℃で１晩静置培養した。

　＜コロニーＰＣＲ＞
　前記にて形質転換したＤＨ５αのホワイトコロニーを、Ｈ鎖及びＬ鎖に関して、各々２４個ずつピックアップし、コロニーＰＣＲを行った。すなわち、１００μＭ　ｐＴ７－プロプライマーと、１００μＭ　ｐＴ７－Ｕ１９プライマーと、１０×ＴａｑバッファーＭｇ＋（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、ｒＴａｑ　ＤＮＡポリメラ―ゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、滅菌水とを加えて必要量のＰＣＲ溶液を調整し、１０μＬずつＰＣＲチューブに分注した。次いで、爪楊枝でホワイトコロニーをピックアップし、チューブへ入れた。さらにその爪楊枝でマスタープレートを作製した。そして、このようにして調製したＰＣＲチューブに、９５℃　２０秒、次いで、９５℃　３０秒、５６℃　３０秒及び７２℃　６０秒のサイクルを３５サイクル繰り返すことにより、ＰＣＲ反応を行った。使用したプライマー配列は下記の通りである
　ｐＴ７－プロプライマー：５’－ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号：２０）
　ｐＴ７－Ｕ１９プライマー：５’－ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧ－３’（配列番号：２１）。

　ＰＣＲ反応後、０．７％アガロースゲルを用いた電気液動を行い、９００ｂ．ｐ．程度のバンドが確認できたものを陽性と判断した。

　＜大腸菌陽性クローンの培養＞
　コロニーＰＣＲで陽性と判断したクローンを、Ｈ鎖及びＬ鎖に関して、各々１２個ずつ培養した。すなわち、マスタープレートから陽性コロニーを爪楊枝でつき、ＬＢ／Ａｍｐ培地を３ｍＬ入れた培養チューブに入れ、３７℃で１晩培養した。

　＜プラスミドの抽出＞
　前記にて培養した大腸菌からのプラスミドの抽出は、ミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。すなわち、１．５ｍＬチューブに培養液を入れ、１５０００ｒｐｍで２０秒間遠心し大腸菌ペレットを回収した。上清を捨て、バッファーＰ１（ミニプレップキットの構成品）２５０μＬを入れてペレットを懸濁した。バッファーＰ２（ミニプレップキットの構成品）２５０μＬを加え、転倒混和した。バッファーＰ３（ミニプレップキットの構成品）３５０μＬを加えて転倒混和した後、１５０００ｒｐｍで３分遠心した。上清を新しい１．５ｍＬチューブに移し１５０００ｒｐｍで３分遠心した。さらに上清をスピンカラムへ移し、１５０００ｒｐｍで数秒遠心した。フロースルーを捨ててＰＥ液（ミニプレップキットの構成品）５００μＬを加え１５０００ｒｐｍで数秒間遠心した。この操作は２回行った。フロースルーを捨てた後、スピンカラムを１５０００ｒｐｍで数秒間遠心し、乾燥した。カラムを１．５ｍＬチューブに移し、滅菌水５０μＬを入れ１分静置した。その後１５０００ｒｐｍで３分遠心しプラスミド溶液を回収した。プラスミド濃度はナノドロップで測定した。

　＜シークエンス＞
　前記にて得られたプラスミドＤＮＡに挿入されているＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子について、シークエンスを行い、これら遺伝子の配列を決定した。使用したプライマー配列は下記の通りである
　ｐＴ７－プロプライマー：
５’－ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号：２０）
　ｐＴ７－Ｕ１９プライマ－
５’－ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧ－３’（配列番号：２１）。

　＜シークエンス結果の解析＞
　前記にて決定した塩基配列について、シークエンススキャナー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ社製）及びジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｙｘ）を使用し、解析を行った。また、ＥＭＢ　ｎｅｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）のクラスタルダブルサーバー（ＣｌｕｓｔａｌＷ　ｓｅｒｖｅｒ）及びボックスシェードサーバー（ＢｏｘＳｈａｄｅ　ｓｅｒｖｅｒ）を使用し、アライメントを作製した。そして、そのアライメントの結果から、各ハイブリドーマサブクローン由来モノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域を決定し、さらにＫａｂａｔルールに基づき、各可変領域におけるＣＤＲ１～３を予測した。得られた結果を配列表及び表１２に示す。

　配列表及び表１２に示す通り、２Ｅ４－２由来のモノクローナル抗体においては、配列の異なる２種類の軽鎖可変領域が同定された。また、２Ｅ４－２由来のモノクローナル抗体と、２Ｅ４－２と同じハイブリドーマクローンから単離された２Ｅ４－１０由来のモノクローナル抗体とにおいて、重鎖可変領域の配列は一致していた。さらに、軽鎖可変領域においても、２Ｅ４－２のうちの１種（配列番号：２５に記載のアミノ酸配列）と２Ｅ４－１０とは、アミノ酸配列が同一であった。また、１０Ｅ９－２由来のモノクローナル抗体と、１０Ｅ９－２と同じハイブリドーマクローンから単離された１０Ｅ９－１０由来のモノクローナル抗体とにおいて、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列は、各々一致していた。

　（実施例１４）
　［エピトープの同定］
　実施例７において確立したシングルクローン（サブクローン）由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体は、免疫原としたｈＴＥＲＴタンパク質の３０４～４６０アミノ酸において、どのアミノ酸配列（エピトープ）を認識し、特異的に結合しているのかを調べた。

　すなわち、先ず、２Ｅ４－２、２Ｅ４－５、２Ｅ４－１０、１０Ｅ９－２、１０Ｅ９－１０、９Ｂ１０－７、１０Ｃ１０－５、１０Ｆ３－１０及び１０Ｆ３－１－１１由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体と、ｈＴＥＲＴの部分ペプチドとの結合性を分析することにより、これら抗体のエピトープを絞り込んだ。

　＜大腸菌発現ベクターの設計＞
　抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体のエピトープ解析のため、抗原として用いたｈＴＥＲＴタンパク質の３０４～４６０アミノ酸領域を分割して各々発現させるための、大腸菌発現ベクターを設計した。すなわち、図３３に示す通り、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体の免疫原（リコンビナントタンパク質ｈＴＥＲＴの３０４～４６０アミノ酸配列からなるポリペプチド（１５７アミノ酸））を、基本長を８０アミノ酸とし、互いに重なり合う部分の長さを６０アミノ酸とし、Ｃ末側にＨｉｓ－ｔａｇを付加した５種のリコンビナントタンパク質に分割して発現させることとした。

　＜大腸菌発現ベクターの構築＞
　次に、ヒトＴＥＲＴ（ＮＰ＿９３７９８３）の１８０～４６０アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした人工遺伝子を含むプラスミドベクター（ｐＩＤＴＳＭＡＲＴＫＡＮ、ＩＤＴ社製）をテンプレートとして、ＮｄｅI認識サイトもしくはＸｈｏＩ認識サイトを付加した配列特異的なプライマーを用い、ＰＣＲ法によって５種の領域のＤＮＡを各々増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ　ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて行い、反応は９９℃にて２分間、次いで、９９℃にて３０秒、５７℃にて１分間及び６８℃にて１分間を１サイクルとして、３５サイクル、次いで、６８℃にて７分間という条件にて行った。表１３に増幅部位と使用したプライマー配列とを示す。なお、これらのプライマーは、つくばオリゴサービス株式会社に依頼して作製した。

　得られたＰＣＲ産物の一部をＭｕｐｉｄ－２ｐｌｕｓサブマリン型電気泳動装置（ＡＤＶＡＮＣＥ社製）にてアガロース電気泳動を行い、目的の２４０ｂｐのＤＮＡが増幅していることを確認した。

　得られたＰＣＲ産物と、大腸菌発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）とを、制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）及びＸｈｏＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）にて切断した。次いで、アガロース電気泳動によって、これら制限酵素による切断を確認し、目的のバンドをアガロースゲルより切り出して精製した。精製にはＱＩＡクイックゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。

　そして、切り出して精製した、目的の部分ペプチドをコードするＤＮＡ（目的遺伝子）及び発現ベクターをライゲーション反応液（製品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ、ＴＯＹＯＢＯ社製）に加え、１６℃にて３０分間、ライゲーション反応を行った。

　次に、得られたプラスミドをコンピテントセルＤＨ５αに導入し、カナマイシンを含んだＬＢ寒天培地にプレーティングし、３７℃にて一晩培養した。このようにして得られたコロニーは、実施例３と同じく、配列番号：３及び４に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的遺伝子が含まれているかどうかを確認した。コロニーＰＣＲの結果、目的遺伝子が含まれていると思われる菌体を２～３ｍＬのカナマイシン入りＬＢ培地にて一晩培養し、翌日、菌体を回収した。回収した菌体からＱＩＡプレップスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、プラスミドを精製した。

　得られた各々の精製プラスミドについて、組み込み部位の塩基配列をシークエンスにて確認し、目的遺伝子が正しく大腸菌発現ベクターに組み込まれていることを確認した。なお、シークエンスプライマーは前記と同じく配列番号：３及び４に記載の塩基配列からなるプライマーを用いた。

　＜部分ペプチドの発現確認＞
　前記にて得られた５種の発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１派生株のコンピテントセルに各々導入し、形質転換した。形質転換は１０μＬのコンピテントセルにプラスミドを加え、氷上に３０分静置した後、ＳＯＣ培地を添加して３７℃にて培養を行い、その後、カナマイシン入りのＬＢ寒天培地にプレーティングし、、一晩培養した。

　形質転換した各々の大腸菌のシングルコロニーを２～３ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ培地にて、対数増殖中期（Ｏ．Ｄ．６００＝０．６）になるまで培養し、Ｏ．Ｄ．６００＝０．６付近となった時点で１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し、その後２時間かけ発現誘導を行った。

　誘導後の菌体溶液を１ｍＬ回収し、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心して培地を除いた。その後、菌体に２００μＬの溶菌バッファー（Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ、ＭＢＬ社製）を加え、超音波破砕を行った。破砕後、２００μＬの２×サンプルバッファー（ＭＢＬ社製）を添加し、沸騰浴中で３分間煮沸して大腸菌ライセートサンプルとした。

　このように調製した各サンプルについて、Ｈｉｓ－ｔａｇに対する抗体（ＭＢＬ社製）を用いたウエスタンブロット法により目的タンパク質の発現を確認した。ウエスタンブロット法は１７．５％アクリルアミドゲルを用いて１レーンあたり培養液２５μＬ分の菌体に相当するタンパク質量を泳動した。サンプルの泳動が終了した後、ブロッティング装置により、２００Ｖにて３０分かけて、前記アクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜（イモビロンＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ）ミリポア社製、孔径　０．４５μｍ）へのサンプルの転写を行った。転写終了後、５％スキムミルク／ＰＢＳにて、ＰＶＤＦ膜のブロッキングを行い、検出用抗体として抗Ｈｉｓ　ｔａｇ－ＨＲＰ標識モノクローナル抗体（ＭＢＬ社製）を２０００倍希釈したものを使用して検出を行なった。検出は発色基質としてＥＣＬウエスタンブロッティングディテクションリージェント（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ＧＥヘルスケア社製）を、現像用のフィルムとしてアマシャムハイパーフィルムＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ　ＥＣＬ、ＧＥヘルスケア社製）を使用して行なった。得られた結果を図３４に示す。なお、図３４において、レーン１は「ｈＴＥＲＴ３０４－３８３サンプルを泳動」、レーン２は「ｈＴＥＲＴ３２４－４０３サンプルを泳動」、レーン３は「ｈＴＥＲＴ３４４－４２３サンプルを泳動」、レーン４は「ｈＴＥＲＴ３６４－４４３サンプルを泳動」、レーン５は「ｈＴＥＲＴ３８４－４６０サンプルを泳動」、レーン６は「陽性対照を泳動」した結果を各々示す。

　図３４に示す通り、抗Ｈｉｓ　ｔａｇ抗体を用いたウエスタンブロット法により、「ｈＴＥＲＴ３０４－３８３」においては１０．２ｋＤａのポリペプチドが、「ｈＴＥＲＴ３２４－４０３」においては１０．６ｋＤａのポリペプチドが、「ｈＴＥＲＴ３４４－４２３」においては１０．３ｋＤａのポリペプチドが、「ｈＴＥＲＴ３６４－４４３」においては１０．１ｋＤａのポリペプチドが、「ｈＴＥＲＴ３８４－４６０」においては９．９ｋＤａのポリペプチドが検出され、各々目的の部分ペプチドが発現できていることが確認できた。なお、分子量について、ウエスタンブロット法においてはタンパク質のアミノ酸構成に由来する移動度の変動が生じるため、理論値との数ｋＤａの移動度の差異は通常認めらており、今回検出されたポリペプチドの分子量は変動の範囲内であると判断した。また、レーン１、レーン４及びレ－ン５において認められた高分子のバンドは、各々分子量から、目的の部分ペプチドの２量体又は３量体であると判断した。

　＜エピトープの絞り込み＞
　前記＜部分ペプチドの発現確認＞にて得られた、ｈＴＥＲＴ３０４－３８３、ｈＴＥＲＴ３２４－４０３、ｈＴＥＲＴ３４４－４２３、ｈＴＥＲＴ３６４－４４３及びｈＴＥＲＴ３８４－４６０、各々の大腸菌ライセートサンプルを用いて、ウエスタンブロット法により抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体のエピトープの絞込みを行った。

　ウエスタンブロット法は、１７．５％アクリルアミドゲルを用い、１レーンあたりの目的タンパク質の泳動量がほぼ同等となるように、ｈＴＥＲＴ３０４－３８３は培養液０．２５μＬ分、ｈＴＥＲＴ３２４－４０３は培養液１．２５μＬ分、ｈＴＥＲＴ３４４－４２３は培養液１．２５μＬ分、ｈＴＥＲＴ３６４－４４３は培養液０．２５μＬ分、ｈＴＥＲＴ３８４－４６０は培養液０．５μＬ分の菌体に相当するタンパク質量を泳動した。また陽性対照として、抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体作製の際に免疫原として用いたリコンビナントタンパク質（ｈＴＥＲＴ３０４－４６０）を１レーンあたり０．０２μｇ泳動した。サンプルの泳動が終了した後、ブロッティング装置により、２００Ｖにて３０分かけてＰＶＤＦ膜（イモビロンＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ）、ミリポア社製、孔径：０．４５μｍ）への転写を行った。転写終了後、５％スキムミルク／ＰＢＳにてブロッキングを行い、１次抗体として抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体クローン　２Ｅ４－２、２Ｅ４－５、２Ｅ４－１０、１０Ｅ９－２、１０Ｅ９－１０、９Ｂ１０－７、１０Ｃ１０－５、１０Ｆ３－１０及び１０Ｆ３－１－１１を各々０．３μｇ／ｍＬに希釈したものを用い、２次抗体として、抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ標識抗体（ＭＢＬ社製）を３０００倍希釈したものを使用して検出を行なった。また、陽性対照として、転写したタンパク質を抗Ｈｉｓ　ｔａｇ－ＨＲＰ標識モノクローナル抗体（ＭＢＬ社製）を２０００倍希釈したもので検出を行った。検出は発色基質としてＥＣＬウエスタンブロッティングディテクションリージェント（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ＧＥヘルスケア社製）を、現像用のフィルムとしてアマシャムハイパーフィルムＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ　ＥＣＬ、ＧＥヘルスケア社製）を使用して行なった。得られた結果を図３５及び３６に示す。なお、図３５及び３６において、レーン１は「ｈＴＥＲＴ３０４－４６０サンプルを泳動」、レーン２は「ｈＴＥＲＴ３０４－３８３サンプルを泳動」、レーン３は「ｈＴＥＲＴ３２４－４０３サンプルを泳動」、レーン４は「ｈＴＥＲＴ３４４－４２３サンプルを泳動」、レーン５は「ｈＴＥＲＴ３６４－４４３サンプルを泳動」、レーン６は「ｈＴＥＲＴ３８４－４６０サンプルを泳動」した結果を各々示す。

　図３５及び３６に示した結果から明らかなように、２Ｅ４－２、２Ｅ４－５、２Ｅ４－１０、１０Ｅ９－２、１０Ｅ９－１０、９Ｂ１０－７、１０Ｃ１０－５、１０Ｆ３－１０及び１０Ｆ３－１－１１由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体において、全てのクローンが「ｈＴＥＲＴ３０４－４６０」と「ｈＴＥＲＴ３０４－３８３」とに反応し、他の部分ペプチドとは反応しなかった。従って、これらモノクローナル抗体のエピトープは、いずれもｈＴＥＲＴタンパク質の３０４～３２３アミノ酸の領域内に存在することが明らかになった。

　また、１０Ｅ９－２、２Ｅ４－２及び２Ｅ４－１０由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体に関しては、ペプチドライブラリーを用いて、より短いアミノ酸配列からなるエピトープを同定した。これらｈＴＥＲＴモノクローナル抗体のエピトープ同定には、メンブレンペプチドアレイ　ＰｅｐＳｐｏｔ（ＪＰＴ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。メンブレン上に合成するペプチドライブラリーとして、抗原であるヒトＴＥＲＴ（ＮＰ＿９３７９８３）の部分配列：３０４～４６０アミノ酸配列（１５７アミノ酸）に基づき、基本ペプチド長を１０アミノ酸とし、互いに重なり合う部分の長さを８アミノ酸とし、オフセットを２アミノ酸とする７５種のペプチド（ペプチド（Ｐｅｐ．）Ｎｏ．１～７５）をデザインした。表１４にこれら７５種のペプチドのアミノ酸配列を示す。

　そして、ＰｅｐＳｐｏｔｓのプロトコールに従い、メンブレンの活性化とブロッキングとを行った。すなわち、メンブレンをメタノールに浸して５分間振とうした後、ＴＢＳ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１３７ｍＭ　ＮａＣｌ，２．７ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ８．０）にて１０分間、３回洗浄した。その後、メンブレンを５％スキムミルク，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳに浸して室温にて２時間振とうし、ブロッキングを行った。

　次に、１０Ｅ９－２、２Ｅ４－２及び２Ｅ４－１０由来のモノクローナル抗体を反応用緩衝液（２．５％スキムミルク，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）に濃度１μｇ／ｍＬとなるように各々希釈し、これら希釈液にメンブレンを浸して室温にて３時間反応させた。反応終了後、ＴＢＳにて５分間、３回洗浄した。

　次いで、前記反応用緩衝液にて４０００倍に希釈した抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ標識抗体（ＭＢＬ社製）にメンブレンを浸し、室温にて２時間振とうし、反応させた。反応終了後、ＴＢＳにて５分間、３回洗浄した。

　そして、メンブレンに化学発光基質ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア社製）を１分間反応させた。次いで、冷却ＣＣＤカメラシステムＬＡＳ－３０００（富士フィルム社製）を用い、メンブレンの化学発光のイメージングを行った。得られた化学発光画像は、デジタイズ画像で取得したメンブレンの画像と重ね合わせ、発光部位の特定を行った。得られた結果を図３７に示す。

　図３７に示した結果から明らかなように、１０Ｅ９－２由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体はペプチドＮｏ．４のスポットにおいて、２Ｅ４－２由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体はペプチドＮｏ．３及びＮｏ．４のスポットにおいて、２Ｅ４－１０由来の抗ｈＴＥＲＴモノクローナル抗体はペプチドＮｏ．４及びＮｏ．５のスポットにおいて、各々反応が認められた。従って、各クローンのエピトープは表１５に記載の範囲内であること、すなわち、１０Ｅ９－２、２Ｅ４－２及び２Ｅ４－１０由来のモノクローナル抗体はいずれもヒトＴＥＲＴ（ＮＰ＿９３７９８３）の部分配列：３０８～３２１アミノ酸配列、特に３１０～３１９アミノ酸配列の中にエピトープを有していることが明らかになった。また、以上の結果より、本発明の抗体のエピトープとしては、ペプチドＮｏ．３～Ｎｏ．５の共通配列であるヒトＴＥＲＴ（ＮＰ＿９３７９８３）の部分配列：３１２～３１７アミノ酸配列からなるポリペプチドが好適である可能性が高い。

　以上説明したように、本発明によれば、ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に認識することが可能となる。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、特に、ウェスタンブロット法、細胞免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ＲＮＡ－結合タンパク質免疫沈降法等の検出方法において、内在性ｈＴＥＲＴタンパク質を特異的に認識する点に優れているため、ｈＴＥＲＴタンパク質を検出及び/又は精製するための試薬、ｈＴＥＲＴタンパク質に結合している分子（核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）、タンパク質等）を検出及び/又は精製するための試薬、ｈＴＥＲＴタンパク質の発現量を指標とするがん等の診断等において有用である。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、Ｍ期にて細胞周期を停止させ、又アポトーシスを誘導することができるため、細胞周期のＭ期において細胞を停止させるための試薬や細胞にアポトーシスを誘導するための試薬、がん等に対する医薬品として有用である。

配列番号１
＜２２３＞　コドンの使用頻度を大腸菌の系に適合させ、人工的に合成されたポリヌクレオチド配列
配列番号３～１５、１７～２１及び１５０～１５４
＜２２３＞　人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号１６
＜２２３＞　人工的に合成されたプローブの配列
配列番号２２
＜２２３＞　軽鎖可変領域１　ＣＤＲ１（２Ｅ４－２）
配列番号２３
＜２２３＞　軽鎖可変領域１　ＣＤＲ２（２Ｅ４－２）
配列番号２４
＜２２３＞　軽鎖可変領域１　ＣＤＲ３（２Ｅ４－２）
配列番号２５
＜２２３＞　軽鎖可変領域１（２Ｅ４－２）
配列番号２７
＜２２３＞　軽鎖可変領域２　ＣＤＲ１（２Ｅ４－２）
配列番号２８
＜２２３＞　軽鎖可変領域２　ＣＤＲ２（２Ｅ４－２）
配列番号２９
＜２２３＞　軽鎖可変領域２　ＣＤＲ３（２Ｅ４－２）
配列番号３０
＜２２３＞　軽鎖可変領域２（２Ｅ４－２）
配列番号３２
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ１（２Ｅ４－２）
配列番号３３
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ２（２Ｅ４－２）
配列番号３４
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ３（２Ｅ４－２）
配列番号３５
＜２２３＞　重鎖可変領域（２Ｅ４－２）
配列番号３７
＜２２３＞　軽鎖可変領域　ＣＤＲ１（２Ｅ４－１０）
配列番号３８
＜２２３＞　軽鎖可変領域　ＣＤＲ２（２Ｅ４－１０）
配列番号３９
＜２２３＞　軽鎖可変領域　ＣＤＲ３（２Ｅ４－１０）
配列番号４０
＜２２３＞　軽鎖可変領域（２Ｅ４－１０）
配列番号４２
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ１（２Ｅ４－１０）
配列番号４３
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ２（２Ｅ４－１０）
配列番号４４
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ３（２Ｅ４－１０）
配列番号４５
＜２２３＞　重鎖可変領域（２Ｅ４－１０）
配列番号４７
＜２２３＞　軽鎖可変領域　ＣＤＲ１（１０Ｅ９－２）
配列番号４８
＜２２３＞　軽鎖可変領域　ＣＤＲ２（１０Ｅ９－２）
配列番号４９
＜２２３＞　軽鎖可変領域　ＣＤＲ３（１０Ｅ９－２）
配列番号５０
＜２２３＞　軽鎖可変領域（１０Ｅ９－２）
配列番号５２
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ１（１０Ｅ９－２）
配列番号５３
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ２（１０Ｅ９－２）
配列番号５４
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ３（１０Ｅ９－２）
配列番号５５
＜２２３＞　重鎖可変領域（１０Ｅ９－２）
配列番号５７
＜２２３＞　軽鎖可変領域　ＣＤＲ１（１０Ｅ９－１０）
配列番号５８
＜２２３＞　軽鎖可変領域　ＣＤＲ２（１０Ｅ９－１０）
配列番号５９
＜２２３＞　軽鎖可変領域　ＣＤＲ３（１０Ｅ９－１０）
配列番号６０
＜２２３＞　軽鎖可変領域（１０Ｅ９－１０）
配列番号６２
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ１（１０Ｅ９－１０）
配列番号６３
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ２（１０Ｅ９－１０）
配列番号６４
＜２２３＞　重鎖可変領域　ＣＤＲ３（１０Ｅ９－１０）
配列番号６５
＜２２３＞　重鎖可変領域（１０Ｅ９－１０）

Claims

　配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体。
　配列番号：２のアミノ酸番号１２５～２８１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドで免疫することを特徴とする、ヒトテロメレース逆転写酵素に対するモノクローナル抗体の製造方法。
　請求項１に記載のモノクローナル抗体を含有する、細胞周期をＭ期にて停止させるための組成物。
　請求項１に記載のモノクローナル抗体を細胞内に導入する工程を含む、細胞周期をＭ期にて停止させるための方法。