KR102268846B1 - Epb41l5 단백질의 에피토프 및 단일클론항체 - Google Patents

Epb41l5 단백질의 에피토프 및 단일클론항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TGFβ/Smad3/EPB41L5 분자 메커니즘에 대한 암 세포에서의 영향을 규명하고, 여기서 EPB41L5의 높은 발현이 암 환자의 전반적인 생존률과 관련이 있음을 밝힌 바, EPB41L5가 암의 잠재적인 예후 지표임을 확인하였다. 따라서 본 발명은 EPB41L5를 항원으로 인식하도록 하는 EPB41L5의 에피토프를 특정하고, 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것으로, 본 발명에서의 항체는 EPB41L5와 관련된 암에 대한 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

EPB41L5 단백질의 에피토프 및 단일클론항체{A Epitope of EPB41L5 and monoclonal antibody}
본 발명은 EPB41L5(Erythrocyte Membrane Protein Band 4.1 Like 5) 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것이다.
암(Cancer)이란 조직을 이루고 있는 세포가 비 정상적으로 무제한 증식하여 종양이 형성되도록 하고, 그에 따라 장기가 정상적인 기능을 수행할 수 없도록 하여 개체의 생명을 위협할 수 있는 매우 치명적인 질환이다. 2017년 한국인 사망원인 1위가 악성 신생물(암)이었으며, 전체사망자 중에서 27.6%가 암으로 인해 사망하였다.
암 질환 중에서 위암은 가장 주요한 사망 원인 중의 하나이다. 특히, 전이성 위암은 전세계적에서 5년 생존률이 30% 미만인 악성 질환으로 알려져 있다. 이러한 전이성 위암의 치료를 위해 새로운 바이오 마커와 관련된 연구들이 진행되어오고 있으나, 그 구체적인 발병기전에 대해서는 명확하게 알려진 바가 없는 실정이다.
현재까지 개발된 표적 치료제는 HER2 표적 치료제, VEGFR2 표적 치료제 등이 있고, 특히 HER2의 경우 Genetech/Roche 사에서 유방암, 난소암 또는 위암의 안 좋은 예후와 관련이 있음을 밝혀, HER2/neu의 세포외 도메인(extracellular domain)에 결합하는 인간화된 단일 클론 항체(Herceptin 또는 Trastuzumab)를 개발한 바 있다. 또한 허셉틴/트라스투주맙(Herceptin/Trastuzumab)은 현재 전세계적으로 판매되는 블록버스터 약으로, 2011년 상반기에만 미국에서 9억 5천만 달러의 판매고를 올렸으나 유방암을 제외한 HER2/neu를 상당량 과발현하는 다른 암들에 대해서는 임상 효과를 나타내지 못할 뿐 아니라 허셉틴/트라스투주맙을 장기 투여한 환자들은 내성을 갖게 된다는 단점이 있다고 알려져 있다.
따라서 암의 성장과 전이와 관련이 있는 생체분자를 규명하고, 이를 표적으로 하여 암의 성장과 전이를 제어할 수 있는 새로운 암 표적 치료의 생물 지표의 발굴에 대한 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 EPB41L5 단백질의 619 내지 624 번째 아미노산 잔기 중에서 선택되는 1 내지 6 mer의 에피토프를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5 단백질을 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산분자; 및 이를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5 단백질의 619 내지 624 번째 아미노산 잔기 중에서 선택되는 1 내지 6 mer의 에피토프; 이를 코딩하는 핵산 분자; 또는 이를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체 또는 이의 단편; 이를 코딩하는 핵산분자; 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EPB41L5의 과발현에 의한 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 정상대조군에 비하여 EPB41L5(Erythrocyte Membrane Protein Band 4.1 Like 5) 단백질의 과발현이 암의 성장과 전이와 관련이 있음을 확인하였고, 이를 표적으로 하여 암의 성장 및 전이를 제어할 수 있는 신규 암 표적 치료 생물 지표를 발굴하고자 예의 노력한 결과, TGFβ-EPB41L5 신호전달기전을 통해 암의 성장 및 전이를 억제하는 EPB41L5 단백질의 에피토프를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5 단백질의 619 내지 624 번째 아미노산 잔기 중에서 선택되는 1 내지 6 mer의 에피토프를 제공한다.
본 발명에서 상기 EPB41L5 단백질은 서열번호 1로 표시될 수 있으며, GenBank No. NM_020909에서 서열정보를 확인할 수 있다.
본 발명에서 상기 EPB41L5(Erythrocyte membrane protein band 4.1 like 5) 단백질은 N-말단에 FREM 도메인과 C-말단에 비상동성 서열을 갖는 Erythrocyte Membrane Protein Band 4.1의 슈퍼패밀리(superfamily)의 NBL4 하위 그룹에 속한다.
본 명세서에서, 용어 "에피토프"라 함은 항체 또는 이의 단편이 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된(localized) 부위를 의미한다. 에피토프는 대체로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면기로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특성 및 특이적 전하 특성을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에서 입체형태적 에피토프에 대한 결합은 손실되지만 비-입체형태적 에피토프에 대해서는 손실되지 않는다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관련되는 아미노산 잔기 (에피토프의 면역우성 성분으로도 칭해짐) 및 결합에 직접 관련되지 않는 기타 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기 (즉, 아미노산 잔기가 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트(footprint) 내에 존재함)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 에피토프는 EPB41L5 단백질의 619, 620, 621, 622, 623 및 624 위치의 아미노산 잔기 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 에피토프는 EPB41L5 단백질의 619 내지 624 번째 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 위치의 아미노산을 포함하는 에피토프는 그 구조를 유지하기 위하여, 백신이나 조성물로 이용될 때 담체와 결합된 형태로 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 담체는 생체 적합하며 본 발명에서 목적하는 효과를 거둘 수 있는 것이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 펩타이드, 혈청 알부민, 면역 글로불린, 헤모시아닌 및 다당체 등에서 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5 단백질을 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 EPB41L5의 619 내지 624 번째 아미노산 잔기 중에서 선택되는 1 내지 6 mer의 에피토프(epitope)에 결합할 수 있다.
상피-중배엽 전이(EMT)는 위암전지의 주요한 원인 중 하나로, 많은 연구 그룹에서 TGFβ의 신호전달기전이 상피-중배엽 전이를 조절하는 것으로 알려진 바 있다. TGFβ 리간드가 세린/트레오닌 키나아제인 TGFβ 수용체 Ⅱ에 의해 TGFβ 수용체 I에 결합하게 되면, TGFβ 수용체 이량체의 활성화에 의해 Smad2/3가 인산화에 의해 활성화되면 co-Smad인 Sma4와 결합하여 핵 내로 이동하여 상피-중배엽 전이 과정과 관련 있는 유전자 PAI-1, ZEB1, Slug를 조절한다. TGF-β1 발현이 위암 환자의 점액, 혈청, 조직에서 높게 나타나며, 높은 TGF-β1 발현이 위암 환자의 낮은 생존률과 관련있다는 일부 연구 보고가 있다.
본 발명에서 oligonucleotide microarray와 Kaplan-Meier 생존분석을 통해 EPB41L5 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준이 높을 때, 암 환자의 생존율이 낮음을 확인하였고, KATOⅢ, MKN28, SNU1, SNU719 네 개의 위암 세포주에서 EPB41L5 mRNA와 단백질 발현은 TGF-β1에 의해 증가되었음을 확인하였으며, TGF-β1에 의해 증가된 EPB41L5 발현은 Smad-의존성 TGFβ 신호 기전에 의해 조절되고 있음을 확인하였다. TGFβ 신호 기전에 의해 증가된 EPB41L5 단백질은 세포부착물질인 p120-catenin과 상호작용하여 암의 전이에 영향을 줄 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 EPB41L5/p120-catenin 복합체 형성될 때 결합되는 아미노산 서열을 에피토프로하여 특이적으로 결합하기 때문에, EPB41L5/p120-catenin 복합체의 형성을 효과적으로 억제함으로써 암 발생, 전이, 성장 등을 매우 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5에 특이적으로 결합하고, EPB41L5와 p120-catenin 간의 상호작용을 차단하는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5 단백질을 항원으로 사용하여 제조된 것이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 가장 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 항원으로 이용한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "에피토프"라 함은 항체 또는 이의 단편이 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된(localized) 부위를 의미한다. 예를 들어, 항원인 폴리펩타이드 중 연속적인 아미노산이 에피토프가 될 수 있으며, 폴리펩타이드에서 3차 구조상 접힘(folding)에 의해 비연속적인 2 또는 그 이상의 부위가 함께 에피토프가 될 수 있다. 에피토프는 항원의 독특한 3차원 구조에서, 연속 또는 비연속의 아미노산을 최소 2개 이상, 최소 3개 이상, 최소 4개 이상, 최소 5개 이상, 최소 6개 이상, 최소 7개 이상, 최소 8개 이상, 최소 9개 이상, 최소 10개 이상, 최소 11개 이상, 최소 12개 이상, 최소 13개 이상, 최소 14개 이상 또는 최소 15개 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 EPB41L5를 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는데, EPB41L5는 상기 619 내지 624 번째 아미노산 잔기 중에서 선택되는 1 내지 6 mer를 에피토프로 하여 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 에피토프는 1 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
주어진 항체가 결합하는 에피토프를 결정하는 방법(예를 들어, 에피토프 맵핑)은 항체에 대한 반응성 테스트를 통한 면역블로팅(immunoblotting) 및 면역침강(immunoprecipitation) 시험 등 다양한 방법이 있다. 에피토프의 3차원 공간 구조를 결정하는 방법은 x-레이 결정학(x-ray crystallography), 2차원 핵자기 공명법(2-dimensional nuclear magnetic resonance) 및 HDX-MS 등 다양한 방법을 이용하여 수행할 수 있다(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 단편이 결합할 수 있는 에피토프는 NMR 분광학, X-ray 회절 결정학, ELISA 분석, HDX-MS(hydrogen/deuterium exchange coupled with mass spectrometry), 어레이 기반 올리고-펩타이드 스캐닝(array-based oligo-peptide scanning assays), 및/또는 돌연변이 유발 맵핑(mutagenesis mapping)을 통해 결정될 수 있다(Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303).
본 명세서에서, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 중 어느 유형의 항체(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY)일 수 있으며, 어느 하위 유형의 항체(예를 들어, 인간에 있어서 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4; 및 마우스에 있어서 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3)일 수 있다. 면역글로불린(예를 들어, IgG1)은 다양한 알로타입(allotype)이 존재할 수 있으며, 본 명세서에서 용어 "항체"는 일반적으로 알려진 아이소타입(isotype) 및 알로타입(allotype)을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 용어 "항체"는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이거나, 이의 하이브리드(hybrid) 유형일 수 있다(예를 들어, IgG2 및 IgG4의 하이브리드).
본 명세서에서 용어 "단일클론항체" 또는 "monoclonal antibody"는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성(single binding specificity) 및 친화도(affinity)를 나타내는 항체를 의미한다.
본 발명의 단일클론항체는 예를 들어 문헌 [Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)]에서 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 생산될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 생산될 수 있다. 단일클론항체는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 단일클론항체는 임의의 적합한 공급원으로부터 입수할 수 있는데 본 발명에서의 단일클론항체는 EPB41L5 항원을 발현하는 세포 또는 EPB41L5 항원을 코딩하는 핵산 형태의 관심있는 항원으로 면역화시킨 마우스로부터 얻은 세포로부터 제조한 하이브리도마로부터 입수할 수 있다. 단일클론항체는 또한 면역화된 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들어 래트, 개, 영장류 등의 항체-발현 세포로부터 유래된 하이브리도마로부터 입수할 수 있다.
본 명세서에서 상기 단일클론항체는 이의 단편을 포함하는 의미로 사용되며, 상기 단편은 바람직하게는 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 의미한다. 상기 단편은 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 파파인(Fab 단편의 생산) 또는 펩신(F(ab')2)과 같은 효소를 이용하여 면역글로불린 분자의 단백질분해성 절단(proteolytic cleavage)을 통하여, Fab 및 F(ab')2 단편을 제조할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "단편"은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFV(single chain Fv), 또는 모노머의 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 sdAb일 수 있으며, 상기 단편에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 또는 이의 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "키메라 항체"는, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
또한, 본 발명에서 상기 "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고, 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명의 단일클론항체 또는 이의 단편은 EPB41L5 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질에 의해 매개되는 암의 성장과 전이와 관련된 생리학적 효과를 억제한다. 구체적으로 암에 있어서 TGF-β1의 증가가 확인되었고, TGF-β1에 의해 EPB41L5 단백질의 발현 수준이 증가되는데, EPB41L5 단백질의 발현 수준은 Smad 의존성 TGFβ 신호기전에 의해 조절된다. 즉 TGF-β1에 의해 증가된 EPB41L5 단백질의 발현 수준은 상피-중배엽 전이 과정을 통해 암의 이동성과 침윤에 영향을 주는 것으로, 상술한 항원 결합 단백질을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 단편을 처리하여 EPB41L5 단백질에 의해 매개되는 세포신호전달 등을 매우 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에서 "성장을 억제한다"는 본 발명의 단일클론항체 또는 이의 단편과 접촉되지 않은 동일한 세포의 성장과 비교하여 단일클론항체 또는 이의 단편과 접촉되었을 때 세포 성장의 임의 측정 가능한 감소(예를 들어 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%의 세포 배양액의 성장 억제를 포함한다)를 포함하도록 의도되며, 상기 세포 성장의 감소는 다양한 메커니즘에 의해 발생할 수 있다.
상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 CDR(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR)을 포함한다. 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 EPB41L5 단백질을 항원으로 하여, 이에 결합하도록 하는 것으로, 본원에서 설명되는 하나 이상의 상보성 결정 구역(CDR)을 포함하는 폴리펩티드이다. 상기 항원 결합 단백질에서 CDR은 적합한 항원 결합 특성이 달성되도록 CDR을 배향시킨다. 본원에서 제공되는 항원 결합 단백질은 EPB41L5와 p120-catenin 상호작용을 저해하거나 차단하거나 감소시키거나 조정할 수 있다. 즉 이를 통해 대상 내에 존재하는 EPB41L5/p120-catenin 복합체 형성을 저해함으로써 TGF-β1에 의해 매개되는 암의 전이, 성장을 억제할 수 있다.
본 발명에서 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은,
서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR1; 서열번호 7로 표시되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 표시되는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR3;을 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은,
서열번호 12로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 가변영역;을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
VH 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 CDR은 중쇄(heavy chain)를 형성하기 위하여 불변 도메인에 연결될 수 있다. 또한, VL 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 CDR은 경쇄(light chain)를 형성하기 위하여 불변 도메인에 연결될 수 있다. 전장(full length) 중쇄 및 전장 경쇄가 결합하여 전장 항체를 구성한다.
본 발명에서 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 앞서 설명한 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5 단백질의 619 내지 624 번째 아미노산 잔기 중에서 선택되는 1 내지 6 mer의 에피토프에 결합하는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5에 특이적으로 결합함으로써 EPB41L5와 p120-catenin 간의 상호작용을 차단하는 효과를 나타낸다.
본 발명에서 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 치료 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 EPB41L5 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제하거나 저해하거나 조정할 수 있고, EPB41L5 단백질에 특이적으로 결합하여, 상기 EPB41L5 단백질과 결합 가능한 단백질, 예를 들면 TGF-β1과의 경쟁적 결합을 통해 실질적으로 EPB41L5 단백질에 의해 유도되는 세포신호전달 등을 억제함으로써 치료 용도로 매우 적절하게 사용될 수 있다.
면역글로불린 사슬의 가변 구역은 일반적으로 가변 구역은 일반적으로 3개의 초가변 구역(보다 종종 "상보성 결정 구역", 즉 CDR로 불림)에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 구역 (FR)을 포함하는 동일한 전체 구조를 보인다. 상기 언급된 각각의 중쇄/경쇄쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 대개 프레임워크 구역에 의해 정렬되어, 표적 단백질 (예를 들어, PCSK9) 상의 특이적 에피토프와 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. N-말단으로부터 C-말단으로, 천연 발생 경쇄 및 중쇄 가변 구역은 모두 일반적으로 다음 순서의 이들 요소와 일치한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 각각의 이들 도메인 내의 위치를 점령하는 아미노산에 숫자를 배정하기 위한 넘버링 시스템이 고안되었다. 상기 넘버링 시스템은 문헌 ([Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD)], 또는 [Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196:901-917]; [Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883])에 정의되어 있다.
다양한 중쇄 및 경쇄 가변 구역이 본원을 통해 제공될 수 있으며, 앞서 설명한 바와 같이 각각의 이들 가변 구역은 상기 중쇄 및 경쇄 불변 구역에 부착되어 각각 완전한 항체 중쇄 및 경쇄를 형성할 수 있다. 또한 각각의 형성된 중쇄 및 경쇄 서열은 조합되어 완전한 항체 구조를 형성할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 EPB41L5 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 트성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면 항체를 이루는 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치호나체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글라이신 및 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 수행할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York (1979)). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Gln/Glu 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 결합 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명에서 용어 "실질적인 동일성"이란, 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 병렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 병렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio.48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 온라인(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ blast_help.html)을 통해 확인할 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자, 바람직하게 상기 항체는, 항체를 생산하는 통상의 방법에 의해 생성될 수 있지만, 친화도 성숙(Affinity maturation)에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서 상기 "친화도 성숙(Affinity maturation)"은, 활성화된 B 세포가 면역 반응 과정에서 항원에 대한 친화도가 증가된 항체를 생산하는 과정을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 친화도 성숙은 자연에서 일어나는 과정과 동일하게, 돌연변이와 선택의 원리에 기초하여 친화도 성숙으로 인해 생성된 항체 또는 항체 단편을 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단일클론항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산분자; 상기 핵산분자를 포함하는 벡터; 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 상기 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. "단리된 핵산"은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 핵산분자를 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 명세서에서 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
본 발명의 숙주세포는 바람직하게는 세균(bacteria)세포, CHO 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, BHK-21 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5 단백질의 619 내지 624 번째 아미노산 잔기 중에서 선택되는 1 내지 6 mer의 에피토프; 이를 코딩하는 핵산분자; 또는 이를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 백신 조성물에서, EPB41L5, 에피토프, 핵산분자, 벡터와 관련된 내용은 앞서 기재한 바와 동일하여 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.
상기 백신은 생백신, 약독화 백신 또는 사백신일 수 있으며, 백신을 사료 또는 사료 첨가제로도 사용할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 능동 면역을 통하여 EPB41L5에 대하여 면역반응 뿐만 아니라 전신면역반응을 유도할 수 있어, 암을 예방 또는 치료할 수 있고, 능동 면역은 병원체가 침입하였을 때 생체 스스로가 자기 몸속에 항체가 생성되게 하여 면역되는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하여 암의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 암은 EPB41L5 유전자 및 이의 단백질 발현 수준을 측정한 경우 EPB41L5 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 과발현된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "과발현"은 적합한 발현 분석법을 통해 EPB41L5 발현 수준을 측정한 경우에 있어서, 비교 대상 세포(예컨대, 해당 기관인 정상 세포)과 비교하여 EPB41L5 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준이 1.1~2배 이상 증가되어 있는 것을 의미한다.본 발명의 암의 종류는 제한되지 않으며, 백혈병(leukemias) 및 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 비림프구 백혈병(acute nonlymphocytic leukemias), 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 호지킨 병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas) 및 다발 골수종(multiple myeloma) 등과 같은 림프종(lymphomas), 뇌종양(brain tumors), 교모세포종(glioblastoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 횡문근육종 (Rhabdomyosarcoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 윌름즈종양(Wilms Tumor), 골종양(bone tumors) 및 연부조직육종(soft-tissue sarcomas) 등과 같은 소아 고형 종양(childhood solid tumors), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 요로암(urinary cancers), 자궁암(uterine cancers), 구강암(oral cancers), 췌장암(pancreatic cancer), 흑색종(melanoma) 및 기타 피부암(skin cancers), 위암(stomach cancer), 난소암(ovarian cancer), 뇌종양(brain tumors), 간암(liver cancer), 후두암(laryngeal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 식도암(esophageal cancer) 및 고환암(testicular cancer) 등과 같은 성인들의 통상의 고형 종양(common solid tumors)들을 포함하여 다수의 암들을 치료하도록 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 암은 암 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 상기 "암 줄기세포"란, 줄기세포 특유의 능력인 자가재생이나 분화능력을 가지고 있는 포괄적인 의미의 암세포를 의미한다. 종양 내 존재하는 것으로 알려져 있으며 정상 줄기세포의 유전적인 정보의 비정상적인 전이로 인해 발생하는 것으로 생각되고 있다. 암줄기세포는 그들이 생존하기 위한 미세환경, 니쉬(niche)의 존재로 인해 유지, 증식되며 주변에 존재하는 정상 세포, 면역관련 세포 또는 분화된 암세포가 이들 특성 유지와 증식에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 상기 암 줄기세포는 정상적인 종양의 생장 조건(상기 "정상적인 종양의 생장 조건"이란 세포 성장에 필요한 영양분(포도당)이 충분하고 종양미세환경의 생장 여건이 풍족하여 세포 스트레스가 없는 상태를 지칭한다.)에서 일반적인 암세포와 상이하게 느린 속도로 증식하거나 휴지기(dormant state) 상태를 유지하여 항암제에 대한 저항성을 가지고 있을 수 있으며, 예를 들어, 전사조절인자의 발현이 정상적인 종양세포와 달리 통제되어 주요 대사조절물질의 기능이 일반 암세포와 비교하여 상이할 수 있다. 이러한 상이한 대사조절 능력과 이에 기전적으로 연계된 세포신호전달계의 조절을 통해 영양 결핍 상태에서 세포 사멸(apoptosis)에 대한 저항성을 획득하고 침윤 및/또는 전이능이 있는 세포를 포괄적으로 지칭한다. 그러나 일반적인 암 세포로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단일클론항체 또는 이의 단편; 이를 코딩하는 핵산분자; 상기 핵산분자를 포함하는 벡터; 또는 EPB41L5 유전자의 발현을 억제하는 억제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료; 또는 암의 전이 억제용 약제학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물에서, 항체 또는 이의 단편, 핵산 분자, 암, 암 줄기세포 등과 관련된 내용은 상기 에피토프, 단일클론항체 또는 이의 단편 등에 기재한 바와 동일하여 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 항체 또는 이의 단편; 이를 코딩하는 핵산분자; 상기 핵산분자를 포함하는 벡터; 또는 EPB41L5 유전자의 발현을 억제하는 억제제; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약제학적 조성물의 가장 큰 특징은 EPB41L5 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질을 표적으로 하여, 상기 EPB41L5 유전자의 발현 수준 또는 상기 EPB41L5 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여, 암을 치료하거나 또는 전이를 억제시킨다는 것이다.
본 발명의 상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA(small interference RNA)이다. 상기 억제제는 EPB41L5 유전자 발현을 억제하는 것으로, 상기 siRNA는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 siRNA 또는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 siRNA일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 상기 암의 예방 또는 치료방법에서, 약제학적 조성물과 관련된 내용은 상기 약제학적 조성물에 기재한 바와 동일하여 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 상기 “예방”은 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 암에 기인한 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시킬 수 있는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 “치료”는 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 암에 기인한 증상이 호전될 수 있도록 하거나, 이롭게 될 수 있도록 하는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, EPB41L5의 과발현에 의한 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 방법은 (a) 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계; (b) 상기 단일클론항체 또는 이의 단편을 상기 샘플에 처리하는 단계; 및 (c) 상기 피검자의 샘플 중에 포함된 EPB41L5의 발현양이 정상군 샘플 중에 포함된 EPB41L5의 발현양 보다 높은지 여부를 확인하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 상기 정보를 제공하는 방법에서, EPB41L5 과발현에 의한 질환, 암, 암 줄기세포, 단일클론항체 등에 대한 내용은 앞서 기재한 바와 동일하여 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 단일클론항체 또는 이의 단편을 처리하는 단계를 포함하는, 샘플 중에 포함된 EPB41L5의 정량 방법을 제공한다.
본 발명의 단일클론항체 또는 이의 단편은 EPB41L5에 특이적으로 결합하기 때문에 이를 이용하면 샘플 중에 포함된 EPB41L5의 양을 정확하게 측정 가능하다.
본 발명의 상기 정량 방법에서, EPB41L5 과발현에 의한 질환, 암, 암 줄기세포, 단일클론항체 등에 대한 내용은 앞서 기재한 바와 동일하여 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단일클론항체 또는 이의 단편을 포함하는 EPB41L5 정량 키트를 제공한다.
본 발명의 정량 키트는 항원항체 결합반응을 통하여 상기 항체에 대한 항원을 분석함으로써 EPB41L5 양을 정량할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글라스(Slide glass)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 사용될 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
상기 2차 항체는 발색반응을 하는 통상의 발색제로 표지되는 것이 바람직하며, HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(Coloid gold), FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(Fluorescein) 및 색소(Dye)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표지체가 사용될 수 있다. 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(ophenylenediamine)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
[서열목록]
서열번호 1: EPB41L5 단백질
MLSFFRRTLG RRSMRKHAEK ERLREAQRAA THIPAAGDSK SIITCRVSLL DGTDVSVDLP 60
KKAKGQELFD QIMYHLDLIE SDYFGLRFMD SAQVAHWLDG TKSIKKQVKI GSPYCLHLRV 120
KFYSSEPNNL REELTRYLFV LQLKQDILSG KLDCPFDTAV QLAAYNLQAE LGDYDLAEHS 180
PELVSEFRFV PIQTEEMELA IFEKWKEYRG QTPAQAETNY LNKAKWLEMY GVDMHVVKAR 240
DGNDYSLGLT PTGVLVFEGD TKIGLFFWPK ITRLDFKKNK LTLVVVEDDD QGKEQEHTFV 300
FRLDHPKACK HLWKCAVEHH AFFRLRGPVQ KSSHRSGFIR LGSRFRYSGK TEYQTTKTNK 360
ARRSTSFERR PSKRYSRRTL QMKACATKPE ELSVHNNVST QSNGSQQAWG MRSALPVSPS 420
ISSAPVPVEI ENLPQSPGTD QHDRKCIPLN IDLLNSPDLL EATIGDVIGA SDTMETSQAL 480
NDVNVATRLP GLGEPEVEYE TLKDTSEKLK QLEMENSPLL SPRSNIDVNI NSQEEVVKLT 540
EKCLNNVIES PGLNVMRVPP DFKSNILKAQ VEAVHKVTKE DSLLSHKNAN VQDAATNSAV 600
LNENNVPLPK ESLETLMLIT PADSGSVLKE ATDELDALLA SLTENLIDHT VAPQVSSTSM 660
ITPRWIVPQS GAMSNGLAGC EMLLTGKEGH GNKDGISLIS PPAPFLVDAV TSSGPILAEE 720
AVLKQKCLLT TEL
서열번호 2: EPB41L5 epitope
Ile Thr Pro Ala Asp Ser
서열번호 3: Human EPB41L5 antigen 386 to 637th amino acid residue
ERRPSKRYSR RTLQMKACAT KPEELSVHNN VSTQSNGSQQ AWGMRSALPV SPSISSAPVP 60
VEIENLPQSP GTDQHDRKCI PLNIDLLNSP DLLEATIGDV IGASDTMETS QALNDVNVAT 120
RLPGLGEPEV EYETLKDTSE KLKQLEMENS PLLSPRSNID VNINSQEEVV KLTEKCLNNV 180
IESPGLNVMR VPPDFKSNIL KAQVEAVHKV TKEDSLLSHK NANVQDAATN SAVLNENNVP 240
LPKESLETLM LITPADSGSV LKEATDELDA
서열번호 4: EPB41L5 siRNA (EPB41L5 siRNA#1)
gcaauuggca gcuuauaauu u
서열번호 5: EPB41L5 siRNA (EPB41L5 siRNA#2)
uucagauucg ugccuauuca guu
서열번호 6: Heavy chain CDR1
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
서열번호 7: Heavy chain CDR2
Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp
서열번호 8: Heavy chain CDR3
Thr Arg Gly Gly Lys Leu Pro Phe Ala Met Asp Tyr
서열번호 9: Light chain CDR1
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
서열번호 10: Light chain CDR2
Lys Val Ser
서열번호 11: Light chain CDR3
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
서열번호 12: Heavy chain_variable region
QVQLKESGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNSDTSYNQKFKDKAKLTAVTSTSTAYMELSSLTDEASAVYYCTRGGKLPFAMDYWGQGTSVTVSS
서열번호 13: Light chain_variable region
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASMSCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 EPB41L5를 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 단편을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명은 EPB41L5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체발굴에 활용할 수 있으며, 이 방법을 통해 발굴한 항체는 EPB41L5의 신호전달과정을 억제하는 기능을 보이며 이 기능을 이용하여 EPB41L5가 관여하는 암 특히 위암에 대한 백신 또는 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 위암 환자 표본으로부터 마이크로어레이 분석을 수행한 결과로, EPB41L5 발현 수준이 높으면 위암 환자의 예후가 좋지 않음을 확인하였다. 도 1a는 림프절 전이가 없는 위암 환자로부터 올리고뉴클레이타이드 마이크로어레이 분석을 수행한 결과이다. 위암 환자는 유전자 발현 양상(EPB41L5 발현 중간 값 기준)에 따라 두 그룹으로 분류하였다. 도 1b는 위암 환자의 두 그룹에 대한 10년 동안의 생존룰을 분석한 결과 그래프이다. 도 1c는 위암 환자 두 그룹에 대한 Kaplan Meier 플러터 분석을 실시한 결과이다.
도 2는 EPB41L5 및 간엽(mesenchymal) 유전자 발현이 TGFβ 신호와 어떠한 관련성을 가지는지 분석하기 위해 수행한 다양한 실험데이터로, 도 2a는 다양한 위암세포들을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 2b는 24시간 동안 TGF-β1(10 ng/ml)을 처리한 위암 세포 및 처리하지 않은 위암 세포들에 대하여 실시간 qPCR을 수행함으로써, EPB41L5 유전자의 발현 수준을 분석한 결과 그래프이다. 이때, control는 TGF-β1을 처리하지 않은 위암세포에서 EPB41L5 mRNA 발현을 나타낸 것이고, TGF-β1은 TGF-β1을 처리한 위암세포에서 EPB41L5 mRNA 발현을 나타낸 것이다.
도 2c는 24시간 동안 TGF-β1(10 ng/ml)을 처리한 위암 세포 및 처리하지 않은 위암 세포들에 대하여 웨스턴 블롯을 수행하여, EMT 관련 유전자(EPB41L5, p-Smad2, Smad2, p-Smad3, Smad3, PAI-1, β-actin) 발현정도를 분석한 결과이다.
도 2d는 24시간 동안 TGF-β1(10 ng/ml)을 처리한 NCI-N87 세포와 KATOⅢ 세포 및 처리하지 않은 NCI-N87 세포와 KATOⅢ 세포(control)로부터 내인성 EPB41L5 및 E-cadherin 발현 수준을 분석한 결과이다. 이때 녹색은 EPB41L5, 빨간색은 E-카데린(E-cadherin), 파란색은 Hochest 33258을 나타내며, 스케일 막대는 20 ㎛를 의미한다.
도 2e는 TGF-β1 처리하거나 처리하지 않은 KATOⅢ 및 SNU719 세포로부터 세포 형태를 촬영한 사진이다. 도 2e를 통해 TGF-β1의 존재 유무에 따른 세포 형태가 관찰되었다. 흰색 화살표는 간엽세포로 형질전환된 세포를 나타내는 것으로, 노출된 KATOⅢ 및 SNU719 세포. 스케일 바는 20 μM을 나타낸다.
도 3은 Smad에 의존적인 TGFβ 신호전달이 EPB41L5 발현을 조절할 수 있음을 확인한 실험결과로, 도 3a는 Smad4의 발현이 결핍된 MKN45 세포 및 NCI-N87 세포에 TGF-β1을 처리하거나 처리하지 않은 뒤에 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 3b는 면역형광 염색 분석을 통해 TGF-β1로 처리하거나, 처리하지 않은 NCI-N87 세포로부터 내인성 EPB41L5 및 E-카데린 발현 수준을 분석한 결과이다. 이때 녹색은 EPB41L5, 빨간색은 E-카데린이며, 스케일 막대는 20 ㎛를 의미한다.
도 3c는 TGF-β1 또는 siSMAD4 #1 또는 #2로 처리하거나, 처리하지 않은 KATOⅢ 세포로부터 Smad4, EPB41L5, Slug, PAI-1의 mRNA fold induction을 분석하여 나타낸 그래프이다. 실험 결과는 평균 ± s.e.m로 표기하였고, 스케일 막대는 20 μM이다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 3d는 TGF-β1(10 ng/ml) 또는 siSmad4 #1, #2를 처리한 KATOⅢ 세포 및 처리하지 않은 KATOⅢ 세포들에 대하여 웨스턴 블롯을 수행하여, EMT 관련 유전자(EPB41L5, p-Smad4, αPAI-1, αSlug, α-tubulin) 발현정도를 분석한 결과이다.
도 4는 아무것도 처리하지 않은 KATOⅢ 세포, TGF-β1만 처리한 KATOⅢ 세포, TGF-β1을 처리한 후 TGFβ 억제제(LY2157299)를 처리한 KATOⅢ 세포를 준비하고, 이를 내인성 EPB41L5 및 E-카데린 발현을 분석하기 위해 면역형광 염색으로 분석한 결과이다. 녹색은 EPB41L5, 빨간색은 E-카데린, 파란색은 Hochest 33258이고, 스케일 막대는 20 ㎛이다.
도 5a은 TGF-β1의 처리에 따른 EPB41L5에 의해 위암 세포의 이동성이 조절되는 것을 확인한 것으로, TGF-β1의 첨가유무에 따른 NC siRNA 형질감염된 KATOⅢ 세포, EPB41L5 siRNA#1, EPB41L5 siRNA#2로 형질감염된 KATOⅢ 세포에서의 실시간 qPCR 결과이다.
도 5b는 TGF-β1의 첨가유무에 따른 NC siRNA 형질감염된 KATOⅢ 세포, EPB41L5 siRNA#1, EPB41L5 siRNA#2로 형질감염된 KATOⅢ 세포에서의 웨스턴 블랏 분석결과이다.
도 5c는 TGF-β1의 첨가유무에 따른 NC siRNA 형질감염된 KATOⅢ 세포, EPB41L5 siRNA#1, EPB41L5 siRNA#2로 형질감염된 KATOⅢ 세포와 SNU719 세포의 형태학적 변화를 나타낸 결과로, 흰색 화살표는 중간엽 세포로 변형된 세포를 나타내며, 스케일 막대는 20 μM이다.
도 5d는 TGF-β1의 첨가유무에 따른 NC siRNA 형질감염된 KATOⅢ 세포, EPB41L5 siRNA#1, EPB41L5 siRNA#2로 형질감염된 KATOⅢ 세포에 대한 시험관 내 이동 및 침윤 분석결과 이미지이다. 스케일 막대는 20 μM이다.
도 5e는 TGF-β1의 첨가유무에 따른 NC(negative control) siRNA 형질감염된 KATOⅢ 세포, EPB41L5 siRNA#1 또는 EPB41L5 siRNA#2로 형질감염된 KATOⅢ 세포에 대한 시험관 내 이동 및 침윤 분석 결과이다. 실험 결과는 평균 ± s.e.m로 표기하였고, * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 6은 항-EPB41L5 단일클론항체의 특이성에 관한 것으로, 도 6a는 MKN28 세포를 Flag-EPB41L5 구조물로 형질감염시킨 후, 이를 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이고, 도 6b는 MKN28 세포를 EPB41L5 siRNA(#1 또는 #2)로 형질감염시킨 후, 이를 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다.
도 6c는 EPB41L5 siRNA로 형질감염된 MKN28 세포(EPB41L5 siRNA)를 면역형광염색으로 분석한 결과이다. 이때, 녹색은 EPB41L5을 나타낸다.
도 6d는 EPB41L5 도메인 구조를 나타낸 개략도이다.
도 6e는 EPB41L5의 FL(전장), EPB41L5의 FERM 및 EPB41L5의 C-말단으로 형질감염된 293T 세포에 대한 웨스턴 분석결과이다.
도 6f는 EPB41L5의 C-말단에서 5개의 아미노산 잔기가 연속적으로 결실된 플라스미드(1-633, 1-628, 1-623, 1-618, 1-613)로 형질감염된 293T 세포의 전체 용해물을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다.
도 6g는 EPB41L5의 FL(전장)과 EPB41L5의 △ 619-624의 플라스미드로 형질감염된 293T 세포의 전체 용해물을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다.
도 6h는 EPB41L5의 FL(전장), EPB41L5의 FERM, EPB41L5의C-term 및 EPB41L5의 △ 619-624 중에서 선택되는 어느 하나와 EPB41L5 siRNA이 공-형질감염된 MKN28 세포를 각각 제조하고, 이들에 대하여 면역형광염색으로 분석한 결과이다. 이때, 면역형광염색은 항-EPB41L5 mAb 및 항-Flag 항체를 사용하여 분석하였다. 녹색은 EPB41L5, 빨간색은 Flag tag, 파란색은 Hochest이고, 스케일 바는 20 μM이다.
도 7은 TGF-β1에 의해 증가된 위암 세포의 침윤과 전이를 항-EPB41L5 단일클론항체에 의해 억제되고 있음을 확인한 것으로, TGF-β1을 처리유무에 따른 KATOⅢ 세포에 항-EPB41L5 mAb를 농도별로 처리하였을 때, 이의 세포 이동에 대한 이미지(a)와 분석 결과 그래프(b)이다. 실험 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표기하였고, 스케일 막대는 20 ㎛이다. ** P <0.01 및 *** P <0.001.
도 8은 본 발명에 따른 단일클론항체와 다른 에피토프를 인지하는 항체간의 TGF-β1에 의해 증가된 위암 세포의 침윤과 전이를 항-EPB41L5 단일클론항체에 의해 억제되는 정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 EPB41L5과 위암 세포의 폐 전이와의 관련성을 확인하기 위한 것으로, 도 9a는 EPB41L5 과발현된 KATOⅢ 세포와 대조군(vehicle)에 대한 시험관 내 이동과 침윤 분석을 수행한 결과이다. 이때, 1% FBS를 화학유인물질로 사용하였다.
도 9b는 EPB41L5 과발현된 KATOⅢ 세포와 대조군(vehicle)에 대한 시험관 내 이동과 침윤 분석을 수행한 결과를 정량화한 것으로, 각 군에서 15개의 세포를 무작위로 선택하여 Fusion Capt 고급 소프트웨어를 통해 셀 계수한 것이다. 실험 데이터는 평균 ± s.e.m로 표기하였다.
도 9c는 EPB41L5 과발현 KATOⅢ 세포(GFP 표지)(EPB41L5(GFP))를 누드 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하고(각 그룹당 10 마리), 이에 대한 폐 전이 추후를 IVIS 광학 영상 시스템으로 분석한 것이다. 도 9d는 도 9c의 영상으로부터 측정한 강도를 정량한 것으로, ROI tool을 사용하였다. 실험 데이터는 평균 복사 효율 ± s.e.m로 표기하였다. * P <0.05 및 ** P <0.01.
도 10a는 EPB41L5 과발현된 KATOⅢ 세포를 누드 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입하고, 2일 간격으로 2주동안 항-EPB41L5 단일클론항체를 5 ㎎/㎏씩 주입한(EPB41L5+mAb)군을 제조하기 위한 다이아그램이다.
도 10b는 대조군(Vehicle)과 EPB41L5 과발현된 KATOⅢ 세포를 누드 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입한(EPB41L5)군, EPB41L5 과발현된 KATO² 세포를 누드 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입하고, 2일 간격으로 2주동안 항-EPB41L5 단일클론항체를 5 ㎎/㎏씩 주입한(EPB41L5+mAb)군에 대한 IVIS 광학 영상 시스템으로 분석결과이다.
도 10c는 도 9b의 영상으로부터 ROI 도구를 통해 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 실험 데이터는 평균 복사 효율 ± s.e.m로 표기하였다. ** P <0.01.
도 11은 EPB41L5 항체를 이용하여 위암, 폐암, 유방암 세포에서 EBP41L5 단백질 발현과 항체 기능을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다.
도 12는 위암, 폐암. 유방암 세포주에 각각 농도별 EBP41L5 항체를 처리하여 세포 생존률을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험방법
1. 환자표본
oligonucelotide microarray와 생존율 분석을 위해 위암 환자 표본은 임상 시험 센터 세브란스 병원(IRB No : 4-2016-0013)로부터 제공받아 진행하였다.
2. 세포 배양 및 시약
인간 위암 세포주인 AGS, NCI-N87, KATO², SK-GT-4, MKN1, MKN28, MKN45, SNU1, SNU5, SNU16, SNU216, SNU484, SNU638, SNU668 및 SNU719는 연세대학교 정재호 교수님 연구실(서울, 한국)로부터 제공받아 사용하였다.
모든 위암 세포는 5% CO2, 37 ℃에서 10% FBS와 1% 항생제/항균제 용액(코닝, Manassas, VA, USA)이 첨가된 RPMI-1640 배지로 배양하였다. 293FT 세포는 DMEM에서 배양하였다. TGF-β1은 Prospec(East Brunswick, NJ, USA)로부터 구입하여 사용하였고, LY2157299는 Selleckchem(Houston, TX, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
3. 플라스미드(plasmid)
전체 길이, FERM 도메인, C-말단, △ 619-624 및 순차적으로 제거된 C 말단의 5 개 아미노산을 코딩하는 EPB41L5 관련 DNA 구조물을 PCR에 의해 생성하고 pSG5-KF2M1 플래그(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 복제하였다. 모든 플라스미드 구조물은 DNA 시퀀싱를 통해 확인하였다.
4. siRNA 형질감염(transfection)
제조사의 절차에 따라 Lipofectamine RNAiMAX(Thermo Fisher Scientific, Rockfod, IL, USA)를 사용하여 세포에 siRNA를 형질감염시켰다. 사용된 siRNA는 Genolution(Seoul, Korea)에서 합성된 것으로, EPB41L5-1(EPB41L5 siRNA#1; siEPB41L5#1)(5'- GC AAUUGGCAGCUUAUAAUUU -3'), EPB41L5-2(EPB41L5 siRNA#2; siEPB41L5#2)(5'- UUCAGAUUC GUGCCUAUUCAGUU -3'), Smad4-1 5'-GCUACUUACCAUCAU AACAUU -3 ') 및 Smad4-2 (5'-GUUCCAUUGCUUACUUUUUUUUU-3')이다.
5. 단일클론항체(Monoclonal antibody)_항-EPB41L5 mAb
단일클론항체는 인간 EPB41L5 항원 386 내지 637번째 아미노산 잔기(서열번호 3)를 마우스에 면역처리하여 제조되었고, 이는 ATgen(성남, 대한민국)에 의뢰하여 획득하였다.
1) 마우스의 면역화 및 하이브리도마 세포 제작
단일클론항체는 인간 EPB41L5 항원 386 내지 637번째 아미노산 잔기(서열번호 3)을 이용하여 제조되었다. 효율적인 항체의 제조를 위하여 서열번호 3을 항체 제작 타겟 펩타이드로 선택하였다.
상기 항체 제작 타겟 펩타이드(서열번호 3)을 마우스에 주사한 후, 항원에 대한 항체를 생산하는 세포를 생성하고, 마우스의 비장으로부터 얻은 항체생산세포(비 세포, B lymphocyte)를 골수종 세포 (Myeloma)와 융합하여 하이브리도마 세포를 획득하였다. 하이브리도마 세포만이 생존할 수 있는 HAT 배지에서 배양한 후, 항체의 활성을 ELISA 실험을 통해 확인하였다.
2) 선별 및 확보
상기 하이브리도마 세포들 중에서 EPB41L5를 특이적으로 인식하는 단일클론 하이브리도마 세포를 선정한 후, 쥐의 복강 내에 상기 선정된 단일클론 하이브리도마 세포를 주입한 후, 복수 (ascites)로부터 획득하였다. 복수에서 회수한 본 발명의 단일클론항체는 단백질 A와 단백질 G 컬럼 등의 사용에 의하여 정제하였다.
이후 상기 항체는 EPB41L5 구조물과 siRNA를 사용하여 웨스턴 블랏과 면역 형광법으로 EPB41L5를 특이적으로 인식하는 단일클론항체(EPB41L5 mAb)를 선별 및 확인하였다.
6. EPB41L5 과발현 세포주(EPB41L5 overexpressing stable cell lines) 생성
EPB41L5 DNA를 pCDH-CMV-MCS-EF1-puro 벡터(Addgene, Cambridge, MA, USA)에 클로닝 하였다. 렌티 바이러스 입자를 생성하기 위해, 패키징 플라스미드 pRSV-Rev 및 pMD2.G를 293FT 세포에서 pCDH-EPB41L5 또는 pLECE3-GFP와 함께 형질감염시켰다. 48 시간 배양한 후, 상등액을 수집하고 0.45 μM 기공 필터로 여과하였다. KATO² 세포를 렌티 바이러스로 감염시킨 후 1 ㎍/㎖ 퓨로마이신(Sigma-Aldrich)으로 선별하였다. 선별된 안정화 EPB41L5 과발현 세포주를 Aria II 유동 세포 계측기(BD Biosciences, Sparks, MD, USA)로 GFP로 분류하였다.
7. 웨스턴 블랏 분석
세포를 용해 완충액(20 mM Tric-Cl, 150mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1.5 % MgCl2, 1mM EDTA, 1mM Na2VO4, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF) 및 프로테아제 억제제 칵테일, pH 7.5 )으로 용해시켰다. 용해물을 간단히 볼텍싱하고, 4 ℃에서 13,000 rpm으로 20 분간 원심분리하여 상등액을 취해 새로운 튜브로 옮겼다. 단백질 농도는 단백질 분석 시약(Thermo Fisher Scientific)으로 660 nm에서 측정하였다. 동일한 농도의 단백질 시료를 준비하고, 각 시료를 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 다음 니트로 셀룰로오스 전달막(Whatman, Dassel, Germany)으로 옮겼다. 0.1%(v/v) Tween 20(Sigma-Aldrich)과 5%(w/v) 무지방 DifcoTM 탈지유(BD Biosciences)를 함유하는 트리스 완충액(pH 7.4)에서 막을 블로킹하고, 1차 항체로 표지(probe)하였다. 항체로는 EPB41L5(ATgen, 한국 성남), Flag-tag, β-actin(Sigma-Aldrich), α-tubulin(Abcam, Cambridge, 영국), TβRI, TβRII, Smad2, Smad3, Smad4, p-Smad2, p-Smad3, 슬러그, ZEB1(Cell signaling, Danvers, MA, USA) 및 PAI-1(Santa Cruz, Dallas, TX, USA)을 사용하였고, 이들의 신호는 제조자의 프로토콜에 따라 기질(Thermo Fisher Scientific)을 통해 확인하였다.
*8. RNA 분리 및 실시간 정량 PCR(qPCR)
TRIzol 시약(Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan)을 사용하여 총 RNA를 추출하고, 제조사의 프로토콜을 따라 PrimeScript Reverse Transcriptase(Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan)와 oligo(dT)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. SYBR Green Master(Roche, Basel, Switzerland)와 ABI Prism 7700 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 정량적 PCR(quantitative PCR)을 수행 하였다. 하기 프라이머를 사용하여 이들의 전사를 확인하였다: α-튜불린(α-tubulin)(5'-TTCTCCATTTACCCGGCACC-3') 및 (5'-GTTAGTGTAGGTTGGGCGCT-3'), EPB41L5(5'- GAAA GAAGGCCCAGCAAACG-3') 및 (5'- AGATCTCATCCCCCAAGCCT-3'), PAI-1(5'-CCCCACTTCTTCAGGCTGTT-3') 및 (5'-GCCGTTGAA GTAGAGGGCAT-3'), Slug(5'-TCATCTTTGGGGCGAGTGAG-3') 및 (5'-TGCAGCTGCTTATGTTTGGC-3'), ZEB1(5'-TATGAATGCCCA AACTGCAA-3') 및 (5'-TGGTGATGCTGAAAGAGACG-3'), Smad4 (5'-TGCATGACTTTGAGGGACAG-3') 및 (5'-GTGGAAGCCACAGGAATGTT-3'). cDNA의 양은 α-튜불린으로 표준화하였다. 모든 실험은 3번 반복하여 수행하였으며, 상대적 발현 수준 및 표준편차는 비교방법으로 계산하여 나타내었다.
9. 면역형광분석(Immunofluorescence analysis)
세포를 챔버 슬라이드(SPL life sciences, 포천시, 한국)에서 배양하고, 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드으로 고정시켰다. PBS로 세척한 후, 고정된 세포를 3% BSA와 함께 1시간 동안 항온배양하여 비특이적 항체들을 블록시켰다. Anti-EPB41L5, Anti-E-카데린(cadherin) 및 항-Flag-tag를 4 ℃에서 밤새 배양한 다음 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 549-conjugated goat anti-rabbit 또는 마우스 2 차 항체(Thermo Fisher Scientific)로 염색하였다. 핵(Nuclei)은 Hoechst 33258로 염색하였고, 상기 시료들은 LSM710 공초점 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 영상화하였다.
10. 시험관 내 이동 및 침윤 분석(in vitro migration and invasion assay)
세포이동은 8.0 μm 크기의 기공을 갖는 폴리카보네이트 막 삽입물(insert)(Corning, Manassas, VA, USA)를 사용하여 트랜스웰(Transwell)로 측정하였다. 침윤 분석을 위해서는, 트랜스웰(Transwell)의 삽입물(insert)을 Matrigel(BD Biosciences)으로 코팅하였다. 1x105 cell/well을 상부(upper) 챔버에 넣고, 하부(lower) 챔버를 화학유인물질(chemoattractant)인 TGF-β1, LY2157299(TGFβ 억제제) 또는 항-EPB41L5 단일클론항체(mAb)를 포함하거나, 포함하지 않은 600㎕의 무혈청 배지로 채웠다. 24시간 배양한 다음, 이동하지 않았거나 침입한 세포(invading cell)들을 면봉으로 조심스럽게 상부 챔버에서 제거하였다. 이동되거나 침윤된 세포(invasive cell)들을 0.2% 크리스탈 바이올렛(Sigma-Aldrich)을 포함한 20% 메탄올 용액으로 염색하고, Х 200 배율의 현미경을 이용하여 계수하였다. 이동 및 침윤 분석은 3 번 반복하여 수행하였다.
11. 생체 내 전이 검정(In vivo metastasis assay)
5 주령의 무흉성증(athymic) BALB/c nu/nu 마우스는 Orient(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 대조군 벡터 또는 pCDH-EPB41L5 및 pLECE3-GFP 과발현된 KATO² 세포(2 Х 107 세포를 포함하는 200 ㎕ PBS 용액)를 외측 꼬리 정맥에 주사하였다. 항-EPB41L5 단일클론항체는 5 mg/kg씩 매일 2주 동안 투여되었다. 형광 이미지를 촬영하고, 분석하기 위해 IVIS 이미징 시스템(Caliper life sciences, Hopkinton, MA, USA)을 사용하였다.
12. 통계 분석
위암 환자 표본로부터 얻은 데이터에서 전체 생존률을 분석하기 위해 Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis)를 사용하였다. 사용된 Affymetrix ID는 220977_x_at이고, log-rank 테스트는 Kaplan-Meier 생존 곡선을 사용하였다. 통계 분석은 독립적인 실험(양면)의 두 그룹을 비교하기 위해 Student 's t-test를 사용하여 수행되었고, 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타내었다. P <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
실시예
<실시예 1>. 위암 환자 표본에서 EPB41L5 유전자의 발현 수준 분석
GC에서 중요한 표적 분자를 확인하기 위하여, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 이는 림프절(lymph node) 전이가 없는 78명 위암 환자들을 대상으로 수행하였다. 상기 환자들은 EPB41L5 유전자의 발현 중간값을 기준으로 제1, 제2 그룹으로 분류하였다. EPB41L5 유전자의 발현 수준의 중간값을 기준으로 좌측에 위치하는 제1 그룹, EPB41L5 유전자의 발현 수준의 중간값을 기준으로 우측에 위치하는 제2 그룹이 있다.
APEG1, SMPX, GPR177 및 EPB41L5 유전자가 높은 제1 그룹은 상기 유전자 발현이 높지 않은 제2 그룹보다 재발률이나 사망률이 더 높은 것을 확인하였다(도 1a). APEG1, SMPX, GPR177 및 EPB41L5 유전자 중에서도 항체-기반 암 치료의 대상이 되는 EPB41L5을 표적 단백질로 선택하였다. EPB41L5 유전자의 발현 수준의 중간값을 기준으로 한 두 그룹에서의 향후 10년간 생존율을 분석한 결과(도 1b), EPB41L5 유전자의 발현 발현이 높은 환자들이 낮은 수준의 환자들에 비해 생존율이 더 낮은 것을 알 수 있다.
또한 암 환자 두 그룹에 대한 Kaplan Meier 플러터 분석을 실시한 것으로, 876 명의 위암 환자를 대상으로 수행한 결과, GEO, EGA, TCGA와 같은 데이터베이스를 사용하는 Kaplan Meier 플로터에서 EPB41L5 발현이 높은 위암 환자는 생존율 역시 낮다는 것을 확인하였다(HR 1.73, P 2.8E-10)(도 1c). 이러한 임상적 결과들을 통해, EPB41L5 발현 수준이 위암 환자의 불량 예후와 관련이 있음을 알 수 있다. 다시 말해 EPB41L5 유전자의 발현 수준이 높은 위암 환자는 생존율이 낮았다.
*<실시예 2>. 위암 세포에서 TGF-β1과 EPB41L5 단백질의 발현 양상 분석
본 발명에서 어떤 위암 세포가 TGFβ 신호에 반응하는지를 조사하고자 하였다. 여러 위암 세포주를 대상으로 웨스턴 블롯 분석을 실시하여, TGFβ 시그널링과 관련성이 있는 단백질 수준을 분석하였다(도 2a). 그 결과, NCI-N87, MKN45, SNU216 및 SNU484 세포에서는 Smad3 또는 Smad4가 검출되지 않았음을 확인하였다.
이후, TGF-β1를 위암 세포에 처리하여 EPB41L5 유전자 발현이 TGFβ 신호에 의해 조절되는지 여부를 조사하고자 하였고, 그 결과 EPB41L5 유전자의 발현 수준은 TGF-β1 처리에 의해 KATOⅢ, MKN28, SNU1 및 SNU719 세포에서 유의하게 증가하였으나, Smad3/Smad4이 결함된 GC 세포에서는 EPB41L5 유전자 발현 수준이 유의적으로 증가하지 않았다(도 2b). 또한 TGF-β1 처리에 의해서 PAI-1, Slug 및 인산화된 Smad2, Smad3와 같은 간엽(mesenchymal) 유전자의 발현이 유의하게 증가하였다(도 2c).
면역형광(Immunofluorescence) 염색분석 결과(도 2d)에 따르면 막내외(transmembrane)에 존재하는 상피마커 E-cadherin의 발현이 감소하고, EPB41L5 단백질의 발현 수준이 KATOⅢ의 세포막에서 TGF-β1에 의해 증가함을 확인하였다. 또한, 위암 세포인 KATOⅢ와 SNU719 세포는 TGF-β1 처리에 의해 간엽성(mesenchymal characteristics)으로 변화되었다(도 2e, 도 2f).
상기 결과를 통해 TGFβ 신호가 암, 예를 들면 위암 세포에서 EPB41L5 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준과 상피 간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition)를 조절한다는 것을 알 수 있다.
<실시예 3>. Smad 의존성 TGFβ 신호전달을 통한 EPB41L5 단백질의 발현 수준 조절
TGF-β1에 의해 유도된 EPB41L5 단백질의 발현 수준의 증가가 Smad 의존성인지 아닌지를 확인하기 위하여, Smad4가 결핍된 MKN45(Smad4 녹-다운된 MKN45) 및 NCI-N87 세포(위암)에서 웨스턴 블롯과 면역형광 염색을 수행하였다. TGF-β1를 처리한 각 세포들에서 이들 유전자와 EPB41L5 단백질 수준이 변화하지 않음을 확인하였다(도 3a, 3b). 또한, TGF-β1로 처리할 경우 각 세포들에서 EPB41L5, PAI-1 및 Slug이 상향 조절되었으며, siRNA를 사용하여 Smad4가 녹-다운된(knock-downed)된 MKN28 세포에서는 EPB41L5, PAI-1 및 Slug 발현이 억제되었음을 확인하였다(도 3c, 도 3d).
이러한 결과를 종합하면 TGFβ 신호 전달 경로가 Smad에 의존적이고, 이는 위암 세포에서 EPB41L5 발현 조절에 관여하고 있음을 의미하는 것이다.
<실시예 4>. TGF-β1의 EPB41L5 단백질과의 관련성 분석
본 발명은 강력한 TGFβ 수용체 I 억제제인 LY2157299(Galunisertib)을 처리하였을 때, EPB41L5 단백질의 발현 수준 변화를 분석하고자 하였다.
도 4는 아무것도 처리하지 않은 KATOⅢ 세포, TGF-β1만 처리한 KATOⅢ 세포, TGF-β1을 처리한 후 TGFβ 억제제(LY2157299)를 처리한 KATOⅢ 세포를 준비하고, 이를 내인성 EPB41L5 단백질 및 E-카데린(E-cadherin) 발현을 분석하기 위해 면역형광 염색으로 분석한 결과이다. 녹색은 EPB41L5 단백질, 빨간색은 E-카데린, 파란색은 Hochest 33258이고, 스케일 막대는 20 ㎛이다.
도 4에 나타난 바와 같이, TGF-β1만을 KATOⅢ 세포에 처리한 것과, TGF-β1과 LY2157299를 순차적으로 처리한 KATOⅢ 세포를 면역형광 염색한 결과, TGF-β1에 의해서 EPB41L5 단백질의 발현 수준이 증가되나, LY2157299에 의해서는 억제되고 있음을 확인하였다.
<실시예 5>. 위암 세포의 이동성에 대한 EPB41L5의 영향 분석
EPB41L5가 TGFβ 신호에 반응하여 위암 세포의 이동에 영향을 주는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위해 KATOⅢ 세포 또는 SNU719 세포에 EPB41L5 siRNA를 형질감염 시켰다. 구체적으로 EPB41L5 결핍을 위해 2가지 유형의 siRNA(EPB41L5 siRNA#1(서열번호 4: 5'- GC AAUUGGCAGCUUAUAAUUU -3 '), EPB41L5 siRNA#2(서열번호 5: 5'- UUCAGAUUC GUGCCUAUUCAGUU -3'))를 사용하였다. NC siRNA 형질감염된 KATOⅢ 세포와 비교하여 EPB41L5 siRNA#1, EPB41L5 siRNA#2로 형질감염된 KATOⅢ 세포에서 EPB41L5 및 PAI-1의 유전자와 단백질 수준이 유의하게 감소되었음을 확인하였다(도 5a, 5b). 그러나 EPB41L5 siRNA#1, EPB41L5 siRNA#2로 형질감염된 KATOⅢ 세포에서 인산화된 Smad3(αp-Smad3)과 Smad3(αSmad3)에는 변화가 관찰되지 않았다(도 5b).
또한, NC siRNA 형질감염된 KATOⅢ 세포, EPB41L5 siRNA#1, EPB41L5 siRNA#2로 형질감염된 KATOⅢ 세포에 TGF-β1을 처리하였을 때, 간엽전이 여부와 위암세포의 이동성을 분석한 결과, EPB41L5이 결핍될 경우 간엽전이와 위암 세포의 이동성에 대한 TGF-β1의 영향을 차단하고 있음을 확인하였다(도 5c, 5d, 5e). 즉 EPB41L5은 TGFβ에 의해 유도되는 세포 전이와 위암 세포의 이동에 필수적인 요소임을 알 수 있다.
<실시예 6>. 항-EPB41L5 mAb(단일클론항체)는 C-말단의 619-624 AA 서열을 인식함
본 발명은 전이에서 세포 부착 분자가 중요한 역할을 수행하기 때문에, 이를 기반으로 단일클론항체와 펩타이드를 이용한다면 새로운 치료제의 개발이 가능할 것이라 여기고, EPB41L5에 대한 단일클론항체(mAb)를 개발하고자 하였다.
개발된 항체의 특이성을 입증하기 위하여 Flag-EPB41L5 또는 EPB41L5 siRNA로 형질감염된 위암 세포를 웨스턴 블랏과 면역형광분석으로 분석하였다. 그 결과 Flag-EPB41L5로 형질감염된 위암세포에서 과발현된 EPB41L5가 검출되었고(도 6a), EPB41L5 siRNA로 형질감염된 위암세포(NC, siRNA#1 또는 siRNA#2)에서 EPB41L5가 침묵하고 있음을 확인하였다(도 6b). 또한, EPB41L5 siRNA로 형질감염된 위암 세포를 면역형광염색법으로 분석한 결과 EPB41L5가 위암 세포에서 항-EPB41L5 단일클론항체에 의해 분명히 검출되었음을 알 수 있다(도 6c). 본 발명에서의 항-EPB41L5 단일클론항체는 웨스턴 블랏 분석을 통해 분석한 결과, EPB41L5의 N 말단 FERM 도메인이 아닌 EPB41L5의 C-말단을 인식하고 있음을 확인하였다(도 6d, 6e).
또한, EPB41L5의 C-말단에서 5 아미노산을 순차적으로 제거한 항체를 확인한 결과, 항체가 EPB41L5의 C-말단의 아미노산 619-624를 인식한다는 것을 확인하였다(도 6f, 6g). 투과하지 못하는 면역형광염색의 특성을 고려하여 내인성 EPB41L5의 발현을 억제하기 위해 EPB41L5의 FL(전장), EPB41L5의 FERM, EPB41L5의 C-term 및 EPB41L5의 △ 619-624 중에서 선택되는 어느 하나의 플라스미드와 EPB41L5 siRNA를 공-형질감염시켰다. 이에 외인성 EPB41L5 발현을 항-Flag 항체를 사용하여 분석하였다. EPB41L5 발현은 FL 및 C-말단 구조체로 형질감염된 FK 세포와 △ 619-624로 형질 감염되지 않은 MKN28 세포에서 확인되었다(도 6h). 이들 결과를 종합하면, 항-EPB41L5 단일클론항체가 EPB41L5의 619-624 아미노산 영역을 특이적으로 인식하고 있음을 알 수 있다.
<실시예 7>. 항-EPB41L5 단일클론항체의 가변영역 서열 분석
상기 <실시예 6>.에서 제작된 단일클론항체의 가변영역의 서열을 에이티젠(한국)에 의뢰하여 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 단일클론항체의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 서열은 하기와 같다.
중쇄가변영역
(서열번호 12) QVQLKESGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNSDTSYNQKFKDKAKLTAVTSTSTAYMELSSLTDEASAVYYCTRGGKLPFAMDYWGQGTSVTVSS
경쇄가변영역
(서열번호 13) DVLMTQTPLSLPVSLGDQASMSCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK
나아가, 본 발명에 따른 단일클론항체의 중쇄가변영역 CDR 1 내지 3과 경쇄가변영역 CDR 1 내지 3의 서열은 하기와 같다.
중쇄가변영역 CDR1: Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp (서열번호 6)
중쇄가변영역 CDR2: Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp(서열번호 7)
중쇄가변영역 CDR3: Thr Arg Gly Gly Lys Leu Pro Phe Ala Met Asp Tyr(서열번호 8)
경쇄가변영역 CDR1: Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr(서열번호 9)
경쇄가변영역 CDR2: Lys Val Ser(서열번호 10)
경쇄가변영역 CDR3: Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr(서열번호 11)
<실시예 8>. 항-EPB41L5 단일클론항체의 치료효과
항-EPB41L5 단일클론항체의 특이성을 검증하고자 하였다. 본 실험에서 TGF-β1 처리를 하거나 하지 않고 GC 세포의 이동에 대한 항-EPB41L5 단일클론항체의 효과를 평가한 결과, TGF-β1은 KATOⅢ 세포의 이동을 효율적으로 증가시켰음을 확인하였다. 나아가, 항-EPB41L5 단일클론항체는 KATOⅢ 세포에서 TGF-β1에 의해 증가된 세포 이동을 저해함을 확인하였다(도 7a, b).
<실시예 9>. 항-EPB41L5 단일클론항체의 전이 억제 효과 비교
상기 <실시예 8>.과 동일한 방법으로 단일클론항체가 인지하는 에피토프의 서열의 차이에 따른 항-EPB41L5 단일클론항체에 의한 세포 이동 저해 정도를 비교하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 단일클론항체(AtGen)의 경우에는 TGF-β1에 의해 증가된 세포 이동을 현저하게 저해(100%)하는 반면, EPB41L5 단백질의 638 내지 708 번째 아미노산 서열을 인지하는 항체(Novus 항체)의 경우에는 TGF-β1에 의해 증가된 세포 이동을 거의 저해하지 못하는 것을 확인하였다. 이에, EPB41L5의 C-터미널 부위의 619 내지 624 번째 아미노산 서열을 인지하는 항체는 다른 아미노산 서열로 구성된 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와 비교하여 TGF-β1에 의해 증가된 세포의 이동성을 매우 효과적으로 저해할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 10>. EPB41L5과 위암 세포 전이와의 관련성 분석
앞선 실험들을 통해 TGF-β1에 의해 증가된 EPB41L5 발현이 생체 내(in vitro)에서 위암 세포의 이동과 침윤에 관여하고 있음을 확인하였다. 이에 본 발명에서는 시험관 내 이동 및 침윤 분석법을 통해 위암 세포의 이동에 있어서 EPB41L5의 효과를 분석하고자 하였다.
구체적으로, EPB41L5를 과발현시킨 KATOⅢ 세포와, 이의 대조군(Vehicle)으로 아무것도 처리되지 않은 KATOⅢ 세포를 준비하였다.
EPB41L5를 과발현시킨 KATOⅢ 세포로부터, 시험관 내 이동 및 침윤 분석을 수행한 결과, EPB41L5를 과발현시킨 KATOⅢ 세포는 실질적으로 세포의 이동과 침윤이 향상되었음을 확인하였다(도 9a, 9b). 생체 내에서 EPB41L5의 발현에 의한 위암 세포의 영향을 관찰하기 위하여, EPB41L5 과발현된 KATOⅢ 세포를 누드 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 그 결과 대조군(Vehicle(GFP))에 비해 위암 세포의 폐전이가 EPB41L5(GFP) 군에서 유의하게 증가하였음을 확인하였다(도 9c, 9d). 종합하면 EPB41L5가 위암 세포의 생체 내 전이를 촉진한다는 것을 알 수 있다.
<실시예 11>. 항-EPB41L5 단일클론항체의 위암 세포 전이 억제능 확인
항-EPB41L5 단일클론항체의 생체내 효능을 확인하고자 하였다. 이를 위해 대조군(Vehicle)과 EPB41L5 과발현된 KATOⅢ 세포를 누드 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입한(EPB41L5)군, EPB41L5 과발현된 KATOⅢ 세포를 누드 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입하고, 2일 간격으로 2주동안 항-EPB41L5 단일클론항체를 5 ㎎/㎏씩 주입한(EPB41L5+mAb)군을 준비하였다(도 10a).
EPB41L5 과발현 세포를 주입한 누드 마우스에서는 암의 폐전이가 증가하였으나, 항-EPB41L5 단일클론항체를 주입한 군에서는 위암 세포의 폐전이가 대조군보다 감소하였음을 확인할 수 있다(도 10b, 10c). 이를 통해 본 발명에 따른 항-EPB41L5 단일클론항체가 효과적으로 진행성 위암에 대해 치료 또는 예방 효과를 나타내고 있음을 알 수 있다.
<실시예 12>. 항-EPB41L5 단일클론항체의 EBP41L5 단백질 특이적 인식 기능 확인
항-EPB41L5 단일클론항체의 EBP41L5에 대한 특이성을 확인하고자 하였다. 이를 위해 위암(Gastric cancer) 세포주로 KATOⅢ 세포와 MKN28 세포를 준비하였다. 폐암(Lung cancer) 세포주로는 A549 세포와 H226 세포를 준비하였고, 유방암(Breast cancer) 세포주로는 MCF7 세포와 MDA-MB-231 세포를 준비하였다. 상기 세포는 연세대 정재호 교수님 연구실 및 한국세포주은행으로부터 제공받아 사용하였다. 각 세포는 5% CO2, 37 ℃에서 10% FBS와 1% 항생제/항균제 용액(코닝, Manassas, VA, USA)이 첨가된 RPMI-1640 배지로 배양하였다.
항-EPB41L5 단일클론항체를 이용하여, 각 세포군에서 EBP41L5 단백질 발현을 웨스턴 블랏을 이용해 확인하였다(도 11). 그 결과, 항-EPB41L5 단일클론항체에 의해 위암 세포주뿐만 아니라, 폐암 세포주와 유방암 세포주에서도 EPB41L5 단백질 발현을 확인하였다(도 11). 이를 통해 본 발명에 따른 항-EPB41L5 단일클론항체가 위암뿐만 아니라, 폐암과 유방암에서도 효과적으로 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있음을 나타내고 있다.
<실시예 11>. 항-EPB41L5 단일클론항체의 세포 특이적 독성 확인
다양한 세포에 대한 본 발명의 항-EPB41L5 단일클론항체의 세포 생존율을 확인하고자 하였다. 이를 위해 위암(Gastric cancer) 세포주로 KATOⅢ 세포와 MKN28 세포를 준비하였다. 폐암(Lung cancer) 세포주로는 A549 세포와 H226 세포를 준비하였고, 유방암(Breast cancer) 세포주로는 MCF7 세포와 MDA-MB-231 세포를 준비하였다. 상기 세포는 연세대 정재호 교수님 연구실 및 한국세포주은행으로부터 제공받아 사용하였다.
각 세포는 5% CO2, 37 ℃에서 10% FBS와 1% 항생제/항균제 용액(코닝, Manassas, VA, USA)이 첨가된 RPMI-1640 배지로 배양하였다.
각 세포군에 항-EPB41L5 단일클론항체를 0, 2, 4, 6 ㎍씩 주입하고, 24 시간이 지난 후, 각 세포군의 세포 생존율(cell Viability, %)을 확인하기 위해 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltertrazolium bromide(MTT) reduction 방법을 통해 확인하였다(도 12). 그 결과, 항-EPB41L5 단일클론항체를 주입한 경우 농도별로 세포 생존률이 감소하는 것을 확인하였는 바, 본 발명의 항-EPB41L5 단일클론항체가 효과적으로 진행성 암 혹은 위암에 대해 치료 또는 예방 효과를 나타내고 있음을 알 수 있다(도 12).
<결론>
세포 부착 단백질은 암 전이에서 중요한 역할을 수행하고 있다. 따라서 세포 부착 단백질에 대한 항체를 이용함으로써, 암 전이에 대한 치료제 개발 가능성이 논의되고 있는 실정이다. 본 발명자는 전이와 관련된 새로운 접착 분자 또는 복합체를 기반으로 하는 새로운 치료법을 개발하고자 노력한 바, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. EMT(상피간엽이행; Epithelial to Mesenchymal Transition)는 세포-세포 접합 및 세포 극성의 상실과 중간엽형 표현형을 가능하게하는 악틴 세포 골격의 재구성을 가지고있다. EPB41L5는 E-cadherin을 불안정화시키는 p120 카테닌 및 paxillin과 상호 작용한다고 보고되어 있으나, focal adhesion kinase 또한 세포 극성을 부정적으로 조절하는 Crumbs complex 성분 인 MPP5와 결합한다고 알려져 있다. 다른 접합 단백질인 β-catenin은 신장 상피 세포의 측막의 EPB41L5와 공존하며, 그 결합은 확인되지 않았다. FAK는 N 말단의 FERM 도메인을 가지고 있고 C 말단의 EPB41L5의 또 다른 결합 파트너 인 ASAP1/AMAP1 및 paxillin과 결합한다.
본 발명에서 EPB41L5가 위암 환자의 불량 예후를 초래한다는 것을 밝혔고, 이와 관련하여 EPB41L5는 암 세포에서 높은 발현율을 나타냄을 확인하였다. 한편 TGF β는 위암 전이를 촉진한다는 알려져 있으므로, 이 발현이 림프절 전이와 암의 예후에 상관관계가 있을 것이라 예측하고, TGFβ와 EPB41L5의 관련성을 분석한 결과 EPB41L5 유전자 프로모터에서 다수의 Smad 결합 모티프를 확인하였다.
이에, EPB41L5의 녹다운으로, TGF-β1-유도된 중간엽 전이와 GC 세포의 이동성 증가를 배제함을 확임함으로써, EPB41L5가 TGFβ 신호전달기전에 있어서 주요 인자임을 확인하였다. 이러한 결과를 종합하면 위암세포에서는 TGFβ/Smad3/EPB41L5 경로를 통한 상피간엽 전이 과정으로 암 세포의 이동과 침윤을 제어할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에서 EPB41L5가 세포 표면에 위치하고, GC 세포의 시험관내 및 생체내 전이를 촉진하고 있음을 확인한 바, 이를 특이적으로 하는 항체는 치료를 기반으로 하는 단일클론항체로서 사용 가능될 것이라 여겨, EPB41L5 단일클론항체를 개발하였다. EPB41L5 단일클론항체는 TGF-β1에 의한 위암 세포의 이동 및 침윤을 효과적으로 차단하였고, EPB41L5이 과발현된 세포에서 발생하는 증가한 폐전이는 항-EPB41L5 단일클론항체에 의해 유의하게 억제되었음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 항-EPB41L5 단일클론항체는 위암, 폐암, 유방암의 각 세포군(특히, 위암 세포주)에서 EPB41L5 단백질 발현을 유의하게 억제하였고, 암 세포의 생존률을 감소시키는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 EPB41L5 단일클론항체는 암, 특히 위암을 예방하거나 치료하거나 전이를 억제하는데에 매우 효과적인 방법임을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUREUS Inc. <120> A Epitope of EPB41L5 and monoclonal antibody <130> PDPB187365k01d01 <150> KR 10-2018-0093045 <151> 2018-08-09 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 733 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPB41L5 protein <400> 1 Met Leu Ser Phe Phe Arg Arg Thr Leu Gly Arg Arg Ser Met Arg Lys 1 5 10 15 His Ala Glu Lys Glu Arg Leu Arg Glu Ala Gln Arg Ala Ala Thr His 20 25 30 Ile Pro Ala Ala Gly Asp Ser Lys Ser Ile Ile Thr Cys Arg Val Ser 35 40 45 Leu Leu Asp Gly Thr Asp Val Ser Val Asp Leu Pro Lys Lys Ala Lys 50 55 60 Gly Gln Glu Leu Phe Asp Gln Ile Met Tyr His Leu Asp Leu Ile Glu 65 70 75 80 Ser Asp Tyr Phe Gly Leu Arg Phe Met Asp Ser Ala Gln Val Ala His 85 90 95 Trp Leu Asp Gly Thr Lys Ser Ile Lys Lys Gln Val Lys Ile Gly Ser 100 105 110 Pro Tyr Cys Leu His Leu Arg Val Lys Phe Tyr Ser Ser Glu Pro Asn 115 120 125 Asn Leu Arg Glu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Phe Val Leu Gln Leu Lys 130 135 140 Gln Asp Ile Leu Ser Gly Lys Leu Asp Cys Pro Phe Asp Thr Ala Val 145 150 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Claims (20)

  1. 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5(Erythrocyte Membrane Protein Band 4.1 Like 5) 단백질의 619 내지 624 번째 아미노산 잔기 중에서 선택되는 1 내지 6 mer의 에피토프 중에서, 상기 에피토프는 EPB41L5 단백질의 아미노산 위치 619 내지 624번째의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 에피토프.
  2. 삭제
  3. 제 1항의 에피토프를 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서,
    상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 EPB41L5와 TGF-β간의 상호작용을 차단하는 것인, 단일클론항체 또는 이의 단편.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편인, 단일클론항체 또는 이의 단편.
  7. 제3항의 단일클론항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산분자.
  8. 제7항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
  9. 제8항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  10. 서열번호 1로 표시되는 EPB41L5 단백질의 619 내지 624 번째 아미노산의 에피토프; 이를 코딩하는 핵산분자; 또는 이를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 암은 암 줄기세포를 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  12. 제3항의 단일클론항체 또는 이의 단편; 이를 코딩하는 핵산분자; 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터;로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 암은 암 줄기세포를 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  14. 제3항의 단일클론항체 또는 이의 단편; 이를 코딩하는 핵산분자; 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터;로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 암은 암줄기세포를 포함하는 것인, 암의 전이 억제용 약제학적 조성물.
  16. (a) 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계;
    (b) 제3항의 단일클론항체 또는 이의 단편을 상기 샘플에 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 피검자의 샘플 중에 포함된 EPB41L5의 발현양이 정상군 샘플 중에 포함된 EPB41L5의 발현양 보다 높은지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 암은 암 줄기세포를 포함하는 것인, 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 암은 전이암인 것인, 방법.
  19. 제3항의 단일클론항체 또는 이의 단편을 처리하는 단계를 포함하는, 샘플 중에 포함된 EPB41L5 단백질을 정량하는 방법.
  20. 제3항의 단일클론항체 또는 이의 단편을 포함하는 EPB41L5 단백질의 정량 키트.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015021800A (ja) * 2013-07-17 2015-02-02 国立大学法人北海道大学 腎癌の再発リスクの予測に用いるための診断薬及びキット、並びに予測方法
JP2017108686A (ja) 2015-12-17 2017-06-22 国立大学法人北海道大学 膵癌の再発リスクの予測に用いるための診断薬及びキット、並びに予測方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
CN1852974A (zh) * 2003-06-09 2006-10-25 密歇根大学董事会 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法
JP6202362B2 (ja) * 2013-03-04 2017-09-27 国立大学法人北海道大学 乳癌乳房温存療法後の局所再発リスクの予測に用いるための診断薬並びに予測方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015021800A (ja) * 2013-07-17 2015-02-02 国立大学法人北海道大学 腎癌の再発リスクの予測に用いるための診断薬及びキット、並びに予測方法
JP2017108686A (ja) 2015-12-17 2017-06-22 国立大学法人北海道大学 膵癌の再発リスクの予測に用いるための診断薬及びキット、並びに予測方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Oncogenesis, 5:e259(2016)*

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