CN105263510A

CN105263510A - 冠毛素调节剂

Info

Publication number: CN105263510A
Application number: CN201480031999.4A
Authority: CN
Inventors: C·奥克斯维格; J·H·米克尔森; M·R·吉普森
Original assignee: Aarhus Universitet
Current assignee: Aarhus Universitet
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2014-05-12
Publication date: 2016-01-20
Also published as: US20160151405A1; HK1215929A1; MX2015015519A; JP2016520583A; WO2014180485A3; EA201591894A1; WO2014180485A2; CA2911933A1; EP2994158A2; US20200261490A1; US11318158B2

Abstract

提供了一种通过降低或提高相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的水平来降低或提高冠毛素多肽的活性的方法。还提供了一种预防、治疗或改善哺乳动物受试者，例如人类中的临床病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者，例如人类施用有效量的斯钙素多肽。而且，提供了一种预防、治疗或改善哺乳动物受试者，例如人类中的临床病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者，例如人类施用有效量的能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂。

Description

冠毛素调节剂

发明领域

本发明涉及冠毛素(Pappalysin)和斯钙素(stanniocalcin)之间的相互作用和复合物形成，及斯钙素作为冠毛素调节剂的用途。

发明背景

妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)是胰岛素样生长因子(IGF)系统的重要调节因子。PAPP-A通过其蛋白水解活性，能够对IGF系统发挥活化作用并从而调节关键生物过程例如组织生长和人类疾病。

PAPP-A，基于其一级结构，被表征为属于甲硫氨酸锌蛋白(metzincin)超家族的金属蛋白酶。然而，PAPP-A也具有不同于其它甲硫氨酸锌蛋白的特征，并且因此将其分类为称为冠毛素的甲硫氨酸锌蛋白亚类，还包括PAPP-A同源物PAPP-A2。

妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)首先被鉴定为与人类妊娠相关的血浆蛋白。该蛋白具有胎盘起源并且在孕妇血清中发现。妊娠期间PAPP-A的浓度增加，并且在妊娠前三个月中母体循环中的PAPP-A水平降低与胎儿唐氏综合征(Down’ssyndrome)的高风险相关，使得PAPP-A成为三体性21的临床标记。另外，已经将母体妊娠血清中的低PAPP-A浓度与足月婴儿的三体性18、子痫前期和低出生体重的高风险相关联。

PAPP-A是负责对IGFBP-4的IGF依赖性蛋白水解活性的蛋白酶。PAPP-A也特异性地裂解IGFBP-5，并且在一定程度上裂解IGFBP-2。具体而言，尚未证实其它蛋白酶在生理学上加工IGFBP-4。PAPP-A介导的IGFBP-4裂解受IGF的存在明显加速。IGFBP裂解片段对IGF的亲和性降低并且PAPP-A蛋白水解活性因此导致能够结合并活化IGF-I受体的生物活性IGF的释放。因此，PAPP-A起IGFBP拮抗剂的作用。

妊娠期间PAPP-A作为400kDa的二聚体从胎盘释放，但是主要作为与500kDa的嗜酸细胞主要碱性蛋白的前体形式(proMBP)的二硫键结合2:2复合物循环。这种表示为PAPP-A/proMBP的异四聚体复合物在妊娠期间增加浓度时发现。当PAPP-A与proMBP复合时，消除了其蛋白水解活性。受proMBP结合的抑制很可能是由PAPP-A活性位点的封闭或活性位点结构上构象变化的诱导引起。通过介于proMBP亚基和PAPP-A二聚体亚基之间的两个链间二硫桥和介于两个proMBP亚基之间的附加桥将PAPP-A/proMBP复合物保持在一起。

除proMBP介导的抑制外，体外研究已经证明，PAPP-A对IGFBP-4的活性受对PAPP-A/proMBP产生的多克隆抗体抑制。此外，能够螯合二价阳离子的剂，例如EDTA和1,10-菲咯啉为金属蛋白酶的通用非特异性抑制剂并且因此也消除PAPP-A蛋白水解活性(Overgaard2000)。最后，已经证实噬菌体来源的单链片段可变(scFv)抗体通过LNR3的靶向抑制PAPP-A对IGFBP-4的蛋白水解，因此LNR3被视为PAPP-A的外位点。LNR3模块位于PAPP-A的C-末端。PAPP-A是IGF信号的治疗性控制中的潜在靶标，并且抗体靶向LNR3展示出一种选择性抑制IGFBP-4蛋白水解的方式。

迄今为止，proMBP是PAPP-A唯一已知的生理抑制剂。

发明概述

本发明涉及使用斯钙素作为冠毛素蛋白水解活性的抑制剂的方面，以及使用斯钙素与冠毛素之间的相互作用的其它方面。

冠毛素包含PAPP-A和PAPP-A2多肽，及其片段和变体。具体地，冠毛素可形成PAPP-A亚基、PAPP-A2亚基或其片段或变体的二聚体，或PAPP-A和PAPP-A2或其片段或变体的冠毛素杂二聚体。

一方面，本发明涉及一种通过降低或提高相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的水平降低或提高冠毛素多肽的活性的方法。

在一个实施方案中，通过施用拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用的剂，例如斯钙素定向siRNA或抗体，例如能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的抗体提高冠毛素多肽的活性。

在另一个实施方案中，通过例如使用表达所述斯钙素多肽或其部分的核酸载体，例如使用逆转录病毒载体提供斯钙素多肽，或通过提供呈纯化或部分纯化斯钙素形式的斯钙素多肽，抑制冠毛素多肽的活性。

通常，冠毛素多肽的活性与斯钙素的水平负相关并且因此，冠毛素多肽的活性可通过提高斯钙素多肽的水平降低，并通过降低斯钙素多肽的水平提高。

在一个实施方案中，所述方法通过提高或降低在人类细胞，例如人类干细胞中的斯钙素多肽的水平而进行。因此，所述方法可适用于提高或降低在哺乳动物受试者中，例如在人类中，例如在哺乳动物受试者(例如人类)的特定组织，例如癌组织中的斯钙素多肽的水平。

另一方面，提供了一种预防、治疗或改善哺乳动物受试者，例如人类中的临床病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者，例如人类施用有效量的斯钙素多肽。通过提供有效量的斯钙素，可以抑制冠毛素多肽的活性。

这种方法用于抑制增生过程，并且因此，该方法优选适用于预防、治疗或改善增生性病症，例如癌症，例如卵巢癌、睾丸癌、肺癌或消化系统的任何癌症，包括室性癌、结肠癌、小肠癌和直肠癌，尤其，所述癌症选自卵巢癌、肺癌和结肠癌。其它优选的临床病状包括再狭窄、动脉粥样硬化、排卵、纤维化以及与人类生殖有关的临床病状。其它优选的临床病状包括积液，例如卵巢癌患者中的腹水产生。

再一方面，本发明关于一种预防、治疗或改善在哺乳动物受试者中，例如在人类中的临床病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者，例如人类施用有效量的能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂。通过提供此类剂，拮抗斯钙素和冠毛素多肽之间的相互作用，并防止斯钙素抑制冠毛素。这种方法可适用于刺激增生过程，并且因此，所述方法可适于临床病状，例如通过骨重建或骨生长治疗骨折，和治疗伤口，其中该治疗或改善为伤口愈合。

优选通过提供抑制斯钙素与冠毛素的相互作用的抗体，例如封闭性抗体拮抗斯钙素和冠毛素多肽之间的相互作用。

在本发明的另一方面，提供了能够特异性结合相互作用的斯钙素和冠毛素多肽，例如PAPP-A和斯钙素1之间的非共价相互作用物和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价复合物的抗体。该抗体优选地对由冠毛素多肽和斯钙素多肽组成或包含冠毛素多肽和斯钙素多肽的所述复合物具有比单独的冠毛素或斯钙素更高的亲和力。这种抗体可用于检测相互作用的斯钙素和冠毛素多肽。然而，该抗体也可用于稳定或促进冠毛素和斯钙素之间共价或非共价复合物的形成，并从而用于抑制冠毛素。

另一方面，提供了能够例如通过结合冠毛素多肽和/或斯钙素多肽拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的抗体。

一方面，本发明还提供了一种剂或一种包含剂的药物组合物，所述剂能够提高或降低斯钙素多肽的水平，和/或能够拮抗或促进斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用，用于药物中。此类剂为例如斯钙素多肽或其部分、靶向斯钙素的siRNA或本发明的抗体。在优选实施方案中，该剂用于伤口愈合和/或骨重建或骨生长中(例如骨折的治疗中)，和/或该剂用于治疗再狭窄、动脉粥样硬化、排卵、纤维化或癌症，例如卵巢癌、睾丸癌、肺癌或消化系统的任何癌症，包括室性癌、结肠癌、小肠癌和直肠癌。

另一方面，本发明涉及一种生成包含冠毛素多肽的组合物的方法，其中所述组合物基本上无斯钙素多肽，所述方法包括从包含冠毛素及冠毛素和斯钙素的所述复合物的组合物中去除斯钙素和/或冠毛素和斯钙素的共价和非共价复合物。这个方面涉及一种生成包含冠毛素多肽的组合物的方法，其中所述组合物基本上无斯钙素多肽和包含斯钙素多肽的复合物，所述方法包括以下步骤

a.提供包含冠毛素多肽的组合物并且从所述组合物中去除斯钙素多肽和包含斯钙素多肽的复合物，或

b.提供包含冠毛素多肽的组合物，所述冠毛素已经在细胞系中表达，其中通过敲除和/或敲减一个或多个斯钙素基因去除所述斯钙素多肽。

本发明还在一个单独方面涉及一种可通过上述方法获得的组合物。

另一方面，本发明涉及一种包含冠毛素的组合物，所述组合物基本上无斯钙素。

另一方面，本发明提供了一种量化样品中冠毛素的水平的方法，所述方法包括使用基本上无斯钙素的同质组合物作为标准品。在这个方面，提供了包括以下步骤的方法

a.提供样品

b.提供包含冠毛素的参考样品，其中所述参考样品基本上无斯钙素

c.测量所述样品和所述参考样品中冠毛素的水平，

d.将步骤c.中为所述样品测定的冠毛素的水平与所述标准参考样品中的水平相关联，并且

e.基于所述相关性，量化所述样品中冠毛素多肽的水平。

再一方面，本发明提供了一种与至少一种斯钙素多肽相互作用的冠毛素多肽。该相互作用在一个实施方案中是PAPP-A和斯钙素1之间的非共价相互作用和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价相互作用；和/或PAPP-A2和斯钙素1之间的非共价相互作用和/或PAPP-A2和斯钙素2之间的共价相互作用。

又一方面，本发明涉及一种生成对相互作用的冠毛素和斯钙素多肽有特异性的抗体的方法，所述方法包括

a.提供动物，例如小鼠

b.用相互作用的冠毛素和斯钙素多肽免疫所述动物，并且

c.从所述动物获得抗体。

此外，本发明一方面提供了一种鉴定能够促进或拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂的方法，所述方法包括

a.提供冠毛素多肽和斯钙素多肽，

b.提供所述剂，

c.用所述冠毛素和斯钙素多肽孵育所述剂，

d.检测在所述剂存在和缺乏时相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的水平，

e.根据在步骤d.中检测的在所述剂存在和缺乏时相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的水平确定所述剂是否能够拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用。

在这种方法的一个优选实施方案中

a.相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的缺乏表明剂能够拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用，并且

b.相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的存在表明剂不能够拮抗或剂促进斯钙素与冠毛素的相互作用。

另一方面，提供了一种鉴定能够结合以下的剂的方法

a.相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，

b.冠毛素或斯钙素多肽的多肽区，所述区域并非相互作用的冠毛素和斯钙素多肽中暴露的表面

c.未结合的冠毛素多肽(即不与斯钙素多肽相互作用，并且不结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的冠毛素多肽

d.未结合的斯钙素多肽(即不与冠毛素多肽相互作用，并且不结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的斯钙素多肽

所述方法包括

i.提供所述剂，

ii.使所述剂与未结合的斯钙素多肽；和/或未结合的冠毛素多肽；和/或相互作用的冠毛素和斯钙素多肽接触，

iii.确定该剂是否结合所述未结合的斯钙素多肽；和/或未结合的冠毛素多肽；和/或相互作用的冠毛素和斯钙素多肽中的一种或多种。

在这种方法的一个实施方案中通过一种方法鉴定能够以比单独的冠毛素或斯钙素更高的亲和力结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂，所述方法包括

a.提供所述剂，

b.使所述剂与相互作用的冠毛素和斯钙素多肽接触，

c.确定所述剂是否结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，并且

d.选择结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂。

在这种方法的另一个实施方案中通过一种方法鉴定能够结合冠毛素或斯钙素多肽的多肽区的剂，所述区域并非相互作用的冠毛素和斯钙素多肽中暴露的表面，所述方法包括

a.提供所述剂，

b.使所述剂与相互作用的冠毛素和斯钙素多肽和/或未结合的冠毛素和斯钙素多肽接触，

c.确定所述剂是否结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽和/或未结合的冠毛素多肽和/或斯钙素多肽，并且

d.选择不结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂；其中所述剂结合未结合的冠毛素多肽和/或斯钙素多肽。

在该方法的另一个实施方案中，通过一种方法鉴定能够结合未结合的冠毛素多肽的剂，其中所述剂在包含斯钙素结合位点的区域内结合冠毛素，所述方法包括

a.提供所述剂，

b.使所述剂与未结合的冠毛素多肽接触，

c.确定所述剂是否结合冠毛素多肽和相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，并且

d.选择结合冠毛素多肽而不结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂。

在该方法的第三个实施方案中，通过一种方法鉴定能够结合未结合的斯钙素多肽的剂，其中所述剂在包含冠毛素结合位点的区域内结合斯钙素，所述方法包括

a.提供所述剂，

b.使所述剂与未结合的斯钙素多肽和/或相互作用的冠毛素和斯钙素多肽接触，

c.确定所述剂是否结合斯钙素多肽和相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，并且

d.选择结合斯钙素多肽而不结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂。

本发明一方面还提供了一种检测样品中冠毛素多肽和斯钙素多肽之间的相互作用的方法，所述方法包括

a.提供所述样品，

b.提供至少一种对所述冠毛素多肽或所述斯钙素多肽或对相互作用的冠毛素和斯钙素多肽有亲和力的抗体，

c.将所述样品暴露于所述抗体以形成所述抗体和多肽之间的复合物，

d.去除过量未结合的样品，

e.将相互作用的抗体-冠毛素-斯钙素多肽暴露于针对所述抗体之一的另一种抗体，并且

f.检测和量化c.和/或e.的未结合抗体的量。

而且，本发明一方面关于一种确定临床病状的方法，所述方法包括检测相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，例如非共价相互作用的PAPP-A和斯钙素1和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价复合物。

临床病状为例如癌症，例如卵巢癌、睾丸癌、肺癌或消化系统的任何癌症，包括室性癌、结肠癌、小肠癌和直肠癌。

在本发明的方法、抗体、剂、组合物和多肽中，斯钙素多肽优选选自

a.斯钙素1(SEQIDNO:1)和/或斯钙素2(SEQIDNO:2)，

b.与SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中的任一个具有至少80％同一性的多肽变体，和

c.a.和b的任何多肽的多肽片段及

d.由独立地选自a.-c.的任何多肽的两个多肽组成的二聚体

e.由独立地选自a.-c.的任何多肽的一个多肽组成的单体，其中负责共价二聚的至少一个半胱氨酸残基突变为例如丙氨酸残基。

进一步地，在本发明的方法、抗体、剂、组合物和多肽中，冠毛素多肽选自

a.PAPP-A(SEQIDNO:3)或PAPP-A2(SEQIDNO:4)

b.与SEQIDNO:3和SEQIDNO:4中的任一个具有至少80％同一性的多肽变体，

c.a.和b.的任何多肽的多肽片段

d.由独立地选自a.-c.的任何多肽的两个多肽组成的二聚体。

附图说明

图1：检测STC1和STC2的Western印迹-共价PAPP-A/STC2复合物的可视化。A)来自于转化细胞的培养上清液的STC1-特异性Western印迹。细胞经空质粒DNA(模拟物)转染或经STC1cDNA和空质粒DNA或PAPP-A(PA)cDNA共转染。B)来自于转化细胞的培养上清液的STC2-特异性Western印迹。细胞经模拟物转染或经STC2cDNA和空质粒DNA或PAPP-A(PA)cDNA共转染。如图所示，样品在非还原或还原(已还原)条件下进行SDS-PAGE。用黑色箭头指示了PAPP-A/STC复合物的定位。

图2：与STC1或STC2共表达期间检测PAPP-A的Western印迹。样品是来自于转染细胞的培养上清液。细胞经空质粒DNA(模拟物)转染或经PAPP-A和空质粒DNA、STC1(A)或STC2(B)cDNA共转染。PAPP-A抗体(Ab)用于PAPP-A检测。A)和B)中的白色箭头分别指出了高分子量(HMW)和低分子量(LMW)PAPP-A条带的消失。描绘了PAPP-A和与STC2复合的PAPP-A的定位。这些结果代表至少三次独立实验。未经STC1或STC2cDNA转染的细胞显示出一定水平的内源STC2，这导致一部分PAPP-A较慢地迁移。

图3：PAPP-A/STC2复合物形成的检测。通过Western印迹法分析在指定时间点取出的PAPP-A和STC2(A)或PAPP-A和模拟物(B)的混合物。负载来自于模拟转染细胞或经PAPP-A和STC2cDNA共转染(PA+STC2co-tf)的细胞的条件培养基作为对照。PAPP-A抗体用于PAPP-A检测。描绘了PAPP-A和与STC2复合的PAPP-A的定位。ON指示孵育过夜。由B显而易见在培养基中存在不饱和水平的内源斯钙素2。

图4：PAPP-A样品中STC2蛋白的检测。A)在Western印迹法中，使用αSTC2抗体检查模拟培养基、培养上清液中的重组PAPP-A(PAPP-A)、纯化(pur.)PAPP-A-E483Q和纯化PAPP-A/proMBP(PP)样品。B)含重组STC2的培养上清液与培养上清液中的PAPP-A(STC2+PA混合物)、培养上清液中的PA-E483Q(STC2+PA-E483Q混合物)或稀释于模拟培养基中的纯化PP(STC2+PP混合物)混合并且在Western印迹法中，使用αSTC2抗体检查。描绘了STC2和与PAPP-A复合的STC2的定位。

图5：纯化STC1和STC2的洗脱部分的SDS-PAGE。纯化STC1A)和STC2B)分10份洗脱。#1-6份通过SDS-PAGE分离。另外，负载在蛋白质洗脱之前的洗涤洗脱物样品和来自于最终柱式汽提的EDTA样品。电泳之后用考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue)为凝胶染色。

图6：PAPP-A对IGFBP-4的蛋白水解活性受STC1和STC2的抑制。用模拟物-、STC1-或STC2-培养基隔夜预孵育培养上清液中的PAPP-A，并且125I-标记的IGFBP-4在37℃下用IGF-II预孵育15分钟。A)通过SDS-PAGE分离样品。为监测PAPP-A对IGFBP-4的蛋白水解活性，在0-120分钟的时间点测量(i)完整和裂解(c)的125I-IGFBP-4的量。对于PAPP-A样品而言在STC1(中部凝胶)或STC2(下部凝胶)的缺乏(上部凝胶)或存在下指示完整和裂解IGFBP-4的位置。B)计算蛋白水解裂解的IGFBP-4的百分比并且描绘为时间的函数。这些结果代表至少三次独立实验。

图7：通过MALDI-TOF质谱分析鉴定PAPP-A相互作用伴侣。使用单克隆PAPP-A抗体从人类癌细胞系的培养基中免疫沉淀出总PAPP-A。沉淀物呈两条带在非还原SDS-PAGE中出现。在下部400kDa的条带中，仅鉴定到源自PAPP-A的肽。除PAPP-A外，上部条带还含有斯钙素肽。

图8：PAPP-Awestern印迹。在37℃下用来自于模拟物、STC2或其中半胱氨酸120经丙氨酸残基(C120A)置换的突变STC2的条件培养基孵育PAPP-A过夜。通过SDS-PAGE分离样品，涂抹到PVDF膜上并用多克隆抗PAPP-A抗体使条带可视化。用C120A突变体未观察到带位移，证明STC2的半胱氨酸120负责与PAPP-A的共价二硫化物复合物的形成。

图9：A.通过表面等离子体共振(SPR)对STC1:PAPP-A相互作用的动力学常数的测定。KD＝75pM。B.对PAPP-A和STC2(C120A)之间相互作用的表面等离子体共振研究。

图10：A.STC1对PAPP-A介导的IGFBP-4裂解的抑制的抑制常数(Ki)的测定。Ki＝68pM。使用GraphPadPrism5.0软件的单点-拟合(Morrison)Ki模型。B.突变STC2(C120A突变体)对PAPP-A介导的IGFBP-4裂解的抑制的抑制常数(Ki)的测定。Ki＝47nM。使用GraphPadPrism5.0软件的单点-拟合(Morrison)Ki模型。

图11：STC1和STC2抑制PAPP-A的蛋白水解活性。a，如图所示在来自于经cDNA的组合转染的HEK293T细胞的培养基中PAPP-A对放射性标记IGFBP-4的蛋白水解活性。b，来自于a的样品的PAPP-AWestern印迹。c，在裂解反应开始时添加的纯化STC1或STC2存在或缺乏时PAPP-A对放射性标记IGFBP-4的蛋白水解活性。右图：纯化蛋白的考马斯染色SDS-PAGE凝胶。d，对STC1与PAPP-A结合的表面等离子体共振分析。e，STC1对IGFBP-4的PAPP-A裂解的抑制的动力学分析。所有凝胶图像和免疫印迹代表至少四次独立实验。

图12：STC2对PAPP-A的抑制需要共价复合物形成。a，如图所示来自于经cDNA的组合转染的HEK293T细胞的培养基的PAPP-AWestern印迹。b，来自于a的样品的STC2Western印迹。c，来自于经cDNA的组合转染的HEK293T细胞的培养基的PAPP-AWestern印迹。d，孵育0-16小时的单独合成的PAPP-A和STC2的PAPP-AWestern印迹。e，在来自于d的16小时样品中PAPP-A对放射性标记IGFBP-4的蛋白水解活性。f，孵育0-16小时的单独合成的PAPP-A和STC1的PAPP-AWestern印迹。免疫印记和凝胶图像代表至少四次独立实验。

图13：与PAPP-A的共价结合受STC2的C120介导。a，如图所示STC2野生型和突变变体的STC2Western印迹。b，来自于经cDNA的组合转染的HEK293T细胞的培养基的PAPP-AWestern印迹。c，STC2(C120A)对IGFBP-4的PAPP-A裂解的抑制的动力学分析。d，IGF-I、IGFBP-4、PAPP-A和STC的组合对体外IGF-I受体刺激的评估。标准化为用单独IGF-I的信号的量化信号如右图所示。结果为来自于四次独立实验的平均值±s.d.。ns，在统计上不显著。e，纯化STC2和STC2(C120A)的圆二色性分析。插图示出了纯化STC2和STC2(C120A)的考马斯染色SDS-PAGE凝胶。所有免疫印迹和凝胶图像代表至少四次独立实验。

图14：STC2的过表达，而非STC2(C120A)在小鼠中引起生长迟缓。a，根据STC2的循环水平分组的非转基因和STC2转基因雌性小鼠的生长曲线。结果为具有所示s.d.的平均值。统计显著性基于对大于三周龄的小鼠的比较。b，根据循环转基因源STC2的测量水平，在第5周时STC2转基因雌性小鼠的体重。c，非转基因和STC2(C120A)转基因雌性小鼠的生长曲线。结果为具有所示s.d.的平均值。ns，在统计上不显著。d，在PAPP-A的特定抑制剂mAb1/41存在或缺乏时，在来自于源自非转基因小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的条件培养基中对放射性标记IGFBP-4的蛋白水解活性。e，在来自于STC2转基因或非转基因MEF的条件培养基中对放射性标记IGFBP-4的蛋白水解活性。右图：用转基因STC2共免疫沉淀(IP)的内源性鼠PAPP-A的PAPP-AWestern印迹。f，描绘间接影响IGF-I受体刺激的活性和受STC抑制的PAPP-A之间的平衡的模型。所有凝胶图像和免疫印迹代表至少四次独立实验。

图15：STC1和STC2对冠毛素家族外的所选蛋白水解酶缺乏抑制活性，但是抑制PAPP-A2。a，放射性标记IGFBP-5受经缓冲液、STC1、STC2或EDTA预孵育(8小时)的基质金属蛋白酶-2(MMP2，甲硫氨酸锌蛋白金属蛋白酶)的蛋白水解裂解。与IGFBP-4相反，IGFBP-5混杂地受许多蛋白酶裂解。b，与a一样，但使用蛋白裂解酶(丝氨酸蛋白酶)和胰蛋白酶(丝氨酸蛋白酶)及苯甲基磺酰氟(PMSF)。f，来自于经编码人PAPP-A2和STC1或STC2的cDNA转染的HEK293T细胞的培养基的PAPP-A2Western印迹。所有凝胶图像和免疫印迹代表至少四次独立实验。

图16：人STC1和STC2的序列比对。使用ClustalOmega(http://www.clustal.org/omega/)对人STC1(NM_003155.2)和STC2(NM_003714.2)的序列比对。用线条指示的STC1的二硫键和二聚二硫化物是根据公布的数据16。用蓝色指示在STC1中没有对应物的STC2的半胱氨酸残基(C120、C197和C205)。

图17：纯化STC2和STC2(C120A)的圆二色性分析。a，示出222nm下平均残基椭圆率的变化的温度扫描。b，在25℃和95℃下，及在95℃下孵育2分钟后在25℃下记录的光谱。

图18：分别对STC2和STC2(C120A)抗体反应性的评估。标绘了可用单克隆抗体与STC2和STC2(C120A)的相对结合。值1表示与STC2和STC2(C120A)同等结合。结果为来自于按一式三份进行的至少四次独立实验的平均值±s.d.。比率差异在统计上不显著。

图19：鼠PAPP-A和PAPP-A2受STC1和STC2抑制，但不受STC2(C120A)抑制。a，在来自于经编码鼠PAPP-A(mPAPP-A)的cDNA转染，用或不用STC1、STC2或STC2(C120A)预孵育的HEK293T细胞的培养基中对放射性标记IGFBP-4的蛋白水解活性。右图：展示鼠PAPP-A和STC2，而非STC2(C120A)之间形成共价复合物的Western印迹。b，STC2(C120A)对鼠PAPP-A的抑制的动力学分析。c，在来自于经编码鼠PAPP-A2(mPAPP-A2)的cDNA转染，用或不用STC1、STC2或STC2(C120A)预孵育的HEK293T细胞的培养基中对放射性标记IGFBP-5的蛋白水解活性。所有凝胶图像和免疫印迹代表至少四次独立实验。

发明详述

本发明人已经鉴定斯钙素多肽为妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)的抑制剂。

本发明的总体发明概念涉及冠毛素和斯钙素多肽的新型复合物。因此，本发明涉及这种复合物在牵涉该复合物的不同方法和产品中的应用。本发明的方方面面涉及冠毛素和斯钙素多肽之间的复合物的用途，以及生产和筛选能够特异性结合该复合物的剂的方法。

如申请文本通篇所用的术语“相互作用的冠毛素和斯钙素多肽”，是指与至少一种斯钙素多肽相互作用的至少一种冠毛素多肽，或与至少一种冠毛素多肽相互作用的至少一种斯钙素多肽。通常，相互作用的冠毛素和斯钙素多肽包含两个冠毛素多肽和两个斯钙素多肽。然而，斯钙素可为重组生成的单体，其中一个或多个半胱氨酸残基突变以防止共价二聚化。

如本文中关于冠毛素和斯钙素多肽所用的术语“未结合”是指所述各个多肽中的任一个不与另一个相互作用。因此，术语“未结合的冠毛素多肽”在本文中通常是指不与斯钙素相互作用的冠毛素多肽。类似地，术语“未结合的斯钙素多肽”在本文中通常是指不与冠毛素相互作用的斯钙素多肽。在这一点上，不管冠毛素和/或斯钙素多肽中的任一个是否可具有任何其它相互作用伴侣。

冠毛素和斯钙素多肽

本发明人还已惊人地发现冠毛素和斯钙素多肽共价地和非共价地相互作用。因此，本发明的主要方面涉及相互作用的冠毛素和斯钙素多肽。

冠毛素多肽

冠毛素为蛋白水解酶，并且包括金属蛋白酶PAPP-A和PAPP-A2。PAPP-A特异性裂解IGF结合蛋白，例如IGFBP-4和IGFBP-5。IGFBP裂解片段对IGF的亲和力降低并且PAPP-A蛋白水解活性因此导致能够结合和活化IGF受体的生物活性IGF释放。IGF受体的活化触发导致例如细胞增殖的活化途径。

在本发明的上下文中，术语“冠毛素”意在包括PAPP-A和PAPP-A2多肽两者。该术语包括任何物种的冠毛素多肽，并因此涵盖任何哺乳动物冠毛素蛋白；即，与人PAPP-A和人PAPP-A2有同源性的任何多肽，其还特别包括小鼠PAPP-A和小鼠PAPP-A2。术语“冠毛素”还涵盖任何PAPP-A和PAPP-A2多肽的变体和片段。该术语涵盖多肽的单体和多聚体两种形式、同型和异型多聚体两种。具体地，冠毛素可形成PAPP-A或PAPP-A2或其片段或变体的同型二聚体，或PAPP-A和PAPP-A2或其片段或变体的冠毛素杂二聚体。

具体地，如本文中所用的术语“PAPP-A”和“PAPP-A2”意在分别涵盖任何种类的人PAPP-A和PAPP-A2，尤其是哺乳动物PAPP-A和PAPP-A2，例如小鼠或人PAPP-A和PAPP-A2的同源多肽，最优选人PAPP-A和PAPP-A2。

在本发明的方法、抗体、剂、组合物和多肽的一个优选实施方案中，冠毛素多肽为人冠毛素多肽或其片段或变体，具体地，冠毛素多肽选自

a.人PAPP-A(SEQIDNO:3)或人PAPP-A2(SEQIDNO:4)

b.与SEQIDNO:3和SEQIDNO:4中的任一个具有至少70％同一性的多肽变体，

c.a.和b.的任何多肽的多肽片段

d.由独立地选自a.-c.的任何多肽的两个多肽组成的二聚体。

因此，在一个优选实施方案中，冠毛素多肽为PAPP-A，例如人PAPP-A，并且在另一个优选实施方案中，冠毛素多肽为PAPP-A2，例如人PAPP-A2。冠毛素多肽的变体包括与PAPP-A(SEQIDNO:3)或PAPP-A2(SEQIDNO:4)中的任一个具有至少60％，例如至少65％，例如至少70％，例如至少75％，例如至少80，例如至少85％、86％、76％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％，例如至少96％、97％、98％或99％或99.5％同一性的变体。在一个优选实施方案中，变体与PAPP-A或PAPP-A2，例如人PAPP-A或PAPP-A2具有至少90％同一性，例如至少95％或至少98％同一性。

因此，冠毛素多肽包括全长PAPP-A和PAPP-A2多肽及其任何变体，以及所述全长PAPP-A和PAPP-A2多肽及其变体的任何片段。PAPP-A、PAPP-A2或其变体的片段通常包含以下或由以下组成：至少5个选自PAPP-A或PAPP-A2，例如人PAPP-A或PAPP-A2的连续氨基酸。片段可包含至少5个，例如至少25个，例如至少50个，例如至少75个，例如至少100个，例如至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少1100个、至少1200个、至少1300个或至少1400个，例如至少1500个选自PAPP-A、PAPP-A2或其变体的连续氨基酸。

此外，本发明的片段可包含少于1500个，例如少于1400个、少于1300个、少于1200个、少于1100个、少于1000个、少于900个、少于800个、少于700个、少于600个、少于500个、少于400个、少于300个、少于200个、少于100个、少于75个或少于50个，例如少于25个，例如少于10个选自PAPP-A、PAPP-A2或其变体的连续氨基酸。

本发明的冠毛素片段的优选长度取决于片段的特定用途。用于免疫的冠毛素片段不一定需要全长酶。然而，检测生物样品中的冠毛素多肽的方法通常旨在检测通常为全长的生物天然冠毛素。

优选地，PAPP-A和PAPP-A2的变体和/或片段为功能片段，尤其是能够裂解IGFBP，例如IGFBP4和/或IGFBP5的金属蛋白水解片段。

斯钙素多肽

斯钙素为糖蛋白，包括斯钙素1(STC1)和斯钙素2(STC2)。人STC1和STC2(hSTC1和hSTC2)是分别具有约30-35kDa和35-40kDa的亚基的同型二聚体糖蛋白。成熟STC1蛋白为247个氨基酸长，而STC2蛋白更长并且由302个氨基酸组成。新合成的STC的N端部分为疏水性并且对蛋白质分泌起到信号肽的作用。STC在各种各样的真核生物间保守。

STC的Blast搜索揭示，该蛋白质具有无可识别蛋白质基序的独特氨基酸序列，并且因此不可能根据STC的序列预测其生化功能。此外，对于指定物种而言STC2的氨基酸序列与STC1小于30％相同。然而，在STC1和STC2之间存在一定程度的序列同源性，包括糖基化位点的保守。另外，在STC1中发现的11个半胱氨酸残基似乎全部在STC2中保守。此外，外显子-内含子边界在STC间保守，表明来自共同祖先基因的起源。其中10个保守STC半胱氨酸残基形成分子内二硫桥，而第11个形成连接STC同型或杂二聚体的亚基的分子间二硫键。STC2总共具有14个半胱氨酸残基，并且与STC1相比，人STC2具有含有能够配位二价金属离子的组氨酸簇(HHxxxxHH)的伸长C端。

在本发明的上下文中，术语“斯钙素”或“STC”意在包括斯钙素1(STC1)和斯钙素2(STC2)多肽两者。该术语包括任何物种的斯钙素多肽，并且因此涵盖任何哺乳动物斯钙素蛋白；即与人STC1和人STC2具有同源性的任何斯钙素多肽，其还特别包括小鼠STC1和小鼠STC2。术语“斯钙素”或“STC”还涵盖任何STC1和STC2多肽的变体和片段。该术语涵盖多肽的单体和多聚体两种形式、同型和异型多聚体两种。具体地，冠毛素可形成STC1的同型二聚体和/或STC2或其片段或变体的二聚体，或STC1和STC2或其片段或变体的斯钙素杂二聚体。

具体地，如本文中所用的术语“STC1”和“STC2”意在分别涵盖任何种类的人STC1和STC2，尤其是哺乳动物STC1和STC2，例如小鼠或人STC1和STC2的同源多肽，最优选人STC1和STC2。

在本发明的方法、抗体、剂、组合物和多肽的一个优选实施方案中，斯钙素多肽为人斯钙素或其片段或变体，具体地，在本发明的方法、抗体、剂、组合物和多肽的斯钙素多肽选自

a.人斯钙素1(SEQIDNO:1)和/或人斯钙素2(SEQIDNO:2)，

b.与SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中的任一个具有至少70％同一性的多肽变体，和

c.a.和b的任何多肽的多肽片段及

d.由独立地选自a.-c.的任何多肽的两个多肽组成的二聚体。

因此，在一个优选实施方案中，斯钙素多肽为STC1，并且在另一个优选实施方案中，斯钙素多肽为STC2。斯钙素多肽的变体包括与STC1(SEQIDNO:1)或STC2(SEQIDNO:2)中的任一个具有至少70％，例如至少75％，例如至少80，例如至少85％、86％、76％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％，例如至少96％、97％、98％或99％或99.5％同一性的变体。在一个优选实施方案中，变体与STC1或STC2，例如人STC1或STC2具有至少90％同一性，例如至少95％或至少98％同一性。

因此，斯钙素多肽包括全长STC1和STC2多肽，例如人STC1或STC2，及其任何变体，以及所述全长STC1和STC2多肽及其变体的任何片段。STC1、STC2或其变体的片段通常包含以下或由以下组成：至少5个选自STC1或STC2的连续氨基酸。片段可包含至少5个，例如至少15个，例如至少20个，例如至少25个，例如至少30个，例如至少40个，例如至少50个，例如至少60个，例如至少70个，例如至少80个，例如至少90个，例如至少100个，例如至少110个，例如至少120个，例如至少130个，例如至少140个，例如至少150个，例如至少160个，例如至少170个，例如至少180个，例如至少190个，例如至少200个选自STC1、STC2或其变体的连续氨基酸。

此外，本发明的片段可包含少于200个、少于190个、少于180个、少于170个、少于160个、少于150个、少于140个、少于130个、少于120个、少于110个、少于100个、少于90个或少于80个，例如少于70个，例如少于60个，例如少于50个，例如少于40个，例如少于30个，例如少于25个，例如少于20个，例如少于15个，例如少于10个选自STC1、STC2或其变体，例如人STC1或STC2或其变体的连续氨基酸。

本发明的斯钙素片段的优选长度取决于片段的特定用途。用于免疫的冠毛素片段不一定需要全长酶。然而，检测生物样品中的斯钙素多肽的方法通常旨在检测通常为全长的生物天然斯钙素。

在某个实施方案中，STC1和STC2的变体和/或片段为功能片段，尤其是能够与冠毛素相互作用的此类变体或片段。具体地，STC1变体和片段优选能够与PAPP-A非共价地相互作用，并且STC2变体和片段优选能够与PAPP-A形成共价复合物。

在一个优选实施方案中，STC多肽为STC2的多肽片段，其至少包含C120，即与半胱氨酸-120相对应的氨基酸残基。

冠毛素-斯钙素相互作用物

冠毛素和斯钙素多肽非共价地和共价地相互作用。一方面，本发明涉及与至少一个斯钙素多肽相互作用的冠毛素多肽。在一个实施方案中，相互作用物为非共价相互作用物。然而，在另一个实施方案中，相互作用物为冠毛素多肽和斯钙素多肽之间的共价复合物。在一个优选实施方案中，提供了PAPP-A或PAPP-A2和斯钙素1之间的非共价相互作用物，即本发明提供了与STC1多肽非共价地相互作用的PAPP-A或PAPP-A2多肽。在另一个优选实施方案中，提供了PAPP-A或PAPP-A2和STC2之间的共价复合物。

相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的检测

斯钙素与冠毛素的相互作用抑制冠毛素的活性，尤其是对IGFPB，例如IGFPB4的蛋白水解活性。鉴于斯钙素对冠毛素活性的这种调节功能，检测相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的方法通常令人感兴趣。

因此，本发明一方面提供了一种检测样品中冠毛素多肽和斯钙素多肽之间的相互作用物的方法。此类方法可使用对冠毛素多肽、斯钙素多肽和/或相互作用的冠毛素和斯钙素多肽有亲和力的检测剂。

抗体是特别适合的剂，因为可产生对特定蛋白质有特定活性的抗体，同时还易于检测。

因此，在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤

a.提供所述样品，

b.提供至少一种对所述冠毛素多肽和/或所述斯钙素多肽和/或相互作用的冠毛素和斯钙素多肽有亲和力的抗体，

d.去除过量未结合的样品，并且

f.检测和量化c.和/或e.的未结合抗体的量。

因此，在一个实施方案中，提供了对相互作用的冠毛素和斯钙素多肽具有特定活性的抗体；即此类抗体对单独的冠毛素和斯钙素多肽没有或有很少活性，并且对相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，非共价相互作用多肽和/或包含冠毛素和斯钙素多肽或由冠毛素和斯钙素多肽组成的共价复合物两者具有高亲和力。如本文其它地方所述，此类抗体也为本发明所涵盖，并且在一个优选实施方案中，本发明的此类抗体用于本发明的检测方法中。

在另一个实施方案中，检测相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的方法采用至少两种不同抗体，其中一种抗体对冠毛素和斯钙素多肽之一具有亲和力而另一种抗体对所述冠毛素和斯钙素多肽中的另一个具有亲和力，例如一种抗体对冠毛素具有亲和力而另一种抗体对斯钙素具有亲和力或反之亦然。第一种抗体在ELISA测定中可为捕捉抗体，而第二种抗体为检测抗体。

因此，在一个实施方案中，提供了一种检测方法，所述方法包括以下步骤

a.提供所述样品，

b.将所述样品暴露于对所述冠毛素或斯钙素多肽之一有亲和力的捕捉抗体，使所述捕捉抗体结合所述多肽，

c.将所述样品暴露于对所述冠毛素或斯钙素多肽中的另一个有亲和力的检测抗体，

d.将抗体-冠毛素-斯钙素复合物暴露于针对所述捕捉或检测抗体之一的另一种抗体；并且

e.检测和量化结合的检测抗体和/或另一种抗体的量。

在一个优选实施方案中，相互作用的冠毛素和斯钙素多肽是PAPP-A和斯钙素1之间的非共价相互作用物和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价复合物。在另一个优选实施方案中，相互作用的冠毛素和斯钙素多肽是PAPP-A2和斯钙素1之间的非共价相互作用物和/或PAPP-A2和斯钙素2之间的共价复合物。

样品的选择取决于使用所述方法的环境。如果所述方法用于临床病状的诊断，则样品可以是从哺乳动物受试者，例如人类获得的生物样品，例如血液样品或组织样品。然而，所述方法也可用于检测从细胞培养物分泌的相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的量。在这种情况下，样品可以是此类细胞培养物的培养基。

如本文其它地方所述，所述方法也可用于筛选能够调节(即刺激或防止)共价和/或非共价复合物的形成的剂。

冠毛素组合物

冠毛素与斯钙素形成稳定且丰富的共价和/或非共价相互作用物，并且因此，冠毛素的组合物通常包含一定量的与斯钙素共价复合和/或非共价地相互作用的冠毛素。因此，因为未知百分率的冠毛素受斯钙素多肽结合，作为分泌冠毛素获得的组合物中游离冠毛素的水平通常未知。因此一方面，本发明涉及包含冠毛素的组合物，其中所述组合物基本上无斯钙素。

另一方面本发明涉及一种生成包含冠毛素多肽的组合物的方法，其中所述组合物基本上无斯钙素多肽，所述方法包括从包含冠毛素的组合物中去除斯钙素。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤

a.提供包含冠毛素多肽的组合物，并且

b.去除斯钙素多肽。

斯钙素的去除可包括游离斯钙素多肽和/或与其它多肽相互作用的斯钙素多肽，尤其是与冠毛素多肽相互作用的斯钙素多肽两者的去除。优选从组合物中去除游离斯钙素多肽和复合/相互作用的斯钙素。

可通过本领域中技术人员可用的任何方法去除斯钙素。在一个实施方案中，通过亲和色谱法去除斯钙素多肽；然而其它方法也可用并且可由本领域中的技术人员应用。本发明包括监测PAPP-A及PAPP-A和斯钙素的复合物的分离，与用于分离的方法无关。所述监测包括通过本文所述的方法检测PAPP-A及PAPP-A和斯钙素的复合物。本发明还包括通过所述方法验证分离。

在一个实施方案中，包含冠毛素多肽的组合物通过以下步骤生成

a.培养表达冠毛素的细胞系足够量的时间以生成冠毛素，

b.收集培养基，并且

c.从所述培养基中去除斯钙素多肽。

细胞系选自表达冠毛素的任何细胞系，优选地细胞系为人类细胞系，例如人癌细胞系。

重要的是，也可通过删除或破坏培养的细胞系中的一个或多个斯钙素基因去除斯钙素多肽。也可通过敲减，例如siRNA敲减，例如STC1和/或STC2的敲减去除斯钙素；优选地敲减、删除或破坏STC1和STC2。基因敲减、破坏和删除/敲除的技术在本领域中众所周知。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种生成包含冠毛素多肽的组合物的方法，其中所述组合物基本上无斯钙素多肽，所述方法包括

a.提供表达冠毛素的细胞系，

b.删除或破坏所述细胞系中编码斯钙素的基因和/或用靶向STC1和/或STC2的siRNA转染所述细胞系

c.培养所述细胞系足够量的时间以生成冠毛素，并且

d.收集培养基。

本发明在一个单独方面还涉及通过本发明的生成包含冠毛素多肽的组合物的方法可获得或已获得的组合物，其中所述组合物基本上无斯钙素多肽，所述方法如以上所定义。

冠毛素的量化

本发明的包含冠毛素的组合物，所述组合物基本上无斯钙素，在量化样品中冠毛素的水平/量的方法中特别有用。如果具有已知浓度的冠毛素，例如PAPP-A和/或PAPP-A2的参考材料可用，则仅可精确测定游离冠毛素的水平。本发明的组合物可用作此类参考或标准材料，因为这种组合物基本上无斯钙素，并且因此，仅包含未被斯钙素结合的冠毛素。

因此，一方面，本发明提供了一种量化样品中冠毛素的水平的方法，所述方法包括使用基本上无斯钙素的组合物作为标准品。该组合物优选为如上文所定义的本发明的冠毛素组合物。

所述方法可包括以下步骤

a.获得或提供样品，

b.提供包含已知浓度的冠毛素多肽的一种或多种参考组合物，所述一种或多种参考组合物基本上无斯钙素多肽，

c.测定所述样品和所述参考组合物中冠毛素多肽的水平，并且

d.将为所述样品测定的所述冠毛素多肽的水平与所述一种或多种参考组合物的水平相关联。

参考样品可包含不含冠毛素的阴性对照，和含任何水平的冠毛素，例如未结合的冠毛素，例如介于0.1ng/mL和1000ng/mL之间任何水平的冠毛素，例如约0.1ng/mL、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900和/或1000ng/mL冠毛素的附加样品。

冠毛素活性的调节

本发明广泛涉及斯钙素作为冠毛素调节剂的用途。本发明人已经发现斯钙素与冠毛素形成稳定的非共价相互作用物和/或共价复合物。具体而言，已经发现斯钙素与冠毛素的相互作用物用于抑制冠毛素的蛋白水解活性。因此，斯钙素起到冠毛素的抑制剂的作用。这意味着可经由调节斯钙素和冠毛素之间的相互作用物调节冠毛素的活性。例如，可通过提供斯钙素，从而促进冠毛素-斯钙素相互作用物的形成来提高冠毛素-斯钙素相互作用物的水平，并因此抑制冠毛素多肽的活性。

可选地，可通过提供能够拮抗冠毛素和斯钙素之间的相互作用物的剂降低冠毛素-斯钙素相互作用物的水平，从而提高有催化活性的未结合的冠毛素(未被斯钙素结合的冠毛素)；即，从而活化冠毛素多肽。

所以通常，冠毛素多肽的活性与斯钙素的水平负相关并且因此，冠毛素多肽的活性可通过提高斯钙素多肽的水平来降低，并通过降低斯钙素多肽的水平来提高。因此本发明的一个实施方案涉及一种降低或提高冠毛素多肽的活性的方法，其中

a.通过提高斯钙素多肽的水平来降低冠毛素多肽的活性，并且

b.通过降低斯钙素多肽的水平来提高冠毛素多肽的活性。

这种方法优选为体外方法，其中调节在样品中，例如在包含细胞培养物，例如表达一种或多种冠毛素多肽的细胞培养物的样品中的冠毛素活性。

在一个实施方案中，通过提高或降低在人类细胞，例如在人类干细胞中的斯钙素多肽的水平进行所述方法。如上文所提到的，斯钙素多肽可为源自任何物种的斯钙素多肽并且因此可为任何哺乳动物斯钙素多肽。在一个优选实施方案中，斯钙素多肽为人或小鼠STC1或STC2。所述方法可适用于提高或降低在哺乳动物受试者，例如人类中，例如在哺乳动物受试者(例如人类)的特定组织，例如癌组织中的斯钙素多肽的水平。

因此，一方面本发明涉及一种通过降低或提高相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的水平来降低或提高冠毛素多肽的活性的方法。

可通过为样品提供或施用能够降低或提高斯钙素多肽的水平的剂来提高或降低斯钙素多肽的水平和/或向包含所述冠毛素多肽的样品提供一定水平的相互作用的冠毛素和斯钙素多肽。剂的选择取决于意图是提高还是降低冠毛素的活性。

在一个实施方案中，提供了一种通过降低游离斯钙素多肽的水平来提高冠毛素多肽的活性的方法。在一个实施方案中，通过施用拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用的剂来提高冠毛素多肽的活性。

在本发明的提高冠毛素活性的方法中可以提供或施用能够以拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用的方式结合斯钙素的任何拮抗剂、多肽、抗体、适配体、小分子或任何其它剂。在所述方法中也可以提供或施用能够以拮抗冠毛素与斯钙素的相互作用的方式结合冠毛素，而不影响冠毛素活性的任何拮抗剂、多肽、抗体、适配体、小分子或任何其它剂。

例如，该剂可为斯钙素定向siRNA或抗体，例如能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的抗体。下文描述了用于本发明的方法中的特定剂。

在另一个实施方案中，提供了一种通过提供或施用斯钙素多肽抑制冠毛素多肽的活性的方法。

存在本领域中技术人员可用来提供斯钙素多肽的许多方法。在生物化学测定中，斯钙素多肽可在适合缓冲溶液中，例如作为重组蛋白而提供。在细胞系统中并且如果向哺乳动物受试者，例如人类施用斯钙素多肽，则斯钙素也可在适合缓冲溶液中作为斯钙多肽而提供或施用。可选地，可使用递送系统，其牵涉受适合载体，例如重组哺乳动物表达载体或病毒载体，例如逆转录病毒载体转染后的转基因表达。因此，可使用表达所述斯钙素多肽或其部分的核酸载体，例如使用逆转录病毒载体提供斯钙素多肽。

疗法

冠毛素，尤其是PAPP-A的活性已涉及许多临床病状，特别是牵涉调节增生过程的临床病状。本发明提供了预防、治疗或改善临床病状的方法，其中治疗牵涉冠毛素，例如PAPP-A的活化或冠毛素；例如PAPP-A的灭活。冠毛素的活化对于希望刺激细胞增殖的临床病状的治疗是恰当的，例如在骨重建或骨生长和/或伤口愈合中。冠毛素的灭活或抑制对于希望抑制细胞增殖的临床病状的治疗是恰当的；例如在癌症的治疗中。

因此，在本发明的一个方面，提供了一种预防、治疗或改善哺乳动物受试者，例如人类中的临床病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者，例如人类施用有效量的斯钙素多肽。如上文所提到的，斯钙素多肽可为源自任何物种的斯钙素多肽并且因此可为任何哺乳动物斯钙素多肽。在一个优选实施方案中，斯钙素多肽为人或小鼠STC1或STC2。通过提供有效量的斯钙素，可以抑制冠毛素多肽的活性。所述冠毛素多肽的活性受冠毛素多肽与至少一种斯钙素多肽的相互作用抑制，但是天然斯钙素多肽通常形成二聚体，并且因此，冠毛素常常受到与两个斯钙素二聚体的相互作用抑制。然而，斯钙素也可呈斯钙素单体形式使用。可通过有一个或多个半胱氨酸残基缺失，从而防止半胱氨酸残基的硫醇基之间形成二硫桥的斯钙素变体的重组表达生成斯钙素单体。在这种情况下，冠毛素将受到与斯钙素单体的相互作用，例如与两个斯钙素单体的相互作用抑制。

另一方面，提供了一种能够促进斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的用于药物中的剂或包含此类剂的药物组合物。如本文其它地方所述，此类剂可为能够结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的抗体。

这种方法和用途用于抑制增生过程，并且因此，所述方法优选适用于预防、治疗或改善增生性病症。优选增生过程与冠毛素表达相关，或与冠毛素表达增加相关。本文其它地方描述了测定冠毛素水平的方法。所述方法对于特征在于冠毛素水平提高的增生过程和临床病状特别恰当。所述方法对于与冠毛素介导的胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)的裂解相关的增生过程和/或增生性病症，尤其是与冠毛素介导的IGFBP4的裂解相关的此类增生过程和/或增生性病症也特别恰当。

在一个优选实施方案中，临床病状为癌症，尤其是特征在于冠毛素水平高，优选特征在于不与斯钙素多肽相互作用的冠毛素水平高的任何癌症类型。

在另一个优选实施方案中，临床病状为血管病，尤其是动脉粥样硬化或再狭窄。

在另一个优选实施方案中，临床病状为积液增加的病状，例如卵巢癌患者中的腹水产生。

在一个实施方案中，临床病状为选自以下的癌症：急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤(例如儿童小脑或儿童大脑)、基底细胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维性组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤(Burkitt'sLymphoma)、类癌瘤、原发灶不明的癌症、原发性中枢神经系统淋巴瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童期癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤(例如儿童室管膜瘤)、食道癌、尤文氏肿瘤家族(Ewing'sFamilyofTumors)、颅外生殖细胞瘤(例如儿童颅外生殖细胞瘤)、性腺外生殖细胞瘤、眼癌(眼内黑素瘤或视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠道类癌瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin'sLymphoma)、下咽癌、下丘脑和视通路胶质瘤(例如儿童下丘脑和视通路胶质瘤)、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤(Kaposi'sSarcoma)、肾(肾细胞)癌、喉癌、唇和口腔癌、肺癌(非小细胞或小细胞)、淋巴瘤(例如AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤)、巨球蛋白血症(例如沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom'sMacroglobulinemia))、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤(例如儿童成神经管细胞瘤)、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤(例如成人恶性间皮瘤或儿童间皮瘤)、原发灶隐匿的转移性颈部鳞状细胞癌、多发性内分泌肿瘤综合征(例如发生在儿童期)、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样霉菌病、骨髓发育异常综合征、骨髓发育异常/骨髓增生性疾病、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、慢性骨髓增生性病症、鼻腔及副鼻窦癌、鼻咽癌、鼻咽癌(例如儿童鼻咽癌)、神经母细胞瘤、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌(例如儿童卵巢癌)、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、胰腺癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、胸膜肺胚细胞瘤、前列腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(例如儿童横纹肌肉瘤)、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、软组织肉瘤(例如儿童软组织肉瘤)、子宫肉瘤、塞泽里综合征(SezarySyndrome)、皮肤癌(例如非黑素瘤皮肤癌)、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、幕上原始神经外胚层肿瘤(例如发生在儿童期)、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、滋养细胞肿瘤(例如妊娠滋养细胞肿瘤)、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑胶质瘤(例如视通路和下丘脑胶质瘤)、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症或威尔姆氏肿瘤(Wilms'Tumor)。

在一个优选实施方案中，癌症选自卵巢癌、睾丸癌、肺癌或消化系统的任何癌症，包括室性癌、结肠癌、小肠癌和直肠癌，尤其，癌症选自卵巢癌、肺癌和结肠癌。在一个优选实施方案中，癌症为卵巢癌。其它优选的临床病状包括再狭窄、动脉粥样硬化、排卵、纤维化以及与人类生殖有关的临床病状。

在预防、治疗或改善哺乳动物受试者，例如人类中的临床病状的方法中，所述方法包括向所述哺乳动物受试者，例如人类施用有效量的斯钙素多肽，斯钙素多肽可通过本领域中技术人员可用的任何适合的方法施用。

在一个优选实施方案中，斯钙素多肽在适于治疗用的适合缓冲溶液中作为斯钙素多肽施用。可选地，可使用递送系统，其牵涉受适合载体，例如重组哺乳动物表达载体或病毒载体，例如逆转录病毒载体转染后的转基因表达。因此，可使用表达所述斯钙素多肽或其部分的核酸载体，例如使用逆转录病毒载体提供斯钙素多肽。

重要的是，本发明还提供了治疗希望细胞增殖增加的临床病状的方法。在此类方法中，通过抑制冠毛素和斯钙素之间的相互作用而活化冠毛素。这产生更多对例如IGFBP(例如IGFBP4)有蛋白水解活性，刺激IGF系统的未结合冠毛素。

因此，一方面，本发明关于一种预防、治疗或改善哺乳动物受试者，例如人类中的临床病状的方法中，所述方法包括向所述哺乳动物受试者，例如人类施用有效量的能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂。通过提供此类剂，拮抗斯钙素和冠毛素多肽之间的相互作用，并且抑制斯钙素免于抑制冠毛素。这种方法可适用于刺激增生过程，并且因此，所述方法可适用于临床病状例如骨折(其中治疗为骨重建和/或骨生长)，和伤口(其中治疗或改善为伤口愈合)。因此，在一个优选实施方案中，能够降低斯钙素多肽的水平的剂用于伤口愈合和/或骨重建或骨生长中。

再一方面，提供了一种能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的用于药物中的剂或包含此类剂的药物组合物。

可通过提供能够拮抗冠毛素和斯钙素之间的相互作用的任何剂抑制冠毛素和斯钙素多肽之间的相互作用。此类剂包括，例如能够以拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用的方式结合斯钙素的任何拮抗剂、多肽、抗体、适配体、小分子或任何其它剂。在本发明的方法中也可以提供或施用能够以拮抗冠毛素与斯钙素的相互作用的方式结合冠毛素，而不影响冠毛素活性的任何拮抗剂、多肽、抗体、适配体、小分子或任何其它剂。

在一个优选实施方案中，通过提供抑制斯钙素与冠毛素的相互作用的抗体，例如封闭性抗体拮抗斯钙素和冠毛素多肽之间的相互作用。

在本文中本发明的临床剂，例如siRNA、抗体和多肽可通过本领域中可用的任何适合的方法施用。如下所述，主要施用途径为肠胃外注射、口服和局部。也考虑到了对于将药物递送至靶位点或将药物引入血流中有效的其它药物施用方法，例如皮下注射。此外，鼻内施用和通过肺部吸入施用是可以使用的方便且有效的施用方法。

临床剂可例如作为口服片剂，口服施用。这是一种方便的非侵入性施用方式，也为大多数患者所优选。这种施用可用于易于经由胃肠道吸收的剂。

然而，在一个更优选的实施方案中，临床剂可经肠胃外施用。这在剂与需要肠胃外注射的附加剂组合施用时也可能是恰当的。因此，在本发明的一个实施方案中，本文提供的临床剂经肠胃外施用，即通过静脉内、肌肉内、皮下、鼻内、直肠内、阴道内或腹腔内施用。通常优选静脉形式的肠胃外施用。此类施用的适当剂型也可通过常规技术制备。临床剂也可通过吸入施用，即通过鼻内和口腔吸入施用。在一个优选实施方案中，本发明的临床剂通过静脉、皮下和/或肌肉内施用而递送。

剂量

剂量需求将随采用的特定临床剂、施用方法和治疗的特定个体而改变。理论上，通过本发明治疗的个体将接受最大耐受剂量内的药学有效量的临床剂，通常不高于在产生抗药性之前需要的剂量。

本发明的方法和用途规定按有效量施用临床剂，例如siRNA、抗体或肽。本文的“有效量”意指因其施用而产生疗效的剂量。确切剂量将取决于待治疗的临床病状或病症，并且可由本领域中的技术人员使用已知技术确定。例如，可按1μg/kg至约100mg/kg/日的量向人施用本发明的抗体或肽。另外，如本领域中所知，对于年龄以及体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用、施用途径和形式及临床病状的严重程度的调整可能是必需的，并且将可由本领域中的技术人员经常规实验确定。

可在5μg至约20g/日的剂量范围内施用本发明的抗体或多肽。在一个实施方案中，抗体或多肽的适合剂量范围通常为每天1-500mg，优选每天1-100mg、每天70-200mg、每天70-150mg且最优选每天1-30mg、每天30-70mg、每天40-60mg、每天45-55mg或每天约50mg。在另一个实施方案中，抗体或多肽的适合剂量为每天5-10mg/kg体重或10-20mg/kg体重，或甚至20-25mg/kg体重或25-30mg/kg体重或30-40mg/kg体重或40-50mg/kg体重或50-60mg/kg。

如本文其它地方所定义的临床剂，例如siRNA、抗体或多肽优选至少每天施用一次，并且因此可每天施用一次或两次。如本文其它地方所提到的，该剂量的临床剂优选经肠胃外施用，例如通过静脉注射。

冠毛素活性的调节剂

本发明的方法采用能够通过影响与斯钙素多肽相互作用的冠毛素多肽的水平来提高或降低冠毛素的活性的不同调节剂。在如本文其它地方所述的方法中这样采用的剂在下一段落中有定义。此类剂为例如斯钙素多肽或其部分、靶向斯钙素的siRNA或本发明的抗体。

本发明在一个特定方面涉及此类调节剂。一方面本发明提供了能够提高或降低斯钙素多肽水平的剂。

能够提高斯钙素多肽水平的剂。

一方面涉及能够提高斯钙素多肽水平的剂。能够提高斯钙素多肽水平的剂包括用于提高关于斯钙素的表达、稳定性、降解抗性等的任何剂。另一方面，该剂为斯钙素多肽，例如STC1、STC2或其能够与冠毛素相互作用的变体或片段。在一个优选实施方案中，斯钙素多肽为STC1或STC2，例如人STC1或STC2。

在一个优选实施方案中，能够降低斯钙素多肽水平的剂用于治疗再狭窄、动脉粥样硬化、排卵、纤维化或癌症，例如卵巢癌、睾丸癌、肺癌或消化系统的任何癌症，包括室性癌、结肠癌、小肠癌和直肠癌。

能够降低斯钙素多肽水平的剂。

另一方面，本发明涉及一种能够降低斯钙素多肽水平的剂。此类剂包括抑制斯钙素的表达和/或稳定性的任何剂。

在一个实施方案中，能够降低斯钙素多肽水平的剂为靶向斯钙素，例如STC1和/或STC2的siRNA。设计siRNA的方法在本领域中众所周知。在一个优选实施方案中，siRNA包含以下或由以下组成：选自STC1或STC2基因，例如用SEQIDNO:5标识的人STC1基因或用SEQIDNO:6标识的人STC2基因的至少5个，例如至少10个，例如至少15个，例如至少20个连续核苷酸的序列。优选地，siRNA包含以下或由以下组成：选自STC1或STC2基因，例如用SEQIDNO:5标识的人STC1基因或用SEQIDNO:6标识的人STC2基因的5-30个，例如10-25个，优选18-22个连续核苷酸的序列。然而，可以使用任何干扰核酸种类。

能够拮抗冠毛素-斯钙素相互作用的剂。

另一方面，本发明涉及一种能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂。此类剂包括抑制斯钙素的表达和/或稳定性的任何剂。

在一个优选实施方案中，能够降低斯钙素多肽的水平和/或能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂用于伤口愈合和/或骨重建或骨生长中。

能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂可选自能够以拮抗斯钙素多肽与冠毛素的相互作用的方式结合斯钙素多肽的任何拮抗剂、多肽、抗体、适配体、小分子或任何其它剂。能够以拮抗冠毛素与斯钙素的相互作用的方式结合冠毛素，而不影响冠毛素活性，或至少不显著地影响冠毛素多肽活性的任何拮抗剂、多肽、抗体、适配体、小分子或任何其它剂也是恰当剂。

在一个实施方案中，所述剂为如下文所述的抗体。

抗体

在一个优选实施方案中，能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂是针对斯钙素多肽的抗体，例如以拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的方式特异性结合斯钙素多肽的抗体。所述抗体优选针对STC1或STC2，例如人STC1或STC2。然而，靶向STC1和STC2两者的抗体也适用。本发明人已经鉴定STC2的C120涉及STC2与冠毛素的共价结合。因此，在一个优选实施方案中，能够拮抗STC和冠毛素之间的相互作用的抗体针对包含STC2的C120残基的一种或多种肽。例如，抗体对选自介于STC2的氨基酸残基60和180之间的区域，例如介于STC2的氨基酸残基70和170之间的区域，例如介于STC2的氨基酸残基80和160之间的区域，例如介于STC2的氨基酸残基90和150之间的区域，例如介于STC2的氨基酸残基100和140之间的区域，例如介于STC2的氨基酸残基110和130之间的区域，例如介于STC2的氨基酸残基115和130之间的区域，例如介于STC2的氨基酸残基119和125之间的区域的3-15个氨基酸的片段有特异性。

可通过本发明的方法检验候选抗体特异性靶向斯钙素并拮抗其与冠毛素多肽的相互作用的能力。

靶向冠毛素多肽的抗体也可为拮抗冠毛素和斯钙素多肽之间的相互作用的恰当剂。因此，在另一个实施方案中，能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂为针对冠毛素多肽的抗体，所述抗体能够以拮抗冠毛素与斯钙素的相互作用的方式结合冠毛素，而不影响冠毛素活性，或至少不显著地影响冠毛素活性。

在本发明的一个方面，提供了能够特异性结合相互作用的斯钙素和冠毛素多肽的剂。在这个方面，提供了能够例如通过结合冠毛素多肽和/或斯钙素多肽，促进斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂。冠毛素和斯钙素可共价地和/或非共价地相互作用。例如，PAPP-A和斯钙素1非共价地相互作用而PAPP-A和斯钙素2形成共价复合物。因此，本发明的抗体能够特异性结合相互作用的斯钙素和冠毛素多肽，例如PAPP-A和斯钙素1之间的非共价相互作用物和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价复合物。该抗体可同时结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽两者；然而，可选地，该抗体可识别冠毛素或斯钙素多肽的特定构象，当多肽相互作用时，观察到所述构象。

不管抗体的确切靶标如何，优选抗体对相互作用的冠毛素和斯钙素多肽具有比单独的冠毛素或斯钙素更高的亲和力。

可通过常规方法通过动物的免疫产生本发明的抗体。此类方法也在本发明的范围之内，由免疫产生的抗体的选择也一样。

一方面，本发明涉及一种生成对相互作用的冠毛素和斯钙素多肽有特异性的抗体的方法，所述方法包括

a.提供动物，例如小鼠

b.用相互作用的冠毛素和斯钙素多肽免疫所述动物，并且

c.从所述动物获得抗体。

更具体地，可在包括以下步骤的方法中生成抗体

a.提供动物

b.提供相互作用的冠毛素和斯钙素多肽

c.向所述动物施用步骤b.的所述相互作用多肽

d.饲养所述动物足够时间以生成抗体

e.从所述动物获得样品，并且

f.从所述样品获得抗体。

用于免疫的冠毛素和斯钙素多肽可共价地或非共价地相互作用，并且在一个实施方案中，相互作用物为PAPP-A或PAPP-A2和STC1之间的非共价相互作用物和/或PAPP-A或PAPP-A2和STC2之间的共价复合物。

重组冠毛素和/或STC多肽可用于生成抗体。可使用标准技术生成与冠毛素和/或STC有反应性的单克隆抗体。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种生成对相互作用的冠毛素和斯钙素多肽有特异性的单克隆抗体的方法，所述方法包括以下步骤

a.提供动物

b.提供相互作用的冠毛素和斯钙素多肽

c.向所述动物施用步骤b.的所述相互作用多肽

d.饲养所述动物足够时间以生成抗体

e.从所述动物获得组织样品，例如脾脏样品，并且

f.分离所述组织样品的产抗体细胞，

g.通过步骤f.的所述分离细胞与适合细胞系的融合生成产抗体杂交瘤细胞

h.分离表达所述单克隆抗体的杂交瘤细胞。

如本文所用的单特异性抗体定义为对冠毛素和/或STC具有特异性结合特征的单一抗体种类或多抗体种类。如本文所用的特异性结合是指所述抗体种类与特异性抗原或表位，例如与冠毛素和/或STC相关的抗原或表位，例如STC对冠毛素的结合位点或冠毛素对STC的结合位点结合的能力。通常可通过用适当浓度的有或无免疫佐剂的冠毛素和/或STC抗原免疫动物例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、马等，优选兔或小鼠，产生冠毛素和/或STC特异性抗体。例如，对冠毛素和/或STC有特异性的抗体可用于纯化天然和重组冠毛素和/或STC，用作实验室试剂和用于基于抗体的诊断剂盒中。

可通过常规方法，例如通过用冠毛素和/或STC多肽/抗原免疫近交系小鼠制备与冠毛素和/或STC有反应性的单克隆抗体(mAb)。用约0.1mg至约10mg，优选约1mg在约0.5ml并入等体积的可接受的佐剂中的缓冲液或盐水中的冠毛素和/或STC多肽/抗原免疫小鼠。优选弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant)。小鼠在第0天接受初次免疫并且保持约3至约30周。可通过静脉(IV)途径给予免疫小鼠一次或多次约0.1至约10mg于缓冲溶液例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的冠毛素和/或STC多肽/抗原的加强免疫。通过本领域中已知的标准程序从免疫小鼠中取出脾脏获得来自抗体阳性小鼠的淋巴细胞。通过在将允许稳定杂交瘤形成的条件下使脾淋巴细胞与适当融合伴侣混合生成杂交瘤细胞。通过本领域中已知的程序通过在次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷和氨基蝶呤补充的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModifiedEaglesMedium)(DMEM)中生长选择融合杂交瘤细胞。在约14、18和21天从生长阳性孔收集上清液并且使用冠毛素和/或STC作为抗原通过免疫测定法例如固相免疫放射性测定法(SPIRA)筛选抗体生成。还在Ouchterlony沉淀测定中试验培养液以确定mAb的同种型。然后克隆来自于抗体阳性孔的杂交瘤细胞。

通过使杂交瘤在培养基中生长进行抗冠毛素或抗体STC的体外生成以获得足够量的特异性mAb。通过本领域中已知的技术纯化mAb。

通过各种血清或免疫测定法，包括但不限于沉淀、被动凝集、酶联免疫吸附抗体(ELISA)技术测定腹水或杂交瘤培养液的抗体滴度。

也可从噬菌体抗体库分离“单克隆抗体”。已鉴定的噬菌体抗体可通过在细菌中表达而生成。

方法例如以上所述的方法可用于生成对冠毛素和/或STC多肽片段或全长新生冠毛素和/或STC多肽有特异性的单特异性抗体。

可通过将抗体添加到凝胶载体，例如Affigel-10(Biorad)，经N-羟基琥珀酰亚胺酯预先活化的凝胶载体上，使得抗体与琼脂糖凝胶珠粒载体形成共价连接而制成冠毛素和/或STC抗体亲和柱。然后抗体经由与间隔臂的酰胺键与凝胶耦合。然后用1M乙醇胺HCl(pH8)猝灭剩余活化酯。用水，接着用0.23M甘氨酸HCl(pH2.6)洗柱以去除任何未偶联的抗体或外来蛋白。然后在磷酸盐缓冲盐水(pH7.3)中使该柱平衡并且使含冠毛素和/或STC或冠毛素和/或STC片段的细胞培养上清液或细胞提取物缓慢地通过该柱。然后洗涤该柱，并洗脱蛋白质。然后用磷酸盐缓冲盐水透析纯化的冠毛素和/或STC蛋白。

也可通过使用抗体亲和柱纯化来自于诸如人血浆或血清、组织提取物或来自于非转染细胞系(其内源性分泌STC)的培养基的来源的天然冠毛素和/或STC。

使用抗冠毛素和/或STC的多克隆或单克隆抗体，可构建许多测定法用于测量体液或组织和细胞提取物中的冠毛素和/或STC抗原并且尤其是相互作用的冠毛素和STC多肽。基于抗体的试剂盒可用于诊断目的。测定法包括但不限于沉淀、被动凝集、酶联免疫吸附测定(ELISA)技术和放射性免疫测定(RIA)技术。

例如，使用ELISA，可以构建夹心测定法，其中样品中存在的抗原被固定的单克隆或多克隆抗(STC)捕捉。然后通过使用一种或多种单克隆冠毛素抗体和过氧化物酶偶联抗(鼠IgG)进行检测。在另一种测定法中，样品中存在的抗原被固定的单克隆或多克隆抗(冠毛素)捕捉，并且使用生物素化多克隆抗(STC)检测。

也可构建ELISA夹心测定法，其中样品中存在的任何抗原均被固定单克隆抗体捕捉。然后通过使用偶联单克隆抗体，例如生物素化抗体进行检测。因此，在另一个实施方案中，通过使样品与特异性结合冠毛素和斯钙素的共价和/或非共价复合物的单克隆抗体接触检测相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，接着通过使冠毛素/斯钙素-抗体复合物与偶联单克隆抗体，例如生物素化抗体接触而检测。

可使用纯化冠毛素和/或STC，尤其是使用包含已知浓度的未结合冠毛素或已知浓度的相互作用的冠毛素和STC多肽的组合物校准测定法。此类校准可涉及通过连续稀释构建标准曲线。

多克隆和/或单克隆抗体可用于抑制STC与冠毛素的相互作用，然而，在一个优选实施方案中，使用单克隆抗体。此类抗体本文也称为封闭性抗体。具体而言，此类抗体可用于抑制PAPP-A和STC1之间的非共价相互作用和/或包含PAPP-A和STC2或由PAPP-A和STC2组成的共价复合物的形成，和/或PAPP-A2和STC1之间的非共价相互作用和/或包含PAPP-A2和STC2或由PAPP-A2和STC2组成共价复合物的形成。

某些单克隆抗体对STC与冠毛素的相互作用也可能有抑制性。此类单克隆抗体很可能识别对冠毛素的结合位点中的表位，但是抑制活性也可基于与相邻表位的结合。可通过用冠毛素和/或STC多肽或其片段免疫获得抑制性单克隆抗体。

因为STC与冠毛素的相互作用抑制冠毛素介导的IGF-BP，例如IGF-BP4的裂解，所以能够抑制STC与冠毛素结合的抗体，也用于活化或促进冠毛素介导的IGF-BP4的裂解，然后这导致IGF受体的活化。已知IGF受体的活化涉及细胞增殖并且还已知与动脉粥样硬化斑块相关。

对冠毛素和STC之间的相互作用有抑制性的抗体在希望提高冠毛素活性的临床病状中具有治疗价值。此类病状包括例如上文所述的伤口愈合和骨重建。

确定临床病状的方法

许多病症与冠毛素或斯钙素的表达改变相关，尤其是某些癌症形式。因此，本发明一方面关于一种确定临床病状的方法，所述方法包括检测相互作用的冠毛素和斯钙素多肽。

在一个实施方案中，所述方法包括检测与斯钙素多肽相互作用的冠毛素多肽。然而，在另一个实施方案中，检测与冠毛素多肽相互作用的斯钙素多肽。

在诊断方法中可检测任何特定冠毛素/斯钙素相互作用物。相互作用物可包括非共价相互作用物和共价复合物两者。在一个实施方案中，相互作用物为PAPP-A和STC1和/或STC2之间的非共价相互作用物。在另一个实施方案中，相互作用物为PAPP-A2和STC1和/或STC2之间的非共价相互作用物。再一个实施方案中，相互作用物为PAPP-A和STC1和/或STC2之间的共价复合物；并且又一个实施方案中，相互作用物为PAPP-A2和STC1和/或STC2之间的共价复合物。在一个优选实施方案中，相互作用物为PAPP-A和斯钙素1之间的非共价相互作用物。在另一个实施方案中，PAPP-A和斯钙素2之间的共价复合物。

诊断方法可用于确定任何相关临床病状；尤其是与冠毛素和/或斯钙素相关的此类病状。

在一个实施方案中，临床病状为癌症。在一个实施方案中，临床病状为选自以下的癌症：急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤(例如儿童小脑或儿童大脑)、基底细胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维性组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发灶不明的癌症、原发性中枢神经系统淋巴瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童期癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤(例如儿童室管膜瘤)、食道癌、尤文氏肿瘤家族、颅外生殖细胞瘤(例如儿童颅外生殖细胞瘤)、性腺外生殖细胞瘤、眼癌(眼内黑素瘤或视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠道类癌瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视通路胶质瘤(例如儿童下丘脑和视通路胶质瘤)、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾(肾细胞)癌、喉癌、唇和口腔癌、肺癌(非小细胞或小细胞)、淋巴瘤(例如AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤)、巨球蛋白血症(例如沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症)、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤(例如儿童成神经管细胞瘤)、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤(例如成人恶性间皮瘤或儿童间皮瘤)、原发灶隐匿的转移性颈部鳞状细胞癌、多发性内分泌肿瘤综合征(例如发生在儿童期)、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样霉菌病、骨髓发育异常综合征、骨髓发育异常/骨髓增生性疾病、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、慢性骨髓增生性病症、鼻腔及副鼻窦癌、鼻咽癌、鼻咽癌(例如儿童鼻咽癌)、神经母细胞瘤、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌(例如儿童卵巢癌)、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、胰腺癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、胸膜肺胚细胞瘤、前列腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(例如儿童横纹肌肉瘤)、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、软组织肉瘤(例如儿童软组织肉瘤)、子宫肉瘤、塞泽里综合征、皮肤癌(例如非黑素瘤皮肤癌)、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、幕上原始神经外胚层肿瘤(例如发生在儿童期)、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、滋养细胞肿瘤(例如妊娠滋养细胞肿瘤)、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑胶质瘤(例如视通路和下丘脑胶质瘤)、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症或威尔姆氏肿瘤。

在本发明的诊断方法中，可使用任何适合方法，尤其是如本文其它地方所定义的本发明的任何方法检测相互作用的冠毛素和斯钙素多肽。在一个实施方案中，使用至少一种抗体检测冠毛素和斯钙素之间的相互作用。优选地在固相免疫测定法，例如ELISA中使用两种不同抗体检测相互作用。例如，可使用冠毛素特异性抗体和/或斯钙素特异性抗体检测相互作用。例如，冠毛素特异性抗体可用作捕捉抗体，然后斯钙素特异性抗体可用作检测抗体。自然地，抗体的功能可互换，并且斯钙素特异性抗体可用作捕捉抗体并且冠毛素特异性抗体可用作检测抗体。

筛选方法

本发明的主要方面涉及相互作用的冠毛素和斯钙素多肽。此类相互作用肽在也在本发明范围之内的许多不同应用中有用。因此，本发明的某些方面涉及在鉴定可用于检测和/或调节相互作用的冠毛素和斯钙素多肽；尤其是检测和/或调节PAPP-A和斯钙素1之间的非共价相互作用物和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价复合物的特定剂的方法中冠毛素/斯钙素相互作用物或复合物的用途。

相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的潜在检测及或调节/调控剂可包括许多相关剂，例如具有治疗潜力的任何剂。在一个实施方案中，该剂为抗体，例如针对冠毛素或斯钙素多肽或其部分的抗体。

拮抗剂

一方面，提供了一种鉴定能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂的方法。

如本文中关于斯钙素和冠毛素之间的相互作用而使用的术语“拮抗”通常是指所述剂抑制冠毛素和斯钙素之间的相互作用的能力。

本发明的方法包括以下步骤

a.提供冠毛素多肽和斯钙素多肽，

b.提供所述剂，

c.用所述冠毛素和斯钙素多肽孵育所述剂，

d.检测相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的存在或缺乏，

e.根据在步骤d.中检测的相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的存在或缺乏确定所述剂是否能够拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用。

在这种方法的一个优选实施方案中

a.相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的缺乏表明所述剂能够拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用，并且

b.相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的存在表明所述剂不能够拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用。

例如可筛选一些冠毛素定向剂，例如抗冠毛素抗体，以拮抗冠毛素与斯钙素的相互作用方式结合冠毛素的能力。可选地，可筛选一些斯钙素定向剂，例如抗斯钙素抗体，以拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用方式结合斯钙素的能力。

特异性结合剂

另一方面，提供了一种鉴定能够结合以下的剂的方法

a.相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，

c.不与斯钙素多肽相互作用的冠毛素多肽，

d.不与冠毛素多肽相互作用的斯钙素多肽，

所述方法包括

i.提供所述剂，

ii.使所述剂与不与冠毛素相互作用的斯钙素多肽；和/或不与斯钙素相互作用的冠毛素多肽；和/或相互作用的冠毛素和斯钙素多肽接触，

iii.确定该剂是否结合所述不与冠毛素相互作用的斯钙素多肽；和/或不与斯钙素相互作用的冠毛素多肽；和/或相互作用的冠毛素和斯钙素多肽中的一种或多种。

在这种方法的一个实施方案中，通过一种方法鉴定能够结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂，所述方法包括

a.提供所述剂，

b.使所述剂与相互作用的冠毛素和斯钙素多肽接触，

c.确定该剂是否结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，并且

d.选择结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂。

在这种方法的另一个实施方案中，通过一种方法鉴定能够结合冠毛素或斯钙素多肽的多肽区的剂，所述区域并非相互作用的冠毛素和斯钙素多肽中暴露的表面，所述方法包括

a.提供所述剂，

c.确定该剂是否结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽和/或未结合的冠毛素多肽和/或斯钙素多肽，并且

在该方法的另一个实施方案中，通过一种方法鉴定能够结合未结合的冠毛素多肽(即不与斯钙素多肽相互作用的冠毛素)的剂，其中所述剂在包含斯钙素结合位点的区域内结合冠毛素，所述方法包括

a.提供所述剂，

b.使所述剂与未结合的冠毛素多肽接触，

c.确定该剂是否结合未结合的冠毛素多肽而不结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，并且

d.选择结合未结合的冠毛素多肽而不结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂

在该方法的另一个实施方案中，通过一种方法鉴定能够结合未结合的斯钙素多肽(即不与冠毛素多肽相互作用的斯钙素)的剂，所述方法包括

a.提供所述剂，

b.使所述剂与未结合的斯钙素多肽和相互作用的冠毛素和斯钙素多肽接触，

c.确定该剂是否结合斯钙素多肽和相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，并且

d.选择结合未结合的斯钙素多肽而不结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂。

例如，可对剂库，例如特异性结合冠毛素和/或斯钙素的抗体，筛选其选择性结合相互作用的冠毛素/斯钙素多肽，而不结合非相互作用的冠毛素或斯钙素多肽的能力

实施例

实施例1

材料和方法

在这个部分中描述了用于实现所呈现的结果的实验程序。

细胞培养和转染

在37℃下于5％CO₂中培养所有细胞。将人胚肾293T(HEK293T)细胞(DuBridge1987)保持在补充了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、非必需氨基酸和庆大霉素(10％SEM)的高葡萄糖杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中。

对于瞬时转染，将2.5*10⁶个细胞接种到6cm培养皿上或将6,3*10⁶个细胞接种到10cm培养皿上并且在20小时后(在60-70％细胞融合度下)通过磷酸钙共沉淀法，使用10或20μg分别通过用GenEluteHPPlasmidMiniprep试剂盒(SIGMA)或PlasmidGiga试剂盒(QIAGEN)于2mMTris(pH7.4)中洗脱制备的质粒DNA转染。将转染细胞保持在10％SEM或无血清培养基(SFM)中。通过离心(3分钟，3200rpm)澄清收获的培养基，并且保存培养上清液。

用于转染的质粒cDNA构建体

人野生型PAPP-AcDNA：在(Overgaard2000)中描述了编码成熟PAPP-A多肽的CD11信号肽和残基1-1547的pcDNA3.1-huPAPP-A。

空质粒：pcDNA3.1+(Invitrogen)

血管紧张素原(AGT)cDNA：pcDNA3.1-AGT

PAPP-A变体：先前描述了含有编码PAPP-A变体的cDNA的构建体；PAPP-A-E483Q(Boldt2001)、PAPP-AdLNR1、PAPP-AdLNR2、PAPP-AdLNR1-2、PAPP-A-356A、PAPP-A389A(Weyer2007)、PAPP-A/PAPP-A2嵌合体(E.Gaidamauskus、C.Oxvig，未公开)、zfPAPP-A(2009，未公开)、muPAPP-A(Soe2002)

人STC1cDNA：编码C端myc-his-标记的人STC1的pcDNA3.1-STC1(由J.Mikkelsen、C.Oxvig制备，未公开)

人STC2cDNA：编码C端myc-his-标记的人STC2的pcDNA3.1-STC2(由J.Mikkelsen、C.Oxvig制备，未公开)

proMBPcDNA：先前制备的pcDNA3.1-proMBP(Overgaard2004)。

SDS-PAGE

样品未经还原或通过添加二硫苏糖醇(DTT)而还原。之后将样品添加到Laemmli上样缓冲液中并且在负载到5-15％、10-20％或12％Tris-甘氨酸凝胶上之前在100℃下加热两分钟。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中凝胶在Laemmli缓冲液中在30mA下运行40-60分钟。通过考马斯亮蓝染色或Western印迹法使蛋白质可视化。使用Typhoon磷光成像仪通过放射自显影术使放射性标记蛋白可视化。

Western印迹法(WB)

通过SDS-PAGE分离后，在500mA和200V下在乙醇转印缓冲液(20％乙醇、0.2M甘氨酸、25mMTris、0.1％SDS，pH8.8)中通过电印迹法将样品转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上。该膜在含有2％吐温(Tween)的TST(50mMTris、0.5MNaCl、0.1％吐温-20，pH9.0)中封闭10分钟并且用稀释于2％M-TST(2％稀释于TST中的脱脂奶粉)中的一抗隔夜(ON)孵育。辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗也稀释于2％M-TST中并且在使用ECLplus(GEHealthcare)显影之前与膜一起孵育1小时。在X-射线胶片上拍摄图像。在所有孵育步骤间期，膜在TST中彻底洗涤。所有步骤均在室温下进行。下面在章节7.1.9和7.1.10中列出了所用抗体。

PAPP-A/STC复合物的形成

对于重组PAPP-A和STC1或STC2的共表达，用5μgPAPP-A和5μg空质粒DNA(为了比较)、5μgSTC1或5μgSTC2cDNA共转染293T细胞。对于PAPP-A的共表达，用5μgPAPP-A、2.5μgSTC1和2.5μgSTC2cDNA共转染STC1和STC2细胞。对比细胞总是用等量的DNA转染。为可视化形成的复合物，之后使用检测PAPP-A/proMBP的多克隆抗体(有效多克隆PAPP-A抗体)或检测人STC1或STC2的多克隆抗体通过Western印迹法分析培养上清液。

对于单独的蛋白质合成后PAPP-A/STC复合物的形成，按1:1体积混合含重组PAPP-A或PAPP-A-E389Q和STC1或STC2的培养上清液。当研究纯化PAPP-A/proMBP复合物时，首先将纯化蛋白与来自于模拟物转染细胞的培养基混合(以获得10μg/mL浓度的PAPP-A/proMBP)，然后与STC2-培养基1:1混合。在37℃下孵育混合物过夜或在规定时间点取出样品并冷冻以终止复合物形成。为可视化形成的复合物，使用检测PAPP-A/proMBP的多克隆抗体或检测STC1或STC2的多克隆抗体通过复合物特异性ELISA或Western印迹法分析混合物。

重组STC蛋白的纯化

通过如章节7.1.1中解释的磷酸钙共沉淀法，用STC1或STC2cDNA(每张10cm板20ug质粒DNA)瞬时转染293T细胞。转染48小时后，将10％SEM更换为无血清培养基(SFM)，两天后收获培养基并用新鲜SFM替换，再两天后收获培养基。

将含有重组人STC1或STC2的SFM与结合缓冲液(20mM咪唑、50mMNaH₂PO₄、1MNaCl、0.05％吐温-20，pH7.5)1:1混合并且在负载到亲和柱上之前经无菌过滤。用通过添加2％于水中NiSO₄的带Ni²⁺电荷并且在结合缓冲液中平衡的螯合琼脂糖快流亲和培养基(GEHealthcare)封装柱。以1mL/分钟的流量隔夜将样品溶液添加到柱内。之后用结合缓冲液洗涤柱，并且在10份250μL洗脱缓冲液(50mMNaH₂PO₄、300mM咪唑，pH7.5)中洗脱蛋白质。

质谱分析

通过SDS-PAGE分离纯化STC1和STC2蛋白质样品并通过考马斯亮蓝染色可视化。切掉可见条带并准备质谱分析。因此，首先使用Speedvac为凝胶塞脱水15分钟，然后用在100mMNH4HCO3中的20mMDTT还原10分钟。之后样品用在100mMNH4HCO3中的碘乙酰胺(IAN)烷基化10分钟，并且于冰上用12.5ng/μL在50mMNH4HCO3中的胰蛋白酶消化45分钟。在所有步骤间期，样品经脱水并用50％或100％乙腈(ACN)洗涤。丢弃胰蛋白酶缓冲液，并且向样品中添加50mMNH4HCO3消化缓冲液并且在37℃下孵育两小时。最后向样品中添加100％ACN，在VoyagerDE-PRO(AppliedBiosystems)上通过MALDI-TOF质谱分析法分析样品。使用单克隆抗体，使PAPP-A从来自于人类癌细胞系的条件培养基中免疫沉淀。在3-8％梯度凝胶上通过SDS-PAGE分离蛋白质并且通过考马斯亮蓝染色而可视化。考马斯染色蛋白条带经切除、胰蛋白酶化并且经受MALDI-TOF肽质量指纹图谱分析。

PAPP-A蛋白水解测定

在37℃下按1:1体积用模拟物-、STC1-或STC2-培养基隔夜预孵育PAPP-A。在37℃下在50mMTris、100mM氯化钠、1mM氯化钙(pH7.5)中用纯化的¹²⁵I-标记的IGFBP-4(经IGF-II预孵育，50nM，0.35μg/mL)或IGFBP-5(10nM，0.30μg/mL)孵育PAPP-A样品(200x稀释)。在0至180分钟的规定时间点取出反应混合物的样品并且通过添加20mM于样品缓冲液中的EDTA终止反应。通过用非还原SDS-PAGE(10-20％Tris-甘氨酸Laemmli凝胶)分离样品监测蛋白水解活性。用Typhoon磷光成像仪测量裂解的和完整的IGFBP-4或-5的条带强度。减去本底后，计算裂解的IGFBP-4或-5的％作为裂解量/总量*100％IGFBP，并根据时间绘图。

表面等离子体共振(Biacore)

所有SRP分析均在BiacoreT200仪器(GEHealthcare)上进行。简言之，通过标准胺耦合将5000RU的PAPP-A单克隆抗体固定在CM5芯片上。用乙醇胺封闭剩余活性基团。捕获HEK293条件培养基中的重组PAPP-A达200RU的水平。在表面上注射一系列稀释的纯化STC1或STC2。在每轮结合之后，通过注射低pH缓冲液再生芯片表面。如果可能，用标准1:1Langmuir模型拟合数据。

酶活性的抑制

简言之，将20pMPAPP-A与一系列稀释的已知浓度的重组表达和纯化的STC1或STC2(C120A)混合并且使其孵育1小时。通过添加10nMI-125标记的IGFBP-4和100nMIGF-II开始酶促反应。在不同时间点取出样品，并通过SDS-PAGE分离。使用磷光成像通过密度测定法测定裂解程度。估计每个STC浓度的相对初始速度(表示为活性％)并且绘制于图表中。使用GraphPadPrism5.0软件的单点拟合(Morrison)Ki模型进行抑制常数Ki的估计。

结果

STC蛋白质的表达和PAPP-A/STC复合物的分析。

为了能够检查STC1和STC2，进行重组蛋白的表达。构建具有编码重组人STC1和STC2的cDNA的插入物的表达质粒，并且在经这些构建体转染的细胞中检验STC1和STC2的表达。此外，我们通过用PAPP-A和STC1或STC2cDNA共转染293T细胞，检查了PAPP-A和STC1或STC2之间蛋白质复合物的可能形成。继转染之后，在还原或非还原条件下进行培养上清液的SDS-PAGE，并且产生STC特异性Western印迹(图1)。通过Western印迹法(未示出)排除了STC1特异性抗体(αSTC1Ab)和STC2特异性抗体(αSTC2Ab)分别对STC2和STC1交叉反应的可能性。

在还原或非还原条件下检测条件培养基中STC1和STC2的存在。在非还原条件下，在～70kDa的模糊条带中检测到STC1，代表共价连接的STC1二聚体(图1A)。负载更大量的样品，产生更加不同的条带。在还原条件下，出现一条～35kDa的STC1条带，与STC1单体相对应。在还原条件下还出现了STC2单体，并且以～45kDa的不同条带为代表(图1B)。在非还原条件下，STC2蛋白主要以～100kDa的条带为代表，但是也可检测到～200kDa以及～150kDa和>250kDa的更高分子量的条带。这些条带很可能代表STC2蛋白的多聚体。一般而言，STC检测抗体似乎比非还原蛋白更好地识别还原STC。

如图1A所示，用STC1和PAPP-AcDNA共转染并未在STC1Western印迹中产生任何附加条带。然而，当用STC2和PAPP-AcDNA共转染293T细胞时，在STC2Western印迹中出现>>250kDa的HMW条带(图1B，用黑色箭头指示)。这个条带在还原后消失，表明这种蛋白质复合物的形成依赖于二硫键。产生检测PAPP-A的相应Western印迹(图2)。

当STC1和PAPP-A在293T细胞中共表达时，在PAPP-A-Western印迹中仅检测到低分子量(LMW)的PAPP-A条带(图2A，白色箭头)。相反，在STC2和PAPP-A共表达期间，仅观察到HMWPAPP-A条带(图2B，白色箭头)。

结合这些发现，PAPP-A和STC的共表达似乎会影响这些蛋白质之间复合物形成的模式。PAPP-A和STC2的共表达导致在STC2Western印迹中出现可还原性HMW条带(图1B，黑色箭头)，表明PAPP-A和STC2之间的HMW二硫键复合物分泌到细胞培养基中。这种复合物很可能产生在PAPP-A印迹中观察到的HMW条带。因此，如STC2印迹所示，过表达PAPP-A和STC2的细胞合成摩尔过滤的STC2，使所有PAPP-A与STC2复合。因此PAPP-A样品的Western印迹中的HMWPAPP-A条带可能代表重组PAPP-A和内源性STC2之间的复合物。

在STC1Western印迹中未检测到STC1和PAPP-A之间相应的复合物，表明潜在STC1/PAPP-A复合物为非共价性。因此可用由于SDS-PAGE中的变性条件，在Western印迹法中未检测到的非共价PAPP-A/STC1复合物的形成解释PAPP-A和STC1共表达后HMWPAPP-A条带的消失。为证明这一点，重组STC1蛋白似乎在与PAPP-A的复合物形成中超过内源性STC2，解释了仅LMWPAPP-A条带(图2A，白色箭头)的出现。此外，PAPP-A、STC1和STC2在细胞中的共表达在Western印迹中产生高分子STC1条带，很可能代表与PAPP-A复合的STC1/STC2杂二聚体。因此，在PAPP-AWestern印迹中观察到的HMW条带代表PAPP-A和STC1/STC2杂二聚体之间的复合物形成。

因为最初仅可在对PAPP-A/STC2而不是对潜在非共价PAPP-A/STC1复合物的Western印迹法中检测到复合物形成，所以检查是否可在酶联免疫吸附测定(ELISA)中检测到复合物。在ELISA中可易于检测到PAPP-A/STC2复合物。

PAPP-A/STC复合物形成的监测

proMBP是众所周知的PAPP-A抑制剂。先前已经证实当PAPP-A/proMBP复合物的形成在混合含有单独合成的重组proMBP和PAPP-A的培养上清液时在细胞外发生。在类似实验中，检查在没有细胞时PAPP-A/STC2复合物的形成是否可能。用空质粒DNA(模拟物)、PAPP-A或STC2cDNA转染293T细胞。按1:1体积将来自于PAPP-A转染细胞的培养上清液与STC2-或模拟物-培养基混合并且在37℃下孵育。在规定时间点取出样品。孵育之后，产生PAPP-AWestern印迹以检查HMWPAPP-A条带的出现(图3)。

孵育开始时，如先前所见，通过PAPP-A/STC2混合物的蛋白质印迹检测到HMW和LMWPAPP-A条带两者(图3A)。随时间推移，LMW条带变得越来越模糊，并且在孵育4小时后，唯一检测到作为HMW复合物的PAPP-A。这些PAPP-A条带比得上在用PAPP-A和STC2cDNA共转染后观察到的HMW条带，表明PAPP-A/STC2复合物在孵育期间已经形成。在STC2Western印迹(未示出)中检验了高分子量的相应STC2条带的时间依赖性出现。有趣的是，在PAPP-A和模拟物培养基的混合物中也可观察到类似复合物形成(图3B)。当混合PAPP-A和模拟物培养基时，随时间推移在HMW复合物中发现百分率递增的PAPP-A。然而，在培养～1小时后，HMW-PAPP-A的百分率保持恒定。这表明模拟培养基中的内源性STC2蛋白或PAPP-A培养基中残留内源性STC2在培养期间与PAPP-A形成复合物，直至内源性STC2用完。

结合来看，数据显示，包含或由重组PAPP-A和STC2组成的复合物可在共转染后形成和通过混合单独合成的PAPP-A和STC2蛋白质形成。此外，很可能在PAPP-A样品的Western印迹中观察到的PAPP-A的HMW条带代表PAPP-A和内源性STC2的复合物。即使未能检测到PAPP-A和STC1之间的共价复合物，但非共价PAPP-A/STC1复合物的存在也有可能。虽然没有说服力，但是此类复合物的存在受到用PAPP-A和STC1共转染细胞时仅检测到PAPP-A的LMW条带的Western印迹和检测PAPP-A/STC1复合物的ELISA的支持。此外，免疫沉淀实验显示了PAPP-A和STC1的免疫共沉淀。

PAPP-A样品中内源性STC的存在

因为在重组PAPP-A表达期间很大百分率的PAPP-A与内源性STC2和STC1复合，所以检查了几份PAPP-A样品中STC2的存在。试验来自于用空质粒DNA或PAPP-AcDNA转染的细胞的培养上清液，以及纯化PAPP-A-E483Q和纯化PAPP-A/proMBP复合物的样品(图4A)。此外，通过将这些样品与含重组STC2的培养基混合，检查是否可以形成PAPP-A/STC2复合物(图4B)。

如图4A所示，在含重组PAPP-A的培养基和纯化PAPP-A-E483Q的样品中检测到STC2。在两种情况下，在HMW复合物中均检测到STC2，表明STC2与PAPP-A复合物。然而，在纯化PAPP-A/proMBP复合物中未检测到STC2。这些结果证明293T细胞表达的一部分的重组PAPP-A蛋白与内源性STC2复合。然而，proMBP的结合很可能拒绝STC2同时结合。

当PAPP-A样品混合并且与培养上清液中的重组STC2一起孵育时，在Western印迹中也检测到形成的PAPP-A/STC2复合物(图4B)。然而，含有纯化PAPP-A/proMBP复合物(PP混合物)的样品未形成STC2复合物。

STC1和STC2蛋白的纯化

纯化蛋白在几个实验程序中的应用可以是有价值的。因此从分别经STC1或STC2cDNA转染的293T细胞的无血清培养基纯化STC1和STC2蛋白。通过利用C端插入的myc-his-标签，通过固定Ni²⁺亲和色谱法纯化STC蛋白。纯化的STC1和STC2蛋白在洗脱蛋白级分的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE中可视化(图5)。

纯化蛋白在#2-6级分中可见。与在STC1Western印迹中一样，纯化STC1主要在～70kDa的条带中迁移(图5A)。此外，正如由STC2Western印迹所预期的，纯化STC2在多种尺寸的条带中迁移，主要条带为～100kDa(图5B)。>170kDa的HMWSTC2条带的出现可指示STC2与未鉴定蛋白的多聚体或复合物形成。这样，因为观察到几个条带，特别是对于STC2而言，研究了在还原和非还原条件下出现在条带中的蛋白质的同一性。通过质谱分析法分析从还原和非还原SDS-PAGE获得的～35-40kDa和～70kDa的STC1条带和～40kDa、～100kDa和>170kDa的STC2条带。在检查的纯化STC1的所有条带中，未鉴定出除STC1外的其它蛋白质。而且，在纯化STC2的条带中仅鉴定出STC2蛋白。这表明在当前条件下，STC并未与293T细胞内源性表达的任何蛋白质形成复合物。

STC影响PAPP-A蛋白水解活性

最后，测试了PAPP-A的蛋白水解活性是否受与STC形成复合物影响。用模拟物-培养基或含重组STC1或STC2的培养基预孵育PAPP-A。通过Western印迹法检验PAPP-A/STC2复合物形成。使用如先前所述用IGF-II预孵育的¹²⁵I-IGFBP-4监测PAPP-A和PAPP-A/STC的蛋白水解活性。通过将代表经SDS-PAGE分离的完整的和裂解的IGFBP-4的条带的强度相关联测定在不同时间点PAPP-A介导的IGFBP-4的蛋白水解裂解(图6A)。

120分钟后用模拟物-培养基预孵育的PAPP-A已经裂解了60％的总IGFBP-4。然而，用STC1或STC2预孵育已致使PAPP-A不能裂解其底物。如图6B所示，当STC1存在时仅～15％的总IGFBP-4裂解，而STC2的存在完全抑制了PAPP-A介导的IGFBP-4裂解。这证明了STC对PAPP-A对IGFBP-4的蛋白水解活性的抑制作用。

实施例2

斯钙素通过对IGF轴的蛋白水解抑制调节哺乳动物生长

材料和方法

用125I-标记的天然底物(IGFBP-4)进行蛋白水解裂解测定和动力学分析。通过SDS-PAGE将裂解产物与完整底物分开，并且通过光激励发光分析裂解。使用纯化重组蛋白进行蛋白质相互作用研究和圆二色性分析。通过定量氨基酸分析或通过使用免疫测定法进行蛋白质浓度的评估。

STC2和人或鼠冠毛素之间共价复合物的体外形成通过哺乳动物细胞共转染或通过孵育来自于单独转染细胞的培养基而实现。通过Western印迹法证明或监测复合物形成。使用稳定地表达IGF-I受体的细胞系进行IGF-I受体活化分析，接着通过Western印迹法进行受体磷酸化的量化。

使用泛在强启动子产生表达STC2或STC2(C120A)的转基因小鼠。通过连续称重监测小鼠的生长。对STC2产生的单克隆抗体用于测定循环转基因源STC2的水平，并且用于源自转基因E13.5胚胎的原代成纤维细胞中存在的转基因源STC2和内源性PAPP-A的免疫沉淀。

质粒构建体和诱变

购买含有人STC1(两侧为5’Xhol位点和3’HindIII位点的NM_003155.2的核苷酸285-1025)和STC2(两侧为5’Xhol位点和3’HindIII位点的NM_003714.2的核苷酸1131-2216)的编码序列的质粒DNA(Invitrogen)。将cDNA克隆到pcDNA3.1/Myc-His(-)A(Invitrogen)的Xhol/HindIII位点以获得pSTC1和pSTC2。其它地方报道了编码人PAPP-A、鼠PAPP-A、人PAPP-A2、人IGFBP-47和人IGFBP-530的质粒构建体的生成。为生成鼠PAPP-A2的表达质粒(NM_001085376.2)，使用两种特异性引物(5’-CCGAGAGGTCAGGAGAGCAG-3’(核苷酸3120-3101)和5’-GAGCTTCTCTTTTAGTCTGCCCCC-3’(核苷酸5425-5402)由小鼠胎盘mRNA合成cDNA。使用两组引物(5’-CCGGGGTACCATGATGTGTTGGAAGGTCCTGAG-3’(核苷酸1-23，Kpnl加下划线)和5’-GATGGTGAGCGGTATGTCACAA-3’(核苷酸3030-3009)；5’-CCGGTCCAGGCGGATACCCT-3’(核苷酸2881-2900)和5’-GATCTCTAGATTACTGGTTTTCTTCTGCCTTGGGG-3’(核苷酸5370-5346，Xbal加下划线))生成均在核苷酸2957处含BgIII位点的两个重叠PCR片段。连接所述片段并克隆到pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的Kpnl/Xbal位点中以生成pmPAPP-A2。

通过QuikChange(Stratagene)使用pSTC2作为模板和使用以下多组引物(编号为NM_003714.2，突变核苷酸加下划线)实现pSTC2的诱变：对于pSTC2(C120A)而言为5’-GCACAGGTTCGGCGCCATAAGCCGGAAGTG-3’(核苷酸1655-1684)和5’-CACTTCCGGCTTATGGCGCCGAACCTGTGC-3’(核苷酸1684-1655)，对于pSTC2(C197A)而言为5’-CAGCGTGCAGGTTCAGGCTGAGCAGAACTGGGGAAG-3’(核苷酸1883-1918)和5’-CTTCCCCAGTTCTGCTCAGCCTGAACCTGCACGCTG-3’(核苷酸1918-1883)，及对于pSTC2(C205A)而言为5’-GAACTGGGGAAGCCTGGCCTCCATCTTGAGCTTC-3’(核苷酸1907-1940)和5’-GAAGCTCAAGATGGAGGCCAGGCTTCCCCAGTTC-3’(核苷酸1940-1907)。使用Xhol/HindIII位点将突变cDNA交换至pSTC2中。通过序列分析检验所有构建体。

细胞培养和转染

将人胚肾293T细胞(293tsA1609neo)保持在补充了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、非必需氨基酸和庆大霉素(Invitrogen)的高葡萄糖DMEM中。对于瞬时转染，将6.0x10⁶个细胞接种到10-cm培养皿上并且在18小时后通过磷酸钙共沉淀法，使用5-10μg通过用GenEluteHPPlasmidMiniprep试剂盒(Sigma)制备的质粒DNA转染。转染48小时后收获培养上清液并通过离心澄清，或在无血清培养基(CD293，Invitrogen)中进一步培养细胞以利于纯化。通过商业ELISA(AL-101,AnshLabs)测定PAPP-A的分泌水平，并且通过如先前所述的ELISA测量PAPP-A2的水平。

蛋白质纯化

在1mlHisTrapHP柱(GEHealthcare)上通过亲和色谱法实现His-标记重组蛋白的纯化。将无血清培养基1:1稀释于20mMNaH2PO4、150mMNaCl(pH7.4)(PBS)中并以1mlmin^-1的流量负载到柱上。用20倍柱体积的50mMNaH₂PO₄、1MNaCl、20mM咪唑、0.05％吐温-20(pH7.4)，接着用5倍柱体积的PBS洗涤该柱。用50mMNaH₂PO₄、300mM咪唑(pH7.4)洗脱蛋白质，并用20mMHEPES、150mMNaCl(pH7.4)透析。碘化之前，如所述，在DiscoveryBIOWidePoreC5柱(4x250mm，Sigma)上通过反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进一步纯化IGFBP-4和-5。通过SDS-PAGE评估蛋白质纯度，并且通过氨基酸分析进行纯化蛋白的量化。

蛋白酶测定和动力学分析

用¹²⁵I(AmershamBiosciences)标记纯化IGFBP-4，并且如先前所述进行裂解反应。简言之，将从用有或无pSTC1、pSTC2或pSTC2(C120A)的人PAPP-AcDNA转染的细胞收获的培养基稀释(1:500)至50pMPAPP-A并且在50mMTris-HCl、100mMNaCl,1mMCaCl2(pH7.5)中与预孵育的¹²⁵I-IGFBP-4(10nM)和IGF-II(100nM)(GroPepBioreagents)混合。在37℃下孵育10-40分钟后，通过添加补充了25mMEDTA的热SDS-PAGE样品缓冲液终止反应。通过12％SDS-PAGE分离底物和裂解产物并且使用储存磷光屏(MolecularDynamics)和Typhoon成像系统(GEHealthcare)通过自显影术可视化。对于一些反应而言，在稀释和活性分析之前，来自于经人或鼠PAPP-AcDNA转染的细胞的培养基在37℃下与含有摩尔过量的STC1或STC2的培养基一起孵育0或16小时。

为定量评估STC1和STC2(C120A)的抑制活性，在0-1000nM纯化STC1或STC2(C120A)的存在下分析人和鼠PAPP-A(20-50pM)对IGFBP-4的蛋白水解活性。根据抑制剂浓度，在5个不同时间点(0-120分钟)终止单独反应。如以上使裂解可视化，并且通过使用ImageQuantTL8.1软件(GEHealthcare)量化条带强度。减去本底信号，并且假设无底物耗尽，通过线性回归测定相对初始速度(V/V0)。使用嵌入GraphPadPrism5.0软件的MorrisonKi模型实现抑制常数(Ki)的测定。

类似地对于以下蛋白酶而言，用或不用10倍摩尔过滤的纯化STC1或STC2评估¹²⁵I-IGFBP-5的裂解：人MMP-2(R&DSystems，902-MP-010)、人ADAM-10(R&DSystems，936-AD-020)、人蛋白裂解酶、牛胰蛋白酶(Sigma，T-8642)和人或鼠PAPP-A2。除胰蛋白酶(0.2nM)和PAPP-A2(50pM)外，酶浓度为100nM。STC2用所有蛋白酶预孵育8小时。裂解反应为30-180分钟，以达到约30％底物裂解。

一抗

对于Western印迹法而言，使用以下抗体：兔多克隆抗(人PAPP-A)、兔多克隆抗(人PAPP-A2)、小鼠单克隆抗(c-myc)(9E10，ATCC)、山羊多克隆抗(人STC1)(R&DSystems，AF2958)、山羊多克隆抗(人STC2)(R&DSystems，AF2830)、用于检测磷酸酪氨酸残基的小鼠单克隆PY99(SantaCruzBiotechnology，sc-7020)、用于检测人IGF-I受体的小鼠单克隆CT-1(GroPepBioreagents，MAJ1)、用于检测β-肌动蛋白的小鼠单克隆AC-74(Sigma，A5316)和用于检测鼠PAPP-A的小鼠单克隆D8-mlgG2a。

为了用于ELISA和免疫共沉淀，产生抗STC2的单克隆抗体。于弗氏完全佐剂中(MPBiomedicals)向BALB/c小鼠给予50μg纯化重组人STC2的初始注射。一个月后于弗氏不完全佐剂中给予加强注射。基于在STC2涂布板上对尾血的筛选，选择响应物用于在第一次加强注射一个月后最终加强。连续四天，小鼠接受腹腔注射160μgSTC2。在第五天，处死小鼠并取出脾脏。脾细胞经离心、等分并储存在液氮中。用一个等分试样的脾细胞进行与SP2/0细胞的融合。在STC2涂布板上筛选所选克隆的培养上清液，并且再克隆阳性克隆。所得克隆为STC216、STC220、STC221、STC225、STC239和STC243。在CD杂交瘤培养基(Invitrogen)中培养克隆以便抗体生成。在蛋白A琼脂糖凝胶(GEHealthcare)上纯化抗体，并且用20mMHEPES、150mMNaCl(pH7.5)透析。

对于生物素化，mAbSTC216在7.4μM下于冰上用20倍摩尔过量的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-生物素(ThermoFisherScientific,#21335)孵育2小时。用10mMTris-HCl终止反应，并用20mMHEPES、150mMNaCl(pH7.5)透析。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

为测量STC2浓度，用100μl/孔于100mMNa₂HCO₃(pH9.4)中的7.5μgml^-1的捕捉抗体(mAbSTC221)，通过在4℃下孵育过夜涂布96孔板(MaxiSorp，Nunc)。然后在37℃下用200μl/孔于TBS(30mMTris-HCl、300mMNaCl、2mMCaCl2，pH7.4)中的2％牛血清白蛋白(BSA)封闭细胞30分钟。将样品稀释于补充了1％BSA的TBS-T(含0.05％吐温-20的TBS)中并且在37℃下在涂布孔中孵育1小时。在TBS-T中洗涤后，该孔在37℃下用在含1％BSA的TBS-T中稀释至1μgml^-1的生物素化检测抗体(STC216)孵育1小时，再次洗涤并且用1:20,000稀释于含1％BSA的TBS-T中的抗生物素蛋白偶联辣根过氧化物酶(P0347，DAKO)孵育(1小时)。最后一轮洗涤之后，使用OPD片剂(S2045，DAKO)使孔显影。校准器基于稀释于含1％BSA的TBS-T中的重组STC2。使用8个校准点(6.25-800ngml^-1)。在490nm下在EnSpire多模式读板仪(PerkinElmer)上测量吸光度。减去空白值并通过使用三次曲线拟合法分析数据。在20％CV下该测定的功能灵敏度为20ngml^-1。

为评估单克隆抗体与STC2和STC2(C120A)的结合，为板涂布100μl/孔的2μgml^-1多克隆抗(STC2)。用可用STC2mAb(1μgml^-1)，接着用1:2000稀释的抗小鼠IgG-HRP(DAKO，P0260)进行检测。标准化来自于一系列稀释的STC2和STC2(C120A)的信号并对每种抗体进行比较。用于稀释和洗涤的缓冲液如上所述。

复合物形成的免疫印迹和分析

将通过SDS-PAGE分离的蛋白质涂抹到PVDF膜(Millipore)上，用2％吐温20封闭，并且在50mMTris-HCl、500mMNaCl、0.1％吐温20(pH9.0)(TST)中平衡。将一抗稀释(至1-5μgml^-1)于含0.5％胎牛血清的TST中，并且在室温下孵育印迹过夜。在室温下用1:2000稀释于含0.5％胎牛血清的TST中的二次抗体(多克隆猪抗兔IgG-HRP(DAKO，P0217)、多克隆兔抗山羊IgG-HRP(DAKO,P0160)或多克隆兔抗小鼠IgG-HRP(DAKO，P0260))孵育印迹1小时。步骤间期的所有洗涤均用TST进行。使用增强化学发光(ECLPrime,GEHealthcare)使印迹显影，并且拍摄图像并使用ImageQuantLAS4000仪器(GEHealthcare)分析。

为探索单独细胞中合成的蛋白质之间的共价复合物形成，在37℃下孵育培养基0-16小时，通过非还原SDS-PAGE(每个泳道2μl)分离，然后如上所述通过Western印迹法分析。在分析之前未孵育来自于共转染细胞的培养基。

表面等离子体共振分析

表面等离子体共振实验均在BiacoreT200(GEHealthcare)上进行。使用胺耦合，将纯化单克隆抗体234-5固定在SCM5系列传感器芯片(GEHealthcare)的流动池(FC)3和4中。为达到5,000个响应单元(RU)的耦合密度，在10mM醋酸钠(pH4.75)中将抗体稀释至30μgml^-1。通过7分钟注射1M乙醇胺(pH8.0)封闭剩余活性基团。对于数据采集，使用FC3作为参比池，仅在FC4中捕获培养基中的重组人PAPP-A(350RU)。在两个FC上按30μlmin^-1注射纯化重组人STC1于10mMHEPESpH7.5、150mMNaCl、1mMCaCl2和0.05％吐温-20中的两倍连续稀释液(6.25nM至195nM)。缔合期为180秒，接着是1,000秒解离期。在每个结合周期结束时，通过40秒注射0.1M甘氨酸(pH2.5)和0.5M盐酸胍再生两个表面。通过氨基酸分析测定分析物(STC1)浓度。在25℃下进行结合分析，并且在10Hz速率下采集数据。正如通过从参比池获得的响应所测定，记录信号减去本底信号。使用1.0版BiacoreT200评价软件进行1:1Langmuir模型的全局拟合。

圆二色性分析

通过使用圆二色性分析比较纯化的野生型和突变体蛋白。分析之前，用20mMNaH2PO4、20mMNaF(pH7.4)透析纯化蛋白。在25℃下在JascoJ-810分光偏振计(JascoSpectroscopic,Japan)上使用0.5mgml^-1的多肽浓度和2mm路径长度的比色皿为每种蛋白质记录10个CD图谱。在260至190nm的范围内在0.2nm的分辨率下使用1.0nm的带宽获得CD数据。扫描速度为100nmmin^-1，并且响应时间为1秒。在260至200nm的范围内进行温度扫描，并且在222nM下记录熔解曲线。在110gmol^-1残基^-1的平均摩尔质量的基础上计算Δε(用degcm²dmol^-1表示)。

IGF-I受体刺激测定

基本上如所述，使用稳定表达IGF-I受体的细胞系293-IGFR(克隆H)测量IGF-I受体磷酸化。在含CaCl2(0.1mgL^-1)和MgCl2(0.1mgL^-1)的PBS(pH7.4)中冲洗饥饿细胞，并且用IGF-I(10nM)、IGFBP-4(50nM)、PAPP-A(2.5nM)和STC1(15nM)或STC2(15nM)的组合刺激15分钟。刺激之前，IGF-I和IGFBP-4在37℃下在20mMHEPES、100mMNaCl、1mMCaCl2(pH7.5)中孵育20分钟，以使IGF-I/IGFBP-4复合物形成。然后添加PAPP-A并且在37℃下在相同缓冲液中进行裂解反应20分钟。使用之前，PAPP-A在37℃下在血清培养基中用或不用STC1、STC2或STC2(C120A)孵育16小时。于冰上用补充了蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，P8340)和磷酸酶抑制剂混合物II组(EMDMillipore，524625)的RIPA缓冲液(Sigma，R0278)裂解刺激细胞10分钟。澄清裂解物的Western印迹用于使用mAbPY99量化β-亚基磷酸化。使用mAbCT-1进行总IGF-I受体的检测。为了负载对照，剥离印迹并用针对肌动蛋白的mAbAC-74重新探测。使用ImageQuantLAS4000仪器(GEHealthcare)进行带强度的量化。mAbPY99的信号减去本底信号并绘图。

动物实验

为了产生转基因小鼠，分别使用引物5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(pcDNA3.1-Myc-His(-)A的核苷酸769-789)和5’-AAAAAAAGATCTTCACCTCCGGATATCAGAATACTC-3’(NM_003714.2的核苷酸2219-2196，BgIII位点加下划线)及pSTC2和pSTC2(C120A)作为模板生成编码未标记STC2或STC2(C120A)的PCR片段。将PCR片段克隆至pCAGGS(BCCM，LMBP2453)的Xhol/BgIII位点以生成pCAGGS-STC2和pCAGGS-STC2(C120A)。用Pvul线性化质粒DNA，并显微注射至B6D2F2接合子(Taconic)的雄性原核中，然后将原核引入假孕NMRI雌性小鼠(Taconic)体内。使用pCAGGS质粒特异性引物(5’-CGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATC-3’(核苷酸216-241)和5’-TGACTGGGAGTAGTCAGGAGAGGAGG-3’(核苷酸511-486)和从尾部活检中纯化的基因组DNA，通过PCR鉴定转基因小鼠，B6D2F2-Tg(STC2)或B6D2F2-Tg(STC2(C120A))。由pCAGGS-STC2注射产生的44只小鼠中，9只对转基因插入物呈阳性。这些中的4只产生在血清中具有可检水平的STC2抗原的转基因后代，并且用作进一步繁殖的奠基者。类似地，由pCAGGS-STC2(C120A)注射产生的34只小鼠中，9只呈阳性。这些中的3只产生在血清中具有可检水平的STC2的转基因后代，并且用作奠基者。奠基者与C57BL/6JBomTac(Taconic)交配，产生含B6；D2-Tg(STC2)N1或B6；D2-Tg(STC2(C120A))N1小鼠的幼仔以及野生型幼仔，幼仔经基因分型并且通过连续称重盲法分析其生长。在第5和8周，从舌下静脉抽血，并且使血清形成，并且样品经冷冻并储存在-20℃下直至进一步分析。对于重量比较，根据个体的STC2血清水平为小鼠分组。对于所有组的B6；D2-Tg(STC2)N1和2-8μgml^-1组的B6；D2-Tg(STC2(C120A))N1而言，n是指在所有时间点所包括的小鼠的数量。对于非转基因组的B6；D2-Tg(STC2(C120A))N1而言，n是指除第3周(n＝9)和第7周(n＝5)外，在所有时间点所包括的小鼠的数量。小鼠保持12小时光/12小时暗循环并任意给予Altromin1319(Brogaarden)。所有小鼠工作均经丹麦国家主管部门许可进行。

小鼠胚胎成纤维细胞的培养和分析

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的原代培养物源自由使B6；D2-Tg(STC2)N1雌性和雄性幼仔交配产生的E13.5胚胎。胚胎经洗涤、切碎、用木瓜蛋白酶消化并且将细胞悬浮液接种在补充了55μMβ-巯基乙醇(Invitrogen)的DMEM培养基中。2-4代的细胞用于实验。来自每个胚胎的残留组织用于基因分型，并且通过ELISA确认分泌到培养基中的转基因源STC2的存在。评估来自于非转基因或转基因MEF的培养基对添加或未添加mAb1/41(100nM)，一种对PAPP-A蛋白水解活性17有抑制性的单克隆抗体的IGFBP-4的蛋白水解活性的存在。

使用其中基本上如所述，通过使用庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐(Sigma)交联按2mgml^-1固定mAbSTC221的30μl蛋白G琼脂糖4快流凝胶(GEHealthcare)使融合板的培养基中所含的转基因STC2从20ml培养基中免疫沉淀。使用mAbD8-mlgG2a通过Western印迹法评估洗脱蛋白中内源性鼠PAPP-A的存在。

统计分析

所有统计分析均使用GraphPadPrism5.0版进行。对于每个时间点使用非配对学生t检验进行小鼠出生后生长数据的统计分析。使用单因素ANOVA，接着用Dunnett检验进行IGF-I受体信号的统计分析。使用单因素ANOVA，接着用Tukey检验进行抗体结合的统计分析。P<0.05视为在统计上显著。

结果

从转染细胞分泌的PAPP-A在体外迅速地在单个位点裂解IGFBP-4。然而，在用STC1或STC2cDNA共转染后(图11a)，即使从细胞分泌的PAPP-A的水平未受影响(图11b)，但我们未检测到对IGFBP-4的蛋白水解活性。为评估STC1和STC2作为蛋白酶抑制剂的可能功能，然后我们分析了向裂解反应中添加经单独合成并纯化的STC的影响。STC1仍然抑制PAPP-A，但是在这个实验中，未观察到STC2的抑制作用(图11c)。对相互作用的定量评估揭示STC1以75pM的KD强烈地与PAPP-A结合(图11d)，并且动力学分析显示STC1有效抑制(Ki＝68pM)PAPP-A的蛋白水解活性(图11e)。

单独转染后，STC2和PAPP-A分别作为约90kDa或400kDa的二聚体在SDS-PAGE中迁移，但是在共转染后，形成了含有两种抗原的约500kDa的高分子量条带(图12a-b)。在用STC1的类似实验中未观察到PAPP-A迁移的变化(图12c)。我们推断STC2，而非STC1，能够与PAPP-A形成在变性PAGE抗分离并且因此最有可能为共价的复合物。我们通过孵育经单独合成的STC2和PAPP-A进一步分析了复合物形成的过程。有趣的是，在孵育期间逐渐出现500kDa的含PAPP-A的条带(图12d)，证明在细胞外环境中复合物形成。PAPP-A在单独孵育后具蛋白水解活性，而在与STC2一起孵育16小时后，PAPP-A未显示出活性(图12e)。与共转染实验一致，STC1在与PAPP-A一起孵育后未形成共价复合物(图12f)。然后我们评估了STC对其它蛋白水解酶的可能抑制活性。孵育后没有受试蛋白酶受STC1或STC2抑制(图15a-b)。然而，两种STC均能够部分抑制PAPP-A2(冠毛素-2)，PAPP-A的唯一同源物，并且STC2，而非STC1，也与PAPP-A2形成共价复合物。因此我们推断STC1和STC2在体外起到由PAPP-A和PAPP-A2组成的金属蛋白酶冠毛素家族的蛋白酶抑制剂的作用。STC1通过形成高亲和力蛋白酶-抑制剂复合物发挥其抑制功能，而STC2抑制活性需要其与靶蛋白酶形成共价复合物。有趣的是注意到同源STC具有独特氨基酸序列，没有可由此预测这种生物化学功能的已知模块或基序。

先前已经证实STC1的11个半胱氨酸残基形成5个分子内二硫键，并且一个残基负责二聚化。这11个半胱氨酸残基在STC2中保守，有趣的是，STC2含有3个另外的半胱氨酸C120、C197和C205(图16)。当这3个残基单独取代为丙氨酸时表达水平不变(图13a)。然而，突变体STC2(C120A)不能与PAPP-A形成共价复合物(图13b)，表明涉及C120的分子间二硫键是STC2和PAPP-A之间共价连接的基础。为允许STC2和PAPP-A之间的二硫键形成，分子必须首先非共价相互作用，很可能用STC2(C120A)和PAPP-A之间相对较弱的相互作用模拟。一致的是，动力学分析显示STC2(C120A)仍然对PAPP-A具有一定抑制活性(Ki＝47nM)(图13c)。虽然STC2(C120A)的抑制效力比STC1低约700倍，但在抑制模式方面，STC2(C120A)类似于非共价STC1。因此，STC2和PAPP-A之间共价键的形成有效地弥补了STC2的其它弱抑制活性。与这些数据一致，我们发现STC1和STC2两者，而非STC2(C120A)，有效地抑制体外PAPP-A介导的IGF受体信号(图13d)。

在用于动物研究之前，我们通过圆二色性分析进一步比较了纯化STC2(C120A)和野生型STC2。类似的图谱和热稳定性表明STC2(C120A)的结构完整性不受其单氨基酸取代损害(图13e和图17)。STC2和STC2(C120A)受6种可用单克隆抗体的同等识别也支持这种解释(图18)。另外，我们证实STC2和STC2(C120A)两者的生物化学性质在鼠类系统中保守(图19a-c)。

为检验我们对STC2过表达通过蛋白水解抑制引起生长迟缓的预测，我们生成并比较了STC2和STC2(C120A)的转基因小鼠。与早期发现4一致，与非转基因动物相比STC2过表达引起出生后生长速率严重降低(图14a)。我们的数据进一步指示了STC2循环水平和生长迟缓严重程度之间的相关性(图14b)。成鲜明对比，即使在高循环蛋白水平下，STC2(C120A)的转基因表达也未引起生成速率可检测的改变(图14c)。

培养的来自于PAPP-A敲除小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)对IGFBP-4缺乏蛋白水解活性。我们发现通过使用对鼠和人PAPP-A两者有特异性的新型抑制性单克隆抗体可完全抑制来自于源自非转基因小鼠的MEF的条件培养基中存在的对IGFBP-4的活性(图14d)。这个实验结论性地显示MEF来源的对IGFBP-4的蛋白水解活性由PAPP-A产生。与来自于非转基因小鼠的MEF培养基相反，来自于源自STC2转基因小鼠的MEF的条件培养基在PAPP-A活性上显示出明显下降(图14e)。重要的是，抑制伴有在MEF培养基中内源性PAPP-A和转基因源STC2之间共价复合物的存在(图14e)。因此我们得出因为PAPP-A的活性受损，所以STC2转基因小鼠显示出生长迟缓的结论。

与PAPP-A敲除或抑制的条件相反，先前对于STC2敲除小鼠观察到的体重大幅增加表明STC2的缺乏引起PAPP-A活性升高。PAPP-A的强合成作用也通过成骨细胞中靶向PAPP-A转基因表达后明显增加的骨厚度，并且类似地，通过成肌细胞中PAPP-A转基因表达后骨骼肌质量的大幅增加所证明。最后，在人类中，通过出生体重和母体妊娠前三个月的PAPP-A水平之间的强正相关性的发现强调了PAPP-A的生长调节潜力。

总的来说，这些发现支持PAPP-A蛋白水解活性与STC抑制活性之间的动态平衡决定体内局部IGF受体刺激的模型(图14f)。在这点上，重要的是强调IGF介导的生长取决于组织微环境中细胞外周、生物活性IGF的水平。这通过IGF-I的肝脏特异性敲除明显降低(75％)了IGF-I的血清水平，但是对生长没有影响的关键发现所强调。也通过在由于STC1或STC2过表达已经变矮小的小鼠中循环IGF-I的水平不改变的观察结果所强调。关于PAPP-A2的了解很少，但是已知基因靶向会引起轻度生长迟缓。因此，根据我们的生物化学数据，即使与PAPP-A相比未广泛表达，对于PAPP-A2而言类似模型也有效。

IGF受体信号调节异常已经广泛地与各种疾病，尤其是人类癌症联系起来。同样，癌症发展中涉及PAPP-A受到越来越多的认可，并且通过PAPP-A敲除小鼠成年自发性癌症的发病率非常低的发现所强调。因此有趣的是多个报告将STC1或STC2与人类癌症联系起来。例如，乳腺癌中BRCA1肿瘤抑制功能的丧失引起STC1表达变得不可检测，并且乳腺癌的晚期复发与STC1和STC2的高表达相关。

总之，本实施例证明哺乳动物斯钙素是调节体内IGF受体活化的复杂细胞外网络的新型蛋白酶抑制剂。

序列

SEQIDNO：1

斯钙素-1(＝STC1)前体[智人]

NCBI参考序列：NP_003146.1

1mlqnsavllvlvisasatheaeqndsvsprksrvaaqnsaevvrclnsalqvgcgafad

61enstcdtdgmydicksflysaakfdtqgkafvkeslkciangvtskvflairrcstfqrm

121iaevqeecysklnvcsiakrnpeaitevvqlpnhfsnryynrlvrsllecdedtvstird

181slmekigpnmaslfhilqtdhcaqthpradfnrrrtnepqklkvllrnlrgeedspshik

241rtshesa

SEQIDNO：2

斯钙素-2(＝STC2)前体[智人]

NCBI参考序列：NP_003705.1

1mcaerlgqfmtlalvlatfdpargtdatnppegpqdrssqqkgrlslqntaeiqhclvna

61gdvgcgvfecfennsceirglhgicmtflhnagkfdaqgksfikdalkckahalrhrfgc

121isrkcpairemvsqlqrecylkhdlcaaaqentrvivemihfkdlllhepyvdlvnlllt

181cgeevkeaithsvqvqceqnwgslcsilsfctsaiqkpptapperqpqvdrtklsrahhg

241eaghhlpepssretgrgakgergskshpnahargrvgglgaqgpsgssewedeqseysdi

301rr

SEQIDNO：3

PAPP-A(＝冠毛素-1)前体[智人]

UniProtKB/Swiss-Prot：Q13219.3

1mrlwswvlhlgllsaalgcglaerprrarrdpragrpprpaagpatcatraargrraspp

61pppppggaweavrvprrrqqreargateepsppsralyfsgrgeqlrlradlelprdaft

121lqvwlraeggqrspavitglydkcsyisrdrgwvvgihtisdqdnkdpryffslktdrar

181qvttinahrsylpgqwvylaatydgqfmklyvngaqvatsgeqvggifspltqkckvlml

241ggsalnhnyrgyiehfslwkvartqreilsdmethgahtalpqlllqenwdnvkhawspm

301kdgsspkvefsnahgflldtslepplcgqtlcdnteviasynqlssfrqpkvvryrvvnl

361yeddhknptvtreqvdfqhhqlaeafkqynisweldvlevsnsslrrrlilancdiskig

421dencdpecnhtltghdggdcrhlrhpafvkkqhngvcdmdcnyerfnfdggeccdpeitn

481vtqtcfdpdsphrayldvnelknilkldgsthlniffaksseeelagvatwpwdkealmh

541lggivlnpsfygmpghthtmiheighslglyhvfrgiseiqscsdpcmetepsfetgdlc

601ndtnpapkhkscgdpgpgndtcgfhsffntpynnfmsyadddctdsftpnqvarmhcyld

661lvyqgwqpsrkpapvalapqvlghttdsvtlewfppidghfferelgsachlclegrilv

721qyasnasspmpcspsghwspreaeghpdveqpckssvrtwspnsavnphtvppacpepqg

781cyleleflyplvpesltiwvtfvstdwdssgavndikllavsgknislgpqnvfcdvplt

841irlwdvgeevygiqiytldehleidaamltstadtplclqckplkykvvrdpplqmdvas

901ilhlnrkfvdmdlnlgsvyqywvitisgteesepspavtyihgsgycgdgiiqkdqgeqc

961ddmnkingdgcslfcrqevsfncidepsrcyfhdgdgvceefeqktsikdcgvytpqgfl

1021dqwasnasvshqdqqcpgwviigqpaasqvcrtkvidlsegisqhawypctisypysqla

1081qttfwlrayfsqpmvaaavivhlvtdgtyygdqkqetisvqlldtkdqshdlglhvlscr

1141nnpliipvvhdlsqpfyhsqavrvsfssplvaisgvalrsfdnfdpvtlsscqrgetysp

1201aeqscvhfacektdcpelavenaslncsssdryhgaqctvscrtgyvlqirrddeliksq

1261tgpsvtvtctegkwnkqvacepvdcsipdhhqvyaasfscpegttfgsqcsfqcrhpaql

1321kgnnslltcmedglwsfpealcelmclapppvpnadlqtarcrenkhkvgsfckykckpg

1381yhvpgssrkskkrafktqctqdgswqegacvpvtcdppppkfhglyqctngfqfnsecri

1441kcedsdasqglgsnvihcrkdgtwngsfhvcqemqgqcsvpnelnsnlklqcpdgyaigs

1501ecatscldhnsesiilpmnvtvrdiphwlnptrvervvctaglkwyphpalihcvkgcep

1561fmgdnycdainnrafcnydggdcctstvktkkvtpfpmscdlqgdcacrdpqaqehsrkd

1621lrgyshg

SEQIDNO：4

PAPP-A2(＝冠毛素-2)前体[智人]

UniProtKB/Swiss-Prot：Q9BXP8.4

1mmclkilrislailagwalcsanselgwtrkkslverehlnqvllegercwlgakvrrpr

61aspqhhlfgvypsragnylrpypvgeqeihhtgrskpdtegnavslvppdltenpaglrg

121aveepaapwvgdspigqsellgdddaylgnqrskeslgeagiqkgsamaattttaifttl

181nepkpetqrrgwaksrqrrqvwkrraedgqgdsgisshfqpwpkhslkhrvkksppeesn

241qnggegsyreaetfnsqvglpilyfsgrrerlllrpevlaeipreaftveawvkpeggqn

301npaiiagvfdncshtvsdkgwalgirsgkdkgkrdarfffslctdrvkkatilishsryq

361pgtwthvaatydgrhmalyvdgtqvassldqsgplnspfmascrslllggdssedghyfr

421ghlgtlvfwstalpqshfqhssqhssgeeeatdlvltasfepvntewvpfrdekyprlev

481lqgfepepeilsplqpplcgqtvcdnvelisqyngywplrgekviryqvvnicddeglnp

541ivseeqirlqhealneafsryniswqlsvhqvhnstlrhrvvlvncepskigndhcdpec

601ehpltgydggdcrlqgrcyswnrrdglchvecnnmlndfddgdccdpqvadvrktcfdpd

661spkraymsvkelkealqlnsthflniyfassvredlagaatwpwdkdavthlggivlspa

721yygmpghtdtmihevghvlglyhvfkgvserescndpcketvpsmetgdlcadtaptpks

781elcrepeptsdtcgftrfpgapftnymsytddnctdnftpnqvarmhcyldlvyqqwtes

841rkptpipippmvigqtnksltihwlppisgvvydrasgslcgactedgtfrqyvhtassr

901rvcdssgywtpeeavgppdvdqpcepslqawspevhlyhmnmtvpcptegcslellfqhp

961vqadtltlwvtsffmessqvlfdteillenkesvhlgpldtfcdipltiklhvdgkvsgv

1021kvytfderieidaalltsqphsplcsgcrpvryqvlrdppfasglpvvvthshrkftdve

1081vtpgqmyqyqvlaeaggelgeaspplnhihgapycgdgkvserlgeecddgdlvsgdgcs

1141kvceleegfncvgepslcymyegdgicepferktsivdcgiytpkgyldqwatraysshe

1201dkkkcpvslvtgephslictsyhpdlpnhrpltgwfpcvasenetqddrseqpegslkke

1261devwlkvcfnrpgearaififlttdglvpgehqqptvtlyltdvrgsnhslgtyglscqh

1321npliinvthhqnvlfhhttsvllnfssprvgisavalrtssriglsapsncisedegqnh

1381qgqscihrpcgkqdscpsllldhadvvnctsigpglmkcaitcqrgfalqassgqyirpm

1441qkeilltcssghwdqnvsclpvdcgvpdpslvnyanfscsegtkflkrcsiscvppaklq

1501glspwltcledglwslpevycklecdappiilnanlllphclqdnhdvgtickyeckpgy

1561yvaesaegkvmkllkiqcleggiweqgscipvvceppppvfegmyectngfsldsqcvl

1621ncnqereklpilctkeglwtqefklcenlqgecppppselnsveykceqgygigavcspl

1681cvippsdpvmlpenitadtlehwmepvkvqsivctgrrqwhpdpvlvhciqscepfqadg

1741wcdtinnraychydggdccsstlsskkvipfaadcdldectcrdpkaeenq

SEQIDNO：5

斯钙素-1(＝STC1)cDNA[智人]

人斯钙素1cDNA

http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi？REQUEST＝CCDS&GO＝MainBrowse&DATA＝CCDS6043.1

ATGCTCCAAAACTCAGCAGTGCTTCTGGTGCTGGTGATCAGTGCTTCTGCAACCCATGAGGCGGAGCAGAATGACTCTGTGAGCCCCAGGAAATCCCGAGTGGCGGCTCAAAACTCAGCTGAAGTGGTTCGTTGCCTCAACAGTGCTCTACAGGTCGGCTGCGGGGCTTTTGCATGCCTGGAAAACTCCACCTGTGACACAGATGGGATGTATGACATCTGTAAATCCTTCTTGTACAGCGCTGCTAAATTTGACACTCAGGGAAAAGCATTCGTCAAAGAGAGCTTAAAATGCATCGCCAACGGGGTCACCTCCAAGGTCTTCCTCGCCATTCGGAGGTGCTCCACTTTCCAAAGGATGATTGCTGAGGTGCAGGAAGAGTGCTACAGCAAGCTGAATGTGTGCAGCATCGCCAAGCGGAACCCTGAAGCCATCACTGAGGTCGTCCAGCTGCCCAATCACTTCTCCAACAGATACTATAACAGACTTGTCCGAAGCCTGCTGGAATGTGATGAAGACACAGTCAGCACAATCAGAGACAGCCTGATGGAGAAAATTGGGCCTAACATGGCCAGCCTCTTCCACATCCTGCAGACAGACCACTGTGCCCAAACACACCCACGAGCTGACTTCAACAGGAGACGCACCAATGAGCCGCAGAAGCTGAAAGTCCTCCTCAGGAACCTCCGAGGTGAGGAGGACTCTCCCTCCCACATCAAACGCACATCCCATGAGAGTGCATAA

SEQIDNO：6

斯钙素-2(＝STC2)cDNA[智人]

人斯钙素2cDNA

http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi？REQUEST＝GV&DATA＝274786&BUILDS＝CURRENTBUILDS

ATGTGTGCCGAGCGGCTGGGCCAGTTCATGACCCTGGCTTTGGTGTTGGCCACCTTTGACCCGGCGCGGGGGACCGACGCCACCAACCCACCCGAGGGTCCCCAAGACAGGAGCTCCCAGCAGAAAGGCCGCCTGTCCCTGCAGAATACAGCGGAGATCCAGCACTGTTTGGTCAACGCTGGCGATGTGGGGTGTGGCGTGTTTGAATGTTTCGAGAACAACTCTTGTGAGATTCGGGGCTTACATGGGATTTGCATGACTTTTCTGCACAACGCTGGAAAATTTGATGCCCAGGGCAAGTCATTCATCAAAGACGCCTTGAAATGTAAGGCCCACGCTCTGCGGCACAGGTTCGGCTGCATAAGCCGGAAGTGCCCGGCCATCAGGGAAATGGTGTCCCAGTTGCAGCGGGAATGCTACCTCAAGCACGACCTGTGCGCGGCTGCCCAGGAGAACACCCGGGTGATAGTGGAGATGATCCATTTCAAGGACTTGCTGCTGCACGAACCCTACGTGGACCTCGTGAACTTGCTGCTGACCTGTGGGGAGGAGGTGAAGGAGGCCATCACCCACAGCGTGCAGGTTCAGTGTGAGCAGAACTGGGGAAGCCTGTGCTCCATCTTGAGCTTCTGCACCTCGGCCATCCAGAAGCCTCCCACGGCGCCCCCCGAGCGCCAGCCCCAGGTGGACAGAACCAAGCTCTCCAGGGCCCACCACGGGGAAGCAGGACATCACCTCCCAGAGCCCAGCAGTAGGGAGACTGGCCGAGGTGCCAAGGGTGAGCGAGGTAGCAAGAGCCACCCAAACGCCCATGCCCGAGGCAGAGTCGGGGGCCTTGGGGCTCAGGGACCTTCCGGAAGCAGCGAGTGGGAAGACGAACAGTCTGAGTATTCTGATATCCGGAGGTGA

SEQIDNO：7

鼠PAPP-A2引物

(5’-CCGAGAGGTCAGGAGAGCAG-3’(核苷酸3120-3101)和

SEQIDNO：8

鼠PAPP-A2引物

5’-GAGCTTCTCTTTTAGTCTGCCCCC

SEQIDNO：9

鼠PAPP-A2引物

(5’-CCGGGGTACCATGATGTGTTGGAAGGTCCTGAG

SEQIDNO：10

鼠PAPP-A2引物

5’-GATGGTGAGCGGTATGTCACAA

SEQIDNO：11

鼠PAPP-A2引物

5’-CCGGTCCAGGCGGATACCCT

SEQIDNO：12

鼠PAPP-A2引物

5’-GATCTCTAGATTACTGGTTTTCTTCTGCCTTGGGG

SEQIDNO：13

STC2引物

5’-GCACAGGTTCGGCGCCATAAGCCGGAAGTG

SEQIDNO：14

STC2引物

5’-CACTTCCGGCTTATGGCGCCGAACCTGTGC

SEQIDNO：15

STC2引物

5’-CAGCGTGCAGGTTCAGGCTGAGCAGAACTGGGGAAG

SEQIDNO：16

STC2引物

5’-CTTCCCCAGTTCTGCTCAGCCTGAACCTGCACGCTG

SEQIDNO：17

STC2引物

5’-GAACTGGGGAAGCCTGGCCTCCATCTTGAGCTTC

SEQIDNO：18

STC2引物

5’-GAAGCTCAAGATGGAGGCCAGGCTTCCCCAGTTC

Claims

1.一种药物组合物，其包含能够提高或降低斯钙素多肽的水平，和/或能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的用于药物中的剂

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述剂为斯钙素多肽或其部分、靶向斯钙素的siRNA或一种。

3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述剂是对斯钙素或冠毛素有特异性，抑制斯钙素与冠毛素的相互作用的封闭性抗体。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于伤口愈合和/或骨重建或骨生长，和/或用于治疗再狭窄、动脉粥样硬化、排卵、纤维化或癌症，例如卵巢癌、睾丸癌、肺癌或消化系统的任何癌症，包括室性癌、结肠癌、小肠癌和直肠癌。

5.一种通过降低或提高相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的水平降低或提高冠毛素多肽的活性的方法。

6.根据权利要求5所述的方法，其中为包含所述冠毛素多肽的样品提供能够降低或提高斯钙素多肽的水平和/或相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的水平的剂。

7.根据前述权利要求5和6中任一项所述的方法，其中

a.通过提高斯钙素多肽的水平降低冠毛素多肽的活性，并且

b.通过降低斯钙素多肽的水平提高冠毛素多肽的活性。

8.根据前述权利要求5-7中任一项所述的方法，其中通过提供拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用的剂提高冠毛素多肽的活性。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述剂为斯钙素定向siRNA或抗体，例如能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的抗体，例如特异性结合冠毛素多肽或斯钙素多肽的抗体，尤其是特异性结合冠毛素或斯钙素的结合区的抗体。

10.根据前述权利要求5-7中任一项所述的方法，其中通过使所述冠毛素与斯钙素多肽接触而抑制冠毛素多肽的活性。

11.根据权利要求10所述的方法，其中使用表达所述斯钙素多肽或其部分的核酸载体，例如使用病毒或逆转录病毒载体向细胞施用所述斯钙素多肽或其部分。

12.根据前述权利要求5-11中任一项所述的方法，其中提高或降低在人类细胞，例如在人类干细胞中的斯钙素多肽的水平。

13.一种预防、治疗或改善哺乳动物受试者，例如人类中的临床病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者，例如人类施用有效量的斯钙素多肽。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中冠毛素多肽的活性受抑制。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述冠毛素多肽的活性受冠毛素多肽与至少一种斯钙素多肽的相互作用抑制。

16.根据前述权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述临床病状为增生性病症。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中增生过程受抑制。

18.根据前述权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述临床病状为再狭窄、动脉粥样硬化、排卵、纤维化或癌症。

19.根据前述权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述临床病状为血管病，例如动脉粥样硬化或再狭窄。

20.根据前述权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述临床病状为积液增加的病状，例如卵巢癌患者中的腹水产生。

21.根据前述权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述临床病状与人类生殖有关。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述增生过程与冠毛素表达相关。

23.根据前述权利要求13-18中任一项所述的方法，其中所述增生过程和/或增生性病症与冠毛素介导的胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)，例如IGFBP4的裂解相关。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌、睾丸癌、肺癌或消化系统的任何癌症，包括室性癌、结肠癌、小肠癌和直肠癌，尤其，所述癌症选自卵巢癌、肺癌和结肠癌。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述临床病状是与冠毛素表达，例如冠毛素表达增加相关的癌症，例如，所述临床病状是特征在于冠毛素表达增加的卵巢癌。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述斯钙素多肽作为多肽和/或使用表达所述斯钙素多肽的核酸载体施用。

27.一种预防、治疗或改善哺乳动物受试者，例如人类中的临床病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者，例如人类施用有效量的能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述增生过程受刺激。

29.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述临床病状为骨生长或骨重建。

30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述临床病状为伤口，并且所述治疗或改善为伤口愈合。

31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述剂为斯钙素定向siRNA和/或抗体，例如能够拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用的抗体。

32.根据权利要求27-31中任一项所述的方法，其中所述剂是对斯钙素或冠毛素有特异性，抑制斯钙素与冠毛素的相互作用的封闭性抗体。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述临床病状与增生过程相关

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过所述剂的局部施用在所述哺乳动物受试者，例如人类的特定组织，例如在皮组织中调节所述增生过程。

35.一种能够特异性结合包含至少一种斯钙素和冠毛素多肽或由至少一种斯钙素和冠毛素多肽组成的共价和/或非共价复合物的抗体。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述相互作用是PAPP-A和斯钙素1之间的非共价相互作用和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价复合。

37.一种能够拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的抗体。

38.根据权利要求37所述的抗体，其中所述抗体能够结合冠毛素多肽和/或斯钙素多肽。

39.根据权利要求35-38中任一项所述的抗体，其中所述相互作用是PAPP-A和斯钙素1之间的非共价相互作用和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价复合。

40.一种生成包含冠毛素多肽的组合物的方法，其中所述组合物基本上无斯钙素多肽和包含斯钙素多肽的复合物，所述方法包括以下步骤

41.根据权利要求40所述的方法，其中去除游离斯钙素多肽和/或与其它多肽相互作用的斯钙素多肽，尤其是与冠毛素多肽相互作用的斯钙素多肽。

42.根据权利要求40-41中任一项所述的方法，其中包含冠毛素多肽的所述组合物通过以下步骤生成

a.培养表达冠毛素的细胞系足够量的时间以生成冠毛素

b.收集所述培养基，并且

c.从所述培养基中去除斯钙素多肽。

43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述方法包括

a.提供表达冠毛素的细胞系，

c.培养所述细胞系足够量的时间以生成冠毛素，并且

d.收集所述培养基。

44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述细胞系为A549细胞系。

45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中通过敲除和/或敲减所述细胞系中的一个或多个斯钙素基因去除所述斯钙素多肽。

46.根据权利要求40-45中任一项所述的方法，其中通过亲和色谱法去除所述斯钙素多肽。

47.一种包含冠毛素的组合物，其中所述组合物基本上无斯钙素。

48.根据权利要求47所述的冠毛素多肽，其中通过根据权利要求37-43中任一项所述的方法获得所述组合物。

49.一种量化样品中冠毛素多肽的水平的方法，所述方法包括

a.提供样品

c.测量所述样品和所述参考样品中冠毛素的水平，

e.基于所述相关性，量化所述样品中冠毛素多肽的水平。

50.一种包含至少一种冠毛素多肽和至少一种斯钙素多肽或由至少一种冠毛素多肽和至少一种斯钙素多肽组成的共价或非共价复合物。

51.根据权利要求50所述的冠毛素多肽，其中所述复合物是PAPP-A和斯钙素1之间的非共价相互作用物和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价相互作用物，和/或PAPP-A2和斯钙素1之间的非共价相互作用物和/或PAPP-A2和斯钙素2之间的共价相互作用物。

52.一种生成对相互作用的冠毛素和斯钙素多肽有特异性的抗体的方法，所述方法包括

a.提供动物，例如小鼠

b.用相互作用的冠毛素和斯钙素多肽免疫所述动物，并且

c.从所述动物获得抗体。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述方法包括以下步骤

a.提供动物

b.提供相互作用的冠毛素和斯钙素多肽

c.向所述动物施用步骤b.的所述相互作用多肽

d.饲养所述动物足够时间以生成抗体

e.从所述动物获得样品，并且

f.从所述样品获得抗体。

54.根据权利要求52-53中任一项所述的方法，其中所述冠毛素多肽和斯钙素多肽共价地或非共价地相互作用。

55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体，并且所述方法包括以下步骤

a.提供动物，

b.提供相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，

c.向所述动物施用步骤b.的所述相互作用多肽，

d.饲养所述动物足够时间以生成抗体，

e.从所述动物获得组织样品，例如脾脏样品，

f.分离所述组织样品的产抗体细胞，

g.通过步骤f.的所述分离细胞与适合细胞系的融合生成产抗体杂交瘤细胞，并且

h.分离表达所述单克隆抗体的杂交瘤细胞。

56.一种鉴定能够促进或拮抗斯钙素多肽与冠毛素多肽的相互作用的剂的方法，所述方法包括

a.提供冠毛素多肽和斯钙素多肽，

b.提供所述剂，

c.用所述冠毛素和斯钙素多肽孵育所述剂，

e.根据在步骤d.中检测的在所述剂存在和缺乏时相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的水平确定所述剂是否能够促进或拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用。

57.根据权利要求56所述的方法，其中

b.相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的存在表明剂不能够拮抗斯钙素与冠毛素的相互作用。

58.根据权利要求56和57中任一项所述的方法，其中所述剂为抗体。

59.一种鉴定能够特异性结合以下的剂的方法

a.相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，

b.冠毛素或斯钙素多肽的多肽区，所述区域并非相互作用的冠毛素和斯钙素多肽中暴露的表面，

c.未结合的冠毛素多肽，和/或

d.未结合的斯钙素多肽，

所述方法包括

i.提供所述剂，

iii.确定所述剂是否结合所述未结合的斯钙素多肽；和/或未结合的冠毛素多肽；和/或相互作用的冠毛素和斯钙素多肽中的一种或多种。

60.根据权利要求59所述的方法，其中鉴定能够结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂，所述方法包括

a.提供所述剂，

b.使所述剂与相互作用的冠毛素和斯钙素多肽接触，

d.选择结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽的剂。

61.根据权利要求59所述的方法，其中鉴定能够结合冠毛素或斯钙素多肽的多肽区的剂，所述区域并非相互作用的冠毛素和斯钙素多肽中暴露的表面，所述方法包括

a.提供所述剂，

62.根据权利要求59所述的方法，其中鉴定能够结合未结合的斯钙素多肽的剂，所述方法包括

a.提供所述剂，

c.确定所述剂是否结合斯钙素多肽和/或相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，并且

63.根据权利要求59所述的方法，其中鉴定能够结合未结合的冠毛素多肽的剂，其中所述剂在包含斯钙素结合位点的区域内结合冠毛素，所述方法包括

a.提供所述剂，

b.使所述剂与未结合的冠毛素多肽接触，

c.确定所述剂是否结合冠毛素多肽而不结合相互作用的冠毛素和斯钙素多肽，并且

64.根据权利要求59-62中任一项所述的方法，其中所述剂为抗体。

65.根据权利要求61-63中任一项所述的方法，其中所述斯钙素多肽为不形成斯钙素二聚体的修饰多肽，例如具有经取代的一个或多个半胱氨酸残基的斯钙素多肽。

66.一种检测样品中冠毛素多肽和斯钙素多肽之间的共价或非共价复合物的方法，所述方法包括

a.提供所述样品，

b.提供至少一种对所述冠毛素多肽和/或所述斯钙素多肽有亲和力的抗体，和/或至少一种对相互作用的冠毛素和斯钙素多肽有亲和力的抗体，

d.去除过量未结合的样品，并且

f.检测和量化c.和/或e.的未结合抗体的量。

67.根据权利要求66所述的方法，所述方法包括

a.提供所述样品，

b.将所述样品暴露于对所述冠毛素或斯钙素多肽之一有亲和力的捕捉抗体以形成所述捕捉抗体和所述多肽之间的复合物，

c.将所述样品暴露于对所述其它冠毛素或斯钙素多肽有亲和力的检测抗体，

d.将所述抗体-冠毛素-斯钙素复合物暴露于针对所述检测抗体的另一种抗体；并且

e.检测和量化结合的检测抗体和/或另一种抗体的量。

68.根据权利要求66和67中任一项所述的方法，其中所述相互作用的冠毛素和斯钙素多肽为PAPP-A和斯钙素1之间的非共价相互作用物和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价复合物。

69.一种确定临床病状的方法，所述方法包括检测相互作用的冠毛素和斯钙素多肽。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述相互作用物为PAPP-A和斯钙素1之间的非共价复合物和/或PAPP-A和斯钙素2之间的共价复合物。

71.根据权利要求69-70中任一项所述的方法，其中使用至少一种抗体，例如两种抗体检测所述相互作用物。

72.根据权利要求69-71中任一项所述的方法，其中使用冠毛素特异性抗体和/或斯钙素特异性抗体检测所述相互作用物。

73.根据权利要求69-72中任一项所述的方法，其中通过如权利要求62-68中任一项中所定义的方法检测所述复合物。

74.根据权利要求69-73中任一项所述的方法，其中所述临床病状为癌症，例如卵巢癌、睾丸癌、肺癌或消化系统的任何癌症，包括室性癌、结肠癌、小肠癌和直肠癌。

75.根据前述权利要求中任一项所述的方法、抗体、调节剂、组合物和复合物，其中所述斯钙素多肽选自

a.斯钙素1(SEQIDNO:1)和/或斯钙素2(SEQIDNO:2)，

b.与SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中的任一个具有至少70％同一性的多肽变体，

c.a.和b.的任何多肽的多肽片段。

76.根据前述权利要求中任一项所述的方法、抗体、调节剂、组合物和复合物，其中所述冠毛素多肽选自

a.PAPP-A(SEQIDNO:3)或PAPP-A2(SEQIDNO:4)

c.a.和b.的任何多肽的多肽片段

d.由独立地选自a.-c.的任何多肽的两个多肽组成的二聚体。