WO2019117303A1 - テロメラーゼ逆転写酵素（ｔｅｒｔ）のリン酸化阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents

テロメラーゼ逆転写酵素（ｔｅｒｔ）のリン酸化阻害剤のスクリーニング方法 Download PDF

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麻美 安川
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Definitions

  • the present invention relates to a screening method for a telomerase reverse transcriptase (TERT) phosphorylation inhibitor and the like.
  • TERT telomerase reverse transcriptase
  • telomeres are repetitive sequences at the ends of chromosomes and protect intact chromosomes. On the other hand, telomeres are known to gradually shorten successive rounds of cell division, and highly shortened telomeres induce senescence and apoptosis.
  • telomerase reverse transcriptase As a catalytic subunit of telomerase, an enzyme that extends telomeres and maintains its structure, telomerase reverse transcriptase (TERT) is expressed at high levels in malignant cells but at very low levels in normal cells Be done. As the activity of TERT, telomerase activity for maintaining telomere structure is known, but recently, it has been reported that it also has RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) activity (Non-patent Document 1).
  • RdRP RNA-dependent RNA polymerase
  • RNA-dependent RNA polymerase is an enzyme that uses RNA as a template to synthesize RNA in the opposite direction, and pairing of these RNAs produces double-stranded RNA.
  • the RdRP activity of TERT exerts an enzyme activity using a non-protein coding RNA such as RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease (RMRP) as a template.
  • RMRP mitochondrial RNA processing endoribonuclease
  • TERT is known to form a TBN complex with helicase BRG1 and nucleostemin (NS) and to be involved in the maintenance of cancer stem cell function (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Documents 3 and 4 enhancement of M phase-specific RdRP activity of TERT is involved in the maintenance of cancer stem cell function.
  • the RdRP activity of TERT is involved in the maintenance of cancer stem cell function, focusing on the RdRP activity of TERT is considered to lead to the creation of an anticancer agent by a novel mechanism.
  • the RdRP activity of TERT is often unknown at present, and the mechanism by which TERT exhibits the RdRP activity rather than the intrinsic telomerase activity is unknown. Therefore, elucidation of the mechanism of RdRP activity by TERT can be a molecular basis for cancer treatment targets.
  • the present inventors have found that the phosphorylation of TERT triggers the RdRP activity of TERT.
  • the present invention is based on such findings.
  • the present invention is as follows.
  • a method of screening for a phosphorylation inhibitor of TERT which comprises using telomerase reverse transcriptase (TERT) or a fragment thereof and a telomerase reverse transcriptase (TERT) kinase.
  • Telomerase reverse transcriptase or a fragment thereof, wherein T249 of telomerase reverse transcriptase (TERT) is replaced with alanine or glutamate.
  • Telomerase reverse transcriptase or a fragment thereof, wherein the amino acid residue of any one of T249, S255, T1088 and S1095 of telomerase reverse transcriptase (TERT) or a fragment thereof is phosphorylated.
  • An anti-telomerase reverse transcriptase (TERT) antibody that recognizes the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-4.
  • telomerase reverse transcriptase a method of screening for a phosphorylation inhibitor of telomerase reverse transcriptase (TERT).
  • HeLa cells or 293T cells were synchronized to M phase, and human TERT (hTERT) was immunoprecipitated and purified with 10E9-2 antibody (MBL).
  • the preparation was analyzed by mass spectrometry to identify two phosphorylated peptides.
  • the identified peptides are 241-GAAPEPER T PVGQGS S WAHPGR-261 (SEQ ID NO: 18) and 1087-V T YVPLLG S LR-1097 (SEQ ID NO: 19), and these peptides are likely to be phosphorylated. There were 4 places (indicated by underlining). Each phosphorylation site specific recognition antibody was produced. Analysis of dephosphorylation treatment by ⁇ phosphatase (Fig.
  • the hTERT 191-306 expressed and purified in a cell-free synthesis system was reacted with a commercially available CDK1 or IKK2 of a negative control to collect a band (indicated by an asterisk) that appeared to be phosphorylated and was analyzed by mass spectrometry.
  • PT249 was detected only from the processed sample.
  • pS206, pS274 and pT283 etc. were detected from the sample treated with IKK2.
  • Western blotting of the same sample using Anti-hTERT pT249 detected a signal from only the sample treated with CDK1.
  • the T249A mutant is a mutant (A mutant) in which the substitution of T for A eliminates the phosphorylation and the endogenously present RdRP activity of hTERT is dominantly negative, while the T249E mutant does not generate T.
  • FIG. 4A shows the results of telomerase activity confirmed by introducing wild-type hTERT, A mutant and E mutant into BJ cells without telomerase activity. Telomerase activity was confirmed in all hTERT mutants. It has been confirmed that the introduction of these mutants into 293T having telomerase activity does not affect the telomerase activity (confirming the increase or decrease by the quantification method) (FIG. 4B). On the other hand, the effect on RdRP activity was dominant negative suppression of endogenous RdRP activity in the A mutant, and stronger RdRP activity was induced in the E mutant than in wild-type (FIG. 4C).
  • T249 phosphorylation Since phosphorylation of T249 by CDK1 was found to be essential for the growth of cancer cells, is the presence or absence of detection of T249 phosphorylation associated with cancer patients' prognosis or recurrence using human cancer patient samples? Examined. This examined whether T249 phosphorylation could be considered a therapeutic target.
  • the cancer tissues of 102 liver cancer patient samples were immunostained with Anti-hTERT pT249 and detection of phosphorylation of hTERT T249 (pT249) was negative (one example is shown as FIG. 6A) and positive for pT249 (one example) (Shown as 6B) (pT249-positive cells were judged as 10% or more as positive in one field of view). Overall survival is shown in FIG.
  • FIG. 6D recurrence free survival is shown in FIG. 6D. It was found that the overall survival time (FIG. 6C, p value ⁇ 0.05) and the recurrence free survival time (FIG. 6D, p value ⁇ 0.05) were significantly shorter in the staining positive case. From these facts, it was confirmed that the presence of T249 phosphorylation itself is correlated with the malignancy and recurrence of cancer, and serves as a molecular basis for cancer treatment targets. Cancer tissues of 67 pancreatic cancer patient samples were immunostained with Anti-hTERT pT249, and hTERT T249 phosphorylated (pT249) positive cells were judged as positive by 10% or more in one field.
  • T249A- CRISPR cells T249A- CRISPR cells in which endogenous hTERT T249 of 293T cells was replaced with alanine, which is a phosphorylated inactive amino acid, using CRISPR-Cas9 genome editing technology.
  • Control cells Control- CRISPR introduced only PuroCas9.
  • T249A- CRISPR cells are cells in which phosphorylation does not occur because A249 is substituted for T249, it was possible to confirm that phosphorylation of T249 is important for tumorigenesis. It was also confirmed that, in T249A- CRISPR cells, RdRP activity was markedly suppressed while telomerase activity was not affected. That is, also in T249A- CRISPR cells, phosphorylation of T249 was required for RdRP activity.
  • T249A- CRISPR cells show marked suppression of tumorigenicity, telomere length was maintained longer than control. From this, it can be said that TERT (T249A mutant) in which T249 of TERT is substituted with alanine is a "tumor suppressor / anti-aging (longevity) enzyme".
  • the present invention is a method of screening for an inhibitor of phosphorylation of telomerase reverse transcriptase (TERT).
  • telomerase reverse transcriptase (TERT) or a fragment thereof and a kinase of telomerase reverse transcriptase (TERT) are used.
  • TERT or a fragment thereof is a substrate for TERT phosphorylation enzyme and has a phosphorylation site by TERT phosphorylation enzyme.
  • the phosphorylation site is not particularly limited as long as it is a phosphorylation site by a kinase, and includes, for example, a serine residue or a threonine residue.
  • the screening method of the present invention is a method of searching for a substance that inhibits the phosphorylation of TERT, using the phosphorylation of the phosphorylation site of TERT or its fragment by the phosphorylation enzyme of TERT as an index.
  • the substance selected by the screening method of the present invention is a phosphorylation inhibitor that blocks the phosphorylation of TERT or a fragment thereof by the TERT kinase.
  • the phosphorylation inhibitor of TERT selected by the screening method of the present invention inhibits the phosphorylation of TERT, which is the starting point of the mechanism for expressing the RdRP activity of TERT, and thus inhibits the RdRP activity of TERT. Since the RdRP activity of TERT is involved in the maintenance of cancer stem cell function, the phosphorylation inhibitor of TERT inhibits the RdRP activity of TERT, which in turn makes it impossible to maintain the function of cancer stem cells. In addition, the presence of TERT phosphorylation is considered to be correlated with cancer grade and recurrence. Therefore, the phosphorylation inhibitor of TERT selected by the screening method of the present invention has the possibility to be used as an anticancer agent by a novel mechanism.
  • the TERT phosphorylation inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that reduces or eliminates the activity of TERT phosphorylation enzyme, for example, proteins such as antibodies, peptides, peptidomimetics, nucleic acids, carbohydrates, lipids and Molecular compounds and the like can be mentioned.
  • TERT or a fragment thereof and a phosphoenzyme of TERT are used.
  • the mode of inhibition is not particularly limited, and the method for confirming that phosphorylation of TERT or a fragment thereof is inhibited is not particularly limited, but the suppression or elimination of phosphorylation relative to a positive control to which no test substance is added
  • the screening inhibitor of TERT can be screened by searching for a substance to be
  • the source of TERT or a fragment thereof is not particularly limited as its origin, and may be derived from rodents such as rats and mice known as model animals, or animals such as monkeys, dogs, rabbits, and guinea pigs. It is preferred to use telomerase reverse transcriptase (TERT) of human origin or a fragment thereof.
  • TERT telomerase reverse transcriptase
  • TERT full-length TERT may be used as TERT or a fragment thereof, if it has an amino acid residue that becomes a phosphorylation site to be phosphorylated by a kinase or the like that is the starting point of the cascade of RdRP, it will be a fragment of TERT A peptide having an amino acid sequence can be used as a substrate for TERT phosphorylation enzyme.
  • TERT examples include amino acid residues of T249, S255, T1088 and S1095, and the like, and is preferably T249.
  • T means threonine residue
  • S means serine residue.
  • NP_937983 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_937983.2
  • Uniprot ID It is meant that it is a 249th threonine in TERT having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) known as O14746-1 (http: // www. Uniprot.
  • T249 is phosphorylated.
  • TERT a fragment thereof or TERT other than TERT known as NP_937983 or Uniprot ID O 14746-1 as described above, phosphorylation is used.
  • the site does not mean to be strictly 249th threonine from the N-terminus. That is, in the screening method of the present invention, it is one embodiment to use TERT having T249, but it is not essential to have an amino acid sequence known as NP — 937983 or Uniprot ID O 14746-1.
  • NP_937983 or Uniprot ID O 14746-1 of TERT In the amino acid sequence known as NP_937983 or Uniprot ID O 14746-1 of TERT, one or several tens, preferably one or several, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 8, 1 to 7, 1 It contains an amino acid sequence in which ⁇ 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 or 2 amino acids have been added, substituted or deleted, and has the ability to be phosphorylated by TERT phosphorylation enzyme
  • a derivative of TERT having an amino acid sequence known as the NP — 937983 or Uniprot ID O 14746-1 may be used, or another telomerase reverse transcriptase identified as TERT may be used.
  • TERT phosphorylation enzyme the amino acid sequence known as NP_937983 or Uniprot ID O 14746-1 as TERT, and 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more
  • TERT having an amino acid sequence having a sequence identity of 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more
  • T249 means a threonine residue corresponding to T249 in a sequence having the highest homology by alignment with the amino acid sequence known as the NP — 937983 or Uniprot ID O 14746-1.
  • the threonine residue of the S / TP phosphorylation motif in the amino acid sequence of these derivatives and the like may be used as the phosphorylation site corresponding to T249 of the amino acid sequence known as NP — 937983 or Uniprot ID O 14746-1.
  • the fragment of telomerase reverse transcriptase is not particularly limited as long as it has an amino acid residue corresponding to a phosphorylation site to be phosphorylated by TERT phosphorylation enzyme.
  • the fragment of TERT is not particularly limited as long as it has an amino acid residue corresponding to a phosphorylation site, for example, but a partial amino acid sequence of TERT having an amino acid residue of any of T249, S255, T1088 and S1095 It is preferable to use an amino acid sequence consisting of positions 191 to 306 of human TERT, for example, as a fragment having it.
  • the fragment of TERT is preferably a fragment containing T249, and for example, a fragment having an amino acid sequence consisting of 10 amino acid residues, such as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a fragment of TERT a chain comprising a fragment having the amino acid sequence of positions 245 to 254 of TERT, which is the N-terminal end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a fragment having the amino acid sequence of positions 191 to 306 of TERT. Fragments located midway in length can be mentioned.
  • the partial fragment of TERT may be a fragment consisting of at least 3 amino acid residues including a phosphorylation site, the N terminus is selected from amino acid residues 191 to 245, and the C terminus is 254
  • a fragment of TERT having an amino acid sequence selected from the amino acid residues at position -306 can be mentioned.
  • CDK1 can be used suitably.
  • the origin of CDK1 is not particularly limited, and may be derived from rodents such as rats and mice known as model animals, animals such as monkeys, dogs, rabbits, and guinea pigs, but human-derived CDK1 is used. Is preferred.
  • CDK1 although full length CDK1 may be used, as long as it has kinase activity, it may be a peptide having an amino acid sequence that becomes a fragment of CDK1.
  • telomerase reverse transcriptase or a fragment thereof and a reagent other than telomerase reverse transcriptase (TERT) phosphorylation enzyme may be used as a system used in a general kinase assay, Reagents for carrying out conventionally known phosphorylation tests of assay systems are used.
  • the kit may be a kit including at least telomerase reverse transcriptase (TERT) or a fragment thereof, and a phosphorylase of telomerase reverse transcriptase (TERT), and the kit may include the above-described reagents.
  • the screening method of the present invention may be performed in a cell system or in a cell-free system.
  • telomerase reverse transcriptase or a fragment thereof used in the screening method of the present invention, and the phosphorylase of telomerase reverse transcriptase (TERT), etc.
  • a protein / peptide expressed in cells may be purified by a conventionally known method, may be expressed in cells, and may be used as it is in cell lines, or it may be expressed in E. coli or the like by combining genetic engineering techniques and purified. Proteins / peptides may be used.
  • M phase accumulation cells may be used, and the method of accumulating cells in M phase can be performed according to known methods.
  • the cells are not particularly limited, but it is preferable to use a cancer cell line derived from a cancer tissue.
  • cancer cell lines include, but are not limited to, 293T cells, HeLa cells, PEO1 (ATCC), PEO14 (ATCC), ES-2 (ATCC), Alex, HLE, HuH7 cells, and U87MG. .
  • the method for confirming the phosphorylation of TERT or a fragment thereof is not particularly limited, but includes, for example, methods for immunological detection such as western blotting, immunohistological staining, immunocytostaining, dot blotting and the like. .
  • detection may be performed by a fluorescent antibody method, an immunoenzyme antibody method (ELISA), a radioactive substance labeled immunoantibody method (RIA), a sandwich ELISA method or the like.
  • ELISA immunoenzyme antibody method
  • RIA radioactive substance labeled immunoantibody method
  • TERT or a fragment thereof may be immunoprecipitated and confirmed by Western blot, or mass spectrometry may be used to confirm that phosphorylation has occurred.
  • an antibody that recognizes the amino acid sequence of TERT or a fragment thereof having such a phosphorylated amino acid residue.
  • the antibody is an amino acid sequence containing an amino acid residue to be phosphorylated, and a peptide in which the amino acid residue is phosphorylated can be used as an antigen to produce an antibody by a conventionally known method.
  • an antigen it is preferable to use as an antigen a peptide having a partial amino acid sequence of TERT having an amino acid residue of any of T249, S255, T1088 and S1095 and in which the amino acid residue is phosphorylated. .
  • an adjuvant is used in combination, or a peptide in which C is linked to the 5 'end of the amino acid sequence derived from TERT as an antigen is used to bind to KLH to stimulate immunity.
  • the antigen may be used. Since the animal producing the antibody is not particularly limited, the origin of the antibody recognizing the amino acid sequence of TERT having a phosphorylated amino acid residue is also not particularly limited.
  • the antibody in the present invention is an antibody that is derived from TERT and recognizes a phosphorylated amino acid sequence, and the phosphorylation is a phosphorylation that induces the RdRP activity of TERT.
  • the antibodies in the present invention can recognize TERT that is phosphorylated.
  • the antibody in the present invention is preferably an antibody that recognizes the amino acid sequence derived from TERT as shown in SEQ ID NO: 1-4.
  • the antibody in the present invention is also an antibody obtained by using, as an antigen, a peptide in which a peptide having an amino acid sequence derived from TERT shown in SEQ ID NOs: 5 to 8 is bound to KLH.
  • the antibody in the present invention is an antibody that recognizes a phosphorylated amino acid sequence derived from TERT, and recognizes an amino acid sequence derived from TERT shown in SEQ ID NOs: 1 to 4, each of SEQ ID NO: 5 to A peptide having an amino acid sequence derived from TERT represented by 8 may be an antibody obtained by using a peptide in which KLH is bound as an antigen.
  • the antibody according to the present invention is an antibody that recognizes the amino acid sequence derived from TERT represented by SEQ ID NO: 1-4, and the chain length is longer than the amino acid sequence derived from TERT represented by SEQ ID NO: 1-4
  • An antibody may be obtained using a peptide having an amino acid sequence as an antigen.
  • the antibody in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and the monoclonal antibody can also be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • the antibody in the present invention may be a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • antigen binding fragments of antibodies may also be provided.
  • Antigen binding fragments include Fab comprising VL, VH, CL and CH1 regions; F (ab ') 2 in which two Fabs are linked by a disulfide bond in the hinge region; Fv comprising VL and VH; VL and VH
  • scFv which is a single-chain antibody linked with an artificial polypeptide linker
  • bispecific antibodies such as diabody type, scDb type, tandem scFv type, leucine zipper type and the like.
  • phosphorylation of a specific amino acid residue has a poor prognosis. Therefore, by confirming whether such amino acid residues are phosphorylated in humans, it is possible to confirm a poor prognosis in cancer treatment. That is, phosphorylation at a specific amino acid residue in TERT can be a prognostic predictor in cancer treatment.
  • a lesion tissue is obtained from a cancer patient and stained by an immunological method, and for example, 5% or more, 10% or more, 20% or more of stained positive cells are present in one field. It can be judged that the prognosis for cancer treatment is poor.
  • the present invention evaluates that the prognosis is poor when any of amino acid residues T249, S255, T1088 and S1095 of telomerase reverse transcriptase (TERT) is phosphorylated, a prognosis prediction method for cancer treatment Also provide.
  • the prognosis prediction method in the present invention may be used as a diagnostic aid.
  • the present invention is carried out to confirm that any amino acid residue of T249, S255, T1088 and S1095 of telomerase reverse transcriptase (TERT) is phosphorylated.
  • the method used in the method for confirming the phosphorylation of TERT or its fragment can be used in the screening method of In TERT, TERT or its fragment in which any amino acid residue of T249, S255, T1088 and S1095 is phosphorylated can also be used as a detection marker.
  • telomerase reverse transcriptase in which T249 of telomerase reverse transcriptase (TERT), which is a mutant of TERT obtained in the process, is substituted with alanine or glutamic acid is a T249A mutant (alanine mutant) or It can be expressed as T249E mutant (glutamic acid mutant).
  • the alanine mutant has an action of suppressing cancer cell growth
  • the glutamate mutant has an action of promoting cancer cell growth.
  • telomere elongation enzyme activity is maintained as it is.
  • alanine mutants can also be recognized as tumor suppressor and anti-aging enzymes. Therefore, according to the present invention, an alanine mutant is provided as a tumor suppressor / anti-aging type TERT.
  • the T249A mutant (alanine mutant) or the T249E mutant (glutamic acid mutant) in the present invention is a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, and threonine at position 249 is mutated to alanine or glutamate.
  • the amino acid residue represented by SEQ ID NO: 17 may be a peptide, provided that the amino acid residue corresponding to 249th position threonine (preferably, the threonine residue of the S / TP phosphorylation motif) is substituted with alanine or glutamic acid It may be a peptide having an amino acid sequence having a sequence identity of 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more .
  • the amino acid residue corresponding to threonine at position 249 is alanine
  • the amino acid residue corresponding to threonine at position 249 is alanine
  • one or several tens, preferably one or several, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 or 2 amino acids are added It may be a peptide having a substituted or deleted amino acid sequence. It may be a fragment of T249A mutant (alanine mutant) or T249E mutant (glutamic acid mutant) as long as it has the above-mentioned activity.
  • TERT phosphorylated on T249 of telomerase reverse transcriptase can be used as a therapeutic target.
  • TERT phosphorylated at T249 of TERT is a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, and may be a peptide phosphorylated at position 249; If the corresponding amino acid residue (preferably, a threonine residue of the S / TP phosphorylation motif) is phosphorylated, 70% or more, 80% or more, 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 , 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of the amino acid sequence having sequence identity.
  • TERT phosphorylated in T249 of the present invention in the present invention is an amino acid residue corresponding to threonine at position 249 (preferably, a threonine residue of S / TP phosphorylation motif) is substituted with alanine or glutamic acid.
  • EPERpTPVGQG (SEQ ID NO: 1) VGQGpSWAHPG (SEQ ID NO: 2) RHRVpTYVPLL (SEQ ID NO: 3) PLLGpSLRTAQ (SEQ ID NO: 4) Oligopeptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5-8 were synthesized by conventional methods. The molecular weight of the target product was confirmed by mass spectrometry, and purified to> 90% purity by HPLC purification.
  • Each oligopeptide also has a partial sequence in hTERT.
  • the oligopeptide-containing amino acid sequences are all phosphorylated at threonine or serine considered to be a phosphorylation site, and at the N-terminus are C (cysteine, Cys) linked amino acid sequences . 2.
  • KLH bond 8 mg of KLH and 5 mg of the crosslinker EMCS were combined by an amino group-mediated bisimide ester method, and then gel filtration purification was performed. Next, KLH-EMCS complex and 4 mg of peptide were linked via the SH group of Cys to secure an immune source. 3.
  • Preparation of Rabbit Antiserum Antigen sensitization was performed a total of four times on Day 0, 14, 28, 49. The amount of phosphorylated peptide used was 100 ⁇ g once. The whole process sensitization site was intradermal, and the adjuvant was FCA (Freund complete adjuvant). On Day 42, blood was partially collected, and ELISA measurement and western blotting for phosphorylated peptide were performed. 4.
  • a purified column was made using phosphorylated peptide and 4-5 mg non-phosphorylated peptide.
  • the column carrier used CNBr-activated sepharose 4B.
  • the antiserum was passed through a phosphopeptide column.
  • the column adsorbed fraction was eluted, and the eluted fraction was passed through a non-phosphorylated peptide column to absorb non-phosphorylated antibody.
  • the non-phosphorylated fraction is collected (phosphorylated specific antibody), and the collected fraction is subjected to phosphorylation and ELISA with non-phosphorylated peptide to confirm the reactivity, and the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to 4 To obtain an anti-telomerase reverse transcriptase (TERT) antibody.
  • An anti-TERT antibody that recognizes the amino acid sequence of EPERpTPVGQG (SEQ ID NO: 1) was called Anti-hTERT pT249 antibody.
  • Detection of phosphorylated hTERT (immunoprecipitation-Western blot) (1) Preparation of M phase accumulation cells DMEM medium (Wako) supplemented with 10% inactivated fetal bovine serum (IFS), Penicillin (100 U / mL) and Streptocin (100 ⁇ g / mL) was used as a normal medium and cultured from the previous day Hela cells (ATCC) were seeded at 1 ⁇ 10 6 cells per 10 cm dish. After culturing for 2 days, the normal medium was replaced with a medium further supplemented with Thymidine (Nacalai Tesque, final 2.5 mM) and cultured.
  • IFS inactivated fetal bovine serum
  • Penicillin 100 U / mL
  • Streptocin 100 ⁇ g / mL
  • the cells were washed three times with 10 mL of PBS (phosphate buffered saline), and cultured in medium replacement. After culturing for 6 hours, the normal medium was replaced with a medium further containing Nocodazole (Sigma, final 0.1 ⁇ g / mL) in the normal medium and cultured. After 14 hours of culture, cells were harvested.
  • PBS phosphate buffered saline
  • siRNA was transfected. Specifically, it was based on the following method. 1. 20 ⁇ L of Lipofectamine 2000 (Invitrogen) was added to 1 mL Opti-MEM. 2. 330 pmol siRNA was added to 1 mL Opti-MEM (Gibco). 3. 1 and 2 were mixed and added dropwise to a 10 cm dish every 20 minutes at room temperature.
  • the membrane was blocked with blocking buffer (TOYOBO NYPBR01) for 1 hour at room temperature, washed with Tris-HCl buffer (TBST) containing 0.1% Tween 20, and reacted with Anti-hTERT pT249 antibody (dilution 1: 1000) for 1 hour at room temperature
  • the reaction solution was washed with TBST, reacted with anti-rabbit IgG-HRP antibody (GE Helthcare) for 1 hour at room temperature, washed with TBST, and then detected with ECL reagent (Roche, Lumi Light Plus Wetern Blotting Substrate).
  • the antibody dilution used TBST containing 2.5% bovine serum albumin (BSA). The results are shown in FIGS. 1A, 1B and 2A.
  • IP-RdRP activity assay method was performed according to the method described in MoI Cell Biol 34: 1576-1593, 2014, MoI Cell Biol 36: 1248-1259, 2016. The results are shown in FIG. 2B.
  • the expressed protein was N-terminally labeled with poly-histidine N11-tag, and thus, N11-tagged hTERT (191-306) was purified with AKTA 10S system (GE Healthcare) using HisTrap columns (GE Healthcare). Specifically, after washing with a gradient buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 M NaCl, 10 mM imidazole), the eluted buffer (50 mM Tris-HCl (pH) with a gradient of imidazole (from 10 to 500 mM) Elution was with 8.0), 0.5 M NaCl). Imidazole was removed by dialysis.
  • a gradient buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 M NaCl, 10 mM imidazole
  • the eluted buffer 50 mM Tris-HCl (pH) with a gradient of imidazole (from 10 to 500 mM) Elution was with 8.0), 0.5 M NaCl.
  • the poly-histidine N11-tag at the N-terminus was removed by TEV protease using artificially introduced TEV (Tobacco Etch virus) protease recognition site.
  • TEV tobacco Etch virus
  • This preparation was purified by ion exchange chromatography on HiTrap SP column (GE Healthcare) and gel filtration on HiLoad 16/600 Superdex columns (GE Healthcare).
  • the final concentration of the buffer containing the purified protein preparation was 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 450 mM NaCl, and 0.25 mM TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphohydrochloride).
  • IKK2 (-664) used as a negative control to convert to CDK1 in in vitro kinase assay IKK2 corresponds to the 2-664 amino acid site of [Approved HGNC name, IKBKB; HGNC ID, 5960; UniProtKB ID, O14920]
  • the cDNAs were introduced into pDEST vector (Thermo Fisher Scientific), and proteins were expressed using Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Thermo Fisher Scientific).
  • Polyhistidine affinity-labeled IKK2 (2-664) was infected with baculovirus and expressed at a multiplicity of infection (MOI) of 1.0 in insect cells Sf9 cells.
  • MOI multiplicity of infection
  • the cells were recovered 48 hours after infection, washed with PBS, cryopreserved in liquid nitrogen and purified according to the following article. [J Biol Chem. 2013 Aug 2; 288 (31): 22758-67.] (3) In Vitro Kinase Assay A kinase assay was performed for 2 hours at 37 ° C. using purified hTERT (191-306) and CDK1-cyclin B (New England Biolabs). The composition of the reaction solution (40 ⁇ L) was as follows.
  • hTERT 191-306 [0.33 ⁇ g / ⁇ L (25.86 ⁇ M)] 16 ⁇ L 4 ⁇ l of 10 ⁇ NEBuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 0.1 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.01% Brij 35) CDK1-cyclin B (20 units / ⁇ L) 6 ⁇ L or H 2 O 6 ⁇ L H 2 O 12.5 ⁇ L 125 mM ATP (Sigma, adenosine triphosphate) 1.5 ⁇ L or H 2 O 1.5 ⁇ L After the reaction, 10 ⁇ L of the sample was 2.5 ⁇ SDS sample buffer (140 mM Tris-HCl (pH 6.8), 5% (w / v) SDS, 250 mM DTT, 15% (v / v) glycerol, 0.01% (w / v) bromophenol blue) Add 10 ⁇ L for 3 minutes at
  • a mutant, E mutant plasmid was prepared using a QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies) according to the recommended protocol.
  • the A mutant is 5'-agccggagcgggcgccccttggg-3 '(SEQ ID NO: 13 Forward) as well as 5'-cccaacgggcgccccctctggggct-3 '(SEQ ID NO: 14 Reverse)
  • the E mutant is 5'-tgagccggagggggggcccctgggcag-3 '(SEQ ID NO: 15 Forward) as well as 5'-ctgcccaacggggctcccgctcggctca-3 '(SEQ ID NO: 16 Reverse) PCR was carried out using pBABE-puro-hTERT retroviral vector or pNK-FLAG-z-hTERT expression vector as
  • the PCR product was treated with restriction enzyme Dpn I at 37 ° C. for 1 hour, and transformed into XL-10-Gold ultracompetent cells.
  • the results of testing the obtained T249A mutant (A mutant) and T249E mutant (E mutant) for telomerase activity and RdRP activity are shown in FIG.
  • the obtained T249A mutant and T249E mutant were introduced into each of Saos2, HCC-MT, PEO1 and PEO14 cell lines using a retrovirus vector (TaKaRa, Retrovirus Packaging Kit Ampho).
  • Each transduced cell was seeded at 20,000 cells / well (only HCC-MT alone: 7,000 cells / well) in a 24-well plate, and the proliferation ability was confirmed by measuring the number of cells over time.
  • a medium for Saos 2 and HCC-MT a DMEM medium (Wako) supplemented with 10% IFS, Penicillin (100 U / mL) and Streptomycin (100 ⁇ g / mL) was used.
  • a medium for PEO1 and PEO14 RPMI-1640 medium (Sigma) to which 10% IFS, Penicillin (100 U / mL), Streptolycin (100 ⁇ g / mL) and Sodium Pyruvate (2 mM) were added was used.
  • a plasmid vector that expresses Cas9, a genome editing enzyme, the sequence of a guide RNA that targets near threonine 249 of hTERT (AGCCGGAGCGG ACG CCCGTTGGG SEQ ID NO: 20 underlined ACG is a codon that encodes threonine Was introduced to make PuroCas 9-hTERT.
  • a 223-base hTERT DNA containing a target amino acid site replacement of ACG encoding threonine with GCC encoding alanine was introduced into a donor vector.

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Abstract

本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化酵素を用いる、ＴＥＲＴのリン酸化阻害剤のスクリーニング方法を提供する。

Description

テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化阻害剤のスクリーニング方法
　本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化阻害剤のスクリーニング方法等に関する。
　テロメアは、染色体末端の反復配列であり、インタクトな染色体を保護する。一方、テロメアは、細胞分裂の連続ラウンドを徐々に短縮し、非常に短縮されたテロメアは老化及びアポトーシスを誘発することが知られている。
　テロメアを伸長させ、その構造を維持する酵素であるテロメラーゼの触媒サブユニットとして、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）は、悪性細胞において高いレベルで発現されるが、正常細胞においては非常に低いレベルで発現される。
　ＴＥＲＴの活性として、テロメア構造を維持するためのテロメラーゼ活性が知られているが、最近、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）活性をも有することが報告されている（非特許文献１）。
　ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを鋳型にして反対向きのＲＮＡを合成する酵素であり、これらＲＮＡが対をなすことで２本鎖ＲＮＡが生成する。
　ＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性は、ＲＮＡ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＲＮＡ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＭＲＰ）等の非たんぱくコードＲＮＡを鋳型として酵素活性を発揮する。
　また、ＴＥＲＴは、ヘリカーゼＢＲＧ１とｎｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ（ＮＳ）と、ＴＢＮ複合体を形成し、がん幹細胞の機能維持に関わることが知られている（非特許文献２）。
　さらに、ＴＥＲＴのＭ期特異的なＲｄＲＰ活性増強は，がん幹細胞の機能維持に関わることが知られている（非特許文献３及び４）。
Cancer Sci 106 (2015) 1486-1492 Proc Natl AcadSci U S A 108 (2011) 20388-20393 Mol Cell Biol 34 (2014) 1576-1593 Mol Cell Biol 36 (2016) 1248-1259
　ＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性は、がん幹細胞の機能維持に関わるため、ＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性に着目すると、新規メカニズムによる抗がん剤の創出につながると考えられる。
　しかしながら、ＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性については、現在においても知られていないことが多く、ＴＥＲＴが、本来のテロメラーゼ活性を示すのではなく、ＲｄＲＰ活性を示す場合のメカニズムは不明である。
　したがって、ＴＥＲＴによるＲｄＲＰ活性のメカニズムを解明することは、がん治療の標的の分子基盤となり得る。
　鋭意検討した結果、本発明者らは、ＴＥＲＴのリン酸化がＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性のトリガーになることを突き止めた。
　本発明は、かかる知見に基づくものである。
　本発明は、以下のとおりである。
（１）
　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化酵素を用いる、ＴＥＲＴのリン酸化阻害剤のスクリーニング方法。
（２）
　リン酸化部位が、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片のＴ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基である、（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）
　リン酸化部位が、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片のＴ２４９である、（１）に記載のスクリーニング方法。
（４）
　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化酵素が、サイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）である、（１）～（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（５）
　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の断片が、Ｔ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する、（１）～（４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（６）
　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＴ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基がリン酸化されている場合に予後が不良であると評価する、がん治療の予後予測方法。
（７）
　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＴ２４９が、アラニン又はグルタミン酸に置換されているテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片。
（８）
　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片のＴ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基が、リン酸化されているテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片。
（９）
　配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列を認識する抗テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）抗体。
　本発明によれば、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化阻害剤のスクリーニング方法を提供し得る。
HeLa細胞又は293T細胞をM期に同調し、ヒトTERT（hTERT）を10E9-2抗体（MBL）にて免疫沈降し精製した。標品を質量分析にて解析しリン酸化された2本のペプチドを同定した。同定したペプチドは、241-GAAPEPERTPVGQGSWAHPGR-261（配列番号１８）及び1087-VTYVPLLGSLR-1097（配列番号１９）であり、これらペプチドにはリン酸化を受ける可能性のある箇所が4カ所存在した（下線を付して示す）。それぞれのリン酸化部位特異認識抗体を作成した。λphosphataseによる脱リン酸化処理（図１Ａ）とsiRNAによるhTERTの発現抑制（図１Ｂ）により解析した結果、リン酸化T249認識抗体（Anti-hTERT pT249）でリン酸化特異的シグナルの消失が見られたことから、T249のリン酸化が確認された。 hTERT T249のリン酸化に関わる上流キナーゼの同定を試みた。T249の部位には先行論文で記述のある(S/T)P motifが存在することからCDK1を筆頭にAurora B kinase、p38 MAP kinase等を推測し、それぞれのkinaseに対するsiRNAを用いてhTERT T249のリン酸化が維持されるかどうかを確認した。その結果、CDK1に対するsiRNAで処理した細胞では、hTERT pT249のシグナルの消失を認めたことから、hTERT T249のリン酸化にはCDK1が必須であることが確認できた（図２Ａ）。さらに、CDK1に対するsiRNAで処理した細胞では、hTERTのRdRP活性も阻害されていることを確認した（図２Ｂ）。 CDK1によりhTERT T249がリン酸化（pT249）されているかどうかを試験管内で確認した。無細胞合成系で発現精製したhTERT_191-306と市販のCDK1又は陰生コントロールのIKK2を反応させリン酸化を受けたと思われるバンド（星印で示す）を回収し質量分析により解析したところ、CDK1で処理したサンプルからのみpT249が検出された。一方、IKK2で処理したサンプルからは、pS206、pS274及びpT283等が検出された。同サンプルをAnti-hTERT pT249を用いてWestern blottingを行ったところ、CDK1で処理をしたサンプルのみからシグナルが検出された。これらの実験から、CDK1はhTERTの249番のTをリン酸化する、Anti-hTERT pT249はリン酸化されたhTERTの249番のTを認識していることが確認された。 hTERT T249のリン酸化ががん細胞の機能維持に重要かどうかを確認するためにたった1アミノ酸のT249に変異を加えたhTERTを作成し、がん細胞の増殖に与える影響を確認した。T249A変異体はTをAに置換することによりリン酸化がおこらなくなり内在性に存在するhTERTのRdRP活性をドミナントネガティブに抑制する変異体（A変異体）であり、一方でT249E変異体はTをEに置換することにより恒常的に同部位がリン酸化されたことを模倣する変異体(E変異体)である。図４Ａは、テロメラーゼ活性の無いBJ細胞に野生型hTERT、A変異体、E変異体を導入しテロメラーゼ活性を確認した結果を示す。いずれのhTERT変異体もテロメラーゼ活性が確認された。テロメラーゼ活性のある293Tにこれらの変異体を導入してもテロメラーゼ活性（定量方法によりその増減を確認）には影響を及ぼさないことが確認できた（図４Ｂ）。一方、RdRP活性に及ぼす影響は、A変異体では内在性のRdRP活性をドミナントネガティブに抑制し、E変異体では野生型より強くRdRP活性を誘導した（図４Ｃ）。 hTERTが発現していないことが知られているSaos2細胞株にE変異体を導入するとがん細胞の増殖が亢進した。また、もとより、hTERTの発現が存在することが知られているがん細胞株（HCC-MT、PEO1及びPEO14）ではE変異体での細胞増殖亢進の上乗せ効果自体はわずかである一方、A変異体でのがん細胞の増殖抑制効果は非常に顕著に見られた。このことから、T249のリン酸化そのものが、がん細胞増殖に必須であるということがいえる。図の破線はコントロール細胞、実線はA変異体導入細胞、点線はE変異体導入細胞の細胞増殖曲線を示す。 CDK1によるT249のリン酸化が、がん細胞の増殖に必須であることがわかったことから、ヒト癌患者検体を用いてT249リン酸化の検出の有無ががん患者の予後や再発と関連するか調べた。これにより、T249リン酸化が治療標的と考え得るかどうかを検討した。肝臓がん患者検体102例のがん組織をAnti-hTERT pT249で免疫染色しhTERT T249のリン酸化(pT249)の検出陰性例(一例を図６Ａとして示す)とpT249の検出陽性例(一例を図６Ｂとして示す)とに分類した（pT249陽性細胞が１視野に10％以上を陽性として判定した）。全生存期間を図６Ｃに示し、無再発生存期間を図６Ｄに示す。染色陽性例では全生存期間（図６Ｃ、p値＜0.05）、無再発生存期間（図６Ｄ、p値＜0.05）ともに有意に短いことがわかった。これらのことより、T249リン酸化の存在自体が癌の悪性度や再発と相関があり、癌治療の標的の分子基盤となることが確認された。 膵臓がん患者検体67例のがん組織をAnti-hTERT pT249で免疫染色し、hTERT T249のリン酸化（pT249）陽性細胞が１視野に10％以上を陽性として判定した。pT249の検出陰性例とpT249の検出陽性例とに分類し、臨床病理学的解析を行った。その結果、染色陽性率59.7％(67例中40例)であり、リンパ節転移陽性例で統計学的有意差をもって染色陽性症例が多かった（p値＜0.0001）(図７Ａ及び７Ｃ)。さらに手術可能症例（47症例）の解析では、染色陽性症例では３年生存率が有意に低いことがわかった（p値＜0.05）。また、同一患者検体内での染色においても、高分化腺がん成分よりも、低分化腺がん成分での染色が強く(図７Ａ及び７Ｂ)、また、極めて予後不良な膵がんである腺扁平上皮がんでは、扁平上皮がん成分で強い染色が観察された(図７Ｃ及び７Ｄ)。これらのことより、膵臓がんにおいても、T249リン酸化の存在自体が予後不良予測因子となることが解った。 293T細胞の、内在性のhTERTのT249を、CRISPR-Cas9ゲノム編集技術を用いて、リン酸化不活性型アミノ酸であるアラニンに置換したT249A-CRISPR細胞（T249A-CRISPR）を作製した。コントロール細胞（Control-CRISPR）は、PuroCas9のみを導入した。これらの細胞を、それぞれ1x105個をNOD/SCIDマウスの皮下に移植した。T249A-CRISPR細胞では造腫瘍能の著明な抑制が見られた。T249A-CRISPR細胞はT249がアラニンに置換されていることでリン酸化が起こらない細胞であることから、T249のリン酸化が腫瘍形成に重要であることを確認できた。 T249A-CRISPR細胞においても、RdRP活性が著明に抑制される一方で、テロメラーゼ活性には影響がないことを確認した。すなわち、T249A-CRISPR細胞においても、T249のリン酸化がRdRP活性に必要であった。T249A-CRISPR細胞では造腫瘍能の著明な抑制が見られる一方で、テロメア長はコントロールよりも長く維持されていた。このことよりTERTのT249が、アラニンに置換されているTERT（T249A変異体）は「がん抑制・抗老化（長寿）酵素」であると言える。
　本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化阻害剤のスクリーニング方法である。
　当該スクリーニング方法においては、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化酵素を用いる。
　ＴＥＲＴ又はその断片は、ＴＥＲＴのリン酸化酵素の基質となり、ＴＥＲＴのリン酸化酵素によるリン酸化部位を有する。
　リン酸化部位としては、キナーゼによるリン酸化部位であれば特に限定されるものではないが、例えば、セリン残基又はスレオニン残基が挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法においては、ＴＥＲＴのリン酸化酵素によるＴＥＲＴ又はその断片におけるリン酸化部位のリン酸化を指標にして、ＴＥＲＴのリン酸化を阻害する物質を探索する方法である。
　本発明のスクリーニング方法により選択される物質は、ＴＥＲＴのリン酸化酵素による、ＴＥＲＴ又はその断片のリン酸化を阻害（ｂｌｏｃｋ）するリン酸化阻害剤である。
　本発明のスクリーニング方法により選択されるＴＥＲＴのリン酸化阻害剤は、ＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性を発現するためのメカニズムの起点となるＴＥＲＴのリン酸化を阻害するため、ＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性を阻害する。
　ＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性は、がん幹細胞の機能維持に関わることから、ＴＥＲＴのリン酸化阻害剤は、ＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性を阻害し、ひいては、がん幹細胞の機能を維持することをできなくする。また、ＴＥＲＴのリン酸化があることは、がん悪性度、再発と相関すると考えられる。
　したがって、本発明のスクリーニング方法により選択されてくるＴＥＲＴのリン酸化阻害剤は、新規メカニズムによる抗がん剤として用いることができる可能性を有する。
　ＴＥＲＴのリン酸化阻害剤としては、ＴＥＲＴのリン酸化酵素の活性を低下又は消失させる物質であれば特に限定されず、例えば、抗体等のタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質及び低分子化合物等が挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法においては、少なくとも、ＴＥＲＴ又はその断片、及びＴＥＲＴのリン酸化酵素を用いる。
　ＴＥＲＴのリン酸化酵素によるＴＥＲＴ又はその断片のリン酸化が阻害されていることを確認することにより、ＴＥＲＴのリン酸化阻害剤である物質をスクリーニングし得る。
　阻害の様式は特に限定されず、また、ＴＥＲＴ又はその断片のリン酸化が阻害されていることの確認方法も特に限定されないが、被験物質を加えない陽性コントロールに対して、リン酸化を抑制乃至消失させる物質を探索することによりＴＥＲＴのリン酸化阻害剤をスクリーニングし得る。
　ＴＥＲＴ又はその断片としては、その由来として特に限定されるものではなく、モデル動物として知られるラットやマウス等のげっ歯類、サル、イヌ、ウサギ、モルモット等の動物由来であってもよいが、ヒト由来のテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片を用いることが好ましい。
　ＴＥＲＴ又はその断片として、全長のＴＥＲＴを用いてもよいが、ＲｄＲＰ活性化のカスケードの起点となるキナーゼ等によるリン酸化を受けるリン酸化部位となるアミノ酸残基を有すれば、ＴＥＲＴの断片となるアミノ酸配列を有するペプチドをＴＥＲＴのリン酸化酵素の基質として用いることができる。
　ＴＥＲＴのリン酸化部位は、例えば、Ｔ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基等が挙げられ、Ｔ２４９であることが好ましい。
　リン酸化部位としての、Ｔはスレオニン残基を意味し、Ｓはセリン残基を意味する。
　Ｔ２４９における「２４９」は、Ｎ末端から２４９番目のアミノ酸残基であることを意味するが、NP_937983 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_937983.2)、あるいはUniprot ID O14746-1 (http://www.uniprot.org/uniprot/O14746)として公知のアミノ酸配列（配列番号１７）を有するＴＥＲＴにおける２４９番目のスレオニンであることを意味している。
　ここで、本発明のスクリーニング方法においては、Ｔ２４９がリン酸化されることが好ましいが、その断片や、ＴＥＲＴとして、上記NP_937983あるいはUniprot ID O14746-1として知られるＴＥＲＴ以外を用いる場合には、リン酸化部位は、厳密にＮ末端から２４９番目のスレオニンであることを意味しない。
　すなわち、本発明のスクリーニング方法においては、Ｔ２４９を有するＴＥＲＴを用いることが一態様となるが、NP_937983あるいはUniprot ID O14746-1として知られるアミノ酸配列を必須として有するものではない。ＴＥＲＴのNP_937983あるいはUniprot ID O14746-1として知られるアミノ酸配列において、１又は数十個、好ましくは１又は数個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１又は２個のアミノ酸が付加、置換、又は欠失したアミノ酸配列を含み、ＴＥＲＴのリン酸化酵素によるリン酸化能を有する当該NP_937983あるいはUniprot ID O14746-1として知られるアミノ酸配列を有するＴＥＲＴの誘導体を用いてもよいし、その他ＴＥＲＴとして同定されているテロメラーゼ逆転写酵素を用いてもよい。
　また、ＴＥＲＴのリン酸化酵素による被リン酸化能を有する限り、ＴＥＲＴとして、当該NP_937983あるいはUniprot ID O14746-1として知られるアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴＥＲＴの誘導体を用いてもよい。
　これら誘導体等を用いる場合には、Ｔ２４９は、当該NP_937983あるいはUniprot ID O14746-1として知られるアミノ酸配列と、アラインメントして最も相同性の高い配列において、Ｔ２４９に相当するスレオニン残基を意味する。好ましくは、これら誘導体等のアミノ酸配列におけるＳ／ＴＰリン酸化モチーフのスレオニン残基を、NP_937983あるいはUniprot ID O14746-1として知られるアミノ酸配列のＴ２４９に対応するリン酸化部位として用いてよい。
　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の断片としては、ＴＥＲＴのリン酸化酵素によるリン酸化を受けるリン酸化部位にあたるアミノ酸残基を有すれば特に限定されるものではない。
　ＴＥＲＴの断片としては、例えば、リン酸化部位にあたるアミノ酸残基を有すれば特に限定されるものではないが、Ｔ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基を有するＴＥＲＴの部分アミノ酸配列を有する断片として挙げられ、例えば、ヒトＴＥＲＴの１９１位～３０６位からなるアミノ酸配列を用いることが好適である。
　また、ＴＥＲＴの断片としては、Ｔ２４９を含む断片であることが好ましく、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列のように、１０アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する断片が挙げられる。
　ＴＥＲＴの断片としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末であるＴＥＲＴの２４５位～２５４位アミノ酸配列を有する断片と、ＴＥＲＴの１９１位～３０６位のアミノ酸配列を有する断片との鎖長において中間に位置する断片を挙げられる。
　具体的には、ＴＥＲＴの部分断片として、リン酸化部位を含む少なくとも３アミノ酸残基からなる断片であってもよく、Ｎ末端を１９１位～２４５位のアミノ酸残基から選択し、Ｃ末端を２５４位～３０６位のアミノ酸残基から選択したアミノ酸配列を有するＴＥＲＴの断片が挙げられる。
　ＴＥＲＴのリン酸化酵素としては、ＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性の起因となるＴＥＲＴのリン酸化をするリン酸化酵素であれば特に限定されるものではないが、ＣＤＫ１を好適に用いることができる。
　ＣＤＫ１の由来も特に限定されるものではなく、モデル動物として知られるラットやマウス等のげっ歯類、サル、イヌ、ウサギ、モルモット等の動物由来であってもよいが、ヒト由来のＣＤＫ１を用いることが好ましい。
　また、ＣＤＫ１としては、全長のＣＤＫ１を用いてもよいが、キナーゼ活性を有する限り、ＣＤＫ１の断片となるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
　本発明のスクリーニング方法において、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化酵素以外に用いる試薬としては、通常のキナーゼアッセイに用いられる系としてもよく、当該アッセイ系の従来より公知のリン酸化試験を行うための試薬類が用いられる。少なくともテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化酵素を含むキットとしてもよく、キットには、上記試薬類を含んでいてもよい。
　また、本発明のスクリーニング方法は、細胞系で行ってもよく、無細胞系で行ってもよい。
　本発明のスクリーニング方法において用いられるテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化酵素等は、従来公知の方法により作成したものを使用してもよい。
　例えば、細胞で発現させたタンパク質／ペプチドを従来公知の方法により精製してもよく、細胞で発現させ細胞系においてそのまま使用してもよく、遺伝子工学技術を組み合わせて大腸菌等で発現させて精製したタンパク質／ペプチドを用いてもよい。
　本発明においては、Ｍ期集積細胞を用いて行ってもよく、細胞をＭ期に集積させる方法は公知の方法に準じて行うことができる。
　また、細胞としては、特に限定されるものではないが、がん組織に由来するがん細胞株を用いることが好適である。
　がん細胞株としては、特に限定されないが、例えば、293T細胞、HeLa細胞、PEO1(ATCC)、PEO14(ATCC)、ES-2(ATCC)、Alex、HLE、HuH7細胞、及びU87MG等が挙げられる。
　ＴＥＲＴ又はその断片のリン酸化を確認する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色法、免疫細胞染色、ドットブロッティング等の免疫学的に検出する方法が挙げられる。また、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法(ELISA)、放射性物質標識免疫抗体法(RIA)、サンドイッチELISA法等により検出してもよい。
　本発明のスクリーニング方法においては、ＴＥＲＴ又はその断片を免疫沈降させ、Westernブロットにより確認する方法や、質量分析によりリン酸化が起こっていることを確認してもよい。
　ＴＥＲＴ又はその断片のリン酸化を確認する場合に、かかるリン酸化されたアミノ酸残基を有するＴＥＲＴ又はその断片のアミノ酸配列を認識する抗体を用いることが好ましい。
　当該抗体は、リン酸化されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であって、当該アミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを抗原として用いて、従来公知の方法により抗体を作製することができる。
　かかる抗原としては、Ｔ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基を有し、当該アミノ酸残基がリン酸化されているＴＥＲＴの部分アミノ酸配列を有するペプチドを抗原とすることが好適である。
　抗体を得る際には、例えば、アジュバンドを併用して用いたり、抗原となるＴＥＲＴに由来するアミノ酸配列の５’末端に、Ｃを連結したペプチドを用いてＫＬＨと結合させ免疫を賦活化させた抗原を用いてもよい。
　抗体を産生させる動物も、特に限定されないため、リン酸化されたアミノ酸残基を有するＴＥＲＴのアミノ酸配列を認識する抗体の由来も特に限定されない。
　本発明における抗体は、ＴＥＲＴに由来し、リン酸化されたアミノ酸配列を認識する抗体であり、当該リン酸化はＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性を惹起するリン酸化である。
　本発明における抗体は、リン酸化されているＴＥＲＴを認識し得る。
　本発明における抗体は、具体的には、配列番号１～４で示されるＴＥＲＴに由来するアミノ酸配列を認識する抗体であることが好ましい。また、本発明における抗体は、配列番号５～８で示されるＴＥＲＴに由来するアミノ酸配列を有するペプチドを、ＫＬＨに結合させたペプチドを抗原として得られる抗体でもある。
　本発明における抗体は、ＴＥＲＴに由来し、リン酸化されたアミノ酸配列を認識する抗体であって、配列番号１～４で示されるＴＥＲＴに由来するアミノ酸配列を認識し、各々が、配列番号５～８で示されるＴＥＲＴに由来するアミノ酸配列を有するペプチドを、ＫＬＨに結合させたペプチドを抗原として得られる抗体であってよい。
　なお、本発明における抗体は、配列番号１～４で示されるＴＥＲＴに由来するアミノ酸配列を認識する抗体であれば、配列番号１～４で示されるＴＥＲＴに由来するアミノ酸配列よりも鎖長の長いアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用いて、抗体を得てもよい。
　本発明における抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により、作成することも可能である。また、本発明における抗体については、キメラ抗体であってもよく、ヒト化抗体、ヒト抗体であってよい。
　また、本発明においては、抗体の抗原結合フラグメントをも提供し得る。
　抗原結合フラグメントとしては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｄｉａｂｏｄｙ型、ｓｃＤｂ型、ｔａｎｄｅｍ　ｓｃＦｖ型、ロイシンジッパー型等の二重特異性抗体等が挙げられる。
　本発明においては、ヒトＴＥＲＴにおいて、特定のアミノ酸残基がリン酸化されていると予後不良であることが確認されている。
　したがって、ヒトにおいて、かかるアミノ酸残基がリン酸化されているかを確認することにより、がん治療における予後不良を確認することができる。すなわち、ＴＥＲＴにおける特定のアミノ酸残基におけるリン酸化を、がん治療における予後不良予測因子とすることができる。
　本発明においては、例えば、がん患者より、病変組織を取得し、免疫学的手法により染色して、染色陽性細胞が1視野において、例えば、5%以上、10％以上、20%以上存在していることをもって、がん治療における予後不良であると判断することができる。
　本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＴ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基がリン酸化されている場合に予後が不良であると評価する、がん治療の予後予測方法をも提供する。本発明における予後予測方法は、診断補助方法として用いてもよい。
　本発明のがん治療の予後予測方法においては、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＴ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基がリン酸化されていることを確認するために、本発明のスクリーニング方法においてＴＥＲＴ又はその断片のリン酸化を確認する方法において用いられる方法を利用することができる。
　また、ＴＥＲＴにおいて、Ｔ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基がリン酸化されたＴＥＲＴ又はその断片を検出マーカーとすることもできる。
　本発明においては、ＴＥＲＴのＲｄＲＰ活性が、ＴＥＲＴのリン酸化酵素によるＴＥＲＴのリン酸化に起因することを確認している。
　その過程で得られたＴＥＲＴの変異体である、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＴ２４９が、アラニン又はグルタミン酸に置換されているテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）は、Ｔ２４９Ａ変異体（アラニン変異体）又はＴ２４９Ｅ変異体（グルタミン酸変異体）と表すことができる。
　アラニン変異体は、がん細胞増殖を抑制する作用を有し、グルタミン酸変異体は、がん細胞増殖を亢進する作用を有する。
　アラニン変異体については、がん細胞の増殖に必須の活性（ＲｄＲＰ活性）をドミナントネガティブに抑制する一方、テロメア伸長酵素活性はそのまま維持している。ここで、テロメア伸長酵素は「抗老化に働く」ことはよく知られているため、アラニン変異体は、がん抑制及び抗老化酵素と認識することもできる。
　したがって、本発明により、アラニン変異体は、がん抑制・抗老化作用型ＴＥＲＴとして提供される。
　本発明におけるＴ２４９Ａ変異体（アラニン変異体）又はＴ２４９Ｅ変異体（グルタミン酸変異体）とは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、２４９位スレオニンがアラニン又はグルタミン酸に変異されたペプチドであってもよく、２４９位スレオニンに相当するアミノ酸残基（好ましくは、Ｓ／ＴＰリン酸化モチーフのスレオニン残基）がアラニン又はグルタミン酸に置換されていれば、配列番号１７で表されるアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
　また、本発明におけるＴ２４９Ａ変異体（アラニン変異体）又はＴ２４９Ｅ変異体（グルタミン酸変異体）は、２４９位スレオニンに相当するアミノ酸残基（好ましくは、Ｓ／ＴＰリン酸化モチーフのスレオニン残基）がアラニン又はグルタミン酸に置換されていれば、リン酸化モチーフのスレオニン残基）がアラニン又はグルタミン酸に置換されていれば、配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１又は数十個、好ましくは１又は数個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１又は２個のアミノ酸が付加、置換、又は欠失したアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
　上述の活性を有する限り、Ｔ２４９Ａ変異体（アラニン変異体）又はＴ２４９Ｅ変異体（グルタミン酸変異体）の断片であってもよい。
　また、本発明においては、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＴ２４９がリン酸化されたＴＥＲＴをも提供する。
　Ｔ２４９がリン酸化されたＴＥＲＴは、治療標的として用いることができる。
　本発明におけるＴＥＲＴのＴ２４９がリン酸化されたＴＥＲＴとは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、２４９位スレオニンがリン酸化されたペプチドであってもよく、２４９位スレオニンに相当するアミノ酸残基（好ましくは、Ｓ／ＴＰリン酸化モチーフのスレオニン残基）がリン酸化されていれば、配列番号１７で表されるアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
　また、本発明におけるＴＥＲＴのＴ２４９がリン酸化されたＴＥＲＴは、２４９位スレオニンに相当するアミノ酸残基（好ましくは、Ｓ／ＴＰリン酸化モチーフのスレオニン残基）がアラニン又はグルタミン酸に置換されていれば、リン酸化モチーフのスレオニン残基）がアラニン又はグルタミン酸に置換されていれば、配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１又は数十個、好ましくは１又は数個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１又は２個のアミノ酸が付加、置換、又は欠失したアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
　２４９位スレオニンがリン酸化されていれば、ＴＥＲＴのＴ２４９がリン酸化されたＴＥＲＴの断片であってもよい。
　以下、実施例及び参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
Anti-hTERT pT249抗体の作製
１．ペプチド合成
　下記「リン酸化hTERTの検出」における「（２）免疫沈降」後に、そこで得られたサンプルを用いて、質量分析により解析しリン酸化された2本のペプチドを同定した。同定したペプチドのアミノ酸配列において、リン酸化を受ける可能性のある箇所が4カ所存在したため、当該リン酸化を受ける可能性のあるアミノ酸残基を中心として、下記４つのアミノ酸配列を選択した。pT及びpSは、リン酸化スレオニン及びリン酸化セリンを意味する。
　EPERpTPVGQG（配列番号１）
　VGQGpSWAHPG（配列番号２）
　RHRVpTYVPLL（配列番号３）
　PLLGpSLRTAQ（配列番号４）
　通常の方法により、配列番号５～８のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成した。質量分析にて目的物の分子量を確認し、HPLC精製にて純度>90%まで精製した。
　hTERT T249     CEPERpTPVGQG（配列番号５）
　hTERT S255     CVGQGpSWAHPG（配列番号６）
　hTERT T1088   CRHRVpTYVPLL（配列番号７）
　hTERT S1095   CPLLGpSLRTAQ（配列番号８）
　なお、いずれのオリゴペプチドも、hTERTにおける部分配列を有する。オリゴペプチド有するアミノ酸配列は、いずれも、リン酸化部位と考えられたスレオニン又はセリンにおいてリン酸化されており、かつ、Ｎ末端には、Ｃ（システイン、Cys）を結合させたアミノ酸配列となっている。
２．KLH結合
　KLH 8mgと、架橋剤EMCS 5mgを、アミノ基を介したビスイミドエステル法にて結合後、ゲルろ過精製した。次に、KLH‐EMCS複合体とペプチド4mgをCysのSH基を介して結合し、免疫源を確保した。
３．ウサギ抗血清作製
　抗原感作は、Day0, 14, 28, 49に計4回実施した。リン酸化ペプチド量として、1回100μgを使用した。全工程感作部位は皮内、アジュバントはFCA(Freund complete adjuvant)使用した。Day 42に部分採血し、リン酸化ペプチドに対するELISA測定とウエスタンブロッティングを実施した。
４．特異抗体の精製(Affinity精製)
　リン酸化ペプチド及び、非リン酸化ペプチド4～5mgを使用し、精製カラムを作成した。カラム担体は、CNBr-activated sepharose4Bを使用した。リン酸化ペプチドカラムに抗血清を通した。カラム吸着分画を溶出し、溶出分画を非リン酸化ペプチドカラムに通し、非リン酸化抗体を吸収した。非リン酸化素通り分画を回収し（リン酸化特異抗体）、回収した素通り画分はリン酸化及び、非リン酸化ペプチドでのELISAを実施し反応性を確認し、配列番号１～４のアミノ酸配列を認識する抗テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）抗体を得た。EPERpTPVGQG（配列番号１）のアミノ酸配列を認識する抗ＴＥＲＴ抗体を、Anti-hTERT pT249抗体とした。
リン酸化hTERTの検出（免疫沈降～Westernブロット）
（１）Ｍ期集積細胞の作成
　10% 非働化ウシ胎児血清 （IFS）、Penicillin (100U/mL)及びStreptomycin (100μg/mL)を添加したDMEM培地 （Wako）を通常培地として、前日より培養したHela細胞（ATCC）を10cm dishあたり1ｘ106個播種した。2日間培養した後、通常培地を、通常培地にThymidine (ナカライテスク、final 2.5mM)をさらに添加した培地に交換して培養した。24時間培養した後、細胞をPBS (phosphate buffered saline) 10mLで3回洗浄し、通常培地に交換して培養した。6時間培養した後、通常培地を、通常培地にNocodazole (Sigma、final 0.1μg/mL)がさらに入った培地に交換して培養した。14時間培養した後、細胞を回収した。
（２）免疫沈降
　回収した細胞を冷却したPBSで洗浄後、1ｘ107個を1mL Lysis buffer A (20mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、0.5% Nonidet P-40 (NP-40))で懸濁、10秒間ソニケーション後遠心して上清を回収した。上清に40μL Protein A agarose (Thermo Fisher Scientific、bed volume 20μL)を加え4℃で30分ローテート、プレクリアを行った。遠心後上清を回収し40μL Protein A agarose (bed volume 20μL)と10μg 抗hTERT 抗体 (MBL M216-3)を加え4℃で18時間ローテートし免疫沈降した。免疫沈降後のagaroseは1mL Lysis buffer Aで3回洗浄した。
（３）λ-phophatase処理
　免疫沈降、洗浄後の20μL agaroseに5μL λ-phosphatase (BioAcademia)、5μL 10ｘλ-phosphatase Buffer (500mM Tris-HCl (pH7.6)、1M NaCl、20mM dithiothreitol、1mM EDTA、0.1% Bryj 35)、5μL 20mM MnCl2、15μL H2Oを加え30℃で30分反応させた。結果を図1Ａに示す。
（４）siRNAによる蛋白ノックダウンM期集積細胞の作成方法
　10% IFSを添加したDMEM培地 （Wako）を培地 (8mL)として、HeLa細胞を10cm dishあたり1ｘ106個播種し、16-18時間培養後siRNAをトランスフェクションした。
　具体的には、以下の方法に依った。
　1. Lipofectamine2000 (Invitrogen) 20μLを1mL Opti-MEMに加えた。
　2. siRNA 330pmolを1mL Opti-MEM (Gibco)に加えた。
　3. 1と2を混ぜ室温で20分おき10cm dishに滴下した。
　トランスフェクションから48時間後Nocodazole (final 0.1μg/mL)の入った培地に換え、16～18時間培養後、細胞を回収した。この細胞を用いた結果を図1Ｂ及び図2に示す。
　siRNAとしては、表１に示すものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（５）Westernブロット
　免疫沈降後のagaroseに2XSDS buffer (100mM Tris-HCl(pH6.8)、4%(w/v) SDS、20%(v/v) glycerol、2%(v/v) 2-mercaptoethanol、0.01%(w/v) bromophenol blue) 20μLを加え95℃5分変性した後、SDS PAGEにより分離し、ウエット型トランスファー装置 (GE Healthcare）を用いてニトロセルロースメンブレンに転写した（4℃、18時間）。転写後のメンブレンはブロッキングバッファー (TOYOBO NYPBR01)で室温1時間ブロッキング後、0.1% Tween20を含むトリス塩酸バッファー (TBST)で洗浄し、Anti-hTERT pT249抗体 （1：1000希釈）、室温で1時間反応させ、TBSTで洗浄、さらに抗ウサギIgG-HRP抗体 (GE Helthcare)を室温1時間反応させ、TBSTで洗浄後ECL試薬 (Roche、Lumi Light Plus Wetern Blotting Substrate)で検出した。抗体希釈液は2.5% ウシ血清アルブミン (BSA)を含むTBSTを用いた。結果を図1A、1B及び2Aに示す。
IP-RdRP 活性測定法
　Mol Cell Biol 34: 1576-1593, 2014、Mol Cell Biol 36: 1248-1259, 2016に記載の方法に準じて、行った。結果を図2Bに示す。
hTERT 191-306を用いての試験管内キナーゼアッセイ
（１）hTERT (191-306)の精製
　hTERT[NP_937983 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_937983.2)、あるいはUniprot ID O14746-1 (http://www.uniprot.org/uniprot/O14746)]のTERT191-306アミノ酸部位に対応するcDNAをpCR2.1-TOPO vector (ThermoFisher Scientific)に導入、無細胞系転写翻訳システム[J Biochem. 2017 Nov 1;162(5):357-369]を用いて、タンパク質を発現させた。発現タンパクはN末端にpoly-histidine N11-tagが標識されていることからHisTrap columns (GE Healthcare)を利用しAKTA 10S system (GE Healthcare)にてN11-tagged hTERT (191-306)を精製した。具体的には濃度勾配buffer (50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1M NaCl、10mM imidazole)にて洗浄後、imidazole (from 10 to 500 mM)の濃度勾配を有する溶出buffer (50mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.5M NaCl)で溶出した。Imidazole は透析により除去した。N末端にpoly-histidine N11-tag は人為的に導入されているTEV (Tobacco Etch virus)プロテアーゼ認識部位を利用しTEVプロテアーゼにより除去した。この標品をHiTrap SP column (GE Healthcare)によるイオン交換クロマトグラフィーとHiLoad 16/600 Superdex columns (GE Healthcare)によるゲル濾過により精製した。精製タンパク標品を含むbufferの最終濃度は、25 mMTris-HCl buffer (pH 7.0)、450 mM NaCl及び0.25mM TCEP [Tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride]であった。
（２）試験管内キナーゼアッセイのCDK1に変わる陰性コントロールとして用いたIKK2(2-664)の精製
　IKK2 [Approved HGNC name, IKBKB; HGNC ID, 5960; UniProtKB ID, O14920]の2-664アミノ酸部位に対応するcDNAをpDEST vector (Thermo Fisher Scientific)に導入、Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Thermo Fisher Scientific)を用いてタンパク質を発現させた。Polyhistidineaffinity標識IKK2 (2-664)は、昆虫細胞Sf9 cellsにおいてmultiplicity of infection (MOI) 1.0にてバキュロウイルスを感染させ発現させた。感染後48時間で細胞を回収し PBS洗浄後に液体窒素にて凍結保存後、下記論文に従い精製した。[J Biol Chem. 2013 Aug 2;288(31):22758-67.]
（３）試験管内キナーゼアッセイ
　精製したhTERT (191-306)とCDK1-cyclin B (New England Biolabs)を用いて37℃で2時間キナーゼアッセイを行った。
　反応液 (40μL)の組成は次の通りとした。
　　hTERT 191-306 [0.33μg/μL(25.86μM)] 16μL
　　10X NEBuffer(50mM Tris-HCl (pH7.5)、10mM MgCl2、0.1mM EDTA、2mM DTT、0.01% Brij 35) 4μL
　　CDK1-cyclin B (20 units/μL) 6μL or H2O 6μL
　　H2O 12.5μL
　　125mM ATP(Sigma、adenosine triphosphate) 1.5μL or H2O 1.5μL
　反応後のサンプル10μLに2.5X SDS sample buffer (140mM Tris-HCl（pH 6.8）、5%(w/v) SDS、250mM DTT、15%(v/v) glycerol、0.01% (w/v) bromophenol blue) 10μLを加え95℃に3分置き蛋白を変性させた後、10μLをPhos-tag SDS-PAGE (http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/product/life/phos-tag/pdf/Phos-tag4.pdf)で分離し（hTERTの最終濃度が約0.6 μg/Laneとなるように調整した）、クマシーで染色した。結果を図3に示す。
（４）リン酸化サイトの確認（質量分析）
　図３の第2レーンの星印及び第3レーンの星印を示したバンド部分を切り出しtrypsin (Promega)により37℃で20時間、消化反応させた。反応後のpeptide標品をLC-ESI-MS/MSにより解析した。
（５）Anti-hTERTｐT249によるWestern Blot
　CDK1/CycB1あるいはIKK2_2-664と反応させたhTERT 191-306 5μLをSDS PAGEにより分離した後、ウエット型トランスファー装置を用いてニトロセルロースメンブレンに転写した。転写後のメンブレンは前述の方法でAnti-hTERTｐT249抗体によりリン酸化hTERTを検出した。結果を図3に示す。
Ａ変異体、Ｅ変異体発現細胞の増殖能
　Ａ変異体、Ｅ変異体プラスミドの作成はQuikChange II XL site-directed mutagenesis Kit (Agilent Technologies)を使用し、推奨プロトコールに従い実施した。
　Ａ変異体は、
5’-agccggagcgggcgcccgttggg-3’ （配列番号１３ Forward）
及び
5’-cccaacgggcgcccgctccggct-3’ （配列番号１４ Reverse）
を、Ｅ変異体は、
5’-tgagccggagcgggagcccgttgggcag-3’ （配列番号１５ Forward）
及び
5’-ctgcccaacgggctcccgctccggctca-3’ （配列番号１６ Reverse）
をそれぞれプライマーとし、pBABE-puro-hTERT retroviral vector又はpNK-FLAG-z-hTERT expression vectorを鋳型としてPCRを実施した。PCR産物を制限酵素Dpn Iで37℃1時間処理し、XL-10-Gold ultracompetent cellsに形質転換した。得られたT249A変異体（Ａ変異体）、T249E変異体（E変異体）についてのテロメラーゼ活性及びRdRP活性について試験した結果を図4に示す。
　Saos2、HCC-MT、PEO1及びPEO14各細胞株にレトロウイルスベクター (TaKaRa、Retrovirus Packaging Kit Ampho)により、得られたT249A変異体、T249E変異体を導入した。各導入細胞を24wellプレートに各細胞20000個/well (HCC-MTのみ7000個/well)を播種し細胞数を経時的に測定することにより増殖能を確認した。結果を図5に示す。
　Saos2、HCC-MTの培地としては、10% IFS、Penicillin (100U/mL)及びStreptomycin (100μg/mL)を添加したDMEM培地 （Wako）を用いた。
　PEO1、PEO14の培地としては、10% IFS、Penicillin (100U/mL)、Streptomycin (100μg/mL)及びSodium Pyruvate (2mM)を添加したRPMI-1640培地 （Sigma）を用いた。
肝臓がん、膵臓がん患者検体の免疫染色による臨床情報解析
　Envision+ kits (Dako)を用いて、添付の手順書に従って染色した。ホルマリン固定後パラフィン包埋薄切患者検体を脱パラフィン再親水化処理後、クエン酸バッファー （DAKO、pH6）を用いてオートクレーブ処理 （120℃、５分間）にて抗原賦活処理をした。Kitに添付の、ブロッキングバッファーにて15分間処理後、Anti-hTERT pT249抗体 (1:250)を4℃、8時間反応させ、Kitに添付のDAB+ substrate chromogenで可視化させて鏡検した。200倍拡大での鏡検下で、染色陽性細胞が1視野に10％以上ある検体を「陽性検体」と判定した。結果を図6及び7に示す。
CRISPR-Cas9ゲノム編集技術を用いた、リン酸化不活性型アミノ酸置換変異293T細胞株の作製
　293T細胞株の、内在性のhTERTタンパク質のスレオニン249を、CRISPR-Cas9ゲノム編集技術を用いて、リン酸化不活性型アミノ酸であるアラニンに置換したT249A-CRISPR細胞株を作製した。始めに、ゲノム編集酵素であるCas9を発現するプラスミドベクター (PuroCas9)に、hTERTのスレオニン249近辺を標的とするガイドRNAの配列（AGCCGGAGCGGACGCCCGTTGGG 配列番号２０ 下線を付したACGはスレオニンをコードするコドン）を導入し、PuroCas9-hTERTを作製した。また、スレオニン249をアラニンに置換するため、標的アミノ酸部位 (スレオニンをコードするACGをアラニンをコードするGCCに置換)を含む223塩基のhTERT DNAをドナーベクターに導入した。これら2種のプラスミドベクター (PuroCas9-hTERT及びドナーベクター)を、遺伝子導入試薬FuGene HDを用いて、293T細胞に導入した。コントロール細胞 (Control-CRISPR)は、PuroCas9のみを導入した。PuroCas9はピューロマイシン耐性遺伝子を含むため、導入された細胞はピューロマイシン耐性を持つ。プラスミドベクターを導入した細胞を、ピューロマイシン処理による薬剤選択後、シングルセルを単離した。単離した細胞のゲノムDNAを抽出し、制限酵素による切断及びサンガーシークエンス法により、標的部位の配列置換を確認した。結果を図8及び９に示す。

Claims (9)

  1. 　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化酵素を用いる、ＴＥＲＴのリン酸化阻害剤のスクリーニング方法。
  2. 　リン酸化部位が、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片のＴ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
  3. 　リン酸化部位が、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片のＴ２４９である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
  4. 　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のリン酸化酵素が、サイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）である、請求項１～３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  5. 　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の断片が、Ｔ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  6. 　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＴ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基がリン酸化されている場合に予後が不良であると評価する、がん治療の予後予測方法。
  7. 　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＴ２４９が、アラニン又はグルタミン酸に置換されているテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片。
  8. 　テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片のＴ２４９、Ｓ２５５、Ｔ１０８８及びＳ１０９５のいずれかのアミノ酸残基が、リン酸化されているテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）又はその断片。
  9. 　配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列を認識する抗テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）抗体。
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