MX2007012627A

MX2007012627A - Metodo de tratamiento del dolor causado por la osteoartritis por medio de la administracion de un antagonista del factor de crecimiento neuronal y composiciones que lo contienen.

Info

Publication number: MX2007012627A
Application number: MX2007012627A
Authority: MX
Inventors: Arnon Rosenthal; David L Shelton; Patricia Ann Walicke
Original assignee: Rinat Neuroscience Corp
Priority date: 2005-04-11
Filing date: 2006-04-11
Publication date: 2008-01-11
Also published as: AR106702A2; KR20070119748A; US9340610B2; PL1871416T3; RU2007137102A; PT2305711T; ES2641787T3; WO2006110883A8; AU2006235559B2; WO2006110883A2; US7569364B2; NZ562229A; JP5340724B2; WO2006110883A3; CA2604443A1; US20080182978A1; JP2013100335A; HK1186127A1; ES2389960T3; IL239170A0

Abstract

Anticuerpos anti-NGF (tales como anticuerpos de antagonistas anti-NGF), y polinucleotidos que los codifican. Uso de dichos anticuerpos y/o polinucleotidos en el tratamiento y/o prevencion del dolor, incluyendo el dolor post-quirurgico, el dolor de la artritis reumatoide y el dolor causado por la osteoartritis.

Description

MÉTODOS DE TRATAMIENTO DEL DOLOR CAUSADO POR LA OSTEOARTRIT1S POR MEDIO DE LA ADMINISTRACIÓN DE UN ANTAGONISTA DEL FACTOR DE CRECIMIENTO NEURONAL Y COMPOSICIONES QUE LO CONTIENEN CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con anticuerpos anti-NGF (tales como anticuerpos antagonistas anti-NGF). Además, la invención se relaciona con el uso de antagonistas, tales como anticuerpos, en el tratamiento y/o la prevención del dolor, incluyendo el dolor post-quirúrgico, el dolor provocado por la artritis reumática y el dolor provocado por la osteoartritis. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de crecimiento neuronal (NGF) fue la primera neurotrofina identificada, y se ha caracterizado bien su participación en el desarrollo y la supervivencia de las neuronas periféricas y centrales. Se ha demostrado que el NGF es un factor crítico de supervivencia y mantenimiento en el desarrollo de las neuronas sensoriales periféricas simpáticas y embrionarias, y de las neuronas colinérgicas básales del cerebro anterior. Smeyne et al., Nature 368:246-249 (1994) y Crowley et al., Cell 76:1001-1011 (1994). El NGF regula positivamente la expresión de neuropéptidos en las neuronas sensoriales (Lindsay y Harmer, Nature 337:362-364 (1989)), y su actividad es mediada por dos receptores unidos a membrana, el receptor de tirosin quinasa TrkA y el receptor de neurotrofina común p75 (algunas veces denominados receptores de NGF de "afinidad elevada" y "baja afinidad", respectivamente). Chao et al., Science 232:518-521 (1986). El receptor p75 está relacionado desde el punto de vista estructural con otros miembros de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral (Chao, et al., Science 232:518-521 (1986)). Para hallar una revisión sobre el NGF, véanse Huang et al., Annu. Rev. Neurosci. 24:677-736 (2001 ); Bibel et al., Genes Dev. 14:2919-2937 (2000). Se ha determinado la estructura cristalina del NGF y el NGF en un complejo con el receptor de trkA. Véase Nature 254:411 (1991 ); Nature 401 :184-188 (1996). Además de sus efectos sobre el sistema nervioso central, se ha implicado cada vez más el NGF en procesos fuera del sistema nervioso. Por ejemplo, se ha demostrado que el NGF mejora la permeabilidad vascular (Otten, et al., Eur J Pharmacol. 106:199-201 (1984)), mejora las respuestas inmunes de las células T y B (Otten, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:10059-10063 (1989)), induce la diferenciación de los linfocitos y la proliferación de los mastocitos, y provoca la liberación de señales biológicas solubles por los mastocitos (Matsuda, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:6508-6512 (1988); Pearce, et al., J. Physiol. 372:379-393 (1986); Bischoff, et al., Blood 79:2662-2669 (1992); Horigome, et al., J. Biol. Chem. 268:14881-14887 (1993)). Aunque se ha demostrado que el NGF agregado por vía exógena puede tener todos estos efectos, es importante destacar que solamente se ha demostrado raramente que el NGF endógeno es importante en cualquiera de estos procesos in vivo (Torda, et al., Cell. 85(3):345-56 (1996)). Por consiguiente, no está claro cuál pueda ser el efecto, de existir en absoluto, de la inhibición de la actividad biológica del NGF endógeno. El NGF es producido por una cantidad de tipos celulares, incluyendo los mastocitos (León, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:3739-3743 (1994)), los linfocitos B (Torda, et al., Cell 85:345-356 (1996), los queratínocitos (Di Marco, et al., J. Biol. Chem. 268:22838-22846)), las células de músculo liso (Ueyama, et al., J. Hypertens. 11:1061-1065 (1993)), los fibroblastos (Lindholm, et al., Eur. J. Neurosci. 2:795-801 (1990)), las células del epitelio bronquial (Kassel, et al., Clin, Exp. Allergy 31 :1432-40 (2001 )), las células del mesangio renal (Steiner, et al., Am. J. Physiol. 261:F792-798 (1991)) y los miotúbulos del músculo esquelético (Schwartz, et al., J Photochem. Photobiol. B66: 195-200 (2002)). Se han hallado receptores de NGF en una variedad de tipos celulares fuera del sistema nervioso. Por ejemplo, se ha hallado TrkA en monocitos, linfocitos T y B y mastocitos humanos. Se ha observado una asociación entre los niveles de NGF incrementados y una variedad de condiciones inflamatorias, en pacientes humanos y en diversos modelos animales. Éstas incluyen el lupus eritematoso sistémico (Bracci-Laudiero, et al., Neuroreport 4:563-565 (1993)), la esclerosis múltiple (Bracci-Laudiero, et al., Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), la psoriasis (Raychaudhuri, et al., Acta Derm. I'enereol. 78:84-86 (1998)), la artritis (Falcim, et al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), la cistitis intersticial (Okragly, et al., J. Urology 161 :438-441 (1999)) y el asma (Braun, et al., Eur. J Immunol. 28:3240-3251 (1998)). De forma consistente, se asocia un nivel de NGF elevado en tejidos periféricos con hiperalgesia y inflamación, y se lo ha observado en una cantidad de formas de artritis. El tejido sinovial de los pacientes afectados por la artritis reumática expresa niveles elevados de NGF, pero se ha informado que es imposible detectar NGF en tejido sinovial no inflamado (Aloe, et al., Arch.

Rheum. 35:351-355 (1992)). Se observaron resultados similares en ratas con artritis reumática inducida en forma experimental (Aloe, et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204 (1992)). Se ha informado la presencia de niveles elevados de NGF en ratones transgénicos con artritis, junto con un incremento en la cantidad de mastocitos (Aloe, el al., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143 (1993)). En la Publicación PCT N° WO 02/096458 se describe el uso de anticuerpos anti-NGF con propiedades determinadas en el tratamiento de diversos trastornos relacionados con el NGF, tales como condiciones inflamatorias (por ejemplo, artritis reumático). Se ha informado que un anticuerpo anti-NGF purificado inyectado en ratones transgénícos con artritis que poseen el gen del factor de necrosis tumoral ex (TNF-a) provoca la reducción en la cantidad de mastocitos, así como una disminución en los nivele de histamina y sustancia P en el tejido sinovial de ratones con artritis (Aloe et al., Rheumatol. Int. 14: 249-252 (1995)). También se ha demostrado que la administración exógena de un anticuerpo contra NGF reduce el nivel mejorado de TNF-a en ratones con artritis (Manni et al., Rheumatol. Int. 18: 97-102 (1998)). También se ha observado una mayor expresión de NGF y una afinidad elevada por el receptor de NGF (TrkA) en condrocitos de seres humanos con osteoartritis (lannone et al., Rheumatology 41 :1413-1418 (2002)). Se han descripto anticuerpos antagonistas anti-NGF de roedores. Véase, por ejemplo, Hongo et al, Hybridoma (2000) 19(3):215-227; Ruberti et Al. (1993) Cell. Molec. Neurobiol. 13(5): 559-568. Sin embargo, cuando se usan anticuerpos de roedores en seres humanos con fines terapéuticos, se desarrolla una respuesta de anticuerpos contra el anticuerpo murino en una cantidad significativa de individuos tratados. Además, se ha comprobado que las funciones efectoras de los anticuerpos de ratón son menos eficientes en el contexto humano. Por consiguiente, existe una necesidad seria de anticuerpos antagonistas anti-NGF, incluyendo anticuerpos antagonistas anti-NGF humanizados. Todas las referencias, las publicaciones y las solicitudes de patente descriptas en la presente documentación se incorporan por completo en la presente documentación a modo de referencia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención descrita en la presente documentación se relaciona con anticuerpos contra el factor de crecimiento neuronal. En otro aspecto, la invención comprende un anticuerpo humanizado y madurado por afinidad, E3, que se une específicamente al factor de crecimiento neuronal humano y de roedor ("NGF"). Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena liviana de E3 se indican en las Figuras 1A (SEQ ID N° 1 ) y 1B (SEQ ID N° 2), respectivamente. Las porciones de las CDR del anticuerpo E3 (incluyendo las CDR Chotia y Kabat) se ilustran en forma diagramática en las Figuras 1A y 1B. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y liviana de E3, y de las CDR individuales extendidas también se indican más adelante (véanse las "secuencias de anticuerpos" más adelante). En otro aspecto, la invención abarca un anticuerpo que comprende un fragmento o una región del anticuerpo E3 (denominado indistintamente "E3" en la presente documentación). En una realización, el fragmento es una cadena liviana del anticuerpo E3, como se indica en la Figura 1B. En otra realización, el fragmento es una cadena pesada del anticuerpo E3, como se indica en la Figura 1A. En aún otra realización, el fragmento contiene una o más regiones variables de una cadena liviana y/o una cadena pesada del anticuerpo E3. En aún otra realización, el fragmento contiene una o más regiones de determinación de la complementariedad (CDR) de una cadena liviana y/o una cadena pesada del anticuerpo E3, como se indica en las Figuras 1A y 1 B. En otro aspecto, la invención abarca un anticuerpo que comprende una cadena liviana que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito ATCC N° PTA-4893 o ATCC N° PTA-4894. En otro aspecto, la invención abarca un anticuerpo que comprende una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito ATCC N° PTA-4895. En otro aspecto, la invención abarca un anticuerpo que comprende (a) una cadena liviana que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito ATCC N° PTA-4894 o ATCC N° PTA-4893; y (b) una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito ATCC N° PTA- 4895 (por motivos de conveniencia en la presente documentación, el o los polinucleótidos producidos por una célula huésped depositadas se designan con los números de depósito ATCC N° PTA-4894, PTA-4893 y PTA-4895). En otro aspecto, la invención abarca un anticuerpo que comprende una región variable de cadena liviana de una cadena liviana, que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito ATCC N° PTA-4894 o ATCC N° PTA-4893. En otro aspecto, la invención abarca un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de una cadena pesada, que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito ATCC N° PTA-4895. En otro aspecto, la invención abarca un anticuerpo que comprende (a) una región variable de cadena liviana de una cadena liviana, que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito ATCC N° PTA-4894 o ATCC N° PTA-4893, y (b) una región variable de cadena pesada de una cadena pesada, que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito ATCC N° PTA-4895. En aún otro aspecto, la invención abarca un anticuerpo que comprende una o más CDR codificadas por (a) un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito ATCC N° PTA-4894; y/o (b) una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito ATCC N° PTA-4895. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende la región constante de la cadena pesada lgG2a humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende la región constante de la cadena liviana kappa humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inerte desde el punto de vista inmunológico, por ejemplo, que no desencadena la lísis mediada por complemento o no estimula la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC). En otras realizaciones, la región constante está modificada como se describe en Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; la Solicitud PCT N° PCT/GB99/01441 ; y/o la Solicitud de Patente del Reino Unido N° 9809951.8. En aún otras realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de una cadena pesada lgG2a humana que comprende las siguientes mutaciones: A330P331 por S330S331 (numeración de aminoácidos con referencia a la secuencia lgG2a tipo salvaje). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (que pueden ser o no un anticuerpo) que comprenden uno o más de cualquiera de los siguientes: a) una o más CDR del anticuerpo E3 indicadas en las Figuras 1A y 1B; b) CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo E3 indicada en la Figura 1A; c) CDR L3 de la cadena liviana del anticuerpo E3 indicada en la Figura 1B; d) tres CDR de la cadena liviana del anticuerpo E3 indicada en la Figura 1B; e) tres CDR de la cadena pesada del anticuerpo E3 indicada en la Figura 1 A; y f) tres CDR de la cadena liviana y tres CDR de la cadena pesada, del anticuerpo E3 indicadas en las Figuras 1A y 1 B. Además, en la invención se proveen polipéptidos (que pueden ser o no un anticuerpo) que comprenden uno o más de cualquiera de los siguientes: a) una o más (una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) CDR derivadas del anticuerpo E3 indicadas en las Figuras 1A y 1 B; b) una CDR derivada de una CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo E3 indicada en la Figura 1A; y/o c) una CDR derivada de una CDR L3 de la cadena liviana del anticuerpo E3 indicada en la Figura 1B. En algunas realizaciones, las CDR pueden ser CDR Kabat, CDR Chotia o una combinación de CDR Kabat y Chotia (denominadas CDR "extendidas" o "combinadas" en la presente documentación). En algunas realizaciones, los polipéptidos (tales como un anticuerpo) se unen al NGF (tal como el NGF humano). En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden cualquiera de las configuraciones de CDF (incluyendo combinaciones, variantes, etcétera) descriptas en la presente documentación. En un aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo), que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID N° 9, donde 134 es S, L, V A, o I; y N35 está sustituido por N, T o S. Por razones de conveniencia en la presente documentación, "sustituido" o "es" en este contexto o en referencia a un aminoácido, hace referencia a elecciones de aminoácidos para una posición dado. Como queda claro, la sustitución, o la elección, puede ser el aminoácido ilustrado en una SEQ ID o una Figura.

En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID N° 10, donde M50 es M, I, G, Q, S, o L; A62 es A, o S; y L63 es L o V. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es D, N, o G; y donde Y110 es Y, K, S, R o T. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID N° 11, donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G; y donde Y110 es cualquier aminoácido. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID N° 11 , donde G98 es G, S, A, C, V, N, D, o T; donde G99 es G, S, A, C, V, N, D, o T; donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G; y donde Y110 es cualquier aminoácido. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena liviana que comprende SEQ ID N° 12, donde S26 es S o F; D28 es D, S, A, o Y; y H32 es H, N, o Q. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena liviana que comprende SEQ ID N° 13, donde 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena liviana que comprende SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es K, H, R, o S; y donde Y96 es Y o R.

En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena liviana que comprende SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y donde Y96 es Y o R. En un aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo), que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 9, donde I34 es S, L, V A, o I; y N35 es N, T o S. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptídos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 10, donde M50 es M, I, G, Q, S, o L; A62 es A, o S; y L63 es L o V. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es D, N, o G; y donde Y110 es Y, K, S, R o T. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 11, donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G; y donde Y110 es cualquier aminoácido. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 11 , donde G98 es G, S, A, C, V, N, D, o T; donde G99 es G, S, A, C, V, N, D, o T; donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G; y donde Y110 es cualquier aminoácido. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 12, donde S26 es S o F; D28 es D, S, A, o Y; y H32 es H, N, o Q.

En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 13, donde 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es K, H, R, o S; y donde Y96 es Y o R. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y donde Y96 es Y o R. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como anticuerpos, incluyendo anticuerpos humanizados) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la región CDR1 de SEQ ID N° 9, donde I34 es S, L, V A, o I; y N35 es N, T o S; la región CDR2 de SEQ ID N° 10, donde M50 es M, I, G, Q, S, o L; A62 es A, o S; y L63 es L o V; y la región CDR3 de SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es D, N, o G; donde Y110 es Y, K, S, R o T. En algunas realizaciones, la región variable de la cadena pesada comprende la región CDR3 de SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G; donde Y110 es cualquier aminoácido. En otras realizaciones, la región vapable de la cadena pesada comprende la región CDR3 de SEQ ID N° 11 , donde G98 es G, S, A, C, V, N, D, o T; donde G99 es G, S, A, C, V, N, D, o T; donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G; y donde Y110 es cualquier aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido (tal como un anticuerpo) comprende además una región variable de una cadena liviana de un anticuerpo.

En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena liviana que comprende la región CDR1 de SEQ ID N° 12, donde S26 es S o F; D28 es D, S, A, o Y; y H32 es H, N, o Q; la región CDR2 de SEQ ID N° 13, donde 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T; y la región CDR3 de SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es K, H, R, o S; y donde Y96 es Y o R. En algunas realizaciones, la región variable de la cadena liviana comprende la región CDR3 de SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y donde Y96 es Y o R. En algunas realizaciones, el polipéptido (tal como un anticuerpo) comprende además un anticuerpo cadena pesada. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región CDR1 de SEQ ID N° 9, donde I34 es S, L, V A, o I; y N35 es N, T o S; la región CDR2 de SEQ ID N° 10, donde M50 es M, I, G, Q, S, o L; A62 es A, o S; y L63 es L o V; y la región CDR3 de SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es D, N, o G; donde Y110 es Y, K, S, R o T; y (b) una región variable de cadena liviana que comprende la región CDR1 de SEQ ID N° 12, donde S26 es S o F; D28 es D, S, A, o Y; y H32 es H, N, o Q; la región CDR2 de SEQ ID N° 13, donde 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T; y la región CDR3 de SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es K, H, R, o S; y donde Y96 es Y o R. En algunas realizaciones, la región variable de la cadena liviana comprende la región CDR3 de SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y donde Y96 es Y o R. En algunas realizaciones, la región variable de la cadena pesada comprende la región CDR3 de SEQ ID N° 11, donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G; donde Y110 es cualquier aminoácido. En otras realizaciones, la región variable de la cadena pesada comprende la región CDR3 de SEQ ID N° 11 , donde G98 es G, S, A, C, V, N, D, o T; donde G99 es G, S, A, C, V, N, D, o T; donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G; y donde Y110 es cualquier aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende además una cadena liviana de un anticuerpo. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo humanizado) que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 9, donde I34 es S, L, V A, o I; y N35 es N, T o S; una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 10, donde M50 es M, I, G, Q, S, o L; A62 es A, o S; y L63 es L o V; y una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es D, N, o G; donde Y110 es Y, K, S, R o T. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R; y donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S 105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G; y donde Y110 es cualquier aminoácido. En otras realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 11 , donde G98 es G, S, A, C, V, N, D, o T; donde G99 es G, S, A, C, V, N, D, o T; donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G; y donde Y110 es cualquier aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido (tal como un anticuerpo) comprende además una región variable de una cadena liviana de un anticuerpo. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 12, donde S26 es S o F; D28 es D, S, A, o Y; y H32 es H, N, o Q; una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 13, donde 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T; y una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es K, H, R, o S; y donde Y96 es Y o R. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y donde Y96 es Y o R. En algunas realizaciones, el po péptido (tal como un anticuerpo) comprende además una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo En otro aspecto, en la invención se proveen po péptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden (a) una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 9, donde I34 es S, L, V A, o I, y N35 es N, T o S, una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 10, donde M50 es M, I, G, Q, S, o L, A62 es A, o S, y L63 es L o V, y una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R, donde Y101 es Y o W, donde G103 es G, A, o S, donde T104 es T o S, donde S105 es S, A, o T, donde Y106 es Y, R, T, o M, donde Y107 es Y o F, donde F108 es F o W donde D109 es D N o G y donde Y110 es Y, K, S, R o T, y (b) una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 12, donde S26 es S o F; D28 es D, S, A, o Y, y H32 es H, N, o Q, una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 13, donde 151 es I, T, V o A, y S56 es S o T, y una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E, K92 es K, H, R, o S, y donde Y96 es Y o R En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E, K92 es cualquier aminoácido, T93 es cualquier aminoácido, y donde Y96 es Y o R En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R, donde Y101 es Y o W, donde G103 es G, A, o S, donde T104 es T o S, donde S105 es S, A, o T, donde Y106 es Y, R, T, o M, donde Y107 es Y o F, donde F108 es F o W, donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G, donde Y110 es cualquier aminoácido En otras realizaciones, el po péptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 11 , donde G98 es G, S, A, C, V, N, D, o T, donde G99 es G, S, A, C, V, N, D, o T, donde Y100 es Y, L, o R, donde Y101 es Y o W, donde G103 es G, A, o S, donde T104 es T o S, donde S105 es S, A, o T, donde Y106 es Y, R, T, o M, donde Y107 es Y o F, donde F108 es F o W, donde D109 es S, A, C, G, D, N, T, o G, y donde Y110 es cualquier aminoácido En algunas realizaciones, el polipéptido comprende además una región vapable de una cadena liviana de un anticuerpo En otro aspecto, en la invención se provee un po péptido (tal como anticuerpos) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende (a) una región CDR1 de SEQ ID N° 9, donde I34 es S, L, V A, o I, y N35 esta sustituido por N, T o S, (b) una región CDR2 de SEQ ID N° 10, donde M50 es I, G, Q, S, o L; A62 es A, o S; y L63 es L o V; y (c) una región CDR3 de SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es D, N, o G; y donde Y110 es Y, K, S, R o T; donde el anticuerpo se une al NGF. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como anticuerpos) que comprenden una región variable de cadena liviana que comprende: (a) una región CDR1 de SEQ ID N° 12, donde S26 es S o F; D28 es D, S, A, o Y; y H32 es H, N, o Q; (b) una región CDR2 de SEQ ID N° 13, donde 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T; y (c) una región CDR3 de SEQ ID N° 14, donde K92 es K, H, R, o S; y donde Y96 es Y o R; donde el anticuerpo se une al NGF. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como anticuerpos) que comprenden (a) una región variable de cadena pesada que comprende: (i) una región CDR1 de SEQ ID N° 9, donde I34 está sustituido por S, L, V A, o I; y N35 está sustituido por N, T o S; (ii) una región CDR2 de SEQ ID N° 10, donde M50 es I, G, Q, S, o L; A62 es A, o S; y L63 es L o V; y (iii) una región CDR3 de SEQ ID N° 11 , donde Y100 es Y, L, o R; donde Y101 es Y o W; donde G103 es G, A, o S; donde T104 es T o S; donde S105 es S, A, o T; donde Y106 es Y, R, T, o M; donde Y107 es Y o F; donde F108 es F o W; donde D109 es D, N, o G; donde Y110 es Y, K, S, R o T; y (b) una región variable de cadena liviana que comprende: (i) una región CDR1 de SEQ ID N° 12, donde S26 es S o F; D28 es D, S, A, o Y; y H32 es H, N, o Q; (ii) una región CDR2 de SEQ ID N° 13, donde 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T; y (iii) una región CDR3 de SEQ ID N° 14, donde S91 es S o E; K92 es K, H, R, o S; y donde Y96 es Y o R; donde el anticuerpo se une al NGF. A menos que se indique lo contrario, la selección (por ejemplo, la sustitución) de un aminoácido en una localización es independiente de la selección de un aminoácido en cualquier otra localización. En algunas realizaciones, los polinucleótidos (tales como un anticuerpo) se unen al NGF (tal como NGF humano). En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden cualquiera de las configuraciones de CDR (incluyendo combinaciones, variaciones, etcétera) descriptas en la presente documentación.

Como resulta evidente a partir de la descripción proporcionada en la presente documentación, la numeración de la región variable usada en la presente documentación es una numeración consecutiva. Aquél entrenado en la técnica comprenderá fácilmente que existe una cantidad de sistemas para la numeración de anticuerpos (tales como la numeración Kabat y Chotia), y sabrá cómo convertir la numeración consecutiva en otro sistema de numeración, tal como la numeración Kabat o la numeración Chotia. En otro aspecto, en la invención se provee un polipéptido (tal como un anticuerpo) que comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una secuencia CDR3) seleccionada entre SEQ ID N° 46 ó 50. En aún otras realizaciones, el polipéptido comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 3, 4, 5, 6, 7 y 8. En aún otras realizaciones, el polipéptido comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15. En otro aspecto, en la invención se provee un polipéptido (tal como un anticuerpo) que comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR, tal como una región CDRH1 y/o CDR H2) seleccionada entre (a) SEQ ID N° 28 y/o 29; (b) SEQ ID N° 30 y/o 31; (c) SEQ ID N° 32 y/o 33; (d) SEQ ID N° 34 y/o 35; (e) SEQ ID N° 36 y/o 37; (f) SEQ ID N° 38 y/o 39; y (g) SEQ ID N° 40 y 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDRH1 ) seleccionada entre SEQ ID N° 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR H2) seleccionada entre SEQ ID N° 29, 31 , 33, 35, 37, 39 y 41. En aún otras realizaciones, el polipéptido comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 3, 4, 5, 6, 7 y 8. En aún otras realizaciones, el polipéptido comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 9, 10, 11 , 12, 13, 14 y 15. En otro aspecto, en la invención se provee un polipéptido (tal como un anticuerpo) que comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR, tal como una región CDRL1 y/o CDR L2) seleccionada entre (a) SEQ ID N° 18 y/o 19; (b) SEQ ID N° 20 y/o 21; y (c) SEQ ID N° 22 y/o 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR L1) seleccionada entre SEQ ID N° 18, 20 y 22. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR L2) seleccionada entre SEQ ID N° 19, 21 y 23. En aún otras realizaciones, el polipéptido comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 3, 4, 5, 6, 7 y 8. En aún otras realizaciones, el polipéptido comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 9, 10, 11 , 12, 13, 14 y 15. En otro aspecto, en la invención se provee un polipéptido (tal como un anticuerpo) que comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR, tal como una región CDRL3 y/o CDR H3) seleccionada entre (a) SEQ ID N° 51 y/o 52; (b) SEQ ID N° 55 y/o 56; (c) SEQ ID N° 57 y/o 58; (c) SEQ ID N° 59 y/o 60; (d) SEQ ID N° 61 y/o 62; (e) SEQ ID N° 63 y/o 64. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR L3) seleccionada entre SEQ ID N° 51 , 55, 57, 59, 61 y 63. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR H3) seleccionada entre SEQ ID N° 52, 56, 58, 60, 62 y 64. En aún otras realizaciones, el polipéptido comprende además una secuencia de aminoácidos indicada en una o más de SEQ ID N° 18, 19, 30 y 31. En aún otras realizaciones, el polipéptido comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 3, 4, 5, 6, 7 y 8. En aún otras realizaciones, el polipéptido comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 9, 10, 11 , 12, 13, 14 y 15. En otro aspecto, en la invención se provee un polipéptido (tal como un anticuerpo) que comprende una o más de una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR) indicada en SEQ ID N° 61 , 63, 18, 19, 30 y 31. En un aspecto, en la invención se provee un anticuerpo anti-NGF (tal como un anticuerpo antagonista) que se une al NGF (tal como el NGF humano) con una afinidad elevada. En algunas realizaciones, una afinidad elevada es (a) la unión al NGF con una KD menor que aproximadamente 2 nM (tal como cualquier valor de aproximadamente 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, o menor), y/o una koff más lenta que aproximadamente 6x10'5 s'1); y/o (b) la inhibición (la reducción y/o el bloqueo) de la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF humano con una IC50 (en presencia de NGF aproximadamente 15 pM) con cualquier valor de aproximadamente 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM, o menor; y/o (c) la inhibición (la reducción y/o el bloqueo) de la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF humano con una IC50 (en presencia de NGF aproximadamente 1 ,5 pM) con cualquier valor de aproximadamente 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM, o menor; y/o (d) la inhibición (la reducción y/o el bloqueo) de la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF de rata con una IC50 (en presencia de NGF aproximadamente 15 pM) con cualquier valor de aproximadamente 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, o menor; y/o (e) la inhibición (la reducción y/o el bloqueo) de la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF de rata con una IC50 (en presencia de NGF aproximadamente 1 ,5 pM) cualquier valor de aproximadamente 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM, o menor; y/o (f) y/o se unen al NGF con mayor afinidad que el receptor trkA. En otro aspecto, en la invención se proveen polipéptidos (tales como un anticuerpo), donde los polipéptidos (a) se unen al NGF (tal como el NGF humano) con una KD menor que aproximadamente 2 nM (tal como cualquier valor de aproximadamente 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, o menor), y/o una koff más lenta que aproximadamente 6x10'5 s"1); y/o (b) inhiben la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF humano con una IC50 (en presencia de NGF aproximadamente 15 pM) con cualquier valor de aproximadamente 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM, o menor; y/o (c) inhiben la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF humano con una IC50 (en presencia de NGF aproximadamente 1,5 pM) con cualquier valor de aproximadamente 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM, o menor; y/o se unen al NGF con mayor afinidad que el receptor trkA. En algunas realizaciones, los polipéptidos (a) se unen al NGF con una KD menor que aproximadamente 2 nM; y/o (b) inhiben la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF humano con una IC50 de aproximadamente 100 pM o menor, donde la IC50 se mide en presencia de NGF aproximadamente 15 pM; y/o (c) inhiben la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13 5 dependiente del NGF humano con una IC50 de aproximadamente 10 pM o menor, donde la IC50 se mide en presencia de NGF aproximadamente 1 ,5 pM, donde la IC50 se mide en presencia de NGF aproximadamente 15 pM En algunas realizaciones, los polipeptidos (a) se unen al NGF con una KD menor que aproximadamente 100 pM, y/o (b) inhiben la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13 5 dependiente del NGF humano con una IC50 de aproximadamente 20 pM o menor, donde la IC50 se mide en presencia de NGF aproximadamente 15 pM, y/o (c) inhiben la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13 5 dependiente del NGF humano con una IC50 de aproximadamente 2 pM o menor, donde la IC50 se mide en presencia de NGF aproximadamente 1 ,5 pM Como resulta evidente a partir de la descripción proporcionada en la presente documentación, se excluyen específicamente de la invención las realizaciones de polipéptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos de anticuerpo monoclonal de ratón 91 1 Las secuencias CDR extendidas de Mab 911 se indican en las Figuras 1A y 1 B y en SEQ ID N° 9-14 En algunas realizaciones, en la invención se provee cualquiera de los polipéptidos o los anticuerpos anteriores, donde ademas el po peptido (tal como un anticuerpo) está aislado En algunas realizaciones, el polipeptido (tal como un anticuerpo) está sustanclalmente purificado En aun otras realizaciones, el polipeptido (tal como un anticuerpo) ha sido madurado por afinidad En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo antagonista En algunas realizaciones, el polipeptido (tal como un anticuerpo) comprende secuencias de marco de trabajo humanas En aún otras realizaciones, el polipeptido (tal como un anticuerpo) comprende uno o mas residuos de marco de trabajo no humanos En algunas realizaciones, el polipeptido (tal como un anticuerpo) se une al NGF (tal como el NGF humano) con una KD de 2nM o menor En algunas realizaciones, el polipeptido comprende una o mas (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o mas) sustituciones de aminoácidos humanos respecto de una secuencia de aminoácidos no humana (tal como una región variable secuencia, tal como una secuencia CDR tal como una secuencia de marco de trabajo) En algunas realizaciones, el polipeptido comprende al menos 1 , al menos 2, o más, tal como al menos 3, 4, 5, 6 o más sustituciones de aminoácidos respecto de la secuencia de aminoácidos de un po peptido progenitor (tal como la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo 911 , tal como una o más de SEQ ID N° 9-14). En algunas realizaciones, la afinidad de unión del anticuerpo ha sido alterada (en algunas realizaciones, incrementada) respecto de la afinidad de un anticuerpo progenitor (tal como Mab 911 ). En aún otras realizaciones, la afinidad de unión del anticuerpo es menor que la afinidad de unión de receptor trkA por el NGF (tal como el NGF humano). En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden ser anticuerpos. En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos humanos. En otras realizaciones, los anticuerpos son anticuerpo humanizados. En aún otras realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo madurado por afinidad. En la invención se proveen polinucleótidos (incluyendo polinucleótidos aislados) que comprenden polinucleótidos que codifican cualquiera de las realizaciones anteriores. En otro aspecto, en la invención se provee un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica un fragmento o una región del anticuerpo E3 (denominado indistintamente "E3" en la presente documentación). En una realización, el fragmento es la cadena liviana del anticuerpo E3 indicada en la Figura 1B. En otra realización, el fragmento es la cadena pesada del anticuerpo E3 indicada en la Figura 1A. En aún otra realización, el fragmento contiene una o más regiones variables de una cadena liviana y/o una cadena pesada del anticuerpo E3. En aún otra realización, el fragmento contiene una o más regiones de determinación de la complementariedad (CDR) de una cadena liviana y/o una cadena pesada del anticuerpo E3, como se indica en las Figuras 1A y 1B. En otro aspecto, la invención comprende un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo E3. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende cualquiera o ambos polinucleótidos indicados en las Figuras 2 y 3. En otro aspecto, la invención comprende un polinucleótido aislado que codifica una cadena liviana E3 con el número de depósito ATCC N° PTA-4893 o ATCC N° PTA-4894. En otro aspecto, la invención comprende un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada E3 con el número de depósito ATCC N° PTA-4895. En aún otro aspecto, la invención comprende un polinucleótido aislado que comprende (a) una región variable codificada por el polinucleótido con el numero de depósito ATCC N° PTA-4893 o PTA-4894, y (b) una región variable codificada por el polinucleotido con el numero de depósito ATCC N° PTA-4895 En otro aspecto, la invención comprende un po nucleotido aislado que comprende (a) una o más CDR codificadas por el polmucleotido con el numero de deposito ATCC N° PTA-4893 o PTA-4894, y/o (b) una o más CDR codificadas por el polinucleotido con el numero de depósito ATCC N° PTA-4895 En otro aspecto, en la invención se proveen po nucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos) o los polipeptidos descnptos en la presente documentación En otro aspecto, en la invención se proveen vectores (incluyendo vectores de expresión y clonación) y células huésped que comprenden cualquiera de los polinucleotidos descnptos en la presente documentación Como resulta evidente a partir de la descripción proporcionada en la presente documentación, en la invención se incluyen específicamente las realizaciones de pohnucleótidos que consisten en una secuencia polinucleotidica idéntica a una secuencia po nucleotídica del anticuerpo monoclonal de ratón 911 Las secuencias CDR extendidas de Mab 911 se indican en las Figuras 1A y 1 B, y en SEQ ID N° 9-14 En otro aspecto, la invención comprende una célula huésped que comprende un po nucleótido que codifica una cadena liviana E3 y un polinucleótido que codifica una cadena pesada E3, donde el o los polinucleótidos que codifican la cadena liviana E3 tienen los números de deposito ATCC N° PTA-4893 y/o ATCC N° PTA-4894, y el polinucleotido que codifica una cadena pesada E3 tiene el numero de deposito ATCC N° PTA-4895 En algunas realizaciones, la célula huésped comprende un polmucleotido que comprende (a) una región variable codificada por el polinucleótido con el numero de deposito ATCC N° PTA-4893 o PTA-4894 y/o (b) una región variable codificada por el polmucleotido con el número de depósito ATCC N° PTA-4895 En algunas realizaciones, la célula huésped comprende un polmucleótido que codifica (a) una o más CDR codificadas por el polinucleotido con el número de depósito ATCC N° PTA-4893 o PTA-4894, y/o (b) una o más CDR codificadas por el polinucleótido con el numero de depósito ATCC N° PTA- 4895 En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de mamífero En otro aspecto, la invención comprende un complejo de NGF unidos por un anticuerpo E3. En otro aspecto, el complejo está aislado. En otro aspecto, el complejo está sustancialmente purificado. En otro aspecto, la invención comprende un complejo de NGF unidos por cualquiera de los anticuerpos o los polipéptidos descriptos en la presente documentación. En otro aspecto, el complejo está aislado. En otro aspecto, el complejo está sustancialmente purificado. En otro aspecto, la invención comprende una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polipéptidos (incluyendo anticuerpos, tales como el anticuerpo E3) o los polinucleótidos descriptos en la presente documentación, tal como las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo E3, o un anticuerpo que comprende un fragmento del anticuerpo E3, y un excipiente aceptable para el uso farmacéutico. En otro aspecto, la invención comprende un método para generar un anticuerpo E3, que comprende preparar una célula huésped que comprende un vector de expresión que codifica el anticuerpo E3; cultivar la célula huésped, o su progenie, bajo condiciones que permiten la producción del anticuerpo E3; y purificar el anticuerpo E3. En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende una o ambas secuencias polinucleotídicas indicadas en las Figuras 2 y 3.

En otro aspecto, la invención comprende un método para generar un anticuerpo E3, que comprende expresar un polinucleótido que codifica una cadena liviana E3 y un polínucleótido que codifica una cadena pesada E3 en una célula apropiada, donde el polinucleótido que codifica una cadena liviana E3 tiene los números de depósito ATCC N° PTA-4893 y/o ATCC N° PTA-4894, y el polinucleótido que codifica una cadena pesada E3 tiene el número de depósito ATCC N° PTA- 4895; a lo que sigue generalmente la recuperación y/o el aislamiento del anticuerpo. En otro aspecto, en la invención se proveen métodos para generar cualquiera de los polipéptidos (tales como anticuerpos) descriptos en la presente documentación, que comprenden expresar uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo (que pueden expresarse por separado como cadenas livianas o pesadas individuales, puede expresarse una cadena liviana y una cadena pesada a partir de un vector) en una célula apropiada, a lo que sigue generalmente la recuperación y/o el aislamiento del anticuerpo o los po péptidos de interés En otro aspecto, la invención comprende un método para antagonizar la actividad biológica del NGF (tal como el NGF humano) usando cualquiera de los polipéptidos (incluyendo anticuerpos, tales como el anticuerpo E3) descpptos en la presente documentación En una realización, el método comprende poner en contacto el factor de crecimiento neuronal humano con cualquiera de los polipeptidos (incluyendo el anticuerpo E3) descpptos en la presente documentación, con lo que se antagoniza reduce, bloquea o suprime la actividad del NGF (tal como la actividad del factor de crecimiento neuronal humano) En otro aspecto, la invención comprende un método para detectar el NGF usando cualquiera de los polipeptidos (incluyendo anticuerpos, tales como el anticuerpo E3) descnptos en la presente documentación La presencia de NGF se detecta a través de la detección de un complejo entre el NGF y cualquiera de los polipeptidos descpptos en la presente documentación (tales como el anticuerpo E3) El termino 'detección", como se lo usa en la presente documentación incluye la detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de medición), con o sin referencia a un control En otro aspecto, la invención comprende un método para tratar el dolor, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende el anticuerpo E3, o cualquiera de las realizaciones de polipéptidos (incluyendo anticuerpos) o po nucleótidos descnptas en la presente documentación En algunas realizaciones, el dolor es dolor post- quirurgico En otro aspecto, la invención comprende un método para prevenir la artritis reumática en un individuo que comprende la administración de una cantidad efectiva de anticuerpo antagonista anti-NGF al individuo De acuerdo con la invención, se ha demostrado que un anticuerpo antagonista anti-NGF puede inhibir o bloquear el dolor asociado con la artritis reumática En algunas realizaciones, el dolor se alivia aproximadamente 24 horas después de la administración del anticuerpo antagonista anti-NGF En algunas realizaciones, el dolor se alivia aproximadamente 4 días después de la administración del anticuerpo antagonista anti-NGF En algunas realizaciones, el dolor se alivia antes de la observación, o en ausencia de una indicación de mejoramiento de la condición inflamatoria en el individuo. En otro aspecto, en la invención se proveen métodos para reducir la incidencia del dolor causado por la artritis reumática, mejorar el dolor causado por la artritis reumática, suprimir el dolor causado por la artritis reumática, paliar el dolor causado por la artritis reumática, y/o demorar el inicio, el desarrollo o la progresión del dolor causado por la artritis reumática en un individuo, donde dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo antagonista anti-NGF al individuo. En otro aspecto, en la invención se proveen métodos para tratar la caquexia inflamatoria (pérdida de peso) asociada con la artritis reumática en un individuo, que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo antagonista anti-NGF. En otro aspecto, la invención comprende un método para prevenir o tratar el dolor causado por la osteoartritis en un individuo, que comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista del factor de crecimiento neuronal (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) al individuo. En otro aspecto, en la invención se proveen métodos para reducir la incidencia del dolor causado por la osteoartritis, mejorar el dolor causado por la osteoartritis, suprimir el dolor causado por la osteoartritis, paliar el dolor causado por la osteoartritis, y/o demorar el inicio, el desarrollo o la progresión del dolor causado por la osteoartritis en un individuo, donde dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) al individuo. En otro aspecto, en la invención se proveen métodos para mejorar la función física en un individuo con osteoartritis, donde dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) al individuo. En otro aspecto, en la invención se proveen métodos para mejorar la rigidez en un individuo con osteoartritis, donde dicho método comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) al individuo.

En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano. En algunas realizaciones, para tratar el dolor causado por la osteoartritis, la frecuencia de dosificación del anticuerpo antagonista anti-NGF es de entre una vez por semana y una vez cada 10 semanas, o una frecuencia menor. En otro aspecto, en la invención se proveen conjuntos de elementos y composiciones que comprenden una o más de las composiciones descriptas en la presente documentación. Estos conjuntos de elementos, generalmente en un envase apropiado y complementados con instrucciones apropiadas, son útiles para cualquiera de los métodos descriptos en la presente documentación. En la invención también se provee cualquiera de las composiciones y los conjuntos de elementos descriptos para cualquier uso indicado en la presente documentación, en el contexto del uso como medicamentos y/o el uso para fabricar un medicamento. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1A: muestra la secuencia de aminoácidos de la región vapable de la cadena pesada del anticuerpo E3 (rotulado "6" y "5 + maduración de afinidad H3). Las CDR Chothia y las CDR Kabat se describen mediante un texto subrayado y un texto en negrita e cursiva, respectivamente. La figura 1A muestra también el alineamiento de las siguientes secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada: (2) secuencia aceptora de línea germinal humana VH4-59 (rotulada "VH4-59" o "2") (SEQ ID N° 69); (3) las secuencias aceptoras injertadas con las CDR extendidas del anticuerpo de ratón 911 (rotulado "CDR injertada" o "3") (SEQ ID N° 70); (4) las secuencias aceptoras injertadas con CDR que ¡ncluyen la sustitución V71K (rotulado como "3+ una mutación de marco" o "4") (SEQ ID N° 71 ); (5) el clon que contiene CDR H1 y H2 de afinidad madura (rotulado "5" o "4+ maduración de afinidad H1 , H2") (SEQ ID N° 72); y el anticuerpo E3 (como se describió previamente). FIGURA 1B: muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo E3 (rotulada como "5" o "4+maduración de afinidad L3"). Las CDR Chothia y las CDR Kabat se describen mediante un texto subrayado y un texto en negrita e cursiva, respectivamente. La figura 1B muestra también el alineamiento de las siguientes secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena liviana: (2) secuencia aceptora de línea germinal humana 08 (rotulada "08" o "2") (SEQ ID N° 73); (3) las secuencias aceptoras injertadas con las CDR extendidas del anticuerpo de ratón 911 (rotulada como "CDR injertada" o "3") (SEQ ID N° 74); (4) las secuencias aceptoras injertadas con CDR (rotuladas "3+maduración de afinidad L1 , L2" o "4") (SEQ ID N° 75); (5) el clon que contiene CDR de afinidad madura L1 y L2 (rotulado "5" o "4+ maduración de afinidad L3"); y el anticuerpo E3 (como se describió previamente). FIGURA 2: muestra un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo E3 (SEQ ID N° 76). FIGURA 3: muestra un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica la región variable de la cadena liviana del anticuerpo E3 (SEQ ID N° 77). FIGURA 4: es un gráfico que describe la supervivencia dependiente de NGF de neuronas E13.5 en presencia de concentraciones variables de NGF humano y de rata. El eje X corresponde a la concentración de NGF (ng/ml) y el eje Y corresponde al recuento de neuronas. FIGURA 5: es un gráfico donde se compara el efecto bloqueante de NGF de varias Fabs en presencia de 0,04 ng/ml de NGF humano (aproximadamente 1 ,5 pM; mostrado en el panel inferior) o de 0,4 ng/ml de NGF humano (aproximadamente 15 pM; mostrado en el panel supepor).

Se evaluó la supervivencia de neuronas trigéminas E13.5 de ratón en varias concentraciones de Fab E3; Fab 911 murino; y Fab H19-L129 y Fab 8L2-6D5. Se calculó la IC50 (en pM) para cada Fab a cada concentración de NGF, como se muestra en la Tabla 9. Fab E3 bloqueó fuertemente la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigéminas, con una IC50 de aproximadamente 21 pM en presencia de 15 pM de NGF humano, y una IC50 de aproximadamente 1 ,2 pM en presencia de 1 ,5 pM de NGF humano. Fabs 3C y H19-L129 también bloquearon fuertemente la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigéminas. En ambos paneles, el eje X corresponde a la concentración de anticuerpo (nM) y el eje Y corresponde al recuento de neuronas. La IC50 fue de aproximadamente 1 ,5 pM, mientras que 15 pM representó una concentración saturante de NGF. FIGURA 6: es un gráfico donde se compara el efecto bloqueante de NGF de varios Fabs en presencia de 0,04 ng/ml de NGF de rata (aproximadamente 15 pM; mostrado en el panel inferior) o de 0,4 ng/ml de NGF de rata (aproximadamente 15 pM; mostrado en el panel superior).

Se evaluó la supervivencia de neuronas trigéminas E13.5 de ratón en varias concentraciones de Fab E3, Fab mupno 911 , y Fab H19-L129 y 8L2-6D5, como se describió previamente La IC50 (en pM) se calculó para cada Fab a cada concentración de NGF, y se muestra en la Tabla 9 Fab E3 bloqueó fuertemente la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigéminas, con una IC50 de aproximadamente 31 ,6 pM en presencia de 15 pM de NGF de rata, y una IC50 de aproximadamente 1 ,3 pM en presencia de 1 ,5 pM de NGF de rata Fabs 3C y H19-L129 también bloquearon fuertemente la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigéminas La IC50 fue de aproximadamente 1 ,5 pM de NGF, mientras que 15 pM representó una concentración saturante de NGF En ambos paneles, el eje X corresponde a la concentración de anticuerpo (nM) y el eje Y corresponde al recuento de neuronas FIGURA 7 es un gráfico que describe el dolor en reposo evaluado 24 horas luego de la cirugía y muestra que el tratamiento con 0,02 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,6 mg/kg, o 1 mg/kg de anticuerpo E3 anti-NGF reduce el dolor "*" indica una diferencia estadísticamente significativa (p<0,5) con relación al control negativo FIGURA 8 es un gráfico que describe el dolor en reposo evaluado 24 horas luego de la cirugía y muestra que el tratamiento con 0,5 mg/kg de anticuerpo anti-NGF E3 reduce significativamente (p<0,005) el dolor en reposo, cuando se lo inyecta dos horas después de la cirugía FIGURA 9 es un gráfico que muestra los resultados del análisis BIAcore de la afinidad de unión del anticuerpo 911 de ratón (Fab) al anticuerpo humano NGF El anticuerpo 911 de ratón se une a NGF con una KD de 3,7 nM, koff de 8,4x10"5s'1 y kon de 2,2x104M 1s-1 FIGURA 10 es un gráfico que muestra los resultados del análisis BIAcore de la afinidad de unión del anticuerpo E3 (Fab) (mencionado como "3E Fab") al anticuerpo NGF humano E3 se une a NGF humano con una KD de aproximadamente 0,07 nM (y con una kon de aproximadamente 6,0 x 105 M V1, y una koff de aproximadamente 4,2x10'5 s'1) FIGURA 11 es un gráfico que describe que el anticuerpo E3 bloquea la interacción de NGF con sus receptores, trkA y p75, evaluado mediante el porcentaje de unión detectado entre NGF y trkA (mostrado en círculos negros) y NGF y p75 (mostrado como cuadrados vacíos) El eje X corresponde a la concentración de anticuerpo E3 (Fab) y el eje Y corresponde a la unión de NGF (porcentaje de RU máximo). Concentraciones aumentadas de E3 Fab bloquean la interacción de NGF tanto con p75 como con trkA, como lo muestra la señal disminuida (medida en RU). Cuando la concentración del anticuerpo E3 (Fab) iguala la concentración de NGF, no se observa unión de NGF (como lo muestra una señal de cero). FIGURA 12: es un gráfico que describe la capacidad bloqueante de NGF humano del anticuerpo E3 completo y de E3 Fab. Se evaluó la supervivencia de neuronas trigéminas E13.5 de ratón en presencia de NGF humano y varias concentraciones de Fab E3 y anticuerpo E3. El eje X corresponde a los sitios de unión NGF (nM) y el eje Y corresponde al recuento normalizado de neuronas trigéminas (TG). Los anticuerpos completos E3 y E3 Fab muestran niveles de inhibición similares de la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigéminas cuando la concentración del anticuerpo completo y Fab se normalizan con respecto al número de sitios de unión NGF (Fab tiene un sitio de unión y el anticuerpo completo tiene dos sitios de unión). FIGURA 13: es un gráfico que describe la capacidad de varias concentraciones (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128, y 0,0 nM) del anticuerpo E3 (triángulos llenos, mencionados como "E3"), del anticuerpo 911 (círculos llenos), y de una inmunoadhesina receptora trkA (cuadrados sombreados, mencionada como "trkA-Fc") de inhibir la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigéminas E13.5 en presencia de 0,4 ng/ml de NGF humano (condiciones saturantes). El eje X corresponde a la concentración de anticuerpo (nM) y el eje Y corresponde al recuento de neuronas. Estos resultados demostraron que el anticuerpo E3 bloqueó a NGF significativamente mejor que el anticuerpo monoclonal 911 anti-NGF de ratón o que la inmunoadhesina trkA. FIGURA 14: es un gráfico que describe que el anticuerpo antagonista anti-NGF E3 (denominado "E3 en la figura") o Fab 911 no inhibieron la supervivencia neuronal promovida por NT3, NT4/5 y MSP, aún a concentraciones de anticuerpo tan altas como 200 nM. Los datos representaron el porcentaje de supervivencia promedio luego de 48 horas en cultivo (± error estándar del promedio, n=3 para cada punto de los datos) relativo a la supervivencia observada en el control positivo para cada experimento (100% de supervivencia de neuronas trigéminas crecidas en presencia de concentraciones saturantes de NGF). Se usaron varias concentraciones (20 nM, 2 nM, o 0,2 nM) de Fab E3 (denominado "3E" en la figura) y del Fab del anticuerpo 911 de ratón, en presencia de neurotrofma no agregada (denominado "control"), 400 pM de NGF (denominado "NGF-400pM"), 10 nM de NT3 (denominado "NT3-10nM") o 600 pM de MSP (denominado "MSP-600 pM") FIGURA 15 es un gráfico que describe que el anticuerpo antagonista anti-NGF E3 (Fab o el anticuerpo completo) (denominado "3E en la figura") o el anticuerpo 911 de ratón (Fab o el anticuerpo completo) no inhibieron la supervivencia neuronal promovida por NT3, NT4/5 y MSP, aun a concentraciones tan altas como 200 nM Se utilizaron vanas concentraciones (200 nM y 80 nM) de Fab E3 y del anticuerpo completo y del anticuerpo 91 1 de ratón completo y Fab en presencia de neurotrofinas no agregadas (denominado "sin factor"), 400 pM de NGF (denominado "NGF-400pM"), 10 nM de NT3 (denominado "NT3-10nM") o 600 pM de MSP (denominado "MSP-600 pM") FIGURA 16 es un gráfico que describe que los anticuerpos antagonistas anti-NGF E3 o Fab E3 no inhibieron la supervivencia de neuronas nodosas E17 promovida por BDNF, NT4/5 o LIF También se probo el anticuerpo antagonista anti-NGF 911 de ratón, y se observaron resultados similares Se probaron vanas concentraciones (200 nM u 80 nM) del anticuerpo completo E3 (denominado "3E en la figura"), de Fab E3, del anticuerpo 911 completo, o de Fab 911 en presencia de neurotrofinas no agregadas (denominado "sin factores"), 400 pM de BDNF (denominado "BDNF-400pM"), 400 pM de NT4/5 (denominado "NT4/5-400pM"), o 2,5 nM de LIF (denominado "LIF-2,5nM") FIGURA 17 es un gráfico que describe que el anticuerpo antagonista anti-NGF E3 o Fab E3 no inhibió la supervivencia de neuronas nodosas E17 promovida por BDNF, NT4/5 o LIF Se probaron vanas concentraciones (200 nM 20 nM, 2 nM) de Fab E3 (denominado "3E en la figura"), o Fab 911 en presencia de neurotrofinas no agregadas (denominado "control"), 400 pM de BDNF (denominado ' DNF-400pM"), 400 pM de NT4/5 (denominado "NT4/5-400pM"), o 2,5 nM de LIF (denominado "LIF-2,5nM") FIGURA 18 es un gráfico que demuestra la respuesta nociceptiva en ratas artríticas (modelo de artritis reumática) luego de la administración de anticuerpos anti-NGF (E3 y 911) a D14 y D19 Se le administraron a ratones artríticos E3 (1 mg/kg, i v en el día 14 y día 19), 911 (10 mg/kg, i.v. en el día 14 y día 19), o ¡ndo (indometacina 3 mg/kg, p.o diariamente durante 10 días). Los valores de intensidad de vocalización se expresan en mV como promedio ± S.E.M. FIGURA 19: es un gráfico que demuestra los efectos de los anticuerpos anti-NGF sobre el peso corporal en la artritis en ratas (modelo de artritis reumática) luego de la administración de anticuerpos anti-NGF en el D14 y D19. Se le administraron a ratones artríticos: E3 (1 mg/kg, i.v. en el día 14 y día 19), 911 (10 mg/kg, i.v. en el día 14 y día 19), o indo (indometacina 3 mg/kg, p.o diariamente durante 10 días). Los valores de peso corporal se expresan en gramos como promedio ± S.E.M. FIGURA 20: es un gráfico que demuestra la respuesta nociceptiva en ratas artríticas (modelo de artritis reumática) luego de la administración de diferentes dosis de anticuerpo E3 anti-NGF (0,003 mg/kg, 0,03mg/kg, y 5 mg/kg) en el D14 y D18. Los valores de intensidad de vocalización se expresan en mV como promedio ± S.E.M. FIGURA 21 : es un gráfico que demuestra los efectos del anticuerpo antí-NGF E3 sobre el porcentaje de peso en el día 14 (normalizado al Día 14) en ratas artríticas (modelo de artritis reumática) luego de la administración de diferentes dosis de anticuerpo anti-NGF E3 (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, y 5 mg/kg) en el D14 y D18. FIGURA 22: es un gráfico que demuestra los efectos del anticuerpo anti-NGF E3 sobre la pérdida de peso en ratas artríticas (modelo de artritis reumática) luego de la administración de diferentes dosis de anticuerpo E3 anti-NGF (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, y 5 mg/kg) en el D14 y D18. Los valores de peso corporal se normalizaron al Día 0. FIGURA 23: descpbe la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de E3 (Fig. 23A) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana (Fig. 23B), numeradas utilizando numeración secuencial, numeración Kabat, y numeración Chotia.

FIGURA 24: descpbe los cambios en la intensidad de dolor diario promedio luego de la administración de anticuerpo anti-NGF E3 comparado con la línea de base en el día 0. El eje Y corresponde a la reducción en la intensidad de dolor diario promedio (puntuación VAS) comprado con la intensidad de dolor diario promedio en el día 0 El eje X corresponde a los días luego de la administración de anticuerpo anti-NGF E3 FIGURA 25 describe la puntuación VAS promedio luego de la administración de anticuerpo anti-NGF E3 "SE" se refiere al error estándar FIGURA 26 describe la reducción máxima porcentual en la diferencia de intensidad de dolor sumada (SPID) entre el día 2 y el día 14 y entre el día 2 y el día 28 luego de la administración de anticuerpo E3 anti-NGF FIGURA 27 describe la media de los cuadrados mínimos (LSM) de la respuesta a WOMAC, sub-escala de dolor, sub-escala de función física, y sub-escala de rigidez entre el día 1 y el día 28, luego de la administración de diferentes dosis (3 µg/kg, 10 µg/kg, 30 µg/kg, 100 µg/kg, y 300 µg/kg) de anticuerpo E3 anti-NGF "SE" se refiere al error estándar. Los ejes X corresponden a las dosis de anticuerpo E3 anti-NGF administradas "*" indica P < 0,05 comparado con la línea de base bajo la prueba de Dunnett DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la invención presentada en la presente documentación se proporcionan anticuerpos antagonistas anti-NGF que unen NGF (tal como NGF humano) con afinidad alta La invención además proporciona anticuerpos y polipéptidos derivados de E3 que unen NGF, y métodos para hacer y usar estos anticuerpos En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo humanizado, E3, que se une al factor de crecimiento neuronal ("NGF"), y métodos para hacer y usar este anticuerpo La invención también proporciona los polipéptidos E3 (incluso los anticuerpos) que unen NGF, y los po nucleótidos que codifica el anticuerpo de E3 y/o el polipéptido En la invención presentada en la presente documentación también se proveen métodos para administrar de una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico de un anticuerpo antagonista anti-NGF para prevenir y/o tratar el dolor de la artritis reumática en un individuo La invención presentada en la presente documentación también provee los métodos de administración de una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico de antagonista de NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) para prevenir y/o tratar el dolor de la osteoartritis en un individuo. En la invención también se proveen métodos para ajustar la afinidad de un anticuerpo y los métodos para caracterizar una región CDR. Técnicas generales En la práctica de la presente invención se emplearán, a menos que se indique, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo las técnicas de recombinación), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología que están dentro de la habilidad de la materia. Tales técnicas se explican en su totalidad en la literatura, como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesís (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods ¡n Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991 ); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford Uníversity Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cáncer: Principies and Practice of Oncology (V.T. DeVíta et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993). Definiciones Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobu na capaz de unirse específicamente a un blanco, como un hidrato de carbono, un polinucleótido, un lípido, un polipéptido, etcétera, a través de por lo menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobu na Como se utiliza en la presente documentación, el término no sólo abarca anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de ellos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), la cadena simple (ScFv), mutantes de ellos, proteínas de fusión que comprenden una porción del anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de mmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antigeno Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, como IgG, IgA, o IgM (o subclase-clase de ellos), y el anticuerpo no necesita ser de alguna clase en particular Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas del anticuerpo, las inmunoglobu nas se pueden asignar a diferentes clases Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y algunas de éstas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2 Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las clases diferentes de inmunoglobu nas se llaman alfa, delta, epsilon, gamma, y mu, respectivamente Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas "Fv" es un fragmento del anticuerpo que contiene el sitio de reconocimiento y de unión completo En las especies de dos cadenas de Fv, esta región consiste de un dímero formado por los dominios variables de una cadena pesada y de una cadena liviana con una asociación no- covalente fuerte En las especies de una sola cadena de Fv, se pueden unir covalentemente un dominio variable de una cadena pesada y una liviana a través de un péptido flexible de unión de modo tal que las cadenas livianas y pesadas se puedan asociar en una estructura dimérica análoga a la de las especies de dos cadenas de Fv Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactuan para definir sobre la superficie del dímero de VH-VL una especificidad de unión a antigeno Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo 3 CDR específicas para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y unir el antígeno, aunque generalmente con una afinidad mas baja que el sitio completo de unión El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1 ) de la cadena pesada. Los fragmentos de Fab' difieren de los fragmentos de Fab por el agregado de algunos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de anticuerpos en donde el anticuerpo monoclonal está compuesto por aminoácidos (de origen natural y de origen no-natural) que están involucrados en la unión selectiva de un antígeno. Una población de anticuerpos monoclonales es altamente específica, dirigida contra un único sitio antigénico. El término "anticuerpo monoclonal" no sólo abarca anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales completos, sino también fragmentos de ellos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), la cadena simple (ScFv), mutantes de ellos, proteínas de fusión que comprendan una porción del anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida y la habilidad para unir un antígeno. Se intenta que no se limite a la fuente del anticuerpo o a la manera mediante la cual se genere (por ejemplo, por hibridoma, selección por fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etcétera). Como se usa en la presente documentación, "anticuerpo humano" significa un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que fue realizado con el uso de alguna de las técnicas para hacer anticuerpos humanos conocidas en la materia o que se describen en la presente documentación. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de la cadena pesada humana o al menos un polipéptído de la cadena liviana humana. Un ejemplo de esto es un anticuerpo que comprende polípéptidos de la cadena liviana murina y de la cadena pesada humana. Se pueden producir anticuerpos humanos con el uso de varias técnicas conocidas en el arte. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, donde esta biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991 , J. Mol. Biol., 227:381 ; Marks et al., 1991 , J. Mol. Biol., 222:581 ). Los anticuerpos humanos también se pueden hacer por introducción del locí de la inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulínas endógenos fueron inactivados parcial o completamente. Esta metodología se describe en las Patentes de los EEUU N° 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; y 5661016. Alternativamente, el anticuerpo humano se puede preparar inmortalizando línfocitos B humanos que produzcan un anticuerpo dirigido contra un antígeno blanco (tales línfocitos B se pueden recuperar de un individuo o se pueden haber inmunizado in vitro). Por ejemplo, véase Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991 , J. Immunol., 147 (1 ):86-95; y la Patente de los EEUU N° 5750373. "Anticuerpos quiméricos" se refiere a aquellos anticuerpos en donde una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y livianas es homologa a las secuencias correspondientes de los anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase en particular, mientras el segmento restante de las cadenas es homólogo a las secuencias correspondientes en otra. Típicamente, en estos anticuerpos quiméricos, la región variable de ambas cadenas, liviana y pesada, simula la región variable de anticuerpos que derivan de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homologas a las secuencias de anticuerpos derivados de otra. Una ventaja clara de tales formas quiméricas es que, por ejemplo, las regiones variables se pueden derivar convenientemente de fuentes actualmente conocidas con el uso de híbridomas o células B fácilmente disponibles de organismos huéspedes no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones celulares humanas. Mientras que la región variable tiene la ventaja de su fácil preparación, y que la especificidad no es afectada por su fuente, la región constante que es humana, es probablemente menos capaz de generar una respuesta inmune en un sujeto humano cuando se le inyectan los anticuerpos que cuando la región constante es de una fuente no-humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo en particular. Una "región Fc funcional" posee al menos una función efectora de una región nativa de la secuencia Fc. Por ejemplo, las "funciones efectoras" incluyen la unión de C1q; la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión del receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células anticuerpo-dependiente (ADCC), fagocitosis, regulación negativa de receptores de la superficie celular (por ejemplo receptor de la célula B, BCR), etcétera Tales funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo un dominio variable de anticuerpo) y se puede alcanzar con la utilización de varios ensayos para evaluar dichas funciones efectoras del anticuerpo conocidos en el arte Una "secuencia nativa de la región Fc" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc que se encuentra en la naturaleza Una "vanante de la región Fc" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia nativa de la región Fc en virtud de al menos una modificación aminoacídica, que todavía retiene al menos una función efectora de la secuencia nativa la región Fc preferiblemente, la vanante de la región Fc tiene al menos una substitución ammoacídica en comparación con la secuencia nativa de la región Fc o con la región Fc de un po peptido relacionado, por ejemplo desde aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones aminoacidicas, y preferiblemente desde aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones ammoacídicas en la secuencia nativa de la región Fc o en la región Fc del po péptido relacionado La vanante de la región Fc poseerá preferiblemente aquí al menos aproximadamente 80% de identidad en la secuencia con la secuencia nativa la región Fc y/o con la región Fc de un po péptido relacionado, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad en la secuencia con ella, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad en la secuencia con ella Como se usa en la presente documentación, "la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcRs) (por ejemplo células asesinas naturales (NK), neutrofilos, y macrofagos) reconocen el anticuerpo unido a la célula blanco y subsiguientemente causan la lisis de la célula blanco La actividad ADCC de una molécula de ínteres se puede evaluar con el uso de un ensayo de ADCC in vitro, como aquel que se describe en las Patentes de los EEUU N° 5500362 ó 5821337 Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células NK Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés se puede evaluar ?n vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descppto en Clynes et al , 1998, PNAS (USA), 95 652-656 Como se usa en la presente documentación, el "receptor Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo El FcR de preferencia es una secuencia nativa del FcR humana Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye los receptores de las subclases FcyRI, FcyRIl, y Fc?RIII, incluyendo vanantes alélicas y formas alternativamente truncadas de estos receptores Los receptores FcvRII incluyen FcyRIlA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente de aquellos en los dominios citoplasmáticos Los FcRs se analizan en Ravetch y Kinet, 1991, Ann Rev Immunol , 9 457-92, Capel et al , 1994, Immunomethods, 4 25-34, y de Haas et al , 1995, J Lab Clin Med , 126 330-41 El "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al , 1976, J Immunol , 117 587, y Kim et al , 1994, J Immunol , 24'249) "La citotoxicidad dependiente del complemento" y "CDC" se refieren a la lisis de un blanco en la presencia de complemento La vía de activación del complemento se inicia con la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula acomplejada (por ejemplo un anticuerpo) con un antígeno asociado Para evaluar la activación del complemento, se puede llevar a cabo un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al , J Immunol Methods, 202 163 (1996) Como se usa en la presente documentación, los términos "E3", "3E", y "anticuerpo E3" se utilizan indistintamente para referirse a un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena liviana que se muestran en las Figuras 1A (SEQ ID N°1) y 1B (SEQ ID N°2), respectivamente Las porciones CDR del anticuerpo E3 (incluso las CDR Chothia y Kabat) se muestran esquemáticamente en las Figuras 1A y 1B Las Figuras 2 y 3 muestran los polinucleótidos que codifica las cadenas pesadas y livianas, respectivamente, que comprenden las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas que se muestran en las Figuras 1A y 1 B, respectivamente La generación y caracterización de E3 se describe en los Ejemplos Con E3 se relacionan diferentes funciones biológicas, que incluyen a, pero no como limitación, la habilidad de unión a NGF e inhibición de la actividad biológica de NGF y/o de vías señalización corriente abajo mediadas por NGF, y la habilidad de inhibir la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigéminas E13 5 de ratón Como se describe en la presente documentación, los anticuerpos de la invención pueden tener una o más de estas características En algunas realizaciones, el termino "E3" se refiere a la mmunoglobulina codificada por (a) un polinucleotido que codifica la cadena liviana de E3 que tiene un número de ingreso de ATCC No PTA-4893 o ATCC No PTA-4894, y (b) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de E3 que tiene un numero del ingreso de ATCC No PTA-4895 Como se usa en la presente documentación, la unión "inmunoespecífica" de anticuerpos se refiere a la interacción de unión específica del antígeno que ocurre entre el sitio de combinación de antigeno de un anticuerpo y el antigeno específico reconocido por ese anticuerpo (es decir, el anticuerpo reacciona con la proteína en un ELISA u otro inmunoensayo, y no reacciona en forma detectable con proteínas no relacionadas) Un epitope que se "une específicamente", o que se "une con preferencia" (usados de manera intercambiable en la presente documentación) a un anticuerpo o a un polipéptido es un término bien entendido en la materia, y los métodos para determinar dicha unión específica o preferencial también son bien conocidos en la materia Se dice que una molécula exhibe "unión especifica" o "unión preferencial" si la misma reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad a una célula o sustancia en particular que lo que lo hace con otras células o sustancias Un anticuerpo se "une específicamente" o se "une con preferencia" a un blanco si se pega con mayor afinidad, avidez, más rápidamente y/o con mayor duración que lo que se une a otras sustancias Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente o con preferencia a un epitope NGF es un anticuerpo que se une a este epitope con mayor afinidad que a otros epitopes de NGF o epitopes no pertenecientes a NGF También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o grupo o epitope) que se une específicamente o con preferencia a un primer blanco puede o no unirse específicamente o con preferencia a un segundo blanco Como tales, la "unión específica" o la "unión preferencial" no requieren necesariamente (a pesar que lo pueden incluir) una unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, una referencia a unión significa unión preferencial. Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se usan en la presente documentación de manera intercambiable para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o por medio de intervención; por ejemplo, formación de puentes disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcación. También se incluye dentro de la definición a, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etcétera) así como otras modificaciones conocidas en la materia. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de esta invención están basados en un anticuerpo, los polipéptidos pueden aparecer como cadenas individuales o cadenas asociadas. "Polinucleótido", o "ácido nucleico", como se usan en la presente documentación de manera intercambiable, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen al ADN y al ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótídos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos, y cualquier sustrato que se pueda incorporar a un polímero a través de ADN o ARN polimerasas. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura del nucleótido se puede impartir antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede además modificarse luego de la polimerización, como por conjugación con un componente de marcación. Entre otros tipos de modificaciones, se incluyen, por ejemplo, "caps", sustituciones de uno o más de los nucleótídos naturales por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con uniones sin carga (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etcétera) y con uniones cargadas (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etcétera), aquellas que contienen grupos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etcétera), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acpdina, psoraleno, etcétera), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boranos, metales oxidantes, etcétera), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con uniones no modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anomépcos, etcétera), así como formas no modificadas de los polinucleótidos Además, cualquiera de los grupos hidroxilo comunmente presentes en los azucares se puede reemplazar, por ejemplo, por grupos fosfonatos, grupos fosfato, se pueden proteger por medio de grupos protectores convencionales, o se pueden activar para preparar uniones adicionales a otros nucleotidos, o se pueden conjugar a soportes sólidos El OH 5' o 3' terminal se puede fosfonlar o sustituir con aminas o grupos de capping orgánicos de entre 1 y 20 átomos de carbono Otros hidroxilos también se pueden depvatizar a grupos protectores convencionales Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de los azúcares ribosa o desoxirnbosa que generalmente son conocidas en la materia, que incluyen a, por ejemplo, análogos de azúcar 2'-0-metil-, 2'-0-al?l, 2'-fluoro- o 2'-az?do-pbosa, carbocíc cos, azúcares a-anomépcos, azúcares epimépcos tales como arabinosa, xilosas o xosas, azucares de piranósicos, azúcares furanósicos, pseudoheptulosas, nucleosidos análogos aciclicos y abásicos tales como metil pbosida Uno o más de las uniones fosfodiéster se pueden reemplazar por grupos de unión alternativos Entre estos grupos de unión alternativos se incluyen, sin limitaciones, realizaciones en donde el fosfato se reemplaza por P(0)S("t?oato"), P(S)S ("ditioato"), "(0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en el cual cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) opcionalmente conteniendo una unión éter (-0-), arito, alquenilo, cicloalquilo , cicloalquenilo o araldilo No todas las uniones en un polinucleótido necesitan ser idénticas La descripción precedente se aplica a todos los polinucleotidos a los que se hace referencia en la presente documentación, incluyendo ARN y ADN Una "región variable" de una anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena liviana del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o combinada Las regiones variables de la cadena pesada o liviana consisten cada una en cuatro regiones de lectura (FR) conectadas mediante tres regiones de determinación de complementapdad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena están sostenidas juntas en proximidad mediante las FR y, con las CDR de las otras cadenas, contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno al anticuerpo. Hay al menos dos técnicas para determinar CDR: (1 ) una aproximación en base a variabilidad de secuencias ¡nter-especíe (o sea Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5ta ed., 1991 , National Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) una aproximación en base a estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Como se usa en la presente documentación, una CDR se puede referir a CDR definidas por cualquiera de las aproximaciones o mediante una combinación de ambas aproximaciones. Una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena liviana o a la región constante de la cadena pesada, ya sea sola o en combinación. Como se usa en la presente documentación, el término "factor de crecimiento neuronal" y "NGF" se refieren al factor de crecimiento neuronal, y a sus variantes que retienen al menos parte de la actividad biológica del NGF. Como se usa en la presente documentación, NGF incluye todas las especies de mamíferos de NGF de secuencia nativa, incluyendo humano, canino, felino, equino o bovino. "Receptor de NGF" se refiere a un polipéptido que se une a través de o que se activa a través de NGF. Entre los receptores de NGF se incluye el receptor TrkA y el receptor p75 de cualquier especie de mamífero, incluyendo a, sin limitaciones, humano, canino, felino, equino, primate o bovino. Como se usa en la presente documentación, un "anticuerpo antagonista anti NGF" (denominado de manera intercambiable "anticuerpo anti-NGF") se refiere a un anticuerpo que puede unirse a NGF e inhibir la actividad biológica de NGF y/o la(s) ruta(s) metabólica(s) corriente abajo mediadas por la señalización de NGF. Un anticuerpo antagonista anti-NGF abarca anticuerpos que bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (incluyendo de manera significativa) la actividad biológica de NGF, incluyendo las vías corriente abajo mediadas por la señalización de NGF tales como unión al receptor y/o inicio de una respuesta celular a NGF. A propósito de la presente invención, se entenderá explícitamente que el término "anticuerpo antagonista anti-NGF" abarca todos los ítems, títulos, y estados funcionales y características previamente identificadas, a través de la cuales el NGF mismo, una actividad biológica de NGF (incluyendo pero no como limitación a su habilidad para mediar cualquier aspecto de dolor post-quirúrgico) o las consecuencias de la actividad biológica, son sustanclalmente anuladas, disminuidas o neutralizadas en cualquier grado significativo En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-NGF se une a NGF y previene la dimepzación de NGF y/o su unión a un receptor de NGF (tal como el p75 y/o el trka) En otras realizaciones, un anticuerpo anti-NGF se une y previene la dimepzación del receptor trka y/o la autofosfoplacion de trkA Ejemplos de anticuerpos antagonistas anti-NGF se proveen en la presente documentación "Actividad biológica" de NGF generalmente se refiere a la habilidad para unirse a receptores de NGF y/o activar rutas de señalización de receptores de NGF No como limitación, una actividad biológica incluye cualquiera de las siguientes la habilidad para pegarse a un receptor NGF (tal como p75 y/o trkA), la habilidad para promover la dimepzación y/o autofosfoplación del receptor, la habilidad para activar una vía de señalización de receptor NGF, la habilidad para promover la diferenciación, proliferación, supervivencia, crecimiento celular y otros cambios en la fisiología celular, incluyendo (en el caso de neuronas, incluyendo neuronas periféricas y centrales) cambios en la morfología neuronal, sinaptogénesis, función sináptica, liberación de neurotransmisor y/o neuropéptido y regeneración luego de daño, y la habilidad para mediar el dolor, incluyendo el dolor post-quirurgico Como se usa en la presente documentación, "sustanclalmente puro" se refiere a un material que esta al menos 50% puro (o sea libre de contaminantes), más preferiblemente al menos 90% puro, mas preferiblemente al menos 95% puro, mas prefepblemente al menos 98% puro, más preferiblemente al menos 99% puro Una "célula huésped" incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o que ha sido un receptor de vector(es) para la incorporación de insertos polinucleotídicos. Entre las células huéspedes se incluye a la progenie de una célula huésped individual, y la progenie puede no necesariamente ser completamente idéntica (en morfología o en complemento genómico de ADN) a la célula parenteral debido a mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido(s) de esta invención. Como se usa en la presente documentación, "tratamiento" es una aproximación para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención, resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no como limitación, uno o más de los siguientes: aminoración de la severidad, alivio de uno o más síntomas asociados con el dolor incluyendo cualquier aspecto del dolor (tal como acortamiento de la duración del dolor, reducción de la sensibilidad o sensación) Una "cantidad efectiva" de droga, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados incluyendo resultados clínicos tales como alivio o reducción de la sensación de dolor. Una cantidad efectiva se puede administrar en una o más administraciones. Para los propósitos de esta invención, una cantidad efectiva de droga, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para tratar, aminorar, reducir la intensidad y/o prevenir el dolor, incluyendo el dolor post-quirúrgico, el dolor causado por artritis reumática, y/o el dolor causado por osteoartritis. En algunas realizaciones, la "cantidad efectiva" puede reducir el dolor al reposar (dolor de reposo) o el dolor inducido mecánicamente (incluyendo el dolor que sigue al movimiento), o ambos, y se puede administrar antes, durante o luego de la incisión, corte, ruptura o herida y/o antes, durante o luego de un estímulo doloroso. Como se la entiende en el contexto clínico, una cantidad efectiva de una droga, compuesto, o composición farmacéutica puede o no conseguirse en conjunción con otra droga, compuesto o composición farmacéutica. De esta manera, una "cantidad efectiva" se puede considerar en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y un agente individual se puede considerar como dado en una cantidad efectiva si, en conjunción con uno o más agentes adicionales, se puede conseguir o se consigue un resultado deseado. "Reducir la incidencia" del dolor significa cualquier reducción de la severidad (que puede incluir reducir la necesidad y/o la cantidad de (por ejemplo, exposición a) otras drogas y/o terapias generalmente usadas para estas condiciones, incluyendo, por ejemplo, opiáceos), de duración, y/o de frecuencia (incluyendo, por ejemplo, retraso o incremento de tiempo de exposición a dolor post- quirúrgico en un individuo). Como se entiende por aquellos expertos en la materia, los individuos pueden variar en términos de sus respuestas al tratamiento, y, como tal, por ejemplo, un "método para reducir la incidencia de dolor causado por artritis reumática o dolor causado por osteoartritis en un individuo" refleja la administración de anticuerpo antagonista anti-NGF sobre la base de una expectativa razonable sobre la probabilidad de dicha administración de causar dicha reducción en la incidencia en un individuo en particular. "Aminoración" de un dolor o uno o más síntomas de un dolor (tales como el dolor por artritis reumática o el dolor por osteoartritis) significa una disminución o un mejoramiento de uno o más síntomas de un dolor en comparación con la no administración de un anticuerpo antagonista anti-NGF. "Aminoración" también incluye el acortamiento o reducción en la duración de un síntoma.

"Paliar" un dolor o una o más síntomas de un dolor (tales como el dolor por artritis reumática o el dolor por osteoartritis) significa reducir la extensión de uno o más manifestaciones clínicas indeseables del dolor post-quirúrgico en un individuo o población de individuos tratados con un anticuerpo antagonista anti-NGF de acuerdo con la invención. Como se usa en la presente documentación, "retrasar" el desarrollo de un dolor significa diferir, impedir, desacelerar, retardar, estabilizar y/o posponer la progresión del dolor, tal como el dolor post-quirúrgico, el dolor por artritis reumática o el dolor por osteoartritis. Este retraso puede ser de duraciones variables de tiempo, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o de los individuos que se estén tratando. Como es evidente para un experto en la materia, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, en donde el individuo no desarrolla dolor. Un método para "retrasar" el desarrollo del síntoma es un método que reduce la probabilidad de desarrollar el síntoma en un marco de tiempo dado y/o que reduce la extensión de los síntomas en un marco de tiempo dado, en comparación con el no uso del método. Tales comparaciones se basan típicamente en estudios clínicos, usando un número de sujetos estadísticamente significativo. "Dolor" como se usa en la presente documentación, se refiere a un dolor de cualquier etiología, incluyendo dolor crónico o agudo, y cualquier dolor con un componente inflamatorio.

Entre los ejemplos de dolor se incluye al dolor post-quirúrgico, el dolor post-operación (incluyendo el dolor dental), la migraña, el dolor de cabeza y la neuralgia trigeminal, dolor asociado con quemadura, herida o cálculo renal, dolor asociado con trauma (incluyendo herida traumática de cabeza), dolor neuropático, dolor asociado con trastornos músculo-esqueléticos como la artritis reumática, osteoartritís, espondilitis anquilosante, artropatías sero-negativas (no reumatoides), reumatismo no articular y trastornos periarticulares, y dolor asociado con cáncer (incluyendo "dolor pasajero" y dolor asociado con cáncer terminal), neuropatía periférica y neuralgia post-herpética. Entre los ejemplos de dolor con componente inflamatorio (además de algunos de los descriptos previamente) se incluye a dolor por reuma, dolor asociado con mucositis y dismenorrea. El "dolor post-quirúrgico" (denominado de manera intercambiable dolor "post-incísión" o "post-traumático") se refiere a un dolor que aparece o resulta de un trauma externo tal como corte, pinchadura, incisión, desgarro, o herida en tejido de un individuo (incluyendo los que aparecen a partir de procedimientos quirúrgicos, ya sean invasivos o no invasivos). Como se usa en la presente documentación, dolor post-quirúrglco no incluye al dolor que ocurre (aparece o se origina) sin un trauma físico externo. En algunas realizaciones, el dolor post-quírúrgico es dolor interno o externo (incluyendo periférico), y la herida, corte, desgarro, trauma o incisión puede ocurrir accidentalmente (como una herida traumática) o deliberadamente (como una incisión quirúrgica). Como se usa en la presente documentación, "dolor" incluye la nocicepción y la sensación de dolor, y el dolor se puede evaluar de manera objetiva o subjetiva, usando escalas de dolor u otros métodos bien conocidos en la materia. El dolor post-quir?rgíco, como se usa en la presente documentación, incluye alodinia (o sea respuesta incrementada a un estímulo normalmente no injurioso) e hiperalgesia (o sea, respuesta incrementada a un estímulo normalmente injurioso o no placentero), el que puede ser de naturaleza térmica o mecánica (táctil). En algunas realizaciones, el dolor está caracterizado por sensibilidad térmica, sensibilidad mecánica, y/o dolor de reposo. En algunas realizaciones, el dolor post-quirúrgico comprende dolor mecánicamente inducido o dolor en reposo. En otras realizaciones, el dolor post-quirúrgico comprende dolor de reposo. El dolor puede ser dolor primario o secundario, como bien se sabe en la materia.

Una "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un individuo y se puede usar en un ensayo de diagnostico o monitoreo. La definición abarca sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tal como un espécimen de biopsia o cultivo de tejidos o células derivadas de ellos, y su progenie. La definición también incluye muestras que se han manipulado de alguna manera luego de su obtención, tal como con tratamiento con reactivos, solubilizacíón, o enriquecimiento con ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos, o embebidos en una matriz sólida o semi-sólida para propósitos de sección. El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica, y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biológico y muestras de tejidos. Un "individuo" es un vertebrado, preferiblemente mamífero, más preferiblemente humano. Entre los mamíferos se incluye a, pero no como limitación, animales de granja (tales como vacas), animales deportivos, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. Como se usa en la presente documentación, "vector", significa una construcción que es capaz de entregar, y preferiblemente expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Entre los ejemplos de vectores se incluye a, pero no como limitación, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, plásmidos, cósmidos o vectores fágicos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, tales como células productoras. Como se usa en la presente documentación, "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. Una secuencia de control de expresión está operablemente ligada a la secuencia de ácido nucleico a transcribirse. Como se usa en la presente documentación, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite que el ingrediente retenga la actividad biológica y que sea no reactivo con el sistema inmune del paciente.

Entre los ejemplos se incluye a, pero no como limitación, cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales como solución salina amortiguada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión aceite/agua, y vanos tipos de agentes humectantes Los diluyentes preferidos para administración en aerosol o parenteral son la solución salina amortiguada con fosfato (0,9%) o normal Las composiciones que comprenden dichos vehículos están formuladas por medio de métodos bien conocidos (Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ava edición, A Gennaro, ed , Mack Publishing Co , Easton, PA, 1990, y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20ava Ed Mack Publishing, 2000) El término "Koff" como se usa en la presente documentación, tiene la intención de significar la constante de velocidad de salida para la disociación de un anticuerpo de un complejo antigeno/anticuerpo El término "Kd" como se usa en la presente documentación, tiene la intención de significar la constante de disociación de una interacción anfígeno/anticuerpo ANTICUERPOS E3, ANTICUERPOS DERIVADOS DE E3, COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA USARLOS Composiciones de E3, Composiciones derivadas de E3 y métodos para preparar las composiciones Esta invención abarca composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo o un po péptido E3, y polmucleótidos que comprenden secuencias que codifican un anticuerpo o un polipeptido E3 Como se las usa en la presente documentación, las composiciones comprenden uno o mas anticuerpos o po péptidos (que pueden ser o no un anticuerpo) que se unen al NGF, y/o uno o mas polmucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más anticuerpos o polipéptidos que se unen al NGF. Además, estas composiciones pueden comprender excipientes apropiados, tales como excipientes aceptables para el uso farmacéutico, incluyendo amortiguadores, que son bien conocidos en la técnica La invención también abarca realizaciones de anticuerpos, polipéptidos y polmucleótidos aislados La invención también abarca realizaciones de anticuerpos, polipéptidos y polinucleótidos sustanclalmente puros 47 aproximadamente 100 pM o menor, con aproximadamente 15 pM de NGF (en algunas realizaciones, NGF humano), y/o una IC50 de aproximadamente 20 pM o menor, con aproximadamente 1 ,5 pM de NGF. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al NGF humano y no se une significativamente al NGF de otra especie de vertebrado (en algunas realizaciones, de mamíferos). En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al NGF humano y a uno o más NGF de otras especies de vertebrados (en algunas realizaciones, de mamíferos). En aún otras realizaciones, el anticuerpo se une al NGF y no reacciona significativamente otras neurotrofinas (tales como las neurotrofinas relacionadas, NT3, NT4/5 y/o BDNF). En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al NGF y al menos otra neurotrofina. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al NGF de una especie de mamífero, tal como caballo o perro, pero no se une significativamente al NGF de otra especie de mamífero. En algunas realizaciones, la invención incluye un anticuerpo que comprende una cadena liviana, que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito de la ATCC N° PTA-4893 o ATCC N° PTA-4894. En otro aspecto, la invención incluye un anticuerpo que comprende una cadena pesada, que está codificada por un polinucleótido que es producido por una célula huésped con el número de depósito de la ATCC N° PTA-4895. La presente invención también abarca diversas formulaciones de E3 y fragmentos de anticuerpos equivalentes (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etcétera), de cadena simple (ScFv), mutantes de éstos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de E3 que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno (NGF) con la especificidad requerida. Los anticuerpos equivalentes de E3, incluyendo los fragmentos de anticuerpos y polipéptidos (que pueden ser o no anticuerpos) de E3, y los polipéptidos que comprenden fragmentos de polipéptidos de E3, se identifican y caracterizan por cualquiera (uno o más) de los criterios indicados previamente. Por consiguiente, en la invención se provee cualquiera de los siguientes, o composiciones (incluyendo composiciones farmacéuticas) que comprenden cualquiera de los siguientes: (a) un anticuerpo E3; (b) un fragmento o una región del anticuerpo E3; (c) una cadena liviana del 48 anticuerpo E3, como se indica en la Figura 1 B; (c) una cadena pesada del anticuerpo E3, como se indica en la Figura 1A; (d) una o más regiones variables de una cadena liviana y/o una cadena pesada del anticuerpo E3; (e) una o más CDR (una, dos tres, cuatro, cinco o seis) del anticuerpo E3 indicado en las Figuras 1A y 1 B; (f) la CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo E3 indicado en la Figura 1A; (g) la CDR L3 de la cadena liviana del anticuerpo E3 indicado en la Figura 1 B; (h) tres CDR de la cadena liviana del anticuerpo E3 indicado en la Figura 1B; (i) tres CDR de la cadena pesada del anticuerpo E3 indicado en la Figura 1A; (j) tres CDR de la cadena liviana y tres CDR de la cadena pesada del anticuerpo E3 indicado en las Figuras 1A y 1 B; y (k) un anticuerpo que comprende cualquiera de (b) a (j). Como resulta evidente a partir de la descripción proporcionada en la presente documentación, se excluyen específicamente de la invención las realizaciones de polipéptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo monoclonal de ratón 911. Las secuencias CDR extendidas de Mab 911 se indican en las Figuras 1 A y 1 B, y en SEQ ID Nc 9-14. Las porciones de CDR del anticuerpo E3 (incluyendo las CDR Chotia y Kabat) se ilustran en forma diagramática en las Figuras 1A y 1B, y consisten en las siguientes secuencias de aminoácidos: (a) CDR de cadena pesada 1 ("CDR H1") GFSLIGYDLN (SEQ ID N° 3); (b) CDR de cadena pesada 2 ("CDR H2") IIWGDGTTDYNSAVKS (SEQ ID N° 4); (c) CDR de cadena pesada 3 ("CDR H3") GGYWYATSYYFDY (SEQ ID N° 5); (d) CDR de cadena liviana 1 ("CDR L1") RASQSISNNLN (SEQ ID N° 6); (e) CDR de cadena liviana 2 ("CDR L2") YTSRFHS (SEQ ID N° 7); y (f) CDR de cadena liviana 3 ("CDR L3") QQEHTLPYT (SEQ ID N° 8). La determinación de las regiones CDR es bien conocida por aquellos entrenados en la técnica. Se comprenderá que, en algunas realizaciones, las CDR pueden ser una combinación de las CDR Kabat y Chotia (también denominadas "CDR combinadas" o "CDR extendidas"). En algunas realizaciones, las CDR comprenden la CDR Kabat. En otras realizaciones, las CDR son las CDR Chotia. En algunas realizaciones, en la invención se provee un anticuerpo que comprende al menos una CDR que es sustancialmente homólogo a al menos una CDR, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos 5 CDR de E3 (o, en algunas realizaciones, sustancialmente homólogo a las 6 CDR de E3, o derivadas de E3). Otras realizaciones incluyen anticuerpos que 49 tienen al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR que son sustancialmente homologas a al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de E3, o derivadas de E3. Se comprender que, para los propósitos de esta invención, en general se retiene la especificidad de unión y/o la actividad general (que puede expresarse en términos de tratamiento y/o prevención del dolor o inhibición de la Supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF), aunque la extensión de la actividad puede variar en comparación con E3 (puede ser mayor o menor). En la invención también se provee un polipéptido (que puede ser o no un anticuerpo) que comprende una secuencia de aminoácidos de E3 (indicado en las Figuras 1A y 1B) que tiene cualquiera de las siguientes características: al menos 5 aminoácidos contiguos, al menos 8 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de una secuencia de E3, donde al menos 3 de los aminoácidos son de una región variable de E3, teniendo en cuenta que se excluyen las realizaciones que consisten en una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal de ratón 911. Las secuencias CDR extendidas de Mab 911 se indican en las Figuras 1A y 1 B, y en SEQ ID N° 9-14. En una realización, la región variable es de una cadena liviana de E3. En otra realización, la región variable es de una cadena pesada de E3. En otra realización, los 5 (o más) aminoácidos contiguos son de una región de determinación de la complementariedad (CDR) de E3 indicada en las Figuras 1A y 1 B. En otra realización, en la invención se provee un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de E3 que tiene cualquiera de las siguientes características: al menos 5 aminoácidos contiguos, al menos 8 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de una secuencia de E3, donde la secuencia E3 comprende cualquiera de los siguientes componentes: un residuo de aminoácido L29 de CDRH1 , I50 de CDRH2, W101 de CDRH3 y/o A103 de CDRH3; y/o un residuo de 50 aminoácido S28 de CDRL1 , N32 de CDRL1 , T51 de CDRL2, 91 E de CDRL3 y/o H92 de CDRL3, teniendo en cuenta que se excluyen las realizaciones que consisten en una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal de ratón 911. Como resulta evidente a partir de la descripción, se usa un esquema de numeración consecutiva de aminoácidos para designar los residuos de aminoácidos en las regiones variables (es decir, los residuos de aminoácidos en cada región variable se enumeran de forma consecutiva). Como es bien conocido en la técnica, los sistemas de numeración Kabat y/o Chotia son útiles cuando se comparan dos anticuerpos o polipéptidos, tales como un anticuerpo E3 y una variante E3 (o un polipéptido sospechado de ser una variante E3). La conversión de la numeración consecutiva en numeración Chotia y/o Kabat es bien conocida en la técnica, por ejemplo, si resulta deseable para usar en la realización de comparaciones entre E3 y otro polipéptido. En la Figura 23 se ¡lustran las regiones variables E3 numeradas usando una numeración consecutiva, Chotía y Kabat. Además, para facilitar la comparación, generalmente se comprende que las regiones de marco de trabajo generalmente, pero no siempre, tienen aproximadamente la misma cantidad de residuos. Sin embargo, las CDR pueden tener un tamaño variable (es decir, es posible tener inserciones y/o supresiones de uno o más residuos de aminoácidos). Cuando se compara un anticuerpo E3 y una variante E3 candidata (por ejemplo, en el caso de una región CDR de una secuencia candidata que ya no está en la secuencia del anticuerpo E3 con el que se realiza el alineamiento), es posible seguir los siguientes pasos (a través de otros métodos conocidos en la técnica). La secuencia de anticuerpo candidata se alinea con las regiones variables de la cadena pesada y la cadena liviana del anticuerpo E3. El alineamiento puede realizarse a mano o por computadora, usando programas comúnmente aceptados. Es posible facilitar el alineamiento usando algunos residuos de aminoácidos que son comunes para la mayor parte de las secuencias Fab. Por ejemplo, cada una de las cadenas livianas y pesadas típicamente tienen dos cisteínas, que comúnmente se hallan en una posición conservada. Se comprende que la secuencia de aminoácidos de una variante de anticuerpo candidata puede ser más larga (es decir, puede tener residuos de aminoácidos insertados) o más cortas (puede tener residuos de aminoácidos suprimidos). Pueden agregarse sufijos a la cantidad de residuos para indicar la inserción de 51 residuos adicionales, por ejemplo, residuo 34 abe. Para las secuencias candidatas que, por ejemplo, se alinean con una secuencia E3, por ejemplo, en los residuos 33 y 35, pero que no tienen residuos entre ellos que se alinean con el residuo 35, simplemente no se asigna el residuo 35 a un residuo. En otro abordaje, generalmente es bien sabido que no puede efectuarse la comparación entre aminoácidos equivalentes desde el punto de vista estructural (por ejemplo, la misma posición en el complejo de antígeno-antícuerpo) cuando se comparan CDR de longitud diferente. Por ejemplo, en la numeración Chotia (Al-Lazikan¡ et al, supra) generalmente (pero no en todos los casos) se colocan inserciones y supresiones en todas las posiciones correctas desde el punto de vista estructural. También puede deducirse o demostrarse la equivalencia estructural usando cristalografía de rayos X o análisis de mutantes de ciclo doble (véase Pons et al. (1999) Prot. Sci. 8:958-968). La afinidad de unión de un anticuerpo anti-NGF con el NGF (tal como el hNGF) puede ser de entre aproximadamente 0,10 y aproximadamente 0,80 nM, entre aproximadamente 0,15 y aproximadamente 0,75 nM, y entre aproximadamente 0,18 y aproximadamente 0,72 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es de aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 40 pM, o mayor que aproximadamente 40 pM. En una realización, la afinidad de unión es de entre aproximadamente 2 pM y 22 pM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es menor que aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 3.5 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 2.5 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 1.5 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 900 pM, aproximadamente 800 pM, aproximadamente 700 pM, aproximadamente 600 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 90 pM, aproximadamente 80 pM, aproximadamente 70 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 10 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es de aproximadamente 10 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es menor que aproximadamente 10 nM. En otras realizaciones, la afinidad de 52 unión es de aproximadamente 0,1 nM o aproximadamente 0,07 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es menor que aproximadamente 0,1 nM o menor que aproximadamente 0,07 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión toma cualquier valor seleccionado entre aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 3.5 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 2.5 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 1.5 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 900 pM, aproximadamente 800 pM, aproximadamente 700 pM, aproximadamente 600 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 90 pM, aproximadamente 80 pM, aproximadamente 70 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 10 pM y aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, o aproximadamente 40 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión toma cualquier valor seleccionado entre aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 3.5 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 2.5 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 1.5 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 900 pM, aproximadamente 800 pM, aproximadamente 700 pM, aproximadamente 600 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 90 pM, aproximadamente 80 pM, aproximadamente 70 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 10 pM. En aún otras realizaciones, la afinidad de unión es de aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 40 pM, o mayor que aproximadamente 40 pM. Es posible determinar la afinidad de unión del anticuerpo con el NGF usando métodos bien conocidos en la técnica. Una forma para determinar la afinidad de unión de los anticuerpos con el NGF comprende medir la afinidad de fragmentos monofuncionales Fab del anticuerpo como se describe en los Ejemplos. Para obtener fragmentos monofuncionales Fab, puede cortarse un 53 anticuerpo (por ejemplo, IgG) con papaína, o puede expresárselo en forma recombinante. Puede determinarse la afinidad de un fragmento anti-NGF Fab de un anticuerpo por resonancia de plasmón superficial (sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore3000™ (SPR), BIAcore, INC, Piscataway NJ), como se describe en los Ejemplos. Este protocolo es apropiado para usar en la determinación de la afinidad de unión de un anticuerpo con el NGF de cualquier especie, incluyendo NGF humano, NGF de otro vertebrado (en algunas realizaciones, de mamífero) (tal como NGF de ratón, NGF de rata, NGF de primate), y también para usar con otras neurotrofinas, tales como las neurotrofinas relacionadas, NT3, NT4/5 y/o BDNF. En algunas realizaciones, los anticuerpos o los péptidos de la invención pueden inhibir (reducir y/o bloquear) la supervivencia de neuronas trigéminas de ratones E13.5 dependiente del NGF humano con una IC50 (en presencia de aproximadamente 15 pM de NGF) seleccionada entre cualquiera de los siguientes valores: 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM o menor. En algunas realizaciones, los anticuerpos o los péptidos de la invención pueden inhibir (reducir y/o bloquear) la supervivencia de neuronas trigéminas de ratones E13.5 dependiente del NGF humano con una IC50 (en presencia de aproximadamente 1 ,5 pM de NGF) seleccionada entre cualquiera de los siguientes valores: 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM o menor. En algunas realizaciones, los anticuerpos o los péptídos de la invención pueden inhibir (reducir y/o bloquear) la supervivencia de neuronas trigéminas de ratones E13.5 dependiente del NGF de rata con una IC50 (en presencia de aproximadamente 15 pM de NGF) seleccionada entre cualquiera de los siguientes valores: 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM o menor. En algunas realizaciones, los anticuerpos o los péptídos de la invención pueden inhibir (reducir y/o bloquear) la supervivencia de neuronas trigéminas de ratones E13.5 dependiente del NGF de rata con una IC50 (en presencia de aproximadamente 1 ,5 pM de NGF) seleccionada entre cualquiera de los siguientes valores: 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM o menor. Los métodos para medir la supervivencia de neuronas trigéminas de ratones E13 son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el Ejemplo 2. 54 En la invención también se proveen métodos para preparar cualquiera de estos anticuerpos o polipéptidos. Los anticuerpos de esta invención pueden prepararse con cualquier procedimiento conocido en la técnica, algunos de los cuales se ilustran en los Ejemplos. Los polipéptidos pueden producirse mediante la degradación proteolítica o por otros medios de los anticuerpos, por métodos recombinantes (es decir, polipéptidos individuales o de fusión) como se describió previamente, o por síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos, de a lo sumo aproximadamente 50 aminoácidos, convenientemente se preparan por síntesis química. Los métodos de síntesis química se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, podría producirse un anticuerpo E3 con un sintetizador de polipéptidos automatizado empleando el método en fase sólida. Véanse también las Patentes de los EEUU N° 5807715, 4816567 y 6331415. También pueden prepararse anticuerpos quiméricos o híbridos in vitro, usando métodos conocidos de química de síntesis de proteínas, incluyendo aquellos que comprenden agentes de reticulación. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos apropiados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato. En otra alternativa, pueden prepararse los anticuerpos en forma recombinante, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. En una realización, se clona un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica las regiones de cadena variable y liviana del anticuerpo E3 (indicado en las Figuras 1A y 1B) en un vector para realizar la expresión o la propagación en una célula huésped (por ejemplo, células CHO). En otra realización, las secuencias de polínucleótidos indicadas en las Figuras 2 y 3 se clonan en uno o más vectores de expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped, y luego puede expandirse y congelarse la célula huésped para un uso futuro. En la presente documentación se describen con mayor detalle los vectores (incluyendo vectores de expresión) y las células huésped. Se han descripto métodos para expresar anticuerpos en forma recombinante en plantas o leche. Véanse, por ejemplo, Peeters et al. (2001) Vaccine 19:2756; Lonberg, N. y D. Huszar (1995) Int.Rev.lmmunol 13:65; y Pollock et al. (1999) J Immunol Métodos 55 231:147. En la técnica se conocen métodos para preparar derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, de cadena simple, etcétera. La invención también abarca fragmentos de regiones variables de cadena simple ("scFv") de los anticuerpos de esta invención, tales como E3. Los fragmentos de regiones variables de cadena simple se preparan uniendo regiones variables de las cadenas liviana y/o pesada por medio del uso de un péptido conector corto. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Un ejemplo de un péptido conector es (GGGGS)3 (SEQ ID N° 15), que conecta aproximadamente 3,5 nm entre el extremo carboxilo de una región variable y el extremo amino de la otra región variable. Se han diseñado y usado conectores para oras secuencias (Bird et al. (1988)). A su vez, es posible modificar los conectores para obtener otras funciones, tales como la unión de drogas o la unión a soportes sólidos. Las variantes de cadena única pueden producirse en forma recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv es posible usar un sintetizador automatizado. Para la producción recombinante de scFv puede introducirse un plásmido apropiado, que contiene un polinucleótido que codifica la scFv, en una célula huésped apropiada, ya sea eucariota, tal como una célula de levadura, planta, insecto o mamífero, o procariota, tal como E. coli. Pueden prepararse polinucleótidos que codifican las scFv de interés realizando manipulaciones de rutina, tales como la unión de los polinucleótidos. La scFv resultante puede aislarse usando procedimientos de purificación de proteínas bien conocidos en la técnica. También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena simple, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes bispecíficos en los que se expresan los dominios VH y VL en una única cadena polipeptídica, pero usando un conector que es demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, con lo que se fuerza el apareamiento de los dominios con dominios complementarios de otra cadena y la creación de dos sitios de unión a antígenos (véanse, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo monoclonal que presenta especificidad de unión por al menos dos antígenos diferentes. Puede prepararse un anticuerpo biespecífico usando los anticuerpos descriptos en la presente documentación. En la técnica se 56 conocen métodos para preparar anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121 :210). Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se ha basado en la coexpresión de los dos pares de cadenas pesadas-cadenas livianas de la inmunoglobulina con dos cadenas pesadas que tienen distintas especificidades (Millstein y Cuello, 1983, Nature 305, 537-539). De acuerdo con un abordaje para preparar anticuerpos biespecíficos, se fusionan dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) con secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. La fusión se realiza preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de articulación, CH2 y CH3. Es preferible que tenga la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena liviana presente en al menos una de las fusiones. Se insertan los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada inmunoglobulina, y si se lo desea, se inserta la cadena liviana de la inmunoglobulina en vectores de expresión separados, y se realiza una co-transfección en un organismo huésped apropiado. Esto proporciona una mayor flexibilidad en el ajuste de las propiedades mutuas de los fragmentos polipeptidicos, en realizaciones en las que se usan relaciones no igualitarias entre las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción para obtener rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o la totalidad de las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión, cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones igualitarias resulta en rendimientos mayores, o cuando las relaciones no tienen una significación particular. En un abordaje, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica, con una cadena liviana de inmunoglobulina en solamente la mitad de la molécula bíespecífica, facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no 57 deseadas. Este abordaje se describe en la Solicitud PCT N° WO 94/04690, publicada el 3 de Marzo de 1994. Los anticuerpos heteroconjugados, que comprenden dos anticuerpos unidos en forma covalente, también están dentro del alcance de la invención. Se han usado anticuerpos para dirigir células del sistema inmune hacia células indeseadas (Patente de los EEUU N° 4676980) y para el tratamiento de infecciones de HIV (publicaciones de solicitudes PCT N° WO 91/00360 y WO 92/200373; EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse usando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes y los procedimientos de reticulación apropiados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de los EEUU N° 4676980. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, por ejemplo, como se conoce en la técnica y se describe en la presente documentación. Es posible modificar los anticuerpos como se describe en la Solicitud PCT N° WO 99/58572, publicada el 18 de Noviembre de 1999. Estos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a la molécula blanco, un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa a la totalidad o una parte de un dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos son capaces de unirse a la molécula blanco sin desencadenar una lisis dependiente de complemento o una destrucción del blanco mediada por células significativa. Preferiblemente, el dominio efector es capaz de unirse específicamente a FcRn y/o FcyRIlb. Éstos típicamente se basan en dominios quiméricos derivados de dos o más dominios CH2 de cadenas pesadas de inmunoglobulina. Se prefieren los anticuerpos modificados de este modo para usar en terapia crónica con anticuerpos, para evitar reacciones inflamatorias y otras reacciones adversas ante la terapia con anticuerpos convencional.

La invención abarca modificaciones al anticuerpo E3, incluyendo anticuerpos equivalentes desde el punto de vista funcional, sin alteraciones significativas en sus propiedades, y variantes que tienen una actividad mejorada o reducida. La modificación de polipéptidos es un procedimiento de rutina en la técnica, y se presentan ejemplos con mayor detalle en la sección de Ejemplos. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polípéptidos con sustituciones (incluyendo 58 sustituciones conservativas) de residuos de aminoácidos, una o más supresiones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente en forma perjudicial la actividad funcional, o el uso de análogos químicos. Una "variante" de un polipéptido, como se la usa en la presente documentación, es un polipéptido que difiere de una proteína nativa en una o más sustituciones, supresiones, adiciones y/o inserciones, de modo que no se reduce sustancialmente la inmunorreactividad del polipéptido. En otras palabras, la capacidad de una variante de unirse específicamente a un antígeno puede estar mejorada o inalterada, en comparación con la proteína nativa, o puede estar reducida en menos de 50%, y preferiblemente menos de 20%, respecto de la proteína nativa. Las variantes de los polipéptidos preferiblemente presentan al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad (determinada como se describe en la presente documentación) con los polipéptidos identificados. Pueden prepararse variantes de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo, o por síntesis química. Estas variantes ¡ncluyen, por ejemplo, supresiones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID N° 1 ó 2 descriptas en la presente documentación. Se realiza cualquier combinación de supresiones, inserciones y sustituciones para obtener la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar el procesamiento post-traduccional del anticuerpo, tal como el cambio de la cantidad o la posición de los sitios de glicosilación. Un método útil para identificar determinados residuos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferidas para mutagénesis o modificaciones se conoce como "mutagénesis de análisis de alanina", y ha sido descripto por Cunníngham y Wells, 1989, Science, 244:1081-1085. Se identifica un residuo o un grupo de residuos blanco (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu), y se los reemplaza por un aminoácido neutro o cargado en forma negativa (más preferiblemente alanína o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas localizaciones de aminoácidos que exhiben sensibilidad funcional a las 59 sustituciones se refman posteriormente introduciendo vanantes alternativas o adicionales en o para los sitios de sustitución Por consiguiente, si bien el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos esta predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se realiza una mutagénesis de análisis de ala o al azar en el codón o la región blanco, y se analiza la actividad deseada en las vanantes de anticuerpos expresadas También puede usarse la mutagénesis de análisis de bibliotecas, tal como se describe en la presente documentación, para identificar localizaciones en un anticuerpo que son apropiadas para mutagénesis o modificación Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxi-terminales con una longitud que varía entre un residuo y po péptidos que contienen cien o más residuos, asi como inserciones de uno o mas residuos de aminoácidos dentro de la secuencia Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal, o el anticuerpo fusionado a una marca de epitope Otras vanantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión de una enzima o un polipéptido que incrementa la vida media en suero del anticuerpo con el extremo N o C del anticuerpo Las vanantes de sustitución presentan la eliminación de al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo, y la inserción de un residuo diferente en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervapables, pero también se contemplan alteraciones FR Se indican sustituciones conservativas en la Tabla 1 , con el encabezado de "sustituciones conservativas" Si estas sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse más cambios sustanciales, denominados "ejemplos de sustituciones" en la Tabla 1 , o como se describe con mayor detalle más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y pueden analizarse los productos Tabla 1 Sustituciones de aminoácidos 60 Pueden efectuarse modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en el efecto de mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o la hídrofobicidad de la molécula en el sitio blanco, o (c) el tamaño de la cadena lateral. Los residuos de ocurrencia natural se dividen en grupos sobre la base de las propiedades de sus cadenas laterales: (1 ) Hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; 61 (2) Hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr; (3) Ácidos: Asp, Glu; (4) Básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg; (5) Residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservativas se realizan intercambiando un miembro de una de estas clases por otra clase. También puede sustituirse cualquier residuo de cisteína que no participa en la conformación apropiada del anticuerpo, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxídativa de la molécula y evitar una reticulación aberrante. Por otro lado, pueden agregarse enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad, particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv. Las modificaciones de los aminoácidos pueden variar entre el cambio o la modificación de uno o más aminoácidos para completar el rediseño de una región, tal como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad y/o la especificidad de unión. En algunas realizaciones, no se realiza más de entre una y cinco sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de un dominio CDR. En otras realizaciones, no se realizan más de entre una y tres sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de un dominio CDR3. En aún otras realizaciones, el dominio CDR es CDRH3 y/o CDR L3. Las modificaciones también los polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como los polipéptidos con otras modificaciones post-traduccionales, tales como, por ejemplo, la glícosílacíón con distintos azúcares, acetilación y fosforilación. Los anticuerpos se glicosilan en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright y Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan la función de la proteína (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe y Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) y la interacción intramolecular entre las porciones de la glicoproteína, que pueden afectar la conformación y la superficie tridimensional expuesta de la glicoproteína (Hefferis y Lund, supra; Wyss y Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). 62 Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una glicoproteína dada hacia determinadas moléculas, sobre la base de estructuras de reconocimiento específicas. También se ha informado que la glícosilación de los anticuerpos afecta la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En particular, se ha informado que las células CHO con expresión de ß(1 ,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa lll (GnTIII) regulada por tetraciclina, una formación que cataliza glicosiltransferasa con un perfil de GIcNAc, tienen una actividad de ADCC mejorada (Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17:176-180). La glicosilación de los anticuerpos típicamente está enlazada a N o enlazada a O. Enlazada a N hace referencia a la unión de la porción de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparragina. Las secuencias de tripéptídos asparragina-X-serína y asparragina-X-treonína, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparragina. Por consiguiente, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Enlazada a O hace referencia a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo convenientemente se efectúa alterando la secuencia del aminoácido para que contenga una o más de las secuencias de trípéptidos descriptas previamente (para los sitios de glicosilación enlazados a N). También es posible efectuar la alteración por medio de la adición o la sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación enlazados a O).

También puede alterarse el patrón de glicosilación de los anticuerpos sin alterar la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilación depende en gran medida de la célula huésped usada para expresar el anticuerpo. Como el tipo celular usado para la expresión de glicoproteínas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, como agentes terapéuticos potenciales raramente es la célula nativa, pueden esperarse variaciones en el patrón de glicosilación de los anticuerpos (véase, por ejemplo Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070). 63 De la elección de las células huésped, los factores que afectan la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos ¡ncluyen el modo de crecimiento, la formulación del medio, la densidad del cultivo, la oxigenación, el pH, los esquemas de purificación y semejantes. Se han propuesto diversos métodos para alterar el patrón de glicosilacíón en un organismo huésped particular, incluyendo la introducción o la sobreexpresión de determinadas enzimas que participan en la producción de oligosacáridos (Patentes de los EEUU N° 5047335, 5510261 y 5278299). Puede eliminarse la glicosilación, o determinados tipos de glicosílación, de la glicoproteina por medios enzimáticos, por ejemplo, usando endoglicosidasa H (Endo H). Además, puede modificarse genéticamente la célula huésped recombinante para que presente defectos en el procesamiento de determinados tipos de polisacáridos. Estos procedimientos, y otros similares, son bien conocidos en la técnica. Otros métodos de modificación incluyen el uso de procedimientos de unión conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitaciones, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelado. Pueden usarse modificaciones, por ejemplo, para unir marcas para un inmunoensayo. Los polipéptidos E3 modificados se preparan usando procedimientos establecidos en la técnica, y pueden analizarse usando ensayos convencionales conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen más adelante y en los Ejemplos. Otras modificaciones a los anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados como se describe en la Publicación PCT N° WO 99/58572, publicada el 18 de Noviembre de 1999. Estos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a la molécula blanco, un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa a la totalidad o una parte de un dominio constante de una cadena pesada de una inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos son capaces de unirse a la molécula blanco sin desencadenar una lisis dependiente de complemento o una destrucción del blanco mediada por células significativa. En algunas realizaciones, el dominio efector es capaz de unirse específicamente a FcRn y/o FcvRllb. Éstos típicamente se basan en dominios quiméricos derivados de dos o más dominios CH2 de cadenas pesadas de inmunoglobulina. Los anticuerpos modificados de este modo son particularmente 64 apropiados para usar en terapia crónica con anticuerpos, para evitar reacciones inflamatorias y otras reacciones adversas ante la terapia con anticuerpos convencional. La invención también abarca proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los anticuerpos (tales como E3) o los polipéptidos de esta invención. En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la región variable de la cadena liviana indicada en la Figura 1 B y/o al menos 10 aminoácidos de la región variable de la cadena pesada indicada en la Figura 1A. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una región variable de la cadena liviana y/o una región variable de la cadena pesada de E3, como se indica en las Figuras 1A y 1B. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una o más CDR de E3. En aún otras realizaciones, el polipéptido de fusión comprende CDR H3 y/o CDR L3 del anticuerpo E3. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende cualquiera de los siguientes componentes: un residuo de aminoácido L29 de CDRH1 , I50 de CDRH2, W101 de CDRH3, y/o A103 de CDRH3; y/o un residuo de aminoácido S28 de CDRL1 , N32 de CDRL1 , T51 de CDRL2, 91 E de CDRL3 y/o H92 de CDRL3. Para los propósitos de esta invención, una proteína de fusión E3 contiene uno o más anticuerpos E3 y otra secuencia de aminoácidos con la que no está unida en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homologa de otra región. Los ejemplos de secuencias heterólogas incluyen, sin limitaciones, una "marca", tal como una marca FLAG o una marca 6His. Las marcas son bien conocidas en la técnica. Puede crearse un polipéptído de fusión E3 empleando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por medios sintéticos o recombinantes, Típicamente, las proteínas de fusión E3 de esta invención se preparan expresando un polinucleótido que las codifica, de acuerdo con los métodos recombinantes descriptos en la presente documentación, aunque también pueden prepararse de acuerdo con otros medios conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, síntesis química. En esta invención también se proveen composiciones que comprenden anticuerpos o polipéptidos E3 conjugados (por ejemplo, unidos) a un agente que facilita la unión a un soporte sólido (tal como biotina o avidina). Por motivos de simplicidad, en general se hará referencia a E3 o 65 anticuerpos, asumiendo que estos métodos se aplican a cualquiera de las realizaciones de unión al NGF descriptas en la presente documentación. La conjugación generalmente hace referencia a la unión de estos componentes como se describió en la presente documentación. La unión (que generalmente comprende fijar estos componentes en asociación próxima al menos para la administración) puede efectuarse de una variedad de formas. Por ejemplo, es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuado cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) en el otro. Un anticuerpo o un polipéptido de esta invención puede estar unido a un agente marcador (que como alternativa puede denominarse "marca"), tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualquier otra marca conocida en la técnica. En la técnica se conocen marcas que generalmente proporcionan (en forma directa o indirecta) una señal. Por consiguiente, la invención incluye anticuerpos y polipéptídos marcados. La capacidad de los anticuerpos y los polipéptidos de esta invención, tal como la capacidad de unirse al NGF; reducir o inhibir una actividad biológica de NGF; reducir y/o bloquear la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 inducida por NGF, puede evaluarse usando métodos conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen en los Ejemplos. En la invención también se proveen composiciones (incluyendo composiciones farmacéuticas) y conjuntos de elementos que comprenden el anticuerpo E3 y, como se aclara en esta descripción, cualquiera o la totalidad de los anticuerpos y/o los polipéptidos descriptos en la presente documentación. Polinucleótidos, vectores y células huésped En la invención también se proveen polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos y los polipéptidos de la invención (incluyendo un anticuerpo que comprende las secuencias polipeptidicas de las regiones variables de la cadena liviana y la cadena pesada indicadas en las Figuras 1A y 1 B), y vectores y células huésped que comprenden el polinucleótido. 66 Por consiguiente, en la invención se proveen polmucleótidos (o composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas), que comprenden pohnucleotidos que codifican cualquiera de los siguientes (a) un anticuerpo E3, (b) un fragmento o una región del anticuerpo E3, (c) una cadena liviana del anticuerpo E3, como se indica en las Figuras 1B, (d) una cadena pesada del anticuerpo E3, como se indica en las Figuras 1A, (e) una o mas regiones variables de una cadena liviana y/o una cadena pesada del anticuerpo E3, (f) una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR) del anticuerpo E3 indicado en las Figuras 1A y 1 B, (g) CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo E3 indicado en la Figura 1A, (h) CDR L3 de la cadena liviana del anticuerpo E3 indicado en la Figura 1B, (i) tres CDR de la cadena liviana del anticuerpo E3 indicado en la Figura 1B, (j) tres CDR de la cadena pesada del anticuerpo E3 indicado en la Figura 1A, (k) tres CDR de la cadena liviana y tres CDR de la cadena pesada, de anticuerpo E3 indicado en las Figuras 1A y 1 B, o (I) un anticuerpo que comprende cualquiera de (b) a (k) En algunas realizaciones, el polinucleotido comprende cualquiera o ambos polinucleótidos indicados en las Figuras 2 y 3 En otro aspecto, la invención comprende un polinucleótido aislado que codifica una cadena liviana E3 con el numero de depósito de la ATCC N° PTA-4893 o ATCC N° PTA-4894 En otro aspecto, la invención comprende un polmucleótido aislado que codifica una cadena pesada E3 con el número de depósito de la ATCC N° PTA-4895 En aún otro aspecto, la invención comprende un polmucleótido aislado que comprende (a) una región variable codificada en el polinucleótido con el número de depósito de la ATCC N° PTA-4894, y (b) una región variable codificada en el po nucleótido con el numero de depósito de la ATCC N° PTA-4895 En otro aspecto, la invención comprende un po nucleotido aislado que comprende (a) una o más CDR codificadas por el po nucleótido con el número de depósito de la ATCC N° PTA-4894, y/o (b) una o más CDR codificadas por el po nucleotido con el numero de depósito de la ATCC N° PTA-4895 En otro aspecto, en la invención se proveen polmucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos) y polipéptidos descpptos en la presente documentación Los polinucleótidos pueden prepararse con procedimientos conocidos en la técnica En otro aspecto, en la invención se proveen composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) que comprenden cualquiera de los polinucleótidos de la invención. En algunas 67 realizaciones, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo E3 descripto en la presente documentación. En otra realización, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos o los polipéptídos descriptos en la presente documentación. En aún otras realizaciones, la composición comprende cualquiera o ambos polinucleótidos indicados en las Figuras 2 y 3. Los vectores de expresión, y la administración de las composiciones de polinucleótidos se describen con mayor detalle en la presente documentación. En otro aspecto, en la invención se provee un método para preparar cualquiera de los polínucleótidos descriptos en la presente documentación. Los polinucleótidos complementarios con cualquiera de estas secuencias también se ¡ncluyen en la presente invención. Los polinucleótidos pueden ser de cadena simple (codificantes o antisentido) o de cadena doble, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de HnARN, que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN con una coincidencia total, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Puede haber secuencias codificantes o no codificantes adicionales presentes en un polinucleótido de la presente invención, pero esto no es necesario, y un polinucleótido puede estar unido a otras moléculas y/o materiales de apoyo, aunque esto no es necesario. Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o una porción de éste) o puede comprender una variante de esta secuencia. Las variantes de los polinucleótidos contienen una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones, de modo que no se reduzca la inmunorreactivídad del polipéptido codificado, respecto de una molécula inmunorreactiva nativa. En general puede evaluarse el efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado como se describe en la presente documentación. Las variantes preferiblemente presentan al menos aproximadamente 70% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente 80% de identidad, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad con una secuencia polipeptídica que codifica un anticuerpo nativo, o una porción de ésta. 68 Se dice que dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos son "idénticas" sí la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es igual cuando se la alinea para obtener una correspondencia máxima, tal como se describirá más adelante. Las comparaciones entre ambas secuencias típicamente se efectúan comparando las secuencias en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se la usa en la presente documentación, hace referencia a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, comúnmente entre 30 y aproximadamente 75, 40 y aproximadamente 50, donde puede compararse una secuencia con una secuencia de referencia de la misma cantidad de posiciones contiguas una vez que se alinean las dos secuencias de forma óptima. Pueden realizarse alineamientos óptimos para comparar secuencias usando el programa Megalign en el conjunto de software de bioinformática Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), con los parámetros por omisión. En este programa se realizan diversos esquemas de alineamiento descriptos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. en Dayhoff, M.O. (editor) Atlas of Proteín Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robínson, E.D., 1971 , Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principies and Practíce of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:726-730. Preferiblemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas en forma óptima dentro de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, donde la porción de la secuencia del polinucleótido o el polipéptido secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia) de 20 por ciento o menos, comúnmente de entre 5 y 15 por ciento, o entre 10 y 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o 69 supresiones) para alinear las dos secuencias de forma óptima. El porcentaje se calcula determinando la cantidad de posiciones en las que las bases de ácidos nucleicos o los residuos de aminoácidos idénticos aparecen en ambas secuencias, con el fin de obtener la cantidad de posiciones de coincidencia, dividiendo la cantidad de posiciones de coincidencia por la cantidad total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Adicionalmente o como alternativa, las variantes pueden ser sustancialmente homologas a un gen nativo, o una porción o un complemento de ésta. Estas variantes de polinucleótidos pueden hibridizar bajo condiciones moderadamente estrictas con una secuencia de ADN de ocurrencia natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria). Las "condiciones moderadamente estrictas" apropiadas ¡ncluyen un lavado previo en una solución de SSC 5X, 0,5% de SDS, EDTA 1 ,0 mM (pH 8,0); una hibridización a 50°C-65°C, SSC 5X, durante la noche, seguido por dos lavados a 65°C por 20 minutos, cada uno con SSC 2X, 0,5X y 0,2X que contiene 0,1% de SDS. Como se las usa en la presente documentación, las "condiciones muy estrictas" o "condiciones de gran severidad" son aquellas en las que: (1 ) se emplea una baja fuerza iónica y una temperatura elevada par el lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/0,1% de dodecil sulfato de sodio a 50°C; (2) durante la hibridización se emplea un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0,1% de albúmina de suero bovino/0, 1 % de Ficoll/0,1 % de polivinilpirrolidona/amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) se emplea 50% de formamida, SSC 5x (NaCI 0,75 M, citato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42°C, con lavados a 42°C en SSC 0,2x (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55°C, a lo que sigue un lavado de gran severidad que consiste en SSC 0,1x que contiene EDTA a 55°C. Aquél entrenado en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etcétera, según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda, y semejantes. 70 Aquellos entrenados en la técnica podrán apreciar que, como resultado de la degeneración del código genético, hay varias secuencias de nucleótídos que codifican un polipéptído como se describe en la presente documentación. Algunos de estos polinucleótidos presentan una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. Aún así, los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso de codones están contemplados específicamente en la presente invención. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente documentación están dentro del alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que se ven alterados como resultado de una o más mutaciones, tales como supresiones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultante pueden tener una estructura o una función alterada, aunque esto no es necesario. Pueden identificarse los alelos usando procedimientos convencionales (tales como hibridización, amplificación y/o comparación de bases de datos de secuencias). Los polinucleótidos de esta invención pueden obtenerse usando síntesis química, métodos recombinantes o PCR. Los métodos para sintetizar polinucleótidos por medios químicos son bien conocidos en la técnica, y no es necesario describirlos en detalle en la presente documentación. Aquél entrenado en la técnica puede usar las secuencias proporcionadas en la presente documentación y un sintetizador de ADN comercial para producir una secuencia de ADN deseada.

Para preparar los polinucleótidos usando métodos recombinantes, puede insertarse un polinucleótído que comprende una secuencia deseada en un vector apropiado, y a su vez puede introducirse el vector en una célula huésped apropiada para que se replique y amplifique, como se describe con mayor detalle en la presente documentación. Los polinucleótídos pueden insertarse en las células huésped de acuerdo con cualquier medio conocido en la técnica. Las células se transforman introduciendo un polinucleótido exógeno por asimilación directa, endocitosis, transfección, apareamiento F o electroporación. Una vez introducido, es posible mantener el polinucleótido exógeno dentro de la célula como un vector no integrado (tal como un plásmido) o integrado en el genoma de la célula huésped. El polinucleótído amplificado de este modo puede 71 aislarse de la célula huésped con métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989). Como alternativa, la PCR permite reproducir secuencias de ADN. La tecnología de PCR es bien conocida en la técnica y se describe en las Patentes de los EEUU N° 4683195, 4800159, 4754065 y 4683202, y también en PCR: The Polimerase Chain Reaction, Mullís et al. editores, Bírkauswer Press, Boston (1994). Puede obtenerse ARN usando el ADN aislado en un vector apropiado, e insertándolo en una célula huésped apropiada. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN, luego puede aislarse el ARN usando métodos bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica, como se indica, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989). Los vectores de clonación apropiados pueden construirse de acuerdo con procedimientos convencionales o pueden seleccionarse entre una gran cantidad de vectores de clonación disponibles en la técnica. Si bien el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula huésped que se desea usar, los vectores de clonación útiles generalmente tendrán la capacidad de replicarse por sí solos, pueden poseer un único blanco para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden contener genes para un marcador que pueden usarse en la selección de los clones que contienen el vector. Los ejemplos apropiados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColEl , pCR1, RP4, ADN de fagos, y vectores de transporte, tales como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles en distribuidores comerciales, tales como BioRad, Strategene e Invitrogen. Los vectores de expresión generalmente son construcciones polinucleotídicas con capacidad de replicación que contienen un polinucleótido de acuerdo con la invención. Está implícito que un vector de expresión debe tener la capacidad de replicarse en las células huésped, ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico. Los vectores de expresión apropiados incluyen, sin limitaciones, plásmidos, vectores virales, incluyendo adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, cósmidos y los vectores de expresión descriptos en la Publicación PCT N° WO 87/04462. Los componentes del vector generalmente pueden incluir, sin 72 limitaciones, uno o más de los siguientes: una secuencia señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos de control de la transcripción apropiados (tales como promotores, potenciadores y terminadores). Comúnmente se requieren uno o más elementos de control de la traducción, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de inicio de la traducción y codones de detención, para la expresión (es decir, para la traducción). Los vectores que contienen los polinucleótídos de interés pueden introducirse en la célula huésped de acuerdo con cualquiera de una cantidad de medios apropiados, incluyendo electroporación, transfecci?n, uso de cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias, bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso, tal como el virus de viruela). La elección de los vectores o los polinucleótidos de introducción comúnmente dependerá de las características de la célula huésped. En la invención también se proveen células huésped que comprenden cualquiera de los polipucleótidos descriptos en la presente documentación. Puede usarse cualquier célula huésped capaz de sobreexpresar ADN heterólogos con el propósito de aislar los genes que codifican el anticuerpo, el polipéptido o la proteína de interés. Los ejemplos no limitantes de células huésped de mamíferos incluyen, sin limitaciones, células COS, HeLa y CHO. Véase también la Publicación PCT N° WO 87/04462. Las células huésped apropiadas que no pertenecen a mamíferos incluyen procariotas (tales como E. coli o B. subtillis) y levaduras (tales como S. cerevisae, S. pombe; o K. lactis). Preferiblemente, las células huésped expresan los ADNc en las células huésped a un nivel aproximadamente 5 veces mayor, más preferiblemente 10 veces mayor, aún más preferiblemente 20 veces mayor que el del anticuerpo o la proteína endógena correspondiente de interés, si está presente. El análisis de la unión específica al NGF en las células huésped se efectúa por inmunoensayo o FACS. Puede identificarse una célula que sobreexpresa el anticuerpo o la proteína de interés. Métodos para usar anticuerpos E3 y derivados de E3 El anticuerpo E3 que se une al NGF puede usarse para identificar o detectar la presencia o la ausencia de NGF. Por motivos de simplicidad, se hará una referencia general a E3 o 73 anticuerpos, teniendo en cuenta que estos métodos se aplican a cualquiera de las realizaciones de unión a NGF (tales como los polipéptidos) descriptas en la presente documentación. La detección generalmente comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo descripto en la presente documentación que se une a NGF, y formar un complejo entre el NGF y un anticuerpo (por ejemplo, E3) que se une específicamente a NGF. La formación de este complejo puede realizarse in vitro o ¡n vivo. El término "detección", como se lo usa en la presente documentación, incluye la detección cualitativa y/o cuantitativa (medición de niveles), con o sin referencia a un control. Puede usarse cualquiera de una variedad de métodos conocidos para la detección, incluyendo, sin limitaciones, inmunoensayo, uso de anticuerpos que se unen al polipéptido, por ejemplo, con un ensayo inmunosorbente conectado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RÍA) y semejantes; y ensayos funcionales para el polipéptido codificado, por ejemplo, ensayos de actividad de unión o enzimáticos. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una marca detectable. Usos diagnósticos de E3 y sus derivados Los anticuerpos y los polipéptidos de la invención pueden usarse en la detección, la diagnosis y el monitoreo de una enfermedad, una condición o un trastorno asociado con la expresión alterada o aberrante del NGF (en algunas realizaciones, una expresión incrementada o disminuida del NGF (respecto de una muestra normal), y/o una expresión inapropiada, tal como la presencia de expresión en tejidos y/o células que normalmente no presentan expresión de NGF, o ausencia de expresión de NGF en tejidos o células que normalmente presentan expresión de NGF). Además, los anticuerpos y los polipéptídos de la invención son útiles para detectar la expresión de NGF, por ejemplo, en una enfermedad asociada con una sensibilidad o una capacidad de respuesta alterada o aberrante al NGF. En algunas realizaciones, se detecta la expresión del NGF en una muestra sospechada de sufrir una enfermedad, un trastorno caracterizado o asociado con una sensibilidad o una capacidad de respuesta alterada o aberrante a la expresión del NGF (por ejemplo, un cáncer en el que la NGF promueve el crecimiento y/o la metástasis). 74 Por consiguiente, en algunas realizaciones, en la invención se proveen métodos que comprenden poner en contacto un espécimen (muestra) de un individuo sospechado de presentar una expresión alterada o aberrante del NGF, con un anticuerpo o un polipéptido de la invención, y determinar si el nivel de NGF difiere del de un espécimen de control o comparación. En algunas realizaciones, el individuo tiene una arritmia cardiaca, enfermedad de Alzheimer y/o disfunción autónoma. En otras realizaciones, en la invención se proveen métodos que comprenden poner en contacto un espécimen (muestra) de un individuo y determinar el nivel de expresión del NGF. En algunas realizaciones, se sospecha que el individuo tiene una enfermedad, un trastorno caracterizado o asociado con una sensibilidad o una capacidad de respuesta alterada o aberrante a la expresión del NGF. En algunas realizaciones, el individuo tiene cáncer de células pulmonares pequeñas, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, carcinoma de ovario, carcinoma hepatocelular o melanoma. Para aplicaciones diagnósticas, típicamente se marcará el anticuerpo con una porción detectable, incluyendo, sin limitaciones, radioisótopos, marcas fluorescentes y diversas marcas enzima-sustrato. En la técnica se conocen métodos para conjugar marcas con un anticuerpo. En otras realizaciones de la invención, los anticuerpos de la invención no necesitan estar marcados, y puede detectarse su presencia usando un anticuerpo marcado que se une a los anticuerpos de la invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como los ensayos de unión competitiva, los ensayos sandwich directos e indirectos, y los ensayos de inmunoprecipítación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Los anticuerpos may también pueden usarse para ensayos diagnósticos in vivo, tales como la formación de imágenes ¡n vivo. En general, el anticuerpo se marca con un radionucleido (tal como 111 ln, 99Tc, 14C, 1311, 1251 o 3H) para poder localizar las células o el tejido de interés usando inmunocentellografía. 75 El anticuerpo también puede usarse como reactivo de coloración en procedimientos de seguimiento de patología bien conocidos en la técnica Métodos para usar E3 y sus derivados para propósitos terapéuticos El anticuerpo E3 es util para reducir y/o bloquear la actividad biológica del NGF Se cree que esta actividad de antagonismo es util en el tratamiento de las condiciones patológicas asociadas con la producción de NGF endógeno, tal como el dolor En general, en estas realizaciones se administra una cantidad efectiva a un individuo Por consiguiente, en un aspecto, en la invención se provee un método para antagonizar la actividad biológica del NGF humano usando cualquiera de los polipeptidos (incluyendo anticuerpos, tales como el anticuerpo E3) descpptos en la presente documentación En una realización, el método comprende poner en contacto el factor de crecimiento neuronal humano con cualquiera de los polipéptidos (incluyendo el anticuerpo E3) descpptos en la presente documentación, con lo que se antagoniza, reduce, bloquea o suprime la actividad del factor de crecimiento neuronal humano En aún otra realización, a un individuo con dolor (tal como dolor post-quirúrgico o dolor causado por la artritis reumática) se le realiza un tratamiento con E3 Por motivos de simplicidad, en general se hará referencia a E3 o a un anticuerpo, teniendo en cuenta que estos métodos se aplican a cualquiera de las vanantes de los anticuerpos y los polipeptidos E3 descpptos en la presente documentación Para la administración pueden usarse diversas formulaciones de E3 o fragmentos de E3 (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etcétera), tales como cadenas individuales (ScFv), mutantes de estas, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de E3 que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno para el NGF con la especificidad requerida En algunas realizaciones, pueden administrarse anticuerpos E3, o diversas formulaciones de E3 de esta clase, en forma pura En otras realizaciones, se administran E3, o diversas formulaciones de E3 (incluyendo cualquier realización de composición descppta en la presente documentación) de esta clase y un excipiente aceptable para el uso farmacéutico, y éstas pueden hallarse en diversas formulaciones Los excipientes aceptables para el uso farmacéutico con conocidos en la técnica, y se trata de sustancias relativamente inertes que 76 facilitan la administración de una sustancia efectiva desde el punto de vista farmacológico. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o puede actuar como díluyente. Los excipientes apropiados incluyen, sin limitaciones, agentes estabilizadores, humectantes y emulsificantes, sales para alterar la osmolaridad, agentes encapsulantes, amortiguadores y potenciadores de la penetración cutánea. Se describen excipientes y formulaciones para administración parenteral y no parenteral en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, Mack Publishing (2000). En algunas realizaciones, estos agentes se formulan para una administración por inyección (por ejemplo, por vía intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etcétera), aunque también pueden usarse otras formas de administración (por ejemplo, oral, a través de las mucosas, por inhalación, sublingual, etcétera). Por consiguiente, preferíblemente se combinan los anticuerpos E3, y sus equivalentes, con vehículos aceptables para el uso farmacéutico, tales como solución salina, solución de Rínger, solución de dextrosa y semejantes. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, el cronograma y la repetición, dependerá del individuo particular y de la historia médica del individuo. En general, podrá usarse cualquiera de las siguientes dosis: una dosis de al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 750 µg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 500 µg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 250 ug/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 100 µg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 50 µg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 10 ug/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 1 µg/kg de peso corporal, o menos. Para administraciones repetitivas durante varios días o más, dependiendo de la condición, se continuará el tratamiento hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un ejemplo de un régimen de dosificación comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 2 mg/kg, a lo que sigue una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 1 mg/kg de anticuerpo anti-NGF, o una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1 mg/kg semana por medio. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de 77 degradación farmacocinética que desee obtener el médico a cargo Las consideraciones empíricas, tales como la vida media, generalmente contribuirán en la determinación de la dosificación El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente con técnicas y ensayos convencionales En algunos individuos puede ser necesaria más de una dosis La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse durante el transcurso de la terapia Por ejemplo, la frecuencia de administración pude determinarse o ajustarse sobre la base del tipo y la severidad del dolor que se desea tratar, la administración del agente para propósitos preventivos o terapéuticos, terapias previas, la historia clínica del paciente y su respuesta al agente, y la discreción del medico a cargo Típicamente el médico administrará un anticuerpo antagonista anti-NGF (tal como E3) hasta alcanzar una dosificación que permita obtener el resultado deseado En algunos casos, pueden ser apropiadas formulaciones de liberación sostenida continua de los anticuerpos E3 En la técnica se conocen diversas formulaciones y dispositivos para obtener una liberación sostenida En una realización, es posible determinar las dosificaciones de los anticuerpos (o los polipeptidos) E3 en forma empírica en los individuos a los que se les ha proporcionado una o más administraciones A los individuos se les proporcionan dosificaciones crecientes de E3 Para evaluar la eficacia del E3 o de otro anticuerpo equivalente, pueden monitorearse marcadores de los síntomas de la enfermedad (tales como el dolor) La administración de un anticuerpo (tal como E3) o un polipéptido de acuerdo con el método de la presente invención puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la condición fisiológica del receptor, el propósito terapéutico o profiláctico de la administración, y otros factores conocidos por aquellos entrenados en la técnica La administración de un anticuerpo puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado, o puede realizarse en una sene de dosificaciones separadas, por ejemplo, antes, durante o después de desarrollarse el dolor, antes, durante, antes y después, durante y después, o antes, durante y después de desarrollar el dolor La administración puede ser antes, durante y/o después de una lesión, una incisión, un trauma, una cirugía y cualquier otro suceso que pueda dar lugar a dolor post-quirúrgico 78 Otras formulaciones incluyen formas de administración apropiadas conocidas en la técnica incluyendo, sin limitaciones, vehículos, tales como liposomas. Véase, por ejemplo, Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Las preparaciones de liposomas incluyen, sin limitaciones, citofectínas, vesículas multilamelaras y vesículas unílamelares. En algunas realizaciones, puede haber más de un anticuerpo o polipéptido presente. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Estas composiciones pueden contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco anticuerpos diferentes. Una mezcla de anticuerpos, como se las denota comúnmente en la técnica, puede ser particularmente útil para tratar un rango más amplio de poblaciones de individuos. También puede usarse un polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos o los polipéptidos de la invención (tales como un anticuerpo E3) para administrar y expresar cualquiera de los anticuerpos o los polipéptidos de la invención (tales como un anticuerpo E3) en una célula deseada. Es evidente que podrá usarse un vector de expresión para dirigir la expresión de un anticuerpo o un polipéptido E3. El vector de expresión puede administrarse por cualquier medio conocido en la técnica, tal como por vía intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal, dérmica, sublingual o por inhalación. Por ejemplo, la administración de los vectores de expresión incluye la administración local o sistémica, incluyendo la inyección, la administración oral, el cañón de partículas o la administración a través de un catéter, y la administración tópica. Aquél entrenado en la técnica estará familiarizado con la administración de vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 6436908, 6413942 y 6376471. También puede usarse la administración dirigida de composiciones terapéuticas que comprenden un polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos o los polipéptidos de la invención (tales como un anticuerpo E3). Se describen procedimientos de administración de ADN mediada por receptores, por ejemplo, en Findeís et al., Trends Bíotechnol. (1993) 11 :202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621 ; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Las 79 composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido se administran en un rango de entre aproximadamente 100 ng y aproximadamente 200 mg de ADN, para una administración local en un protocolo de terapia génica. También pueden usarse rangos de concentración de entre aproximadamente 500 ng y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 1 µg y aproximadamente 2 mg, entre aproximadamente 5 µg y aproximadamente 500 µg, y entre aproximadamente 20 µg y aproximadamente 100 µg de ADN durante un protocolo de terapia génica. Los polinucleótidos y los polipéptidos terapéuticos de la presente invención pueden administrarse usando vehículos para administrar genes. El vehículo para administrar genes puede ser de origen viral o no viral (véanse en general, Jolly, Cáncer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; y Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Es posible inducir la expresión de estas secuencias codificantes usando promotores endógenos de mamíferos o heterólogos. La expresión de la secuencia codificante puede ser constitutiva o regulada. Los vectores basados en virus para administrar y expresar un polinucleótido deseado en una célula deseada son bien conocidos. Los ejemplos de vehículos basados en virus ¡ncluyen, sin limitaciones, retrovirus recombs (véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT N° WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; las Patentes de los EEUU N° 5219740, 4777127; la Patente de Gran Bretaña N° 2200651 ; y la Patente EP N° 0 345 242), los vectores basados en alfavirus (por ejemplo, los vectores de virus Síndbís, el virus Semliki forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), el virus Ross Ríver (ATCC VR-373; ATCC VR- 1246) y el virus de la enceflaitis equina de Venezuela (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), y los vectores de virus adeno-asociados (AAV) (véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT N° WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191 ; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655). También puede realizarse la administración de ADN unido a adenovirus muertos, como se describe en Curíel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147. También pueden emplearse vehículos y métodos de administración no viral, incluyendo, sin limitaciones, ADN policatiónico condensado, unido o no unido a adenovirus muertos solo (véase, por ejemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); ADN unido a ligandos (véase, por ejemplo, 80 Wu, J Biol Chem (1989) 264 16985), vehículos celulares para la administración en células eucariotas (véanse, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 5814482, las Publicaciones PCT N° WO 95/07994, WO 96/17072, WO 95/30763, y WO 97/42338) y la neutralización de cargas nucleicas o la fusión con membranas celulares También puede emplearse ADN desnudo Se describen ejemplos de métodos para introducir ADN desnudo en la Publicación PCT N° WO 90/11092 y la Patente de los EEUU N° 5580859 Se descpben posomas que pueden actuar como vehículos para la administración de genes en la Patente de los EEUU N° 5422120, las Publicaciones PCT N° WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445, y la Patente EP N° 0 524 968 Se describen otros abordajes en Philip, Mol Cell Biol (1994) 14 2411 , y en Woffendin, Proc Nati Acad Sa (1994) 91 1581 Con referencia a todos los métodos descpptos en la presente documentación, las referencias a los anticuerpos antagonistas anti-NGF también incluyen composiciones que comprenden uno o más de estos agentes Además, estas composiciones pueden comprender excipientes apropiados, tales como excipientes aceptables para el uso farmacéutico, incluyendo amortiguadores bien conocidos en la técnica La presente invención puede usarse sola o en combinación con otros métodos de tratamiento convencionales MÉTODOS PARA USAR EL ANTICUERPO ANTAGONISTA ANTI-NGF PARA TRATAR O PREVENIR EL COLOR CAUSADO POR LA ARTRITIS REUMÁTICA En algunos aspectos, en la invención se proveen métodos para tratar y/o prevenir el dolor causado por la artritis reumática en individuos, incluyendo mamíferos humanos y no humanos Por consiguiente, en un aspecto, en la invención se proveen métodos para tratar el dolor causado por la artritis reumática en un individuo, que comprenden administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo antagonista anti-NGF Los anticuerpos antagonistas anti-NGF son conocidos en la técnica y se describen en la presente documentación En otro aspecto, en la invención se proveen métodos para reducir la incidencia, mejorar, suprimir, paliar y/o demorar el inicio, el desarrollo o la progresión del dolor causado por la artritis reumática en un individuo Por consiguiente, en algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista 81 anti-NGF se administra antes del desarrollo del dolor o de un episodio de dolor en un individuo con artritis reumática En otro aspecto en la invención se proveen métodos para tratar la caquexia inflamatoria (perdida de peso) asociada con la artritis reumática en un individuo, que comprenden administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo antagonista anti-NGF (Roubenoff et al , Arthntis Rheum 40(3) 534-9 (1997), Roubenoff et al , J Clin Invest 93(6) 2379-86 (1994)) La diagnosis o la evaluación del dolor causado por la artritis reumática esta bien establecida en la técnica Le evaluación puede realizarse sobre la base de medidas conocidas en la técnica, tales como la caracterización del dolor del paciente usando diversas escalas de dolor Véanse, por ejemplo, Katz et al, Surg Clin North Am (1999) 79 (2) 231-52, Caraceni et al J Pain Symptom Manage (2002) 23(3) 239-55 Estas son escalas de uso común para medir un estado de enfermedad, tales como las escalas del Colegio Americano de Reumatología (ACR) (Felson, et al , Arthptis and Rheumatism (1993) 36(6) 729-740), el Cuestionario de Evaluación de la Salud (HAQ) (Fríes, et al (1982) J Rheumatol 9 789-793), la Esclaa Paulus (Paulus, et al , Arthptis and Rheumatism (1990) 33 477-484) y la Escala de Medición del Impacto de la Artritis (AIMS) (Meena , et al , Arthptis and Rheumatology (1982) 25 1048-1053) Puede administrarse el anticuerpo antagonista anti-NGF a un individuo a través de cualquier ruta apropiada En la presente documentación se describen ejemplos de distintas rutas de administración Es posible caracterizar el alivio del dolor a partir del transcurso del alivio Por consiguiente, en algunas realizaciones, se observa un alivio del dolor aproximadamente 24 horas después de la administración del anticuerpo antagonista anti-NGF En otras realizaciones, se observa un alivio del dolor aproximadamente 36, 48, 60, 72 horas o 4 días después de la administración del anticuerpo antagonista anti-NGF En aun otras realizaciones, se observa un alivio del dolor antes de observar una indicación de mejora de la condición inflamatoria asociada con la artritis reumática En algunas realizaciones, se reduce la frecuencia y/o la intensidad del dolor, y/o se incrementa la calidad de vida de aquellos que sufren la enfermedad En las siguientes secciones ("antagonistas del NGF", "anticuerpo antagonista anti-NGF", "otros antagonistas del NGF", "identificación de antagonistas del NGF (tales como anticuerpos 82 antagonistas anti-NGF)"; "composiciones para usar en los métodos de la invención"; "administración de un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF)") se describe la preparación y el uso de antagonistas del NGF (incluyendo anticuerpos anti-NGF) para estos métodos. MÉTODOS PARA USAR UN ANTICUERPO ANTAGONISTA ANTI-NGF PARA TRATAR O PREVENIR EL DOLOR CAUSADO POR LA OSTEOARTRITIS En algunos aspectos, en la invención se proveen métodos para tratar y/o prevenir el dolor causado por la osteoartritis en individuos, incluyendo mamíferos humanos y no humanos. Por consiguiente, en un aspecto, en la invención se proveen métodos para tratar el dolor causado por la osteoartritis en un individuo, que comprenden administrar una cantidad efectiva de un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF). Los antagonistas del NGF, incluyendo los anticuerpos antagonistas anti-NGF, son conocidos en la técnica y se describen en la presente documentación. En otro aspecto, en la invención se proveen métodos para reducir la incidencia, mejorar, suprimir, paliar y/o demorar el inicio, el desarrollo o la progresión del dolor causado por la osteoartritis en un individuo, que comprenden administrar una cantidad efectiva de un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF). Por consiguiente, en algunas realizaciones, el antagonista del NGF (tal como el anticuerpo antagonista anti-NGF) se administra antes del desarrollo del dolor o de un episodio de dolor en un individuo con osteoartritis. La diagnosis o la evaluación del dolor causado por la osteoartritis está bien establecida en la técnica. Le evaluación puede realizarse sobre la base de medidas conocidas en la técnica, tales como la caracterización del dolor del paciente usando diversas escalas de dolor. Véanse, por ejemplo, Katz et al, Surg Clin North Am. (1999) 79 (2):231-52; Caraceni et al. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55. Por ejemplo, puede emplearse la Escala de Dolor Ambulatorio WOMAC (incluyendo dolor, rigidez y función física) y la Escala Visual de 100 mm (VAS) para determinar el dolor y evaluar la respuesta al tratamiento. 83 Pueden administrarse antagonistas del NGF (tales como un anticuerpo antagonista anti-NGF) a un individuo a través de cualquier ruta apropiada. En la presente documentación se describen ejemplos de distintas rutas de administración. En algunas realizaciones, el antagonista del NGF (tal como el anticuerpo antagonista anti-NGF) se administra una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada nueve semanas, una vez cada diez semanas, una vez cada quince semanas, una vez cada veinte semanas, una vez cada veinticinco semanas, o una vez cada veintiséis semanas. En algunas realizaciones, el antagonista del NGF (tal como el anticuerpo antagonista anti-NGF) se administra una vez por mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, o una vez cada seis meses. Es posible caracterizar el alivio del dolor a partir del transcurso del alivio. Por consiguiente, en algunas realizaciones, se observa un alivio del dolor aproximadamente 24 horas después de la administración de un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo antagonista antí-NGF). En otras realizaciones, se observa un alivio del dolor aproximadamente 36, 48, 60, 72 horas o 4 días después de la administración del antagonista del NGF (tal como el anticuerpo antagonista anti- NGF). En algunas realizaciones, se reduce la frecuencia y/o la intensidad del dolor, y/o se incrementa la calidad de vida de aquellos que sufren la enfermedad. En algunas realizaciones, se proporciona alivio para el dolor causado por la osteoartritis por una duración de al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 14 días, al menos aproximadamente 21 días, al menos aproximadamente 28 días, al menos aproximadamente 35 días, al menos aproximadamente 42 días, al menos aproximadamente 49 días, al menos aproximadamente 56 días, al menos aproximadamente 63 días, al menos aproximadamente 70 días, al menos aproximadamente 77 días, al menos aproximadamente 84 días, al menos aproximadamente 180 días o más, después de administrar una única dosis del antagonista del NGF (tal como el anticuerpo antagonista anti-NGF). 84 En las siguientes secciones ("antagonistas del NGF", "anticuerpo antagonista anti-NGF"; "otros antagonistas del NGF"; "identificación de antagonistas del NGF (tales como anticuerpos antagonistas anti-NGF)"; "composiciones para usar en los métodos de la invención"; "administración de un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF)") se describe la preparación y el uso de antagonistas del NGF (incluyendo anticuerpos anti-NGF) para estos métodos. Antagonistas del NGF En los métodos de la invención (relacionados con el dolor causado por la artritis reumática y el dolor causado por la osteoartritis) se usa un antagonista del NGF, con lo que se hace referencia a cualquier molécula que bloquea, suprime o reduce (incluyendo una reducción significativa) la actividad biológica del NGF, incluyendo las vías rio abajo mediadas por la señalización del NGF, tales como la unión a receptores y/o la generación de una respuesta celular al NGF. El término "antagonista" no implica un mecanismo específico de acción biológica en particular, y se considera que incluye expresamente y abarca todas las interacciones farmacológicas, fisiológicas y bioquímicas posibles con el NGF, y las consecuencias que pueden alcanzarse con una variedad de composiciones diferentes y divergentes desde el punto de vista químico. Los ejemplos de antagonistas del NGF incluyen, sin limitaciones, un anticuerpo anti-NGF, una molécula antisentido dirigida contra el NGF (incluyendo una molécula antisentido dirigida contra un ácido nucleico que codifica NGF), una molécula antisentido dirigida contra un receptor del NGF (tal como el receptor TrkA y/o el receptor p75) (incluyendo una molécula antisentido dirigida contra un ácido nucleico que codifica TrkA y/o p75), un compuesto inhibidor del NGF, un análogo estructural del NGF, una mutación dominante negativa de un receptor de TrkA que se une al NGF, una inmunoadhesina TrkA, un anticuerpo anti-TrkA, una mutación dominante negativa de un receptor p75 que se une al NGF, un anticuerpo anti-p75 anticuerpo, y un inhibidor de quinasa. Para el propósito de la presente invención, se comprenderá explícitamente que el término "antagonista" abarca todos los términos, títulos y estados funcionales identificados previamente, y las características por las cuales el se anula, disminuye o neutraliza sustancialmente el NGF en sí, una función biológica del NGF (incluyendo, sin limitaciones, su capacidad de mediar cualquier 85 aspecto de dolor), o las consecuencias de la actividad biológica, en cualquier grado significativo. En algunas realizaciones, un antagonista del NGF (por ejemplo, un anticuerpo) se une (interactúa físicamente) al NGF, se une a un receptor del NGF (tal como el receptor TrkA y/o el receptor p75), y/o reduce (impide y/o bloquea) la señalización rio abajo del receptor del NGF. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un antagonista del NGF se une (interactúa físicamente) al NGF. En algunas realizaciones, el antagonista del NGF es un polipéptido que se une al NGF. En algunas realizaciones, el antagonista del NGF es un péptido o un péptido modificado (tal como un péptido que se une al NGF fusionado a un dominio Fc) descripto en PCT WO 2004/026329. En otra realización, un antagonista del NGF se une a un receptor del NGF (tal como el receptor TrkA o p75). En otras realizaciones, un antagonista del NGF reduce (impide y/o bloquea) la señalización río abajo del receptor del NGF (por ejemplo, inhibidores de la señalización de quinasa). En otras realizaciones, un antagonista del NGF inhibe (reduce) la síntesis y/o la liberación del NGF. En otra realización, el antagonista del NGF es un antagonista del NGF que no es una inmunoadhesina TrkA (es decir, es distinto de una inmunoadhesina TrkA). En otra realización, el antagonista del NGF es distinto de un anticuerpo anti-NGF. En otra realización, el antagonista del NGF es distinto de una inmunoadhesína y distinto de un anticuerpo anti-NGF. En algunas realizaciones, el antagonista del NGF se une al NGF (tal como el hNGF) y no se une significativamente a neurotrofinas relacionadas, tales como NT-3, NT4/5 y/o BDNF. En algunas realizaciones, el antagonista del NGF no está asociado con una respuesta inmune adversa. En otras realizaciones, el antagonista del NGF es un anticuerpo anti-NGF. En aún otras realizaciones, el anticuerpo anti- NGF está humanizado (tal como un anticuerpo E3 descripto en la presente documentación). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-NGF es un anticuerpo E3 (como se describe en la presente documentación). En otras realizaciones, el anticuerpo anti-NGF comprende una o más CDR de un anticuerpo E3 (tal como una, dos, tres, cuatro, cinco, o, en algunas realizaciones, las seis CDR de E3). En otras realizaciones, el anticuerpo es humano. En aún otras realizaciones, el anticuerpo anti-NGF comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada indicada en la Figura 1A (SEQ ID N° 1) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana indicada en la Figura 1 B (SEQ ID N° 2). En aún otras realizaciones, el 86 anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inerte desde el punto de vista inmunología), por ejemplo, que no desencadena la lisis mediada por complemento o no estimula la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) En otras realizaciones, la región constante está modificada como se describe in Eur J Immunol (1999) 29 2613-2624, la Solicitud PCT N° PCT/GB99/01441 , y/o la Solicitud de Patente del Reino Unido N° 9809951 8 Anticuerpo antagonista anti-NGF En los métodos de la invención (relacionados con el dolor causado por la artritis reumática y el dolor causado por la osteoartptis) se usa un anticuerpo antagonista anti-NGF, con lo que se hace referencia a cualquier molécula de anticuerpo que bloquea, suprime o reduce (incluyendo una reducción significativa) la actividad biológica del NGF, incluyendo las vías río abajo mediadas por la señalización del NGF, tales como la unión a receptores y/o la generación de una respuesta celular al NGF Un anticuerpo antagonista anti-NGF debería presentar una o más de cualquiera de las siguientes características (a) unión al NGF e inhibición de la actividad biológica del NGF o las vías rio abajo mediadas por la función de señalización del NGF, (b) prevención, mejora o tratamiento de cualquier aspecto del dolor causado por la artritis reumática o el dolor causado por la osteoartptis, (c) bloqueo o reducción de la activación del receptor del NGF (incluyendo la dimepzación y/o la autofosfonlacion del receptor TrkA), (d) incremento de la eliminación de NGF, (e) inhibición (reducción) de la síntesis, la producción o la liberación de NGF Los anticuerpos antagonistas anti- NGF son conocidos en la técnica, véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT N° WO 01/78698, WO 01/64247, las Patentes de los EEUU N° 5844092, 5877016 y 6153189, Hongo et al , Hybpdoma, 19 215-227 (2000), Cell Molec Biol 13 559-568 (1993), los N° de Acceso GenBank U39608 U39609, L17078 o L17077 También se describen anticuerpos y po péptidos antagonistas anti-NGF en PCT WO 2005/019266 Para los propósitos de esta invención, el anticuerpo reacciona con el NGF de un modo que inhibe el NGF y/o las vías río abajo mediadas por la función de señalización del NGF En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-NGF reconoce el NGF humano En aún otras 87 realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-NGF se une específicamente al NGF humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-NGF no se une significativamente a neurotrofinas relacionadas, tales como NT-3, NT4/5 y/o BDNF. En aún otras realizaciones, el anticuerpo anti-NGF puede unirse al NGF e inhibir eficientemente la unión del NGF a su receptor TrkA y/o p75 in vivo, y/o puede inhibir efectivamente la activación del receptor TrkA y/o p75 por parte del NGF. En aún otras realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo monoclonal. En aún otras realizaciones, el anticuerpo anti-NGF está humanizado (tal como un anticuerpo E3 descripto en la presente documentación). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-NGF es humano. Véase, por ejemplo, WO 2005/019266. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano que reconoce uno o más epitopes en el NGF humano. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de ratón o rata que reconoce uno o más epitopes en el NGF humano. En otra realización, el anticuerpo reconoce uno o más epitopes en un NGF seleccionado del grupo que consiste en NGF de primates, canino, felino, equino y bovino. En aún otras realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-NGF se une esencialmente al mismo epitope 6 del NGF que un anticuerpo seleccionado entre uno o más de cualquiera de los siguientes: MAb 911 , MAb 912 y MAb 938 (véase Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). En otras realizaciones, el anticuerpo se une al mismo epítope que Mab 911. En otra realización, el anticuerpo comprende una región constante que es inerte desde el punto de vista inmunológico (por ejemplo, que no desencadena la lisis mediada por complemento o no estimula la citotoxícidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC)). Es posible evaluar la actividad de ADCC usando los métodos descriptos en la Patente de los EEUU N° 5500362. En otras realizaciones, la región constante está modificada como se describe in Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; la Solicitud PCT N° PCT/GB99/01441 ; y/o la Solicitud de Patente del Reino Unido N° 9809951.8. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo monoclonal anti-NGF de ratón denominado anticuerpo "E3", cualquiera de los anticuerpos relacionados con E3 descriptos en la presente documentación, o cualquier fragmento de éstos, que son antagonistas del NGF. 88 Los anticuerpos útiles en la presente invención pueden incluir anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etcétera), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados, cadenas individuales (ScFv), mutantes de éstas, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos humanizados y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno con la especificidad requerida, incluyendo variantes de glicosilación de los anticuerpos, variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y anticuerpos modificados en forma covalente. Los anticuerpos pueden ser murinos, de rata, humanos o de cualquier otro origen (incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados). La afinidad de unión de un anticuerpo antagonista anti-NGF por el NGF (tal como el hNGF) puede ser de entre aproximadamente 0,10 y aproximadamente 0,80 nM, entre aproximadamente 0,15 y aproximadamente 0,75 nM, y entre aproximadamente 0,18 y aproximadamente 0,72 nM. En una realización, la afinidad de unión es de entre aproximadamente 2 pM y 22 pM. En una realización, la afinidad de unión es de entre aproximadamente 23 pM y aproximadamente 100 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es de aproximadamente 10 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es menor que aproximadamente 10 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es de aproximadamente 0,1 nM o aproximadamente 0,07 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es menor que aproximadamente 0,1 nM o menor que aproximadamente 0,07 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión toma un valor seleccionado entre aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM, y aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM o aproximadamente 40 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión toma un valor seleccionado entre aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM, o menor que aproximadamente 50 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es menor que cualquier valor seleccionado entre 89 aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM. En aún otras realizaciones, la afinidad de unión es aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 40 pM, o mayor que aproximadamente 40 pM. Una forma de determinar la afinidad de unión de los anticuerpos por el NGF comprende medir la afinidad de unión de fragmentos monofuncíonales Fab del anticuerpo. Para obtener fragmentos monofuncionales Fab, puede cortarse un anticuerpo (por ejemplo, IgG) con papaína, o puede expresárselo en forma recombinante. Puede determinarse la afinidad de un fragmento anti-NGF Fab de un anticuerpo por resonancia de plasmón superficial (sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore3000™ (SPR), BIAcore, INC, Piscataway NJ), como se describe en los Ejemplos. Pueden activarse chips CM5 con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodimída (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Puede diluirse el NGF humano (o cualquier otro NGF) en acetato de sodio 10 mM, pH 4,0, puede inyectárselo en el chip activado a una concentración de 0,005 mg/ml. Usando un flujo de tiempo variable a través de los canales de cada chip individual, pueden obtenerse dos rangos de densidad de antígeno: 100-200 unidades de respuesta (RU) para los estudios cinéticos detallados y 500-600 RU para los ensayos de análisis. Es posible bloquear el chip con etanolamina. Los estudios de regeneración han demostrado que una mezcla de amortiguador de elución Pierce (Producto N° 21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) y NaCI 4 M (2:1) desprende efectivamente el Fab unido, al tiempo que se mantiene la actividad del hNGF sobre el chip por más de 200 inyecciones. Se usa amortiguador HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCI 0,15, EDTA 3 mM, 0,005% de agente tensioactivo P29) como amortiguador de ejecución para los ensayos BIAcore. Se inyectan diluciones en serie (0,1 -10x respecto de la K0 estimada) de muestras de Fab purificadas por 1 minuto, a razón de 100 µl/min, y se permiten tiempos de disociación de hasta 2 horas. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan por ELISA y/o electroforesis en SDS-PAGE, usando un Fab a una concentración conocida (determinada con un análisis de aminoácidos) como referencia. Se obtienen las velocidades de asociación (kon) y disociación (koff) cinética ajustando 90 los datos a un modelo de unión Langmuir 1 :1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) con el programa BIAevaluation. Los valores de la constante de disociación en equilibrio (KD) se calculan como kotf/kon. Este protocolo es apropiado para usar en la determinación de la afinidad de unión de un anticuerpo con cualquier NGF, incluyendo NGF humano, NGF de otro vertebrado (en algunas realizaciones, de mamífero) (tal como NGF de ratón, NGF de rata, NGF de primate), y también para usar con otras neurotrofinas, tales como las neurotrofinas relacionadas, NT3, NT4/5 y/o BDNF. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al NGF humano, y no se une significativamente al NGF de otras especies de vertebrados (en algunas realizaciones, de mamíferos). En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al NGF humano y a uno o más NGF de otras especies de vertebrados (en algunas realizaciones, de mamíferos). En aún otras realizaciones, el anticuerpo se une al NGF y no reacciona significativamente con otras neurotrofinas (tales como las neurotrofinas relacionadas, NT3, NT4/5 y/o BDNF). En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al NGF y al menos a otra neurotrofina. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al NGF de una especie de mamífero, tal como de caballo o perro, pero no se une significativamente al NGF de otra especie de mamífero. El o los epitopes pueden ser continuos o discontinuos. En una realización, el anticuerpo se une esencialmente a los mismos epitopes del hNGF que un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en MAb 911 , MAb 912 y MAb 938, como se describe in Hongo et al., Hybridoma, 19:215- 227 (2000). En otra realización, el anticuerpo se une esencialmente al mismo epítope del hNGF que MAb 911. En aún otra realización, el anticuerpo se une esencialmente al mismo epítope que MAb 909. Hongo et al., supra. Por ejemplo, el epitope puede comprender uno o más de los siguientes componentes: los residuos K32, K34 y E35 en la región variable 1 (aminoácidos 23-35) del hNGF; los residuos F79 y T81 en la región variable 4 (aminoácidos 81-88) del hNGF; los residuos H84 y K88 en la región variable 4; el residuo R103 entre la región variable 5 (aminoácidos 94-98) del hNGF y el extremo C (aminoácidos 111-118) del hNGF; el residuo E11 en la región pre- variable 1 (aminoácidos 10-23) del hNGF; Y52 entre la región variable 2 (aminoácidos 40-49) del hNGF y la región variable 3 (aminoácidos 59-66) del hNGF; los residuos L112 y S113 en el 91 extremo C del hNGF; los residuos R59 y R69 en la región variable 3 del hNGF; o los residuos V18, V20 y G23 en la región pre-variable 1 del hNGF. Además, un epitope puede comprender una o más regiones seleccionadas entre la región variable 1 , la región variable 3, la región variable 4, la región variable 5, la región del extremo N, y/o el extremo C del hNGF. En aún otra realización, el anticuerpo reduce significativamente el acceso al solvente del residuo R103 del hNGF. Se comprenderá que, aunque los epitopes descriptos previamente se relacionan con el NGF humano, aquél entrenado en la técnica podrá alinear las estructuras del NGF humano con el NGF de otra especie e identificar contrapartes probables para estos epitopes. En un aspecto, pueden prepararse anticuerpos (por ejemplo, humanos, humanizados, de ratón, quiméricos) que pueden inhibir el NGF usando inmunógenos que expresan la secuencia completa o parcial del NGF. En otro aspecto, puede usarse un inmunógeno que comprende una célula que sobreexpresa el NGF. Otro ejemplo de un ¡nmunógeno que puede usarse es la proteína NGF que contiene el NGF completo, o una porción de la proteína NGF. Los anticuerpos antagonistas anti-NGF pueden prepararse con cualquier método conocido en la técnica. La ruta y el cronograma de inmunización del animal huésped generalmente se realizan de acuerdo con los procedimientos establecidos y convencionales de estimulación y producción de anticuerpos, como se describe con mayor detalle en la presente documentación. Los procedimientos generales para producir anticuerpos de seres humanos y ratones son conocidos en la técnica y se describen en la presente documentación. Se contempla la posibilidad de manipular cualquier sujeto mamífero, incluyendo seres humanos, o cualquier célula productora de anticuerpos de dicho sujeto, para utilizarlo como base para la producción de líneas celulares de hibridomas de mamíferos, incluyendo seres humanos. Típicamente, el animal huésped es inoculado por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica con una cantidad de inmunógeno, incluyendo como se describe en la presente documentación. Pueden prepararse hibridomas a partir de los linfocitos y las células de mieloma inmortalizadas, usando el procedimiento de hibridización general de células somáticas de Kohier, B. y Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497, o de acuerdo con la modificación de Buck, D. W., et 92 al., In Vitro, 18:377-381 (1982). En la hibridización pueden usarse líneas de mielomas disponibles, incluyendo, sin limitaciones, X63-Ag8.653 y aquellas del Instituto Salk, Centro de Distribución de Células, San Diego, California, EEUU. En general, el procedimiento comprende fusionar células de mieloma y células linfoides usando un fusógeno, tal como polietilenglicol, o por medios eléctricos bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de cultivo selectivo, tal como medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar las células progenitoras que no han hibridízado. Puede usarse cualquiera de los medios descriptos en la presente documentación, suplementados con o sin suero, para cultivar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa al procedimiento de fusión celular, pueden usarse células B inmortalizadas con EBV para producir los anticuerpos monoclonales anti-NGF de la presente invención. Si se lo desea, se expanden y subclonan los hibridomas, y se analiza la actividad anti-inmunógeno en los sobrenadantes con procedimientos de inmunoensayo convencionales (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo con enzimas o inmunoensayo de fluorescencia). Los hibridomas que pueden usarse como fuentes de anticuerpos incluyen todos los derivados, las células de la progenie de los hibridomas progenitores que producen anticuerpos monoclonales específicos para el NGF, o una porción de éstos. Los hibridomas que producen estos anticuerpos pueden cultivarse in vitro o in vivo usando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse del medio de cultivo o los fluidos corporales, con procedimientos convencionales de purificación con inmunoglobulinas, tales como precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se lo desea. De haber una actividad indeseable presente, puede eliminársela, por ejemplo, tratando la preparación con adsorbentes preparados con el inmunógeno unido a una fase sólida, y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. La inmunización de un animal huésped con un NGF humano, o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos deseada, conjugada con una proteína que es inmunogénica en la especie que se desea inmunizar, por ejemplo, hemocianina de cangrejo cacerola, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de 93 maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina), glutaradehído, anhídrido succínico, SOCI2, o R1 N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes, puede resultar en una población de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales). Si se lo desea, puede secuenciarse el anticuerpo antagonista anti-NGF (monoclonal o policlonal) de interés, y luego puede clonarse la secuencia polinucleotídica en un vector para expresarla y propagarla. Es posible mantener la secuencia que codifica el anticuerpo de interés en un vector en una célula huésped, y luego puede expandirse y congelarse la célula huésped para usarla en el futuro. En una alternativa, es posible usar la secuencia polinucleotídica para realizar una manipulación genética para "humanizar" el anticuerpo o mejorar la afinidad u otras características del anticuerpo. Por ejemplo, puede modificarse la región constante para que resulte más semejante a las regiones constantes humanas, con el fin de evitar una respuesta inmune si se usa el anticuerpo en pruebas clínicas y tratamientos en seres humanos. Puede ser deseable manipular genéticamente la secuencia del anticuerpo para obtener una mayor afinidad por el NGF y una mayor eficiencia en la inhibición del NGF. Será evidente para aquellos entrenados en la técnica que pueden realizarse uno o más cambios de polinucleótidos en el anticuerpo antagonista anti-NGF, y aún puede mantenerse su capacidad de unión al NGF. Hay cuatro pasos generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Éstos son: (1 ) la determinación de la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos predicha de los dominios variables liviano y pesado del anticuerpo original; (2) el diseño del anticuerpo humanizado, es decir, la decisión de cuál región de marco de trabajo del anticuerpo se usará durante el proceso de humanización; (3) las metodologías/técnicas usadas en la humanización; y (4) la transfección y la expresión del anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 4816567, 5807715, 5866692, 6331415, 5530101 , 5693761 , 5693762, 5585089 y 6180370. Se ha descripto una cantidad de moléculas de anticuerpos "humanizados" que comprenden un sitio que se une al antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedores o modificadas, y sus regiones de 94 determinación de la complementariedad (CDR) asociadas fusionadas a dominios constantes humanos. Véanse, por ejemplo, Winter et al. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987), y Brown et al. Cáncer Res. 47:3577-3583 (1987). En otras referencias se describen CDR de roedores injertadas en una región de marco de trabajo de soporte humana (FR), antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado. Véanse, por ejemplo, Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988), y Jones et al. Nature 321 :522-525 (1986). En otra referencia se describen CDR de roedores soportadas por regiones de marco de trabajo de roedores modificadas en forma recombinante. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Europea N° 0519596. Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para minimizar la respuesta inmune indeseada ante moléculas de anticuerpos de roedores antihumanos, que limita la duración y la efectividad de las aplicaciones terapéuticas de estas porciones en receptores humanos. Por ejemplo, puede modificarse la región constante del anticuerpo de modo que sea inerte desde el punto de vista inmunológico (por ejemplo, para que no desencadene la lisis del complemento). Véanse, por ejemplo, la Publicación PCT N° PCT/GB99/01441 ; la Solicitud de Patente del Reino Unido N° 9809951.8. Se describen otros métodos para humanizar anticuerpos que pueden utilizarse en Daugherty et al., Nucí. Acids Res. 19:2471-2476 (1991), las Patentes de los EEUU N° 6180377, 6054297, 5997867, 5866692, 6210671 y 6350861; y la Publicación PCT N° WO 01/27160. En aún otra alternativa, pueden obtenerse anticuerpos completamente humanos usando ratones disponibles comercialmente que hayan sido modificados para expresar proteínas de inmunoglobulina específicas para seres humanos. También pueden usarse animales transgénicos que estén diseñados para producir una respuesta inmune más deseable (por ejemplo, anticuerpos completamente humanos) o más robusta para generar anticuerpos humanizados o humanos. Los ejemplos de esta tecnología son Xenomouse™, de Abgenix, Inc. (Fremont, CA), y HuMAb-Mouse® y TC Mouse™, de Medarex, Inc. (Princeton, NJ). En una alternativa, pueden prepararse anticuerpos en forma recombinante, y puede expresárselos usando cualquier método conocido en la técnica. En otra alternativa, pueden 95 prepararse anticuerpos en forma recombinante con tecnología de presentación de fagos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 5565332, 5580717, 5733743 y 6,265150; y Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Como alternativa, puede usarse la tecnología de presentación de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominios variables (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con este procedimiento, se clonan los genes de los dominios V de los anticuerpos en el sentido del marco de lectura con cualquier gen de una proteína de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se los presenta como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Como la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena simple del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta estas propiedades. Por consiguiente, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. Es posible realizar la presentación de fagos en una variedad de formatos; para hallar una revisión, véanse, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de segmentos de genes V para presentar fagos. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) aislaron un conjunto diverso de anticuerpos anti- oxazolona de una pequeña biblioteca de combinación al azar de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes B de donantes humanos no inmunizados, y pueden aislarse los anticuerpos contra un conjunto de antígenos diversos (incluyendo auto-antígenos) esencialmente de acuerdo con los procedimientos descriptos en Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991 ), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). En una respuesta inmune natural, los genes de los anticuerpos acumulan mutaciones con una velocidad elevada (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán una afinidad elevada, y preferiblemente las células B que presenten una ¡nmunoglobulina superficial con gran afinidad se replicarán y diferenciarán durante el ataque subsiguiente con antígenos. Este proceso natural puede imitarse empleando la técnica conocida como "barajado de cadenas". Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). En este método, puede mejorarse la afinidad de los anticuerpos 96 humanos "primarios" obtenidos con la presentación de fagos reemplazando en forma consecutiva los genes de las regiones V de las cadenas pesada y liviana por repertorios de variantes de ocurrencia natural (repertorios) de genes de dominios V obtenidos a partir de donantes no inmunizados. Esta técnica permite producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el rango pM-nM. Waterhouse et al., Nucí. Acids Res. 21 :2265-2266 (1993), han descripto una estrategia para preparar repertorios de anticuerpos de fagos muy grandes (también conocidos como "la madre de todas las bibliotecas"). También puede emplearse el barajado de genes para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedores, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares a las del anticuerpo de roedor inicial. De acuerdo con este método, que también se conoce como "fijación de epitopes", se reemplaza el gen del dominio V de las cadenas pesada o liviana de anticuerpos de roedores obtenidos con técnicas de presentación de fagos por un repertorio de genes de dominios V humanos, con lo que se crean quimeras de roedores-humanos. La selección del antígeno resulta en el aislamiento de regiones variables humanas capaces de restaurar un sitio de unión a antígeno funcional, es decir, el epitope gobierna (fija) el asociado seleccionado. Cuando se repite el proceso para reemplazar el domino V de roedor remanente, se obtiene un anticuerpo humano (véase la Publicación PCT N° WO 93/06213, publicada el 1o de Abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos de roedores mediante el injerto de CDR, esta técnica provee anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos del marco de trabajo o CDR originadas en el roedor. Es evidente que, aunque la descripción anterior se relaciona con anticuerpos humanizados, los principios generales descriptos pueden aplicarse para modificar anticuerpos para usar, por ejemplo, en perros, gatos, primates, equinos y bovinos. Además, es evidente que pueden combinarse uno o más aspectos de la humanización de un anticuerpo descripto en la presente documentación, por ejemplo, con injertos de CDR, mutaciones de marcos de trabajo y mutaciones de CDR. Es posible producir los anticuerpos en forma recombinante, aislando primero los anticuerpos y las células productoras de anticuerpos a partir de los animales huésped, obteniendo 97 la secuencia del gen, y usando la secuencia del gen para expresar el anticuerpo de forma recombinante en las células huésped (por ejemplo, células CHO). Otro método que puede emplearse comprende expresar la secuencia del anticuerpo en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han descripto métodos para expresar anticuerpos en forma recombínante en plantas o leche. Véanse, por ejemplo, Peeters, et al. Vaccine 19:2756 (2001 ); Lonberg, N. y D. Huszar Int.Rev.lmmunol 13:65 (1995); y Pollock, et al., J Immunol Métodos 231 :147(1999). En la técnica se conocen métodos para preparar derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, cadenas individuales, etcétera. También pueden emplearse inmunoensayos y procedimientos de clasificación por citometría de flujo, tales como la clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS), para aislar anticuerpos específicos para el NGF. Los anticuerpos pueden unirse a diversos vehículos diferentes. Los vehículos pueden ser activos y/o inertes. Los ejemplos vehículos bien conocidos incluyen polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, vidrio, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. Para los propósitos de la invención, la naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble. Aquellos entrenados en la técnica conocerán otros vehículos apropiados para unir anticuerpos, o podrán determinar cuáles utilizar realizando experimentos de rutina. En algunas realizaciones, el vehículo comprende una porción dirigida hacia el miocardio. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando oligonucleótídos sonda que pueden unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridomas sirven como fuente preferida para este ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión (tales como los vectores de expresión descriptos en la Publicación PCT N° WO 87/04462), que se transfectan en células huésped, tales células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteínas de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT N° WO 87/04462. También es posible modificar el ADN, por ejemplo, sustituyendo 98 la secuencia codificante de los dominios constantes de la cadena pesada y liviana humana por las secuencias murinas homologas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81 :6851 (1984), o uniendo en forma covalente la totalidad o una parte de la secuencia codificante de un polipéptido distinto de la inmunoglobulina con la secuencia codificante de la inmunoglobulina. De este modo, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-NGF de la presente documentación. Los anticuerpos antagonistas anti-NGF pueden caracterizarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método comprende identificar el epitope con el que se unen, o "mapeo de epitopes". Existen diversos métodos conocidos en la técnica para mapear y caracterizar la localización de los epitopes en las proteínas, incluyendo la obtención de la estructura cristalina de un complejo de anticuerpo-antígeno, los ensayos de competición, los ensayos de expresión de fragmentos de genes y los ensayos basados en péptidos sintéticos, como se describe, por ejemplo, en el capítulo 11 de Harlow y Lañe, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1999. En un ejemplo adicional, puede utilizarse el mapeo de epitopes para determinar la secuencia con la que se une un anticuerpo antagonista anti-NGF. El mapeo de epitopes está disponible comercialmente en diversas fuentes, por ejemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Países Bajos). El epitope puede ser un epitope lineal, es decir, puede estar contenido en un único segmento de aminoácidos, o un epitope de conformación formado por una interacción tridimensional de aminoácidos, que no necesitan estar contenidos en un único segmento. Pueden aislarse o sintetizarse péptidos de longitudes variables (por ejemplo, de al menos 4-6 aminoácidos de largo) (por ejemplo, en forma recombinante), y puede usárselos en ensayos de unión con un anticuerpo antagonista anti-NGF. En otro ejemplo, es posible determinar el epitope con el que se une el anticuerpo antagonista anti-NGF en un análisis sistemático, usando péptidos superpuestos derivados de la secuencia del NGF; y determinando la unión con el anticuerpo antagonista anti- NGF. De acuerdo con los ensayos de expresión de fragmentos de genes, el marco abierto de lectura que codifica el NGF se fragmenta al azar o con construcciones genéticas específicas, y se determina la reactividad de los fragmentos de NGF expresados con el anticuerpo que se desea 99 evaluar. Es posible producir fragmentos de genes, por ejemplo, por PCR, y luego puede transcribírselos y traducírselos en proteínas in vitro, en presencia de aminoácidos radiactivos.

Luego se determina la unión del anficuerpo con los fragmentos de NGF marcados con radiactividad por inmunoprecipitación y electroforesis en gel. También pueden determinarse algunos epitopes usando grandes bibliotecas de secuencias de péptidos al azar presentadas en la superficie de partículas de fagos (bibliotecas de fagos). Como alternativa, puede evaluarse la unión al anticuerpo de prueba en una biblioteca definida de fragmentos de péptidos superpuestos en ensayos de unión sencillos. En un ejemplo adicional, puede realizarse la mutagénesis de un dominio de unión a antígeno, experimentos de intercambio de dominios y mutagénesís de análisis de alanina para identificar los residuos requeridos, suficientes y/o necesarios para la unión de los epitopes. Por ejemplo, pueden efectuarse experimentos de intercambio de dominios usando un NGF mutante en el que se hayan reemplazado (cambiado) diversos fragmentos del polipéptido del NGF por secuencias de una proteína relacionada estrechamente, pero diferente desde el punto de vista antigénico (tal como otro miembro de la familia de proteínas de la neurotrofina). Al evaluar la unión del anticuerpo al NGF mutante, puede determinarse la importancia del fragmento de NGF particular para la unión al anticuerpo. Aún otro método que puede usarse para caracterizar un anticuerpo antagonista anti-NGF comprende el uso de ensayos de competición con otros anticuerpos conocidos que se unen al mismo antígeno, es decir, diversos fragmentos en NGF, para determinar si el anticuerpo antagonista anti-NGF se une al mismo epitope que otros anticuerpos. Los ensayos de competición son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Los ejemplos de anticuerpos que pueden usarse en los ensayos de competición de la presente invención incluyen MAb 911 , 912, 938, como se describe en Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000). Puede usarse un vector de expresión para dirigir la expresión de un anticuerpo antagonista anti-NGF. Aquél entrenado en la técnica sabrá sobre la administración de vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 6436908, 6413942 y 6376471. La administración de vectores de expresión incluye la administración local o sistémica, incluyendo la inyección, la administración oral, el cañón de 100 partículas o la administración cateterizada, y la administración tópica. En otra realización, el vector de expresión se administra directamente en el tronco simpático o el ganglio, o en una arteria coronaria, el atrio, el ventrículo o el pericardio. También puede emplearse la administración dirigida de composiciones terapéuticas que contienen un vector de expresión o polinucleótidos subgenómícos. Se describen procedimientos de administración de ADN mediada por receptores, por ejemplo, en Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11 :202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, editor) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621 ; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991 ) 266:338. Para la administración local en un protocolo de terapia géníca, las composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido se administran en un rango de entre aproximadamente 100 ng y aproximadamente 200 mg de ADN. También pueden usarse rangos de concentración de entre aproximadamente 500 ng y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 1 µg y aproximadamente 2 mg, entre aproximadamente 5 µg y aproximadamente 500 µg, y entre aproximadamente 20 µg y aproximadamente 100 µg de ADN durante un protocolo de terapia génica. Los polinucleótidos y los polipéptidos terapéuticos pueden administrarse vehículos para la administración de genes. El vehículo para la administración de genes puede ser de origen viral o no viral (véase en general, Jolly, Cáncer Gene Therapy (1994) 1:51 ; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1 :185; y Kaplitt, Nature Genefics (1994) 6:148). Es posible inducir la expresión de estas secuencias codificantes usando promotores heterólogos o endógenos de mamíferos. La expresión de la secuencia codificante puede ser constitutiva o regulada. En la técnica se conocen vectores basados en virus para administrar y expresar un polinucleótido deseado. Los ejemplos de vectores basados en virus incluyen, sin limitaciones, vectores de retrovirus recombinantes (véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT N° WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; las Patentes de los EEUU N° 5219740 y 4777127; la Patente de Gran Bretaña N° 2200651 ; y la Patente EP N° 0 345 242), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores de 101 virus Sindbis, virus Semliki forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de la encefalitos equina de Venezuela (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) y virus adeno-asociados (AAV) (véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT N° WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655). También puede emplearse una administración de ADN unido a adenovirus muertos, como se describe en Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147. También pueden emplearse vehículos y métodos de administración no viral, incluyendo, sin limitaciones, ADN policatiónico condensado, unido o no unido a adenovirus muertos solo (véase, por ejemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); ADN unido a ligandos (véase, por ejemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); vehículos celulares para la administración en células eucariotas (véanse, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 5814482; las Publicaciones PCT N° WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; y WO 97/42338) y la neutralización de cargas nucleicas o la fusión con membranas celulares. También puede emplearse ADN desnudo. Se describen ejemplos de métodos para introducir ADN desnudo en la Publicación PCT N° WO 90/11092 y la Patente de los EEUU N° 5580859. Se describen líposomas que pueden actuar como vehículos para la administración de genes en la Patente de los EEUU N° 5422120; las Publicaciones PCT N° WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; y la Patente EP N° 0 524 968. Se describen otros abordajes en Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 , y en Woffendin, Proc. Nati. Acad. Sci. (1994) 91:1581. Otros antagonistas del NGF Pueden usarse antagonistas del NGF distintos de anticuerpos anti-NGF (relacionados con el dolor causado por la artritis reumática y el dolor causado por la osteoartritis). En algunas realizaciones de la invención, el antagonista del NGF comprende al menos una molécula antisentido capaz de bloquear o disminuir la expresión de un NGF funcional. Las secuencias de nucleótidos de NGF son conocidas y están disponibles en bases de datos públicas. Véanse, por ejemplo, Borsani et al., Nuc. Acids Res. 1990, 18, 4020; Número de Acceso NM 002506; Ullrich et al., Nature 303:821-825 (1983). Es común preparar moléculas de oligonucleótidos antísentído que se unirán específicamente al ARNm del NGF sin reticularse con otros polinucleótidos. Los ejemplos 102 de sitios de direccionamiento ¡ncluyen, sin limitaciones, el codón de inicio, las regiones reguladoras 5', la secuencia codificante y la región 3' no traducida. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen entre aproximadamente 10 y 100 nucleótidos de longitud, entre aproximadamente 15 y 50 nucleótidos de longitud, entre aproximadamente 18 y 25 nucleótidos de longitud, o más. Los oligonucle?tidos pueden comprender modificaciones en el esqueleto, tales como, por ejemplo, enlaces fosforotioato y modificaciones de azúcares 2'-0 bien conocidas en la técnica. Los ejemplos de moléculas antisentido incluyen las moléculas de NGF antisentido descriptas en la Publicación de los EEUU N° 20010046959; véase también http://www.rna-tec.com/repair.htm. En otras realizaciones, el antagonista del NGF comprende al menos una molécula antisentido capaz de bloquear o reducir la expresión de un receptor funcional del NGF (tal como TrkA y/o p75). Woolf et al., J. Neuroscí. (2001) 21(3):1047-55; Taglialetela et al, J Neurochem (1996) 66(5): 1826-35. Las secuencias de nucleótidos de TrkA y p75 son conocidas y están disponibles en bases de datos públicas. Como alternativa, puede disminuirse la expresión y/o la liberación del NGF, y/o la expresión del receptor del NGF usando eliminación genética, morfolíno oligonucleótidos, ARNi o ribozimas, métodos que son bien conocidos en la técnica. Véanse http://www.macalester.edu/-montgomery/RNAi.html; http://pub32.ezboard.com/fmorpholinosfrm19.showMessage?topiclD=6.topic; http://www.highveld.com/ribozyme.html. En otras realizaciones, el antagonista del NGF comprende al menos un compuesto inhibidor del NGF. Como se lo usa en la presente documentación, un "compuesto inhibidor del NGF" hace referencia a un compuesto distinto de un anticuerpo anti-NGF, que reduce, inhibe, neutraliza o anula directa o indirectamente la actividad biológica del NGF. Un compuesto inhibidor del NGF debería presentar una o más de las siguientes características: (a) unión al NGF e inhibición de la actividad biológica del NGF y/o las vías río abajo mediadas por la función de señalización del NGF; (b) prevención, mejora o tratamiento de cualquier aspecto de dolor (tal como el dolor causado por la osteoartritis); (c) bloqueo o disminución de la activación del receptor del 103 NGF (incluyendo la dimerización y/o la autofosforilación del receptor TrkA); (d) incremento de la eliminación del NGF; (e) inhibición (reducción) de la síntesis, la producción o la liberación de NGF. Los ejemplos de compuestos inhibidores del NGF incluyen las pequeñas moléculas inhibidoras del NGF descriptas en la Publicación de los EEUU N° 20010046959; los compuestos que inhiben la unión del NGF a p75, como se describe en la Publicación PCT N° WO 00/69829, y PD90780 [ácido 7-(benzolilamino)-4,9-dihidro-4-metil-9-oxo-pirazolo[5, 1 -b]quinazolin-2-carboxílico], como se describe en Colquhoun et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 310(2):505-11 (2004); los compuestos que inhiben la unión del NGF a TrkA y/o p75, como se describe en la Publicación PCT N° WO 98/17278. Otros ejemplos de compuestos inhibidores del NGF incluyen los compuestos descriptos en las Publicaciones PCT N° WO 02/17914 y WO 02/20479, y en las Patentes de los EEUU N° 5342942, 6127401 y 6359130. Otros compuestos inhibidores del NGF incluyen los compuestos que son inhibidores competitivos del NGF. Véase la Patente de los EEUU N° 6291247. Además, aquél entrenado en la técnica puede preparar otros compuestos de pequeñas moléculas inhibidoras del NGF. En algunas realizaciones, un compuesto inhibidor del NGF se une al NGF. Los ejemplos de sitios de direccionamiento (unión) incluyen, sin limitaciones, la porción del NGF que se une al receptor TrkA y/o el receptor p75, y aquellas porciones del NGF que son adyacentes a la región de unión al receptor, y que son responsables, en parte, de la forma tridimensional correcta de la porción que se une al receptor. En otra realización, un compuesto inhibidor del NGF se une a un receptor del NGF (tal como TrkA y/o p75) e inhibe una actividad biológica del NGF. Los ejemplos de sitios de direccionamiento incluyen aquellas porciones de TrkA y/o p75 que se unen al NGF.

En las realizaciones que comprenden moléculas pequeñas, una molécula pequeña puede tener cualquier peso molecular entre 100 y 20000 daltons, entre 500 y 15000 daltons, o entre 1000 y 10000 daltons. Hay bibliotecas de moléculas pequeñas disponibles comercialmente. Las moléculas pequeñas pueden administrarse usando cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo por inhalación, por vía intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmica. En general, cuando el 104 antagonista del NGF de acuerdo con la invención sea una molécula pequeña, se lo administrará a una tasa de entre 0,1 y 300 mg/kg de peso corporal del paciente, dividido en entre una y tres o más dosis. Para un paciente adulto de peso normal, pueden administrarse dosis que varían entre 1 mg y 5 g por dosis. En otras realizaciones, el antagonista del NGF comprende al menos un análogo estructural del NGF. En la presente invención, los "análogos estructurales del NGF" hacen referencia a los compuestos que tienen una estructura tridimensional parcialmente similar a la del NGF, y que se unen a un receptor del NGF bajo condiciones fisiológicas in vitro o in vivo, donde la unión inhibe al menos en forma parcial una actividad biológica del NGF. En una realización, el análogo estructural del NGF se une a un receptor TrkA y/o p75. Los ejemplos de análogos estructurales del NGF incluyen, sin limitaciones, los péptidos bicíclicos descriptos en la Publicación PCT N° WO 97/15593; los péptidos bicíclícos descriptos en la Patente de los EEUU N° 6291247; los compuestos cíclicos descriptos en la Patente de los EEUU N° 6017878; y los pépfidos derivados del NGF descriptos en la Publicación PCT N° WO 89/09225. Los análogos estructurales del NGF apropiados también pueden diseñarse y sintetizarse mediante el modelado molecular de la unión al receptor del NGF, por ejemplo, con el método descripto en la Publicación PCT N° WO 98/06048. Los análogos estructurales del NGF pueden ser monómeros o dímeros/oligómeros, con cualquier combinación deseada de estructuras iguales o diferentes, para obtener afinidades y efectos biológicos mejorados. En otras realizaciones, en la invención se provee un antagonista del NGF que comprende al menos una mutante dominante negativa del receptor TrkA y/o receptor p75. Aquél entrenado en la técnica puede preparar mutantes dominantes negativas, por ejemplo, del receptor TrkA, de modo que el receptor se unirá al NGF, con lo que actuará como "reserva" para capturar NGF. Sin embargo, mutantes dominantes negativas no tendrán la actividad biológica normal del receptor TrkA al unirse al NGF. Los ejemplos de mutantes dominantes negativas incluyen, sin limitaciones, las mutantes descriptas en las siguientes referencias: Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1998, 95, 10884; Eíde et al., J. Neurosci. 1996, 16, 3123; Liu et al., J. Neurosci 1997, 17, 8749; Klein et al., Cell 1990, 61 , 647; Valenzuela et al., Neuron 1993, 10, 963; Tsoulfas et al., Neuron 1993, 10, 975; 105 y Lamballe et al., EMBO J. 1993, 12, 3083, cada uno de los cuales se incorpora por completo en la presente documentación a modo de referencia. Las mutantes dominantes negafivas pueden administrarse bajo la forma de proteínas o bajo la forma de un vector de expresión, de modo que la mutante dominante negativa, por ejemplo, el receptor TrkA mutante, se exprese ¡n vivo. La proteína o el vector de expresión puede administrarse usando cualquier medio conocido en la técnica, tal como por vía intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal, dérmica o por inhalación. Por ejemplo, la administración de los vectores de expresión incluye la administración local o sistémica, incluyendo inyección, administración oral, cañón de partículas o administración cateterizada, y administración tópica. Aquél entrenado en la técnica sabrá cómo administrar los vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 6436908, 6413942 y 6376471. También puede usarse la administración dirigida de composiciones terapéuticas que comprenden un polinucleótido antisentido, un vector de expresión o polinucleótídos subgenómicos. Se describen procedimientos de administración de ADN mediada por receptores, por ejemplo, en Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11 :202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621 ; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Las composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido se administran en un rango de entre aproximadamente 100 ng y aproximadamente 200 mg de ADN, para una administración local en un protocolo de terapia génica. En algunas realizaciones, también pueden usarse rangos de concentración de entre aproximadamente 500 ng y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 1 µg y aproximadamente 2 mg, entre aproximadamente 5 µg y aproximadamente 500 µg, y entre aproximadamente 20 µg y aproximadamente 100 µg de ADN, o más, durante un protocolo de terapia génica. Los polinucleótidos y los polipéptidos terapéuticos de la presente invención pueden administrarse usando vehículos para administrar genes. El vehículo para administrar genes puede ser de origen viral o no viral (véanse en general, Jolly, Cáncer Gene Therapy (1994) 1 :51 ; Kimura, 106 Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1 :185; y Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Es posible inducir la expresión de estas secuencias codificantes usando promotores endógenos de mamíferos o heterólogos. La expresión de la secuencia codificante puede ser constitutiva o regulada. En la técnica se conocen vectores basados en virus para administrar y expresar un polinucleótido deseado. Los ejemplos de vectores basados en virus incluyen, sin limitaciones, vectores de retrovirus recombinantes (véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT N° WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; las Patentes de los EEUU N° 5219740 y 4777127; la Patente de Gran Bretaña N° 2200651 ; y la Patente EP N° 0 345 242), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores de virus Sindbis, virus Semliki forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de la encefalitos equina de Venezuela (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) y virus adeno-asociados (AAV) (véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT N° WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655). También puede emplearse una administración de ADN unido a adenovírus muertos, como se describe en Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147. También pueden emplearse vehículos y métodos de administración no viral, incluyendo, sin limitaciones, ADN policatiónico condensado, unido o no unido a adenovírus muertos solo (véase, por ejemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); ADN unido a ligandos (véase, por ejemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); vehículos celulares para la administración en células eucariotas (véanse, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 5814482; las Publicaciones PCT N° WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; y WO 97/42338) y la neutralización de cargas nucleicas o la fusión con membranas celulares. También puede emplearse ADN desnudo. Se describen ejemplos de métodos para introducir ADN desnudo en la Publicación PCT N° WO 90/11092 y la Patente de los EEUU N° 5580859. Se describen liposomas que pueden actuar como vehículos para la administración de genes en la Patente de los EEUU N° 5422120; las Publicaciones PCT N° WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; y la Patente EP N° 0 524 968. 107 Se describen otros abordajes en Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411, y en Woffendin, Proc. Nati. Acad. Sci. (1994) 91:1581. También es evidente que puede usarse un vector de expresión para dirigir la expresión de cualquiera de los antagonistas del NGF basados en proteínas descriptos en la presente documentación (por ejemplo, anticuerpos anti-NGF, inmunoadhesinas TrkA, etcétera). Por ejemplo, en la técnica se conocen otros fragmentos receptores de TrkA capaces de bloquear (de forma parcial o completa) el NGF y/o una actividad biológica del NGF. En otra realización, el antagonista del NGF comprende al menos una inmunoadhesina TrkA. Las inmunoadhesinas TrkA, como se las usa en la presente documentación, hacen referencia a moléculas quiméricas que comprenden el dominio extracelular de un receptor TrkA y una secuencia de inmunoglobulina, que retienen la especificidad de unión del receptor TrkA (retienen sustancialmente la especificidad de unión del receptor TrkA) y pueden unirse al NGF. Las ¡nmunoadhesinas TrkA son conocidas en la técnica, y se ha descubierto que bloquean la unión del NGF al receptor TrkA. Véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 6153189. Brennan et al. describen la administración de inmunoadhesina TrkA en un modelo de dolor post-quirúrgico en rata. Véase Society for Neuroscience Abstracts 24 (1-2) 880 (1998). En una realización, la inmunoadhesina TrkA comprende una fusión de una secuencia de aminoácidos de un receptor TrkA (o una porción de ésta) del dominio extracelular de TrkA, capaz de unirse al NGF (en algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos que retiene sustancialmente la especificidad de unión al receptor TrkA), y una secuencia de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el receptor TrkA es una secuencia de un receptor TrkA humano, y la fusión es con una secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina. En otras realizaciones, la secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina es una secuencia del dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina. En otras realizaciones, la asociación de dos fusiones de cadenas pesadas de receptores TrkA-inmunoglobulinas (por ejemplo, a través de una unión covalente por enlaces disulfuro) resulta en una estructura homodiméríca semejante a la inmunoglobulina. Además, puede asociarse una cadena liviana de inmunoglobulína con una o ambas quimeras de receptor TrkA-ínmunoglobulina en un dímero unido por enlaces disulfuro para obtener una 108 estructura homotrimérica u homotetramérica. Los ejemplos de inmunoadhesinas TrkA apropiadas incluyen aquellas descriptas en la Patente de los EEUU N° 6153189. En otra realización, el antagonista del NGF comprende al menos un anticuerpo anti-TrkA capaz de bloquear, suprimir, alterar y/o reducir la interacción física del NGF con el receptor TrkA, y/o la señalización río abajo, con lo que se reduce y/o bloquea la actividad biológica del NGF. Los anticuerpos anti-TrkA son conocidos en la técnica. Los ejemplos de anticuerpos anti-TrkA incluyen aquellos descriptos en las Publicaciones PCT N° WO 97/21732, WO 00/73344, WO 02/15924, y la Publicación de los EEUU N° 20010046959. En otra realización, el antagonista del NGF comprende al menos un anticuerpo anti-p75 capaz de bloquear, suprimir y/o reducir la interacción física del NGF con el receptor p75, y/o la señalización río abajo, con lo que se reduce y/o bloquea la actividad biológica del NGF. En otra realización, el antagonista del NGF comprende al menos un inhibidor de quinasa capaz de inhibir la señalización río abajo de la quinasa asociada con la actividad del receptor TrkA y/o p75. Un ejemplo de inhibidor de quinasa es K252a o K252b, que es conocido en la técnica y se describe en Knusel et al., J. Neurochem. 59:715-722 (1992); Knusel et al., J. Neurochemistry 57:955-962 (1991); Koizumi et al., J. Neuroscience 8:715-721 (1988); Hírata et al., Chemical Abstracts 111:728, XP00204135, véase el resumen, y 12th Collective Chemical Substance Index, p. 34237, c. 3 (5-7), 55-60, 66-69), p. 34238, c.1 (41-44), c.2 (25-27, 32-33), p. 3423, c.3 (48-50, 52-53); y la Patente de los EEUU N° 6306849. Se espera que, de ser buscadas por los médicos clínicos, será posible identificar una cantidad de otras categorías de antagonistas del NGF. Identificación de antagonistas del NGF (tales como anticuerpos antagonistas anti-NGF) Los antagonistas del NGF, incluyendo los anticuerpos antagonistas anti-NGF, pueden identificarse o caracterizarse usando métodos conocidos en la técnica, que permitan detectar y/o medir la reducción, la mejora o la neutralización de una actividad biológica del NGF. Pueden usarse los métodos descriptos en PCT WO 04/065560. Puede usarse otro método, por ejemplo, un ensayo de activación de receptor de quinasa (KIRA) descripto en las Patentes de los EEUU N° 5766863 y 5891650, para identificar agentes anti-NGF. Este ensayo semejante al ELISA es 109 apropiado para realizar mediciones cualitativas o cuantitativas de la activación de la quinasa, mediante la medición de la autofosforilación del dominio de la quinasa de una proteína tirosin quinasa receptora (conocida de aquí en adelante como "rPTK"), por ejemplo la TrkA receptora, y también para identificar y caracterizar los antagonistas potenciales de una rPTK seleccionada, por ejemplo, TrkA. La primera etapa del ensayo comprende fosforilar el dominio de quinasa de un receptor de quinasa, por ejemplo, un receptor TrkA, donde el receptor está presente en la membrana celular de una célula eucariota. El receptor puede ser un receptor endógeno o un ácido nucleico que codifica el receptor, o una construcción receptora, y puede usárselo para transformar una célula. Típicamente se recubre una primera base sólida (por ejemplo, una cavidad de una primera placa de ensayo) con una población sustancialmente homogénea de estas células (usualmente una línea de células de mamíferos), de modo que las células se adhieren a la fase sólida. Comúnmente las células son adherentes, por lo que se adhieren de forma natural a la primera fase sólida. Si se usa una "construcción receptora", ésta comúnmente comprende una fusión de una quinasa receptora y un polipéptido de marca. El polipéptído de marca es reconocido por el agente de captura, comúnmente un anticuerpo de captura, en la parte de ELISA del ensayo. Luego se agrega un analito, tal como un candidato a antagonista del NGF (incluyendo un anticuerpo antagonista anti-NGF), junto con NGF, a las cavidades que contienen las células adherentes, de modo que la tirosin quinasa receptora (por ejemplo, el receptor TrkA) se expone (o se pone en contacto) al NGF y al analito. Este ensayo permite identificar antagonistas (incluyendo anticuerpos) que inhiben la activación de TrkA por su ligando, el NGF. Después de la exposición al NGF y al analito, se solubilizan las células adherentes usando un amortiguador de lisis (que contiene un detergente solubilizante) y se agita suavemente, con lo que se libera un lisado celular, que puede someterse directamente a la parte de ELISA del ensayo, sin la necesidad de concentrar o aclarar ei lisado celular. De este modo, el lisado celular preparado como se ha indicado está listo para la etapa de ELISA del ensayo. Como primer paso en la etapa de ELISA, se recubre una segunda fase sólida (comúnmente una cavidad de una placa de microtitulación de ELISA) con un agente de captura (comúnmente un anticuerpo de captura) que se une específicamente a la tirosin quinasa receptora, 110 o en el caso de una construcción receptora, al polipéptido de marca. Se recubre la segunda fase sólida para que el agente de captura se adhiera a la segunda fase sólida. El agente de captura generalmente es un anticuerpo monoclonal, pero como se describe en los ejemplos de la presente documentación, también pueden usarse anticuerpos policlonales. Luego se expone o se pone en contacto el lisado celular obtenido con el agente de captura adherente, de modo que el receptor o la construcción receptora se adhiere (o queda capturada) a la segunda fase sólida. Luego se efectúa un paso de lavado para eliminar el lisado celular no unido, con lo que se deja solamente el receptor o la construcción receptora capturada. Luego se expone o se pone en contacto el receptor o la construcción receptora capturada con un anticuerpo anti-fosfotírosina, con lo que se identifican los residuos de tirosina fosforilados en la tirosin quinasa receptora. En una realización, el anticuerpo anti-fosfotirosina está conjugado (directa o indirectamente) con una enzima que cataliza un cambio de color de un reactivo coloreado no radiactivo. Por consiguiente, es posible medir la fosforilación del receptor por medio del cambio de color subsiguiente del reactivo. Puede unirse la enzima al anticuerpo anti-fosfotirosina en forma directa, o puede conjugarse una molécula de conjugación (por ejemplo, biotina) con el anticuerpo anti-fosfotírosina anticuerpo, y luego puede unirse la enzima con el anticuerpo anti-fosfotirosina a través de la molécula de conjugación.

Finalmente se mide la unión del anticuerpo anti-fosfotirosina con el receptor o la construcción receptora capturada, por ejemplo, a través de un cambio de color en el reactivo coloreado. También es posible identificar antagonistas del NGF (tales como anticuerpos antagonistas anti-NGF) incubando un agente candidato con NGF y monitoreando una o más de cualquiera de las siguientes características: (a) la unión al NGF y la inhibición de la actividad biológica del NGF o las vías río abajo mediadas por la función de señalización del NGF; (b) la inhibición, el bloqueo o la disminución de la activación del receptor del NGF (incluyendo la dimerización y/o la autofosforilación de TrkA); (c) el incremento de la eliminación de NGF; (d) el tratamiento o la prevención de cualquier aspecto del dolor causado por la artritis reumática o el dolor causado por la osteoartritis; (e) la inhibición (reducción) de la síntesis, la producción o la liberación de NGF. En algunas realizaciones, se identifica un antagonista del NGF (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-NGF) incubando un agente candidato con NGF y monitoreando la unión y/o la reducción o la 111 neutralización concomitante de una actividad biológica del NGF. El ensayo de unión puede efectuarse con uno o más polipéptidos NGF purificados, o con células que expresan polipéptidos NGF, en forma natural o por transfección. En una realización, el ensayo de unión es un ensayo de unión competitiva, donde se evalúa la capacidad de un agente candidato (tal como un anticuerpo) de competir con un anficuerpo antagonista anti-NGF conocido por la unión al NGF. El ensayo puede realizarse en diversos formatos, incluyendo el formato de ELISA. En otras realizaciones, se identifica un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) incubando un agente candidato con NGF, monitoreando la unión y la inhibición concomitante de la dimerización y/o la autofosforilación de TrkA. Una vez realizada la identificación inicial, puede confirmarse y retinarse adicíonalmente la actividad de un candidato a antagonista anti-NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) con ensayos biológicos conocidos para evaluar las actividades biológicas. Como alternativa, es posible usar ensayos biológicos para analizar directamente los candidatos. Por ejemplo, el NGF promueve una cantidad de cambios morfológicos reconocibles en las células que responden. Éstos incluyen, sin limitaciones, la promoción de la diferenciación de células PC12 y la potenciación del crecimiento de neuritas a partir de estas células (Greene et al., Proc Nati Acad Sci U S A. 73(7):2424-8, 1976), la promoción del crecimiento de neurita a partir de explantes de ganglios responsables de respuestas sensoriales y simpáticos (Levi-Montalcini, R. y Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48:534-569, 1968), y la promoción de la supervivencia de las neuronas dependientes del NGF, tales como las neuronas del ganglio embrionario de la raíz dorsal, el ganglio trigémino o el ganglio simpático (por ejemplo, Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711 , (1977); Buchman & Davies, Development 118:989-1001 (1993). Por consiguiente; el ensayo de la inhibición de la actividad biológica del NGF comprende cultivar células que responden al NGF con NGF más un analito, tal como un candidato a antagonista del NGF (incluyendo anticuerpos antagonistas anti-NGF). Después de un período de tiempo apropiado, se evaluará la respuesta de las células (diferenciación celular, crecimiento de neuritas o supervivencia celular). También puede evaluarse la capacidad de un candidato a antagonista del NGF (incluyendo anticuerpos antagonistas anti-NGF) de bloquear o neutralizar una actividad biológica del NGF 112 monitoreando la capacidad del agente candidato de inhibir la supervivencia de ganglios embrionarios de la raíz dorsal de rata mediada por NGF, en un ensayo biológico como se describe en Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000). Composiciones para usar en los métodos de la invención Las composiciones usadas en los métodos de la invención (relacionados con el dolor causado por la artritis reumática y el dolor causado por la osteoartritis) comprenden una cantidad efectiva de un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo anti-NGF), y, en algunas realizaciones, comprenden además un excipiente aceptable para el uso farmacéutico. En algunas realizaciones, la composición puede usarse en cualquiera de los métodos descriptos en la presente documentación. También se han descripto y se describirán más adelante ejemplos de estas composiciones y de los procedimientos para formularlas. En una realización, la composición comprende un antagonista del NGF. En otra realización, la composición comprende uno o más antagonistas del NGF. En otra realización, la composición comprende uno o más antagonistas del NGF seleccionados entre uno o más de cualquiera de los siguientes: un antagonista (por ejemplo, un anticuerpo) que se une (interactúa físicamente) al NGF, un antagonista que se une a un receptor del NGF (tal como el receptor TrkA y/o el receptor p75), y/o un antagonista que reduce (impide y/o bloquea) la señalización río abajo del receptor del NGF. En aún otras realizaciones, la composición comprende cualquier antagonista del NGF que no es una ¡nmunoadhesina TrkA (es decir, es distinto de una inmunoadhesina TrkA). En otras realizaciones, la composición comprende cualquier antagonista del NGF que es distinto de un anticuerpo anfi-NGF. En aún otras realizaciones, la composición comprende cualquier antagonista del NGF que es distinto de una ¡nmunoadhesina TrkA y distinto de un anticuerpo anti-NGF. En otras realizaciones, un antagonista del NGF inhibe (reduce) la síntesis, la producción o la liberación de NGF. En algunas realizaciones, el antagonista del NGF se une al NGF y no reacciona significativamente con las neurotrofinas relacionadas (tales como NT3, NT4/5 y/o BDNF). En algunas realizaciones, el antagonista del NGF no está asociado con una respuesta inmune adversa. En algunas realizaciones, el antagonista del NGF se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-NGF, una molécula antísentido dirigida contra el NGF (incluyendo una molécula antisentido dirigida contra un ácido nucleico que 113 codifica NGF), una molécula antisentido dirigida contra un receptor del NGF (tal como TrkA y/o p75), un compuesto inhibidor del NGF, un análogo estructural del NGF, una mutación dominante negativa de un receptor TrkA que se une al NGF, una inmunoadhesina TrkA, un anticuerpo anti-TrkA, un anticuerpo antí-p75 y un inhibidor de quinasa. En otra realización, el antagonista del NGF es un anticuerpo anti-NGF. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-NGF reconoce el NGF humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-NGF es humano. En aún otras realizaciones, el anticuerpo anti-NGF está humanizado (tal como el anticuerpo E3 descripto en la presente documentación). En aún otra realización, el anticuerpo anti-NGF comprende una región constante que no desencadena una respuesta inmune no buscada o indeseable, tal como la lisis mediada por anticuerpos o la ADCC. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-NGF comprende una o más CDR del anficuerpo E3 (tal como una, dos, tres, cuatro, cinco, o, en algunas realizaciones, las seis CDR de E3). Se comprenderá que las composiciones pueden comprender más de un antagonista del NGF. Por ejemplo, una composición puede comprender más de un miembro de una clase de antagonistas del NGF (por ejemplo, una mezcla de anticuerpos anti-NGF que reconocen disfintos epitopes del NGF), así como miembros de distintas clases de antagonistas del NGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF y un compuesto inhibidor del NGF). Otros ejemplos de composiciones comprenden más de un anticuerpo anti-NGF que reconocen los mismos epitopes, distintas especies de anticuerpos anti-NGF que se unen a disfintos epitopes de NGF, o distintos compuestos inhibidores del NGF. Además, la composición usada en la presente invención puede comprender vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables para el uso farmacéutico (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición (2000) Lippincott Williams y Wilkins, editado por K. E. Hoover.), bajo la forma de formulaciones liofilízadas o soluciones acuosas. En la presente documentación se describen con mayor detalle los excipientes aceptables para el uso farmacéutico. También es posible usar el antagonista del NGF, y las composiciones de éste, con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la efectividad de los agentes. Para el dolor causado por la osteoartritis, puede administrarse el antagonista del NGF en combinación con uno o 114 mas analgésicos, NSAID o esteroides Los analgésicos incluyen, sin limitaciones, acetaminofeno, tramadol, capsaicina (tópica) Los ejemplos de NSAID comprenden salicilatos acetilados, incluyendo aspirina, salicilatos no acetilados, incluyendo salsalato, diflunisal, ácidos acéticos, incluyendo etodolac, diclofenac, indometacma, cetorolac, nabumetona, ácidos propiónicos, incluyendo fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, cetoprofeno, naproxeno, naproxeno sodio, oxaprozma, fenamatos, incluyendo meclofenamato, acido mefenamico, fenilbutazona, piroxicam, inhibidores de COX-2, incluyendo celecoxib, etopcoxib, valdecoxib, rofecoxib, lumiracoxib Un ejemplo de esteroides lo constituyen los corticosteroides intraarticulares (IAC) Para tratar el dolor causado por la artritis reumática, puede administrarse el antagonista del NGF en combinación con uno o mas analgésicos, NSAID, corticosteroides (por ejemplo, prednisona) u otras drogas antirreumaticas modificadoras de enfermedades adicionales Los ejemplos de drogas antirreumaticas modificadoras de enfermedades incluyen metotrexato, hidroxicloroquma, sulfasalazina, leflunomida, inhibidores del TNF, receptor de ?nterleuqu?na-1 soluble, conjugados de oro, agentes citotoxicos (azatippna, ciclofosfamida, ciclospopna A) Admmistration de un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) El antagonista del NGF (tal como el anticuerpo antagonista anti-NGF) puede administrarse a un individuo (para tratar la artritis reumática y la osteoartntis) a través de cualquier ruta apropiado Para aquellos entrenados en la técnica, sera evidente que los ejemplos descpptos en la presente documentación no pretenden limitar la invención, sino que sirven para ilustrar los procedimientos disponibles Por consiguiente, en algunas realizaciones, el antagonista del NGF (tal como el anticuerpo antagonista anti-NGF) se administra a un individuo de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como bolos o por infusión continua durante un periodo de tiempo, a través de una ruta intramuscular, intrapeptoneal, intracerebrospinal, subcutánea, mtraarticular, sublingual, intrasinovial, mtratecal, oral, tópica, por insuflación o inhalación La administración puede ser sistémica, por ejemplo, administración intravenosa o localizada Los nebulizadores para formulaciones líquidas disponibles comercialmente, incluyendo los nebulizadores a chorro y los nebulizadores ultrasónicos, son útiles para la administración Las formulaciones liquidas pueden nebulizarse directamente, y los polvos 115 liofilizados pueden nebulizarse una vez reconstituidos. Como alternativa, puede convertirse un antagonista del NGF (tal como anticuerpo antagonista anti-NGF) en aerosol, usando una formulación de fluorocarburo y un inhalador de dosis medidas, o puede inhalárselo como un polvo liofilizado y molido. En una realización, se administra un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) con procedimientos de administración en sitios específicos o localizaciones deseadas. Los ejemplos de procedimientos de administración en sitios específicos o localízaciones deseadas incluyen diversas fuentes de depósito implantables del antagonista del NGF (tal como el anticuerpo antagonista anti-NGF) o catéteres de administración local, tales como catéteres de infusión, catéteres de introgresión o catéteres tipo aguja, injertos sintéticos, envolturas adventicias, conexiones y stents, u otros dispositivos implantables, vehículos para sitios específicos, inyección directa, o aplicación directa. Véanse, por ejemplo, la Publicación PCT N° WO 00/53211 y la Patente de los EEUU N° 5981568. Pueden usarse diversas formulaciones de un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) para la administración. En algunas realizaciones, el antagonista del NGF (por ejemplo, el anticuerpo antagonista anti-NGF) puede administrarse puro. En algunas realizaciones, puede administrarse el antagonista del NGF (por ejemplo, el anticuerpo antagonista anti-NGF) y un excipiente aceptable para el uso farmacéutico en diversas formulaciones. Los excipientes aceptables para el uso farmacéutico son conocidos la técnica, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia efectiva desde el punto de vista farmacológico. Por ejemplo, un excipiente puede brindar forma o consistencia, o puede actuar como diluyente. Los excipientes apropiados incluyen, sin limitaciones, agentes estabilizadores, agentes humectantes y emulsificantes, sales para alterar la osmolaridad, agentes encapsulantes, amortiguadores y potenciadores de la penetración cutánea. Se describen excipientes y formulaciones para la administración parenteral y no parenteral de drogas en Remington, The Science and Practíce of Pharmacy, 20a edición. Mack Publishíng (2000). En algunas realizaciones, estos agentes se formulan para una administración por inyección (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etcétera). Por consiguiente, 116 es posible combinar estos agentes con vehículos aceptables para el uso farmacéutico, tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y semejantes. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, el cronograma y la repetición, dependerá del individuo particular y de su historia médica. Puede administrarse un anticuerpo anti-NGF usando cualquier método apropiado, incluyendo la administración por inyección (por ejemplo, intraperítoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etcétera). También pueden administrarse los anticuerpos anti-NGF por inhalación, como se describe en la presente documentación. En general, para administrar los anticuerpos anti-NGF, una dosis candidata inicial puede ser de aproximadamente 2 mg/kg. Para el propósito de la presente invención, una dosificación diaria típica puede tomar cualquier rango de entre aproximadamente 0,1 µg/kg, 1 µg/kg, 3 µg/kg, 30 µg/kg, 300 µg/kg, 3 mg/kg, y 30 mg/kg, 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados previamente. Por ejemplo, puede administrarse un anticuerpo anti-NGF a razón de aproximadamente 1 µg/kg, aproximadamente 10 µg/kg, aproximadamente 20 µg/kg, aproximadamente 50 µg/kg, aproximadamente 100 µg/kg, aproximadamente 200 µg/kg, aproximadamente 500 µg/kg, aproximadamente 1 mg/kg o aproximadamente 2 mg/kg. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, se continúa el tratamiento hasta que se obtiene una supresión deseada de los síntomas o se alcanzan niveles terapéuticos suficientes para reducir el dolor. Un ejemplo de un régimen de dosificación comprende administrar una dosis inicial de aproximadamente 2 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1 mg/kg del anticuerpo anti-NGF, o seguida por una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1 mg/kg semana por medio. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles, dependiendo del patrón de degradación farmacocinética que se desea alcanzar. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se contempla una dosificación de entre una y cuatro veces por semana. Puede usarse una dosificación aún menos frecuente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-NGF se administra una vez cada 2 semanas, cada 3 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas, cada 10 semanas, cada 15 semanas, cada 20 semanas, cada 25 semanas o con menor frecuencia. En algunas realizaciones, 117 el anticuerpo anti-NGF se administra una vez por mes, cada 2 meses, cada 3 meses, cada 4 meses, cada 5 meses, cada 6 meses o con menor frecuencia. El progreso de la terapia se monitorea fácilmente con procedimientos y ensayos convencionales. El régimen de dosificación (incluyendo el o los antagonistas del NGF usados) puede variar con el tiempo. Los estudios realizados en pacientes con dolor entre moderado y severo causado por osteoartritis en la rodilla (resumidos en el Ejemplo 10) demostraron que las dosificaciones en el rango de entre 3 y 300 µg/kg proporcionaron un alivio del dolor durante diversos períodos de tiempo. Todas las dosificaciones evaluadas (3, 10, 30, 100 y 300 µg/kg) produjeron una reducción del dolor por al menos 7 días; las dosificaciones más elevadas resultaron en un alivio del dolor prolongado por al menos 28 días (Figura 24). Una dosis de 100 µg/kg produjo un alivio del dolor por al menos 80 días (Figura 25). En general, cuando no es un anticuerpo, puede administrarse un antagonista del NGF (en algunas realizaciones) a una tasa de entre aproximadamente 0,1 y 300 mg/kg de peso del paciente, dividido en entre una y tres dosis, o como se describe en la presente documentación. En algunas realizaciones, para un paciente adulto de peso normal, pueden administrarse dosis que varían entre aproximadamente 0,3 y 5,00 mg/kg. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, el cronograma y la repetición, dependerá del individuo particular y de su historia médica, y también de las propiedades de los agentes individuales (tales como la vida media del agente, y otras consideraciones bien conocidas en la técnica). Para el propósito de la presente invención, la dosificación apropiada de un antagonista del NGF (incluyendo un anticuerpo antagonista anti-NGF) dependerá del antagonista del NGF (o las composiciones de éste) empleado, el tipo y la severidad del dolor a tratar, la administración del agente para propósitos preventivos o terapéuticos, las terapias previas, la historia clínica del paciente y su respuesta al agente, y la discreción del médico a cargo. Típicamente, el médico a cargo administrará un antagonista del NGF (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-NGF) hasta alcanzar una dosificación que permita obtener el resultado deseado. La dosis y/o la frecuencia puede variar con el transcurso del tratamiento. 118 Las consideraciones empíricas, tales como la vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosificación. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos que son compatibles con el sistema inmune humano, tales como anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos, para prolongar la vida media del anticuerpo y evitar que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmune del huésped. La frecuencia de administración se determinará y ajustará durante el transcurso de la terapia, y en general, pero no necesariamente, se basará en el tratamiento y/o la supresión y/o la mejora y/o la demora del dolor. Como alternativa, pueden ser apropiadas las formulaciones de liberación continua de los antagonistas del NGF (por ejemplo, anticuerpos antagonistas anti-NGF). En la técnica se conocen diversas formulaciones y dispositivos para obtener una liberación sostenida. En una realización, es posible determinar las dosificaciones de un antagonista del NGF (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-NGF) en forma empírica en individuos que han recibido una o más administraciones de un antagonista del NGF. A los Individuos se les proporcionan dosificaciones crecientes de un antagonista del NGF (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-NGF). Para evaluar la eficacia de un antagonista del NGF (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-NGF), puede evaluarse un indicador del dolor. La administración de un antagonista del NGF (por ejemplo, un anficuerpo antagonista anti- NGF) de acuerdo con el método de la presente invención puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la condición fisiológica del receptor, del propósito terapéutico o profiláctico de la administración, y de otros factores conocidos por aquellos entrenados en la técnica. La administración de un antagonista del NGF (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti- NGF) puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado, o puede comprender una serie de dosis separadas, por ejemplo, antes, durante o después del desarrollo del dolor; antes; durante; antes y después; durante y después; antes y durante; o antes, durante, y después del desarrollo del dolor. En algunas realizaciones, puede haber presente más de un antagonista del NGF, tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF. Puede haber al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más antagonistas del NGF (por ejemplo, anticuerpos antagonistas 119 anti-NGF) presentes. En general, estos antagonistas del NGF (tales como anticuerpos antagonistas anfi-NGF) tendrán actividades complementarias que no afecten en forma adversa las de los otros. También pueden usarse antagonistas del NGF en combinación con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la efectividad de los agentes. Las formulaciones terapéuticas de antagonistas del NGF (por ejemplo, anticuerpos antagonistas anti-NGF) usadas de acuerdo con la presente invención se preparan para el almacenamiento mezclando un antagonista del NGF (por ejemplo, un anticuerpo) que tiene el grado de pureza deseada con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales aceptables para el uso farmacéutico (Remington, The Science and Practíce of Pharmacy, 2a edición. Mack Publishing (2000)), bajo la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, los excipientes o los estabilizadores aceptables no son tóxicos para aquellos que reciben las dosificaciones a las concentraciones empleadas, y pueden comprender amortiguadores, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; preservantes (tales como cloruro de octadecíldímetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenes, tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; cíclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpírrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparragina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteínas); y/o agentes tensíoactivos no iónicos, tales como TWEENTM, PLURONICSTM o polietilenglicol (PEG). Los liposomas que contienen antagonistas del NGF (tales como anticuerpos antagonistas anti-NGF) se preparan con métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y las Patentes de los EEUU N° 4485,045 y 4544545. Se describen liposomas con un 120 tiempo de circulación mejorado en la Patente de los EEUU N° 5013556. Es posible generar liposomas particularmente útiles con un método de evaporación de fase inversa, usando una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros con un tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. También pueden atraparse los ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, con técnicas de coacervación o por polimerización de ¡nterfases, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metacilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de drogas coloidales (por ejemplo, liposomas, microsferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 2a edición. Mack Publishing (2000). Pueden producirse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista (tal como el anticuerpo), donde estas matrices toman la forma de artículos moldeados, por ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrílato de 2-hidroxietílo), o poli(alcohol vinílico)), poliláctidos (Patente de los EEUU N° 3773919), copolímeros de ácido L- glutámico y L-glutamato de 7-etilo, acetato de etílen vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como LUPRON DEPOT TM (microesferas inyectables compuestas por copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), acetato de isobutirato de sacarosa, y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Las formulaciones que se usarán para una administración in vivo deberán ser estériles. Esto se realiza fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones de antagonistas terapéuticos del NGF (por ejemplo, anticuerpos antagonistas anti-NGF) generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un recipiente que tiene un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica. 121 Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden estar en formas de dosificación individuales, tales como tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, granulos, soluciones o suspensiones, o supositorios, para una administración oral, parenteral o rectal, o para una administración por inhalación o insuflación Para preparar composiciones solidas, tales como tabletas, se mezcla el ingrediente activo principal con un vehículo farmacéutico, por ejemplo ingredientes convencionales para la formación de tabletas, tales como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, acido esteárico, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, por ejemplo, agua, para formar una composición de preformulacion sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una sal no tóxica de éste aceptable para el uso farmacéutico Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas se interpreta que el ingrediente activo se dispersa en forma pareja en la composición, de modo que es posible subdividir finamente la composición en formas de dosificación individuales igualmente efectivas, tales como tabletas, pildoras y cápsulas Luego se subdivide esta composición de preformulacion solida en formas de dosificación individuales del tipo descppto previamente, que contienen entre 0,1 y aproximadamente 500 mg del ingrediente activo de la presente invención Las tabletas o las pildoras de la nueva composición pueden recubrirse o combinarse de otro modo para proporcionar una forma de dosificación que tiene la ventaja de una acción prolongada Por ejemplo, la tableta o la pildora puede comprender una dosificación interna y un componente de dosificación externa, donde esta última toma la forma de un recubrimiento alrededor del primero Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica, que sirve para resistir la desintegración en el estomago y permite que el componente interno pase intacto hacia el duodeno o presente una liberación demorada Puede usarse una variedad de materiales para estas capas o recubrimientos entéricos, donde estos materiales incluyen una cantidad de ácidos pohmepcos, y mezclas de ácidos polimépcos con materiales tales como shellac, alcohol cetilico y acetato de celulosa Los agentes activos en superficie apropiados incluyen, en particular, agentes no iónicos, tales como po oxietilensorbitan (por ejemplo, TweenTM 20, 40, 60, 80 o 85) y otros sorbitan (por 122 ejemplo, SpanTM 20, 40, 60, 80 o 85). Las composiciones con un agente activo en superficie comprenderán entre 0,05 y 5% de agente activo en superficie, o entre 0,1 y 2,5%. Se apreciará que podrán agregarse otros ingredientes, por ejemplo, manitol, u otros vehículos aceptables para el uso farmacéutico, de ser necesario. Pueden prepararse emulsiones apropiadas usando emulsiones de grasa disponibles comercialmente, tales como IntralipidTM, LiposynTM, InfonutrolTM, LipofundinTM y LípíphysanTM. El ingrediente activo puede disolverse en una composición de una emulsión mezclada con anterioridad, o como alternativa, puede disolverse en un aceite (por ejemplo, aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendra), y puede formarse una emulsión al realizar una mezcla con un fosfolípido (por ejemplo, fosfolípidos de huevo, fosfolípidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que podrán agregarse otros ingredientes, por ejemplo glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones apropiadas típicamente contendrán hasta 20% de aceite, por ejemplo, entre 5 y 20%. La emulsión de grasa puede comprender gotas de grasa de entre 0,1 y 1 ,0 µm, particularmente entre 0,1 y 0,5 µm, y pueden tener un pH en el rango de entre 5,5 y 8,0. Las composiciones de emulsión pueden ser aquellas preparadas mezclando un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo contra el factor de crecimiento neuronal) con IntralipidTM, o los componentes de éste (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua). Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en solventes acuosos u orgánicos aceptables para el uso farmacéutico, o mezclas de éstos, y polvos. Las composiciones sólidas o líquidas pueden contener excipientes apropiados aceptables para el uso farmacéutico, como se indicó previamente. En algunas realizaciones, las composiciones se administran a través de la ruta oral o nasal respiratoria, para obtener un efecto local o sistémico. Las composiciones, preferiblemente en solventes estériles aceptables para el uso farmacéutico, pueden nebulizarse con el uso de gases. Las soluciones nebulizadas pueden respirarse directamente a partir del dispositivo nebulizador, o puede unirse el dispositivo nebulizador a una máscara facial, una campana o una máquina de respiración por presión positiva intermitente. Las 123 soluciones, las suspensiones o las composiciones en polvo pueden administrarse, preferiblemente por vía oral o nasal, desde dispositivos que administran la formulación de forma apropiada Es posible evaluar la eficacia del tratamiento de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica CONJUNTOS DE ELEMENTOS QUE COMPRENDEN ANTICUERPOS Y POLINUCLEÓTIDOS DE LA INVENCIÓN En la invención también se proveen conjuntos de elementos que comprenden anticuerpos o po péptidos para usar en detección y/o terapia Por consiguiente, en algunas realizaciones, los conjuntos de elementos comprenden un anticuerpo E3 En algunas realizaciones, el conjunto de elementos comprende cualquier anticuerpo o polipéptido descppto en la presente documentación En otros aspectos, los conjuntos de elementos pueden usarse para cualquiera de los métodos descpptos en la presente documentación, incluyendo, por ejemplo, para tratar un individuo con dolor (incluyendo dolor post-quirurgico, dolor causado por artritis reumática y dolor causado por osteoartptis) Los conjuntos de elementos de esta invención están en envases apropiados, y opcionalmente pueden contener componentes adicionales, tales como amortiguadores e instrucciones, para usar el anticuerpo en cualquiera de los métodos descpptos en la presente documentación En algunas realizaciones, los conjuntos de elementos incluyen instrucciones para tratar el dolor En algunas realizaciones, el conjunto de elementos comprende un anticuerpo antagonista anti-NGF descppto en la presente documentación e instrucciones para tratar y/o prevenir el dolor causado por la artritis reumática en un individuo En otras realizaciones, el conjunto de elementos comprende un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo antagonista anti-NGF) descppto en la presente documentación e instrucciones para tratar y/o prevenir el dolor causado por la osteoartptis en un individuo En algunas de las realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-NGF es el anticuerpo E3 En otro aspecto, en la invención se proveen conjuntos de elementos que comprenden un po nucleótido que codifica un polipeptido E3, como se describe en la presente documentación En 124 algunas realizaciones, los conjuntos de elementos comprenden además instrucciones para usar el polinucleótido en cualquiera de los métodos descriptos en la presente documentación. MÉTODOS PARA AJUSTAR LA AFINIDAD DE UN ANTICUERPO Y MÉTODOS PARA CARACTERIZAR UN CDR Los inventores desarrollaron un nuevo método para caracterizar una CDR de un anticuerpo y/o alterar (tal como mejorar) la afinidad de unión de un polipéptido, como un anticuerpo, denominado "mutagénesis exploradora de biblioteca". Generalmente, la mutagénesis exploradora de biblioteca funciona como sigue. Una o más posiciones en la CDR de un aminoácido se reemplazan con dos o más (tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20) aminoácidos con el uso de métodos conocidos en la materia. Esto genera bibliotecas pequeñas de clones (en algunas realizaciones, una para cada posición de aminoácido que se analiza), cada una con una complejidad de dos o más miembros (si dos o más aminoácidos son sustituidos en cada posición). Generalmente, la biblioteca también incluye un clon que comprende el aminoácido nativo (no sustituido). De cada biblioteca, se estudia la afinidad de unión al polipépfido blanco de un número pequeño de clones, por ejemplo, aproximadamente 20-80 clones (dependiendo de la complejidad de la biblioteca), y se identifican los candidatos con unión elevada, igual, o disminuida. Los métodos para determinar la afinidad de unión son muy conocidos en la materia. En algunas realizaciones, la afinidad de unión se determina con el uso de análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore que detecta diferencias en la afinidad de unión de aproximadamente 2 veces o más. BIAcore es particularmente útil cuando el anticuerpo inicial ya se une con una afinidad relativamente alta, por ejemplo un K de aproximadamente 10 nM o menor. El estudio de tamizaje con el uso de resonancia de plasmón superficial BIAcore se describe aquí en los ejemplos. En otras realizaciones, la afinidad de unión se determina con el uso de Kinexa Biocenso, ensayo de proximidad por centelleo, ELISA, inmunoensayo ORIGEN (IGEN), extinción de fluorescencia, transferencia de fluorescencia, y/o expresión a través de levaduras. En otras realizaciones, se estudia la afinidad de unión con el uso de un bioensayo conveniente. En algunas realizaciones, cada posición de los aminoácidos en una CDR se reemplaza (en algunas realizaciones, uno por vez) con los 20 aminoácidos naturales con el uso de métodos de 125 mutagénesis conocidos en la materia (algunos de los cuales se describen aquí). Esto genera bibliotecas pequeñas de clones (en algunas realizaciones, una para cada posición del aminoácido que se analiza), cada una con una complejidad de 20 miembros (si todos los 20 aminoácidos son sustituidos en cada posición). En algunas realizaciones, la biblioteca que se va a estudiar comprende las sustituciones en dos o más posiciones que pueden estar en el mismo CDR o en dos o más CDR. Así, en algunas realizaciones, la biblioteca comprende las sustituciones en dos o más posiciones en un CDR. En otras realizaciones, la biblioteca comprende la sustitución de dos o más posiciones en dos o más CDR. Aun en otras realizaciones, la biblioteca comprende la sustitución en 3, 4, 5, o más posiciones, tales posiciones encontradas en dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. En algunas realizaciones, la sustitución se prepara con el uso de codones de baja redundancia. Véase, por ejemplo, Tabla 2 de Balint et al., (1993) Gene 137(1 ):109-18. En algunas realizaciones, la CDR es CDRH3 y/o CDRL3. En otras realizaciones, la CDR es uno o más de CDRL1 , CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, y/o CDRH3. En algunas realizaciones, la CDR es una CDR Kabat, una CDR Chothia, o una CDR extendido. Se pueden secuenciar candidatos con unión mejorada, de esta manera identificar una sustitución mutante en una CDR que resulte en una afinidad mejorada (también llamada una sustitución "mejorada"). Por ejemplo, como se demostró en el Ejemplo 1 , el uso de este método permitió la identificación de una única sustitución que mejoró la unión, incluso cuando estimativamente otras 18 sustituciones en la misma posición del aminoácido resultaran en la no unión (es decir, pérdida de la función del anticuerpo). Los candidatos que se unen, se pueden secuenciar, por lo tanto se puede identificar una sustitución en la CDR que conserve la unión. En algunas realizaciones, se realizan procedimientos múltiples de estudio de tamizaje. Por ejemplo, los candidatos (cada uno comprendiendo una sustitución de un aminoácido en una o más posiciones de uno o más CDR) con unión mejorada, son útiles también para el desarrollo de una segunda biblioteca que contenga al menos el aminoácido original y el sustituido en cada posición mejorada de la CDR (por ejemplo, una posición de aminoácido en la CDR en la cual una 126 sustitución mutante muestre una unión mejorada) Mas adelante se describe la preparación, y el estudio de tamizaje o selección de esta biblioteca La mutagenesis exploradora de biblioteca también provee una manera para caracterizar una CDR, en tanto que la frecuencia de clones con unión mejorada, la misma unión, unión disminuida o sin unión también provee información relacionada a la importancia de cada posición de aminoácido para la estabilidad del complejo antigeno-anticuerpo Por ejemplo, si una posición de la CDR retiene la unión, cuando se sustituyo por todos los 20 aminoácidos, tal posición se identifica como una posición que improbablemente sea requerida para la unión del antigeno Reciprocamente, si una posición de CDR retiene la unión en sólo un porcentaje pequeño de sustituciones, la posición se identifica como una posición que es importante para la función de la CDR Asi, la mutagenesis de exploración de biblioteca genera información respecto de las posiciones en los CDR que pueden cambiarse a muchos aminoácidos diferentes (incluyendo todos los 20 aminoácidos), y las posiciones en las CDR que no pueden cambiarse o que sólo pueden cambiarse a unos pocos aminoácidos Este aspecto se discute y se ejemplifica en el Ejemplo 1 En algunas realizaciones se combinan candidatos con la afinidad mejorada en una segunda biblioteca que incluye el aminoácido mejorado, el aminoácido original de esa posición, y que ademas puede incluir las sustituciones adicionales en esa posición, dependiendo de la complejidad de la biblioteca que se desea, o que se permite con el uso del método de estudio de tamizaje o selección deseado Ademas, si se lo desea, la posición del aminoácido adyacente se puede cambiar al azar a por lo menos dos o mas aminoácidos El cambio aleatorio de aminoácidos adyacentes puede permitir flexibilidad conformacional en la CDR mutante que, puede a su vez, permitir o facilitar la introducción de un numero mas grande de mutaciones mejoradas En algunas realizaciones, la biblioteca también comprende la sustitución de posiciones que no mostraron mejora en la afinidad en la primera rueda de estudio de tamizaje En la segunda biblioteca se tamizan o seleccionan los miembros de la biblioteca con mejora y/o alteración de la afinidad de unión, con el uso de cualquier método conocido en la materia, incluso con el estudio de tamizaje que usa el análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore, y la selección que usa cualquier método de selección conocido en la materia, incluso la 127 expresión a través de fagos, expresión a través de levaduras, y expresión a través de ribosomas.

Ventajas de los métodos para ajustar la afinidad de un anticuerpo y caracterizar un CDR Los métodos son útiles para pre-estudiar posiciones de aminoácidos de la CDR con el objeto de identificar sustituciones del aminoácido que mejoren la unión o conserven la unión. La pre-identificación de residuos importantes, sustitución que mejore la unión y/o sustituciones que conserven la función del anticuerpo, permiten el diseño eficiente y el estudio de una biblioteca de maduración de afinidad. El presente método también es útil para caracterizar una CDR, y brinda información comprensiva respecto de la importancia de cada posición del aminoácido en una CDR para la unión al antígeno. El presente método también se puede usar para identificar sustituciones que mejoren la unión. El uso de bibliotecas pequeñas en que cada posición puede alterarse al azar (en algunas realizaciones, una por vez), lo que permite el estudio de tamizaje de mutantes de sustitución con el uso de métodos sensibles, como BIAcore, el que proporciona información cinética detallada. Los métodos de estudio de tamizaje son generalmente poco prácticos cuando se estudian bibliotecas más grandes. En cambio, los métodos de selección, como la expresión a través de fagos, expresión a través de levaduras y la expresión a través de ribosomas, normalmente se utilizan para identificar clones que conservan la unión. La expresión a través de fagos y los ensayos de ELISA pueden depender mucho de la concentración de la muestra de proteínas preparada a partir del clon, y así tender a ser altamente sesgadas hacia clones que han aumentado la expresión, aumentado la estabilidad, o disminuido la toxicidad, en lugar de identificar los clones con la afinidad de unión aumentada. Además, las diferencias en el nivel de expresión de los clones pueden enmascarar las pequeñas mejoras en la afinidad de unión. Estas desventajas son particularmente agudas cuando un anticuerpo con alta afinidad de unión se utiliza como material de partida, porque deben utilizarse niveles muy bajos de antígeno para que el estudio de tamizaje sea suficientemente estricto. 128 Por el contrario, los métodos de la invención, como la alteración al azar en cada posición (en algunas realizaciones, una posición por vez), permiten la introducción y caracterización del efecto de la sustitución de, por ejemplo, todos los 20 aminoácidos en una dada posición Este análisis proporciona la información acerca de cuantas sustituciones se toleran (o sea, unión de anticuerpo conservada) en una posición dada, lo que a su vez provee información relacionada a cada aminoácido para la función del anticuerpo Además, pueden identificarse sustituciones que resultan en una mejora de la unión, incluso bajo las circunstancias en que muchas o la mayoría de las sustituciones en una dada posición resulten en anticuerpos no funcionales (no ligadores) Por el contrario, la mutagénesis exploradora con alanina que comúnmente se utiliza para identificar posiciones importantes en la CDR, proporciona información relacionada a si la sustitución de alanina permite o previene la unión Generalmente, las posiciones en las cuales la sustitución por alanina previene la unión, se quitan de la biblioteca de maduración de afinidad. En muchos casos, sin embargo, la alanina puede ser un sustituto débil en la posición de la CDR Los métodos presentes también permiten la identificación y caracterización del efecto de mutaciones únicas en la CDR Por el contrario, los métodos como la expresión a través de fagos introducen y seleccionan muchas mutaciones simultáneamente, y esto incrementa potencialmente el nesgo de que las mutaciones positivas se enmascaren por la presencia de una mutación perjudicial en un clon particular Los métodos presentes también son útiles para mejorar la afinidad, mientras se conserva la especificidad de unión del anticuerpo original (inicial), en la medida en que los métodos presentes permitan la identificación de números pequeños de mutaciones (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4 ó 5 mutaciones en una única CDR) que resulten en una afinidad de unión mejorada Por el contrario, los métodos como la expresión a través de fagos típicamente mejoran la afinidad de unión con el uso de mutaciones múltiples por vez, lo cual puede resultar en un cambio de especificidad del anticuerpo y/o aumento no deseado de la reactividad cruzada Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la invención EJEMPLOS 129 Ejemplo 1 Humanización y maduración de afinidad de anticuerpos antagonistas anti-NGF 911 de ratón A Métodos generales Los siguientes métodos generales se utilizaron en este ejemplo Generación de la biblioteca Las bibliotecas se generaron por mutagénesis en cassette por PCR con oligonucleótidos degenerados como el que se describe en Kay et al (1996), Phage displav of peptides and proteins a laboratory manual, San Diego, Academic Press (véase, paginas 277-291) El doping de codones NNK se utilizo para aleatopzar una posición aminoacídica para incluir 20 posibles aminoácidos Para aleatopzar una posición de un aminoácido, para incluir sólo un subgrupo de aminoácidos con las propiedades especificas, el doping de codones se utilizó como se describe en Balint et al, (1993) Gene 137(1 ) 109-18 La mutagénesis dirigida de un sitio se realizó con el uso de PCR recombinante como se describe en Innis et al, (1990) PCR protocols- A guide to methods and applications (véase, páginas 177-183) Preparación de Fab en baja escala Se optimizo la expresión en baja escala en placas de 96 fosas para el estudio de tamizaje de las bibliotecas de Fab Comenzando desde colonias de E coll transformadas con una biblioteca de Fab, se repicaron colonias para inocular una placa principal (agar LB + Ampicihna (50 µg/ml) + 2% Glucosa) y una placa de trabajo (2 ml/fosa, 96 fosas/placa que contienen 1,5 ml de LB + Ampicilina (50 µg/ml) + 2% Glucosa) Ambas placas se hicieron crecer a 30°C durante 8-12 horas La placa principal se almaceno a 4°C y las células de la placa de trabajo se recogieron a 5000 rpm y se resuspendieron con 1 ml de LB +Amp?c?l?na (50 µg/ml) + 1 mM IPTG para inducir la expresión de Fabs Luego de un tiempo de expresión de 5 h a 30°C, las células se separaron por centrifugación, luego se resuspendieron en 500 µL de HBS-EP (100 mM HEPES buffer pH 7,4, 150 mM de NaCI, 0,005% de P20, 3 mM de EDTA) Se logró la lisis de las células resuspendidas en HBS-EP mediante un ciclo de congelamiento (-80°C) y posterior descongelamiento a 37°C Se centrifugaron los lisados celulares a 5000 rpm durante 30 mm para separar los restos celulares de sobrenadantes que contenían Fabs Luego se inyectaron los sobrenadantes en el aparato de 130 resonancia de plasmón superficial BIAcore para obtener la información de afinidad para cada Fab. Se rescataron los clones que expresaron Fabs de la placa principal para secuenciar el ADN y para producir Fab a gran escala y para su caracterización detallada como se describirá más adelante.

Preparación de Fab en gran escala Para obtener los parámetros cinéticos detallados, se expresaron y se purificaron Fabs de grandes cultivos. Se inocularon frascos Erlenmeyer que contenían 200 ml de LB + Ampicilina (50 µg/ml) + 2% Glucosa con 5 ml de cultivo de una noche de un clon de E. coli seleccionado por la expresión de un Fab. Se incubaron los clones a 30°C hasta que se obtuvo una OD550nm de 1,0 y luego se indujo reemplazando el medio por 200 ml, de LB + Ampicilina (50 µg/ml) + 1 mM de IPTG. Luego de un tiempo de expresión de 5h a 30°C, las células se recogieron por centrifugación, luego se resuspendieron en 10 ml PBS (pH 8). La lisis de las células se obtuvo por dos ciclos de congelamiento/descongelamiento (a -80°C y 37°C, respectivamente). Se cargaron los sobrenadantes de los lisados celulares sobre columnas de sefarosa de alto flujo Ni-NTA (Qiagen, Valencia. CA) equilibradas con PBS, pH 8, luego se lavaron con 5 volúmenes de columna de PBS, pH 8. Los Fabs individuales se eluyeron en diferentes fracciones con PBS (pH 8) + 300 mM de Imidazol. Las fracciones que contenían los Fabs se mezclaron y se dializaron en PBS, luego se cuantíficaron por ELISA, previo a la caracterización de la afinidad. Preparación del anticuerpo completo Para la expresión de anticuerpos completos, se clonaron las regiones variables de la cadena pesada y liviana en dos vectores de expresión en mamíferos (Eb.911.E3 o Eb.pur.911.3E para la cadena liviana y Db.911.3E para la cadena pesada; descriptos aquí) y se transfectaron, con el uso de lipofectamina, en células HEK 293, para la expresión transitoria. Se purificaron los anticuerpos por medio de métodos estándares con el uso de proteína A. Ensayo Biacore Se determinaron las afinidades de los Fabs anti-NGF y anticuerpos monoclonales con el uso del sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore3000™ (SPR) (BIAcore, INC, Piscaway NJ). Se activaron las superficies de inmovilización CM5 con clorhidrato de N-etil-N'-(3- 131 d?met?lam?noprop?l)-carbod??m?da (EDC) y N-hidroxisuccimmida (NHS) según las instrucciones del fabricante Se diluyó NGF humano en acetato de sodio 10 mM a pH 4,0 y se inyectó con una concentración de 0,005 mg/ml sobre la superficie de inmovilización activada Se lograron dos rangos de densidad del antígeno con el uso de tiempos variables de flujo a través de los canales individuales de cada superficie de inmovilización, 100-200 unidades de respuesta (RU) para los estudios cinéticos detallados y 500-600 RU para los ensayos de tamizaje La superficie de inmovilización se bloqueo con etanolamina Los estudios de regeneración mostraron que una mezcla de elusion Pierce (Producto No 21004, Pierce Biotechnology, Rockfod, IL) y 4 M de NaCI (2 1 ) removieron eficazmente el Fab unido, mientras que la actividad de hNGF en la superficie de inmovilización se conservo por mas de 200 inyecciones Se utilizó buffer HBS-EP (0,01 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 M de NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005% de Surfactante P29) como buffer de corrida para todos los ensayos BIAcore Ensayos de estudio de tamizaje Se optimizo el ensayo de tamizaje BIAcore para determinar la afinidad de los clones Fab de las bibliotecas Se inyectaron a razón de 50 µl/mín durante 2 min los sobrenadantes de lisados de pequeños cultivos Para determinar la velocidad de disociación exponencial simple (koff) se utilizaron tiempos de disociación de entre 10 y 15 minutos, con el uso del programa BIAevaluation Las muestras que mostraron velocidades koff en el mismo rango que los moldes utilizados para crear la biblioteca (clon 8L2-6D5, koff 1x10'3 s"1) se inyectaron para la confirmación y se permitieron tiempos de disociación de hasta 45 mm para obtener mejores valores de koff Se expresaron a gran escala los clones que mostraron mejoras en los valores de koff (más lentos) y se determinaron los parámetros cinéticos completos, kon y k0ff en el purificado proteico El ensayo fue capaz de detectar diferencias en la afinidad que fueran de aproximadamente 2 veces mayor o más Ensayos de determinación de afinidad Se inyectaron diluciones senadas (KD estimado 0,1 -10x) de muestras de Fab purificadas durante 1 min a 100 µL/mm y se permitieron tiempos de disociación de hasta 2 h Se determinó la concentración de proteínas de Fab por ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE con el uso de un Fab de concentración conocida como estándar (determinado por análisis de aminoácidos) Se 132 obtuvieron simultáneamente las velocidades de asociación cinética (kon) y las velocidades de disociación (koff) por ajuste de los datos a un modelo de unión Langmuír 1 :1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) con el uso del programa BIAevaluation. Se calcularon los valores de la constante de equilibrio de disociación (K ) como k0ff/kon. B, Humanización y maduración de afinidad de anticuerpos antagonistas anti-NGF 911 de ratón Se seleccionó el anticuerpo antagonista anti-NGF de ratón, 911 (véase Hongo et al, (2000) Hybridoma 19(3):215-227) para la humanización y maduración de afinidad. Mab 911 se une a NGF humano y de rata con alta afinidad y no exhibe ninguna reactividad cruzada significativa con los neutrófilos NT3, NT4/5 o BDNF. Véase Hongo, id. La afinidad del fragmento Fab del Mab 911 de ratón olivado por papaína se determinó con el uso del análisis BIAcore como se describe anteriormente. El fragmento Fab del Mab 911 de ratón clivado con papaína une NGF humano con un KD de aproximadamente 10 nM. Se realizó la humanización y maduración de la afinidad en varios pasos, como sigue: (1 ) Preparación del molde de CDR-injertado. Se injertó la cadena liviana extendida de CDR del anticuerpo 911 (o sea, incluyendo ambas regiones de la CDR Kabat y Chothia) dentro de las secuencias aceptoras 08 con JK2 de la línea germinal humana, y la cadena pesada extendida de CDR del anticuerpo 911 se inyectó en la secuencia aceptora VH4-59 con JH4 de la línea germinal humana. En la figura 1A y 1B se muestran las secuencias de aminoácidos de las secuencias aceptoras de la línea germinal humana. La numeración de aminoácidos es secuencial. Con el uso de los marcos de lectura de la proteína detallada con anterioridad, se diseñaron las secuencias de ADN para genes sintéticos que codifiquen para marcos de lectura humanos con CDR murinos. Estos dominios variables pesados y livianos humanizados se denominaron hVH y hVL respectivamente. Se optimizaron los codones para el uso en E. coli y hámster. Se utilizaron varios oligonucleótidos solapados (69-90 bases de longitud) que se extendían a lo largo de todo el hVL y hVH con dos cebadores flanqueantes cortos para cada cadena para sintetizar separadamente los dos genes mediante PCR recurrente esencialmente como se describe en Prodromou et al, (1992) 133 Protein Eng 5(8) 827-9 Los fragmentos de ADN resultantes de longitud correcta se purificaron en gel y luego se clonaron en un plasmido de expresión bicistrónico de E coll (resistente a ampici na) La expresión de los anticuerpos estuvo bajo el control de un promotor lacZ inducible por IPTG similar al que se describe en Barbas (2001) Phage display a laboratoy manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratoy Press (véase Vector pComb3X, en página 2 10), sin embargo, las modificaciones incluyeron la adición y expresión de los siguientes dominios adicionales dominio constante de la cadena liviana Kappa humana (véase No de acceso al GenBank CAA09181) y el dominio constante CH1 de la inmuglobulma humana lgG2a (N° de acceso al GenBank P01859) Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo CDR-injertado (también denominado "molde"), denominado 8L2-4D5, también se muestran en las Figuras 1A y 1B La afinidad del 8L2-4D5 se determino con el uso del análisis BIAcore como se describió previamente El 8L2-4D5 se une al NGF humano con un KD de aproximadamente 38 nM (2) Introducción de una mutación puntual en la secuencia del marco de lectura Se introdujo la sustitución V71K en la cadena pesada de la CDR-mjertada con el uso de mutagénesis sitio dirigida por PCR recombinante como se describe en Innis et al, (1995) PCR strateqies. San Diego, Academic Press Esta sustitución reemplaza el residuo del marco de lectura humano por el correspondiente residuo del marco de lectura de ratón El anticuerpo resultante se denominó 8L2- 6D5, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 8L2-6D5 se muestra en Figura 1 A Se determino la afinidad de 8L2-6D5 con el uso de análisis BIAcore como se describió previamente Los fragmentos Fab de 8L2-6D5 unen NGF humano con un KD de aproximadamente 15 nM Se escogió 8L2-6D5 como molde para la maduración de afinidad (3) Humanización y maduración de afinidad de CDR L1 , L2, H1 y H2 Se sometieron los CDR L1 , L2, H1 y H2 a la humanización y maduración de afinidad Se identificaron las posiciones de aminoácidos en los CDR L1 , L2, H1 , y H2 que no son esenciales para la estructura de las CDR basado en la estructura canónica de Chothia (véase Al-Lazikapi et al (1997) J Mol Biol 273(4) 927-48), y se sometieron a alteración al azar como sigue Se prepararon dos bibliotecas que contenían las mutaciones de la cadena liviana o las mutaciones de la cadena pesada mostradas en 134 la Tabla 2, y las CDR L3 o CDR H3 unidas (ratón), respectivamente, con el uso de mutagénesis en cassette por PCR con oligonucleótidos degenerados como se describe en Kay et al. (1996), Phage display of peptides and proteins: a laboratoy manual, San Diego, Academíc Press, con el uso de doping de codones como se describe en Balint et al, (1993) Gene 137(1 ):109-18). Generalmente, los residuos de los aminoácidos se cambiaron por residuos que son más comunes en los anticuerpos humanos, basado en los alineamientos de la cadena liviana del anficuerpo 911 y en las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada con las secuencias de anticuerpo de la línea germinal humana. El residuo aminoacídíco salvaje (no sustituido) también estaba representado en la biblioteca, con la excepción del residuo 50 de la CDR H2, una metionina, en el cual la metionina salvaje no estaba representada en la biblioteca. Los residuos de metionina se sometieron a oxidación; se esperaba así que el reemplazo de ese residuo mejorara la estabilidad del anticuerpo resultante. Se clonaron las bibliotecas de Fabs en el vector pComb3X más el CH1 humano y las regiones CK, como se describió previamente. Tabla 2: 1. Biblioteca de la cadena pesada H1/H2; CDR-H1 I34 se cambió por F, L, V, S, P, T, A, o I N35 se cambió por N, T, S, o Y CDR-H2 M50 se cambió por todos los 20 aminoácidos naturales A62 se cambió por A o S L63 se cambió por L o V 2. Biblioteca de la cadena liviana L1/L2 CDR-L1 S26 se cambió por S, A, V, o F D28 se cambió por D, A, S, o Y H32 se cambió por H, N, K, D, E, Q, o Y CDR-L2 135 Y50 se cambió por Y, D, A, o S 151 se cambió por I, T, A, o V F54 se cambió por F o L S56 se cambió por S y T Para los experimentos de estudios de tamizaje de afinidad, cada biblioteca se apareó con la correspondiente cadena liviana o pesada de la CDR-injertada (por ejemplo, la biblioteca H1/H2 se apareó con la cadena liviana de CDR-injertada), el anticuerpo se expresó, y se estudió por tamizaje la afinidad por NGF humano de los clones individuales con el uso del sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ) según las instrucciones del fabricante y como se describió previamente. Se determinaron los koff, kon y KD. Se clasificaron los clones del anticuerpo en base en las velocidades de kof , ya que generalmente se observa más variación en la afinidad del koff, y más aún porque las velocidades de koff son independientes de la concentración del anticuerpo. Se determinó la secuencia de los clones que unieron, y en la Tabla 3 se muestran las secuencias de los clones que unieron. Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de L1 y L2, secuencias de aminoácidos de H1 y H2, y los datos cinéticos de los clones que unen luego del estudio de afinidad de los clones de la biblioteca H1/H2 o L1/L2. 136 137 AA en negrita se alteró al azar como se indicó previamente *KD se calculó con el uso de kon 4e4 M"1s'1 "Por conveniencia, "e" como se utiliza aquí, indica "x10." Así, 4e4 indistintamente significa 4x10* Las CDR que contienen las siguientes sustituciones conservaron la unión: CDR-H1 I34: S, L, V, l y A unidos. N35: N, T y S unidos. CDR-H2 M50: M, I, G, Q, S, L unidos. A62: A y S unidos. L63: L y V unidos. CDR-L1 S26: S, y F unidos. D28: D, S, A, Y unidos. H32: H, N, Q unidos. CDR-L2 Y50: Y unido. 138 151 I, T, V, A, unidos F54: F unido. S56: S y T unidos Se seleccionaron las CDR que contienen las siguientes sustituciones generalmente sobre la base de la afinidad de unión, y se combinaron en un solo clon, denominado H19-L129: CDR-H1: I34L; N35N (sin cambio) CDR-H2: M50I; A62A (sin cambio); L63V CDR-L1 : S26S (sin cambio); D28S; H32N CDR-L2: Y50Y (sin cambio); 151 T; F54F (sin cambio); S56S (sin cambio) Estas mutaciones se combinaron (por amplificación por PCR de las cadenas H y L, por corte de los productos de PCR y el vector (pRN8) con la enzima de restricción y por realización de una ligazón de 3 fragmentos) en un solo clon, denominado H19-L129, que también incluyó el H3 unido y las CDR de L3. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesadas y de las cadenas livianas de H19-L129 se muestran en las Figuras 1A y 1B, y la Tabla 4 muestra las secuencias de aminoácidos de las CDR L1 , L2, H1 y H2. H19-L129 se unió a NGF con un KD de aproximadamente 1 nM, como se determinó con el uso de análisis por BIAcore como se describe aqui Tabla 4: Secuencia de aminoácidos de las CDR H1, H2, L1 y L2 y datos cinéticos para el clon combinado H19-L129. D 5 139 *KD se calculó con el uso de kon 4e4 M s (4) Maduración de afinidad de las CDR H3 y L3 La maduración de afinidad de las CDR H3 y L3 se llevo a cabo en dos pasos Primero, en un proceso denominado "mutagénesis exploradora de biblioteca", cada residuo de aminoácido en H3 y L3 se pre-estudió por tamizaje individual, con el fin de identificar posiciones de aminoácidos en los que una mutación producía el incremento de la afinidad de unión a NGF humano Sobre la base de los resultados de la mutagénesis exploradora de biblioteca (también denominada "análisis de alteración al azar de biblioteca pequeña"), se selecciono un subconjunto de posiciones de aminoácido en H3 y L3 para la preparación de la biblioteca de maduración de afinidad, y se estudió por tamizaje la afinidad por NGF humano de la biblioteca de maduración de afinidad, con el uso del análisis de BIAcore como se describe aquí Se aprecia que estas técnicas se pueden aplicar de manera general (a) Mutagénesis exploradora de biblioteca Cada posición del aminoácido en las CDR H3 y L3 se pre-estudió por tamizaje individual para observar cuales sustituciones producían un incremento de la afinidad de unión a NGF humano La frecuencia de sustituciones de aminoácidos en cualquier posición que resultó en una unión mejorada, la misma unión, peor unión o ninguna unión, proporcionó información relacionada a las posiciones en las CDR que se pueden cambiar por muchos otros aminoácidos diferentes (incluyendo todos los 20 aminoácidos), y posiciones en las CDR que no se pueden cambiar o que solo se pueden cambiar por unos pocos aminoácidos También se identificaron sustituciones de aminoácidos que produjeron el incremento de la afinidad de unión Sobre la base de los resultados de este estudio, se seleccionó un subgrupo de posiciones de aminoácidos en las CDR H3 y L3 para la preparación de una biblioteca de maduración de afinidad Se prepararon las bibliotecas de Fab individuales en que cada aminoácido de las CDR L3 y H3 se aleatopzo a todos los 20 aminoácidos, uno por vez, resultando en vanas bibliotecas pequeñas (5 bibliotecas para la cadena liviana y 13 bibliotecas para la cadena pesada), cada una con una complejidad de 20 posibilidades de aminoácidos en cada posición de aminoácido En 140 todos los casos, el aminoácido nativo (es decir, el no cambiado) se representó en la biblioteca. Las bibliotecas se prepararon por mutagénesís en cassette por PCR con oligonucleótidos degenerados como se describe en Kay et al. (1996), Phage display of Peptides and Proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press, con el uso de doping de codones NNK para aleatorizar la posición de un aminoácido para incluir 20 posibles aminoácidos. El 8L2-6D5 (el anticuerpo CDR injertado, con la mutación V71K en el marco de lectura) sirvió como molde para la construcción de la biblioteca, ya que la menor afinidad del anticuerpo CDR injertado permitió detectar más fácilmente diferencias en la afinidad en mutantes H3 y de L3 durante el estudio. Así, cada miembro de una biblioteca tuvo una CDR3 (tanto H3 o L3) con una sustitución de un aminoácido, y 5 CDR injertadas. Se estudiaron 20-80 clones de cada biblioteca pequeña con el uso del análisis BIAcore como se describe aquí. Se analizó simultáneamente con BIAcore la afinidad de unión a NGF de las muestras en un canal de la superficie de inmovilización de BIAcore, y la presencia de Fab en otro canal de la superficie de inmovilización sensora, por unión a un anficuerpo marcado con cinco histidinas, para detectar la marca de Histidina en el extremo C terminal de la cadena pesada. Los clones que expresaron la proteína se clasificaron según tuviesen la misma afinidad, peor afinidad, mejor afinidad o ninguna unión, con el uso del koff para clasificar: Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla 5. Tabla 5. Los clones que expresaron la proteína se clasificaron según tuviesen la misma afinidad, peor afinidad, mejor afinidad o ninguna unión, basado en el koff. 141 igual Porcentaje de AAs que retienen la capacidad de unión mutación mejor > 1e-3, peor sin unión 1e-3 < 2e-3 < > 2e-3 Cadena liviana L_S91X 13% 40% 20% 26% 50% L_K92X 100% -100% L_T93X 93% 7% 93% L_L94X 40% 60% 40% 10 L_Y96X 13% 80% 7% 13% Cadena pesada H_G98X 50% 37% 13% 50% H_G99X 46% 54% 46% 15 H Y100X 26% 73% 26% H Y101X 6% 12% 82% 6% H_Y102X 7% 25 68% 7% H_G103X 4% 21% 16% 58% 25% 0 Se determinó la secuencia de todos los clones con afinidad mejorada, revelando la frecuencia e identidad de sustituciones de aminoácidos que produjeron el ¡ncremento de afinidad. Además, se seleccionaron de cada biblioteca los clones que conservaron una afinidad similar al clon 8I2-6D5 para determinar las sustituciones de secuencias de aminoácidos que se permitieron en una posición dada, aunque la sustitución no necesariamente aumentara la afinidad de unión. Se resumen los resultados de este análisis en la Tabla 6. Tabla 6. 144 *?D se calculó con el uso de kon 4e4 M' s" Varias mutaciones resultaron con una afinidad de unión incrementada. Por lo menos las siguientes mutaciones resultaron con una afinidad de unión significativamente incrementada si se las compara con el molde 8L2-6D5: (H_Y101W (secuencia de CDR GGYWYGTSYYFDY (SEQ ID N° 46)); H_S105A (secuencia de CDR GGYYYGTAYYFDY (SEQ ID N° 47)); H_S105T (secuencia de CDR GGYYYGTTYYFDY (SEQ ID N° 48)); H_G103A (secuencia de CDR GGYYYATSYYFDY (SEQ ID N° 49); y L_S91 E (secuencia de CDR QQEKTLPYT (SEQ ID N° 50)). Se utilizaron los resultados de este experimento para guiar la selección de posiciones de aminoácidos para la generación de las bibliotecas de maduración de afinidad. Este experimento también proporcionó información respecto de la frecuencia de sustituciones de aminoácidos en cualquier posición que produjese una mejor unión, la misma unión, peor unión o ninguna unión, como se muestra en la Tabla 5. Esta información permitió la identificación de posiciones de aminoácidos en las CDR que podrían ser cambiados por muchos otros aminoácidos (incluyendo todos los 20 aminoácidos), y posiciones en las CDR que podrían ser cambiados por pocos aminoácidos o por muy pocos aminoácidos (en algunas realizaciones, ningún aminoácido). Estos resultados también mostraron sustituciones de aminoácidos que incrementaron la afinidad de unión, (b) Maduración de afinidad 145 Luego, se usaron los resultados del análisis de alteración al azar de la biblioteca pequeña (mencionada previamente) para seleccionar los residuos para la producción de las bibliotecas de H3 y L3 para la maduración de afinidad de las CDR H3 y L3. Se seleccionaron los residuos Y101 y G103 de la CDR H3 y los residuos S91 y K92 de CDR L3 para la producción de las bibliotecas de H3 y L3 para la maduración de afinidad de las CDR H3 y L3. Esta biblioteca combinó al mismo tiempo mutaciones de H3 y L3 en el clon 8L2-6D5 CDR-injertado, y por separado en el historial de H19-L129, y tuvo una diversidad de 80 clones diferentes. La Tabla 7 muestra los residuos de aminoácidos que se seleccionaron para la sustitución y los aminoácidos que se sustituyeron en cada posición. Tabla 7. Residuos de aminoácidos en H3 y L3 que se seleccionaron para sustitución y los aminoácidos que se sustituyeron en cada posición CDR-H3: Y101 se cambió por Y y W, C, (Nótese que C se incluyó porque el uso del codón TRS en un oligonucleótido degenerado también genera el codón C). G103 se cambió por A , P, S, CDR-L3: S91 se cambió por E. K92 se cambió por todos los veinte aminoácidos. A, R, K, y H unió. Cada polipéptido se expresó como un Fab, y se estudió por tamizaje la afinidad por NGF humano de 96 clones individuales de cada biblioteca con el uso del análisis BIACORE según las instrucciones del fabricante y como se describió previamente. Se muestran los resultados de este análisis en Tabla 8. Tabla 8. 146 H_Y101W; H_G103A (secuencia de la CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID N° 52)) L_S91 E; L_K92R 1.0E-4 25 (secuencia de la CDR QQERTLPYT (SEQ ID N° 53)) H_Y101W; H_G103A (secuencia de la CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID N° 54)) Mutaciones combinadas de CDR L3 H3 s-1) KD (nM) (molde H19-L129, H1H2L1 L2 maduro) 1 ,1e-4 L_S91 E; L_K92H 1.2E-5 0,3 (secuencia de la CDR QQEHTLPYT (SEQ ID N° 55)) H_Y101W; H_G103A (secuencia de la CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID N° 56)) (CLON E3) L_S91 E; L_K92S 4.7E-5 1,1 (secuencia de la CDR QQESTLPYT (SEQ ID N° 57)) H_Y101W; H_G103S (secuencia de la CDR GGYWYSTSYYFDY (SEQ ID N° 58)) L_S91E; L_K92K 2.E-5 0,5 (secuencia de la CDR QQEKTLPYT (SEQ ID N° 59)) H_Y101Y; H_G103A (secuencia de la CDR GGYYYATSYYFDY (SEQ ID N° 60)) L_S91 E; L_K92R 1.4E-5 0,35 (secuencia de la CDR QQERTLPYT (SEQ ID N° 61 )) H_Y101W; H_G103A (secuencia de la CDR GGYWYATSYYFDY (SEQ ID N° 62)) (CLON 3C) L S91E; L K92R 1.5E-5 0,37 _ 147 *KD se calculó con el uso de kon 4e4 M s Basado en la afinidad de unión, se seleccionaron los mejores clones, E3 (indistintamente denominado "3E") y 3C, para una caracterización mas extensa En E3 se encontraron las siguientes sustituciones de CDR CDR-H3 Y101W, G103A, y CDR-L3 S91 E, K92H que se combinaron en un solo clon el cual también incluyo las siguientes mutaciones de L1 , L2, H1 y H2, CDR-H1 I34L, CDR-H2 M50I, L63V, CDR-L1 D28S, H32N, CDR-L2 I51T En las Figuras 1A y 1 B se muestran las secuencias de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena liviana de E3 En 3C se encontraron las siguientes sustituciones de CDR CDR-L3 S91 E, K92R, CDRH3 Y101W, G103A que se combinaron en un solo clon, el cual también incluyo las mutaciones de L1 , L2, H1 y H2 que se describieron para el clon 3E Se clonaron las secuencias de 3E y 3C en los vectores de expresión mamíferos para la producción de Fab y del anticuerpo completo, y se expresaron en células HEK293 y se purificaron con el uso de cromatografía en Ni-NTA o con proteina A Las proteínas purificadas se cuantificaron con precisión por medio de análisis de aminoácidos Se midieron las afinidades de unión de los Fabs de E3 y 3C por NGF humano con el uso de análisis con BIAcore según las instrucciones del fabricante y como se describió previamente, solo que se utilizo 100 RU de NGF en la superficie de inmovilización para prevenir un efecto de re- unión Brevemente, se inyectaron vanas concentraciones de anticuerpos (Fabs) durante 2 minutos en una superficie de inmovilización CM5 con 100 RU de NGF humano inmovilizado en ella, y se permitió que se disociara durante 1800 segundos Se analizó el anticuerpo 911 (Fab) de ratón como control Los resultados se analizaron con el uso del programa BIAevaluation según las 148 instrucciones del fabricante Los resultados del análisis de los anticuerpos E3 y 911 se muestran en las Figuras 9 y 10 E3 su unió a NGF humano con un KD de aproximadamente 0,07 nM (y con un kon de aproximadamente 6,0e5 M 1s 1, y un koff de aproximadamente 4.2E-5 s 1) 3C se unió a NGF humano con un KD de aproximadamente 0,35 nM (con un kofí de aproximadamente 1.4E-5) Por el contrario, el anticuerpo 911 de ratón se unió NGF con un KD de 3,7 nM, \.ofí de 8,4x10-5s 1 y kon de 2,2x104M 1s 1 Se selecciono el anticuerpo E3 (indistintamente denominado 3E) para un análisis más extenso basado en la elevada afinidad de unión Para probar la habilidad de E3 de prevenir la interacción de NGF con los receptores de NGF trkA y p75, se premezclaron e incubaron 2,5 nM de NGF humano durante una hora con 0 a 50 nM de anticuerpo E3 (Fab) Luego de la incubación, se inyectaron las muestras a 10 µl/minuto en una superficie de inmovilización CM5 BIAcore que contenía 260 RU de p75 (canal 2) y 600 RU de trkA (canal 3), y se determino el porcentaje de unión Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 11 Se bloqueó la interacción de NGF con ambos, p75 y trka, con concentraciones elevadas de Fab E3, como lo muestra la baja señal (medido en RU), que indica que Fab E3 bloquea la interacción de NGF humano con ambos, trkA y p75 Cuando la concentración del anticuerpo E3 (Fab) se igualó a la concentración de NGF (concentración de NGF de aproximadamente 2,5 nM), no se observó unión a NGF (como lo muestra una señal nula) El hecho que la unión NGF-receptor fuera de cero por ciento cuando la concentración de NGF era igual a la del anticuerpo 3E, sugirió que 2,5 nM de NGF fue al menos diez veces superior que el kD de E3 para NGF y en equilibrio Ejemplo 2 evaluación de la habilidad de NGF de bloqueo de anticuerpos anti-NGF con el uso de ensayos de supervivencia de neuronas trigéminas E13 5 de ratón Se evaluó la habilidad de Fab E3 o del anticuerpo completo E3 para bloquear la actividad de NGF por medio de la medida de la capacidad del anticuerpo para inhibir in vitro la supervivencia NGF-dependiente de las neuronas trigéminas E13 5 de ratón El ganglio trigémino comprende neuronas sensoriales cutáneas que inervan la región facial La supervivencia de las neuronas trigéminas E13 5 de ratón es un ensayo sensible para evaluar la actividad de bloqueo de NGF de anticuerpos antagonistas anti-NGF ya que se requiere NGF para la supervivencia de estas 149 neuronas. Por ejemplo, en concentraciones saturantes de NGF, la supervivencia es cercana al 100% durante 48 horas en cultivo. Por el contrario, menos del 5% de las neuronas sobreviven durante 48 horas en ausencia de NGF. El ensayo de supervivencia se realizó como sigue: se realizó eutanasia por inhalación de C02 de ratones hembra preñadas Swiss Webster de la misma edad. Las trompas uterinas se removieron y se extrajeron los embriones en fase embrionaria E13.5 y se decapitaron. Se disecaron los ganglios trigéminos con el uso de agujas de tungsteno electrolíticamente afiladas. Luego, los ganglios se digirieron con tripsina, se disociaron mecánicamente y se plaquearon con una densidad de 200-300 células por fosa en medio definido libre de suero en placas de 96 fosas recubiertas con poli-L-ornitina y laminina. Se evaluó la actividad de bloqueo de anti-NGF Fabs o anticuerpos por agregado a las neuronas trigéminas de dosis variables de anticuerpos Mab 911 (Fab) anti-NGF, 8L2-6D5; H19-L129; E3 y 3C; y NGF humano o de rata a las siguientes concentraciones: 0,4 ng/ml (-15 pM; esta concentración representó una concentración saturante de NGF para la supervivencia) y 0,04 ng/ml (-1 ,5 pM; esta concentración se encuentra alrededor del IC50). Luego de 48 horas en cultivo, las células se sometieron a un protocolo del inmunohistoquímica automatizado realizado en un equipo de manipulación de líquido Biomek FX (Beckman Coulter) como sigue: fijación con el uso de 4% de formaldehído, 5% de sacarosa, y PBS; permeabilización con el uso de 0,3% de Tritón X-100 en PBS); bloqueo de sitios inespecíficos de unión con el uso de 5% de suero normal de cabra, 0,11% de BSA en PBS; e incubación secuencial con anticuerpos primarios y secundarios para detectar las neuronas. Se utilizó como anticuerpo primario un anticuerpo policlonal de conejo contra el producto 89.5 del gen de la proteína (PGP9.5, Chemicon), un marcador fenotípico neuronal establecido. Como anticuerpo secundario se utilizó Alexa Fluor 488 anti-conejo de cabra (Molecular Probes), junto con el indicador nuclear Hoechst 33342 (Molecular Probes) para marcar los núcleos de todas las células presentes en el cultivo. La adquisición de las imágenes y el análisis de las imágenes se realizó con un Discovery-I/Genll Imager (Universal Imaging Corporation). Las imágenes se adquirieron automáticamente con dos longitudes de onda para Alexa Fluor 488 y Hoechst 33342, con la tinción nuclear utilizada como punto de referencia para el sistema de auto foco del Imager basado en la imagen, ya que la tinción 150 nuclear se haya presente en todas las fosas. Se seleccionaron los objetivos apropiados y el número de imágenes de los sitios visualizados por fosa para cubrir la superficie entera de cada una de las fosas. El análisis automatizado de las imágenes se configuró para contar el número de neuronas presentes en cada fosa luego de 48 horas de cultivo basado en su tinción específica con el anticuerpo anti-PGP9.5. Se realizó un conteo exacto del número de neuronas por fosa por aplicación de un cuidadoso umbral de corte de la imagen y de un filtro de selectividad de morfología e intensidad de fluorescencia. Los resultados de este experimento demostraron que el Fab E3 bloqueó la actividad de NGF con una elevada afinidad. Los resultados se muestran en las Figuras 4-6, y en la Tabla 9. La Figura 4 es un gráfico que muestra supervivencia NGF-dependiente de neuronas E13.5 en presencia de una concentración variable de NGF humano y de rata. La Figura 5 es un gráfico que compara el efecto de bloqueo de NGF de varios Fabs tanto en presencia de 0,04 ng/ml de NGF humano (aproximadamente 1 ,5 pM; que se muestra en el panel inferior) o de 0,4 ng/ml de NGF humano (aproximadamente 15 pM; que se muestra en el panel superior). 1 ,5 pM de NGF fue un valor cercano al EC50 de NGF promotor de la supervivencia, mientras 15 pM representó una concentración saturante de NGF. Se evaluó la supervivencia de neuronas trigéminas E13.5 ratón en varias concentraciones de Fab E3; 911 Fab murino; Fab H19-L129 y Fab 8L2-6D5 como se describió previamente. Se calculó el IC50 (en pM) para cada Fab a cada concentración de NGF, y se los muestra en la Tabla 9. Fab E3 bloqueó fuertemente la supervivencia de neuronas trigéminas NGF humano-dependientes con un IC50 de aproximadamente 21 pM en presencia de 15 pM de NGF humano, y un IC50 de aproximadamente 1 ,2 pM en presencia de 1 ,5 pM de NGF humano. Los Fabs 3C y H19-L129 también bloquearon fuertemente la supervivencia de neuronas trigéminas NGF humano-dependientes. La Figura 6 es un gráfico que compara el efecto de bloqueo del NGF de varios Fabs tanto en presencia de 0,04 ng/ml de NGF de rata (aproximadamente 1,5 pM; que se muestra en el panel inferior) o de 0,4 ng/ml de NGF de rata (aproximadamente 15 pM; que se muestra en el panel superior). 1 ,5 pM de NGF fue un valor cercano al EC50, mientras que 15 pM representó una concentración saturante de NGF. Se evaluó la supervivencia de neuronas trigéminas E13.5 de 151 ratón en varias concentraciones de Fab E3; Fab 911 murino; Fab H19-L129 y 8L2-6D5 como se describió previamente. Se calculó el EC50 (en pM) para cada Fab a cada concentración de NGF, y se los muestra en la Tabla 9. Fab E3 bloqueó fuertemente la supervivencia de neuronas trigéminas NGF humano-dependientes, con un IC50 de aproximadamente 31 ,6 pM en presencia de 15 pM de NGF de rata, y un IC50 de aproximadamente 1 ,3 pM en presencia de 1 ,5 pM NGF de rata. Fabs 3C y H19-L129 también bloquearon fuertemente la supervivencia de neuronas trigéminas NGF- dependientes. Tabla 9: 152 En un experimento diferente, los inventores compararon la habilidad del anticuerpo completo E3 y Fab 3E para inhibir la supervivencia de las neuronas E13.5 NGF-dependientes en presencia de 0,4 ng/ml (concentración saturante) de NGF humano. En la Figura 12 se muestran los resultados del análisis. El anticuerpo completo E3 y Fab 3E mostraron niveles similares de inhibición de supervivencia NGF-dependiente cuando la concentración del anticuerpo completo y Fab se normalizó al número de sitios de unión de NGF (Fab posee un sitio unión y el anticuerpo completo posee dos sitios de unión). Estos resultados demostraron que no había efecto de avidez debido a la unión de un anticuerpo completo al dímero de NGF. En otro experimento, los inventores compararon la habilidad de varias concentraciones (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128, y 0,0 nM) de anficuerpo E3, anticuerpo 911 , y de una inmunoadhesina receptora trkA (que consistía en la fusión del dominio extracelular del receptor trkA de NGF con el dominio Fc de inmunoglobulinas, CH2-CH3) para inhibir la supervivencia de neuronas E13.5 NGF-dependientes en presencia de 0,4 ng/ml (condiciones saturantes). En la Figura 13 se muestran estos resultados. Estos resultados demostraron que el anticuerpo E3 bloqueó a NGF mejor que el anticuerpo 911 o la inmunoadhesina trkA. Ejemplo 3: Evaluación de la especificidad del anticuerpo E3 antí-NGF con el uso de ensayos de supervivencia de neuronas trigéminas y nodosas de ratón Se evaluó la habilidad del anticuerpo E3 para bloquear específicamente la actividad de NGF por medio de la capacidad del anticuerpo para inhibir la supervivencia in vitro de neuronas trigéminas E17/18 de ratón en presencia de concentraciones saturantes de NGF, de neurotrofina NT3 NGF-relacionada, o del factor neurotrófico NGF-no relacionado, proteína estimulante de macr?fagos (MSP). La supervivencia de neuronas trigéminas E17/18 de ratón es un ensayo sensible para evaluar la actividad de bloqueo de NGF de anticuerpos antagonistas antí-NGF ya que se requiere NGF en concentraciones más altas para la supervivencia de estas neuronas que el nivel de NGF requerido para la supervivencia de las neuronas TG E13.5. La supervivencia de estas neuronas también requiere NT3 o MSP; por consiguiente, la supervivencia de estas neuronas también es un ensayo sensible para evaluar si el anticuerpo antagonista anti-NGF también bloqueó a NT3 o MSP. 153 Se evaluó también la habilidad del anticuerpo E3 para bloquear específicamente la actividad de NGF por medio de la capacidad del anticuerpo para inhibir la supervivencia de neuronas nodosas E17 de ratón en presencia de concentraciones saturantes de BDNF o NT4/5. La supervivencia de neuronas nodosas requiere BDNF o NT4/5; por consiguiente, la supervivencia de estas neuronas es un ensayo sensible para evaluar la habilidad de bloqueo de BDNF o NT4/5 del anficuerpo antagonista anti-NGF. El ensayo de supervivencia se realizó como sigue: se realizó eutanasia por inhalación de C02 de ratones hembra preñadas Swiss Webster de la misma edad. Las trompas uterinas se removieron y se extrajeron los embriones (al día embrionario 17 ó 18) y se decapitaron. Se disecaron y se limpiaron los ganglios trigéminos y nodosos. Luego, los ganglios se digirieron con tripsina, se disociaron mecánicamente y se plaquearon con una densidad de 100-300 células por fosa en medio definido libre de suero en placas de 4 fosas (Greiner) recubiertas con poli-L-ornitina y laminina. Se hicieron crecer neuronas trigéminas E 17/18 tanto sin factores neurotróficos agregados (control negativo) o en presencia de concentraciones saturantes de NGF humano (400 pM y 15 pM) (control positivo); de NT3 (400 pM); o de MSP (600 pM). Se prepararon cultivos por duplicado con concentraciones variables de los Fabs E3 y 911 y anticuerpos completos. Se indicó la concentración de Fab y de los anticuerpos completos por sitio de unión (por ejemplo, un anticuerpo completo contiene un sitio de unión, mientras que un Fab contiene un sitio de unión). Se hicieron crecer neuronas nodosas E17 en ausencia de factores neurotróficos agregados (control negativo), o con concentraciones saturantes de BDNF (400 pM) (control positivo) o NT4/5 (400 pM) o el factor de crecimiento NGF no relacionado ILF (factor inhibidor de interleuquinas). Se utilizaron concentraciones elevadas de neurotrofinas, ya que el objetivo de este experimento fue probar la especificidad de los anticuerpos. Se realizaron cultivos por duplicado variando nuevamente con y sin el agregado de anticuerpos E3 y 911. El número total de neuronas que sobrevivieron en cada fosa, luego de 48 horas en cultivo bajo cada condición, se determinó por conteo manual con el uso de un microscopio de contraste de fase. 154 Los resultados de estos experimentos demostraron que los anticuerpos E3 y 911 bloquearon completamente los efectos promotores de supervivencia de NGF en neuronas trigéminas E18. Por el contrario, los anticuerpos E3 y 911 no tuvieron efecto en la supervivencia de neuronas trigéminas promovidas por NT3 o MSP, o en la supervivencia de neuronas nodosas promovidas por BDNF o NT4/5 o LIF. Estos resultados demostraron que el anticuerpo E3 tuvo especificidad selectiva por NGF, ya que no se detectó ninguna interacción entre estos anticuerpos y otras neurotrofinas NGF relacionadas (NT3, NT4/5, BDNF) en concentración 1000-veces a 10000-veces superior que la concentración eficaz para el bloqueo de NGF. Además, estos resultados demostraron que la muerte de neuronas NGF-dependientes observada en cultivos NGF-suplementados con la adición de anticuerpo o Fab E3 era debida a una interacción específica entre estos anticuerpos y NGF, y no era debida a un efecto tóxico generalizado. También se ensayó el anticuerpo 911 antagonista anti-NGF de ratón, y se observaron resultados similares. Nótese que debido a las elevadas concentraciones de neurotrofinas utilizadas, ambos anficuerpos E3 y 911 se encuentran muy cerca de las condiciones de titulación y se esperó que unieran NGF a niveles similares ya que las diferencias en la afinidad de unión de estos anticuerpos a NGF deberían ser menos evidentes bajo estas condiciones. En las figuras 14, 15, 16, y 17 se muestran los resultados de estos experimentos. Los datos mostraron que la supervivencia porcentual media luego de 48 horas en cultivo (± error estándar de la media, n=3 para cada punto de los datos) relativa a la supervivencia observada en el control positivo para cada experimento (por ejemplo, 100% de supervivencia de neuronas trigéminas crecidas en presencia de concentraciones saturantes de NGF, y 100 % de supervivencia de neuronas nodosas crecidas en presencia de concentraciones saturantes de BDNF, respectivamente). Las Figuras 14-15 son gráficos que muestran que el anticuerpo E3 antagonista anti-NGF o el Fab E3 no inhibieron la supervivencia promovida por NT3, y MSP, incluso a concentraciones de anticuerpo tan altas como 200 nM. Por el contrario, 20 nM de anticuerpo E3 o Fab 3E y Fab 911 bloquearon totalmente la supervivencia conducida por NGF. También se ensayó el anticuerpo 911 antagonista anti-NGF de ratón, y se observaron resultados similares. Específicamente, la Figura 14 es un gráfico que muestra la comparación del efecto de 155 vanas concentraciones (20 nM, 2 nM, o 0,2 nM) de Fab de E3 (denominado "3E" en la figura) y de Fab del anticuerpo 911 de ratón en la supervivencia de neuronas trigéminas E18 en presencia de ninguna neurotrofina agregada (denominado "control"), de 400 pM de NGF (denominado "NGF-400pM"), de 10 nM de NT3 (denominado "NT3-10nM") o de 600 pM de MSP (denominado "MSP-600 pM") La Figura 15 es un gráfico que describe la comparación del efecto de vanas concentraciones (200 nM y 80 nM) de Fab E3 y del anticuerpo 911 completo de ratón y del Fab en la supervivencia de neuronas trigéminas E17 en presencia de ninguna neurotrofina agregada (denominado "ningún factor"), de 400 pM de NGF (denominado "NGF-400pM"), de 10 nM de NT3 (denominado "NT3-10nM") o de 600 pM de MSP (denominado "MSP-600pM") Las Figuras 16-17 son gráficos que muestran que el anticuerpo E3 antagonista anti-NGF o el Fab E3 no inhibieron la supervivencia de neuronas nodosas E17 promovidas por BDNF, NT4/5 o LIF También se ensayó el anticuerpo 911 antagonista anti-NGF de ratón, y se observaron resultados similares Específicamente, la Figura 16 es un gráfico que muestra la comparación del efecto de vanas concentraciones (200 nM u 80 nM) de anticuerpo completo E3 (denominado "3E en la figura"), Fab E3, anticuerpo 911 completo, o Fab 911 en la supervivencia de neuronas nodosas E17 en presencia de ninguna neurotrofina agregada (denominado "ningún factor"), 400 pM de BDNF (denominado "BDNF-400pM"), 400 pM de NT4/5 (denominado "NT4/5-400pM"), o 2,5 nM de LIF (denominado "LIF-2,5 nM") La Figura 17 es un gráfico que muestra la comparación del efecto de vanas concentraciones (200 nM, 20 nM, 2nM) de Fab E3 (denominado "3E en la figura"), o Fab 911 en la supervivencia de neuronas nodosas E17 en presencia de ninguna neurotrofina agregada (denominado "control"), de 400 pM de BDNF (denominado "BDNF-400pM"), de 400 pM de NT4/5 (denominado "NT4/5-400pM"), o 2,5 NM de LIF (denominado "LIF-2,5 nM) Ejemplo 5 Preparación de vectores mamíferos de expresión y expresión del anticuerpo E3 en células de mamífero Se diseñaron y construyeron tres vectores de expresión en mamíferos para el uso en la expresión del anticuerpo E3 en células de mamífero El vector Db 911 3E es un vector de expresión que comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo E3 y la región constante de la lgG2a humana, y es conveniente para 156 la expresión transitoria o estable de la cadena pesada. Db.911.3E posee secuencias de nucleótidos que se corresponden con las siguientes regiones: región promotora del citomegalovirus murino (nucleótidos 1-612); un intrón sintético (nucleófidos 619-1507); la región codificante del DHFR (nucleótidos 707-1267); péptido señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1525-1602); región variable de la cadena pesada del anticuerpo 3E (nucleótidos 1603-1965); región constante de la cadena pesada de lgG2a humana que contiene las siguientes mutaciones A330P331 a S330S331 (numeración aminoacídica en referencia a la secuencia salvaje de lgG2a véase Eur. J. ImMunol. (1999) 29:2613-2624); señal tardía de poliadenilación SV40 (nucleótidos 2974-3217); región potenciadora del SV40 (nucleótidos 3218-3463); región f1 de fagos (nucleótidos 3551-4006) y región codificante de beta lactamasa (AmpR) (nucleótidos 4443-5300). Se registró Db.911.3E en el ATCC el 8 de enero de 2003, y se le asignó el No. de acceso de ATCC PTA-4895.

El vector Eb.911.3E es un vector de expresión que comprende la región variable de la cadena liviana del anticuerpo E3 y la región constante de la cadena kappa humana, y es apropiado para la expresión transitoria de la cadena liviana. Eb.911.3E posee secuencias de nucleótidos que corresponden a las siguientes regiones: región promotora del citomegalovírus murino (nucleótidos 1-612); el intrón de EF-1 humano (nucleótidos 619-1142); péptido señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1173-1150); región variable de la cadena liviana del anticuerpo E3 (nucleótidos 1251-1571 ); región constante de la cadena kappa humana (nucleótidos 1572- 1892); señal tardía de poliadenilación de SV40 (nucleótidos 1910-2153); región potenciadora del SV40 (nucleótidos 2154-2399); región f1 de fagos (nucleótidos 2487-2942) y región codificante de beta lactamasa (AmpR) (nucleótidos 3379-4236). Se registró Eb.911.3E en el ATCC el 8 de enero de 2003, y se le asignó el No. de acceso de ATCC PTA-4893. El vector Eb.pur.911.3E es un vector de expresión que comprende la región variable de la cadena liviana del anticuerpo E3 y la región constante de la cadena kappa humana, y es apropiado para la expresión estable de la cadena liviana. Eb.911.3E posee secuencias de nucleótidos que corresponden a las siguientes regiones: región promotora del citomegalovírus murino (nucleótidos 1-612); intrón de EF-1 humano (nucleótidos 619-1758); región codificante del gen pac 157 (puromicinaR) (nucleótidos 739-1235); región 5'UTR de la hsp70 humana (nucleótidos 1771-1973); péptido señal de la hormona de crecimiento humano (nucleófidos 1985-2062); región variable de la cadena liviana del anticuerpo E3 (nucleótidos 2063-2383); región constante de la cadena kappa humana (nucleótidos 2384-2704); señal tardía de poliadenilación de SV40 (nucleótidos 2722-2965); región potenciadora del SV40 (nucleótidos 2966-3211 ); región f1 de fagos (nucleótidos 3299-3654) y región codificante de beta lactamasa (AmpR) (nucleótidos 4191-5048). Se registró Eb.pur.911.3E en el ATCC el 8 de enero de 2003, y se le asignó el No. de acceso de ATCC PTA-4894. La expresión celular transitoria se realizó como sigue: se co-transfectaron transitoriamente células CHO y HEK293T con 25 µg de cada plásmido en placas de 150 mm (o sea, un plásmido que contenia la cadena pesada y un plásmido que contenía la cadena liviana). Se mezcló el ADN con 100 µl de lipofectamina 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se permitió que los complejos ADN-lípidos contactaran con las células durante 5 horas en el medio de DMEM/F12 sin suero ni antibióticos. Luego de esta incubación, se cambió el medio por Opti-MEM (Invitrogen) para la expresión sin ningún aditivo durante dos días. Se recogieron secuencialmente los sobrenadantes celulares que contenían el anticuerpo hasta cuatro veces con el subsiguiente reemplazo del medio. Se purificaron los sobrenadantes por cromatografía de afinidad con el uso de resina de proteína A MapSelect (Amersham biosciences 17-5199-02). El anticuerpo se unió a la proteína A de la resina en buffer 0,3 M de glicina, 0,6 M de NaCI a pH 8, luego se eluyó con buffer 0,1 M de citrato a pH 3. Se neutralizaron inmediatamente las fracciones que contenían el anticuerpo con buffer 1 M de Tris a pH 8,0, luego las fracciones del anticuerpo se dializaron y concentraron en PBS. Ejemplo 6: el anticuerpo E3 anti-NGF es eficaz en el tratamiento del dolor post-quirúrgico Para evaluar la eficacia del tratamiento con el anticuerpo E3, los inventores utilizaron un modelo de dolor que simula el dolor post-quirúrgico. El anticuerpo E3 contenía la región constante de la cadena pesada de lgG2a humana que contenía las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (numeración aminoacídica en referencia a la secuencia salvaje de lgG2a; véase Eur. J. ImMunol. (1999) 29:2613-2624); la región constante de la cadena liviana de cadena kappa 158 humana; y las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas mostradas en las Tablas 1A y 1B. Animales. Se compraron ratas macho Sprague Dawley con un peso entre 220-240 gramos de Harían (Wisconsin) y se las aclimató al bioterio durante una semana previa a la cirugía. Cirugía. La cirugía se basó en el procedimiento descripto por Brennen, et al. Pain 64:493- 501 (1996). Los animales se anestesiaron con una mezcla isofluorano al 2% en aire, que se mantuvo durante la cirugía a través de un cono nasal. La superficie plantar de la pata derecha trasera se preparó con una almohadilla de iodo-povidona, y se hizo una incisión longitudinal central de 1 cm a través de la piel y la fascia, comenzando a 0,5 cm del eje del talón y extendiéndose hacia los dedos. Las medidas se hicieron con una regla con el pie sostenido en una posición flexionada. El músculo plantar se elevó usando fórceps curvados y se le hizo una incisión longitudinal. Al músculo se le hizo una incisión en su total profundidad, entre el origen y la inserción. El sangrado a lo largo de la cirugía se controló mediante presión aplicada a través de una almohadilla de gasa. La herida se cerró con dos suturas de colchón (monofilamento negro de etilón 5-0). Estas suturas se anudaron 5-6 veces, con el primer nudo apenas atado. El sitio de la herida se limpió con solución de bacitracina. Los animales se dejaron recuperar y descansar en cajas limpias durante dos horas o más antes de comenzar la prueba de comportamiento. Evaluación del dolor en reposo. Se usó una escala de dolor acumulativo para calcular el dolor relacionado al aguante de un peso. Los animales se colocaron sobre una malla plástica (cuadrícula: 8 mm2) en cajas de plástico transparente que se elevaron sobre una plataforma (altura: 18") permitiendo la inspección de la parte de abajo de sus patas. Luego de un periodo de aclimatación de 20 minutos, se calculó el aguante al dolor sobre una escala de 0 a 2. Se dio una puntuación de 0 si la pata estaba pálida o presionada contra la malla, indicando un aguante total al dolor. Una puntuación de 1 se dio sí la pata estaba ayudada con la piel apenas tocando la malla, sin palidez o indentación de la piel. Una puntuación de 2 se dio si la pata estaba completamente sostenida sin tocar la malla. El encogimiento de la pata se consideró como un 2 aún si la rata estaba descansando. Cada animal fue observado durante 1 minuto cada 5 minutos, durante 30 minutos. La suma de las 6 puntuaciones (0-12) obtenidas durante Vi hora se usó para calcular el 159 dolor en el pie operado También se calculo la frecuencia de las puntuaciones de 2, y esto se usó para calcular la incidencia de dolor agudo o de protección total de la pata por parte del animal Cada animal se testeó 24 horas antes de la cirugía (línea base), y 2 h, 24 h, 48 h y 72 h postoperación Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 1 , la cual esquematiza la puntuación de dolor en reposo acumulativo que se observó en los animales que se trataron con 35 mg/kg de anticuerpo anti-NGF de ratón 911 Estos resultados demostraron que el tratamiento con anticuerpo anti NGF redujo significativamente el dolor de reposo post-quirúrgico El aguante al dolor se correlacionaba bien con la forma en que el animal estaba dispuesto a usar el miembro, y por lo tanto fue una medida efectiva del alivio al dolor El anticuerpo E3 se inyecto en forma intrapentoneal (i p ) a diferentes concentraciones de anticuerpo (0,004, 0,01 , 0,02, 0,1 , 0,6 y 1 mg por kilogramo de peso del animal) 15 horas antes de la incisión El grupo control negativo no recibió anticuerpo, sino que se inyectó i.p con una solución salina Se inyecto fentanil i p a 0,01 mg/kg como control positivo 30 minutos antes del testeo de 24 horas post-cirugía Cada experimento involucró 8 animales (n=8 por grupo) para cada condición, y et grupo control tuvo 56 animales Se llevó a cabo la cirugía y se midió la puntuación de dolor acumulativo como se describió previamente El dolor de reposo se evaluó veinticuatro horas luego de la cirugía Como se muestra en la Figura 7, el anticuerpo E3 anti-NGF humanizado redujo significativamente el dolor de descanso (p<0,05 luego de la cirugía cuando se administró a dosis entre 0,02 mg/kg y 1 mg/kg Un "*" indica una diferencia significativamente significativa en comparación con el control (p<0,05) El tratamiento con 0,02 mg/kg alivianó la respuesta al dolor al menos tan efectivamente como el tratamiento con 0,01 mg/kg de fentanil Esta dosis de fentanil es 10 veces la dosis humana normal de este potente opioide En otro experimento, se testeó la eficacia del anticuerpo E3 en la reducción del dolor post- quirúrgico cuando se lo administró post-quirúrgicamente El anticuerpo E3 (0,5 mg/kg) se inyectó intravenosamente (i v ) dos horas luego de la cirugía El grupo control no recibió anticuerpo sino que se inyectó i v con una solución salina La cirugía se llevó a cabo y el dolor de descanso expresado como una puntuación de dolor acumulativo se calculó 24 horas después de la cirugía 160 Como se muestra en la Figura 8, el tratamiento con anticuerpo anti-NGF disminuyó significativamente (p<0,05) el dolor de reposo a las 24 horas luego de la incisión, con el anticuerpo administrado 2 horas post-incision Estos resultados demostraron que el anticuerpo E3 alivia efectivamente el dolor post-quirúrgico cuando se lo administra luego de la cirugía Ejemplo 7 Evaluación de los efectos analgésicos de anticuerpo antagonista 911 anti-NGF en un modelo de artritis reumática en rata Se investigaron los efectos analgésicos del anticuerpo anti-NGF, 911 (véase, Hongo et al , Hybpdoma 19(3) 215-227 (2000)) en ratas con artritis crónica inducida con adyuvante de Freund completo (CFA) usando la prueba de vocalización, en comparación con indometacina, la que se uso como sustancia de referencia Cincuenta (50) ratas Lewis (LEWIS LEW / Crl Ico) (Charles River Bélgica) macho de peso entre 150 g y 220 g al comienzo de la fase experimental se incluyeron en este estudio Todos los animales se conservaron durante al menos 5 días antes del experimento, y se almacenaron en un cuarto controlado a una temperatura (19,5-24,5°C), humedad relativa (45-65%) y con ciclos de luz/oscuridad de 12 h, con acceso ad-libitum a agua filtrada y alimento de laboratorio texturado estándar (U A R , Francia) a lo largo del estudio Los animales se identificaron individualmente en la cola Al día 0 (DO), se indujo artritis a las ratas por medio de inyección intradérmica en la cola con 0,05 ml de una suspensión de Mycobacterium butyricum (Dyfco, E E U U ) en aceite mineral (10 mg/ml) Al día 14 (D14), las ratas con artritis se incluyeron en el estudio de acuerdo a su habilidad para vocalizar con una suave flexión de la pata trasera y por medio de su índice de artritis, que se evaluó usando una puntuación de inflamación para cada pata delantera y trasera (véase Kuzuna et al , Chem Pharm Bull (Tokyo) 23 1184-1191 (1975); Pearson et al , Arthptis Rheum 2 440-459 (1959)) Los animales se puntuaron sobre la base del siguiente criterio Puntuación 0 aspecto normal, Puntuación 1 eritema, Puntuación 2 eritema con edema leve, Puntuación 3 inflamación fuerte sin anquilosis, Puntuación 4 anquilosis Solamente los animales 161 capaces de vocalizar con una flexión suave y presentando una puntuación entre 2 y 3 se incluyeron en el estudio. Cuatro grupos de 10 ratas cada uno se incluyeron en el estudio. Para el grupo 1 (vehículo), al día 14 (D14), luego se la selección, las ratas recibieron intravenosamente vehículo (salina). Al dia 18 (D18), se evaluó la intensidad nociceptiva por medio de una flexión suave de la pata trasera y se registró la intensidad del nivel de vocalización para cada animal. Para el grupo 2 (4 días), al D14, luego de la selección, las ratas recibieron intravenosamente 911 (10 mg/kg). Al día 18 (D18) se evaluó la intensidad nociceptiva por medio de una flexión suave de la pata trasera y se registró la intensidad del nivel de vocalización para cada animal. Para el grupo 3 (24 horas), al día 17 luego de la inyección de CFA, las ratas recibieron intravenosamente 911 (10 mg/kg). Se evaluó la intensidad nociceptiva por medio de una flexión suave de la pata trasera 24 horas después, y se registró la intensidad del nivel de vocalización para cada animal. Para el grupo 4 (indometacina), en el día 18 (D18), se evaluó la intensidad nociceptiva medíante flexión suave de la pata trasera una hora después de la administración oral de indometacina (10 mg/kg). También se registró la intensidad del nivel de vocalización para cada animal. Las sustancias de testeo se administraron en forma ciega y al azar por medio de ruta intravenosa en un volumen de 5 ml/kg, mientras que la indometacina se administró por medio de ruta oral en un volumen de 10 ml/kg. Los efectos analgésicos del anticuerpo anti-NGF 911 se muestran en la Tabla 10. Los resultados se expresaron para cada grupo como intensidad nociceptiva evaluada, la intensidad del nivel de vocalización se registró para cada animal (media ± SEM), y el porcentaje de variación de la intensidad nociceptiva se calculó a partir del valor medio del grupo tratado con vehículo. La significancia estadística entre los grupos tratados y el grupo vehículo se determinó con una prueba de Dunnett, usando la varianza residual luego de un análisis de una vía de la varianza (p<0,05). Tabla 10. Efectos analgésicos de 911 en ratas con artritis crónica inducida por adyuvante de Freund completo. 162 Los resultados se expresan como media ± SEM n=10 ratas por grupo Dia 0 (DO) Inducción de Artritis crónica por medio de administración de CFA Vehículo salina Se administró 911 (10 mg/kg) intravenosamente el D14 o el D17 y la medida del dolor se llevó a cabo el D18 Se dio indometacma (10 mg/kg) oralmente el D18 y la medida del dolor se llevó a cabo una hora luego de la dosis Prueba de Dunnett * indica una diferencia significativa en comparación con el grupo tratado con vehículo para p<0 05 Como se muestra en la Tabla 10, el anticuerpo 911 anti-NGF redujo significativamente el dolor en un modelo de rata de artritis reumática 24 horas o 4 días luego de una administración única del anticuerpo. Ejemplo 8. Efectos farmacológicos de anticuerpo antagonista E3 anti-NGF y 911 en un modelo de rata de artritis reumática Los efectos farmacológicos (efectos anti-inflamatorios y analgésicos) del anticuerpo antagonista anti-NGF E3 y 911 se investigaron en una modelo de artritis crónica inducida con adyuvante de Freupd completo (CFA) en ratas, en comparación con indometacina, que se usó como sustancia control positivo interno Los efectos analgésicos de E3 y 911 se evaluaron por medio de la medida de la respuesta nociceptiva Los efectos anti-inflamatorios se evaluaron por medio de volumen de pata, índice de artritis (puntuación de inflamación), y del peso de cuerpo y de las patas traseras. Los niveles de citoquinas en las patas (IL-6, IL-1 ß, TNF-ß y TGF-1ß), de TGF-ß1 circulante en suero, las concentraciones plasmáticas de E3 y 911 , los parámetros biológicos y las radiografías de rayos X se llevaron a cabo al final del experimento. 163 Protocolo experimental 1. Diseño del estudio 80 ratas macho Lewis (LEWIS Lew / Ico) (Charles River Laboratories- Bélgica) de 5 semanas de edad se incluyeron en este estudio. Se mantuvieron en un cuarto de temperatura (19,5-24,5°C) y humedad relativa (45-65%) controladas, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, con acceso ad-libitum a agua filtrada y a alimento de laboratorio texturado estándar (SAFE, Francia) a lo largo del estudio. Al recibir los animales, los mismos se alojaron de a 5 por caja y con un periodo de aclimatación de 10 días para observación antes del ensayo. Los animales se identificaron individualmente en la cola. Se incluyeron cinco grupos de 10 animales cada uno (ratas macho Lewis -LEWIS LEW/lco, de Charles River Laboratorios - Bélgica de cinco semanas de edad) en este estudio: Grupo 1 : ratas no artríticas/salina (vehículo), i.v. en bolo, n = 10; Grupo 2: ratas artríticas/salina (vehículo), í.v. en bolo, n = 10; Grupo 3: ratas artríticas/indometacina 3 mg/kg, p.o. diariamente durante 10 días, n = 10: Grupo 4: ratas artríticas/E3, 1 mg/kg, i.v. en bolo, n = 10; Grupo 5: ratas artríticas/911, 10 mg/kg, i.v. en bolo, n = 10. Las dosis se expresaron en términos de sustancia activa libre (mg/kg). E3 y 911 se prepararon extemporáneamente en salina a partir de la solución madre hasta la concentración deseada. E3 1 mg/kg: 3,41 ml de solución madre (0,88 mg/ml) c.s.p. 15 ml de salina. 911 10 mg/kg: 12 ml de la solución madre (2,5 mg/ml) c.s.p. 15 ml de salina. Todas las soluciones diluidas (antes de la inyección i.v.) se esterilizaron usando una unidad de filtro estéril de 0,20 µm. Los valores de pH y osmolaridad de las soluciones diluidas se midieron antes de cada inyección i.v. Antes de la primera inyección i.v., las osmolaridades (mosm/l) para la salina, E3 y 911 fueron 278, 269 y 308, respectivamente; los pH para la salina, E3 y 911 fueron 5,93, 6,76 y 6,71 , respectivamente. Antes de la segunda i.v., las osmolaridades (mosm/l) para la salina, E3, y 911 fueron 280, 270 y 309 respectivamente; los pH para la salina, E3 y 911 fueron 5,86, 6,72 y 6,59 respectivamente. Se administró por medio de inyección i.v. en bolo E3. 911 o salina, en el Día 14 y Día 19 luego de la inducción de la artritis en un orden aleatorio y codificado, con un volumen de 5 ml/kg. El grupo no artrítico recibió salina por medio de inyección i.v. en bolo, en el Día 14 y Día 19 con un 164 volumen de 5 ml/kg. La indometacina se preparó extemporáneamente en metilcelulosa al 1%. La indometacina se administró por medio de ruta oral (p.o.) una vez diariamente durante 10 días, desde el Día 14 al Día 23 luego de la inducción de la artritis en un orden aleatorio codificado con un volumen de 10 ml/kg. 2. Inducción de artritis En al Día 0 (DO), se indujo artritis en 70 ratas por medio de inyección intradérmica en la cola de 0,05 ml de una suspensión de Mycobacterium butiricum. Un grupo de 10 ratas no recibió inyección intradérmica (ratas no artríticas). En el Día 14 (D14), las ratas artríticas se incluyeron en el estudio usando el siguiente criterio: todas las ratas incluidas mostraron un incremento en el volumen medio de la pata (media entre el volumen de pata izquierda y derecha) de al menos 0,30 ml, en comparación con la media del volumen de pata (media entre el volumen de pata izquierda y derecha) del grupo no artrítico (medida de volumen de pata como se describirá más adelante); todas las ratas incluidas mostraron una vocalización ante flexión suave (medida de repuesta nociceptiva como se describirá más adelante); y todas la ratas incluidas mostraron una puntuación de índice de artritis de 2-3 en cada pata trasera (medida del índice de artritis como se describirá más adelante) (los animales con una puntuación de 0, 1 o 4 se descartaron). 3. Peso corporal Los animales se pesaron una vez por día a partir del Día 0 al Día 24 (excepto durante los días de fin de semana antes del tratamiento: D1 , D2, D8, D9, D10). Todas las medidas se llevaron a cabo entre las 9:00 y 12:00 a.m., excepto en el D14, (7:30 - 9:00 a.m.) y en el D24 (7:30 - 8:00 a.m.). 3. Medición del volumen de la pata El volumen de pata derecha e izquierda da cada rata (ratas artríticas y no artríticas) se midió usando un pletismómetro. Las medidas se llevaron a cabo en los siguientes tiempos (luego de la inducción artritis): Día 14 (antes de administración i.v. en bolo o p.o.); y Día 24 (5 días luego de la última inyección i.v. en bolo o 24 h luego de la última administración p.o.). Todas las mediciones se llevaron a cabo entre las 9:00 y 12:00 a.m. Todos los datos se colectaron y se registraron por medio del programa WinDas. 165 4. índice de artritis El índice de artritis se evaluó usando una puntuación de inflamación para cada pata trasera y delantera (ratas artríticas): Puntuación 0: aspecto normal; Puntuación 1 : eritema; Puntuación 2: eritema con edema leve; Puntuación 3: inflamación fuerte sin anquilosis; Puntuación 4: anquilosis. Esta evaluación se llevó a cabo a los siguientes tiempos (luego de la inducción de la artritis): Día 14 (antes de administración i.v. en bolo o p.o.); y Día 24 (5 días luego de la última inyección i.v. en bolo o 24 h luego de la última administración p.o.). Todas las medidas se llevaron a cabo entre las 2:00 y 3:00 p.m. (D 14), entre las 8:00 y 9:00 a.m. (D 24). Todos los datos se colectaron y se registraron por medio del programa WinDas. 5. Medición de la respuesta nociceptiva (prueba de vocalización) La respuesta pociceptiva se evaluó por medio de flexión suave de la pata trasera derecha e izquierda, repetidamente, 2 veces a intervalos de 4 a 5 segundos con un dedo del operador (ratas artríticas). La intensidad del nivel de vocalización se registró para cada animal para cada pata trasera (2 veces: en la pata trasera derecha: s1 y s3; 2 veces: en la pata trasera izquierda: s2 y s4). Esta evaluación se llevó a cabo en los siguientes tiempos (luego de la inducción de la artritis): Día 14 (antes de administración i.v. en bolo o p.o.); Día 18 (antes de la segunda inyección i.v. en bolo o 1 hora después de administración p.o.). Todas las medidas se llevaron a cabo entre las 9:00 y 12:00 a.m. excepto en el D14 (7:30 - 9:00 a.m.) y D24 (7:30 - 9:00 a.m.). 6_, Recolección de sangre para medida de concentración de E3 o 911 v de TGF-ßl circulante y parámetros hematológicos En el Día 24 (luego de las medidas de volúmenes de pata y del índice de artritis y de la prueba de vocalización), bajo anestesia general usando isofluorano (en una mezcla de oxígeno y óxido nitroso), las muestras de sangre (aproximadamente entre de 800 y 1000 µl) se colectaron del seno retroorbital por medio de acción capilar con una micropipeta. Medida de la concentración de E3 o 911 (grupos 2, 4 y 5): Una parte de la muestra de sangre se colectó en tubos conteniendo heparina de Li (mantenida en hielo) y se centrifugó a 2500- 3000 g durante 10 min. Las muestras de plasma (al menos 100 µl) se obtuvieron, se congelaron en 166 nitrógeno líquido, se almacenaron a -80°C. Una muestra estaba levemente hemolizada (rata artrítica # 36 tratada con vehículo). Medición de TGF-ß1 circulante (grupos 1-2-3-4-5): Una parte de la muestra de sangre se colectó a temperatura ambiente en microtubos para preparación de suero. Luego de la recolección de la muestra, la sangre se mezcló y se dejó contraer durante 30 minutos antes de la centrifugación. Los tubos se centrifugaron a aproximadamente 6000 g durante 3 minutos. Cada muestra de suero (al menos 100 µl, excepto para las ratas # 52 y # 53) se alicuotó y almacenó a -20°C hasta la activación de la muestra para el análisis de TGF-ß1. Esas alícuotas (50 viales) se conservaron durante un periodo de 6 meses a partir del comienzo del final del estudio. Algunas muestras estaban levemente hemolizadas (ratas no artríticas tratadas con vehículo: # 2, # 5, # 9, # 10: ratas artríticas tratadas con vehículo: # 53, # 63; ratas artríticas tratadas con E3 # 31 , # 51; ratas artríticas tratadas con 911 : # 52, # 62, # 64). Los niveles de TGF-ß1 se midieron usando un conjunto de componentes para ELISA para TGF-ß1 humano (ref. DB100, Lote 212258 y 213610, R&D Systems - Francia). Recolección de sangre para parámetros hematológicos (grupos 1-2-3-4-5: 50 viales): Una parte de la muestra de sangre se colectó en tubos conteniendo K3 - EDTA (al menos 100 µl). La determinación de los parámetros se llevó a cabo en el día de la recolección y las muestras no se almacenaron. Los parámetros hematológicos, entre los que se incluye a células sanguíneas rojas, células sanguíneas blancas, plaquetas, hemoglobina y hematocrito se midieron con un contador hematológíco (D 24). Algunos parámetros hematológicos no se midieron debido a muestras coaguladas (ratas no artríticas tratadas con vehículo: # 10; ratas artríticas tratadas con E3: # 59, # 67; ratas artríticas tratadas con 911 : # 16). 7. Niveles de citoquinas de las patas En el día 24 (5 días luego de la última inyección i.v. en bolo o 24 horas luego de la última administración p.o.) (luego de las radiografías de rayos X), cada pata trasera de cada animal (ratas artríticas y no artríticas) se pesó y se recolectó en un vial de poliefileno rotulado. Las muestras de tejido se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. 167 Preparación de homogenatos de articulación: Las patas traseras congeladas se pulverizaron usando un Bio-Pulverizer. Las patas traseras pulverizadas se colocaron entonces dentro de un tubo de centrífuga cónico conteniendo 3 ml de PBS suplementado con 50 µl de una mezcla anti-proteasa, y se homogeneizaron en hielo usando un homogeneizador Ultra-Turrax (al 50% de la velocidad máxima). Luego los homogenatos se centrifugaron a 200 x g durante 15 minutos a 4°C y los sobrenadantes se filtraron a través de filtros Sartorius de 0,2 µm, se alicuotaron y almacenaron a -80°C hasta su uso. Medida de los niveles de citoquina: Los niveles de citoquina de TNF-a (conjunto de componentes para medida de TNF-a de rata por ELISA, ref. RTA00, Lote 213718, R&D Systems, Francia), IL-1 ß (conjunto de componentes para medida de IL-1ß de rata por ELISA, ref. RLBOO, Lote 212435, R&D Systems, Francia), IL-6 (conjunto de componentes para medida de IL-6 de rata por ELISA, ref. R6000, Lotes 211773, 214008 y 214362, R&D Systems, Francia), y TGF-ßl (conjunto de componentes para medida de TGF-ß1 humana por ELISA, ref. DB100, Lotes 212258 y 213610, R&D Systems, Francia) se determinaron por duplicado, de acuerdo a los procedimientos del fabricante. Las alícuotas de homogenatos de pata trasera se almacenaron a -80°C. 8. Análisis por rayos X En el Día 24, luego de la recolección de sangre, se sacrificaron los animales y se obtuvieron radiografías de rayos X (patas traseras) para la estimación de las lesiones de articulación. El análisis de rayos X se concentró en erosiones articulares, espacio articular, anormalidades de periostio en ambas patas traseras. Todas las radiografías se analizaron por medio de la búsqueda de siete ítems diferentes: daño a tejido blando, deformidad, desmíneralización, espacio articular, erosiones, osteogénesis y reacción periostal. Para cada animal, los primeros seis ítems se analizaron en forma independiente mirando el peor pie trasero. La reacción periostal se analizó mirando a la cola. Para cada ítem, la puntuación va de 0 (normal) a 4 (daño máximo). Por lo tanto, la puntuación total va de 0 a 28. La interpretación radiográfica se hizo a través del mismo intérprete, sin saber nada acerca de los animales (tratados o no tratados). 9. Observaciones 168 Un animal (# 65) murió en el D 23 luego de la administración de indometacina (antes de la administración al D 23) debido a causa desconocida. 10. Análisis y expresión de los resultados Todos los resultados se informaron como Media ± S.E.M. de 10 ratas en cada grupo a cada punto de fiempo. El volumen de pata se expresó en ml calculados a partir del valor medio del volumen de la pata derecha e izquierda. El índice de artritis se calculó a partir de la suma de la puntuación obtenida de cada una de las 4 patas. La respuesta nociceptiva se evaluó mediante la intensidad del nivel de vocalización registrado para cada animal (media de 4 valores: 2 veces/pata) en mV. El porcentaje de inhibición de la respuesta nociceptiva se calculó a partir del valor medio del grupo artrítico tratado con vehículo [(valor medio del grupo artrítico tratado con vehículo - valor medio del grupo artrítico tratado/ valor medio del grupo artrítico tratado con vehículo)*100]. El peso corporal se expresó en gramos. El peso de las patas traseras (izquierda y derecha) se expresó en gramos. Los niveles de citoquinas (IL-6, IL-1ß, TNF-a y TGF-ß1) de cada pata trasera se expresaron en pg/ml. Los niveles circulantes de TGF-ß1 se expresaron en pg/ml. El índice radiológico para cada parámetro (desmíneralización, erosiones, reacción periostal, daño al tejido blando, espacio en articulación, deformidad por osteogénesis) y el índice radiológico total (puntuación total) se calcularon a partir de la suma de la puntuaciones obtenidas para cada parámetro. Las significancias intergrupales de las desviaciones entre los valores del grupo tratado con vehículo (ratas artríticas) y el grupo tratado con vehículo (ratas no artríticas) se calcularon por medio de la prueba t Student o de la Prueba de la Suma de Rangos de Mann-Whitney cuando la prueba de varianzas iguales o normalidad ha fallado. Las significancias ¡ntergrupales de las desviaciones entre los valores del grupo tratado con vehículo (ratas artríticas) y los grupos tratados con E3 y 911 e indometacina se calcularon por medio de análisis de 1 vía de la varianza, ANOVA, seguido de prueba t de Dunnett para no apareados. Una probabilidad de p<0,05 se consideró como significativa. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el programa Sigmastat™. 169 Resultados 1 Respuesta nociceptiva (prueba de vocalización) Como se muestra en la Tabla 11 y Figura 18, en el D 14, la respuesta nociceptiva fue 4147 ± 331 , 4386 ± 235, 4644 ± 367 y 4468 ± 143 en los grupos artríticos tratados con vehículo, indometacina E3 y 911 respectivamente La indometacina disminuyo fuerte y significativamente la respuesta nociceptiva luego de 3 mg/kg/dia p o (durante 10 días) en aproximadamente -3768 mV (% de inhibición 71 %) y -4353 mV (% de inhibición 74%) en los días D 18 y D 24, respectivamente en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (D 18 1511 ± 398 vs 5279 ± 326 mV D 24 1552 ± 508 vs 5905 ± 345 mV) E3 (1 mg/kg i v en el D 14 y D 19) disminuyo fuerte y significativamente la respuesta nociceptiva en aproximadamente -4167 mV (% de inhibición 79 %) y -5905 mV (% de inhibición 100 %) al D 18 y D 24, respectivamente, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (D 18 1112 ± 401 vs 5279 ± 326 mV, D 24 0 ± 0 vs 5905 ± 345 mV) 911 (10 mg/kg i v 2 días al D 14 y D 19) disminuyó fuerte y significativamente la respuesta nociceptiva en aproximadamente -3932 (% de inhibición 74 %) y -5358 mV (% de inhibición 91 %) al D 18 y D 24, respectivamente, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (D 18 1347 ± 492 vs 5279 ± 326 mV, D 24 547 ± 307 vs 5905 ± 345 mV) Tabla 11 Efectos de E3 y 911 después de una inyección i v (2 días D 14- D 19) sobre la respuesta nociceptiva en artritis reumática en ratas Día D14 D 18 D 24 vehículo i v 4147 5279 5905 ±331 ±326 ±345 E3 4644 1112 0 1 mg/kg i v ±367 ±401 ±0 * # % de inhibición 0 79 100 170 Ratas Artríticas 91 1 4468 1347 547 10 mg/kg i v ±143 ±492 ±307 * * % de inhibición 0 74 91 Indometacma 4386 1511 1552 3 mg/kg p o ±235 ±398 ±508 (durante 10 días) * % de inhibición 0 71 74 Los valores se expresan en mV como la Media ± S E M n= 10 animales por grupo excepto en el D 24 para Indometacina (n=9) Prueba t de Dunnett * p< 0,05 vs ratas artríticas tratadas con vehículo 2 Peso corporal Como se muestra en la Tabla 12 y Figura 19, se observó una marcada disminución en la ganancia de peso corporal en las ratas artríticas en comparación con las ratas no artríticas entre D 0 y D 14, debido al establecimiento de la artritis En al D 14 (día de selección) las ratas artríticas mostraron una disminución en peso significativa en comparación con las ratas no artríticas (289 ± 2 vs 217 ± 4 g) (prueba t de Student p< 0,05) Sin embargo, no se detectó una diferencia de peso significativa (D 14) en todos los grupos artríticos (prueba t de Dunnett p< 0,05) El peso corporal aumento moderada y significativamente en el grupo tratado con indometacina (3 mg/kg/día durante 10 días) entre D 17 y D 24, con un máximo de aproximadamente 43 g al D 24, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (261 ± 5 vs 218 ± 3 g) Luego del tratamiento con E3 (1 mg/kg i v en el D 14 y D 19) el peso corporal se incrementó moderada y significativamente entre D 17 y D 24, con un máximo de aproximadamente 46 g en el D 24, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (264 ± 5 g vs 218 ± 3 g) Luego del tratamiento con 911 (10 mg/kg i v en el D 14 y D 19), el peso corporal aumento moderada y significativamente entre D 18 y D 24, con 171 un máximo de aproximadamente 47 g en el D 24, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo. Tabla 12. Efectos de E3 y 911 después de una inyección i.v. (2 días: D 14 - D 19) sobre el peso corporal en artritis reumática en ratas. Día DO D3 D4 D5 D6 D7 D11 D12 D13 D14 Ratas vehículo i.v. 197 215 22 23 23 24 272 277 282 289 2 2 6 4 No ±2 ±2 ±2 ±2 ±2 ±2 ±2 ±2 ±2 ±2 Artríticas vehículo i.v. 199 214 22 23 23 24 229 223 218 217 1 0 6 1 ±2 ±2 ±2 ±2 ±2 ±3 ±6 ±5 ±5 ±4 E F33 29D0fi6 2 92929 2 933 2 944 2 944 2 944 2 94492 2 93377 2933n0 2 929f5¡ 0 1 3 9 1 mg/kg i.v. ±4 ±3 ±3 ±3 ±3 ±3 ±6 ±6 ±5 ±5 Ratas 911 201 211 21 22 23 23 234 228 221 218 8 7 1 9 Artríticas 10 mg/kg i.v. +2 ±5 ±5 ±5 ±5 ±5 ±8 ±7 ±7 ±6 Indometacina 202 217 22 23 23 24 242 235 227 224 5 5 9 6 3 mg/kg p.o. ±3 ±4 ±4 ±4 ±4 ±4 ±7 ±7 ±6 ±5 durante 10 días Día D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22 D23 D24 172 Ratas vehículo i v 285 291 297 302 307 308 312 316 321 326 No ±2 +2 ±2 ±3 ±3 ±3 ±3 ±3 ±3 ±3 Artríticas vehículo i v 213 212 211 210 208 210 212 214 216 218 ±4 ±4 ±3 ±3 ±3 ±3 ±3 ±3 ±3 ±3 E3 223 224 227 232 235 238 245 250 257 264 1 mg/kg i v ±5 ±5 ±4 ±4 ±4 ±4 ±4 ±5 ±5 ±5 * * * * * * * * Ratas 911 217 221 226 229 233 239 246 253 258 265 Artríticas 10 mg/kg iv ±5 ±5 ±5 ±5 ±6 ±6 ±6 ±6 ±6 ±7 Indometacina 230 230 231 234 236 241 246 248 253 261 3 mg/kg p o ±4 ±5 ±4 ±4 ±4 ±4 ±4 ±5 ±5 ±5 durante 10 . * - . . . . . días Los valores se expresan en gramos como la Media ± S E M n= 10 animales por grupo excepto en el D 23 y D 24 (n=9) para Indometaana Prueba t de Dunnett * p< 0,05 vs ratas artríticas tratadas con vehículo. 3 Volumen de pata En el D 14, se llevo a cabo una alteración al azar con el objetivo de obtener grupos homogéneos en términos de volumen de pata Como se muestra en la Tabla 13, en el D 14, el volumen de la pata trasera (media del volumen de la pata derecha e izquierda) fue significativamente mayor en el grupo artrítico que en el grupo no artrítico (2,10 ± 0,05 vs 1 ,44 ± 0,02 ml (prueba t de Student p< 0,05) La indometacma (3 mg/kg/día p o durante 10 días) disminuyo significativamente el volumen de pata en aproximadamente - 0,75 ml (D 24) en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (1 ,59 ± 0,03 ml vs 2,34 ± 0,08 ml) E3 (1 173 mg/kg i v en el D 14 y D 19) incrementó ligera y significativamente el volumen de pata en aproximadamente 0,37 ml, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (2,71 ± 0,09 ml vs 2,34 ± 0,08 ml) 911 (10 mg/kg i v en el D 14 y D 19) incrementó ligera y significativamente el volumen de pata en aproximadamente 0,36 ml, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (2,70 ± 0,11 ml vs 2,34 ± 0,08 ml) Tabla 13 Efectos de E3 y 911 después de una inyección i v (2 días D 14 - D 19) sobre el volumen de pata en artritis reumática en ratas Día D14 D24 Ratas vehículo i v 1 ,44 1 ,47 No Artríticas ±0,02 ±0,02 vehículo i v 2,10 2,34 ±0,05 ±0,08 E3 2,06 2,71 1 mg/kg i v ±0,03 ±0,09 Ratas 911 2,02 2,70 Artríticas 10 mg/kg i v ±0,07 ±0,11 * Indometacina 2,08 1 ,59 3 mg/kg p o ±0,06 ±0,03 durante 10 días * Los valores se expresan en ml como la Media ± S E M n= 10 animales por grupo excepto en el D 24 para Indometacina (n=9) 174 Prueba t de Dunnett * p = 0,05 vs ratas artríticas tratadas con vehículo 4. índice de artritis Como se muestra en la Tabla 14, al D 14, el índice de artritis fue 10,1 ± 0,8, 8,7 ± 0,6, 10,2 ± 0,4 y 9,4 ± 0,7 en los grupos artríticos tratados con vehículo, indometacina, E3 y 911 , respectivamente La indometacina disminuyó fuerte y significativamente el índice de artritis luego de 3 mg/kg/día p o (durante 10 días) en un máximo de - 8,0 en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (2,7 ± 0,7 vs 10,7 ± 0,6) E3 (1 mg/kg i v en el D 14 y D 19) no afectó el índice de artritis en comparación con el grupo tratado con vehículo (11 ,4 ± 0,4 vs 10,7 ± 0,6). 911 (10 mg/kg i v en el D 14 y D 19) no afectó el índice de artritis en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (10,9 ± 0,7 vs 10,7 ± 0,6) Tabla 14 Efectos de E3 y 911 después de una inyección i v (2 días D 14 - D 19) sobre el índice de artritis en artritis reumática en ratas Día D14 D24 vehículo i v 10,1 10,7 ±0,8 ±0,6 E3 10,2 11 ,4 1 mg/kg i v ±0,4 ±0,4 Ratas 911 9 4 10.9 Artríticas 10 mg/kg i v ±0,7 ±0,7 Indometacina 8,7 2,7 3 mg/kg p o ±0,6 ±0,7 durante 10 días 175 Los valores se expresan como la Media ± S E M (puntuación) n= 10 animales por grupo excepto para Indometacina (n=9) Prueba t de Dunnett * p < 0,05 vs ratas artríticas tratadas con vehículo 5 Niveles de citoquinas en la patas Como se muestra en la Tabla 15, en el D 24, los niveles de citoquinas de las patas derecha e izquierda se incrementaron en el grupo tratado con vehículo en un máximo de aproximadamente 3.5 (IL-1 ß), 4 (TNF-a) y 1 ,8 (TGF-ß1 ) veces en comparación con el grupo no artrítico tratado con vehículo No se observó diferencia significativa para los niveles de IL-6, en la pata derecha e izquierda, entre los dos grupos Los niveles de citoquinas del grupo artrítico fueron similares en las patas izquierda y derecha 259,7 ± 38,5 vs 219,2 ± 32,4, 4802,8 ± 365,5 vs 4007,1 ± 380,4; 17,8 ± 1.6 vs 18,6 ± 1 ,9 y 9735,0 ± 1219,8 vs 9161 ,4 ± 846,1 pg/ml para IL-6, IL-1ß, TNF-a y TGF-ß1 respectivamente La indometacina, disminuyó ligera pero significativamente el nivel de TGF-ß1 en la pata derecha luego de 3 mg/kg/día p o (durante 10 días) en aproximadamente 1 ,3 veces, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (7057,4 ± 335,6 vs 9161 ,4 ± 846,1 ), mientras que no modifico los niveles de I L-6, TNF-a o IL-1ß Un efecto similar pero no significativo se observo en la pata izquierda E3 (1 mg/kg i v en el D 14 y D 19) no afectó los niveles de IL-6, IL- 1ß, TNF-a o TGF-ß1 , en ambas patas, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo 911 (10 mg/kg i v en el D 14 y D 19) incrementó el nivel de IL-1ß en la pata derecha en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (6215,3 ± 666,7 vs 4007,1 ± 380,4) No tuvo efecto sobre los niveles de las otras citoquinas en ambas patas Tabla 15 Efecto de E3 y 911 después de una inyección i v (2 días en el D 14 y D 19) sobre los niveles ce citoquinas de las patas en artritis reumática en ratas. Niveles de citoquinas en pata izquierda Ratas no Artríticas Ratas Artríticas E3 911 Indometacina 3 vehículo i v vehículo i v 1 mg/kg i v 10 mg/kg i v mg/kg p o 176 Niveles de citoquinas en pata derecha 177 5024,8 9161 ,4 9362,7 10861,2 7057,4 TGF-ß1 ±148,4 ±846, 1 ±423,4 ±604,6 ±335,6 Los valores se expresan en pg/ml, como la Media ± S.E.M. n= 10 animales por grupo excepto para No artríticos tratados con vehículo (Pata derecha), Artríticos tratados con vehículo (Pata izquierda) e Indometacina (n=9) Prueba t de Dunnett: * p = 0,05 vs. ratas artríticas tratadas con vehículo. 6. Medida de TGF-ßl circulante Como se muestra en la Tabla 16, en el D 24, el nivel de TGF-ß1 plasmático se incrementó en el grupo artrítico tratado con vehículo, en comparación con el grupo no artrítico tratado con vehículo (81715,7 1984,1 vs.60269,9 ± 2142,8). La indometacina disminuyó significativamente el nivel de TGF-ß1 sérico luego de 3 mg/kg/día p.o. (durante 10 días) en aproximadamente 1 ,5 veces, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (57222,2 ± 3194,1 vs. 81715,7 ± 1984,1). E3 (1 mg/kg i.v. en el D 14 y D 19) y 911 (10 mg/kg i.v. en el D 14 y D 19) disminuyeron significativamente el nivel sérico de TGF-ß1 , de manera que los niveles de la citoquina en los grupos tratados con E3 y 911 fueron comparables con los observados en el grupo no artrítico tratado con vehículo (69408,8 ± 3926,7 y 67214,5 ± 3649,4 respectivamente, vs. 60269,9 ± 2142,8). Tabla 16. Efecto de E3 y 911 después de una inyección i.v. (2 días en D 14 y D 19) sobre los niveles séricos de TGF-ß1 en ratas con artritis reumática.

Ratas no Artríticas Ratas Artríticas E3 911 Indometacína vehículo i.v. vehículo i.v. 1 mg/kg i.v. 10 mg/kg i.v. 3 mg/kg p.o. 60269,9 81715,7 69408,8 67214,5 57222,2 178 TGF-ß1 ±2142,8 ±1984,1 ±3926,7 ±3649,4 ±3194,1 Los valores se expresan en pg/ml, como la Media ± S.E M n= 10 animales por grupo excepto para No artríticos tratados con vehículo (Pata derecha), Artríticos tratados con vehículo (Pata izquierda) e Indometacina (n=9) Prueba t de Dunnett * p = 0,05 vs ratas artríticas tratadas con vehículo 7 Parámetros hematol?qicos Como se muestra en la Tabla 17, los parámetros hematológicos tales como células blancas sanguíneas y plaquetas fueron mayores en las ratas artríticas tratadas con vehículo en comparación con las ratas no artríticas tratadas con vehículo (prueba t de Student p = 0,05), mientras que las células rojas sanguíneas, la hemoglobina y el hematocpto (prueba t de Student p = 0,05) no cambiaron La indometacina no afecto loa parámetros sanguíneos luego de 3 mg/kg/día p o (durante 10 días) en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo E3 (1 mg/kg i.v en D14 y D 19) no afectó los parámetros sanguíneos, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo 911 (19 mg/kg i v en D 14 y D 19) no afectó los parámetros sanguíneos en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo Tabla 17 Efectos de E 3 y 911 después de una inyección i v (2 días en D 14 y D 19) sobre los parámetros sanguíneos en artritis reumática en ratas (Medida en D 24) Células Células blancas rojas Plaque¬ HemogloHemato- Día sanguísanguítas bina g/dl cpto % neas neas 103/mm3 103/mm3 106/mm3 Ratas vehículo i v 8,7 7,98 15,1 42,6 322 no ±0,9 ±0,31 ±0,7 ±1 ,6 ±89 Artríticas n = 9 n = 9 n = 9 n = 9 n = 9 vehículo i v 19,0 7,54 13,2 37,4 10,43 179 ±0,9 ±0,31 ±0,7 ±1 ,6 ±89 n = 10 n = 10 n = 10 n = 10 n = 10 E3 19 1 7J4 12,9 38,5 827 1 mg/kg i v ±1 ,2 ±0,17 ±0,3 ±1 ,0 ±77 n = 7 n = 8 n = 8 n = 8 n = 8 Ratas Artríticas 911 22,6 7,30 12,1 36,5 799 10 mg/kg i v ±2,9 ±0,40 ±0,7 ±2,1 ±121 n = 8 n = 9 n = 9 n = 9 n = 9 Indometacina 21 ,7 6,93 11 ,8 35,0 705 3 mg/kg p o ±2,5 ±0,31 ±0,6 ±1 ,5 ±111 durante 10 n = 9 n = 9 n = 9 n = 9 n = 9 Los valores se expresan como la Media ± S E M ANOVA p = 0,05 vs ratas artríticas tratadas con vehículo 8 Peso de la pata trasera Como se muestra en la Tabla 18, el peso de la pata trasera izquierda y derecha fue mayor en la ratas artríticas tratadas con vehículo que en las ratas no artríticas tratadas con vehículo (3,43 ± 0,11 vs 1 ,98 ± 0,01 y 3,32 ± 0,12 vs 1 ,99 ± 0,02 g, respectivamente) (prueba t de Student o de Mann-Withney p < 0 05) La indometacina disminuyo significativamente el peso de las patas traseras luego de 3 mg/kg/dia p o (durante 10 días) en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (pata trasera izquierda 2,23 ± 0,04 vs 3,43 ± 0,11 g, pata trasera derecha 2,20 ± 0,05 vs 3,32 ± 0,12 g) E3 (1 mg/kg i v en el D 14 y D 19) solamente incrementó significativamente el peso de la pata trasera izquierda, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (pata trasera izquierda 3,86 ± 0,14 vs 3,43 ± 0,11 g, pata trasera derecha 3,72 ± 0,13 vs 3,32 ± 180 0,12 g). 911 (10 mg/kg i.v. en el D 14 y D 19) solamente incrementó significativamente el peso de la pata derecha, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (pata trasera izquierda: 3,73 ± 0,12 vs. 3,43 ± 0,11 g; pata trasera derecha: 3,83 ± 0,15 vs. 3,32 ± 0,12 g). Tabla 18. Efectos de E3 y 911 después de una inyección i.v. (2 días en el D 14 y D 19) sobre el peso de las patas traseras en artritis reumática en ratas (Medida en el D 24) Pata Pata derecha izquierda Ratas vehículo i.v 1 ,98 1 ,99 no Artríticas ±0,01 ±0,02 vehículo i.v. 3,43 3,32 ±0,11 ±0,12 E3 3,86 3,72 1 mg/kg i.v. ±0,14 ±0,13 * Ratas 911 3,73 3,83 Artríticas 10 mg/kg i.v. ±0,12 ±0,15 * Indometacina 2,23 2,20 3 mg/kg p.o. ±0,04 ±0,05 durante 10 días * * Los valores se expresan en gramos como la Media ± S.E.M. n= 10 animales por grupo excepto para Indometacina (n=9) Prueba t de Dunnett: * p = 0,05 vs. ratas artríticas tratadas con vehículo. 181 8 Análisis de rayos X Como se muestra en la Figura 19, se observo una puntuación total de 0,0 ± 0,0 en las ratas no artríticas tratadas con vehículo Las ratas artríticas tratadas con vehículo tienen una puntuación total de 15,1 ± 1 ,3, con las mayores puntuaciones para la desmineralización, (2,4 ± 0,3), erosiones (2,7 ± 0,3), daño de tejido blando (3,1 ± 0,2) y espacio de articulación (3,3 ± 0,2), una puntuación moderada para reacción pepostal (1 ,0 ± 0,3), osteogénesis (0,8 ± 0,2) y deformidad (1 ,8 ± 0,2) Indometacina (3 mg/kg/dia p o durante 10 días) disminuyó fuerte y significativamente la puntuación total en aproximadamente 10,7, en comparación con las ratas artríticas tratadas con vehículo (4,4 ± 0,9 vs 15,1 ± 1 ,3) E3 (1 mg/kg i v en el D 14 y D 19) no afectó la puntuación total, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (14,2 ± 1 ,3 vs 15,1 ± 1 ,3) 911 (10 mg/kg i v en el D 14 y D 19) no afecto la puntuación total, en comparación con el grupo artrítico tratado con vehículo (15,4 ± 1 ,0 vs 15,1 ± 1 ,3) 182 Tabla 19. Efectos de E3 y 911 después de una inyección i.v. (2 días en el D 14 y D 19) sobre los parámetros de rayos X en artritis reumática en ratas Daño Espacio en ErosioReacción en Puntua-ción Día Desmineralización articula- Osteogéne-sis Deformi-dad nes periostal tejido TOTAL ción blan-do Ratas vehículo i.v. 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 no ±0.0 ±0.0 ±0.0 ±0.0 ±0.0 ±0.0 ±0.0 ±0.0 Artríticas 10 vehículo i.v. 2.4 2.7 1.0 3.1 3.3 0.8 1.8 15.1 ±0.3 ±0.3 ±0.3 ±0.2 ±0.2 ±0.2 ±0.2 ±1.3 E3 2.0 2.4 0.8 3.3 2.7 1.2 1.8 14.2 15 1 mg/kg i.v. ±0.2 ±0.3 ±0.2 ±0.3 ±0.2 ±0.2 ±0.2 ±1.3 Ratas 91 1 2.3 2.5 1.0 3.4 3.3 0.9 2.0 15.4 Artríticas 10 mg/kg i.v. ±0.3 ±0.2 ±0.3 ±0.2 ±0.2 ±0.2 ±0.2 ±1.0 Indometacin 0.3 0.9 0.7 1.0 1.0 0.1 0.4 4.4 20 183 a 3 mg/kg p.o. ±0.2 ±0.2 ±0.3 ±0.2 ±0.2 ±0.1 ±0.2 ±0.9 * * * Los valores se expresan como la Media ± S.E.M (puntuación). n= 10 animales por grupo excepto para Indometacina (n=9) Prueba t de Dunnett: * p < 0,05 vs. ratas artríticas tratadas con vehículo. Conclusión Bajo las condiciones experimentales descriptas con anterioridad, E3 (1 mg/kg i.v. 2 días: D 14 y D 19) y 911 (1 Omg/kg i.v. 2 días: D 14 y D 19) mostraron fuertes efectos analgésicos, pero no mostraron efectos anti-inflamatorios significativos en este modelo de artritis. 10 15 20 Ejemplo 9. Efectos de diferentes dosis de anticuerpo anti-NGF en un modelo de artritis reumática en rata La habilidad de E3 para producir reducción del dolor en ratas artríticas se investigó además por medio del examen de la relación dosis respuesta entre la administración de E3 y la reducción del dolor. Las ratas se trataron con adyuvante para inducir artritis como se describió previamente. Diez ratas no inyectadas con adyuvante se usaron como controles no artríticos. Catorce días luego de la inyección de adyuvante, los animales se clasificaron dentro del estudio sobre la base de los criterios mencionados con anterioridad, se distribuyeron al azar en ocho grupos de diez ratas y se testearon para evaluar la intensidad de su respuesta de vocalización. Entonces, se les dio una dosis, en el día 14, de salina o de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg o 5 mg/kg de anticuerpo E3 como se describió previamente. Los anímales se testearon para evaluar su respuesta de vocalización en los días 16, 18, 20 y 24. Se les dio a los animales una nueva dosis con salina o con la misma dosis de E3 en el día 18, luego de la prueba de vocalización. Los animales también se pesaron cada día, comenzando el día 14. De esa manera, los animales recibieron dos dosis de una dada dosis de anticuerpo o salina, en los días 14 y 18, y se ensayaron para investigar el dolor cinco veces, en los días 14, 16, 18, 20 y 24. Los datos se muestran en las Tablas 20-22 y en las Figuras 20-22. Tabla 20. Efectos de diferentes dosis de E3 sobre la respuesta nociceptiva (intensidad de vocalización) en ratas con artritis reumática. Los valores de intensidad de vocalización se expresan en mV como la media ± S.E.M. 185 vehículo I 0,003mq/kq I 0,01 mg/ g | 0,03 mg/kg I 0,1 mq/kq I 0,3 mq/kg | 1,0 mg/kg | 5,0 mg/kg día 14 día 16 día 18 día 20 día 24 El efecto del tratamiento de los animales con vanas dosis de anticuerpo anti-NGF E3 sobre la vocalización inducida por el dolor (datos mostrados en al Tabla 20), se analizó estadísticamente mediante el uso de ANOVA de dos vías para comparar los resultados obtenidos de a pares entre animales artríticos tratados con vehículo con aquellos tratados con una dada dosis de anticuerpo E3 Hubo un efecto altamente significativo a todos los niveles de E3 estudiados (p<0,0001). Aun a la dosis más baja probada (0,003 mg/kg de E3), la diferencia en la vocalización fue significativa (p<0,0001) Como se muestra en la Tabla 20 y en la Figura 20, de acuerdo con los experimentos anteriores, el tratamiento con anticuerpo E3 a 1 mg/kg mostró un rápido y robusto alivio del dolor. Dentro de los días (el punto de tiempo más temprano probado) la intensidad de vocalización cayó en un 90% El tratamiento con concentraciones de E3 menores también proveyó un robusto alivio del dolor, a pesar de que a menores dosis el alivio del dolor tomó un periodo más largo en manifestarse. Es probable que la disminución aparente en la eficacia en el día 24 de todas las dosis, menos de la más alta, se deba a una disminución del nivel real de nivel plasmático de E3 secundario a una respuesta inmune de las ratas tratadas. Aparentemente las dosis tan bajas como 0,003 mg/kg proveen al menos un alivio parcial al dolor en este modelo. Tabla 21 Efectos de diferentes dosis de E3 sobre el peso corporal en ratas con artritis reumática (normalizado al día 14) 186 No Artríticas vehículo 0,003 mg/kg 0,01 mg/kg 0,03 i t?g/kg Día Media S,E,M Media S,E,M Media S,E,M Media S,E,M Media S.E.M 14 100,00 0,00 100.00 0,00 100,00 0.00 100.00 0,00 100.00 0,00 15 99,53 0,30 99,14 0,37 99,20 0,48 99,18 0,43 100,34 0,36 16 102,52 0.45 99.57 0.60 99.58 0.79 99.33 0.72 100.89 0,57 17 103,31 0,41 99,50 0,64 100,46 0,77 99,69 0,73 101,80 0,82 18 106,11 0,72 100,26 0,93 100,90 1,19 100,69 0,72 102,70 0,92 20 109,62 0,85 101,46 1,22 102,26 1,58 102,70 1,07 104,51 0,75 21 110,52 0,93 102.73 1.49 103,16 1.87 102,63 1,18 105.08 0,98 23 114,28 1,19 104,54 1,92 106,09 1,67 104,41 1,33 106,14 1,06 24 115.44 1,15 105,12 1.92 106,16 1,90 104,23 1.46 106,23 1,26 Tabla 22. Efectos de diferentes dosis de E3 sobre el peso corporal en ratas con artritis reumática (normalizados al día 0). 187 No Artríticas veh culo 0,003 mg/kg 0,01 mg/kg 0,03 mg/kg Oía Media S.E.M. Media S.E.M. Media S.E.M. Media S.E.M. Media S.E.M. 0 100,00 0,00 100,00 0,00 100,00 0,00 100,00 0.00 100.00 0.00 1 100,45 0,19 98,34 0,48 98,37 0,35 98,86 0,33 98,67 0,34 2 105.94 0.33 101.75 0.71 102.47 0,59 102,61 0.40 102,05 0,53 3 109,29 0,33 105,04 1 ,04 106,54 0,99 106,29 0,60 105,31 0,85 4 113,13 0.46 109.14 1 ,15 110.09 0.72 110.61 0.41 109.24 0,82 7 124,15 0,70 119,90 1,39 121 ,29 1 ,32 121,59 0,72 117,15 1 ,36 8 127,82 0,80 123,38 1 ,52 124.44 1 ,43 124,47 1.24 118.52 1.89 9 132,40 0,80 125,50 1 ,59 125,91 1 ,69 125,82 1 ,95 118,60 2,62 10 135,91 0,83 123.51 1 ,77 123.30 2.47 123.87 2,59 115.26 3.19 11 140,42 1 ,13 119,82 1 ,98 119,55 2,76 121,20 2,99 112,94 3,48 14 152,59 1 ,72 111 ,79 1,40 111 ,50 1.87 111 ,80 1 ,65 108,37 2.75 15 151 ,87 1 ,87 110,82 1 ,41 110,63 2,05 110,85 1 ,44 108,68 2,45 16 156.47 2.25 111.33 1.74 111.08 2.32 110.98 1.31 109.21 2.16 17 157,65 2,08 111 ,24 1 ,62 112,06 2,36 111,42 1 ,66 110,16 2,03 18 161 ,98 2.71 112.16 2.21 112.60 2.78 112.54 1.64 111.14 2.11 20 167,36 2,93 113,49 2,37 114,17 3,24 114,82 2,12 113,17 2,49 21 168,73 3,07 114,93 2.62 115.25 3.68 114.76 2.30 113,80 2.68 23 174,51 3,54 116,96 3,02 118,48 3,49 116,76 2,51 114,93 2,62 24 176,27 3,50 117,63 3,13 118,58 3,71 116,56 2,57 114,99 2.51 0,1 mg/kg 0,3 m g/kg 1 ,0 mg/kg 5,0 mg/kg Día Media S.E.M Media S.E.M. Media S.E.M. Media S.E.M. 0 100,00 0,00 100,00 0,00 100.00 0.00 100.00 0.00 1 99,31 0,61 99,26 0,28 98,81 0,27 98,25 0,58 2 102.87 0,73 102,98 0,43 103,18 0,50 101 ,82 0.53 3 106,26 0,82 106,95 0,50 106,52 0,55 105,47 0,58 4 110.20 0,64 110,50 0.58 110.52 0.67 109.29 0.58 7 120,50 1 ,20 120,03 0,82 121 ,54 1 ,15 119,77 1 ,19 8 123,48 1 ,58 121.38 1.31 124.28 1.59 121.96 1.72 9 125,46 2,47 121 ,57 2,09 125,60 2,23 123,04 2,42 10 123.95 3,38 118.27 3.07 124.11 2.97 120.00 2.81 11 121 ,98 3,93 116,02 3,32 121 ,27 3,42 117,97 2,98 14 113.90 2.14 108,43 1 ,94 111 ,72 2.27 111.58 2.59 15 113,66 1 ,91 109,59 2,12 112,30 2,23 113,33 2,37 16 115.06 2,00 111 ,54 2,02 115,00 2,36 116,06 2,30 17 115,99 2,18 113,57 2,04 118,08 2,32 119,14 2,42 18 118.01 2,29 116, 13 2.14 121.16 2.55 122.14 2.61 20 122,17 2,57 120,62 2,20 126,90 2,87 128,60 2,77 21 123.49 2.90 122.88 2.49 130.41 2.98 132.82 2.84 23 124,35 3,02 125,36 2,83 137,81 3,09 140,79 2,83 24 123.77 2,80 125,33 2,75 138,93 2.76 141.77 2,91 El efecto de tratamiento sobre los animales con varias dosis de anficuerpo anti-NGF E3 sobre en peso corporal se analizó estadísticamente usando ANOVA de dos vías para comparar los resultados obtenidos de a pares entre los animales artríticos tratados con vehículo, con aquellos tratados con una dosis dada de anticuerpo E3. Usando los datos normalizados al peso del día 14 (Tabla 21), las dosis de 0,03 mg/kg de E3 resultaron en un cambio significativo del peso corporal (?<0,005). A todas las dosis más altas de E3, la diferencia entre animales artríticos tratados y no 188 tratados fue significativa (p= o < 0,0001 ) Usando los datos normalizados al peso del día 0 (Tabla 22), la dosis de 0,03 mg/kg de E3 resulto en un cambio significativo del peso corporal (p<0,002) Para todas las dosis mayores de E3, la diferencia entre animales artríticos tratados y no tratados fue significativa (p<0 0001) Nuevamente de acuerdo con estudios anteriores, las ratas tratadas con E3 mostraron menos perdida de peso aparente que las ratas artríticas tratadas con salina (Tabla 22 y Figura 22) De hecho, las ratas tratadas con altas dosis de anticuerpo E3 recuperaron la pérdida de peso temprana, y efectivamente ganaron peso mas rápido que sus cohortes no artríticos (Tabla 21 y Figura 21) Ejemplo 10 Efectos analgésicos de anticuerpos anti-NGF E3 en pacientes con dolor de osteoartptis en rodilla de moderado a severo En este estudio con escalado de dosis al azar, controlado por placebos, a doble ciego, se compararon los efectos analgésicos de dosis intravenosas individuales (3 µg/kg, 10 µg/kg, 30 µg/kg, 100 ug/kg, o 300 µg/kg) de anticuerpo anti-NGF E3 con placebo, en pacientes con dolor de osteoartptis en rodilla de moderado a severo Varones y mujeres adultas (con edad entre 35 y 65), quienes estaban experimentando dolor de osteoartptis de rodilla moderado a severo, pero que teman sin embargo un buen estado de salud general, se enrolaron en este estudio Durante el periodo de estudio rápido, se les requirió a los pacientes que discontinuasen las medicaciones para la artritis tales como NSAIDs, inhibidores de ciclooxigenasa de tipo 2 (COX-2), y opiáceos, al menos 14 días antes de la administración de anticuerpo anti-NGF E3 A los pacientes se les permitió usar medicamentos de rescate de acetamonifeno o ibuprofeno con algunas restricciones basadas en hallazgos de laboratorio u historia médica pasada Algunos pacientes tomaron medicaciones de rescate durante el estudio, pero las medicaciones de rescate no se consumieron durante los dos días previos y posteriores a la administración de anticuerpo anti-NGF E3 Treinta y cuatro pacientes fueron admitidos para el estudio y considerados como pacientes hospitalizados durante los Días de Estudio -1 , 1 y 2 La administración de anticuerpo anti-NGF E3 ocurrió en la mañana del Día 1 Se usaron diarios electrónicos para registrar el índice de dolor en rodilla y medicación de rescate usada en la clínica y en casa Diez pacientes se trataron como 189 placebo Veinticuatro pacientes se trataron con anticuerpo anti-NGF E3 cuatro pacientes por nivel de dosis para 3 µg/kg (cohorte 1) 10 µg/kg (cohorte 2) y 30 µg/kg (cohorte 3), y seis pacientes por nivel de dosis para 100 µg/kg (cohorte 4) y 300 µg/kg (cohorte 5) El placebo que se usó fue Inyección estéril de Cloruro de Sodio al 0 9%, USP (salina normal) El anticuerpo anti-NGF E3 era una formulación liquida congelada que consistía en 10 mg/ml de anticuerpo en una solución acuosa de 10 mM de histidina 275 mM de sucrosa, 0,01% de pohsorbato 20, pH 6,0 Una hora antes de la administración IV, el anticuerpo congelado se descongeló y se diluyó dentro de la Inyección de Cloruro de Sodio USP El volumen para cada paciente se calculó sobre la base del peso del paciente en el Día -1 y al nivel de dosis asignada, estando en el rango de 3-6 cc para el cohorte 1 10-20 cc para cohorte 2, 30-60 cc para cohorte 3 y 100 cc para cohorte 4 y cohorte 5 Para cohortes 1 y 2, el anticuerpo E3 se administro mediante IV lenta en bolo durante 3 a 5 minutos, seguido de un empujón IV con 5 cc de Inyección de Cloruro de Sodio, USP Para las cohortes 3-5, se administro el anticuerpo E3 a 100 cc/hora a través de bomba de infusión, seguido de un empuje IV de 5 cc Inyección de Cloruro de Sodio, USP y discontinuación de la IV Dentro de cada cohorte, el placebo (Inyección de Cloruro de Sodio, USP) se administró a través de infusión lenta en bolo o continua de la misma manera que el anticuerpo E3 Luego de dos días de internación, los pacientes se enviaron a casa Dependiendo del nivel de dosis de cohorte, continuaron siendo evaluados en sus niveles de dolor durante 28 días luego de la administración del anticuerpo E3 (Cohortes 1 , 2 y 3) o hasta 181 días luego de la administración del anticuerpo E3 (Cohortes 4 y 5) Se llevaron a cabo evaluaciones periódicas de segundad para todos los pacientes Se evaluaron los efectos analgésicos antes del dosaje y en múltiples ocasiones luego de la administración del anticuerpo E3 Se utilizó un VAS electrónico validado con un rango de 0-100, con resolución de 101 puntos, para el índice de dolor de rodilla actual Los pacientes se contaron 4 veces por día y recibieron instrucciones para indicar el nivel de dolor de artritis en el índice de dolor de rodilla en ese momento También se usó un VAS electrónico validado con un rango de 0-100, con 101 puntos de resolución, para indexar el dolor de rodilla durante una caminata El VAS para 190 indexar el dolor de rodilla durante una caminata se completó diariamente, en concurrencia con el cuarto índice de dolor de rodilla VAS actual Un diario electrónico para la recolección de datos se publicó en el día -8 y se llevó a cabo una evaluación rápida de la obediencia al diario electrónico desde el día -8 al día -2 para determinar el éxito en el uso de diarios electrónicos para un paciente dado La media del VAS registrado durante el periodo de investigación rápida se usa como línea de base para la evaluación de la eficacia También se uso WOMAC (Western Ontario and McUniversities Arthptis Scale) 3 1 Osteoarthptis Index Versión VA 1® para la evaluación del dolor de artritis WOMAC 3 1™ consiste en 24 preguntas divididas en tres dominios dolor (5 preguntas), rigidez (2 preguntas) y función física (17 preguntas) Bellamy et al , J Rheumatol 15 1833-40 (1988), y Bellamy, Semm Arthntis Rheum 18 14-7 (1989) El dominio de función física provee información sobre la habilidad para llevar a cabo actividades de la vida diana Los pacientes levaron a cabo la prueba directamente en el diario electrónico diariamente durante visitas clínicas designadas, usando VAS electrónico validado con una rango de 0-100 con resolución de 101 puntos Cada dominio se puntuó por medio de la determinación de la medias de la puntuación VAS de las preguntas componentes El WOMAC 3 1™ total se puntuó mediante la determinación de las medias de las puntuaciones para cada uno de los 3 dominios A los pacientes también se les requirió el reporte de la medicación de rescate usada a través del diario electrónico Los resultados se evaluaron como cambio desde la linea de base (nivel de dolor durante el periodo de estudio), expresados como diferencia en la intensidad del dolor (PID) o diferencia en la intensidad del dolor sumada (SPID) para diferentes niveles de dosis Los cambios a partir de la linea de base en las mediadas de las actividades se analizaron usando un modelo de análisis de co-vananza (ANCOVA) con el tratamiento como el principal factor y el dolor base como co-vapable Para las medias y cambios en las medias, las comparaciones entre anticuerpo E3 y placebo se hicieron usando la prueba de Dunnett Se uso la prueba de tendencia de Tukey-Ciminera-Heyse para evaluar la relación dosis-respuesta 191 Como se muestra en la Figura 24, la disminución de la media de la intensidad de dolor diaria luego de una administración individual de anticuerpo anti-NGF E3 se observó en todas las dosis probadas. Generalmente, el efecto de la reducción en la intensidad del dolor duró más tiempo en el grupo tratado con la dosis más alta (30 µg/kg, 100 µg/kg y 300 µg/kg) que en el grupo tratado con la dosis más baja (3 µg/kg y 10 µg/kg). Como se muestra en la Figura 25, las reducciones en la intensidad del dolor duraron al menos 80 días luego de la administración de100 µg/kg de E3. En la Tabla 23 a continuación se muestran las diferencias en intensidad de dolor (SPID) para cada dosis de E3 durante días 2-8, días 2-14, días 2-21 y días 2-28, como comparación contra los niveles de la linea de base. Se usó ANCOVA para el análisis estadístico. La Tabla 23 indica que la reducción del dolor fue estadísticamente significativa (p<0,05) luego de una administración individual de anticuerpo anti-NGF E3. Tabla 23. Diferencias de intensidad de dolor sumada para intervalos de tiempo variables comparados con la línea de base. 192 El análisis estadístico se llevó a cabo sin ajuste o con ajuste para comparaciones múltiples. La primera fila de los valores de p entre paréntesis para cada intervalo de tiempo se hizo sin ajuste; la segunda filas de los valores de p entre paréntesis fue con ajuste de Dunnett. Como se muestra en la Figura 26, el porcentaje de la reducción máxima en SPID por la administración individual de anticuerpo anti-NGF E3 alcanzó entre aproximadamente 45% y aproximadamente 65%, entre el día 2 y el día 14, para cada dosis de E3 testeada, y alcanzó aproximadamente entre 45% y aproximadamente 60% entre el día 2 y el día 28, para las dosis de 10 µg/kg, 30 µg/kg, 100 µg/kg y 300 µg/kg de E3. Como se muestra en la Figura 27, la administración de anticuerpo anti-NGF E3 también redujo la puntuación WOMAC entre el día 1 y el día 28. La puntuación del dolor, de la función física y de la rigidez se redujo significativamente en la dosis de 100 µg/kg de E3. Estos datos indican que una administración individual de anticuerpo anti-NGF no solamente reduce el dolor, sino que también mejora la función física y la rigidez en pacientes que tienen osteoartritis. Ingreso del Material Biológico Los siguientes materiales se han ingresado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA (ATCC): Material No de Acceso ATCC. Día de Ingreso Eb.911.3E cadena liviana de PTA-4893 Enero 8, 2003 E3 Eb.pur.911.3E cadena liviana de PTA-4894 Enero 8, 2003 E3 Db.911.3E cadena pesada PTA-4895 Enero 8, 2003 193 de E3 El vector Eb.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena liviana de E3; el vector Eb.pur.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena liviana de E3, y el vector Db.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena pesada de E3. Este ingreso se hizo bajo la disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Ingreso de Microorganismos con el Propósito de Procedimiento de Patentes, y bajo sus regulaciones (Tratado de Budapest). Este asegura el mantenimiento de un cultivo del ingreso viable durante 30 años, a partir del la fecha del ingreso. El ingreso estará disponible en ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Rinat Neuroscience Corp. y ATCC, el que asegura una disponibilidad pública permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del ingreso sobre la emisión de la Patente de los E.E.U.U. pertinente o sobre la puesta en apertura al público de cualquier solicitud de patente, de los E.E.U.U. o extranjera, cualquiera sea la primera, y el que asegura la disponibilidad de la progenie a alguien determinado por el U.S. Commissioner of Patents and Trademarks para su intitulado de acuerdo con la reglas de 35 USC Section 122 y las del Commissioner en su conformidad (incluyendo a la 37 CFR Sección 1.14 con referencia particular a 886 OG 638). El cesionario de la presente solicitud está de acuerdo con que, sí un cultivo de los materiales del ingreso se muere o pierde o destruye cuando se cultiva bajo las condiciones apropiadas, los materiales serán puntualmente reemplazados bajo notificación con otro ¡gual. La disponibilidad del material ingresado no debe interpretarse como licencia de práctica de la invención en contravención con los derechos concedidos bajo la autoridad de ningún gobierno, de acuerdo con sus leyes sobre patente. Secuencias de los anticuerpos Región variable de la cadena pesada (los CDR de Kabat están subrayados: los CDR de Chothia están EN NEGRITA E ITÁLICA) 194 qvqlqesqpQlvkpsetlsItctvsqfsliqydLnwirqppqkglewigliwqdqttdynsaVksrvtiskdtsknqfslklssvtaa dtavvvcarqqyWvAtsvyfdywqqqtlvtvs (SEQ ID N° 1 ) Región variable de la cadena liviana (los CDR's de Kabat están subrayados: los CDR's de Chothia están EN NEGRITA E ITÁLICA) 5 diqmtqspssIsasvqdrvtitcrasqSisnNInwvqqkpqkapkllivvTsrfhsqvpsrfsqsqsqtdftftissIqpediatvvc qqEHtlpytfqqgtkleikrt (SEQ ID N° 2) CDR extendidas de la cadena pesada de E3 CDRH1 gfs gydLn (SEQ ID N° 3) CDRH2: liwgdgttdynsaVks (SEQ ID N° 4) 0 CDRH3: ggyWyAtsyyfdy (SEQ ID N° 5) CDR extendidas de la cadena liviana de E3 CDRL1 rasqSisnNIn (SEQ ID N° 6) CDRL2: yTsrfhs (SEQ ID N° 7) CDRL3- qqEHtlpyt (SEQ ID N° 8) ,. CDR extendidas de anticuerpo monoclonal de ratón 911 CDR extendidas de cadena pesada de 911 CDRH1 • gfsligydin (SEQ ID N° 9) CDRH2 : miwgdgttdynsalks (SEQ ID N° 10) CDRH3 GGYYYGTSYYFDY (SEQ ID N0 11 ) Q CDR extendidas de cadena liviana de 911 CDRL1 : rasqdisnhln (SEQ ID N° 12) CDRL2: yisrfhs (SEQ ID N° 13) CDRL3: QQSKTLPYT (SEQ ID N° 14) Secuencia de aminoácidos (completa) de la cadena pesada de E3 c QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNS AVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE 195 VTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N° 16) Secuencia de aminoácidos (anticuerpo completo) de la cadena liviana de 3E DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSR FSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHXVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N° 17) Secuencia de nucleótidos (anticuerpo completo) de la cadena pesada de 3E CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCC CTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAGCCTC CAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAACCACAGACTATAATTCA GCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTG AGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGC CACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCAC CAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGC GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGA TCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTC CACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGG ACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAG GACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAA GCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACC AGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGC ATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCC ACCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTA 196 TCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCA CCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGT CCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCAC TATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA (SEQ ID N° 65) Secuencia de nucleótidos del dominio variable de la cadena pesada de 3E CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCC CTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAGCCTC CAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAACCACAGACTATAATTCA GCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTG AGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGC CACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID N° 66) Secuencia de nucleótidos (anticuerpo completo) de la cadena liviana de 3E GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGTCA CCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAG GCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCATCACGCT TCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATA TTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCT GGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTTCCTCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGA CAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGA AACACMAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCT TCAACCGCGGTGAGTGCTAA (SEQ ID N° 67) Secuencia de nucleótidos del dominio variable de la cadena liviana de 3E GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGTCA CCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAG GCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCATCACGCT 197 TCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATA TTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCT GGAGATCAAACGC (SEQ ID N° 68) Se entiende que los ejemplos y las realizaciones que aqui se describen son con propósitos ilustrativos solamente, y que numerosas modificaciones o cambios en su contenido serán sugeridas por personas expertas en la materia y serán incluidas dentro del espíritu y competencia de esta solicitud

Claims

198 REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica CARACTERIZADA PORQUE comprende un antagonista del NGF y un vehículo aceptable para el uso farmacéufico, para tratar el dolor causado por la osteoartritis en un individuo. 2. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 1 , CARACTERIZADA PORQUE el antagonista del NGF es un anticuerpo antagonista apti-NGF. 3. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 2, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anfi-NGF es un anticuerpo monoclonal. 4. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 3, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo humanizado. 5. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 4, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se une al NGF humano. 6. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 5, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se une adicionalmente al NGF de roedor. 7. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 6, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF: (a) se une al NGF con una KD menor que aproximadamente 2 nM; (b) inhibe la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF humano con una IC50 de aproximadamente 100 pM o menor, donde la IC50 se mide en presencia de NGF humano aproximadamente 15 pM; y 199 (c) inhibe la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13 5 dependiente del NGF humano con una IC50 de aproximadamente 10 pM o menor, donde la IC50 se mide en presencia de NGF aproximadamente 1 ,5 pM 8 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 7, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF comprende una región variable de cadena pesada que comprende (a) una región CDR1 indicada en SEQ ID N° 3, (b) una región CDR2 indicada en SEQ ID N° 4 y (c) una región CDR3 indicada en SEQ ID N° 5 9 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 8, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF comprende una región variable de cadena liviana que comprende (a) una región CDR1 indicada en SEQ ID N° 6, (b) una región CDR2 indicada en SEQ ID N° 7, y (c) una región CDR3 indicada en SEQ ID N° 8 10 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 9, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF comprende además una región variable de cadena pesada que comprende (a) una región CDR1 indicada en SEQ ID N° 3, (b) una región CDR2 indicada en SEQ ID N° 4, y (c) una región CDR3 indicada en SEQ ID N° 5 11 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 10, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 1 y 2 200 12 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 11 , CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 16 y 17 13 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 12, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se usa a una dosis en un rango de entre aproximadamente 3 µg/kg y aproximadamente 1 mg/kg 14 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 13, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se usa a una dosis de aproximadamente 100 µg/kg 15 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 13, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se usa a una dosis de aproximadamente 300 µg/kg 16 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 15, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra por vía intravenosa o subcutánea 17 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 16, CARACTERIZADA PORQUE el individuo es un ser humano 18 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 17, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra al individuo con una frecuencia de dosificación en un rango de entre una vez por semana y una vez cada doce semanas 201 19. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 17, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra al individuo una vez por mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, o una vez cada seis meses. 20. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 17, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra al individuo una vez cada tres meses. 21. Una composición farmacéufica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 17, CARACTERIZADA PORQUE el dolor se alivia por una duración de al menos aproximadamente siete días después de la administración de una única dosis del anticuerpo antagonista anti-NGF. 22. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 17, CARACTERIZADA PORQUE el dolor se alivia por una duración de al menos aproximadamente catorce dias después de la administración de una única dosis del anticuerpo antagonista anti-NGF. 23. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 17, CARACTERIZADA PORQUE el dolor se alivia por una duración de al menos aproximadamente cuatro semanas después de la administración de una única dosis del anticuerpo antagonista anti- NGF. 24. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 2 a 15, CARACTERIZADA PORQUE el dolor se alivia por una duración de al menos aproximadamente doce semanas después de la administración de una única dosis del anticuerpo antagonista anfi- NGF. 202 25. El uso de una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 1-24 CARACTERIZADO PORQUE es en la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento del dolor causado por la osteoartritis en un individuo. 26. Un conjunto de elementos ("kit") CARACTERIZADO PORQUE comprende (a) una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 1-24; y (b) instrucciones para administrar una cantidad efectiva de dicha composición farmacéutica a un individuo para tratar el dolor causado por la osteoartritis. 27. Una composición farmacéutica CARACTERIZADA PORQUE comprende un antagonista del NGF y un vehículo aceptable para el uso farmacéutico para mejorar la función física en un individuo con osteoartritis. 28. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 27, CARACTERIZADA PORQUE el antagonista del NGF es un anticuerpo antagonista antí-NGF. 29. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 28, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo monoclonal. 30. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 29, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo humanizado. 31. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 30, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista antí-NGF se une al NGF humano. 32. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 31 , CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se une adicionalmente al NGF de roedor. 203 33 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 32, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF' (a) se une al NGF con una KD menor que aproximadamente 2 nM; (b) inhibe la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF humano con una IC50 de aproximadamente 100 pM o menor, donde la IC50 se mide en presencia de NGF humano aproximadamente 15 pM, y (c) inhibe la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13.5 dependiente del NGF humano con una IC50 de aproximadamente 10 pM o menor, donde la IC50 se mide en presencia de NGF aproximadamente 1 ,5 pM. 34. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 33, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF comprende una región variable de cadena pesada que comprende (a) una región CDR1 indicada en SEQ ID N° 3, (b) una región CDR2 indicada en SEQ ID N° 4, y (c) una región CDR3 indicada en SEQ ID N° 5 35 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 34, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF comprende una región variable de cadena liviana que comprende' (a) una región CDR1 indicada en SEQ ID N° 6, (b) una región CDR2 indicada en SEQ ID N° 7, y (c) una región CDR3 indicada en SEQ ID N° 8. 36 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 35, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF comprende además una región variable de cadena pesada que comprende 204 (a) una región CDR1 indicada en SEQ ID N° 3; (b) una región CDR2 indicada en SEQ ID N° 4; y (c) una región CDR3 indicada en SEQ ID N° 5. 37. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 36, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anfi-NGF es un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 1 y 2. 38. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 37, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 16 y 17. 39. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 38, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se usa a una dosis en un rango de entre aproximadamente 3 µg/kg y aproximadamente 1 mg/kg. 40. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 39, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se usa a una dosis de aproximadamente 100 µg/kg. 41. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 39, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se usa a una dosis de aproximadamente 300 µg/kg. 42. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 41. CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra por vía intravenosa o subcutánea. 43. Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 42, CARACTERIZADA PORQUE el individuo es un ser humano. 205 44 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 43 CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra al individuo con una frecuencia de dosificación en un rango de entre una vez por semana y una vez cada doce semanas 45 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 43, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra al individuo una vez por mes una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, o una vez cada seis meses 46 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 28 a 43, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra al individuo una vez cada tres meses 47 El uso de una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 27 a 46 CARACTERIZADO PORQUE es en la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento para mejorar la función física en un individuo con osteoartptis 48 Un conjunto de elementos CARACTERIZADO PORQUE comprende (a) una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 27 a 46, y (b) instrucciones para administrar una cantidad efectiva de dicha composición farmacéutica a un individuo con osteoartptis, para mejorar la función física 49 Una composición farmacéutica CARACTERIZADA PORQUE comprende un antagonista del NGF y un vehículo aceptable para el uso farmacéutico para mejorar la rigidez en un individuo con osteoartptis 206 50 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 49, CARACTERIZADA PORQUE el antagonista del NGF es un anticuerpo antagonista anti-NGF 51 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 50, CARACTERIZADA PORQUE el anficuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo monoclonal 52 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 50 a 51 CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo humanizado 53 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 50 a 52, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se une a NFG humano 54 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 53, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se une adicionalmente al NGF de roedor 55 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 50 a 54, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF (a) se une al NGF con una KD menor que aproximadamente 2 nM, (b) inhibe la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13 5 dependiente del NGF humano con una IC50 de aproximadamente 100 pM o menor, donde la IC50 se mide en presencia de NGF humano aproximadamente 15 pM, y (c) inhibe la supervivencia de neuronas trigéminas de ratón E13 5 dependiente del NGF humano con una IC50 de aproximadamente 10 pM o menor, donde la IC50 se mide en presencia de NGF aproximadamente 1 ,5 pM 207 56 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 50 a 55 CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF comprende una región variable de cadena pesada que comprende (a) una región CDR1 indicada en SEQ ID N° 3, (b) una región CDR2 indicada en SEQ ID N° 4 y (c) una región CDR3 indicada en SEQ ID N° 5 57 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 50 a 55 CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF comprende una región variable de cadena liviana que comprende (a) una región CDR1 indicada en SEQ ID N° 6, (b) una región CDR2 indicada en SEQ ID N° 7, y (c) una región CDR3 indicada en SEQ ID N° 8 58 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 57, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF comprende ademas una región variable de cadena pesada que comprende (a) una región CDR1 indicada en SEQ ID N° 3 (b) una región CDR2 indicada en SEQ ID N° 4, y (c) una región CDR3 indicada en SEQ ID N° 5 59 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 58, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 1 y 2 60 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 59, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF es un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N° 16 y 17 208 61 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 50 a 60, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se usa a una dosis en un rango de entre aproximadamente 3 µg/kg y aproximadamente 1 mg/kg. 62 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 61 , CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se usa a una dosis de aproximadamente 100 µg/kg. 63 Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 61 , CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se usa a una dosis de aproximadamente 300 µg/kg. 64 Una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 50 a 63, CARACTERIZADA PORQUE el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra por vía intravenosa o subcutánea 65 El uso de una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 49 a 64 CARACTERIZADO PORQUE es en la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento para mejorar la rigidez en un individuo con osteoartritis. 66 Un conjunto de elementos CARACTERIZADO PORQUE comprende (a) una composición farmacéutica como se indica en al menos una de las reivindicaciones 49 a 64; y (b) instrucciones para administrar una cantidad efectiva de dicha composición farmacéutica a un individuo con osteoartptis para mejorar la rigidez.