JP5340724B2 - 神経成長因子アンタゴニストを投与することによって骨関節炎疼痛を治療するための方法とそれを含有する組成物 - Google Patents

神経成長因子アンタゴニストを投与することによって骨関節炎疼痛を治療するための方法とそれを含有する組成物 Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
関連出願への相互対照
本出願は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号１１／１０４，２４８（２００５年４月１１日出願）の優先権利益を特許請求する。
技術分野
本発明は、抗ＮＧＦ抗体（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）に関する。さらに本発明は、抗体のようなアンタゴニストの、術後疼痛、慢性関節リウマチ疼痛、および骨関節炎疼痛が含まれる疼痛の治療および／または予防における使用に関する。
背景技術
神経成長因子（ＮＧＦ）は、最初に同定されたニュートロフィンであって、末梢と中枢の両方のニューロンの発達および生存におけるその役割は、十分に特性決定されてきた。ＮＧＦは、末梢交感神経ニューロンと胚の感覚ニューロン、並びに基底前脳コリン作動性ニューロンの発達に必須な生存および維持因子であることが示されている。Ｓｍｅｙｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：２４６−２４９（１９９４）およびＣｒｏｗｌｅｙら，Ｃｅｌ ｌ７６：１００１−１０１１（１９９４）。ＮＧＦは、神経ペプチドの感覚ニューロンにおける発現をアップレギュレートし（ＬｉｎｄｓａｙとＨａｒｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３６２−３６４（１９８９））、その活性は、２つの異なる膜結合性受容体、ＴｒｋＡチロシンキナーゼ受容体とｐ７５共通ニュートロフィン受容体（それぞれ「高アフィニティー」および「低アフィニティー」ＮＧＦ受容体と呼ばれるときがある）を介して仲介される。Ｃｈａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：５１８−５２１（１９８６）。ｐ７５受容体は、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの他のメンバーへ構造的に関連する（Ｃｈａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：５１８−５２１（１９８６））。ＮＧＦに関する概説については、Ｈｕａｎｇら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：６７７−７３６（２００１）；Ｂｉｂｅｌら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：２９１９−２９３７（２０００）を参照のこと。ＮＧＦと、ｔｒｋＡ受容体と複合したＮＧＦの結晶構造が決定されている。Ｎａｔｕｒｅ ２５４：４１１（１９９１）；Ｎａｔｕｒｅ ４０１：１８４−１８８（１９９６）を参照のこと。
神経系におけるその効果に加えて、ＮＧＦは、神経系の外側のプロセスとますます関連付けられてきた。例えば、ＮＧＦは、血管透過性を高める（Ｏｔｔｅｎら，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０６：１９９−２０１（１９８４））、Ｔ細胞およびＢ細胞の免疫応答を高める（Ｏｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００５９−１００６３（１９８９））、リンパ球分化と肥満細胞増殖を誘導して、可溶性の生物学的シグナルの肥満細胞からの放出を引き起こす（Ｍａｔｓｕｄａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６５０８−６５１２（１９８８）；Ｐｅａｒｃｅら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７２：３７９−３９３（１９８６）；Ｂｉｓｃｈｏｆｆら，Ｂｌｏｏｄ ７９：２６６２−２６６９（１９９２）；Ｈｏｒｉｇｏｍｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４８８１−１４８８７（１９９３））ことが示されている。外因的に加えたＮＧＦでは、上記の効果のすべてを有することが可能であることが示されたが、内因性ＮＧＦがこれらのプロセスのいずれでもｉｎ ｖｉｖｏで重要であることごく稀にしか示されていないことに留意するのは重要である（Ｔｏｒｃｉａら，Ｃｅｌｌ．８５（３）：３４５−５６（１９９６））。故に、内因性ＮＧＦの生体活性を阻害することの効果が、あるとすれば何なのかは、明らかでない。
ＮＧＦは、肥満細胞（Ｌｅｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３７３９−３７４３（１９９４））、Ｂリンパ球（Ｔｏｒｃｉａら，Ｃｅｌｌ ８５：３４５−３５６（１９９６）、角化細胞（Ｄｉ Ｍａｒｃｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８３８−２２８４６））、平滑筋細胞（Ｕｅｙａｍａら，Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１１：１０６１−１０６５（１９９３））、線維芽細胞（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：７９５−８０１（１９９０））、気管支上皮細胞（Ｋａｓｓｅｌら，Ｃｌｉｎ，Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ３１：１４３２−４０（２００１））、腎メサンギウム細胞（Ｓｔｅｉｎｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｆ７９２−７９８（１９９１））、および骨格筋の筋管（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｊ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ６６：１９５−２００（２００２））が含まれるいくつかの細胞種により産生される。ＮＧＦ受容体は、神経系の外側の多様な細胞種で見出されてきた。例えば、ＴｒｋＡは、ヒト単球、ＴおよびＢリンパ球、および肥満細胞上で見出されている。
増加したＮＧＦレベルと多様な炎症状態の間の関連性がいくつかの動物モデルだけでなくヒト患者でも観察されてきた。これらには、全身性紅斑性狼瘡（Ｂｒａｃｃｉ−Ｌａｕｄｉｅｒｏら，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ４：５６３−５６５（１９９３））、多発性硬化症（Ｂｒａｃｃｉ−Ｌａｕｄｉｅｒｏら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１４７：９−１２（１９９２））、乾癬（Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉら，Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ．ｌ’ｅｎｅｒｅｏｌ．７８：８４−８６（１９９８））、関節炎（Ｆａｌｃｉｍら，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５５：７４５−７４８（１９９６））、間質性膀胱炎（Ｏｋｒａｇｌｙら，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １６１：４３８−４４１（１９９９））、および喘息（Ｂｒａｕｎら，Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３２４０−３２５１（１９９８））が含まれる。
首尾一貫して、末梢組織におけるＮＧＦの上昇レベルは、痛覚過敏や炎症と関連していて、いくつかの関節炎の形態で観察されてきた。慢性関節リウマチに罹患した患者の滑膜が高レベルのＮＧＦを発現する一方で、非炎症性の滑膜ＮＧＦは、検出不能であると報告されている（Ａｌｏｅら，Ａｒｃｈ．Ｒｈｅｕｍ．３５：３５１−３５５（１９９２））。実験的に誘発した慢性関節リウマチのラットでも、同様の結果が見られた（Ａｌｏｅら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１０：２０３−２０４（１９９２））。トランスジェニック関節炎マウスでは、肥満細胞の数の増加とともに、ＮＧＦの上昇レベルが報告されている（Ａｌｏｅら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ−Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ａｓｐｅｃｔｓ １５：１３９−１４３（１９９３））。ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ０２／０９６４５８は、ある種の特性がある抗ＮＧＦ抗体の、炎症状態のような様々なＮＧＦ関連障害（例、慢性関節リウマチ）を治療することにおける使用を開示する。ヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）遺伝子を担う関節炎トランスジェニックマウスへ注射した精製抗ＮＧＦ抗体は、関節炎マウスの滑膜内のヒスタミンおよびサブスタンスＰレベルの減少だけでなく、肥満細胞の数の低下を引き起こした（Ａｌｏｅら，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．１４：２４９−２５２（１９９５））。ＮＧＦ抗体の外からの投与により、関節炎マウスにおいて生じるＴＮＦ−αの亢進レベルが低下したことが示されている（Ｍａｎｎｉら，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．１８：９７−１０２（１９９８））。
また、ヒト骨関節炎の軟骨細胞では、ＮＧＦおよび高アフィニティーＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）の増加した発現が観察された（Ｉａｎｎｏｎｅら，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ４１：１４１３−１４１８（２００２））。
齧歯動物の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が報告されている。例えば、Ｈｏｎｇｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（２０００）１９（３）：２１５−２２７；Ｒｕｂｅｒｔｉら，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１３（５）：５５９−５６８を参照のこと。しかしながら、齧歯動物の抗体をヒトにおいて療法的に使用する場合、治療される個体の有意数でヒトの抗マウス抗体応答が発現される。さらに、マウス抗体のエフェクター機能は、ヒトのコンテクストではさほど効率的でないことが証明されている。従って、ヒト化抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が含まれる、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体への重大なニーズがある。
本明細書に開示するすべての参考文献、刊行物、および特許出願は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
発明の簡単な概要
本明細書に開示する発明は、神経成長因子への抗体に関する。
別の側面において、本発明は、ヒトおよび齧歯動物の神経成長因子（「ＮＧＦ」）へ特異的に結合する、ヒト化およびアフィニティー成熟化抗体、Ｅ３である。Ｅ３の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図１Ａ（配列番号１）および１Ｂ（配列番号２）にそれぞれ示す。抗体Ｅ３のＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔ ＣＤＲが含まれる）を図１Ａおよび１Ｂに図解的に図示する。Ｅ３重鎖および軽鎖と個々の延長ＣＤＲのアミノ酸配列も以下に示す（以下の「抗体配列」を参照のこと）。
別の側面において、本発明は、抗体Ｅ３（本明細書では交換可能的に「Ｅ３」と呼ぶ）の断片または領域を含んでなる抗体である。１つの態様において、断片は、図１Ｂに示すような抗体Ｅ３の軽鎖である。別の態様において、断片は、図１Ａに示すような抗体Ｅ３の重鎖である。なお別の態様において、断片は、抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖からの１以上の可変領域を含有する。なお別の態様において、断片は、図１Ａおよび１Ｂに示すような抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖からの１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖を含んでなる抗体である。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる重鎖を含んでなる抗体である。別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖；および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる重鎖を含んでなる抗体である（本明細書では便宜上、寄託された宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドを、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４、ＰＴＡ−４８９３およびＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有すると言及する）。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖の軽鎖可変領域を含んでなる抗体である。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる重鎖の重鎖可変領域を含んでなる抗体である。別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖の軽鎖可変領域、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる重鎖の重鎖可変領域を含んでなる抗体である。なお別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる１以上のＣＤＲ；および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる重鎖を含んでなる抗体である。
いくつかの態様において、抗体は、ヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、ヒト軽鎖κ定常領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、免疫学的に不活性である（例えば、補体仲介性溶解を始動しないし、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない）定常領域のような修飾定常領域を含む。他の態様において、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／またはイギリス特許出願番号９８０９９５１．８に記載のように修飾される。なお他の態様において、抗体は、以下の突然変異を含んでなるヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域を含む：Ａ３３０Ｐ３３１→Ｓ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列を基準にしたアミノ酸の番号付け）。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４。
別の側面において、本発明は、以下のどの１以上も含んでなるポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）を提供する：ａ）図１Ａおよび１Ｂに示す抗体Ｅ３の１以上のＣＤＲ；ｂ）図１Ａに示す抗体Ｅ３の重鎖からのＣＤＲ Ｈ３；ｃ）図１Ｂに示す抗体Ｅ３の軽鎖からのＣＤＲ Ｌ３；ｄ）図１Ｂに示す抗体Ｅ３の軽鎖からの３つのＣＤＲ；ｅ）図１Ａに示す抗体Ｅ３の重鎖からの３つのＣＤＲ；およびｆ）図１Ａおよび１Ｂに示す抗体Ｅ３の、軽鎖からの３つのＣＤＲと重鎖からの３つのＣＤＲ。さらに本発明は、以下のどの１以上も含んでなるポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）を提供する：ａ）図１Ａおよび１Ｂに示す抗体Ｅ３に由来する１以上（１、２、３、４、５、または６）のＣＤＲ；ｂ）図１Ａに示す抗体Ｅ３の重鎖からのＣＤＲ Ｈ３に由来するＣＤＲ；および／またはｃ）図１Ｂに示す抗体Ｅ３の軽鎖からのＣＤＲ Ｌ３に由来するＣＤＲ。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ） ＣＤＲ、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの組合せ（本明細書では「延長」または「組合せ」ＣＤＲと呼ぶ）であってよい。いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、ＮＧＦ（ヒトＮＧＦのような）へ結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、本明細書に記載されるＣＤＲ配置（組合せ、変異体、等）のいずれも含む。
１つの側面において、本発明は、配列番号９（ここでＩ３４は、Ｓ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＩであり；そしてＮ３５は、Ｎ、ＴまたはＳで置換されている）を含んでなる重鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。本明細書では便宜上、このコンテクストまたはアミノ酸への言及における「置換（されている）」または「である」は、所与の位置でのアミノ酸の選択に関連する。明らかであるように、置換または選択は、配列番号または図に図示されるアミノ酸であり得る。
別の側面において、本発明は、配列番号１０（ここでＭ５０は、Ｍ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、またはＬであり；Ａ６２は、ＡまたはＳであり；そしてＬ６３は、ＬまたはＶである）を含んでなる重鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｄ、ＮまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、Ｙ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである）を含んでなる重鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）を含んでなる重鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１１（ここでＧ９８は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＧ９９は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）を含んでなる重鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。

別の側面において、本発明は、配列番号１２（ここでＳ２６は、ＳまたはＦであり；Ｄ２８は、Ｄ、Ｓ、ＡまたはＹであり；そしてＨ３２は、Ｈ、ＮまたはＱである）を含んでなる軽鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１３（ここでＩ５１は、Ｉ、Ｔ、ＶまたはＡであり；そしてＳ５６は、ＳまたはＴである）を含んでなる軽鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、Ｋ、Ｈ、ＲまたはＳであり；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）を含んでなる軽鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、どのアミノ酸でもよく；Ｔ９３は、どのアミノ酸でもよく；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）を含んでなる軽鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
１つの側面において、本発明は、配列番号９（ここでＩ３４は、Ｓ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり；そしてＮ３５は、Ｎ、ＴまたはＳである）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１０（ここでＭ５０は、Ｍ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり；Ａ６２は、ＡまたはＳであり；そしてＬ６３は、ＬまたはＶである）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｄ、ＮまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、Ｙ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１１（ここでＧ９８は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＧ９９は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１２（ここでＳ２６は、ＳまたはＦであり；Ｄ２８は、Ｄ、Ｓ、ＡまたはＹであり；そしてＨ３２は、Ｈ、ＮまたはＱである）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１３（ここでＩ５１は、Ｉ、Ｔ、ＶまたはＡであり；そしてＳ５６は、ＳまたはＴである）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、Ｋ、Ｈ、ＲまたはＳであり；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、どのアミノ酸でもよく；Ｔ９３は、どのアミノ酸でもよく；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。
別の側面において、本発明は、配列番号９（ここでＩ３４は、Ｓ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり；そしてＮ３５は、Ｎ、ＴまたはＳである）のＣＤＲ１領域；配列番号１０（ここでＭ５０は、Ｍ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり；Ａ６２は、ＡまたはＳであり；そしてＬ６３は、ＬまたはＶである）のＣＤＲ２領域；そして配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｄ、ＮまたはＧであり；ここでＹ１１０は、Ｙ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである）のＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域を含むポリペプチド（ヒト化抗体が含まれる抗体のような）を提供する。いくつかの態様において、重鎖可変領域は、配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；ここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）のＣＤＲ３領域を含む。他の態様において、重鎖可変領域は、配列番号１１（ここでＧ９８は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＧ９９は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）のＣＤＲ３領域を含む。いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、抗体軽鎖可変領域をさらに含む。
別の側面において、本発明は、配列番号１２（ここでＳ２６は、ＳまたはＦであり；Ｄ２８は、Ｄ、Ｓ、ＡまたはＹであり；そしてＨ３２は、Ｈ、ＮまたはＱである）のＣＤＲ１領域；配列番号１３（ここでＩ５１は、Ｉ、Ｔ、ＶまたはＡであり；そしてＳ５６は、ＳまたはＴである）のＣＤＲ２領域；および配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、Ｋ、Ｈ、ＲまたはＳであり；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）のＣＤＲ３領域を含んでなる軽鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、どのアミノ酸でもよく；Ｔ９３は、どのアミノ酸でもよく；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）のＣＤＲ３領域を含む。いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、抗体重鎖をさらに含む。
別の側面において、本発明は、（ａ）配列番号９（ここでＩ３４は、Ｓ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり；そしてＮ３５は、Ｎ、ＴまたはＳである）のＣＤＲ１領域；配列番号１０（ここでＭ５０は、Ｍ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり；Ａ６２は、ＡまたはＳであり；そしてＬ６３は、ＬまたはＶである）のＣＤＲ２領域；そして配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｄ、ＮまたはＧであり；ここでＹ１１０は、Ｙ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである）のＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号１２（ここでＳ２６は、ＳまたはＦであり；Ｄ２８は、Ｄ、Ｓ、ＡまたはＹであり；そしてＨ３２は、Ｈ、ＮまたはＱである）のＣＤＲ１領域；配列番号１３（ここでＩ５１は、Ｉ、Ｔ、ＶまたはＡであり；そしてＳ５６は、ＳまたはＴである）のＣＤＲ２領域；および配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、Ｋ、Ｈ、ＲまたはＳであり；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）のＣＤＲ３領域を含んでなる軽鎖可変領域を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、どのアミノ酸でもよく；Ｔ９３は、どのアミノ酸でもよく；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）のＣＤＲ３領域を含む。いくつかの態様において、重鎖可変領域は、配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；ここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）のＣＤＲ３領域を含む。他の態様において、重鎖可変領域は、配列番号１１（ここでＧ９８は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＧ９９は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）のＣＤＲ３領域を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、抗体軽鎖をさらに含む。
別の側面において、本発明は、配列番号９（ここでＩ３４は、Ｓ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり；そしてＮ３５は、Ｎ、ＴまたはＳである）に示すアミノ酸配列；配列番号１０（ここでＭ５０は、Ｍ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり；Ａ６２は、ＡまたはＳであり；そしてＬ６３は、ＬまたはＶである）に示すアミノ酸配列；および配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｄ、ＮまたはＧであり；ここでＹ１１０は、Ｙ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（ヒト化抗体が含まれる抗体のような）を提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；そしてここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）に示すアミノ酸配列を含む。他の態様において、ポリペプチドは、配列番号１１（ここでＧ９８は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＧ９９は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、抗体軽鎖可変領域をさらに含む。
別の側面において、本発明は、配列番号１２（ここでＳ２６は、ＳまたはＦであり；Ｄ２８は、Ｄ、Ｓ、ＡまたはＹであり；そしてＨ３２は、Ｈ、ＮまたはＱである）に示すアミノ酸配列；配列番号１３（ここでＩ５１は、Ｉ、Ｔ、ＶまたはＡであり；そしてＳ５６は、ＳまたはＴである）に示すアミノ酸配列；および、配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、Ｋ、Ｈ、ＲまたはＳであり；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、どのアミノ酸でもよく；Ｔ９３は、どのアミノ酸でもよく；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、抗体重鎖可変領域をさらに含む。
別の側面において、本発明は、（ａ）配列番号９（ここでＩ３４は、Ｓ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり；そしてＮ３５は、Ｎ、ＴまたはＳである）に示すアミノ酸配列；配列番号１０（ここでＭ５０は、Ｍ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり；Ａ６２は、ＡまたはＳであり；そしてＬ６３は、ＬまたはＶである）に示すアミノ酸配列；および配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｄ、ＮまたはＧであり；ここでＹ１１０は、Ｙ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである）に示すアミノ酸配列；および（ｂ）配列番号１２（ここでＳ２６は、ＳまたはＦであり；Ｄ２８は、Ｄ、Ｓ、ＡまたはＹであり；そしてＨ３２は、Ｈ、ＮまたはＱである）に示すアミノ酸配列；配列番号１３（ここでＩ５１は、Ｉ、Ｔ、ＶまたはＡであり；そしてＳ５６は、ＳまたはＴである）に示すアミノ酸配列；および、配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、Ｋ、Ｈ、ＲまたはＳであり；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体のような）を提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、どのアミノ酸でもよく；Ｔ９３は、どのアミノ酸でもよく；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；ここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）に示すアミノ酸配列を含む。他の態様において、ポリペプチドは、配列番号１１（ここでＧ９８は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＧ９９は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり；ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、どのアミノ酸でもよい）に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、抗体軽鎖可変領域をさらに含む。
別の側面において、本発明は、（ａ）配列番号９（ここでＩ３４は、Ｓ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり；そしてＮ３５は、Ｎ、ＴまたはＳで置換されている）のＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号１０（ここでＭ５０は、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり；Ａ６２は、ＡまたはＳであり；そしてＬ６３は、ＬまたはＶである）のＣＤＲ２領域；および（ｃ）配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｄ、ＮまたはＧであり；そしてここでＹ１１０は、Ｙ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである）のＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域を含んでなるポリペプチド（抗体のような）を提供し、ここで抗体は、ＮＧＦへ結合する。
別の側面において、本発明は、（ａ）配列番号１２（ここでＳ２６は、ＳまたはＦであり；Ｄ２８は、Ｄ、Ｓ、ＡまたはＹであり；そしてＨ３２は、Ｈ、ＮまたはＱである）のＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号１３（ここでＩ５１は、Ｉ、Ｔ、ＶまたはＡであり；そしてＳ５６は、ＳまたはＴである）のＣＤＲ２領域；および（ｃ）配列番号１４（ここでＫ９２は、Ｋ、Ｈ、ＲまたはＳであり；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）のＣＤＲ３領域を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチド（抗体のような）を提供し、ここで抗体は、ＮＧＦへ結合する。
別の側面において、本発明は、（ａ）（ｉ）配列番号９（ここでＩ３４は、Ｓ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩで置換されていて；そしてＮ３５は、Ｎ、ＴまたはＳで置換されている）のＣＤＲ１領域；（ｉｉ）配列番号１０（ここでＭ５０は、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり；Ａ６２は、ＡまたはＳであり；そしてＬ６３は、ＬまたはＶである）のＣＤＲ２領域；および（ｉｉｉ）配列番号１１（ここでＹ１００は、Ｙ、ＬまたはＲであり；ここでＹ１０１は、ＹまたはＷであり；ここでＧ１０３は、Ｇ、ＡまたはＳであり；ここでＴ１０４は、ＴまたはＳであり；ここでＳ１０５は、Ｓ、ＡまたはＴであり；ここでＹ１０６は、Ｙ、Ｒ、ＴまたはＭであり；ここでＹ１０７は、ＹまたはＦであり；ここでＦ１０８は、ＦまたはＷであり；ここでＤ１０９は、Ｄ、ＮまたはＧであり；ここでＹ１１０は、Ｙ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである）のＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域；および（ｂ）（ｉ）配列番号１２（ここでＳ２６は、ＳまたはＦであり；Ｄ２８は、Ｄ、Ｓ、ＡまたはＹであり；そしてＨ３２は、Ｈ、ＮまたはＱである）のＣＤＲ１領域；（ｉｉ）配列番号１３（ここでＩ５１は、Ｉ、Ｔ、ＶまたはＡであり；そしてＳ５６は、ＳまたはＴである）のＣＤＲ２領域；および（ｉｉｉ）配列番号１４（ここでＳ９１は、ＳまたはＥであり；Ｋ９２は、Ｋ、Ｈ、ＲまたはＳであり；そしてここでＹ９６は、ＹまたはＲである）のＣＤＲ３領域を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチド（抗体のような）を提供し、ここで抗体は、ＮＧＦへ結合する。
他に述べなければ、１つの位置におけるアミノ酸の選択（例えば、置換）は、他のどの位置にあるアミノ酸の選択より独立して選択される。
いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、ＮＧＦ（ヒトＮＧＦのような）へ結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、本明細書に記載するＣＤＲ配置（組合せ、変異体、等）のいずれも含む。
本明細書の記載から明らかであるように、本明細書に使用する可変領域番号付けは、連続した番号付けである。当業者は、いくつかの抗体番号付けシステム（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けのような）が存在することと、連続した番号付けをＫａｂａｔ番号付けまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けのような番号付けシステムへ変換する方法を容易に理解する。
別の側面において、本発明は、配列番号４６または５０より選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ３配列のような）を含んでなるポリペプチド（抗体のような）を提供する。なお他の態様において、ポリペプチドは、配列番号３、４、５、６、７、および８に示すアミノ酸配列の１以上をさらに含む。なお他の態様において、ポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５に示すアミノ酸配列の１以上をさらに含む。
別の側面において、本発明は、（ａ）配列番号２８および／または２９；（ｂ）配列番号３０および／または３１；（ｃ）配列番号３２および／または３３；（ｄ）配列番号３４および／または３５；（ｅ）配列番号３６および／または３７；（ｆ）配列番号３８および／または３９；並びに（ｇ）配列番号４０および４１より選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ Ｈ１および／またはＣＤＲ Ｈ２領域のようなＣＤＲ領域のような）を含んでなるポリペプチド（抗体のような）を提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号２８、３０、３２、３４、３６、３８、および４０より選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ Ｈ１領域のような）を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１より選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ Ｈ２領域のような）を含む。なお他の態様において、ポリペプチドは、配列番号３、４、５、６、７、および８に示すアミノ酸配列の１以上をさらに含む。なお他の態様において、ポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５に示すアミノ酸配列の１以上をさらに含む。
別の側面において、本発明は、（ａ）配列番号１８および／または１９；（ｂ）配列番号２０および／または２１；並びに（ｃ）配列番号２２および／または２３より選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ Ｌ１および／またはＣＤＲ Ｌ２領域のようなＣＤＲ領域のような）を含んでなるポリペプチド（抗体のような）を提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号１８、２０、および２２より選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ Ｌ１領域のような）を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号１９、２１、および２３より選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ Ｌ２領域のような）を含む。なお他の態様において、ポリペプチドは、配列番号３、４、５、６、７、８に示すアミノ酸配列の１以上をさらに含む。なお他の態様において、ポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５に示すアミノ酸配列の１以上をさらに含む。
別の側面において、本発明は、（ａ）配列番号５１および／または５２；（ｂ）配列番号５５および／または５６；（ｃ）配列番号５７および／または５８；（ｃ）配列番号５９および／または６０；（ｄ）配列番号６１および／または６２；（ｅ）配列番号６３および／または６４より選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ Ｌ３および／またはＣＤＲ Ｈ３領域のようなＣＤＲ領域のような）を含んでなるポリペプチド（抗体のような）を提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号５１、５５、５７、５９、６１、および６３より選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ Ｌ３領域のような）を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号５２、５６、５８、６０、６２、および６４より選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ Ｈ３領域のような）を含む。なお他の態様において、ポリペプチドは、配列番号１８、１９、３０および３１の１以上に示すアミノ酸配列をさらに含む。なお他の態様において、ポリペプチドは、配列番号３、４、５、６、７、および８に示すアミノ酸配列の１以上をさらに含む。なお他の態様において、ポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５に示すアミノ酸配列の１以上をさらに含む。
別の側面において、本発明は、配列番号６１、６３、１８、１９、３０および３１に示すアミノ酸配列（ＣＤＲ領域のような）の１以上を含んでなるポリペプチド（抗体のような）を提供する。
１つの側面において、本発明は、ＮＧＦ（ヒトＮＧＦのような）へ高いアフィニティーで結合する抗ＮＧＦ抗体（アンタゴニスト抗体のような）を提供する。いくつかの態様において、高いアフィニティーは、（ａ）ＮＧＦへ約２ｎＭ未満（約１ｎＭ、８００ｐＭ、６００ｐＭ、４００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのような）のＫＤ、および／または約６ｘ１０−５ｓ−１より遅いｋｏｆｆで結合すること；および／または（ｂ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下に）約２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０で阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎ）（抑制（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、および／または阻止（ｂｌｏｃｋｉｎｇ））すること；および／または（ｃ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下に）約５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０で阻害（抑制、および／または阻止）すること；および／または（ｄ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存性の生存を（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下に）約１５０ｐＭ、１２５ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０で阻害（抑制、および／または阻止）すること；および／または（ｅ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存性の生存を（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下に）約３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭ、３ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０で阻害（抑制、および／または阻止）すること；および／または（ｆ）ｔｒｋＡ受容体より高いアフィニティーでＮＧＦへ結合することである。
別の側面において、本発明は、ポリペプチド（抗体のような）を提供し、ここでポリペプチドは、（ａ）ＮＧＦ（ヒトＮＧＦのような）へ約２ｎＭ未満（約１ｎＭ、８００ｐＭ、６００ｐＭ、４００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのような）のＫＤ、および／または約６ｘ１０−５ｓ−１より遅いｋｏｆｆで結合する；および／または（ｂ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下に）約２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０で阻害（抑制、および／または阻止）する；および／または（ｃ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下に）約５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０で阻害（抑制、および／または阻止）する；および／またはｔｒｋＡ受容体より高いアフィニティーでＮＧＦへ結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、（ａ）ＮＧＦへ約２ｎＭ未満のＫＤで結合する；および／または（ｂ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を約１００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する（ここでＩＣ５０は、約１５ｐＭ ＮＧＦの存在下に測定する）；および／または（ｃ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を約１０ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する（ここでＩＣ５０は、約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下に測定する、ここでＩＣ５０は、約１５ｐＭ ＮＧＦの存在下に測定する）。いくつかの態様において、ポリペプチドは、（ａ）ＮＧＦへ約１００ｐＭ未満のＫＤで結合する；および／または（ｂ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を約２０ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する（ここでＩＣ５０は、約１５ｐＭ ＮＧＦの存在下に測定する）；および／または（ｃ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を約２ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する（ここでＩＣ５０は、約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下に測定する）。
本明細書の記載から明らかであるように、本明細書より特に除外されるのは、マウスモノクローナル抗体、９１１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドの態様である。Ｍａｂ９１１の延長ＣＤＲ配列を図１Ａおよび１Ｂと配列番号９〜１４に示す。
いくつかの態様において、本発明は、上記ポリペプチドまたは抗体のいずれも提供して、さらにここでポリペプチド（抗体のような）は、単離されている。いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、実質的に精製されている。なお他の態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、アフィニティー成熟化している。他の態様において、抗体は、アンタゴニスト抗体である。いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、ヒトフレームワーク配列を含む。なお他の態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、１以上の非ヒトフレームワーク残基を含む。いくつかの態様において、ポリペプチド（抗体のような）は、ＮＧＦ（ヒトＮＧＦのような）へ２ｎＭ以下のＫＤで結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、非ヒトアミノ酸配列（可変領域配列のような、ＣＤＲ配列のような、フレームワーク配列のような）に対する１以上（２、３、４、５、６、７、８以上のような）のヒトアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、元のポリペプチドアミノ酸配列（配列番号９〜１４のいずれか１以上のような、抗体９１１アミノ酸配列のような）に対して、少なくとも１、少なくとも２、または少なくとも３、４、５、６以上のようなアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、抗体の結合アフィニティーは、元の抗体（Ｍａｂ９１１のような）アフィニティーに対して改変されている（いくつかの態様において、増加している）。なお他の態様において、抗体の結合アフィニティーは、ｔｒｋＡ受容体のＮＧＦ（ヒトＮＧＦのような）への結合アフィニティーより低い。いくつかの態様において、ポリペプチドは、抗体であり得る。いくつかの態様において、抗体は、ヒト抗体である。他の態様において、抗体は、ヒト化抗体である。なお他の態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体は、アフィニティー成熟化抗体である。
本発明は、上記態様のいずれもコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（単離ポリヌクレオチドが含まれる）を提供する。
別の側面において、本発明は、抗体Ｅ３（本明細書においては、交換可能的に「Ｅ３」と呼ぶ）の断片または領域をコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離ポリヌクレオチドを提供する。１つの態様において、断片は、図１Ｂに示すような抗体Ｅ３の軽鎖である。別の態様において、断片は、図１Ａに示すような抗体Ｅ３の重鎖である。なお別の態様において、断片は、抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖からの１以上の可変領域を含有する。なお別の態様において、断片は、図１Ａおよび１Ｂに示すような抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖からの１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
別の側面において、本発明は、抗体Ｅ３をコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離ポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、図２および３に示すポリヌクレオチドの片方または両方を含む。
別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いたＥ３軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドである。別の側面において、本発明はＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いたＥ３重鎖をコードする単離ポリヌクレオチドである。なお別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いたポリヌクレオチド中でコードされる可変領域、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いたポリヌクレオチド中でコードされる可変領域を含んでなる単離ポリヌクレオチドである。別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いたポリヌクレオチド中でコードされる１以上のＣＤＲ；および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いたポリヌクレオチド中でコードされる１以上のＣＤＲを含んでなる単離ポリヌクレオチドである。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載の抗体（抗体断片が含まれる）またはポリペプチドのいずれもコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の側面において、本発明は、本明細書に開示するポリヌクレオチドのいずれも含んでなるベクター（発現およびクローニングベクターが含まれる）および宿主細胞を提供する。
本明細書の記載から明らかであるように、本明細書より特に除外されるのは、マウスモノクローナル抗体、９１１のポリヌクレオチド配列と同一のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの態様である。Ｍａｂ９１１の延長ＣＤＲ配列を図１Ａおよび１Ｂと配列番号９〜１４に示す。
別の側面において、本発明は、Ｅ３軽鎖をコードするポリヌクレオチドとＥ３重鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞であり、ここでＥ３軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３および／またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有し、Ｅ３重鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有する。いくつかの態様において、宿主細胞は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いたポリヌクレオチド中でコードされる可変領域、および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いたポリヌクレオチド中でコードされる可変領域を含んでなるポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いたポリヌクレオチド中でコードされる１以上のＣＤＲ；および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いたポリヌクレオチド中でコードされる１以上のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
別の側面において、本発明は、ＮＧＦへ抗体Ｅ３が結合した複合体である。別の側面において、この複合体は、単離されている。別の側面において、この複合体は、実質的に精製されている。
別の側面において、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドのいずれもＮＧＦへ結合した複合体である。別の側面において、この複合体は、単離されている。別の側面において、この複合体は、実質的に精製されている。
別の側面において、本発明は、抗体Ｅ３または抗体Ｅ３の断片を含んでなる抗体と医薬的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物のような、本明細書に記載のポリペプチド（抗体Ｅ３のような抗体が含まれる）またはポリヌクレオチドのいずれも含んでなる医薬組成物である。
別の側面において、本発明は、抗体Ｅ３をコードする発現ベクターを含んでなる宿主細胞を調製すること；上記宿主細胞またはその子孫を、抗体Ｅ３の産生を可能にする条件下で培養すること；および、抗体Ｅ３を精製することを含んでなる、抗体Ｅ３を産生する方法である。いくつかの態様において、発現ベクターは、図２および３に示すポリヌクレオチド配列の一方または両方を含む。
別の側面において、本発明は、Ｅ３軽鎖をコードするポリヌクレオチドとＥ３重鎖をコードするポリヌクレオチドを好適な細胞において発現させること（ここでＥ３軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３および／またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有し、Ｅ３重鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５を有する）；一般に、これに続けて、該抗体を回収および／または単離することを含んでなる、抗体Ｅ３を産生する方法である。
別の側面において、本発明は、該抗体をコードする１以上のポリヌクレオチドを好適な細胞において発現させること（これは、単一の軽鎖または重鎖として別々に発現させても、軽鎖と重鎖の両方を１つのベクターより発現させてもよい）、一般に、これに続けて、目的の抗体またはポリペプチドを回収および／または単離することによって、本明細書に記載のポリペプチド（抗体のような）のいずれも産生する方法を提供する。
別の側面において、本発明は、本明細書に開示するポリペプチド（抗体Ｅ３のような抗体が含まれる）のいずれも使用して、ＮＧＦ（ヒトＮＧＦのような）の生物学的活性に拮抗する方法である。１つの態様において、本方法は、本明細書に記載のポリペプチド（抗体Ｅ３が含まれる）のいずれかとヒト神経成長因子を接触させることによって、ＮＧＦ活性（ヒト神経成長因子活性のような）を拮抗、抑制、阻止、または抑圧させることを含む。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド（抗体Ｅ３のような抗体が含まれる）のいずれも使用して、ＮＧＦを検出する方法である。ＮＧＦと本明細書に記載のポリペプチド（抗体Ｅ３のような）のいずれかとの間の複合体を検出することによって、ＮＧＦの存在を検出する。本明細書に使用する用語「検出」には、対照への参照を伴うかまたは伴わない、定性的および／または定量的な検出（レベルを測定する）が含まれる。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載の抗体Ｅ３またはポリペプチド（抗体が含まれる）またはポリヌクレオチド態様のいずれも含んでなる組成物の有効量を投与することによって疼痛を治療する方法である。いくつかの態様において、疼痛は、術後疼痛である。
別の側面において、本発明は、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を個体へ投与することによって、該個体において慢性関節リウマチ疼痛を予防または治療するための方法である。本発明により、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が、慢性関節リウマチに関連した疼痛を阻害または阻止することが可能であることが示された。いくつかの態様において、疼痛は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与後約２４時間以内に緩和される。いくつかの態様において、疼痛は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与後約４日以内に緩和される。いくつかの態様において、疼痛は、個体における炎症状態の改善の徴候を観察する前に、またはその非存在下で緩和される。
別の側面において、本発明は、個体において、慢性関節リウマチ疼痛の発症を抑える、慢性関節リウマチ疼痛を改善する、慢性関節リウマチ疼痛を抑圧する、慢性関節リウマチ疼痛を緩和する、および／または慢性関節リウマチ疼痛の発現、発達、または進行を遅らせるための方法を提供し、前記方法は、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を該個体へ投与することを含んでなる。
別の側面において、本発明は、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与することを含んでなる、個体において慢性関節リウマチに関連した炎症性悪液質（体重損失）を治療するための方法を提供する。
別の側面において、本発明は、神経成長因子のアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の有効量を個体へ投与することによって、該個体において骨関節炎疼痛を予防または治療するための方法である。
別の側面において、本発明は、個体において、骨関節炎疼痛の発症を抑える、骨関節炎疼痛を改善する、骨関節炎疼痛を抑圧する、骨関節炎疼痛を緩和する、および／または骨関節炎疼痛の発現、発達、または進行を遅らせるための方法を提供し、前記方法は、ＮＧＦのアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の有効量を該個体へ投与することを含んでなる。
別の側面において、本発明は、骨関節炎を有する個体において身体機能を改善するための方法を提供し、前記方法は、ＮＧＦのアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の有効量を該個体へ投与することを含んでなる。
別の側面において、本発明は、骨関節炎を有する個体においてこわばりを改善するための方法を提供し、前記方法は、ＮＧＦのアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の有効量を該個体へ投与することを含んでなる。
いくつかの態様において、個体は、ヒトである。いくつかの態様において、骨関節炎疼痛を治療するために、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投薬頻度は、毎週１回と１０週毎に１回の間であるか、またはそれほど頻繁ではない。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載の組成物のどの１以上も含んでなるキットおよび組成物を提供する。これらのキットは、概して好適な包装状態にあって、適正な説明書とともに提供され、本明細書に記載の方法のいずれにも有用である。本発明はまた、本明細書に記載の方法のいずれにも使用の医薬組成物を提供し、該組成物は、有効量のＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦ抗体のような）と医薬的に許容される担体を含む。
本発明はまた、医薬品としての使用、および／または医薬品の製造のための使用のコンテクストにかかわらず、本明細書に記載のどの使用についても記載される組成物およびキットのいずれも提供する。
発明の詳細な説明
本明細書に開示する発明は、ＮＧＦ（ヒトＮＧＦのような）へ高いアフィニティーで結合する抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を提供する。さらに本発明は、ＮＧＦへ結合するＥ３に由来する抗体およびポリペプチドと、これらの抗体を作製して使用する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、神経成長因子（「ＮＧＦ」）へ結合するヒト化抗体、Ｅ３と、この抗体を作製して使用する方法を提供する。本発明はまた、ＮＧＦへ結合するＥ３ポリペプチド（抗体が含まれる）と、Ｅ３抗体および／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本明細書に開示する発明はまた、治療有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与によって、個体において慢性関節リウマチ疼痛を予防する、および／または治療するための方法を提供する。
本明細書に開示する発明はまた、ＮＧＦのアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の治療有効量の投与によって、個体において骨関節炎疼痛を予防する、および／または治療する方法を提供する。
本発明はまた、抗体のアフィニティーを調整するための方法と、ＣＤＲ領域を特性決定するための方法を提供する。
一般技術
本発明の実施は、他に示さなければ、当該技術分野の技量内にある、分子生物学（組換え技術が含まれる）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の慣用技術を利用する。そのような技術は、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）コールドスプリングハーバー・プレス；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ監修，１９８４）；「分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」ヒュマナ・プレス；「細胞生物学：実験ノート（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ）」（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ監修，１９９８）アカデミック・プレス；「動物培養細胞（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ監修，１９８７）；「細胞および組織培養入門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒとＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）プレナム・プレス；「細胞および組織培養：実験手順（Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）」（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ監修，１９９３−１９９８）Ｊ．ウィリー・アンド・サンズ；「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」（アカデミックプレス社）；「実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ監修）；「哺乳動物細胞の遺伝子導入ベクター（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ）」（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ監修，１９８７）；「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，監修，１９８７）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（Ｍｕｌｌｉｓら，監修，１９９４）；「免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，監修，１９９１）；「分子生物学の簡略プロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（ウィリー・アンド・サンズ、１９９９）；「免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；「抗体：実践アプローチ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ｄ．Ｃａｔｔｙ監修，ＩＲＬプレス、１９８８−１９８９）；「モノクローナル抗体：実践アプローチ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ監修，オックスフォード大学出版局、２０００）；「抗体の使用：実験マニュアル（Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（コールドスプリングハーバーラボラトリー・プレス、１９９９）；「抗体（Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ監修，ハーバードアカデミーパブリッシャーズ、１９９５）；並びに「癌：腫瘍学の原理と実践（Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら，監修，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）のような文献において十分説明されている。
定義
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、等のような標的へ特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書に使用するように、この用語には、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのような）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含んでなる融合タンパク質、並びに、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のあらゆる修飾配置も含まれる。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）のような、あらゆるクラスの抗体が含まれて、抗体は、特別なクラスである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスへ帰属可能である。５つの主要な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、このうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へさらに分類可能である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ、およびμとそれぞれ呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造と三次元配置は、よく知られている。
「Ｆｖ」は、全長な抗原の認識および結合部位を含有する抗体断片である。二本鎖Ｆｖ種において、この領域は、緊密な非共有性の会合状態にある、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ種においては、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが、軽鎖と重鎖が二本鎖Ｆｖ種に類似した二量体構造において会合可能であるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有的に連結可能である。それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合特異性を規定するのは、この配置においてである。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つだけのＣＤＲを含んでなるＦｖの半分）でも、全結合部位よりは概して低いアフィニティーであるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインが含まれる重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加により、Ｆａｂ断片から異なる。
「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団を意味し、ここでモノクローナル抗体は、抗原の選択的な結合に関与するアミノ酸（天然に存在する、および非天然に存在する）からなる。モノクローナルの集団はきわめて特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられる。用語「モノクローナル抗体」には、インタクトなモノクローナル抗体と全長モノクローナル抗体だけでなく、それらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのような）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含んでなる融合タンパク質、並びに、必要とされる特異性の抗原認識部位と抗原へ結合する能力を含む免疫グロブリン分子の他のあらゆる修飾配置も含まれる。抗体の供給源やそれが作製されるやり方（例、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物、等による）に関して限定することは企図されない。
本明細書に使用するように、「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するそれを有する抗体、および／または当該技術分野で知られているかまたは本明細書に開示される、ヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製した抗体を意味する。このヒト抗体の定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体が含まれる。１つのそのような例は、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含んでなる抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られた様々な技術を使用して、産生可能である。１つの態様において、ヒト抗体は、ファージライブラリーより選択され、ここでそのファージライブラリーは、ヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４；Ｓｈｅｅｔｓら，１９９８，ＰＮＡＳ，（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１）。ヒト抗体は、トランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が一部または完全に不活性化されたマウス）へヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによっても作製可能である。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；および５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって製造可能である（このようなＢリンパ球は、個体から回収可能であるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化されたものでもよい）。例えば、Ｃｏｌｅら，「モノクローナル抗体と癌療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。
「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部が特別な種に由来するかまたは特別なクラスに属する抗体中の対応配列に相同である一方で、鎖の残るセグメントは、別の種の対応配列に相同である抗体を意味する。典型的には、これらのキメラ抗体では、軽鎖と重鎖の両方の可変領域が哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部分は、別の種に由来する抗体中の配列に相同である。そのようなキメラ型の１つの明瞭な利点は、例えば、容易に利用可能なハイブリドーマまたは非ヒト宿主生物からのＢ細胞を、例えば、ヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて使用して、現在知られている供給源より可変領域を簡便に誘導可能であることである。可変領域が製造の容易さの利点を有する一方で、特異性はその供給源により影響されず、定常領域がヒトであるので、その抗体を注射した場合、ヒト被検者から免疫応答を誘発する可能性は、非ヒト供給源からの定常領域より低い。しかしながら、この定義は、この特別な例に限定されない。
「機能性Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保有する。例示の「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーション、等が含まれる。そのようなエフェクター機能は、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例、抗体可変ドメイン）と組み合うことを概して必要として、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当該技術分野で知られた様々なアッセイを使用して評価可能である。
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾のためにネイティブ配列Ｆｃ領域のそれとは異なるが、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能は保持するアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または元のポリペプチドのＦｃ領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、約１〜約１０のアミノ酸置換）を、そして好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域または元のポリペプチドのＦｃ領域における約１〜約５のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または元のポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、そして最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、それと少なくとも約９５％の配列同一性を保有する。
本明細書に使用するように「抗体依存性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性の細胞（例、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識して、引き続き標的細胞の溶解を引き起こす、細胞仲介性の反応を意味する。目的の分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２または５，８２１，３３７号に記載されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを使用して評価可能である。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞が含まれる。あるいは、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら，１９９８，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６に開示されるような動物モデルにおいて評価可能である。
本明細書に使用するように、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域へ結合する受容体について記載する。好ましいＦｃＲは、ネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）へ結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体の対立遺伝子変異体と選択的にスプライスされる形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインにおいて異なる、類似のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲについては、ＲａｖｅｔｃｈとＫｉｎｅｔ，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２；Ｃａｐｅｌら，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５−３４；およびｄｅ Ｈａａｓら，１９９５，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０−４１に概説されている。「ＦｃＲ」には、母体ＩｇＧの胎児への導入に責任がある新生児受容体、ＦｃＲも含まれる（Ｇｕｙｅｒら，１９７６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７；およびＫｉｍら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４９）。
「補体依存性細胞毒性」および「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的の溶解を意味する。補体活性化経路は、補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）の、コグネイト抗原と複合した分子（例、抗体）への結合によって開始される。補体活性化を評価するには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）に記載のようなＣＤＣアッセイが実施可能である。
本明細書に使用するように、用語「Ｅ３」、「３Ｅ」および「抗体Ｅ３」は、交換可能的に使用されて、図１Ａ（配列番号１）および１Ｂ（配列番号２）にそれぞれ示す重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含んでなる抗体を意味する。抗体Ｅ３のＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔ ＣＤＲが含まれる）を図１Ａおよび１Ｂに概略的に図示する。図２および３は、図１Ａおよび１Ｂにそれぞれ示す重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを示す。Ｅ３の産生および特性決定については、実施例に記載する。異なる生物学的機能がＥ３と関連し、限定されないが、ＮＧＦへ結合してＮＧＦ生物学的活性および／またはＮＧＦシグナル伝達により仲介される下流経路を阻害する能力；および、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を阻害する能力が含まれる。本明細書において考察するように、本発明の抗体は、上記特性のどの１以上も有してよい。いくつかの態様において、用語「Ｅ３」は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有するＥ３軽鎖をコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有するＥ３重鎖をコードするポリヌクレオチドによりコードされる免疫グロブリンを意味する。
本明細書に使用するように、抗体の「免疫特異的」結合は、抗体の抗原結合部位とその抗体により認識される特異抗原の間で生じる抗原特異的な結合相互作用を意味する（即ち、抗体は、ＥＬＩＳＡや他のアッセイにおいて特定のタンパク質と反応するが、無関係のタンパク質とは検出可能なほどに反応しない）。
抗体またはポリペプチドへ「特異的に結合する」または「選好的に結合する」（本明細書において交換可能的に使用する）エピトープは、当該技術分野でよく理解されている用語であり、そのような特異的または選好的な結合を定量する方法も当該技術分野でよく知られている。分子は、代わりの細胞または物質とよりも特定の細胞または物質とより頻繁に、より迅速に、より長い期間で、および／またはより大きなアフィニティーで反応するかまたは会合するならば、「特異結合」または「選好結合」を明示すると言われる。抗体は、他の物質へ結合するよりも大きなアフィニティー、アビディティで、より容易に、および／またはより長い期間で標的へ結合するならば、それへ「特異的に結合する」または「選好的に結合する」。例えば、ＮＧＦエピトープへ特異的または選好的に結合する抗体は、他のＮＧＦエピトープまたは非ＮＧＦエピトープへ結合するよりも大きなアフィニティー、アビディティで、より容易に、および／またはより長い期間でこのエピトープへ結合する抗体である。また、この定義を読むことによって、例えば、第一標的へ特異的または選好的に結合する抗体（または部分またはエピトープ）は、第二標的へ特異的または選好的には結合してもしなくてもよいということが理解される。「特異結合」または「選好結合」それだけでは、排他的な結合（それは包含可能であるが）を必ずしも必要としない。一般に、但し必ずではないが、結合への言及は、選好結合を意味する。
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において交換可能的に使用して、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを意味する。ポリマーは、直鎖でも分岐鎖でもよく、それは、修飾アミノ酸を含んでよく、それは、非アミノ酸により中断可能である。この用語には、天然で、または介入（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の操作または修飾（標識化成分とのコンジュゲーションのような））により修飾されたアミノ酸ポリマーも含まれる。この定義内にまた含まれるのは、例えば、アミノ酸の１以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸、等が含まれる）、並びに当該技術分野で知られた他の修飾を含有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドが抗体に基づいているので、ポリペプチドは、単鎖または会合鎖として出現可能であると理解される。
本明細書において交換可能的に使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはこれらの類似体、またはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーへ取込み可能なあらゆる基質であってよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドとその類似体のような修飾ヌクレオチドを含んでよい。存在するならば、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立ての前または後に付与可能である。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断可能である。ポリヌクレオチドは、標的化成分とのコンジュゲーションによるように、ポリマー化の後でさらに修飾可能である。他の種類の修飾には、例えば、「キャップ」、１以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体での置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カバメート、等）、および荷電連結（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、等）での修飾、例えば、タンパク質（例、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン、等）のような付帯部分を含有する修飾、挿入剤（例、アクリジン、ソラレン、等）での修飾、アルキレーターを含有する修飾、キレータ（例、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化金属、等）を含有する修飾、アルキレーターを含有する修飾、修飾連結（例、α−アノマー核酸、等）での修飾、並びに、ポリヌクレオチドの非修飾型が含まれる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えば、ホスホネート基、リン酸基に置き換えても、標準の保護基により保護しても、活性化して追加のヌクレオチドへ追加の連結を製造しても、固体支持体へコンジュゲートさせてもよい。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化可能であるか、またはアミンまたは１〜２０炭素原子からの有機キャッピング基部分で置換可能である。他のヒドロキシルも、標準的な保護基へ誘導化可能である。ポリヌクレオチドはまた、当該技術分野で一般的に知られているリボースまたはデオキシリボースの類似形態を含有してよく、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環の糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースのようなエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリル酸類似体、およびメチルリボシドのような非塩基性ヌクレオシド類似体が含まれる。１以上のホスホジエステル連結が代わりの連結基に置き換え可能である。これらの代わりの連結基には、限定されないが、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、「（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）により置き換えられた態様が含まれ、ここでそれぞれのＲまたはＲ’は、独立してＨであるか、または、エーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルを随意に含有する置換または未置換アルキル（１−２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中すべての連結がいずれも同一である必要はない。先行の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡが含まれる、本明細書に言及するすべてのポリヌクレオチドへ適用される。
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単独で、または組合せにおいて意味する。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結した４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲにより、他の鎖からのＣＤＲとごく近接に一緒に固定されて、抗体の抗原決定部位の形成に貢献する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技術がある：（１）種間配列変動性に基づくアプローチ（即ち、Ｋａｂａｔら，「免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」（第５版、１９９１，国立医療研究所、メリーランド州ベセスダ））；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ｃｈｏｔｈｉａら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７；Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））。本明細書に使用するように、ＣＤＲは、片方のアプローチによるかまたは両方のアプローチの組合せにより規定されるＣＤＲに言及する場合がある。
抗体の「定常領域」は、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を単独で、または組合せにおいて意味する。
本明細書に使用するように、用語「神経成長因子」および「ＮＧＦ」は、神経成長因子と、ＮＧＦの生物学的活性の少なくとも一部を保持するその変異体を意味する。本明細書に使用するように、ＮＧＦには、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシが含まれるすべての哺乳動物種のネイティブ配列ＮＧＦが含まれる。
「ＮＧＦ受容体」は、ＮＧＦにより結合されるかまたは活性化されるポリペプチドを意味する。ＮＧＦ受容体には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、霊長動物、またはウシが限定されずに含まれるあらゆる哺乳動物種のＴｒｋＡ受容体およびｐ７５受容体が含まれる。
本明細書に使用するように、「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体」（交換可能的に「抗ＮＧＦ抗体」と呼ばれる）は、ＮＧＦへ結合して、ＮＧＦの生物学的活性および／またはＮＧＦシグナル伝達により仲介される下流経路を阻害することができる抗体を意味する。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体には、ＮＧＦシグナル伝達により仲介される下流経路が含まれ、受容体結合および／またはＮＧＦへの細胞応答の誘発のようなＮＧＦの生物学的活性を阻止する、拮抗する、抑制する、または低下させる（有意に、が含まれる）抗体が含まれる。本発明の目的では、用語「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体」には、それによりＮＧＦそれ自体、ＮＧＦ生物学的活性（限定されないが、その能力〜術後疼痛のあらゆる側面に仲介する能力が含まれる）または生物学的活性の結果が、意味ある度合いで実質的に無効化、減少、または中和される、これまでに確認されたすべての用語、表題、および機能状態、および特性が含まれると明らかに理解される。いくつかの態様において、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、ＮＧＦへ結合して、ＮＧＦ二量体化および／またはＮＧＦ受容体（ｐ７５および／またはｔｒｋＡのような）への結合を妨げる。他の態様において、抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦへ結合して、ｔｒｋＡ受容体二量体化および／またはｔｒｋＡ自己リン酸化を妨げる。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の例を本明細書に提供する。
ＮＧＦの「生物学的活性」は、一般に、ＮＧＦ受容体へ結合する、および／またはＮＧＦ受容体シグナル伝達経路を活性化する能力を意味する。限定なしに、生物学的活性には、以下のどの１以上も含まれる：ＮＧＦ受容体（ｐ７５および／またはｔｒｋＡのような）へ結合する能力；ｔｒｋＡ受容体二量体化および／または自己リン酸化を促進する能力；ＮＧＦ受容体シグナル伝達経路を活性化する能力；細胞の分化、増殖、生存、成長と、（末梢および中枢のニューロンが含まれるニューロンの場合は）ニューロン形態、シナプス産生、シナプス機能、神経伝達物質および／または神経ペプチドの放出を促進する能力、および傷害後の再生における変化が含まれる、細胞生理における他の変化を促進する能力；マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンの生存を促進する能力；および、術後疼痛が含まれる疼痛に仲介する能力。
本明細書に使用するように、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（即ち、汚染物質を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋である物質に関連する。
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチドインサートの取込み用ベクターのレシピエントであり得るかまたはあった、個別の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異により、元の親細胞と（形態において、またはゲノムＤＮＡ相補性において）必ずしも完全に同一でなくてよい。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（複数）でｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクトされた細胞が含まれる。
本明細書に使用するように、「治療」は、有益であるかまたは望まれる臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益であるかまたは望まれる臨床結果には、限定されないが、以下の１以上が含まれる：急性、慢性、炎症性、ニューロパシー、術後疼痛、慢性関節リウマチ疼痛、または骨関節炎疼痛が含まれる、疼痛のあらゆる側面の改善または緩和。本発明の目的では、有益であるかまたは望まれる臨床結果には、限定されないが、以下の１以上が含まれる：疼痛のあらゆる側面が含まれる疼痛に関連した１以上の症状の重症度の軽減、その緩和（疼痛の期間の短縮、疼痛感受性または感覚の低下のような）。
薬物、化合物、または医薬組成物の「有効量」は、疼痛感覚の緩和または低下のような臨床結果が含まれる、有益であるかまたは望まれる結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１以上の投与で投与可能である。本発明の目的では、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、術後疼痛、慢性関節リウマチ疼痛、および／または骨関節炎疼痛が含まれる疼痛を治療する、改善する、その強度を低下させる、および／またはそれを妨げるのに十分な量である。いくつかの態様において、「有効量」は、安静時の疼痛（安静時疼痛）または機械的に誘発した疼痛（運動後の疼痛が含まれる）、またはその両方を抑制可能であり、それは、切開、切断、裂傷、または損傷の前、間、後に、および／または疼痛刺激の前、間、または後に投与可能である。臨床コンテクストにおいて理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と一緒に達成しても、達成しなくてもよい。このように、「有効量」は、１以上の治療薬剤を投与するコンテクストにおいて考慮してよく、１以上の他の薬剤と一緒になって、望まれる結果が達成可能であるかまたは達成される場合でも、単一の薬剤を有効量で与えることを考慮してよい。
疼痛の「発症を抑えること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）」は、重症度を低下させること（これには、この適応症に一般的に使用される他の薬物および／または療法（例えば、オピエートが含まれる）の必要性、および／またはその量（例えば、それへの曝露）を抑えることを含めてよい）、期間、および／または頻度を抑えること（例えば、個人において術後疼痛を遅らせるかまたはそれへの時間を増やすことが含まれる）のいずれも意味する。当業者に理解されるように、個体は、治療に対するその応答に関して異なる場合があるので、そのために、例えば、「個体において慢性関節リウマチ疼痛または骨関節炎疼痛の発症を抑える方法」には、そのような投与がその特別な個体における発症のそのような低下を引き起こす可能性があり得るという合理的な予測に基づいて、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与することが反映される。
疼痛または疼痛（慢性関節リウマチ疼痛または骨関節炎疼痛のような）の１以上の症状を「改善すること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与しないことに比較した、疼痛の１以上の症状の軽減または改善を意味する。「改善すること」には、症状の期間の短縮または減少も含まれる。
疼痛または疼痛（慢性関節リウマチ疼痛または骨関節炎疼痛のような）の１以上の症状を「緩和すること（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」は、本発明による抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体で治療した個体または個体の集団において、術後疼痛の１以上の望まれない臨床症状の程度を軽減することを意味する。
本明細書に使用するように、疼痛の進展を「遅らせること（ｄｅｌａｙｉｎｇ）」は、術後疼痛、慢性関節リウマチ疼痛、または骨関節炎疼痛のような疼痛の進行を引き伸ばす、妨げる、遅らせる、遅延させる、安定化させる、および／または延期することを意味する。この遅延は、疾患の前歴および／または治療される個体に依存して、多様な時間の長さであり得る。当業者に明らかであるように、十分であるかまたは有意な遅延は、結果において、個体が疼痛を発症しないという点において、予防を含めてよい。症状の進展を「遅らせる」方法は、この方法を使用しないことと比較したときに、所与の時間枠において症状が進展する確率を低下させる、および／または所与の時間枠において症状の程度を抑える方法である。そのような比較は、典型的には、統計学的に有意な数の被検者を使用する臨床試験に基づく。
本明細書に使用する「疼痛」は、急性および慢性の疼痛と、炎症性の要素を伴うあらゆる疼痛が含まれるあらゆる病因の疼痛を意味する。疼痛の例には、術後疼痛、手術後疼痛（歯痛が含まれる）、偏頭痛、頭痛および三叉神経痛、熱傷、創傷または腎結石に伴う疼痛、外傷（外傷性頭部損傷が含まれる）に伴う疼痛、ニューロパシー疼痛、慢性関節リウマチ、骨関節炎、強直性脊椎炎、血清陰性（非リウマチ様）関節症、非関節性リウマチ、および関節周囲障害のような筋骨格障害に伴う疼痛、および癌（「ブレークスルー疼痛」と終末期癌に伴う疼痛が含まれる）、末梢神経障害、およびヘルペス後神経痛に伴う疼痛が含まれる。炎症性の要素を伴う疼痛の例には（上記に記載のいくつかに加えて）、リウマチ疼痛、粘膜炎および月経困難症に伴う疼痛が含まれる。
「術後疼痛」（交換可能的に「切開後」または「外傷後疼痛」と呼ばれる）は、個体の組織への切断、穿刺、切開、裂傷、または創傷のような外傷より発生するかまたは生じる疼痛（侵襲性または非侵襲性であれ、すべての外科手技より発生するものが含まれる）を意味する。本明細書に使用するように、術後疼痛には、外部からの物理的な外傷なしに生じる（発生する、または起因する）疼痛を含めない。いくつかの態様において、術後疼痛は、内部または外部（末梢が含まれる）の疼痛であり、創傷、切断、外傷、裂傷、または切開は、偶発的に（外傷性創傷を伴うように）生じても、意図的に（外科切開を伴うように）生じてもよい。本明細書に使用するように、「疼痛」には、疼痛感と疼痛の感覚が含まれ、疼痛は、当該技術分野でよく知られた疼痛スコアと他の方法を使用して、客観的および主観的に評価可能である。術後疼痛には、本明細書に使用するように、本来は熱または機械的（触覚）であり得る、異疼痛（即ち、通常は非有害性の刺激への増加した応答）と痛覚過敏（即ち、通常は有害または不快な刺激への増加した応答）が含まれる。いくつかの態様において、疼痛は、熱感受性、機械感受性、および／または安静時疼痛を特徴とする。いくつかの態様において、術後疼痛は、機械的に誘発した疼痛または安静時疼痛を含む。他の態様において、術後疼痛は、安静時疼痛を含む。当該技術分野でよく知られるように、疼痛は、一次性または二次性の疼痛であり得る。
「生物学的試料」には、個体より入手される多様な試料種が含まれ、診断またはモニタリングアッセイに使用可能である。この定義には、血液や生物起源の他の液体試料、生検標本のような固体組織試料またはそれに由来する組織培養物または細胞と、それらの子孫が含まれる。この定義には、試薬での処理、可溶化、またはタンパク質またはポリヌクレオチドのようなある種の成分の濃縮、または切片作製目的の半固体または固体マトリックスへの埋込みによるように、その獲得の後であらゆるやり方で操作された試料も含まれる。用語「生物学的試料」には臨床試料が含まれ、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解液、血清、血漿、生物学的体液、および組織試料も含まれる。
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（ウシのような）、運動動物、ペット（ネコ、イヌ、およびウマのような）、霊長動物、マウス、およびラットが含まれる。
本明細書に使用するように、「ベクター」は、目的の１以上の遺伝子または配列を宿主細胞へ送達して、好ましくはそこで発現させることが可能である構築体を意味する。ベクターの例には、限定されないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン縮合剤と結合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに被包化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞のようなある種の真核細胞が含まれる。
本明細書に使用するように、「発現制御配列」は、核酸の転写を指令する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成または誘導プロモーターのようなプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列へ機能可能的に連結する。
本明細書に使用するように、「医薬的に許容される担体」には、有効成分と組み合わされるときに、該成分が生物学的活性を保持することを可能にして、被検者の免疫系と非反応性である、あらゆる材料が含まれる。例には、限定されないが、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、オイル／水エマルジョンのようなエマルジョン、および様々な種類の湿潤剤のような標準医薬担体のいずれも含まれる。エアゾールまたは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝化生理食塩水または通常の（０．９％）生理食塩水である。そのような担体を含んでなる組成物は、よく知られた慣用法により製剤化する（例えば、「レミントン製剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ監修、マック・パブリッシング社、ペンシルヴェニア州イーストン、１９９０；および、レミントン，「製剤の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」第２０版、マック・パブリッシング、２０００を参照のこと）。
本明細書に使用する用語「Ｋｏｆｆ」は、抗体の抗体／抗原複合体からの解離のオフ速度定数を意味するものとする。
本明細書に使用する用語「Ｋｄ」は、抗体−抗原相互作用の解離定数を意味するものとする。
抗体Ｅ３、Ｅ３派生抗体、組成物、および使用の方法
Ｅ３組成物、Ｅ３派生組成物、および組成物を作製する方法
本発明には、Ｅ３抗体またはポリペプチドを含んでなる医薬組成物が含まれる組成物と、Ｅ３抗体またはポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドが含まれる。本明細書に使用するように、組成物は、ＮＧＦへ結合する１以上の抗体またはポリペプチド（これは、抗体であってもなくてもよい）、および／またはＮＧＦへ結合する１以上の抗体またはポリペプチドをコードする配列を含んでなる１以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当該技術分野でよく知られた、緩衝剤が含まれる医薬的に許容される賦形剤のような好適な賦形剤をさらに含んでよい。
本発明にはまた、単離された抗体、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドの態様が含まれる。本発明にはまた、実質的に純粋な抗体、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドの態様が含まれる。
本発明の抗体およびポリペプチドは、以下の特性のいずれ（１以上）も特徴とする：（ａ）ＮＧＦへ結合する能力；（ｂ）ＮＧＦ生物学的活性および／またはＮＧＦシグナル伝達により仲介される下流経路を抑制および／または阻害する能力；（ｃ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を抑制および／または阻害する能力；（ｄ）ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦへの有意な交差反応性の非存在；（ｅ）疼痛（術後疼痛が含まれる）を治療および／または予防する能力；（ｆ）ＮＧＦのクリアランスを高める能力；（ｇ）例えば、キナーゼ受容体活性化アッセイ（ＫＩＲＡ）（米国特許第６，０２７，９２７号を参照のこと）を使用して検出されるような、ｔｒｋＡ受容体の活性化を抑制または阻害する能力。
ヒトＮＧＦへ高いアフィニティーと遅い解離動態で結合する抗体Ｅ３の結合特性を、マウス抗ＮＧＦモノクローナル抗体９１１と比較して以下に要約する。Ｅ３は、元のマウス抗体９１１よりほぼ５０倍高い結合アフィニティーでヒトＮＧＦへ結合する。
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Ｅ３抗体と関連抗体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（実施例２および３を参照のこと）により評価されるように、ヒトＮＧＦに拮抗する強い能力を明示する。例えば、抗体Ｅ３は、マウスＥ１３三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存に、１５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下では約２１ｐＭのＩＣ５０で、そして１．５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下では約１．２ｐＭのＩＣ５０で拮抗する。
従って、別の側面において、本発明の抗体およびポリペプチドは、（ｈ）低い解離動態を伴う、ヒトＮＧＦへの高いアフィニティー結合（いくつかの態様において、ＫＤは約２ｎＭ未満であり、および／またはｋｏｆｆは、約６ｘ１０−５ｓ−１より遅い）、および／または（ｉ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を、約１５ｐＭのＮＧＦ（いくつかの態様において、ヒトＮＧＦ）では約１００ｐＭ以下のＩＣ５０で、および／または約１．５ｐＭのＮＧＦでは約２０ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害（阻止）する能力によりさらに同定されて特性決定される。
いくつかの態様において、該抗体は、ヒトＮＧＦへ結合して、別の脊椎動物種（ある態様において、哺乳動物）由来のＮＧＦへは有意に結合しない。いくつかの態様において、抗体は、ヒトＮＧＦだけでなく、別の脊椎動物種（いくつかの態様において、哺乳動物）由来の１以上のＮＧＦへ結合する。なお他の態様において、抗体は、ＮＧＦへ結合して、他のニュートロフィン（関連のニュートロフィン、ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦのような）と有意には交差反応しない。いくつかの態様において、抗体は、ＮＧＦだけでなく、少なくとも１つの他のニュートロフィンへ結合する。いくつかの態様において、抗体は、ウマやイヌのような哺乳動物種のＮＧＦへ結合するが、別の哺乳動物種由来のＮＧＦへ有意には結合しない。
いくつかの態様において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖を含んでなる抗体である。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いた宿主細胞により産生されるポリヌクレオチドによりコードされる重鎖を含んでなる抗体である。本発明にはまた、Ｅ３と同等の抗体断片（例、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、等）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含んでなる融合タンパク質、および、必要とされる特異性の抗原（ＮＧＦ）認識部位を含むＥ３の他のあらゆる修飾配置の様々な製剤が含まれる。Ｅ３の抗体およびポリペプチド断片（これは、抗体であってもなくてもよい）が含まれる、Ｅ３の同等の抗体と、Ｅ３のポリペプチド断片を含んでなるポリペプチドは、上記に記載の判定基準のいずれ（１以上）によっても同定されて特性決定される。
従って、本発明は、以下のいずれも、または以下のいずれも含んでなる組成物（医薬組成物が含まれる）を提供する：（ａ）抗体Ｅ３；（ｂ）抗体Ｅ３の断片または領域；（ｃ）図１Ｂに示すような抗体Ｅ３の軽鎖；（ｃ）図１Ａに示すような抗体Ｅ３の重鎖；（ｄ）抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖からの１以上の可変領域；（ｅ）図１Ａおよび１Ｂに示す抗体Ｅ３の１以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５または６のＣＤＲ）；（ｆ）図１Ａに示す抗体Ｅ３の重鎖からのＣＤＲ Ｈ３；（ｇ）図１Ｂに示す抗体Ｅ３の軽鎖からのＣＤＲ Ｌ３；（ｈ）図１Ｂに示す抗体Ｅ３の軽鎖からの３つのＣＤＲ；（ｉ）図１Ａに示す抗体Ｅ３の重鎖からの３つのＣＤＲ；（ｊ）図１Ａおよび１Ｂに示す抗体Ｅ３の、軽鎖からの３つのＣＤＲと重鎖からの３つのＣＤＲ；並びに（ｋ）（ｂ）〜（ｊ）のどの１つも含んでなる抗体。本明細書の記載から明らかであるように、本発明から特に除外されるのは、マウスモノクローナル抗体、９１１のアミノ酸配列に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドの態様である。Ｍａｂ９１１の延長ＣＤＲ配列を図１Ａおよび１Ｂと配列番号９〜１４に示す。
抗体Ｅ３のＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔ ＣＤＲが含まれる）は、図１Ａおよび１Ｂに図解的に図示され、以下のアミノ酸配列からなる：（ａ）重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲ Ｈ１」）ＧＦＳＬＩＧＹＤＬＮ（配列番号３）；（ｂ）重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲ Ｈ２」）ＩＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＶＫＳ（配列番号４）；（ｃ）重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲ Ｈ３」）ＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号５）；（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲ Ｌ１」）ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮ（配列番号６）；（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲ Ｌ２」）ＹＴＳＲＦＨＳ（配列番号７）；および（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲ Ｌ３」）ＱＱＥＨＴＬＰＹＴ（配列番号８）。ＣＤＲ領域の決定は、当該技術分野の技量内で十分である。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの組合せ（「組合せＣＤＲ」または「延長ＣＤＲ」とも呼ばれる）であり得る。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲを含む。他の態様において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。
いくつかの態様において、本発明は、Ｅ３の少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つのＣＤＲに実質的に相同である（または、いくつかの態様では、Ｅ３の、またはＥ３に由来する全６つのＣＤＲに実質的に相同である）少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体を提供する。他の態様には、Ｅ３の、またはＥ３に由来する少なくとも２、３、４、５または６のＣＤＲに実質的に相同である、少なくとも２、３、４、５、または６のＣＤＲを有する抗体が含まれる。本発明の目的では、活性の程度はＥ３に比較して変動してよい（より大きくても小さくてもよい）が、結合特異性および／または全体の活性（これは、疼痛を治療および／または予防するかまたはＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を阻害することに関するものでよい）は、概ね保持されると理解される。
本発明はまた、以下：Ｅ３の配列の少なくとも５の連続アミノ酸、少なくとも８の連続アミノ酸、少なくとも約１０の連続アミノ酸、少なくとも約１５の連続アミノ酸、少なくとも約２０の連続アミノ酸、少なくとも約２５の連続アミノ酸、少なくとも約３０の連続アミノ酸のいずれも有するＥ３のアミノ酸配列（図１Ａおよび１Ｂに示す）を含むポリペプチド（これは、抗体であってもなくてもよい）を提供し、ここで該アミノ酸の少なくとも３つはＥ３の可変領域に由来し、マウスモノクローナル抗体、９１１のアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列からなる態様は、特に除外されるとの理解を伴う。Ｍａｂ９１１の延長ＣＤＲ配列を図１Ａおよび１Ｂと配列番号９〜１４に示す。１つの態様において、可変領域は、Ｅ３の軽鎖に由来する。別の態様において、可変領域は、Ｅ３の重鎖に由来する。別の態様において、５（またはより多い）の連続アミノ酸は、図１Ａおよび１Ｂに示すＥ３の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する。
別の態様において、本発明は、以下：Ｅ３の配列の少なくとも５の連続アミノ酸、少なくとも８の連続アミノ酸、少なくとも約１０の連続アミノ酸、少なくとも約１５の連続アミノ酸、少なくとも約２０の連続アミノ酸、少なくとも約２５の連続アミノ酸、少なくとも約３０の連続アミノ酸のいずれも有するＥ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでＥ３配列は、以下：ＣＤＲ Ｈ１のアミノ酸残基Ｌ２９、ＣＤＲ Ｈ２のＩ５０、ＣＤＲ Ｈ３のＷ１０１、および／またはＣＤＲ Ｈ３のＡ１０３；および／またはＣＤＲ Ｌ１のアミノ酸残基Ｓ２８、ＣＤＲ Ｌ１のＮ３２、ＣＤＲ Ｌ２のＴ５１、ＣＤＲ Ｌ３の９１Ｅおよび／またはＣＤＲ Ｌ３のＨ９２のどの１以上も含み、ここでマウスモノクローナル抗体、９１１のアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列からなる態様は、特に除外されるとの理解を伴う。
明らかであるように、本開示を通して、可変領域中のアミノ酸残基へ言及するには、連続したアミノ酸の番号付けスキームを使用する（即ち、各可変領域中のアミノ酸残基を連続して番号付ける）。当該技術分野でよく知られるように、Ｋａｂａｔおよび／またはＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムは、Ｅ３抗体とＥ３変異体（または、Ｅ３変異体であると疑われるポリペプチド）のような、２つの抗体またはポリペプチドを比較するときに有用である。当該技術分野では、例えば、Ｅ３と別のポリペプチドの間で比較することの使用に望まれるならば、連続した番号付けをＣｈｏｔｈｉａおよび／またはＫａｂａｔ番号付けへ変換する方法がよく理解されている。図２３は、連続、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＫａｂａｔ番号付けを使用して番号付けられたＥ３可変領域を図示する。さらに、比較を容易にするには、一般に、フレームワーク残基は、いつもではないが通常は、ほぼ同じ数の残基を有すると理解される。しかしながら、ＣＤＲは、サイズが変動してよい（即ち、１以上のアミノ酸残基の挿入および／または欠失を有することが可能である）。Ｅ３抗体と候補Ｅ３変異体を比較するとき（例えば、並置した抗体Ｅ３中の配列がより長い候補配列由来のＣＤＲ領域の場合）、以下の工程に従ってよい（もっとも、当該技術分野では他の方法も知られている）。候補抗体配列をＥ３抗体の重鎖および軽鎖可変領域と並置する。アライメント（並置）は、手動で行っても、一般的に受容れられたコンピュータプログラムを使用して、コンピュータにより行ってもよい。アライメントは、ほとんどのＦａｂ配列に共通したいくつかのアミノ酸残基を使用することによって促進可能である。例えば、軽鎖と重鎖は、それぞれ典型的には、保存された位置にしばしば見出される、２つのシステインを有する。候補変異体抗体のアミノ酸配列は、より長くても（即ち、挿入アミノ酸残基を有する）、より短くても（欠失アミノ酸残基を有する）よいと理解される。追加残基の挿入を示すには、残基番号へ接尾辞を付加してよい（例えば、残基３４ａｂｃ）。例えば、Ｅ３配列と、例えば、残基３３および３５について並置させたが、その間に残基３５と並置させる残基がない候補配列では、残基３５は、単に残基へ割り当てない。別のアプローチにおいて、異なる長さのＣＤＲを比較するときには、構造的に同等の（例えば、抗原−抗体複合体中の同じ位置の）アミノ酸の間で比較可能であることが一般によく知られている。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら，同上）は、一般に（すべての場合においてではないが）、構造的に正しい位置に挿入と欠失を入れる。構造同等性はまた、Ｘ線結晶学または二重突然変異体サイクル分析（Ｐｏｎｓら，（１９９９）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．８：９５８−９６８を参照のこと）を使用して、演繹または実証可能である。
抗ＮＧＦ抗体のＮＧＦ（ｈＮＧＦのような）への結合アフィニティーは、約０．１０〜約０．８０ｎＭ、約０．１５〜約０．７５ｎＭ、および約０．１８〜約０．７２ｎＭであり得る。いくつかの態様において、結合アフィニティーは、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭより大きい。１つの態様において、結合アフィニティーは、約２ｐＭと２２ｐＭの間である。他の態様において、結合アフィニティーは、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭである。いくつかの態様において、結合アフィニティーは、約１０ｎＭである。他の態様において、結合アフィニティーは、約１０ｎＭ未満である。他の態様において、結合アフィニティーは、約０．１ｎＭまたは約０．０７ｎＭである。他の態様において、結合アフィニティーは、約０．１ｎＭ未満または約０．０７ｎＭ未満である。他の態様において、結合アフィニティーは、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれか〜約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかである。いくつかの態様において、結合アフィニティーは、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれかである。なお他の態様において、結合アフィニティーは、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭより大きい。
該抗体のＮＧＦへの結合アフィニティーは、当該技術分野でよく知られた方法を使用して決定可能である。抗体のＮＧＦへの結合アフィニティーを決定する１つのやり方は、実施例に記載するように、抗体の単機能性Ｆａｂ断片のアフィニティーを測定することによる。単機能性Ｆａｂ断片を入手するために、抗体（例えば、ＩｇＧ）は、パパインで切断しても、組換え的に発現させてもよい。抗体の抗ＮＧＦ Ｆａｂ断片のアフィニティーは、実施例に記載するように、表面プラズモン共鳴（ＢｌＡｃｏｒｅ３０００ＴＭ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）により決定可能である。このプロトコールは、ヒトＮＧＦ、別の脊椎動物のＮＧＦ（いくつかの態様では、哺乳動物）（マウスＮＧＦ、ラットＮＧＦ、霊長動物ＮＧＦのような）が含まれるあらゆる種のＮＧＦに対する抗体の結合アフィニティーを決定することにおける使用にだけでなく、関連したニュートロフィン、ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦのような他のニュートロフィンでの使用にも適している。
いくつかの態様において、本発明の抗体またはペプチドは、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下に）約２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０で阻害（抑制、および／または阻止）可能である。いくつかの態様において、本発明の抗体またはペプチドは、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下に）約５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０で阻害（抑制、および／または阻止）可能である。いくつかの態様において、本発明の抗体またはペプチドは、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存性の生存を（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下に）約１５０ｐＭ、１２５ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０で阻害（抑制、および／または阻止）可能である。いくつかの態様において、本発明の抗体またはペプチドは、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存性の生存を（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下に）約３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭ、３ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０で阻害（抑制、および／または阻止）可能である。マウスＥ１３三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存の測定の方法は、当該技術分野で知られていて、例えば、実施例２において記載する。
本発明はまた、これらの抗体またはポリペプチドのいずれかを作製する方法を提供する。本発明の抗体は、当該技術分野で知られた手順により作製可能であり、そのいくつかを実施例に例示する。該ポリペプチドは、抗体のタンパク分解や他の分解により、上記に記載のような組換え法（即ち、単一または融合ポリペプチド）により、または化学合成により生成可能である。抗体のポリペプチド、具体的には、約５０までのアミノ酸より短いポリペプチドは、簡便には、化学合成によって作製する。化学合成の方法は当該技術分野で知られていて、実用的に利用可能である。例えば、Ｅ３抗体は、固相法を利用する自動化ポリペプチド合成機によって生成可能である。米国特許第５，８０７，７１５；４，８１６，５６７；および６，３３１，４１５号も参照のこと。キメラまたはハイブリッド抗体も、架橋剤を伴うものが含まれる、合成タンパク化学の既知の方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで製造可能である。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用するかまたはチオエーテル結合を形成することによって構築可能である。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートとメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
別の選択肢において、抗体は、当該技術分野でよく知られた手順を使用して作製可能である。１つの態様において、抗体Ｅ３の可変および軽鎖領域（図１Ａおよび１Ｂに示す）をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドを、宿主細胞（例、ＣＨＯ細胞）における発現または増殖用のベクターへクローニングする。別の態様では、図２および３に示すポリヌクレオチド配列を、発現または増殖用の１以上のベクターへクローニングする。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクターにおいて維持可能であり、次いで宿主細胞は、繁殖させて、将来使用のために凍結可能である。ベクター（発現ベクターが含まれる）と宿主細胞については本明細書においてさらに記載する。抗体を植物またはミルクにおいて組換え的に発現させる方法が開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら．（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２７５６；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．とＤ．Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５；および、Ｐｏｌｌｏｃｋら．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７を参照のこと。抗体の誘導体（例えば、ヒト化、単鎖、等）を作製する方法が当該技術分野で知られている。
本発明にはまた、Ｅ３のような本発明の抗体の単鎖可変領域断片（「ｓｃＦｖ」）が含まれる。単鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを使用することによって、軽鎖および／または重鎖可変領域を連結させることによって作製する。Ｂｉｒｄら．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６。連結ペプチドの例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１５）であり、これは、１つの可変領域のカルボキシ末端と他の可変領域のアミノ末端の間のほぼ３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーが設計されて使用されている（Ｂｉｒｄら．（１９８８））。次いで、リンカーは、薬物の付加または固体支持体への付加といった、追加の機能のために修飾可能である。単鎖変異体は、組換え的にまたは合成的に産生可能である。ｓｃＦｖの合成生成では、自動化合成機が使用可能である。ｓｃＦｖの組換え生成では、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを好適な宿主細胞（酵母、植物、昆虫、哺乳動物細胞のような真核細胞、または大腸菌のような原核細胞のいずれか）へ導入可能である。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションのような定型的な操作によって作製可能である。生じるｓｃＦｖは、当該技術分野で知られた標準タンパク質精製技術を使用して単離可能である。
ダイアボディのような単鎖抗体の他の形態も含まれる。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、ここでは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同一鎖上の２つのドメイン間を対合させるには短すぎるリンカーを使用するので、このドメインは別の鎖の相補性ドメインと対合することを強制されて、２つの抗原結合部位が創出される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ら．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
抗体は、二重特異性抗体（少なくとも２つの異なる抗原への結合特異性を有するモノクローナル抗体）であってよい。二重特異性抗体は、本明細書に開示する抗体を使用して製造可能である。二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０を参照のこと）。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎとＣｕｅｌｌｏ，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５，５３７−５３９）。
二重特異性抗体を作製する１つのアプローチに従って、望みの結合特異性（抗体−抗原結合部位）のある抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列へ融合させる。融合は、好ましくは、少なくとも一部のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含んでなる、免疫グロブリン重鎖定常ドメインのものである。融合物の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する、第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物と、望まれるならば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターへ挿入して、好適な宿主生物へ同時トランスフェクトさせる。これにより、構築に使用する３つのポリペプチド鎖の不均等な比率が最適の収率を提供するときの態様において、３つのポリペプチド断片の相互比率を調整する場合に大きな柔軟性が提供される。しかしながら、同一比率の少なくとも２のポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、またはその比が特に重要でない場合は、２または全部で３のポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターへ挿入することが可能である。
１つのアプローチにおいて、二重特異性抗体は、第一の結合特異性が一方のアームにあるハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）からなる。免疫グロブリン軽鎖が二重特異性分子の一方の半分にしかないこの非対称構造により、望ましい二重特異性化合物の、望まれない免疫グロブリン鎖の組合せからの分離が促進される。このアプローチは、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９４／０４６９０（１９９４年３月３日公開）に記載されている。
２つの共有連結抗体を含んでなるヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内にある。そのような抗体は、免疫系細胞を望まれない細胞へ標的指向させるために（米国特許第４，６７６，９８０号）、そしてＨＩＶ感染症の治療（ＰＣＴ出願公開公報番号ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）に使用されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、どの簡便な架橋連結法を使用して作製してもよい。好適な架橋連結剤と技術が当該技術分野で知られていて、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
抗体は、例えば、当該技術分野で知られるような、そして本明細書に記載するようなヒト化抗体であってよい。
抗体は、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９９／５８５７２（１９９９年１１月１８日公開）に記載のように修飾可能である。これらの抗体は、標的分子へ向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全部または一部に実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の重大な補体依存性の溶解や細胞仲介性の破壊を始動させることなく、標的分子へ結合することが可能である。好ましくは、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂへ特異的に結合することが可能である。これらは、典型的には、２以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。このやり方で修飾された抗体は、慢性抗体療法における使用が好ましく、慣用の抗体療法に対する炎症性および他の有害反応を回避する。
本発明には、その特性に有意に影響を及ぼさない、機能的に同等な抗体が含まれる抗体Ｅ３に対する修飾と、亢進または低下した活性を有する変異体が含まれる。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野では定型的な実践であり、実施例においてさらに例示する。修飾されたポリペプチドの例には、機能活性を著しく有害には変化させない、アミノ酸残基の置換（保守的な置換が含まれる）、アミノ酸の１以上の欠失または付加を伴うポリペプチドまたは化学類似体の使用が含まれる。
本明細書に使用するポリペプチド「変異体」は、ポリペプチドの免疫反応性が実質的には減少しないような１以上の置換、欠失、付加および／または挿入において、ネイティブなタンパク質から異なるポリペプチドである。言い換えると、抗原へ特異的に結合する変異体の能力は、ネイティブタンパク質に対して亢進または不変であっても、ネイティブタンパク質に対して５０％未満、そして好ましくは２０％未満減少してもよい。ポリペプチド変異体は、好ましくは、同定ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性（本明細書に記載のように決定する）を明示する。
抗体のアミノ酸配列変異体は、好適なヌクレオチド変化を抗体ＤＮＡへ導入することによるか、またはペプチド合成によって製造可能である。そのような変異体には、例えば、本明細書に記載の配列番号１または２のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれへの挿入、および／またはその置換が含まれる。欠失、挿入、および置換のどの組合せでも最終構築体へ到達するようになされるが、最終構築体は、望まれる特性を保有することが条件である。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数また配置を変化させることのように、抗体の翻訳後プロセスを改変可能である。
突然変異誘発または修飾に好ましい位置である抗体の特定残基または領域の同定に有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれ、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されている。標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕのような荷電性の残基）の基または群を同定し、抗原と該アミノ酸の相互作用に影響を及ぼすために、中性または陰性電荷のアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）に置き換える。次いで、置換の部位にさらに導入するかまたは置換の部位のための他の変異体を導入することによって、置換に対する機能感受性を明示するこのアミノ酸位置をより明確にする。このように、アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位が予め決定されている一方で、突然変異の本質それ自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の機能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的のコドンまたは領域で行って、発現される抗体変異体について、望みの活性をスクリーニングする。本明細書に記載のライブラリースキャニング突然変異誘発も、突然変異誘発または修飾に適している抗体中の位置を同定するために使用可能である。
アミノ酸配列挿入には、１つの残基〜１００以上の残基を含有するポリペプチドに及ぶ長さのアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、並びに単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基のある抗体、またはエピトープタグへ融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を高める酵素またはポリペプチドの、抗体のＮ若しくはＣ末端への融合が含まれる。
置換変異体では、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されて、その場所に異なる残渣が挿入される。置換突然変異誘発に最も注目される部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ改変も考慮される。保守的置換を表１の「保守的置換」の見出し下に示す。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらすならば、表１において「例示置換」と呼ぶか、またはアミノ酸クラスに関連して以下により詳しく記載する、より実質的な変化を導入可能であり、産物についてスクリーニング可能である。
表１：アミノ酸置換
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抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）置換の領域中のポリペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはらせんコンホメーションのような）、（ｂ）標的部位にある分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩（かさ）を維持することに対するその効果が有意に異なる置換を選択することによって達成する。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群へ分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性、親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向性に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保守的置換は、上記クラスの１つのメンバーと別のクラスのメンバーを交換することによってなされる。
抗体の適切なコンホメーションを維持することに関与しないどのシステイン残基も、一般にはセリンで置換可能であり、分子の酸化安定性を向上させて、異常な架橋連結を妨げる。逆に、システイン結合を抗体へ加えてその安定性を向上させてよい（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合）。
アミノ酸修飾は、１以上のアミノ酸を変化させるかまたは修飾すること〜可変領域のような領域の完全な再設計に及ぶ場合がある。可変領域における変化は、結合アフィニティーおよび／または特異性を改変可能である。ある態様では、１〜５以下の保守的アミノ酸置換をＣＤＲドメインの内部で行う。他の態様では、１〜３以下の保守的アミノ酸置換をＣＤＲ３ドメインの内部で行う。なお他の態様において、ＣＤＲドメインは、ＣＤＲ Ｈ３および／またはＣＤＲ Ｌ３である。
修飾には、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、並びに、例えば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化のような他の翻訳後修飾のあるポリペプチドが含まれる。抗体は、その定常領域中の保守的位置でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓとＬｕｎｄ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１−１２８；ＷｒｉｇｈｔとＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，ＴｉｂＴＥＣＨ １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら，１９９６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８；ＷｉｔｔｗｅとＨｏｗａｒｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５−４１８０）と糖タンパク質の部分間の分子内相互作用に影響を及ぼし、このことが、糖タンパク質のコンホメーションと提示の三次元表面に影響を及ぼす場合がある（ＨｅｆｆｅｒｉｓとＬｕｎｄ，同上；ＷｙｓｓとＷａｇｎｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９−４１６）。オリゴ糖も、特異的な認識構造に基づいて、所与の糖タンパク質をある分子へ標的指向させるのに役立つ場合がある。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすと報告されてきた。特に、β（１、４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）［二等分ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ］のテトラサイクリン調節発現を有するＣＨＯ細胞は、改善されたＡＤＣＣ活性を有すると報告された（Ｕｍａｎａら，１９９９，Ｍａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を意味する。トリペプチド配列：アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸは、プロリン以外のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的付加のための認識配列である。このように、ポリペプチド中のこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を創出する。Ｏ連結グリコシル化は、糖：Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニン（但し、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用可能である）への付加を意味する。
グリコシル化部位の抗体への追加は、簡便には、抗体が上記トリペプチド配列（Ｎ連結グリコシル化部位のため）の１以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって達成する。この改変はまた、元の抗体の配列への１以上のセリンまたはスレオニン残基（Ｏ連結グリコシル化部位のため）の追加、またはそれによる置換によって行ってよい。
抗体のグリコシル化パターンは、基本となるヌクレオチド配列を改変しなくても改変可能である。グリコシル化は、主に、抗体を発現するために使用する宿主細胞に依存する。潜在的な治療薬としての組換え糖タンパク質（例えば、抗体）の発現のために使用する細胞種がネイティブ細胞であることは稀であるので、抗体のグリコシル化パターンには、種々のバリエーションが期待できる（例えば、Ｈｓｅら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２−９０７０を参照のこと）。
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生の間のグリコシル化に影響を及ぼす要因には、増殖形式、培地製剤、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキーム、等が含まれる。オリゴ糖産生に関与するある種の酵素を導入するかまたは過剰発現させることが含まれる、特別な宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを改変するために様々な方法が提唱されてきた（米国特許第５，０４７，３３５；５，５１０，２６１および５，２７８，２９９号）。グリコシル化、またはある種のグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）を使用して、糖タンパク質より酵素的に除去可能である。さらに、組換え宿主細胞は、ある種の多糖をプロセシングすることが欠損するように遺伝子工学処理可能である。こういった技術や同様の技術は、当該技術分野でよく知られている。
他の修飾の方法には、限定されないが、酵素手段、酸化的置換、およびキレート化が含まれる、当該技術分野で知られたカップリング技術を使用することが含まれる。例えば、イムノアッセイの標識の付加のために、種々の修飾が使用可能である。当該技術分野で確立された手順を使用して修飾Ｅ３ポリペプチドを作製して、当該技術分野で知られた標準アッセイ（このうちのいくつかは、以下と実施例において記載する）を使用してスクリーニング可能である。
他の抗体修飾には、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９９／５８５７２（１９９９年１１月１８日公開）に記載のように修飾された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子へ指向される結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全部または一部に実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の重大な補体依存性の溶解や細胞仲介性の破壊を始動させることなく、標的分子へ結合することが可能である。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂへ特異的に結合することが可能である。これらは、典型的には、２以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。このやり方で修飾された抗体は、慢性抗体療法における使用に特に適していて、慣用の抗体療法に対する炎症性および他の有害反応を回避する。
本発明には、本発明の抗体（Ｅ３のような）またはポリペプチドからの１以上の断片または領域を含んでなる融合タンパク質も含まれる。１つの態様において、図１Ｂに示す少なくとも１０の連続アミノ酸の可変軽鎖領域および／または図１Ａに示す少なくとも１０のアミノ酸の可変重鎖領域を含む融合ポリペプチドを提供する。別の態様において、融合ポリペプチドは、図１Ａおよび１Ｂに示すような軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の態様において、融合ポリペプチドは、Ｅ３の１以上のＣＤＲを含む。なお他の態様において、融合ポリペプチドは、抗体Ｅ３のＣＤＲ Ｈ３および／またはＣＤＲ Ｌ３を含む。別の態様において、融合ポリペプチドは：ＣＤＲ Ｈ１のアミノ酸残基Ｌ２９、ＣＤＲ Ｈ２のＩ５０、ＣＤＲ Ｈ３のＷ１０１、および／またはＣＤＲ Ｈ３のＡ１０３；および／またはＣＤＲ Ｌ１のアミノ酸残基Ｓ２８、ＣＤＲ Ｌ１のＮ３２、ＣＤＲ Ｌ２のＴ５１、ＣＤＲ Ｌ３の９１Ｅおよび／またはＣＤＲ Ｌ３のＨ９２のどの１以上も含む。本発明の目的では、Ｅ３融合タンパク質は、１以上のＥ３抗体と、ネイティブ分子においてはそれに付かない別のアミノ酸配列、例えば、異種配列または別の領域からの同種配列を含有する。例示の異種配列には、限定されないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグのような「タグ」が含まれる。タグは、当該技術分野でよく知られている。
Ｅ３融合ポリペプチドは、当該技術分野で知られた方法により、例えば、合成的または組換え的に創製可能である。典型的には、本発明のＥ３融合タンパク質は、本明細書に記載の組換え法を使用して、それらをコードするポリヌクレオチドを調製して発現させることによって作製するが、それらは、例えば、化学合成が含まれる、当該技術分野で知られた他の手段によっても製造可能である。
本発明はまた、固体支持体へのカップリングを容易にする薬剤（ビオチンまたはアビジンのような）へコンジュゲートした（例えば、連結した）Ｅ３抗体またはポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。簡明に言えば、これらの方法は、本明細書に記載のＮＧＦ結合態様のいずれにも適用されるという理解とともに、概してＥ３または抗体に関連する。一般に、コンジュゲーションは、本明細書に記載のようなこれらの成分を連結させることを意味する。連結（これは、一般的には、これらの成分を少なくとも処理のために近似会合状態に固定することである）は、任意数のやり方で達成可能である。例えば、それぞれが他方と反応することが可能な置換基を保有する場合、薬剤と抗体の間の直接的な反応があり得る。例えば、アミノまたはスルフヒドリル基のような求核基が一方にあれば、他方にある無水物または酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基と、または良好な脱離基（例、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することが可能であり得る。
本発明の抗体またはポリペプチドは、蛍光分子、放射活性分子、または当該技術分野で知られた他のあらゆる標識のような標識剤（あるいは「標識」と呼ぶ）へ連結可能である。当該技術分野では、一般的にシグナルを（直接的に、または間接的に）提供する標識が知られている。従って、本発明には、標識化した抗体およびポリペプチドが含まれる。
ＮＧＦへ結合すること；ＮＧＦ生物学的活性を抑制または阻害すること；Ｅ１３．５マウス三叉神経ニューロンのＮＧＦ誘発性の生存を抑制および／または阻止することといった、本発明の抗体およびポリペプチドの能力は、当該技術分野で知られた方法を使用して検査可能であり、そのいくつかを実施例に記載する。
本発明はまた、抗体Ｅ３と、本開示が明らかにするように、本明細書に記載の抗体および／またはポリペプチドのいくつかまたはすべてを含んでなる組成物（医薬組成物が含まれる）およびキットを提供する。
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明はまた、本発明の抗体およびポリペプチド（図１Ａおよび１Ｂに示す軽鎖および重鎖可変領域のポリペプチド配列を含んでなる抗体が含まれる）をコードする単離ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを含んでなるベクターおよび宿主細胞を提供する。
従って、本発明は、以下のいずれもコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（または、医薬組成物が含まれる組成物）を提供する：（ａ）抗体Ｅ３；（ｂ）抗体Ｅ３の断片または領域；（ｃ）図１Ｂに示すような抗体Ｅ３の軽鎖；（ｄ）図１Ａに示すような抗体Ｅ３の重鎖；（ｅ）抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖からの１以上の可変領域；（ｆ）図１Ａおよび１Ｂに示す抗体Ｅ３の１以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５または６のＣＤＲ）；（ｇ）図１Ａに示す抗体Ｅ３の重鎖からのＣＤＲ Ｈ３；（ｈ）図１Ｂに示す抗体Ｅ３の軽鎖からのＣＤＲ Ｌ３；（ｉ）図１Ｂに示す抗体Ｅ３の軽鎖からの３つのＣＤＲ；（ｊ）図１Ａに示す抗体Ｅ３の重鎖からの３つのＣＤＲ；（ｋ）図１Ａおよび１Ｂに示す抗体Ｅ３の、軽鎖からの３つのＣＤＲと重鎖からの３つのＣＤＲ；または（ｌ）（ｂ）〜（ｋ）のいずれも含んでなる抗体。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、図２および３に示すポリヌクレオチドの片方または両方を含む。
別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いたＥ３軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドである。別の側面において、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いたＥ３重鎖をコードする単離ポリヌクレオチドである。なお別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いたポリヌクレオチドにコードされる可変領域、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いたポリヌクレオチドにコードされる可変領域を含んでなる単離ポリヌクレオチドである。別の側面において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号の付いたポリヌクレオチドにコードされる１以上のＣＤＲ；および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号の付いたポリヌクレオチドにコードされる１以上のＣＤＲを含んでなる単離ポリヌクレオチドである。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載の抗体（抗体断片が含まれる）とポリペプチドのいずれもコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られた手順によって作製可能である。
別の側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれも含んでなる組成物（医薬組成物のような）を提供する。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載のＥ３抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを含む。他の態様において、組成物は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドのいずれもコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを含む。なお他の態様において、組成物は、図２および３に示すポリヌクレオチドの一方または両方を含む。発現ベクターと、ポリヌクレオチド組成物の投与については、本明細書でさらに記載する。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれも作製する方法を提供する。
任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも、本発明に含まれる。ポリヌクレオチドは、単鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二本鎖であっても、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有してＤＮＡ分子へ１対１のやり方で対応するＨｎＲＮＡ分子と、イントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。本発明のポリヌクレオチド内には、追加のコードまたは非コード配列が、必要ではないが、存在してもよく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料へ、必要ではないが、連結してもよい。
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（即ち、抗体またはその部分をコードする内因性の配列）を含んでも、そのような配列の変異体を含んでもよい。ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの免疫反応性がネイティブな免疫反応性の分子に比べて減退しないように、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。一般に、コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、本明細書に記載のように評価可能である。変異体は、ネイティブな抗体またはその部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、および最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を明示する。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、この２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載のように最高の対応で並置されるときに同じであれば、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、局所領域の配列類似性を同定して比較するために、比較ウィンドウにわたって配列を比較することによって実施する。本明細書に使用する「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続位置のセグメントを意味し、ここでは、２つの配列を最適に並置した後で、同数の連続位置の参照配列に対して配列を比較可能である。
比較のための配列の最適アライメントは、デフォルト変数を使用する、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅセット中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ社、ウィスコンシン州マジソン）を使用して実行可能である。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかのアライメントスキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（監修）「タンパク質配列および構造の図解書（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ワシントン、Ｄ．Ｃ．第５巻，補遺３，３４５−３５８頁中、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）「タンパク質における革新的な変化のモデル−離れた関係を検出するためのマトリックス（Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ）」；Ｈｅｉｎ Ｊ．，１９９０「アライメントへの統一アプローチと系統遺伝子（Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ）」６２６−６４５頁、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」１８３巻，アカデミック・プレス社、カリフォルニア州サンディエゴ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．とＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．とＭｕｌｌｅｒ Ｗ．，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．とＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，「数的命名法の原理と実践（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ）」フリーマン・プレス、カリフォルニア州サンフランシスコ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：７２６−７３０。
好ましくは、「配列同一性の百分率」は、２つの最適に並置した配列を少なくとも２０の位置の比較のウィンドウにわたって比較することによって決定し、ここで比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アライメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）へ比較するとき、２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（即ち、ギャップ）を含んでよい。この百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中に生じる位置の数を決定して適合位置の数を得て、この適合位置の数を参照配列（即ち、ウィンドウサイズ）中の位置の全数で割り、その結果に１００をかけて、配列同一性の百分率を得て計算する。
変異体はまた、あるいは、ネイティブ遺伝子、またはその部分または相補体に実質的に相同であってもよい。そのようなポリヌクレオチド変異体は、ネイティブ抗体をコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補配列）へ中等度ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能である。
好適な「中等度ストリンジェント条件」には、５Ｘ ＳＳＣ，０．５％ ＳＤＳ，１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での前洗浄；５０℃〜６５℃，５Ｘ ＳＳＣで一晩ハイブリダイズすること；続いて、０．１％ ＳＤＳを含有する２Ｘ、０．５Ｘ、および０．２Ｘ ＳＳＣのそれぞれで、６５℃で２０分間、２回洗浄することが含まれる。
本明細書に使用するように、「きわめてストリンジェントな条件」または「高ストリンジェント条件」は：（１）例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で洗浄するのに低イオン強度と高温を利用する；（２）ハイブリダイーションの間に、ホルムアミドのような変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド＋０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）＋７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で利用する；または（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、音波処理済みサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で、４２℃での０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）における洗浄と５５℃での５０％ホルムアミドにおける洗浄とともに利用して、ＥＤＴＡを含有する０．１ｘＳＳＣからなる５５℃での高ストリンジェンシー洗浄を続けるものである。当業者は、温度、イオン強度、等を必要に応じて調整して、ブローブの長さ、等のような要因に適応させる方法を認知している。
当業者には、遺伝暗号の縮重性の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることが理解されよう。これらのポリヌクレオチドのなかには、どのネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列にもわずかな相同性しか有さないものがある。それでも、コドン使用における違いにより変動するポリヌクレオチドが、本発明により具体的に考慮される。さらに、本明細書に提供するポリヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子の対立遺伝子が本発明の範囲内にある。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換のような１以上の突然変異の結果として改変された内因性の遺伝子である。生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、改変された構造または機能を有してよいが、有する必要はない。対立遺伝子は、標準技術（ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較のような）を使用して同定可能である。
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを使用して入手可能である。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は、当該技術分野でよく知られていて、本明細書において詳しく記載するに及ばない。当業者は、本明細書に提供される配列と市販のＤＮＡ合成機を使用して、望みのＤＮＡ配列を生成することができる。
組換え法を使用してポリヌクレオチドを製造するには、本明細書において詳しく考察するように、望みの配列を含んでなるポリヌクレオチドを好適なベクターへ挿入可能であり、次いでこのベクターは、複製および増幅に適した宿主細胞へ導入可能である。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られたどの手段によっても、宿主細胞へ挿入可能である。外因性のポリヌクレオチドを直接取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ交配、またはエレクトロポレーションにより導入することによって、細胞を形質転換する。導入したならば、外因性のポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミドのような）として細胞内に維持しても、宿主細胞ゲノムへ組み込んでもよい。このように増幅したポリヌクレオチドは、当該技術分野でよく知られた方法によって、宿主細胞より単離可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（１９８９）を参照のこと。
あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の再生産を可能にする。ＰＣＲ技術は、当該技術分野でよく知られていて、米国特許第４，６８３，１９５号、４，８００，１５９号、４，７５４，０６５号、および４，６８３，２０２号、並びに「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」Ｍｕｌｌｉｓら．監修、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ，ボストン（１９９４）に記載されている。
ＲＮＡは、単離ＤＮＡを適正なベクターにおいて使用して、それを好適な宿主細胞中へ挿入することによって入手可能である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）において示されるように、細胞が複製して、ＤＮＡがＲＮＡへ転写されるとき、ＲＮＡは、当業者によく知られた方法を使用して単離可能である。
好適なクローニングベクターは、標準技術に従って構築しても、当該技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターより選択してもよい。選択されるクローニングベクターは、使用することを企図される宿主細胞により変動してよいが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特別な制限エンドヌクレアーゼへの短一標的を保有可能であり、および／または、該ベクターを含有するクローニングを選択するときに使用可能であるマーカーの遺伝子を担うことができる。好適な例には、プラスミドと細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例、ｐＢＳ ＳＫ＋）とその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、並びに、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８のようなシャトルベクターが含まれる。上記や他の多くのクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような市販ベンダーより利用可能である。
発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する、複製可能なポリヌクレオチド構築体である。発現ベクターは、宿主細胞において、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの必須部分として複製可能でなければならない。好適な発現ベクターには、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスが含まれる）、コスミド、およびＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８７／０４４６２に開示される発現ベクターが含まれる。一般に、ベクター成分には、限定されないが、以下の１以上を含めてよい：シグナル配列；複製始点；１以上のマーカー遺伝子；好適な転写制御要素（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターのような）。発現（即ち、翻訳）には、リボゾーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンのような、１以上の翻訳制御要素も通常は必要とされる。
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を利用するトランスフェクション；微小射出体衝突法；リポフェクション；および、感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスのような感染性病原体である場合）が含まれるいくつかの適正な手段のいずれによっても宿主細胞へ導入可能である。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、しばしば、宿主細胞の特徴に依存する。
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれも含んでなる宿主細胞を提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することが可能などの宿主細胞も、目的の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために使用可能である。哺乳動物の宿主細胞の非限定的な例には、限定されないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が含まれる。ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８７／０４４６２も参照のこと。好適な非哺乳動物の宿主細胞には、原核生物（大腸菌または枯草菌のような）と酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ；またはＫ．ｌａｃｔｉｓのような）が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞に存在するならば、対応する目的の内因性抗体またはタンパク質のレベルより約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、なおより好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。宿主細胞についてＮＧＦへの特異結合をスクリーニングすることは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳにより行う。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞が同定可能である。
Ｅ３とＥ３由来抗体を使用する方法
ＮＧＦへ結合する抗体Ｅ３を使用して、ＮＧＦの存在または非存在を同定または検出することができる。簡明に言えば、これらの方法は、本明細書に記載のＮＧＦ結合態様（ポリペプチドのような）のいずれにも適用されるという理解とともに、概してＥ３または抗体に関連する。一般に、検出は、ＮＧＦへ結合する本明細書に記載の抗体と生物学的試料を接触させることと、ＮＧＦとＮＧＦへ特異的に結合する抗体（例、Ｅ３）の間の複合体の形成に関連する。このような複合体の形成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎｖｉｖｏでもあり得る。本明細書に使用する用語「検出」には、対照への参照を伴うかまたは伴わない、定性的および／または定量的な検出（レベルを測定すること）が含まれる。
多様な既知の方法もいずれも検出に使用可能であり、限定されないが、ポリペプチドへ結合する抗体を使用するイムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、等による）；および、コードされるポリペプチドへの機能アッセイ（例、結合活性または酵素アッセイ）が含まれる。いくつかの態様において、抗体は、検出可能的に標識する。
Ｅ３と誘導体の診断使用
本発明の抗体およびポリペプチドは、改変または逸脱したＮＧＦ発現（いくつかの態様においては、（正常試料に比べて）増加または減少したＮＧＦ発現、および／または通常はＮＧＦ発現を欠く組織および／または細胞における発現の存在、または通常はＮＧＦ発現を保有する組織または細胞における発現の非存在といった不適正な発現）に関連する疾患、状態、または障害の検出、診断、およびモニタリングに使用可能である。本発明の抗体およびポリペプチドは、例えば、ＮＧＦへの改変または逸脱した感受性または応答性に関連した疾患におけるＮＧＦ発現の検出にさらに有用である。いくつかの態様において、ＮＧＦ発現は、ＮＧＦ発現への改変または逸脱した感受性または応答性を特徴とするかまたはそれに関連した疾患、障害（例えば、ＮＧＦが増殖および／または転移を促進する癌）を有することが疑われる個体からの試料において検出する。
このように、いくつかの態様において、本発明は、改変または逸脱したＮＧＦ発現を有することが疑われる個体の標本（試料）を本発明の抗体またはポリペプチドと接触させることと、ＮＧＦのレベルが対照または比較標本のそれから異なるかどうかを決定することを含んでなる方法を提供する。いくつかの態様において、個体は、心臓不整脈、アルツハイマー病、および／または自律機能障害を有する。
他の態様において、本発明は、個体の標本（試料）を接触させて、ＮＧＦ発現のレベルを決定することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、個体は、ＮＧＦ発現への改変または逸脱した感受性または応答性を特徴とするかまたはそれに関連した疾患、障害を有することが疑われる。いくつかの態様において、個体は、小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肝細胞癌、または黒色腫を有する。
診断応用では、抗体は、典型的には、限定されないが、放射性同位体、蛍光標識、および様々な酵素−基質標識が含まれる、検出可能な部分で標識される。標識を抗体へコンジュゲートする方法は、当該技術分野で知られている。本発明の他の態様において、本発明の抗体は、標識する必要がなく、その存在は、本発明の抗体へ結合する標識抗体を使用して検出可能である。
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイのような、どの既知のアッセイ法においても利用可能である。Ｚｏｌａ，「モノクローナル抗体：技術マニュアル（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」１４７−１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社、１９８７）。
抗体はまた、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングのようなｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイにも使用可能である。一般に、抗体は、免疫シンチグラフィーを使用して目的の細胞または組織を位置決定することができるように、放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、または３Ｈのような）で標識する。
抗体は、当該技術分野でよく知られた技術に従って、病理学における染色試薬としても使用可能である。
Ｅ３および誘導体を治療目的に使用する方法
抗体Ｅ３は、ＮＧＦの生物学的活性を抑制および／または阻止するのに有用である。この拮抗活性は、疼痛のような、内因性ＮＧＦ産生に関連した病理学的状態の治療に有用であると考えられている。一般に、これらの態様では、有効量を個体へ投与する。従って、１つの側面において、本発明は、本明細書に開示するポリペプチド（抗体Ｅ３のような抗体が含まれる）のいずれかを使用して、ヒトＮＧＦの生物学的活性に拮抗させる方法を提供する。１つの態様において、本方法は、本明細書に記載のポリペプチド（抗体Ｅ３が含まれる）のいずれかとヒト神経成長因子を接触させて、それによりヒト神経成長因子の活性に拮抗させる、それを抑制、阻止、または抑圧することを含む。なお別の態様では、疼痛（術後疼痛または慢性関節リウマチ疼痛のような）のある個体へＥ３での治療を与える。
簡明に言えば、これらの方法は、本明細書に記載のＥ３変異体の抗体およびポリペプチドのいずれにも適用されるという理解とともに、概してＥ３または抗体に関連する。
Ｅ３またはＥ３の断片（例、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのような）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含んでなる融合タンパク質、並びに、必要とされる特異性の抗原ＮＧＦ認識部位を含むＥ３の他のあらゆる修飾配置の様々な製剤が投与のために使用可能である。いくつかの態様において、Ｅ３抗体またはＥ３の様々な製剤は、そのまま投与可能である。他の態様において、Ｅ３抗体またはＥ３の様々な製剤（本明細書に記載のあらゆる組成物の態様が含まれる）と医薬的に許容される賦形剤が投与されて、様々な製剤であり得る。医薬的に許容される賦形剤は、当該技術分野で知られていて、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形状またはコンシステンシーを付与しても、希釈剤として作用してもよい。好適な賦形剤には、限定されないが、安定化剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変化させるための塩類、被包化剤、緩衝剤、および皮膚透過エンハンサーが含まれる。賦形剤、並びに、非経口および非腸管外の薬物送達用の製剤については、レミントン，「調剤の科学および実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」第２０版、マック・パブリッシング（２０００）に説明されている。
いくつかの態様において、上記の薬剤は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、等）による投与用に製剤化されるが、他の形態の投与（例、経口、粘膜、吸入による、舌下、等）も使用可能である。従って、Ｅ３抗体とその同等物は、好ましくは、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、等のような医薬的に許容される担体と組み合わせる。特別な投与方式（即ち、用量、時機、および反復）は、特別な個体とその個体の治療歴に依存するものである。一般に、以下の用量のいずれも使用可能である：少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重またはそれ未満の用量を投与する。数日またはより長きにわたる反復投与では、状態に依存して、疾患症状の望まれる抑圧が起こるまで、治療を持続する。例示の投薬方式は、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量に、約１ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体の毎週の維持量、または約１ｍｇ／ｋｇの隔週の維持量を続ける。しかしながら、診療医が達成することを望む薬物動態減衰のパターン次第では、他の投与方式も有用であり得る。投与量の決定には、半減期のような経験上の考慮が貢献するものである。この療法の進捗は、慣用の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
ある個体では、１回より多くの用量が要求される場合がある。投与の頻度は、療法の経過にわたって決定および調整可能である。例えば、投与の頻度は、治療すべき疼痛の種類および重症度、薬剤を予防または治療の目的のいずれのために投与するのか、過去の療法、患者の臨床歴と薬剤への応答、および担当医の裁量に基づいて決定または調整可能である。典型的には、臨床医は、望ましい結果を達成する投与量に達するまで、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体（Ｅ３のような）を投与するものである。ある場合には、Ｅ３抗体の持続連続放出製剤が適正であるかもしれない。持続放出を達成するための様々な製剤およびデバイスが当該技術分野で知られている。
１つの態様において、Ｅ３抗体（またはポリペプチド）の投与量は、１回以上の投与をすでに与えた個体においては、経験的に決定可能である。個体には、Ｅ３の漸増投与量を与える。Ｅ３または他の同等の抗体の効力を評価するには、疾患症状（疼痛のような）のマーカーをモニタリング可能である。
本発明の方法に準拠した抗体（Ｅ３のような）またはポリペプチドの投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療または予防のいずれであるのかということ、そして熟練の診療医に知られた他の要因に依存して、連続的または間欠的であり得る。抗体の投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続しても、空白のある投薬（例えば、疼痛を発症する前、間、または後、疼痛を発症する前、間、前および後、間および後、または前、間、および後）の連続であってもよい。投与は、創傷、切開、外傷、外科手術、および術後疼痛を生じる可能性がある他のあらゆるイベントの前、間、および／または後であってよい。
他の製剤には、限定されないが、リポソームのような担体が含まれる、当該技術分野で知られた好適な送達形態が含まれる。例えば、Ｍａｈａｔｏら．（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９を参照のこと。リポソーム調製物には、限定されないが、サイトフェクチン、多層小胞、および単層小胞が含まれる。
いくつかの態様では、１より多い抗体またはポリペプチドが存在してよい。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。そのような組成物は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる抗体を含有可能である。抗体の混合物は、当該技術分野でしばしば注目されるように、より広い範囲の個体集団を治療するのに特に有用であり得る。
本発明の抗体またはポリペプチド（抗体Ｅ３のような）のいずれもコードするポリヌクレオチドも、本発明の抗体またはポリペプチド（抗体Ｅ３のような）のいずれもの送達と所望の細胞における発現のために使用可能である。Ｅ３抗体またはポリペプチドの発現を指令するために発現ベクターを使用可能であることは明らかである。発現ベクターは、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、鞘内、心室内、経口、腸内、腸管外、鼻腔内、皮内、舌下、または吸入によるような、当該技術分野で知られたどの手段によっても投与可能である。例えば、発現ベクターの投与には、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与が含まれる局部または全身投与と、局所投与が含まれる。当業者は、外因性タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現を入手するための発現ベクターの投与に馴染みがある。米国特許第６，４３６，９０８；６，４１３，９４２；および６，３７６，４７１号を参照のこと。
本発明の抗体またはポリペプチド（抗体Ｅ３のような）のいずれもコードするポリヌクレオチドを含んでなる治療組成物の標的指向送達も使用可能である。受容体仲介性のＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら，「遺伝子治療薬：直接的な遺伝子移入の方法および応用（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ監修）（１９９４）；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療組成物は、遺伝子治療プロトコールにおける局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与する。遺伝子治療プロトコールの間は、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲も使用可能である。本発明の治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達担体を使用して送達可能である。遺伝子送達担体は、ウイルス起源でも非ウイルス起源でもよい（一般的には、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照のこと）。そのようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物または異種プロモーターを使用して誘導可能である。コード配列の発現は、構成的でも、調節的でもよい。
望まれるポリヌクレオチドの送達と望まれる細胞での発現のためのウイルスベースのベクターは、当該技術分野でよく知られている。例示のウイルスベースの担体には、限定されないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；ＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５，２１９，７４０；４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；およびＥＰ特許第０ ３４５ ２４２号を参照のこと）、α−ウイルスベースのベクター（例、シンドビス・ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバー・ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照のこと）が含まれる。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載されるような死滅アデノウイルスへ連結したＤＮＡの投与も利用可能である。
非ウイルス性送達の担体および方法も利用可能であり、限定されないが、死滅アデノウイルス単独へ連結または非連結のポリカチオン濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照のこと）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照のこと）；真核細胞送達担体細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９５／０７９９４；ＷＯ９６／１７０７２；ＷＯ９５／３０７６３；およびＷＯ９７／４２３３８を参照のこと）、および核酸電荷の中和、または細胞膜との融合が含まれる。裸のＤＮＡも利用可能である。例示の裸ＤＮＡ導入法がＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達担体として作用し得るリポソームが米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；およびＥＰ特許第０５２４９６８号に記載されている。追加のアプローチがＰｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１とＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載されている。
本明細書に記載のすべての方法に関して言えば、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体への言及には、これら薬剤の１以上を含んでなる組成物も含まれる。これらの組成物は、当該技術分野でよく知られている、緩衝剤が含まれる医薬的に許容される賦形剤のような、好適な賦形剤をさらに含んでよい。本発明は、単独で、または他の慣用の治療方法と組み合わせて使用可能である。
慢性関節リウマチ疼痛を治療または予防するために抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を使用する方法
いくつかの側面において、本発明は、哺乳動物（ヒトと非ヒトの両方）が含まれる個体において、慢性関節リウマチ疼痛を治療および／または予防する方法を提供する。従って、１つの側面において、本発明は、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与することを含んでなる、個体において慢性関節リウマチ疼痛を治療する方法を提供する。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、当該技術分野で知られていて、本明細書に記載する。
別の側面において、本発明は、慢性関節リウマチ疼痛の個体における発症を抑制する、それを改善する、抑圧する、緩和する、および／またはその発現、発達または進行を遅らせる方法を提供する。このように、いくつかの態様では、慢性関節リウマチを有する個体において、疼痛または疼痛エピソードの発達に先立って抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与する。
別の側面において、本発明は、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与することを含んでなる、個体において慢性関節リウマチに関連した炎症性悪液質（体重損失）を治療する方法を提供する（Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４０（３）：５３４−９（１９９７）；Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３（６）：２３７９−８６（１９９４））。
慢性関節リウマチ疼痛の診断または評価は、当該技術分野で十分確立している。評価は、様々な疼痛尺度を使用する、疼痛の患者特性決定のような、当該技術分野で知られた測定に基づいて実施可能である。例えば、Ｋａｔｚら，Ｓｕｒｇ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．（１９９９）７９（２）：２３１−５２；Ｃａｒａｃｅｎｉら．Ｊ Ｐａｉｎ Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｍａｎａｇｅ（２００２）２３（３）：２３９−５５を参照のこと。米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（ＡＣＲ）（Ｆｅｌｓｏｎら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９３）３６（６）：７２９−７４０）、健康評価質問表（Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＨＡＱ）（Ｆｒｉｅｓら，（１９８２）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．９：７８９−７９３）、Ｐａｕｌｕｓ尺度（Ｐａｕｌｕｓら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９０）３３：４７７−４８４）、および関節炎影響測定尺度（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｉｍｐａｃｔ Ｍｅａｓｕｒｅ Ｓｃａｌｅ）（ＡＩＭＳ）（Ｍｅｅｎａｍら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（１９８２）２５：１０４８−１０５３）のような、病態を測定するためによく使用される尺度もある。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、好適な経路を介して個体へ投与可能である。異なる投与経路の例を本明細書に記載する。
疼痛緩和は、疼痛の時間経過を特徴とする場合がある。従って、いくつかの態様では、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与後約２４時間以内に疼痛緩和を観察する。他の態様では、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与後約３６、４８、６０、７２時間または４日以内に疼痛緩和を観察する。なお他の態様では、慢性関節リウマチと関連した炎症状態の改善の指標を観察する前に疼痛緩和を観察する。いくつかの態様では、疼痛の頻度および／または強度が減少する、および／またはこの疾患に罹患している人々の生命の質が高まる。
これらの方法のためにＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦ抗体が含まれる）を作製して使用することを以下のセクション（「ＮＧＦアンタゴニスト」、「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体」；「他のＮＧＦアンタゴニスト」；「ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の同定」；「本発明の方法に使用の組成物」；「ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の投与」）において記載する。
骨関節炎疼痛を治療または予防するために抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を使用する方法
いくつかの側面において、本発明は、哺乳動物（ヒトと非ヒトの両方）が含まれる個体において、骨関節炎疼痛を治療および／または予防する方法を提供する。従って、１つの側面において、本発明は、有効量のＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）を投与することを含んでなる、個体において骨関節炎疼痛を治療する方法を提供する。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が含まれるＮＧＦアンタゴニストは、当該技術分野で知られていて、本明細書に記載する。
別の側面において、本発明は、有効量のＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）を投与することを含んでなる、骨関節炎疼痛の個体における発症を抑制する、それを改善する、抑圧する、緩和する、および／またはその発現、発達または進行を遅らせる方法を提供する。このように、いくつかの態様では、骨関節炎を有する個体において、疼痛または疼痛エピソードの発達に先立ってＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）を投与する。
骨関節炎疼痛の診断または評価は、当該技術分野で十分確立している。評価は、様々な疼痛尺度を使用する、疼痛の患者特性決定のような、当該技術分野で知られた測定に基づいて実施可能である。例えば、Ｋａｔｚら，Ｓｕｒｇ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．（１９９９）７９（２）：２３１−５２；Ｃａｒａｃｅｎｉら．Ｊ Ｐａｉｎ Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｍａｎａｇｅ（２００２）２３（３）：２３９−５５を参照のこと。例えば、疼痛を評定して治療への応答を評価するために、ＷＯＭＡＣ通院疼痛尺度（Ａｍｂｕｌａｔｉｏｎ Ｐａｉｎ Ｓｃａｌｅ）（疼痛、こわばり、および身体機能が含まれる）と１００ｍｍ視覚アナログ尺度（Ｖｉｓｕａｌ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｓｃａｌｅ）（ＶＡＳ）が利用可能である。
ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）は、好適な経路を介して個体へ投与可能である。異なる投与経路の例を本明細書に記載する。
いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）は、毎週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、５週毎に１回、６週毎に１回、７週毎に１回、８週毎に１回、９週毎に１回、１０週毎に１回、１５週毎に１回、２０週毎に１回、２５週毎に１回、または２６週毎に１回投与する。いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）は、毎月１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、４ヶ月毎に１回、５ヶ月毎に１回、または６ヶ月毎に１回投与する。
疼痛緩和は、疼痛の時間経過を特徴とする場合がある。従って、いくつかの態様では、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の投与後約２４時間以内に疼痛緩和を観察する。他の態様では、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の投与後約３６、４８、６０、７２時間または４日以内に疼痛緩和を観察する。いくつかの態様では、疼痛の頻度および／または強度が減少する、および／またはこの疾患に罹患している人々の生命の質が高まる。いくつかの態様では、骨関節炎の疼痛緩和を、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の単回投薬後少なくとも約７日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、少なくとも約２８日、少なくとも約３５日、少なくとも約４２日、少なくとも約４９日、少なくとも約５６日、少なくとも約６３日、少なくとも約７０日、少なくとも約７７日、少なくとも約８４日、少なくとも約１８０日の間、またはより長く提供する。
これらの方法のためにＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦ抗体が含まれる）を作製して使用することを以下のセクション（「ＮＧＦアンタゴニスト」、「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体」；「他のＮＧＦアンタゴニスト」；「ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の同定」；「本発明の方法に使用の組成物」；「ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の投与」）において記載する。
ＮＧＦアンタゴニスト
本発明の方法（慢性関節リウマチ疼痛および骨関節炎疼痛に関する）は、ＮＧＦアンタゴニストを使用するが、これは、受容体結合および／またはＮＧＦへの細胞応答の顕在化のような、ＮＧＦシグナル伝達により仲介される下流経路が含まれるＮＧＦ生物学的活性を阻止、抑圧、または抑制する（有意に、が含まれる）あらゆる分子を意味する。用語「アンタゴニスト」は、生物学的作用の特異的な機序を何であれ含意せず、異なる、そして化学的に多岐にわたる多様な組成物によって達成可能である、ＮＧＦとのすべての可能な薬理学的、生理学的、および生化学的な相互作用とその結果を明らかに包含および網羅すると考えられる。例示のＮＧＦアンタゴニストには、限定されないが、抗ＮＧＦ抗体、ＮＧＦへ向けられるアンチセンス分子（ＮＧＦをコードする核酸へ向けられるアンチセンス分子が含まれる）、ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ受容体および／またはｐ７５受容体のような）へ向けられるアンチセンス分子（ＴｒｋＡおよび／またはｐ７５をコードする核酸へ向けられるアンチセンス分子が含まれる）、ＮＧＦ阻害性化合物、ＮＧＦ構造類似体、ＮＧＦへ結合するＴｒｋＡ受容体の優性ネガティブ突然変異体、ＴｒｋＡイムノアドへシン、抗ＴｒｋＡ抗体、ＮＧＦへ結合するｐ７５受容体の優性ネガティブ突然変異体、抗ｐ７５抗体、およびキナーゼ阻害剤が含まれる。本発明の目的では、用語「アンタゴニスト」には、ＮＧＦそれ自身、ＮＧＦの生物学的活性（限定されないが、疼痛のあらゆる側面に仲介する能力が含まれる）、または生物学的活性の結果がそれにより意味のある度合いにおいて、実質的に無効化、減少、または中和される、これまでに確認されてきた用語、タイトル、および機能の状態および特徴がすべて含まれると明白に理解されよう。いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニスト（例、抗体）は、ＮＧＦへ結合する（それと物理的に相互作用する）、ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ受容体および／またはｐ７５受容体のような）へ結合する、および／または下流のＮＧＦ受容体シグナル伝達を抑制（妨害および／または阻止）する。従って、いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦへ結合する（それと物理的に相互作用する）。いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦへ結合するポリペプチドである。いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＰＣＴ ＷＯ２００４／０２６３２９に記載される、ペプチドまたは修飾ペプチド（Ｆｃドメインへ融合したＮＧＦ結合ペプチドのような）である。他の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦ受容体（ｔｒｋＡ受容体またはｐ７５のような）へ結合する。他の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、下流のＮＧＦ受容体シグナル伝達抑制（妨害および／または阻止）する（例、キナーゼシグナル伝達の阻害剤）。他の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦ合成および／または放出を阻害（抑制）する。別の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＴｒｋＡイムノアドへシンではない（即ち、ＴｒｋＡイムノアドへシン以外である）ＮＧＦアンタゴニストである。別の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ抗体以外である。他の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＴｒｋＡイムノアドへシン以外であり、抗ＮＧＦ抗体以外である。ある態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦ（ｈＮＧＦのような）へ結合して、ＮＴ−３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦのような関連のニュートロフィンへ有意には結合しない。いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、有害な免疫応答に関連しない。他の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ抗体である。なお他の態様において、抗ＮＧＦ抗体は、ヒト化されている（本明細書に記載の抗体Ｅ３のような）。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体は、抗体Ｅ３である（本明細書に記載のように）。他の態様において、抗ＮＧＦ抗体は、抗体Ｅ３の１以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５のような、またはいくつかの態様では、Ｅ３由来の全６つのＣＤＲ）を含む。他の態様において、抗体は、ヒト由来である。なお他の態様において、抗ＮＧＦ抗体は、図１Ａに示す重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）と図１Ｂに示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）を含む。なお他の態様において、抗体は、免疫学的に不活性である（例えば、補体仲介性溶解を始動させず、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない）定常領域のような、修飾定常領域を含む。他の態様において、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願番号９８０９９５１．８に記載のように修飾される。
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体
本発明の方法（慢性関節リウマチ疼痛および骨関節炎疼痛に関する）は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を使用するが、これは、受容体結合および／またはＮＧＦへの細胞応答の顕在化のような、ＮＧＦシグナル伝達により仲介される下流経路が含まれるＮＧＦ生物学的活性を阻止、抑圧、または抑制する（有意に、が含まれる）あらゆる抗体分子を意味する。
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、以下の特徴のどの１以上も明示するはずである：（ａ）ＮＧＦへ結合して、ＮＧＦの生物学的活性またはＮＧＦのシグナル伝達機能により仲介される下流経路を阻害する；（ｂ）慢性関節リウマチ疼痛または骨関節炎疼痛のあらゆる側面を予防、改善、または治療する；（ｃ）ＮＧＦ受容体活性化（ＴｒｋＡ受容体二量体化および／または自己リン酸化が含まれる）を阻止するかまたは減少させる；（ｄ）ＮＧＦのクリアランスを高める；（ｅ）ＮＧＦの合成、産生、または放出を阻害（抑制）する。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、当該技術分野で知られていて、例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ０１／７８６９８、ＷＯ０１／６４２４７、米国特許第５，８４４，０９２、５，８７７，０１６、および６，１５３，１８９号；Ｈｏｎｇｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１９：２１５−２２７（２０００）；Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１３：５５９−５６８（１９９３）；ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号：Ｕ３９６０８、Ｕ３９６０９、Ｌ１７０７８、またはＬ１７０７７を参照のこと。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体およびポリペプチドは、ＰＣＴ ＷＯ２００５／０１９２６６にも記載されている。
本発明の目的では、抗体は、ＮＧＦおよび／またはＮＧＦシグナル伝達機能により仲介される下流経路を阻害するやり方でＮＧＦと反応する。いくつかの態様において、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、ヒトＮＧＦを認識する。なお他の態様において、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、ヒトＮＧＦへ特異的に結合する。いくつかの態様において、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、ＮＴ−３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦのような関連のニュートロフィンへ有意には結合しない。なお他の態様において、抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦへ結合して、ＮＧＦのそのＴｒｋＡおよび／またはｐ７５受容体への結合をｉｎ ｖｉｖｏで有効に阻害する、および／またはＮＧＦがそのＴｒｋＡおよび／またはｐ７５受容体を活性化することを有効に阻害することが可能である。なお他の態様において、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体である。なお他の態様において、抗ＮＧＦ抗体は、ヒト化されている（本明細書に記載の抗体Ｅ３のように）。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体は、ヒト由来である。例えば、ＷＯ２００５／０１９２６６を参照のこと。１つの態様において、抗体は、ヒトＮＧＦ上の１以上のエピトープを認識するヒト抗体である。別の態様において、抗体は、ヒトＮＧＦ上の１以上のエピトープを認識するマウスまたはラットの抗体である。別の態様において、抗体は、霊長動物、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシからなる群より選択されるＮＧＦ上の１以上のエピトープを認識する。なおさらなる態様において、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、以下のどの１以上からも選択される抗体と本質的に同じＮＧＦエピトープ６へ結合する：ＭＡｂ９１１、ＭＡｂ９１２、およびＭＡｂ９３８（Ｈｏｎｇｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：２１５−２２７（２０００）を参照のこと）。他の態様において、抗体は、Ｍａｂ９１１と同じエピトープへ結合する。別の態様において、抗体は、免疫学的に不活性である（例えば、補体仲介性溶解を始動させず、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない）定常領域を含む。ＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号に開示される方法を使用して評価可能である。いくつかの態様において、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願番号９８０９９５１．８に記載のように修飾される。
いくつかの態様において、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、抗体「Ｅ３」と呼ばれるヒト化マウス抗ＮＧＦモノクローナル抗体、本明細書に記載のＥ３関連抗体のいずれか、またはＮＧＦアンタゴニストである、そのあらゆる断片である。
本発明に有用な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、等）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含んでなる融合タンパク質、ヒト化抗体、並びに、必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のあらゆる修飾配置を含めてよく、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有修飾抗体が含まれる。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または他のあらゆる起源であってよい（キメラまたはヒト化抗体が含まれる）。
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のＮＧＦ（ｈＮＧＦのような）への結合アフィニティーは、約０．１０〜約０．８０ｎＭ、約０．１５〜約０．７５ｎＭ、および約０．１８〜約０．７２ｎＭである。１つの態様において、結合アフィニティーは、約２ｐＭと２２ｐＭの間である。１つの態様において、結合アフィニティーは、約２３ｐＭと約１００ｐＭの間である。ある態様において、結合アフィニティーは、約１０ｎＭである。他の態様において、結合アフィニティーは、約１０ｎＭ未満である。他の態様において、結合アフィニティーは、約０．１ｎＭまたは約０．０７ｎＭである。他の態様において、結合アフィニティーは、約０．１ｎＭ未満であるかまたは約０．０７ｎＭ未満である。他の態様において、結合アフィニティーは、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれか〜約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかである。いくつかの態様において、結合アフィニティーは、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれかであるか、または約５０ｐＭ未満である。いくつかの態様において、結合アフィニティーは、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれか未満である。なお他の態様において、結合アフィニティーは、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭより大きい。
抗体のＮＧＦへの結合アフィニティーを定量する１つのやり方は、抗体の単機能Ｆａｂ断片のアフィニティーを測定することによる。単機能Ｆａｂ断片を入手するために、抗体（例えば、ＩｇＧ）は、パパインで切断しても、組換え的に発現させてもよい。抗体の抗ＮＧＦ Ｆａｂ断片のアフィニティーは、表面プラズモン共鳴（ＢｌＡｃｏｒｅ３０００ＴＭ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）により定量可能である。ＣＭ５チップは、供給業者の説明書に従って、塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化可能である。ヒトＮＧＦ（または他のあらゆるＮＧＦ）を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）へ希釈して、０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で活性化チップ上へ注入することが可能である。個々のチップチャネルを通過する可変フロー時間を使用して、２つの範囲の抗原密度：詳しい動態試験用の１００〜２００応答単位（ＲＵ）とスクリーニングアッセイ用の５００〜６００ＲＵが達成可能である。チップは、エタノールアミンで阻止可能である。再生試験は、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４、ピアス・バイオテクノロジー、イリノイ州ロックフォード）および４Ｍ ＮａＣｌ（２：１）の混合物が、２００回の注入にわたり、チップ上のｈＮＧＦの活性を維持しながら、結合したＦａｂを効果的に除去することを示した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．１５ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２９）をＢＩＡｃｏｒｅアッセイ用の操作緩衝液として使用する。精製Ｆａｂ試料の系列希釈液（０．１〜１０ｘの推定ＫＤ）を１００μＬ／分で１分間注入して、２時間までの解離時間を可能にする。Ｆａｂタンパク質の濃度を、既知濃度（アミノ酸分析により定量するような）のＦａｂを標準品として使用して、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により定量する。ＢＩＡ評価プログラムを使用して、１：１ラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６．９９−１１０）へデータを適合させることによって、動態会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に入手する。平衡解離定数（ＫＤ）値は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。このプロトコールは、ヒトＮＧＦ、別の脊椎動物（いくつかの態様において、哺乳動物）のＮＧＦ（マウスＮＧＦ、ラットＮＧＦ、霊長動物ＮＧＦのような）が含まれる、あらゆるＮＧＦへの抗体の結合アフィニティーを決定することにおける使用に、並びに、関連のニュートロフィン、ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦといった他のニュートロフィンとの使用に適している。
いくつかの態様において、抗体は、ヒトＮＧＦへ結合して、別の脊椎動物種（ある態様において、哺乳動物）からのＮＧＦへ有意には結合しない。いくつかの態様において、抗体は、ヒトＮＧＦだけでなく、別の脊椎動物種（いくつかの態様において、哺乳動物）からの１以上のＮＧＦへ結合する。なお他の態様において、抗体は、ＮＧＦへ結合して、他のニュートロフィン（関連のニュートロフィン、ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦのような）と有意には交差反応しない。いくつかの態様において、抗体は、ＮＧＦだけでなく、少なくとも１つの他のニュートロフィンへ結合する。いくつかの態様において、抗体は、ウマまたはイヌのような哺乳動物種のＮＧＦへ結合するが、別の哺乳動物種からのＮＧＦへ有意には結合しない。
エピトープは、連続性または不連続性であってよい。１つの態様において、抗体は、Ｈｏｎｇｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１９：２１５−２２７（２０００）に記載のＭＡｂ９１１、ＭＡｂ９１２、およびＭＡｂ９３８からなる群より選択される抗体と本質的に同じｈＮＧＦへ結合する。別の態様において、抗体は、ＭＡｂ９１１と本質的に同じｈＮＧＦエピトープへ結合する。なお別の態様において、抗体は、ＭＡｂ９０９と本質的に同じエピトープへ結合する。Ｈｏｎｇｏら，同上。例えば、エピトープは、以下の１以上を含んでよい：ｈＮＧＦの可変領域１（アミノ酸２３〜３５）内の残基Ｋ３２、Ｋ３４、およびＥ３５；ｈＮＧＦの可変領域４（アミノ酸８１〜８８）内の残基Ｆ７９およびＴ８１；可変領域４内の残基Ｈ８４およびＫ８８；ｈＮＧＦの可変領域５（アミノ酸９４〜９８）とｈＮＧＦのＣ末端（アミノ酸１１１〜１１８）の間の残基Ｒ１０３；ｈＮＧＦのプレ可変領域１（アミノ酸１０〜２３）内の残基Ｅ１１；ｈＮＧＦの可変領域２（アミノ酸４０〜４９）とｈＮＧＦの可変領域３（アミノ酸５９〜６６）の間のＹ５２；ｈＮＧＦのＣ末端内の残基Ｌ１１２およびＳ１１３；ｈＮＧＦの可変領域３内の残基Ｒ５９およびＲ６９；または、ｈＮＧＦのプレ可変領域１内の残基Ｖ１８、Ｖ２０、およびＧ２３。さらに、エピトープは、ｈＮＧＦの可変領域１、可変領域３、可変領域４、可変領域５、Ｎ末端領域、および／またはＣ末端の１以上を含むことができる。なお別の態様において、抗体は、ｈＮＧＦの残基Ｒ１０３の溶媒接近可能性を有意に抑制する。上記に記載のエピトープはヒトＮＧＦに関連するが、当業者は、ヒトＮＧＦの構造を他の種のＮＧＦと並置させて、これらエピトープへの可能な相対物を同定することが可能であると理解される。
１つの側面において、ＮＧＦを阻害可能である抗体（例、ヒト、ヒト化、マウス、キメラ）は、ＮＧＦの完全長または部分配列を発現させる免疫原を使用することによって作製可能である。別の側面では、ＮＧＦを過剰発現する細胞を含んでなる免疫原が使用可能である。使用可能である免疫原の別の例は、完全長のＮＧＦを含有するＮＧＦタンパク質またはそのＮＧＦタンパク質の一部である。
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、当該技術分野で知られたどの方法によっても作製可能である。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、本明細書にさらに記載されるように、抗体の刺激および産生について確立された慣用技術に概して従う。ヒトおよびマウスの抗体の産生の一般技術は、当該技術分野で知られて、本明細書に記載されている。
ヒトまたはそれからの抗体産生細胞が含まれるどの哺乳動物被検者も、ヒトが含まれる哺乳動物のハイブリドーマ細胞系の産生の基礎として役立つように操作可能である。典型的には、宿主動物に、本明細書に記載のものが含まれる免疫原のある量を腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および／または皮内に接種する。
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．とＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用するかまたはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ，１８：３７７−３８１（１９８２）により改良されるようにして、リンパ球と不死化骨髄腫細胞より調製可能である。限定されないがＸ６３−Ａｇ８．６５３が含まれる利用可能な骨髄腫細胞系と、サーク研究所、細胞分配センター（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）、カリフォルニア州サンディエゴ、アメリカからのそれがハイブリダイゼーションに使用可能である。一般に、この技術は、ポリエチレングリコールのような融合剤（ｆｕｓｏｇｅｎ）を使用するか、または当業者によく知られた電気的手段によって骨髄腫細胞とリンパ様細胞を融合することに関連する。融合の後で、細胞を融合培地より分離して、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地のような選択増殖培地で増殖させて、非ハイブリダイズの親細胞を一掃する。血清を補充するかまたは補充しない、本明細書に記載するどの培地も、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するのに使用可能である。細胞融合技術に代わる別の選択肢として、本発明の抗ＮＧＦモノクローナル抗体を産生するために、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞が使用可能である。ハイブリドーマは、望まれるならば、拡張およびサブクローニングして、上清について、慣用のイムノアッセイ手法（例、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）により抗免疫原活性を検定する。
抗体の供給源として使用可能であるハイブリドーマには、すべての誘導体、ＮＧＦに特異的なモノクローナル抗体を産生する元のハイブリドーマの子孫細胞、またはその一部が含まれる。
そのような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の手順を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖可能である。モノクローナル抗体は、望まれるならば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過のような慣用の免疫グロブリン精製手法により、培養基または体液より単離可能である。望まれない活性が存在すれば、例えば、固相に付着した免疫原から構成される吸着剤上に調製物を泳動させて、望みの抗体を免疫原より溶出または放出させることによって、除去可能である。ヒトＮＧＦ、または、免疫化される動物種において免疫原性となるタンパク質（例えば、アオガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤）へ二機能性または誘導化剤（例、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここでＲとＲ１は、異なるアルキル基である））を使用してコンジュゲートした標的アミノ酸配列を含有する断片での宿主動物の免疫化により、抗体の集団（例、モノクローナル抗体）が産生可能である。
望まれるならば、目的の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）は配列決定可能であり、次いでこのポリヌクレオチド配列は、発現または増殖のためにベクターへクローニング可能である。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクターにおいて維持可能であり、次いで宿主細胞は、将来の使用のために拡張および凍結可能である。１つの選択肢において、ポリヌクレオチド配列は、抗体を「ヒト化する」かまたは抗体のアフィニティーや他の特性を改善するための遺伝子操作に使用可能である。例えば、定常領域は、その抗体をヒトでの臨床治験や治療に使用するならば、免疫応答を回避するためにヒトの定常領域により似せるように工学処理可能である。ＮＧＦへのより大きなアフィニティーとＮＧＦを阻害するより大きな効力を得るように、抗体配列を遺伝子操作することが望まれる場合がある。当業者には、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体へ１以上のポリヌクレオチドの変化を施して、それでもＮＧＦへのその結合活性を維持可能であることが明らかであろう。
モノクローナル抗体をヒト化するには、４つの一般的な工程がある。これらは：（１）出発の抗体軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドと予測アミノ酸配列を決定する工程（２）ヒト化抗体を設計する工程（即ち、ヒト化プロセスの間にどの抗体フレームワーク領域を使用すべきかを決定すること）（３）実際のヒト化の方法論／技術、および（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７；５，８０７，７１５；５，８６６，６９２；６，３３１，４１５；５，５３０，１０１；５，６９３，７６１；５，６９３，７６２；５，５８５，０８９；および６，１８０，３７０号を参照のこと。
齧歯動物または修飾齧歯動物のＶ領域とその関連した相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト定常ドメインへ融合したキメラ抗体が含まれる、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含んでなるいくつかの「ヒト化」抗体分子が記載されている。例えば，Ｗｉｎｔｅｒら．Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９（１９９１）、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４２２０−４２２４（１９８９）、Ｓｈａｗら．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７）、およびＢｒｏｗｎら．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３（１９８７）を参照のこと。他の参考文献は、適正なヒト抗体定常領域との融合に先立ってヒトの支持フレームワーク領域（ＦＲ）へ移植した齧歯動物ＣＤＲについて記載する。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら．Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、およびＪｏｎｅｓら．Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）を参照のこと。別の参考文献は、組換え的に補強した（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）齧歯動物フレームワーク領域により支持される齧歯動物ＣＤＲについて記載する。例えば、ヨーロッパ特許公開公報番号０５１９５９６を参照のこと。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療応用の期間および有効性を制限する、齧歯動物の抗ヒト抗体分子に対する望まれない免疫学的応答を最小化するように設計される。例えば、抗体定常領域は、それが免疫学的に不活性である（例えば、補体溶解を始動させない）ように工学処理可能である。例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；英国特許出願番号９８０９９５１．８を参照のこと。利用可能でもある抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２４７１−２４７６（１９９１）および、米国特許第６，１８０，３７７；６，０５４，２９７；５，９９７，８６７；５，８６６，６９２；６，２１０，６７１；および６，３５０，８６１号；並びにＰＣＴ公開公報番号ＷＯ０１／２７１６０により開示されている。
なお別の選択肢において、完全にヒトの抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように工学処理された市販のマウスを使用することによって入手可能である。より望ましい（例、完全にヒトの抗体）、またはより大きな免疫応答を産生するように設計されたトランスジェニック動物も、ヒト化またはヒトの抗体の産生に使用可能である。そのような技術の例は、アブジェニクス社（カリフォルニア州フレモント）からのＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭとメダレクス社（ニュージャージー州プリンストン）からのＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ ＭｏｕｓｅＴＭである。
１つの選択肢において、抗体は、当該技術分野で知られたどの方法を使用して組換え的に作製して発現させてもよい。別の選択肢において、抗体は、ファージディスプレイ技術によって組換え的に作製可能である。例えば、米国特許第５，５６５，３３２；５，５８０，７１７；５，７３３，７４３；および６，２６５，１５０号と、Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）を参照のこと。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０））を使用して、非免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーより、ヒト抗体と抗体断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生することができる。この技術によれば、Ｍ１３またはｆｄのような繊維状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーのいずれかのコートタンパク質遺伝子へ抗体Ｖドメイン遺伝子をインフレームでクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能性の抗体断片として表出させる。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能特性に基づいた選択は、この特性を明示する抗体をコードする遺伝子の選択ももたらす。このように、このファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、多様なフォーマットで実施可能である。概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．とＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ遺伝子切片のいくつかの供給源がファージディスプレイに使用可能である。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーより抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーが構築可能であり、多様な抗原（自己抗原が含まれる）のアレイへの抗体が本質的にＭａｒｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈら，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）により記載される技術に従って単離可能である。天然の免疫応答において、抗体遺伝子は、突然変異を高い割合で蓄積している（体細胞の超突然変異）。導入される変化の中には、より高いアフィニティーを付与するものがあり、高アフィニティーの表面免疫グロブリンを表示するＢ細胞が選好的に複製されて、後続の抗原チャレンジの間に差別化される。この天然のプロセスは、「鎖シャフリング」として知られる技術を利用することによって模倣可能である。Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３（１９９２））。この方法では、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を、免疫化ドナーより入手したＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体（レパートリー）のレパートリーで連続的に置き換えることによって、ファージディスプレイにより得られる「一次」ヒト抗体のアフィニティーを改善可能である。この技術は、ｐＭ〜ｎＭ範囲のアフィニティーの抗体および抗体断片の産生を可能にする。ごく大きなファージ抗体レパートリー（「万物の母のライブラリー」としても知られる）を作製するための戦略がＷａｔｅｒｈｏｕｓｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載された。遺伝子シャフリングはまた、齧歯動物抗体よりヒト抗体を誘導するため使用可能であり、ここでヒト抗体は、出発の齧歯動物抗体に類似したアフィニティーおよび特異性を有する。「エピトープ刻印」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術により得られる齧歯動物抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えて、齧歯動物−ヒトキメラを創出する。抗原での選択により、機能的な抗原結合部位を回復することが可能なヒト可変領域の単離がもたらされ、即ち、このエピトープがパートナーの選択を支配する（刻印する）。残る齧歯動物Ｖドメインを置き換えるためにこの方法を繰り返して、ヒト抗体を入手する（ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９３／０６２１３（１９９３年４月１日公開）を参照のこと）。齧歯動物抗体のＣＤＲ移植によるこれまでのヒト化と違って、この技術は、齧歯動物起源のフレームワークもＣＤＲ残基も有さない、完全にヒトの抗体を提供する。
上記の考察はヒト化抗体に関するものであるが、ここで考察した一般原理は、例えば、イヌ、ネコ、霊長動物、ウマ、およびウシにおける使用に抗体をカスタマイズすることへ適用可能であることは明らかである。さらに、本明細書に記載の抗体をヒト化することの１以上の側面を、例えばＣＤＲ移植、フレームワーク突然変異、ＣＤＲ突然変異と組合せ可能であることが明らかである。
抗体は、はじめに抗体と抗体産生細胞を宿主動物より単離すること、この遺伝子配列を入手すること、およびこの遺伝子配列を使用して宿主細胞（例、ＣＨＯ細胞）において抗体を組換え的に発現させることによって組換え的に作製可能である。利用可能である別の方法は、抗体配列を植物（例、タバコ）またはトランスジェニック・ミルクにおいて発現させることである。抗体を植物またはミルクにおいて組換え的に発現させる方法が開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら．Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２７５６（２００１）；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５（１９９５）；および、Ｐｏｌｌｏｃｋら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７（１９９９）を参照のこと。抗体の誘導体、例えば、ヒト化、単鎖、等を作製する方法は、当該技術分野で知られている。
ＮＧＦに特異的である抗体を単離するために、イムノアッセイと蛍光励起細胞分取法（ＦＡＣＳ）のようなフローサイトメトリー分取技術も利用可能である。
抗体は、多くの異なる担体へ結合可能である。担体は、活性および／または不活性であり得る。よく知られた担体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、本発明の目的のために、可溶性でも不溶性でもよい。当業者は、抗体を結合することに適した他の担体について知るか、または定型的な実験を使用して、そのことを確かめることができよう。いくつかの態様において、担体は、心筋を標的とする部分を含む。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子へ特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離して配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ひとたび単離したならば、ＤＮＡは、発現ベクター（ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８７／０４４６２に開示される発現ベクターのような）へ入れることが可能であり、次いでこれを、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような、他のやり方では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へトランスフェクトして、モノクローナル抗体の合成をこの組換え宿主細胞において得る。例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８７／０４４６２を参照のこと。ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を代用することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列へ非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有連結することによって修飾可能である。そのやり方で、本明細書の抗ＮＧＦモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を製造する。
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、当該技術分野でよく知られた方法を使用して特性決定可能である。例えば、１つの方法は、それが結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。当該技術分野では、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングして特性決定するための多くの方法が知られていて、例えば、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ「抗体を使用すること：実験マニュアル（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」コールドスプリングハーバーラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９９）の第１１章に記載されるように、抗体−抗原複合体の結晶構造を解明すること、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドをベースとするアッセイが含まれる。追加の例において、エピトープマッピングは、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が結合する配列を決定するために使用可能である。エピトープマッピングは、様々な供給元、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５，８２１９ ＰＨ Ｌｅｌｙｓｔａｄ，オランダ）より市販されている。エピトープは、線状エピトープ（即ち、アミノ酸の単一ストレッチに含まれる）、または必ずしも単一ストレッチに含まれなくてもよいアミノ酸の三次元的な相互作用により形成されるコンホメーションエピトープであり得る。多様な長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）のペプチドが単離または合成（例えば、組換え的に）可能であり、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体との結合アッセイに使用可能である。別の例において、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が結合するエピトープは、ＮＧＦ配列に由来する重なりペプチドを使用して、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体による結合を決定することによる体系的なスクリーニングにおいて決定可能である。遺伝子断片発現アッセイによれば、ＮＧＦをコードするオープンリーディングフレームを無作為に、または特定遺伝子構築により断片化して、発現されるＮＧＦの断片の試験すべき抗体との反応性を決定する。この遺伝子断片は、例えば、ＰＣＲにより産生可能であり、次いで、転写して、放射活性アミノ酸の存在下にｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質へ翻訳可能である。次いで、放射活性標識したＮＧＦ断片への抗体の結合を免疫沈降とゲル電気泳動により決定する。ある種のエピトープはまた、ファージ粒子（ファージライブラリー）の表面に表示されるランダムペプチド配列の大きなライブラリーを使用することによって同定可能である。あるいは、重なるペプチド断片の一定のライブラリーについて、試験抗体への結合性を簡単な結合アッセイにおいて試験することができる。追加の例では、エピトープ結合に必要とされる、十分な、および／または必要な残基を同定するために、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメインスワッピング実験、およびアラニンスキャニング突然変異誘発が実施可能である。例えば、ドメインスワッピング実験は、ＮＧＦポリペプチドの様々な断片が、ごく近縁ではあるが抗原的には異なるタンパク質（ニュートロフィンタンパク質ファミリーの別のメンバーのような）からの配列で置き換えられた（スワップされた）突然変異体ＮＧＦを使用して実施可能である。抗体の突然変異体ＮＧＦへの結合を評価することによって、特別なＮＧＦ断片の抗体結合に対する重要性を評価可能である。
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を特性決定するために使用可能であるなお別の方法は、同じ抗原（即ち、ＮＧＦの様々な断片）へ結合することが知られている他の抗体との競合アッセイを使用して、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が他の抗体と同じエピトープへ結合するかどうかを決定することである。競合アッセイは、当業者によく知られている。本発明の競合アッセイにおいて使用可能である抗体の例には、Ｈｏｎｇｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：２１５−２２７（２０００）に記載のような、ＭＡｂ９１１、９１２、９３８が含まれる。
発現ベクターを使用して、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の発現を指令することができる。当業者は、外因性タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現を得るための発現ベクターの投与に馴染みがある。例えば、米国特許第６，４３６，９０８；６，４１３，９４２；および６，３７６，４７１号を参照のこと。発現ベクターの投与には、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与が含まれる局部または全身投与と、局所投与が含まれる。別の態様において、発現ベクターは、交感神経幹または神経節へ、または冠動脈、心房、心室、または心膜中へ直接投与される。
発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療組成物の標的指向送達も使用可能である。受容体仲介性のＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら，「遺伝子治療薬：直接的な遺伝子移入の方法および応用（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ監修）（１９９４）；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療組成物は、遺伝子治療プロトコールにおける局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与する。遺伝子治療プロトコールの間は、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲も使用可能である。本治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達担体を使用して送達可能である。遺伝子送達担体は、ウイルス起源でも非ウイルス起源でもよい（一般的には、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照のこと）。そのようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物または異種プロモーターを使用して誘導可能である。コード配列の発現は、構成的でも、調節的でもよい。
望まれるポリヌクレオチドの送達と望まれる細胞での発現のためのウイルスベースのベクターは、当該技術分野でよく知られている。例示のウイルスベースの担体には、限定されないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；ＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５，２１９，７４０；４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；およびＥＰ特許第０ ３４５ ２４２号を参照のこと）、α−ウイルスベースのベクター（例、シンドビス・ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバー・ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照のこと）が含まれる。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載の死滅アデノウイルスへ連結したＤＮＡの投与も利用可能である。
非ウイルス性送達の担体および方法も利用可能であり、限定されないが、死滅アデノウイルス単独へ連結または非連結のポリカチオン濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照のこと）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照のこと）；真核細胞送達担体細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９５／０７９９４；ＷＯ９６／１７０７２；ＷＯ９５／３０７６３；およびＷＯ９７／４２３３８を参照のこと）、および核酸電荷の中和、または細胞膜との融合が含まれる。裸のＤＮＡも利用可能である。例示の裸ＤＮＡ導入法がＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達担体として作用し得るリポソームが米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；およびＥＰ特許第０５２４９６８号に記載されている。追加のアプローチがＰｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１とＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載されている。
他のＮＧＦアンタゴニスト
抗ＮＧＦ抗体以外のＮＧＦアンタゴニストを（慢性関節リウマチ疼痛および骨関節炎疼痛に関して）使用可能である。本発明のいくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、機能性ＮＧＦの発現を阻止するかまたは減少させることが可能な少なくとも１つのアンチセンス分子を含む。ＮＧＦのヌクレオチド配列は知られていて、公的に利用可能なデータベースより容易に利用可能である。例えば、Ｂｏｒｓａｎｉら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８，４０２０；受入れ番号ＮＭ００２５０６；Ｕｌｌｒｉｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ ３０３：８２１−８２５（１９８３）を参照のこと。他のポリヌクレオチドと交差反応せずにＮＧＦ ｍＲＮＡへ特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を製造することは、定型的である。例示の標的指向部位には、限定されないが、開始コドン、５’調節領域、コード配列、および３’非翻訳領域が含まれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが約１０〜１００ヌクレオチド、長さが約１５〜５０ヌクレオチド、長さが約１８〜２５ヌクレオチド、またはそれより多い。オリゴヌクレオチドは、例えば、当該技術分野でよく知られるホスホロチオエート連結、および２’−Ｏ糖修飾のような骨格修飾を含んでよい。例示のアンチセンス分子には、米国公開公報番号２００１００４６９５９に記載のＮＧＦアンチセンス分子が含まれる；
1197346462281_0.htm
も参照のこと。
他の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、機能性ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡおよび／またはｐ７５のような）の発現を阻止するかまたは減少させることが可能な少なくとも１つのアンチセンス分子を含む。Ｗｏｏｌｆら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１（３）：１０４７−５５；Ｔａｇｌｉａｌｅｔｅｌａら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９６）６６（５）：１８２６−３５。ＴｒｋＡおよびｐ７５のヌクレオチド配列は知られていて、公的に利用可能なデータベースより容易に利用可能である。
あるいは、ＮＧＦの発現および／または放出、および／またはＮＧＦ受容体の発現は、遺伝子ノックダウン、モルホリノオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、またはリボザイムといった、当該技術分野でよく知られた方法を使用して減少可能である。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃａｌｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／〜ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ／ＲＮＡｉ．ｈｔｍｌ；
ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂ３２．ｅｚｂｏａｒｄ．ｃｏｍ／ｆｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓｆｒｍ１９．ｓｈｏｗＭｅｓｓａｇｅ？ｔｏｐｉｃＩＤ＝６．ｔｏｐｉｃ；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｇｈｖｅｌｄ．ｃｏｍ／ｒｉｂｏｚｙｍｅ．ｈｔｍｌを参照のこと。
他の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、少なくとも１つのＮＧＦ阻害性化合物を含む。本明細書に使用するように、「ＮＧＦ阻害性化合物」は、抗ＮＧＦ抗体以外に、ＮＧＦ生物学的活性を直接的または間接的に抑制、阻害、中和、または消失させる化合物を意味する。ＮＧＦ阻害性化合物は、以下の特徴のどの１以上も明示するはずである：（ａ）ＮＧＦへ結合して、ＮＧＦの生物学的活性またはＮＧＦのシグナル伝達機能により仲介される下流経路を阻害する；（ｂ）疼痛（骨関節炎疼痛のような）のあらゆる側面を予防、改善、または治療する；（ｃ）ＮＧＦ受容体活性化（ＴｒｋＡ受容体二量体化および／または自己リン酸化が含まれる）を阻止するかまたは減少させる；（ｄ）ＮＧＦのクリアランスを高める；（ｅ）ＮＧＦの合成、産生、または放出を阻害（抑制）する。例示のＮＧＦ阻害性化合物には、米国公開公報番号２００１００４６９５９に記載される低分子ＮＧＦ阻害剤；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ００／６９８２９に記載されるような、ＮＧＦのｐ７５への結合を阻害する化合物、およびＣｏｌｑｕｈｏｕｎら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３１０（２）：５０５−１１（２００４）により記載されるＰＤ９０７８０：［７−（ベンゾリルアミノ）−４，９−ジヒドロ−４−メチル−９−オキソ−ピラゾロ［５，１−ｂ］キナゾリン−２−カルボン酸］；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９８／１７２７８に記載されるような、ＮＧＦのＴｒｋＡおよび／またはｐ７５への結合を阻害する化合物が含まれる。ＮＧＦ阻害性化合物の追加例には、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ０２／１７９１４およびＷＯ０２／２０４７９と米国特許第５，３４２，９４２；６，１２７，４０１；および６，３５９，１３０号に記載される化合物が含まれる。さらなる例示のＮＧＦ阻害性化合物は、ＮＧＦの競合阻害剤である化合物である。米国特許第６，２９１，２４７号を参照のこと。さらに、当業者は、他の低分子ＮＧＦ阻害性化合物を製造可能である。
いくつかの態様において、ＮＧＦ阻害性化合物は、ＮＧＦへ結合する。例示の標的指向（結合）部位には、限定されないが、ＴｒｋＡ受容体および／またはｐ７５受容体へ結合するＮＧＦの部分と、受容体結合領域に隣接して、受容体結合部分の正確な三次元形状に一部責任があるＮＧＦの部分が含まれる。別の態様において、ＮＧＦ阻害性化合物は、ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡおよび／またはｐ７５のような）へ結合して、ＮＧＦ生物学的活性を阻害する。例示の標的指向部位には、ＮＧＦへ結合するＴｒｋＡおよび／またはｐ７５の部分が含まれる。
低分子を含んでなる態様において、低分子は、約１００〜２０，０００ダルトン、５００〜１５，０００ダルトン、または１０００〜１０，０００ダルトンのいずれの分子量も有してよい。低分子のライブラリーは、市販されている。低分子は、吸入、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、鞘内、心室内、経口、腸内、腸管外、鼻腔内、または皮内が含まれる、当該技術分野で知られたどの手段を使用しても投与可能である。一般に、本発明によるＮＧＦアンタゴニストが低分子である場合、それは、患者の体重ｋｇにつき０．１〜３００ｍｇの割合で１〜３回以上の用量へ分割して投与される。標準体重の成人患者では、投薬につき１ｍｇ〜５ｇに及ぶ用量が投与可能である。
他の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、少なくとも１つのＮＧＦ構造類似体を含む。本発明における「ＮＧＦ構造類似体」は、ＮＧＦの構造の一部に類似した３次元構造を有して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの生理学的条件の下でＮＧＦ受容体へ結合する化合物を意味し、ここでその結合は、ＮＧＦの生物学的活性を少なくとも一部阻害する。１つの態様において、ＮＧＦ構造類似体は、ＴｒｋＡおよび／またはｐ７５受容体へ結合する。例示のＮＧＦ構造類似体には、限定されないが、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９７／１５５９３に記載される二環系ペプチド；米国特許第６，２９１，２４７号に記載される二環系ペプチド；米国特許第６，０１７，８７８号に記載される環式化合物；および、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８９／０９２２５に記載されるＮＧＦ由来ペプチドが含まれる。好適なＮＧＦ構造類似体はまた、例えばＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９８／０６０４８に記載の方法によって、ＮＧＦ−受容体結合の分子モデリングを通して設計および合成可能である。ＮＧＦ構造類似体は、改善されたアフィニティーおよび生物学的効果を得るために、同じまたは異なる構造のあらゆる望みの組合せにおいて、単量体または二量体／オリゴマーであってよい。
他の態様において、本発明は、ＴｒｋＡ受容体および／またはｐ７５受容体の少なくとも１つの優性ネガティブ突然変異体を含んでなるＮＧＦアンタゴニストを提供する。当業者は、例えば、ＴｒｋＡ受容体がＮＧＦへ結合して、それによりＮＧＦを捕捉する「シンク（ｓｉｎｋ）」として作用するように、その受容体の優性ネガティブ突然変異体を製造可能である。しかしながら、優性ネガティブ突然変異体は、ＮＧＦへ結合するときに、ＴｒｋＡ受容体の正常な生物活性を有さないものである。例示の優性ネガティブ突然変異体には、限定されないが、以下の参考文献に記載される突然変異体が含まれる：Ｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９８，９５，１０８８４；Ｅｉｄｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９６，１６，３１２３；Ｌｉｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９７，１７，８７４９；Ｋｌｅｉｎら，Ｃｅｌｌ １９９０，６１，６４７；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，Ｎｅｕｒｏｎ １９９３，１０，９６３；Ｔｓｏｕｌｆａｓら，Ｎｅｕｒｏｎ １９９３，１０，９７５；およびＬａｍｂａｌｌｅら，ＥＭＢＯＪ．１９９３，１２，３０８３（このいずれも全体が参照により本明細書に組み込まれる）。優性ネガティブ突然変異体は、タンパク質の形態でも、優性ネガティブ突然変異体（例、突然変異体ＴｒｋＡ受容体）がｉｎ ｖｉｖｏで発現されるような発現ベクターの形態でも投与可能である。このタンパク質または発現ベクターは、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、鞘内、心室内、経口、腸内、腸管外、鼻腔内、皮内、または吸入によるような、当該技術分野で知られたどの手段によっても投与可能である。例えば、発現ベクターの投与には、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与が含まれる局部または全身投与と、局所投与が含まれる。当業者は、外因性タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現を入手するための発現ベクターの投与に馴染みがある。例えば、米国特許第６，４３６，９０８；６，４１３，９４２；および６，３７６，４７１号を参照のこと。
アンチセンスポリヌクレオチド、発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療組成物の標的指向送達も使用可能である。受容体仲介性のＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら，「遺伝子治療薬：直接的な遺伝子移入の方法および応用（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ監修）（１９９４）；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療組成物は、遺伝子治療プロトコールにおける局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与する。いくつかの態様では、遺伝子治療プロトコールの間に、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇ、またはより多いＤＮＡの濃度範囲も使用可能である。本発明の治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達担体を使用して送達可能である。遺伝子送達担体は、ウイルス起源でも非ウイルス起源でもよい（一般的には、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照のこと）。そのようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物または異種プロモーターおよび／またはエンハンサーを使用して誘導可能である。コード配列の発現は、構成的でも、調節的でもよい。
望まれるポリヌクレオチドの送達と望まれる細胞での発現のためのウイルスベースのベクターは、当該技術分野でよく知られている。例示のウイルスベースの担体には、限定されないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；ＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５，２１９，７４０；４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；およびＥＰ特許第０ ３４５ ２４２号を参照のこと）、α−ウイルスベースのベクター（例、シンドビス・ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバー・ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照のこと）が含まれる。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載の死滅アデノウイルスへ連結したＤＮＡの投与も利用可能である。
非ウイルス性送達の担体および方法も利用可能であり、限定されないが、死滅アデノウイルス単独へ連結または非連結のポリカチオン濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照のこと）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照のこと）；真核細胞送達担体細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９５／０７９９４；ＷＯ９６／１７０７２；ＷＯ９５／３０７６３；およびＷＯ９７／４２３３８を参照のこと）、および核酸電荷の中和、または細胞膜との融合が含まれる。裸のＤＮＡも利用可能である。例示の裸ＤＮＡ導入法がＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達担体として作用し得るリポソームが米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；およびＥＰ特許第０５２４９６８号に記載されている。追加のアプローチがＰｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１とＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載されている。
発現ベクターが本明細書に記載のタンパク質ベースのＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦ抗体、ＴｒｋＡイムノアドへシン、等）のいずれの発現を指令するために使用可能であることも明らかである。例えば、ＮＧＦおよび／またはＮＧＦ生物学的活性を阻止する（一部〜完全な阻止）ことが可能である他のＴｒｋＡ受容体断片も当該技術分野で知られている。
別の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、少なくとも１つのＴｒｋＡイムノアドへシンを含む。本明細書に使用するＴｒｋＡイムノアドへシンは、ＴｒｋＡ受容体の細胞外ドメインと、ＴｒｋＡ受容体の結合特異性を保持して（ＴｒｋＡ受容体の結合特異性を実質的に保持して）、ＮＧＦへ結合することが可能である免疫グロブリン配列を含んでなる可溶性キメラ分子を意味する。
ＴｒｋＡイムノアドへシンは当該技術分野で知られていて、ＮＧＦのＴｒｋＡ受容体への結合を阻止することが見出された。例えば、米国特許第６，１５３，１８９号を参照のこと。Ｂｒｅｎｎａｎら．は、術後疼痛のラットモデルにおけるＴｒｋＡイムノアドへシンの投与について報告する。Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ２４（１−２）８８０（１９９８）を参照のこと。１つの態様において、ＴｒｋＡイムノアドへシンは、ＮＧＦへ結合することが可能なＴｒｋＡ細胞外ドメインからのＴｒｋＡ受容体アミノ酸配列（またはその部分）（いくつかの態様では、ＴｒｋＡ受容体の結合特異性を実質的に保持するアミノ酸配列）と免疫グロブリン配列の融合を含む。いくつかの態様において、ＴｒｋＡ受容体は、ヒトＴｒｋＡ受容体配列であり、融合は、免疫グロブリン定常ドメイン配列とのものである。他の態様において、免疫グロブリン定常ドメイン配列は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列である。他の態様において、２つのＴｒｋＡ受容体−免疫グロブリン重鎖融合物の会合（例えば，ジスルフィド結合による共有連結を介した）は、ホモ二量体の免疫グロブリン様構造をもたらす。免疫グロブリン軽鎖は、ジスルフィド結合二量体のＴｒｋＡ受容体−免疫グロブリンキメラの一方または両方とさらに会合可能であり、ホモ三量体またはホモ四量体の構造をもたらす。好適なＴｒｋＡイムノアドへシンの例には、米国特許第６，１５３，１８９号に記載のものが含まれる。
別の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦのＴｒｋＡ受容体との物理的な相互作用および／または下流のシグナル伝達を阻止、抑圧、改変、および／または抑制することによってＮＧＦ生物学的活性を抑制および／または阻止することが可能な少なくとも１つの抗ＴｒｋＡ抗体を含む。抗ＴｒｋＡ抗体は、当該技術分野で知られている。例示の抗ＴｒｋＡ抗体には、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９７／２１７３２、ＷＯ００／７３３４４、ＷＯ０２／１５９２４、および米国公開公報番号２００１００４６９５９に記載されるものが含まれる。
別の態様において，ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦのｐ７５受容体との物理的な相互作用および／または下流のシグナル伝達を阻止、抑圧、および／または抑制することによってＮＧＦ生物学的活性を抑制および／または阻止することが可能な少なくとも１つの抗ｐ７５抗体を含む。
別の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＴｒｋＡおよび／またはｐ７５受容体活性と関連した下流のキナーゼシグナル伝達を阻害することが可能な少なくとも１つのキナーゼ阻害剤を含む。例示のキナーゼ阻害剤は、Ｋ２５２ａまたはＫ２５２ｂであり、これは、当該技術分野で知られていて、Ｋｎｕｓｅｌら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５９：７１５−７２２（１９９２）；Ｋｎｕｓｅｌら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５７：９５５−９６２（１９９１）；Ｋｏｉｚｕｍｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：７１５−７２１（１９８８）；Ｈｉｒａｔａら，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ １１１：７２８，ＸＰ００２０４１３５（抄録と化学物質インデックス集成、第１２版［１２ｔｈ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｉｎｄｅｘ］３４２３７頁、ｃ．３（５−７），５５−６０，６６−６９），３４２３８頁、ｃ．１（４１−４４），ｃ．２（２５−２７，３２−３３）、３４２３頁、ｃ．３（４８−５０，５２−５３）を参照のこと）；および米国特許第６，３０６，８４９号に記載されている。
今後、臨床医が探究すれば、いくつかの他のカテゴリーのＮＧＦアンタゴニストが同定されると予測される。
ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の同定
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が含まれるＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦ生物学的活性の抑制、改善、または中和を検出および／または測定する当該技術分野で知られた方法を使用して同定または特性決定可能である。ＰＣＴ ＷＯ０４／０６５５６０に記載される方法が使用可能である。別の方法、例えば、米国特許第５，７６６，８６３および５，８９１，６５０号に記載のキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイは、抗ＮＧＦ剤を同定するために使用可能である。このＥＬＩＳＡタイプのアッセイは、受容体タンパク質チロシンキナーゼ（以下「ｒＰＴＫ」）、例えばＴｒｋＡ受容体のキナーゼドメインの自己リン酸化を測定することによるキナーゼ活性化の定性的または定量的な測定、並びに選択されるｒＰＴＫ（例、ＴｒｋＡ）の潜在的なアンタゴニストの同定および特性決定に適している。このアッセイの第一段階は、キナーゼ受容体、例えば、ＴｒｋＡ受容体（ここでこの受容体は、真核細胞の細胞膜に存在する）のキナーゼドメインのリン酸化に関連する。受容体は、内因性の受容体であっても、この受容体をコードする核酸または受容体構築体を細胞中へ形質転換してもよい。典型的には、第一の固相（例、第一アッセイプレートのウェル）をそのような細胞（通常は、哺乳動物細胞系）の実質的に均質な集団でコートして、その細胞を固相へ付着させる。しばしば、細胞は付着性であり、それにより第一の固相へ自然に付着する。「受容体構築体」を使用するならば、それは通常、キナーゼ受容体とフラッグポリペプチドの融合を含む。フラッグポリペプチドは、アッセイのＥＬＩＳＡ部分において、捕捉剤、しばしば捕捉抗体により認識される。次いで、付着細胞を有するウェルへ、候補ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が含まれる）のような分析物をＮＧＦと一緒に加えて、チロシンキナーゼ受容体（例、ＴｒｋＡ受容体）がＮＧＦと分析物へ曝露される（またはそれと接触させる）ようにする。このアッセイは、そのリガンド、ＮＧＦによるＴｒｋＡの活性化を阻害するアンタゴニスト（抗体が含まれる）の同定を可能にする。ＮＧＦと分析物への曝露に続いて、溶解緩衝液（その中に可溶化洗浄剤を有する）と穏やかな撹拌を使用して付着細胞を可溶化して、それにより細胞溶解液を放出させて、これは、細胞溶解液の濃縮または清浄化の必要なく、アッセイのＥＬＩＳＡ部分へ直接処すことができる。
次いで、このように調製した細胞溶解液は、アッセイのＥＬＩＳＡ段階へ処す準備ができている。ＥＬＩＳＡ段階における第一工程として、第二の固相（通常は、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル）を、チロシンキナーゼ受容体または（受容体構築体の場合は）フラッグポリペプチドへ特異的に結合する捕捉剤（しばしば、捕捉抗体）でコートする。第二の固相のコーティングは、捕捉剤が第二の固相へ付着するように行う。捕捉剤は概してモノクローナル抗体であるが、本明細書の実施例に記載されるように、ポリクローナル抗体も使用可能である。次いで、入手した細胞溶解液を付着した捕捉剤へ曝露するかまたはそれと接触させて、受容体または受容体構築体が第二の固相へ付着する（またはその中に捕捉される）ようにする。次いで、洗浄工程を行って、非結合の細胞溶解液を除去して、捕捉された受容体または受容体構築体を残すようにする。次いで、付着したかまたは捕捉された受容体または受容体構築体を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化チロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体へ曝露するかまたはそれと接触させる。１つの態様において、抗ホスホチロシン抗体は、非放射活性の発色試薬の色変化を触媒する酵素へ（直接的または間接的に）コンジュゲートさせる。従って、受容体のリン酸化は、この試薬の後続の色変化によって測定可能である。酵素は、抗ホスホチロシン抗体へ直接結合可能であるか、またはコンジュゲート分子（例、ビオチン）を抗ホスホチロシン抗体へコンジュゲートして、引き続き、このコンジュゲート分子を介して、酵素を抗ホスホチロシン抗体へ結合することができる。最後に、例えば発色試薬における色変化によって、抗ホスホチロシン抗体の捕捉受容体または受容体構築体への結合を測定する。
ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）は、ＮＧＦと候補剤をインキュベートして、以下の特性のどの１以上でもモニタリングすることによっても同定可能である：（ａ）ＮＧＦへ結合して、ＮＧＦの生物学的活性またはＮＧＦのシグナル伝達機能により仲介される下流経路を阻害すること；（ｂ）ＮＧＦ受容体活性化（ＴｒｋＡ受容体二量体化および／または自己リン酸化が含まれる）を阻害、阻止するかまたは減少させること；（ｃ）ＮＧＦのクリアランスを高めること；（ｄ）慢性関節リウマチ疼痛または骨関節炎疼痛のあらゆる側面を治療または予防すること；（ｅ）ＮＧＦの合成、産生、または放出を阻害（抑制）すること。いくつかの態様では、ＮＧＦと候補剤をインキュベートして、結合および／またはＮＧＦの生物学的活性の付随の低下または中和をモニタリングすることによってＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）を同定する。結合アッセイは、精製ＮＧＦポリペプチドを用いて、またはＮＧＦポリペプチドを自然に発現するかまたは発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて実施可能である。１つの態様において、結合アッセイは競合結合アッセイであり、ここでは、既知の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体とＮＧＦ結合について競合する候補剤（抗体のような）の能力を評価する。このアッセイは、ＥＬＩＳＡフォーマットが含まれる様々なフォーマットにおいて実施可能である。他の態様では、ＮＧＦと候補剤をインキュベートして、結合と、ｔｒｋＡ受容体二量体化および／または自己リン酸化の付随の阻害をモニタリングすることによってＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）を同定する。
最初の同定に続いて、候補抗ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の活性は、標的となる生物学的活性について試験することが知られているバイオアッセイによってさらに確認および精緻化可能である。あるいは、バイオアッセイは、候補物質を直接スクリーニングするために使用可能である。例えば、ＮＧＦは、応答細胞におけるいくつかの形態学的に認識可能な変化を促進する。これらには、限定されないが、ＰＣ１２細胞の分化を促進して、これらの細胞からの神経突起の成長を亢進させること（Ｇｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７３（７）：２４２４−８，１９７６）、反応性の感覚および交感神経節の外移植片からの神経突起伸長を促進すること（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．およびＡｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８：５３４−５６９，１９６８）および、胚性脊髄後根神経節、三叉神経節、または交感神経節ニューロンのようなＮＧＦ依存性ニューロンの生存を促進すること（例、Ｃｈｕｎ ＆ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．７５：７０５−７１１（１９７７）；Ｂｕｃｈｍａｎ ＆ Ｄａｖｉｅｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：９８９−１００１（１９９３））が含まれる。このように、ＮＧＦ生物学的活性の阻害についてのアッセイは、候補ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が含まれる）のような分析物＋ＮＧＦとともにＮＧＦ応答細胞を培養することを伴う。適正な時間の後で、細胞応答（細胞分化、神経突起伸長、または細胞生存）を検定する。
ＮＧＦの生物学的活性を阻止または中和する候補ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が含まれる）の能力はまた、Ｈｏｎｇｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：２１５−２２７（２０００）に記載されるような胚性ラット脊髄後根神経節生存バイオアッセイにおいてＮＧＦ仲介性の生存を阻害する候補剤の能力をモニタリングすることによって評価可能である。
本発明の方法に使用の組成物
本発明の方法（慢性関節リウマチ疼痛および骨関節炎疼痛に関する）に使用する組成物は、有効量のＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦ抗体のような）を含み、そしていくつかの態様において、医薬的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載の方法のいずれでも使用する。そのような組成物の例については、製剤化の方法とともに、先のセクションと以下でも記載する。１つの態様において、組成物は、ＮＧＦアンタゴニストを含む。別の態様において、組成物は、１以上のＮＧＦアンタゴニストを含む。別の態様において、組成物は、以下のどの１以上より選択される１以上のＮＧＦアンタゴニストを含む：ＮＧＦへ結合する（それと物理的に相互作用する）アンタゴニスト（例、抗体）、ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡおよび／またはｐ７５受容体のような）へ結合するアンタゴニスト、および下流のＮＧＦ受容体シグナル伝達を抑制する（妨害する、および／または阻止する）アンタゴニスト。なお他の態様において、組成物は、ＴｒｋＡイムノアドへシンではない（即ち、ＴｒｋＡイムノアドへシン以外である）、どのＮＧＦアンタゴニストも含む。他の態様において、組成物は、抗ＮＧＦ抗体以外である、どのＮＧＦアンタゴニストも含む。なお他の態様において、組成物は、ＴｒｋＡイムノアドへシン以外であり、抗ＮＧＦ抗体以外である、どのＮＧＦアンタゴニストも含む。他の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦ合成、産生、または放出を阻害（抑制）する。いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦへ結合して、関連のニュートロフィン（ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦのような）と有意には交差反応しない。いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、有害な免疫応答に関連しない。いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ抗体、ＮＧＦへ向けられるアンチセンス分子（ＮＧＦをコードする核酸へ向けられるアンチセンス分子が含まれる）、ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ受容体および／またはｐ７５受容体のような）へ向けられるアンチセンス分子（ＴｒｋＡおよび／またはｐ７５をコードする核酸へ向けられるアンチセンス分子が含まれる）、ＮＧＦ阻害性化合物、ＮＧＦ構造類似体、ＮＧＦへ結合するＴｒｋＡ受容体の優性ネガティブ突然変異体、ＴｒｋＡイムノアドへシン、抗ＴｒｋＡ抗体、抗ｐ７５抗体、およびキナーゼ阻害剤からなる群より選択される。別の態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ抗体である。他の態様において、抗ＮＧＦ抗体は、ヒトＮＧＦを認識する。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体は、ヒト由来である。なお他の態様において、抗ＮＧＦ抗体は、ヒト化されている（本明細書に記載の抗体Ｅ３のように）。なお他の態様において、抗ＮＧＦ抗体は、抗体仲介性溶解またはＡＤＣＣのような、望まれないかまたは望ましくない免疫応答を始動しない定常領域を含む。他の態様において、抗ＮＧＦ抗体は、抗体Ｅ３の１以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５のＣＤＲ、またはいくつかの態様では、Ｅ３由来の全６つのＣＤＲのような）を含む。
本組成物は、１より多いＮＧＦアンタゴニストを含んでよいと理解される。例えば、組成物は、ＮＧＦアンタゴニストの群（例えば、ＮＧＦの異なるエピトープを認識する抗ＮＧＦ抗体の混合物）の１より多いメンバー、並びにＮＧＦアンタゴニストの異なる群（例、抗ＮＧＦ抗体とＮＧＦ阻害性化合物）のメンバーを含んでよい。他の例示の組成物は、同一のエピトープ、ＮＧＦの異なるエピトープへ結合する異なる種の抗ＮＧＦ抗体、または異なるＮＧＦ阻害性化合物を認識する１より多い抗ＮＧＦ抗体を含む。
本発明に使用する組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液剤の形態で、医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤をさらに含んでよい（レミントン：「調剤の科学および実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」第２０版（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ（監修）Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）。医薬的に許容される賦形剤については、本明細書においてさらに記載する。
ＮＧＦアンタゴニストとその組成物はまた、薬剤の有効性を高める、および／または補填するのに役立つ他剤と一緒に使用可能である。骨関節炎疼痛のために、ＮＧＦアンタゴニストは、１以上の他の鎮痛薬、ＮＳＡＩＤ、またはステロイドと一緒に投与可能である。鎮痛薬には、限定されないが、アセトアミノフェン、トラマドール、カプサイシン（局所用）が含まれる。ＮＳＡＩＤの例は、アセチル化サリチル酸（アスピリンが含まれる）；非アセチル化サリチル酸（サルサラート、ジフルニサールが含まれる）；酢酸（エトドラク、ジクロフェナク、インドメタシン、ケトロラク、ナブメトンが含まれる）；プロピオン酸（フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジンが含まれる）；フェナメート（メクロフェナメート、メフェナム酸が含まれる）；フェニルブタゾン、ピロキシカム；ＣＯＸ−２阻害剤（セレコキシブ、エトリコキシブ、バルデコキシブ、ロフェコキシブ、ルミラコキシブが含まれる）である。ステロイドの例は、関節内コルチコステロイド（ＩＡＣ）である。
慢性関節リウマチ疼痛を治療するために、ＮＧＦアンタゴニストは、１以上の他の鎮痛薬、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド（例、プレドニゾン）、他の疾患改善抗リウマチ薬と一緒に投与可能である。疾患改善抗リウマチ薬の例は、メトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、レフルノミド、ＴＮＦ阻害剤、可溶性インターロイキン−１受容体、金コンジュゲート、細胞傷害剤（アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ）である。
ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の投与
ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）は、個体へ（慢性関節リウマチおよび骨関節炎のために）どの好適な経路を介しても投与可能である。当業者には、本明細書に記載の例が、利用可能な技術を制限するものではなくてその例示であることが明らかなはずである。従って、いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）は、静脈内投与（例えば、ボーラスとして、またはある一定時間にわたる連続注入により）、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、舌下、滑液嚢内、通気により、鞘内、経口、吸入、または局所経路によるといった、既知の方法に従って個体へ投与する。投与は、全身性（例、静脈内投与）であっても、局所性であってもよい。液体製剤用に市販されているネブライザー（ジェットネブライザーと超音波ネブライザーが含まれる）が投与に有用である。液体製剤は、直接霧状化可能であり、凍結乾燥粉末は、復元後に霧状化可能である。あるいは、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）は、フルオロカーボン製剤と目盛量吸入器を使用してエアゾール化しても、凍結乾燥して粉砕化した粉末として吸入してもよい。
１つの態様では、部位特異的または標的指向性の局所送達技術によりＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）を投与する。部位特異的または標的指向性の局所送達技術の例には、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の様々な埋め込み可能デポー供給源、注入カテーテル、留置カテーテル、または有針カテーテルのような局所送達カテーテル、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステント、または他の埋め込み可能デバイス、部位特異的な担体、直接注射、または直接適用が含まれる。例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ００／５３２１１および米国特許第５，９８１，５６８号を参照のこと。
ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）の様々な製剤を投与に使用可能である。いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）は、そのまま投与可能である。いくつかの態様において、ＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）と医薬的に許容される賦形剤は、様々な製剤中にあり得る。医薬的に許容される賦形剤は当該技術分野で知られていて、薬理学的に有効な物質の投与を促進する、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態またはコンシステンシーを与えるか、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤には、限定されないが、安定化剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変化させるための塩類、被包化剤、緩衝剤、および皮膚透過エンハンサーが含まれる。賦形剤、並びに、非経口および非腸管外の薬物送達用の製剤については、レミントン，「調剤の科学および実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」第２０版、マック・パブリッシング（２０００）に説明されている。
いくつかの態様において、上記の薬剤は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、等）による投与用に製剤化される。従って、上記の薬剤は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、等のような医薬的に許容される担体と組み合わせ可能である。特別な投与方式、即ち、用量、時機、および反復は、特別な個体とその個体の治療歴に依存するものである。
抗ＮＧＦ抗体は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、等）によることが含まれるどの好適な方法を使用しても投与可能である。抗ＮＧＦ抗体はまた、本明細書に記載されるように、吸入により投与可能である。一般に、抗ＮＧＦ抗体の投与では、初回の候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本発明の目的では、典型的な１日投与量は、上記の要因に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上のいずれに及んでもよい。例えば、抗ＮＧＦ抗体は、約１μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、または約２ｍｇ／ｋｇで投与可能である。数日以上にわたる反復投与では、状態に依存して、症状の望まれる抑制が生じるまで、または疼痛を抑えるのに十分な療法レベルに達するまで治療を持続する。例示の投与方式は、約２ｍｇ／ｋｇの初回用量に、約１ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体の週維持量を続けるか、または隔週約１ｍｇ／ｋｇの維持量を続ける。しかしながら、診療医が達成することを望む薬物動態上の減衰様式に依存して、他の投与量も有用であり得る。例えば、いくつかの態様では、週に１〜４回の投薬を考慮する。さほど頻繁でない投薬でも使用可能である。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体は、２週毎、３週毎、４週毎、５週毎、６週毎、７週毎、８週毎、９週毎、１０週毎、１５週毎、２０週毎、２５週毎、またはより長期に１回投与する。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体は、１ヶ月毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎、４ヶ月毎、５ヶ月毎、６ヶ月毎、またはより長期に１回投与する。この療法の進捗は、慣用の技術およびアッセイにより容易にモニタリングする。投与方式（使用するＮＧＦアンタゴニストが含まれる）は、経時的に変動してよい。
膝の骨関節炎に由来する中等度〜重度の疼痛のある患者で行った試験（実施例９に要約する）は、３〜３００μｇ／ｋｇの範囲の投与量が様々な期間の間に疼痛緩和をもたらすことを実証した。試験したすべての投与量（３、１０、３０、１００、および３００μｇ／ｋｇ）で少なくとも７日間の疼痛抑制をもたらし；より高い投与量は、少なくとも２８日の延長した疼痛緩和をもたらした（図２４）。１００μｇ／ｋｇの用量は、少なくとも８０日間の疼痛緩和をもたらした（図２５）。
一般に、抗体でない場合、ＮＧＦアンタゴニストは（いくつかの態様において）患者の体重（ｋｇ）につき約０．１〜３００ｍｇの割合で、１〜３回の用量へ分割するかまたは本明細書に開示するようにして投与可能である。いくつかの態様において、標準体重の成人患者では、約０．３〜５．００ｍｇ／ｋｇに及ぶ用量が投与可能である。特別な投与方式（即ち、用量、時機および反復）は、特別な個体とその個体の治療歴、並びに個別の薬剤の特性（薬剤の半減期や、当該技術分野でよく知られた他の考察のような）に依存するものである。
本発明の目的では、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が含まれる）の適正な投与量は、利用するＮＧＦアンタゴニスト（またはその組成物）、治療すべき疼痛の種類および重症度、薬剤を予防または治療の目的のいずれのために投与するのか、過去の療法、患者の臨床歴と薬剤への応答、および担当医の裁量に依存する。典型的には、臨床医は、望ましい結果を達成する投与量に達するまで、ＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）を投与するものである。用量および／または頻度は、治療の経過にわたって変動可能である。
一般に、半減期のような経験上の考察が投与量の決定に貢献する。例えば、ヒト化抗体または全長ヒト抗体のような、ヒト免疫系と適合可能である抗体は、抗体の半減期を延長させて、抗体が宿主の免疫系により攻撃されることを防ぐために使用可能である。投与の頻度は、療法の経過にわたって決定および調整可能であり、一般的には、必ずではないが、疼痛の治療および／または抑制および／または改善および／または遅延に基づく。あるいは、ＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）の持続性の連続放出製剤も適正であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤およびデバイスが当該技術分野で知られている。
１つの態様において、ＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）の投与量は、ＮＧＦアンタゴニストの１回以上の投与を与えた個体では、経験的に決定可能である。個体へ漸増量のＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）を与える。ＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）の効力を評価するために、疼痛の指標を追跡可能である。
本発明の方法に従ったＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療または予防のいずれかであるかということ、そして熟練診療医に知られる他の要因に依存して、連続的または間欠的であり得る。ＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）の投与は、予め選択した期間にわたり本質的には連続的であっても、連続した間隔のある投薬（例えば、疼痛を発症する前、間、または後；前；間；前と後；間と後；前と間；または疼痛を発症する前、間、および後のいずれか）であってもよい。
いくつかの態様において、１より多いＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）が存在してよい。少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５の異なる、またはより多くのＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）が存在してよい。一般に、これらのＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）は、互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する。ＮＧＦアンタゴニストはまた、薬剤の有効性を高める、および／または補填するのに役立つ他剤と一緒に使用可能である。
本発明に従って使用するＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）の療法製剤は、望まれる度合いの純度を有するＮＧＦアンタゴニスト（例、抗体）を最適な医薬的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液剤の形態で保存用に調製する（レミントン，「製剤の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」第２０版、マック・パブリッシング、２０００）。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、利用する投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸のような緩衝剤；塩化ナトリウムのような塩類；アスコルビン酸およびメチオニンが含まれる抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールのような）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート形成剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含んでよい。
ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）を含有するリポソーム剤は、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５および４，５４４，５４５号に記載されるような、当該技術分野で知られた方法によって調製する。循環時間の亢進されたリポソーム剤が米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソーム剤は、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含んでなる液体組成物を用いた逆相蒸発法によって産生可能である。望みの直径のリポソームを得るために、一定の孔径のフィルターに通してリポソームを押出し成型する。
有効成分はまた、コロイド状の薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）において、またはミクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術によるかまたは界面重合化により製造したマイクロカプセル剤、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル剤とポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル剤に捕捉可能である。そのような技術については、レミントン，「製剤の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」第２０版、マック・パブリッシング（２０００）に開示されている。
持続放出調製物が調製可能である。持続放出調製物の好適な例には、アンタゴニスト（抗体のような）を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、該マトリックスは、成形品（例、フィルム）またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７−エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ ＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドより構成される注射可能なミクロスフェア）、スクロースアセテートイソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用する製剤は、無菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。一般に、治療用ＮＧＦアンタゴニスト（例、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）組成物は、無菌のアクセス孔を有する容器（例えば、静脈内溶液バッグ）、または皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有するバイアルへ入れる。
本発明による組成物は、経口、非経口、または直腸投与、または吸入若しくは通気による投与のために、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤または懸濁液剤、または坐剤のような単位剤形であってよい。
錠剤のような固体組成物を調製するには、主要な有効成分を医薬担体（例、コーンスターチ、乳糖、ショ糖、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、またはゴムのような慣用の錠剤化成分）と他の医薬希釈剤（例、水）と混合して、本発明の化合物またはその無毒の医薬的に許容される塩の均質混合物を含有する固体のプレ製剤化組成物を生成する。このプレ製剤化組成物を均質と述べる場合は、有効成分が組成物全体に等しく分散して、組成物が錠剤、丸剤、およびカプセル剤のような等しく有効な単位剤形へ容易に再分割可能であることを意味する。次いで、この固体のプレ製剤化組成物を、本発明の有効成分の０．１〜約５００ｍｇを含有する上記に記載した種類の単位剤形へ再分割する。この新規組成物の錠剤または丸剤は、被覆しても、他のやり方で配合して、延長作用の利点をもたらす剤形を提供してもよい。例えば、錠剤または丸剤は、内側投与および外側投与の成分を含んでよく、後者は、前者を覆うエンベロープの形態である。この２つの成分は、胃での崩壊に抵抗することに役立って、内側成分がそのまま十二指腸を通過するかまたは放出が遅れることを可能にする腸溶層によって分離可能である。そのような腸溶層またはコーティングには多種の材料が使用可能であり、そのような材料には、いくつかの高分子酸と、シェラック、セチルアルコール、およびセルロースアセテートのような材料と高分子酸の混合物が含まれる。
好適な界面活性剤には、特に、ポリオキシエチレンソルビタン（例、ＴｗｅｅｎＴＭ２０、４０、６０、８０または８５）と他のソルビタン（例、ＳｐａｎＴＭ２０、４０、６０、８０または８５）のような非イオン性の薬剤が含まれる。界面活性剤のある組成物は、簡便には、０．０５〜５％の界面活性剤を含み、０．１〜２．５％であってよい。他の成分、例えば、マンニトールや他の医薬的に許容される担体を必要ならば加えてよいと理解される。
好適なエマルジョンは、ＩｎｔｒａｌｉｐｉｄＴＭ、ＬｉｐｏｓｙｎＴＭ、ＩｎｆｏｎｕｔｒｏｌＴＭ、ＬｉｐｏｆｕｎｄｉｎＴＭおよびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎＴＭのような市販の脂肪エマルジョンを使用して調製可能である。有効成分は、予め混合したエマルジョン組成物に溶かしても、あるいはそれをオイル（例、ダイズ油、べにばな油、綿実油、ゴマ油、とうもろこし油、またはヘントウ油）に溶かして、リン脂質（例、卵リン脂質、大豆リン脂質、または大豆レシチン）および水と混合してエマルジョンを生成してもよい。他の成分、例えば、グルセロールまたはグルコースを加えてエマルジョンの張度を調整してよいことが理解されよう。好適なエマルジョンは、典型的には２０％まで、例えば、５〜２０％のオイルを含有する。脂肪エマルジョンは、０．１〜１．０μｍ、特に０．１〜０．５μｍの脂肪滴を含み、ｐＨを５．５〜８．０の範囲に有してよい。
エマルジョン組成物は、ＮＧＦアンタゴニスト（神経成長因子抗体のような）をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄＴＭまたはその成分（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロール、および水）と混合することによって調製するものであってよい。
吸入または通気用の組成物には、医薬的に許容される水系溶媒または有機系の溶媒、またはそれらの混合物中の溶液剤および懸濁液剤と散剤が含まれる。この液体または固体の組成物は、上記に示したような好適な医薬的に許容される賦形剤を含有可能である。いくつかの態様において、該組成物は、局所または全身効果のために、経口または鼻呼吸経路により投与する。好ましくは無菌の医薬的に許容される溶媒中の組成物は、ガスの使用により霧状化可能である。霧状化した溶液剤は、霧状化デバイスから直接吸込んでも、霧状化デバイスをフェイスマスク、テント、または間欠陽圧呼吸マシーンへ付着させてもよい。溶液、懸濁液、または散剤の組成物は、製剤を適正なやり方で送達するデバイスより、好ましくは経口または経鼻で投与可能である。
治療の効力は、当該技術分野でよく知られた方法によって評価可能である。
本発明の抗体およびポリヌクレオチドを含んでなるキット
本発明はまた、検出および／または療法に使用の抗体またはポリペプチドを含んでなるキットを提供する。従って、いくつかの態様において、キットは、抗体Ｅ３を含む。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載のどの抗体またはポリペプチドも含む。
他の側面において、キットは、例えば、疼痛（術後疼痛、慢性関節リウマチ疼痛、および骨関節炎疼痛が含まれる）のある個体を治療することが含まれる、本明細書に記載の方法のいずれにも使用可能である。本発明のキットは、好適な包装状態にあり、緩衝液のような追加成分と、本明細書に記載の方法のいずれにもおける抗体の使用についての説明書を随意に提供可能である。いくつかの態様において、キットには、疼痛を治療することについての説明書が含まれる。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体と、慢性関節リウマチ疼痛を個体において治療および／または予防することについての説明書を含む。他の態様において、キットは、本明細書に記載のＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような）と、骨関節炎疼痛を個体において治療および／または予防することについての説明書を含む。態様のいくつかにおいて、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、抗体Ｅ３である。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載のＥ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載のいずれにもおけるポリヌクレオチドの使用についての説明書をさらに含む。
抗体のアフィニティーを調整するための方法とＣＤＲを特性決定するための方法
我々は、「ライブラリースキャニング突然変異誘発」と呼ぶ、抗体のＣＤＲを特性決定すること、および／または抗体のようなポリペプチドの結合アフィニティー改変すること（改善することのように）の新規な方法を開発した。概して言えば、ライブラリースキャニング突然変異誘発は、以下のように作用する。当該技術分野で認知された方法を使用して、ＣＤＲ中の１以上のアミノ酸位置を２以上の（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のような）アミノ酸で置き換える。これにより、クローン（いくつかの態様では、解析する各アミノ酸位置について１つ）の小さなライブラリーが産生され、それぞれが２以上のメンバーの複雑性を有する（あらゆる位置で２以上のアミノ酸が置換されるならば）。一般に、このライブラリーにはまた、ネイティブ（未置換）アミノ酸を含んでなるクローンも含まれる。各ライブラリーからの少数のクローン、例えば、約２０〜８０のクローン（ライブラリーの複雑性に依存する）について、標的ポリペプチドへの結合アフィニティーをスクリーニングして、結合が増加した、同じである、減少した、または皆無である候補を同定する。結合アフィニティーを決定するための方法は、当該技術分野でよく知られている。いくつかの態様において、結合アフィニティーは、約２倍以上大きい結合アフィニティーの差を検出するＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を使用して決定する。ＢＩＡｃｏｒｅは、出発の抗体が比較的高いアフィニティー（例えば、約１０ｎＭ以下のＫＤ）ですでに結合するときに特に有用である。ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を使用するスクリーニングについては、本明細書の実施例に記載する。
他の態様では、Ｋｉｎｅｘａ Ｂｉｏｃｅｎｓｏｒ、シンチレーション近似アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮイムノアッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光消光法、蛍光転移、および／または酵母ディスプレイを使用して結合アフィニティーを決定する。他の態様では、好適なバイオアッセイを使用して結合アフィニティーをスクリーニングする。
いくつかの態様では、当該技術分野で認知された突然変異誘発法（このいくつかを本明細書に記載する）を使用して、ＣＤＲ中の各アミノ酸位置を全２０の天然アミノ酸に置き換える（いくつかの態様では、１回に１つ）。これにより、クローン（いくつかの態様では、解析する各アミノ酸位置について１つ）の小さなライブラリーが産生され、それぞれが２０のメンバーの複雑性を有する（あらゆる位置で全２０のアミノ酸が置換されるならば）。
いくつかの態様において、スクリーニングするライブラリーは、同一のＣＤＲにあっても、２以上のＣＤＲにあってもよい２以上の位置に置換を含む。このように、いくつかの態様において、ライブラリーは、１つのＣＤＲ中の２以上の位置に置換を含む。他の態様において、ライブラリーは、２以上のＣＤＲ中の２以上の位置に置換を含む。なお他の態様において、ライブラリーは、３、４、５、またはより多くの位置に置換を含み、前記位置は、２、３、４、５、または６のＣＤＲに見出される。いくつかの態様において、置換は、低重複コドンを使用して作製する。例えば、Ｂａｌｉｎｔら，（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７（１）：１０９−１８の表２を参照のこと。
いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＣＤＲ Ｈ３および／またはＣＤＲ Ｌ３である。他の態様において、ＣＤＲは、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、および／またはＣＤＲ Ｈ３の１以上である。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、または延長ＣＤＲである。
結合が改善された候補は配列決定可能であり、それによって、改善アフィニティー（「改善」置換とも呼ばれる）をもたらすＣＤＲ置換突然変異体を同定する。例えば、実施例１において実証するように、この方法の使用は、同じアミノ酸位置での他の推定１８種の置換が結合なし（即ち、抗体機能の消失）をもたらしたときでも、結合を改善する単一の置換の同定を可能にした。結合する複数の候補も配列決定可能であり、それによって、結合を保持するＣＤＲ置換を同定する。
いくつかの態様では、多数ラウンドのスクリーニングを実施する。例えば、結合が改善した候補（それぞれ、１以上のＣＤＲの１以上の位置でアミノ酸置換を含んでなる）はまた、少なくとも元のアミノ酸とそれぞれの改善ＣＤＲ位置（即ち、置換突然変異体が改善結合を示したＣＤＲ中のアミノ酸位置）での置換アミノ酸を含有する二次ライブラリーの設計に有用である。このライブラリーの調製とそのスクリーニングまたは選択については、以下に詳しく考察する。
ライブラリースキャニング突然変異誘発はまた、改善結合、同じ結合、減少結合、または無結合のクローンの頻度が抗体−抗原複合体の安定性についての各アミノ酸位置の重要性に関する情報も提供するという限りにおいて、ＣＤＲを特性決定するための手段を提供する。例えば、ＣＤＲのある位置が全２０のアミノ酸へ変化するときに結合を保持するのなら、その位置は、抗原結合に必要とされる可能性が低い位置と同定される。逆に、ＣＤＲのある位置がごく小さな百分率の置換において結合を保持するならば、その位置は、ＣＤＲ機能に重要である位置として同定される。このように、ライブラリースキャニング突然変異誘発法は、多くの異なるアミノ酸（全２０のアミノ酸が含まれる）へ変化可能であるＣＤＲ中の位置と、変化し得ないかまたは少数のアミノ酸だけに変化可能であるＣＤＲ中の位置に関する情報をもたらす。この側面については実施例１において考察して例示する。
いくつかの態様では、アフィニティー改善された候補を、その位置での改善アミノ酸、元のアミノ酸が含まれて、望まれるかまたは望みのスクリーニングまたは選択法を使用して可能になるライブラリーの複雑性に依存して、その位置での追加置換がさらに包含可能である第二のライブラリーにおいて組み合わせる。さらに、望まれるならば、隣のアミノ酸位置を少なくとも２以上のアミノ酸へ無作為化可能である。隣接アミノ酸の無作為化は、突然変異体ＣＤＲにおける追加のコンホメーション柔軟性を許容する場合があり、それがより多数の改善的な突然変異の導入を許容または促進する場合がある。いくつかの態様において、ライブラリーはまた、第一ラウンドのスクリーニングにおいては改善アフィニティーを示さなかった位置での置換を含む。
第二のライブラリーについて、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を使用するスクリーニングと、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイが含まれる、選択について当該技術分野で知られるあらゆる方法を使用する選択が含まれる、当該技術分野で知られるあらゆる方法を使用して、改善および／または改変した結合アフィニティーのあるライブラリーメンバーをスクリーニングまたは選択する。
抗体のアフィニティーを調整してＣＤＲを特性決定するための方法の利点
本方法は、結合を改善するかまたは結合を保持するアミノ酸置換を同定するためにＣＤＲアミノ酸位置をプレスクリーニングするのに有用である。重要な残基のプレ同定、結合を改善する置換、および／または抗体機能を保持する置換は、アフィニティー成熟ライブラリーの効率的な設計およびスクリーニングを可能にする。
本方法はまた、ＣＤＲを特性決定するのに有用であり、ＣＤＲ中の各アミノ酸位置の、抗原への結合への重要性に関する総合的な情報を提供する。本方法はまた、結合を改善する置換を同定するために使用可能である。
各位置を無作為化可能である（いくつかの態様では、１回に１つ）小さなライブラリーの使用は、詳細な動態情報を提供するＢＩＡｃｏｒｅのような高感度の方法を使用する、置換突然変異体のスクリーニングを可能にする。スクリーニング法は、より大きなライブラリーをスクリーニングするとき、概して非実用的である。一方、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイのような選択法は、通常、結合を保持するクローンを同定するために使用されている。ファージディスプレイとＥＬＩＳＡアッセイは、クローンより調製するタンパク試料の濃度に大きく依存する場合があるので、結合アフィニティーが増加したクローンを同定することよりむしろ、増加した発現、増加した安定性、または減少した毒性を有するクローンに対して大きく偏る傾向がある。さらに、クローンの発現レベルにおける差異は、結合アフィニティーのわずかな改善を隠す可能性がある。これらの欠点は、結合アフィニティーが高い抗体を出発材料として使用するとき、特に深刻になる。なぜなら、スクリーニングが十分にストリンジェントであるためには、ごく低いレベルの抗原を使用しなければならないからである。
対照的に、各位置での無作為化（いくつかの態様では、１回に１つ）のような本発明の方法は、所与の位置での、例えば全２０のアミノ酸の置換の導入とその効果の特性決定を可能にする。この分析は、所与の位置で寛容される（即ち、抗体結合を保持する）置換の数に関する情報を提供し、次いでこれが、各アミノ酸の抗体機能に対する重要性に関する情報を提供する。さらに、所与の位置での置換の多くまたは大部分が非機能性（非結合性）の抗体をもたらす状況の下でも、改善結合をもたらす置換が同定可能である。対照的に、重要なＣＤＲ位置を同定するために通常使用されているアラニン−スキャニング突然変異誘発は、アラニンの置換が結合を可能にするかまたは妨げるかに関する情報を提供する。一般に、アラニン置換が結合を妨げる位置は、アフィニティー成熟ライブラリーより除去される。しかしながら、多くの場合、アラニンは、ＣＤＲ位置での不十分な代用物であり得る。
本方法はまた、単一のＣＤＲ突然変異の効果の同定および特性決定を可能にする。対照的に、ファージディスプレイのような方法は、多くの突然変異を同時に導入および選択するので、特別なクローンに存在する有害な突然変異の存在により、陽性の突然変異がマスクされるリスクが潜在的に高まる。
本方法は、改善された結合アフィニティーをもたらす少数の突然変異（例、単一のＣＤＲ中に１、２、３、４、または５の突然変異）の同定を本方法が可能にする限りにおいて、元の（出発の）抗体の結合特異性を保持しながらアフィニティーを改善することにも有用である。対照的に、ファージディスプレイのような方法は、典型的には、１回に多数の突然変異を使用して結合アフィニティーを改善するので、これは、抗体の特異性のシフト、および／または望まれない交差反応性の増加をもたらす場合がある。
本発明を例示するために（制限するためにではなく）以下の実施例を提供する。
実施例
実施例１：マウスアンタゴニスト抗ＮＧＦ抗体９１１のヒト化およびアフィニティー成熟化
Ａ．一般法
本実施例において以下の一般法を使用する。
ライブラリー作製
ライブラリーは、Ｋａｙら．（１９９６）「ペプチドおよびタンパク質のファージディスプレイ：実験マニュアル（Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」サンディエゴ、アカデミックプレス（２７７〜２９１頁を参照のこと）に記載のように、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲカセット突然変異誘発により作製した。ドーピング（ｄｏｐｉｎｇ）コドンのＮＮＫを使用して、１つのアミノ酸位置に２０の可能なアミノ酸が含まれるように無作為化した。特異的な性質のあるアミノ酸の亜集合だけが含まれるように１つのアミノ酸位置を無作為化するには、Ｂａｌｉｎｔら，（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７（１）：１０９−１８）に記載のようにドーピングコドンを使用した。部位特異的突然変異誘発は、Ｉｎｎｉｓら，（１９９０）「ＰＣＲプロトコール：方法および応用の手引き（ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（１７７〜１８３頁を参照のこと）に記載のような組換えＰＣＲを使用して実施した。
小スケールのＦａｂ調製
９６ウェルプレートにおける小スケール発現をＦａｂライブラリーのスクリーニング用に最適化した。Ｆａｂライブラリーで形質転換した大腸菌より始めて、コロニーを摘出して、マスタープレート（寒天ＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％グルコース）と作業プレート（２ｍｌ／ウェル、９６ウェル／プレート、１．５ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％グルコースを含有する）の両方に接種した。両方のプレートを３０℃で８〜１２時間増殖させた。マスタープレートを４℃で保存して、作業プレートからの細胞を５０００ｒｐｍでペレットにして、１ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭ ＩＰＴＧとともに再懸濁させて、Ｆａｂの発現を誘導した。３０℃で５時間の発現時間の後で細胞を遠心分離により採取してから、５００μＬの緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．００５％ Ｐ２０，３ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。ＨＢＳ−ＥＰ再懸濁細胞の溶解を、凍結（−８０℃）に次ぐ３７℃での融解の１サイクルによって達成した。細胞溶解液を５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、Ｆａｂを含有する上清より細胞残滓を分離させた。次いで、この上清をＢＩＡｃｏｒｅプラズモン共鳴装置へ注入して、それぞれのＦａｂについてのアフィニティー情報を得た。Ｆａｂを発現するクローンをマスタープレートより拾い上げて、ＤＮＡの配列を決定して、以下に記載のような大スケールのＦａｂ産生と詳細な特性決定に供した。
大スケールのＦａｂ調製
詳細な動態変数を得るために、大きな培養物よりＦａｂを発現させて、精製した。２００ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％グルコースを含有するエーレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコに、選択したＦａｂ発現大腸菌クローン由来の一晩内容物の５ｍＬを接種した。クローンを３０℃で１．０のＯＤ５５０ｎｍが達成されるまでインキュベートしてから、培地を２００ｍｌの（ＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭ ＩＰＴＧ）に置き換えることによって誘導した。３０℃で５時間の発現時間の後で、細胞を遠心分離によりペレット化してから、１０ｍＬ ＰＢＳ（ｐＨ８）に再懸濁させた。細胞の溶解は、２サイクルの凍結／融解（それぞれ、−８０℃と３７℃）によって得た。細胞溶解液の上清を、ＰＢＳ（ｐＨ８）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ超流セファロース（Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア）カラム上へロードしてから、５カラム量のＰＢＳ（ｐＨ８）で洗浄した。ＰＢＳ（ｐＨ８）＋３００ｍＭイミダゾールで、異なる分画中に各Ｆａｂが溶出した。Ｆａｂｓを含有する分画をプールして、ＰＢＳ中で透析してから、アフィニティー特性決定に先立って、ＥＬＩＳＡにより定量した。
全長抗体の調製
完全抗体（ｆｕｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の発現には、重鎖および軽鎖の可変領域を２つの哺乳動物発現ベクター（軽鎖にはＥｂ．９１１．Ｅ３またはＥｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅ、そして重鎖にはＤｂ．９１１．３Ｅ；本明細書に記載する）にクローニングし、リポフェクタミンを使用して、一過性発現用のＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクトした。プロテインＡを使用する標準法を使用して、抗体を精製した。
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
ＢｌＡｃｏｒｅ３０００ＴＭ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して、抗ＮＧＦ Ｆａｂとモノクローナル抗体のアフィニティーを決定した。供給元の説明書に従って、ＣＭ５チップをＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化した。ヒトＮＧＦを１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）へ希釈して、活性化チップ上に０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で注入した。個々のチップチャネルを通過する可変フロー時間を使用して、詳細な動態試験用の１００〜２００応答単位（ＲＵ）とスクリーニングアッセイ用の５００〜６００ＲＵという、２つの範囲の抗原密度を達成した。チップをエタノールアミンで遮断した。再生試験は、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４，Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，イリノイ州ロックフォード）および４Ｍ ＮａＣｌ（２：１）の混合物が、２００回を超える注入の間に、チップ上のｈＮＧＦの活性を保つ一方で、結合したＦａｂを有効に除去することを示した。すべてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイで、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．１５ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２９）をランニング緩衝液として使用した。
スクリーニングアッセイ
ライブラリー由来Ｆａｂクローンのアフィニティーを決定するために、スクリーニングＢＩＡｃｏｒｅアッセイを最適化した。小培養溶解液の上清を５０μｌ／分で２分間注入した。ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用する単一指数解離速度（ｋｏｆｆ）の決定には、１０〜１５分の解離時間を使用した。ライブラリー（クローン８Ｌ２−６Ｄ５，ｋｏｆｆ１ｘ１０−３ｓ−１）を創出するために使用する鋳型と同じ範囲にｋｏｆｆ速度を示す試料を確定のために注入して、４５分までの解離時間を許容してよりよいｋｏｆｆ値を得た。改善した（より遅い）ｋｏｆｆ値を示すクローンを大スケールで発現させて、精製タンパク質について完全動態変数のｋｏｎおよびｋｏｆｆを決定した。このアッセイは、ほぼ２倍以上であるアフィニティーの差異を検出することが可能であった。
アフィニティー決定アッセイ
精製Ｆａｂ試料の系列希釈液（０．１〜１０ｘ推定ＫＤ）を１００μＬ／分で１分間注入して、２時間までの解離時間を許容した。Ｆａｂタンパク質の濃度は、既知濃度（アミノ酸分析により定量する）のＦａｂを標準品として使用するＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって定量した。ＢＩＡ評価プログラムを使用する１：１ラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６．９９−１１０）へデータを適合させることによって、動態会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に入手した。平衡解離定数（ＫＤ）値は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。
Ｂ．マウスアンタゴニスト抗ＮＧＦ抗体９１１のヒト化およびアフィニティー成熟化
マウスアンタゴニスト抗ＮＧＦ抗体、９１１（Ｈｏｎｇｏら，（２０００）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９（３）：２１５−２２７を参照のこと）をヒト化とアフィニティー成熟化のために選択した。Ｍａｂ９１１は、ヒトおよびラットのＮＧＦへ高いアフィニティーで結合して、ニュートロフィンのＮＴ３、ＮＴ４／５またはＢＤＮＦと有意な交差反応性を明示しない。Ｈｏｎｇｏ，同上を参照のこと。上記のようにＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して、マウスＭａｂ９１１のパパイン切断Ｆａｂ断片のアフィニティーを決定した。マウスＭａｂ９１１のパパイン切断Ｆａｂ断片は、ヒトＮＧＦへほぼ１０ｎＭのＫＤで結合した。
ヒト化とアフィニティー成熟化は、以下のように、いくつかの工程で行なった：
（１）ＣＤＲ移植鋳型の調製。抗体９１１の軽鎖延長ＣＤＲ（即ち、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ領域が含まれる）をヒト生殖系アクセプタ配列Ｏ８へＪＫ２とともに移植して、抗体９１１の重鎖延長ＣＤＲをヒト生殖系アクセプタ配列ＶＨ４−５９へＪＨ４とともに移植した。ヒト生殖系アクセプタ配列のアミノ酸配列を図１Ａおよび１Ｂに示す。アミノ酸番号付けは、連続的である。上記に述べたタンパク質フレームワークを使用して、ヒトフレームワークをマウスＣＤＲとともにコードする合成遺伝子のＤＮＡ配列を設計した。これらのヒト化重鎖および軽鎖可変ドメインをそれぞれｈＶＨおよびｈＶＬと命名した。大腸菌とハムスターの使用のためにコドンを最適化した。完全長のｈＶＬおよびｈＶＨに各鎖につき２つの短いフランキングプライマーとともに延長する、いくつかの重なるオリゴヌクレオチド（６９〜９０塩基の長さ）を使用して、Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕら，（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ５（８）：８２７−９に本質的に記載されるような再帰性（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）ＰＣＲによって、２つの遺伝子を別々に合成した。生じる正確な長さのＤＮＡ断片をゲル精製してから、大腸菌二重シストロン発現プラスミド（アンピシリン抵抗性）へクローニングした。抗体の発現は、Ｂａｒｂａｓ（２００１）「ファージディスプレイ：実験マニュアル（Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、コールドスプリングハーバー・プレス（２．１０頁のＶｅｃｔｏｒ ｐＣｏｍｂ３Ｘを参照のこと）の記載と同様に、ＩＰＴＧ誘導ｌａｃＺプロモーターの制御下にあったが、以下の追加ドメインの追加および発現を含めた：ヒトκ軽鎖定常ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＣＡＡ０９１８１を参照のこと）とＩｇＧ２ａヒト免疫グロブリンのＣＨＩ定常ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号Ｐ０１８５９）。
８Ｌ２−４Ｄ５と命名したＣＤＲ移植抗体（「鋳型」とも呼ぶ）の可変領域のアミノ酸配列も、図１Ａおよび１Ｂに示す。上記に記載のようなＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して、８Ｌ２−４Ｄ５のアフィニティーを決定した。８Ｌ２−４Ｄ５は、ヒトＮＧＦへほぼ３８ｎＭのＫＤで結合した。
（２）フレームワーク配列への点突然変異の導入。Ｉｎｎｉｓら，（１９９５）「ＰＣＲ戦略（ＰＣＲ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」サンディエゴ、アカデミック・プレスに記載のような組換えＰＣＲ部位突然変異誘発を使用して、ＣＤＲ移植重鎖へＶ７１Ｋ置換を導入した。この置換により、ヒトフレームワーク残基を対応のマウスフレームワーク残基に置き換えた。生じる抗体を８Ｌ２−６Ｄ５と命名して、８Ｌ２−６Ｄ５の重鎖可変領域のアミノ酸配列を図１Ａに示す。上記に記載のようなＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して、８Ｌ２−６Ｄ５のアフィニティーを決定した。８Ｌ２−６Ｄ５のＦａｂ断片は、ヒトＮＧＦへほぼ１５ｎＭのＫＤで結合した。８Ｌ２−６Ｄ５をアフィニティー成熟化の鋳型として選択した。
（３）ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１およびＨ２のヒト化およびアフィニティー成熟化。ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、およびＨ２をヒト化とアフィニティー成熟化に処した。Ｃｈｏｔｈｉａ基準構造（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３（４）：９２７−４８を参照のこと）に基づいて、ＣＤＲの構造に本質的ではない、ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、およびＨ２中のアミノ酸位置を同定して、以下のような無作為化へ処した。Ｂａｌｉｎｔら，（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７（１）：１０９−１８）に記載のようなドーピングコドンを使用し、Ｋａｙら．（１９９６）「ペプチドおよびタンパク質のファージディスプレイ：実験マニュアル（Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」サンディエゴ、アカデミックプレスに記載のような縮重オリゴヌクレオチドでのＰＣＲカセット突然変異誘発を使用して、表２に示す軽鎖突然変異または重鎖突然変異とそれぞれ移植（マウス）ＣＤＲ Ｌ３またはＣＤＲ Ｈ３を含有する２つのライブラリーを調製した。全般的に、アミノ酸残基は、抗体９１１軽鎖および重鎖アミノ酸配列のヒト生殖系抗体配列とのアライメントに基づいて、ヒト抗体においてより一般的である残基へ改変した。野生型（未置換）アミノ酸残基もこのライブラリーに表れたが、ＣＤＲ Ｈ２の残基５０、メチオニンは例外であり、野生型メチオニンはこのライブラリーに表れなかった。メチオニン残基を酸化に処し；それにより、この残基の置き換えは、生じる抗体の安定性を改善することが期待された。上記に記載のように、ＦａｂのライブラリーをベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ＋ヒトＣＨ１およびＣκ領域へクローニングした。
表２：
１．重鎖Ｈ１／Ｈ２ライブラリー：
ＣＤＲ−Ｈ１
Ｉ３４をＦ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、またはＩへ変えた。
Ｎ３５をＮ、Ｔ、Ｓ、またはＹへ変えた。
ＣＤＲ−Ｈ２
Ｍ５０を全２０の天然アミノ酸へ変えた。
Ａ６２をＡまたはＳへ変えた。
Ｌ６３をＬまたはＶへ変えた。
２．軽鎖Ｌ１／Ｌ２ライブラリー
ＣＤＲ−Ｌ１
Ｓ２６をＳ、Ａ、Ｖ、またはＦへ変えた。
Ｄ２８をＤ、Ａ、Ｓ、またはＹへ変えた。
Ｈ３２をＨ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、またはＹへ変えた。
ＣＤＲ−Ｌ２
Ｙ５０をＹ、Ｄ、Ａ、またはＳへ変えた。
Ｉ５１をＩ、Ｔ、Ａ、またはＶへ変えた。
Ｆ５４をＦまたはＬへ変えた。
Ｓ５６をＳおよびＴへ変えた。
アフィニティースクリーニング実験では、各ライブラリーを対応のＣＤＲ移植軽鎖または重鎖とさらに対にし（例えば、Ｈ１／Ｈ２ライブラリーをＣＤＲ移植軽鎖と対にした）、抗体を発現させ、製造業者の説明書に従って、そして上記に記載のようにＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ社．ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して、個々のクローンのヒトＮＧＦへのアフィニティーをスクリーニングした。ｋｏｆｆ、ｋｏｎおよびＫＤを決定した。一般に、ほとんどのアフィニティーの変動がｋｏｆｆ速度に見られ、そしてさらにｋｏｆｆ速度は抗体濃度から独立しているので、ｋｏｆｆ速度に基づいて抗体クローンを順位付けた。
結合したクローンの配列を決定して、結合したクローンの配列を表３に示す。
表３：Ｌ１およびＬ２のアミノ酸配列、Ｈ１およびＨ２のアミノ酸配列、およびＨ１／Ｈ２またはＬ１／Ｌ２ライブラリークローンのアフィニティースクリーニングに従って結合したクローンの速度論データ
Figure 0005340724
Figure 0005340724
以下の置換を含有するＣＤＲは、結合を保持した：
ＣＤＲ−Ｈ１
Ｉ３４：Ｓ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＡ−結合。
Ｎ３５：Ｎ、Ｔ、およびＳ−結合。
ＣＤＲ−Ｈ２
Ｍ５０：Ｍ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｌ−結合。
Ａ６２：ＡおよびＳ−結合。
Ｌ６３：ＬおよびＶ−結合。
ＣＤＲ−Ｌ１
Ｓ２６：Ｓ、およびＦ−結合。
Ｄ２８：Ｄ、Ｓ、Ａ、Ｙ−結合。
Ｈ３２：Ｈ、Ｎ、Ｑ−結合。
ＣＤＲ−Ｌ２
Ｙ５０：Ｙ−結合。
Ｉ５１：Ｉ、Ｔ、Ｖ、Ａ−結合。
Ｆ５４：Ｆ−結合。
Ｓ５６：ＳおよびＴ−結合。
結合アフィニティーに概ね基づいて以下の置換を含有するＣＤＲを選択し、単一クローンへ組み合わせて、Ｈ１９−Ｌ１２９と命名した：
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｉ３４Ｌ；Ｎ３５Ｎ（変化なし）
ＣＤＲ−Ｈ２：Ｍ５０Ｉ；Ａ６２Ａ（変化なし）；Ｌ６３Ｖ
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｓ２６Ｓ（変化なし）；Ｄ２８Ｓ；Ｈ３２Ｎ
ＣＤＲ−Ｌ２：Ｙ５０Ｙ（変化なし）；Ｉ５１Ｔ；Ｆ５４Ｆ（変化なし）；Ｓ５６Ｓ（変化なし）。
これらの突然変異を（ＨおよびＬ鎖をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物およびベクター（ｐＲＮ８）を制限酵素で切断して、３断片ライゲーションを実施することによって）単一クローンへ組み合わせ、Ｈ１９−Ｌ１２９と命名した（これには、移植したＨ３およびＬ３ ＣＤＲも含まれた）。Ｈ１９−Ｌ１２９の重鎖および軽鎖可変領域の配列を図１Ａおよび１Ｂに示し、そして表４は、ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１およびＨ２アミノ酸配列を示す。Ｈ１９−Ｌ１２９は、本明細書に記載のＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して決定するように、ＮＧＦへほぼ１ｎＭのＫＤで結合した。
表４：ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１およびＬ２のアミノ酸配列と、組合せクローン、Ｈ１９−Ｌ１２９の速度論データ
Figure 0005340724
（４）Ｈ３およびＬ３ ＣＤＲのアフィニティー成熟化。Ｈ３およびＬ３ ＣＤＲのアフィニティー成熟化を２つの工程で行った。最初に、「ライブラリースキャニング突然変異誘発」と呼ぶ方法において、突然変異がヒトＮＧＦへの結合アフィニティーの増加をもたらすアミノ酸位置を同定するために、Ｈ３およびＬ３中の各アミノ酸残基を個別にプレスクリーニングした。このライブラリースキャニング突然変異誘発（「小ライブラリー無作為化分析」とも呼ばれる）の結果に基づいて、Ｈ３およびＬ３中のアミノ酸位置の亜集合をアフィニティー成熟化ライブラリーの調製用に選択し、このアフィニティー成熟化ライブラリーについて、本明細書に記載のＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して、ヒトＮＧＦへのアフィニティーをスクリーニングした。上記の技術は、一般的に適用可能であると理解される。
（ａ）ライブラリースキャニング突然変異誘発
Ｈ３およびＬ３ ＣＤＲ中のそれぞれのアミノ酸位置について、ヒトＮＧＦへの結合アフィニティーの増加をもたらす置換を個別にプレスクリーニングした。改善結合、同じ結合、悪化結合、または無結合をもたらす、所与の位置でのアミノ酸置換の頻度により、多くの異なるアミノ酸（全２０のアミノ酸が含まれる）へ変化可能であるＣＤＲ中の位置と、変化可能でないかまたはわずかなアミノ酸へのみ変化可能であるＣＤＲ中の位置に関する情報を得た。結合アフィニティーの増加をもたらすアミノ酸置換も同定した。このスクリーニングの結果に基づいて、ＣＤＲ Ｈ３およびＬ３中のアミノ酸位置の亜集合をアフィニティー成熟化ライブラリーの調製用に選択した。
Ｌ３およびＨ３ ＣＤＲの各アミノ酸を全２０のアミノ酸へ１回に１つ無作為化した個別のＦａｂライブラリーを調製し、いくつかの（軽鎖については５ライブラリーで、重鎖については１３ライブラリー）小ライブラリーを得た（それぞれに各アミノ酸位置で２０のアミノ酸の可能性の複雑性がある）。すべての場合において、ネイティブ（即ち、不変の）アミノ酸がライブラリーに表れた。１つのアミノ酸位置に２０の可能なアミノ酸が含まれるように無作為化するためにドーピングコドンのＮＮＫを使用して、Ｋａｙら．（１９９６）「ペプチドおよびタンパク質のファージディスプレイ：実験マニュアル（Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」サンディエゴ、アカデミックプレス（２７７〜２９１頁を参照のこと）に記載のように、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲカセット突然変異誘発によりライブラリーを作製した。８Ｌ２−６Ｄ５（フレームワーク突然変異Ｖ７１Ｋを有する、ＣＤＲ移植抗体）は、ライブラリー構築の鋳型として役立った。このＣＤＲ移植抗体のより低いアフィニティーにより、スクリーニングの間に、Ｈ３およびＬ３突然変異体のアフィニティーの差異のより容易な検出が可能になるからである。このように、ライブラリーの各メンバーは、１つのアミノ酸置換があるＣＤＲ３（Ｈ３またはＬ３のいずれか一方）と５つの移植ＣＤＲを含有した。
それぞれの小ライブラリーからの２０〜８０クローンについて、本明細書に記載のＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用してスクリーニングした。試料について、ＢＩＡｃｏｒｅによって、ＢＩＡｃｏｒｅチップの１つのチャネルにおけるＮＧＦへの結合アフィニティーと、（重鎖のＣ末端でのｈｉｓタグを検出する）センサーチップの別のチャネルにおけるペンタｈｉｓタグへ結合することによるＦａｂの存在を同時に分析した。ｋｏｆｆを分類に使用して、タンパク質を発現するクローンを、同じアフィニティー、悪化アフィニティー、良化アフィニティー、または無結合を有するものとして分類した。この分析の結果を表５に示す。
表５．タンパク質を発現するクローンを、ｋｏｆｆに基づいて、同じアフィニティー、悪化アフィニティー、良化アフィニティー、または無結合を有するものとして分類した。
Figure 0005340724
アフィニティー改善したすべてのクローンの配列を決定し、アフィニティー増加をもたらすアミノ酸置換の頻度および本体を明らかにした。さらに、８ｌ２−６Ｄ５クローンに類似したアフィニティーを保持するいくつかのクローンを各ライブラリーより選択して、その置換により必ずしも結合アフィニティーが増加しなくても、所与の位置で許容されるアミノ酸配列置換を確認した。この分析の結果を表６に要約する。
表６
Figure 0005340724
いくつかの突然変異は、結合アフィニティーの増加をもたらした。少なくとも以下の突然変異は、８Ｌ２−６Ｄ５鋳型と比較して有意に増加した結合アフィニティーをもたらした：（Ｈ＿Ｙ１０１Ｗ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＷＹＧＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号４６））；Ｈ＿Ｓ１０５Ａ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＹＹＧＴＡＹＹＦＤＹ（配列番号４７））；Ｈ＿Ｓ１０５Ｔ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＹＹＧＴＴＹＹＦＤＹ（配列番号４８））；Ｈ＿Ｇ１０３Ａ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＹＹＡＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号４９）；およびＬ＿Ｓ９１Ｅ（ＣＤＲ配列ＱＱＥＫＴＬＰＹＴ（配列番号５０））。
この実験の結果を使用して、アフィニティー成熟化ライブラリーの作製用のアミノ酸位置の選択を導いた。
この実験はまた、表５に示すように、改善結合、同じ結合、悪化結合、または無結合をもたらす、あらゆる所与の位置でのアミノ酸置換の頻度に関する情報を提供した。この情報は、多くの異なるアミノ酸（全２０のアミノ酸が含まれる）へ変化可能であるＣＤＲ中のアミノ酸位置と、少数のアミノ酸またはごく少数のアミノ酸（いくつかの態様では、アミノ酸なし）へ変化可能であるＣＤＲ中の位置の同定を可能にした。上記の結果はまた、結合アフィニティーを高めるアミノ酸置換を実証した。
（ｂ）アフィニティー成熟化
次に、小ライブラリー無作為化分析の結果（上記）を使用して、Ｈ３およびＬ３ ＣＤＲのアフィニティー成熟化へのＨ３およびＬ３ライブラリーの産生のために残基を選択した。Ｈ３およびＬ３ ＣＤＲのアフィニティー成熟化へのＨ３およびＬ３ライブラリーの産生のために、ＣＤＲ Ｈ３の残基Ｙ１０１およびＧ１０３とＣＤＲ Ｌ３の残基Ｓ９１およびＫ９２を選択した。
このライブラリーは、ＣＤＲ−移植クローン８Ｌ２−６Ｄ５では同時に、そしてＨ１９−Ｌ１２９のバックグラウンドでは別々に、Ｈ３およびＬ３中の突然変異を組み合わせて、８０の異なるクローンの多様性を有した。表７は、置換のために選択したアミノ酸残基と、各位置で置換したアミノ酸を示す。
表７．置換のために選択したＨ３およびＬ３中のアミノ酸残基と、各位置で置換したアミノ酸
ＣＤＲ Ｈ３：
Ｙ１０１をＹおよびＷ、Ｃへ変えた（Ｃを含めたのは、１つの縮重オリゴヌクレオチドにおけるコドンＴＲＳの使用もコドンＣを産生するためであることに留意すること）。
Ｇ１０３をＡ、Ｐ、Ｓへ変えた。
ＣＤＲ Ｌ３：
Ｓ９１をＥへ変えた。
Ｋ９２を全２０のアミノ酸へ変えた。Ａ、Ｒ、Ｋ、およびＨが結合性であった。
各ポリペプチドをＦａｂとして発現させ、ＢＩＡＣＯＲＥ分析を製造業者の説明書に従って、そして上記に記載のように使用して、各ライブラリーについて、９６の個別クローンのヒトＮＧＦへのアフィニティーをスクリーニングした。この分析の結果を表８に示す。
表８
Figure 0005340724
結合アフィニティーに基づいて、最良のクローン、Ｅ３（交換可能的に「３Ｅ」と呼ぶ）と３Ｃをさらなる特性決定のために選択した。Ｅ３は、以下のＣＤＲ置換を含み：ＣＤＲ Ｈ３：Ｙ１０１Ｗ、Ｇ１０３Ａ；および、ＣＤＲ Ｌ３：Ｓ９１Ｅ、Ｋ９２Ｈ（これらは、単一のクローン中へ組み合わせる）、以下のＬ１、Ｌ２、Ｈ１およびＨ２突然変異も含まれた：
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｉ３４Ｌ；
ＣＤＲ−Ｈ２：Ｍ５０Ｉ；Ｌ６３Ｖ；
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｄ２８Ｓ；Ｈ３２Ｎ；
ＣＤＲ−Ｌ２：Ｉ５１Ｔ。
Ｅ３の重鎖および軽鎖可変領域の配列を図１Ａおよび１Ｂに示す。３Ｃは、以下のＣＤＲ置換を含み：ＣＤＲ Ｌ３：Ｓ９１Ｅ；Ｋ９２Ｒ；ＣＤＲ Ｈ３：Ｙ１０１Ｗ；Ｇ１０３Ａ（これらは、単一のクローン中へ組み合わせる）、クローン３Ｅについて記載したＬ１、Ｌ２、Ｈ１およびＨ２の突然変異も含まれた。
３Ｅおよび３Ｃの配列を、Ｆａｂおよび全長抗体の産生のために哺乳動物の発現ベクターへクローニングして、ＨＥＫ２９３細胞において発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡまたはプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。純粋なタンパク質をアミノ酸分析によって正確に定量した。
ＢＩＡｃｏｒｅ分析を製造業者の説明書に従って、そして上記に記載のように使用して（但し、再結合効果を防ぐために、１００ＲＵ ＮＧＦをチップ上で使用した）、Ｆａｂ Ｅ３および３ＣのヒトＮＧＦに対する結合アフィニティーを測定した。簡潔に言えば、１００ＲＵの固定化ヒトＮＧＦがその上にあるＣＭ５チップ上へいくつかの濃度の抗体（Ｆａｂｓ）を２分間注入して、１８００秒の間解離させた。対照としてマウス抗体９１１（Ｆａｂ）を分析した。ＢＩＡ評価ソフトウェアを製造業者の説明書に従って使用して、データを分析した。抗体Ｅ３および９１１の分析の結果を図９および１０に示す。Ｅ３は、ヒトＮＧＦへほぼ０．０７ｎＭのＫＤで（および、約６．０ｅ５Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎと約４．２ｅ−５ｓ−１のｋｏｆｆで）結合した。３Ｃは、ヒトＮＧＦへほぼ０．３５ｎＭのＫＤで（約１．４Ｅ−５のｋｏｆｆで）結合した。対照的に、マウス抗体９１１は、ＮＧＦへ３．７ｎＭのＫＤ、８．４ｘ１０−５ｓ−１のｋｏｆｆと２．２ｘ１０４Ｍｓ−１のｋｏｎで結合した。
抗体Ｅ３（交換可能的に３Ｅと呼ぶ）を、高い結合アフィニティーに基づいて、さらなる分析のために選択した。ＮＧＦ受容体、ｔｒｋＡおよびｐ７５とＮＧＦの相互作用を妨げるＥ３の能力を検証するために、２．５ｎＭのヒトＮＧＦを０〜５０ｎＭの抗体Ｅ３（Ｆａｂ）と予め混合して、１時間インキュベートした。このインキュベーションの後で、２６０ＲＵのｐ７５（チャネル２）と６００ＲＵのｔｒｋＡ（チャネル３）を含有するＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップ上に１０μｌ／分で試料を注入して、結合（パーセント）を決定した。この分析の結果を図１１に示す。増加濃度のＦａｂ Ｅ３は、減少シグナル（ＲＵで測定する）により示されるように、ｐ７５およびｔｒｋＡの両方とＮＧＦの相互作用を阻止して、Ｆａｂ Ｅ３がｔｒｋＡおよびｐ７５の両方とヒトＮＧＦの相互作用を阻止することを示した。抗体Ｅ３（Ｆａｂ）濃度がＮＧＦ濃度に等しい場合（約２．５ｎＭ ＮＧＦ濃度で）、ＮＧＦ結合は、（０のシグナルによって示すように）観察されなかった。ＮＧＦの濃度が抗体３Ｅ濃度に等しいときに０パーセントのＮＧＦ−受容体結合が起こるという事実は、２．５ｎＭ ＮＧＦがＥ３のＮＧＦへのｋＤと平衡時より少なくとも１０倍高いことを示唆した。
実施例２：マウスＥ１３．５三叉神経ニューロン生存アッセイを使用する、抗ＮＧＦ抗体のＮＧＦ阻止能力の評価
ＮＧＦ活性を阻止するＦａｂ Ｅ３または全長抗体Ｅ３の能力を、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する抗体の能力の測定によって評価した。三叉神経節は、顔の部位を神経支配する皮膚感覚ニューロンからなる。マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンの生存は、これらニューロンの生存を支援するためにＮＧＦが必要とされるので、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のＮＧＦ阻止活性を評価するための鋭敏なアッセイとなる。例えば、飽和濃度のＮＧＦでは、生存が培養４８時間までに１００％へ近づく。対照的に、ＮＧＦの非存在下で４８時間まで生存するのは、このニューロンの５％未満である。
この生存アッセイを以下のように行った：時間交配（ｔｉｍｅ ｍａｔｅｄ）した妊娠スイス・ウェブスター雌マウスをＣＯ２吸入により安楽死させた。子宮角を取り出して、胚性期Ｅ１３．５の胚を摘出して断頭した。電解的に鋭利化したタングステン針を使用して、三叉神経節を切り離した。次いで、この神経節をトリプシン処理し、機械的に解離させて、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンでコートした９６ウェルプレート中の規定の無血清培地において２００〜３００細胞／ウェルの密度でプレート培養した。
この三叉神経ニューロンへ様々な用量の抗ＮＧＦ抗体、Ｍａｂ９１１（Ｆａｂ）、８Ｌ２−６Ｄ５；Ｈ１９−Ｌ１２９；Ｅ３および３Ｃと、ヒトまたはラットのＮＧＦを以下の濃度で加えることによって、抗ＮＧＦ Ｆａｂまたは抗体の阻止活性を評価した：０．４ｎｇ／ｍｌ（約１５ｐＭ；この濃度は、ＮＧＦの生存の飽和濃度を表した）および０．０４ｎｇ／ｍｌ（約１．５ｐＭ；この濃度は、ほぼＩＣ５０である）。４８時間の培養後、この細胞を、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ液体処理ワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で以下のように実施する自動化免疫細胞化学プロトコールへ処した：４％ホルムアミド、５％スクロース、およびＰＢＳを使用する固定；ＰＢＳ中０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用する浸透化；ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清、０．１１％ ＢＳＡを使用する、非特異結合部位の阻止；および、ニューロンを検出する一次および二次抗体との連続インキュベーション。一次抗体は、タンパク遺伝子産物、８９．５（ＰＧＰ９．５，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、確立されたニューロン表現型マーカーに対するウサギポリクローナル抗体であった。二次抗体は、培養液中に存在するすべての細胞の核を標識する核色素、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）であった。イメージ獲得とイメージ分析は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−Ｉ／ＧｅｎＩＩ Ｉｍａｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で実施した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２について２つの波長でイメージを自動的に獲得し、ウェルのすべてで核染色が存在するので、この核染色をＩｍａｇｅｒのイメージベース自動焦点システムの基準点とした使用した。各ウェルの表面全体をカバーするために、各ウェルにつきイメージ化するのに適正な目標および部位数を選択した。４８時間培養後に各ウェルに存在するニューロンの数を抗ＰＧＰ９．５抗体での特異的な染色に基づいてカウントするように、自動イメージ分析を設定した。イメージの慎重な境界設定（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）と形態および蛍光強度に基づく選択フィルターの適用により、各ウェルの正確なニューロン数を得た。
この実験の結果は、Ｆａｂ Ｅ３がＮＧＦ活性を高いアフィニティーで阻止することを実証した。この結果を図４〜６と表９に示す。
図４は、様々な濃度のヒトおよびラットＮＧＦの存在下におけるＥ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を示すグラフである。
図５は、０．０４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（ほぼ１．５ｐＭ；下のパネルに示す）または０．４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（ほぼ１５ｐＭ；上のパネルにに示す）のいずれかの存在下における、様々なＦａｂのＮＧＦ阻止効果を比較するグラフである。１．５ｐＭのＮＧＦが生存を促進するＮＧＦのＥＣ５０にほぼ等しいのに対し、１５ｐＭは、ＮＧＦの飽和濃度を表した。様々な濃度のＦａｂ Ｅ３；マウス９１１ Ｆａｂ；およびＦａｂ Ｈ１９−Ｌ１２９およびＦａｂ ８Ｌ２−６Ｄ５におけるＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存を上記の記載のように評価した。それぞれのＦａｂについてそれぞれのＮＧＦ濃度でＩＣ５０を（ｐＭで）計算して、表９に示す。Ｆａｂ Ｅ３は、１５ｐＭヒトＮＧＦの存在下でほぼ２１ｐＭのＩＣ５０、そして１．５ｐＭヒトＮＧＦの存在下でほぼ１．２ｐＭのＩＣ５０で、ヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロン生存を強く阻止した。Ｆａｂ ３ＣおよびＨ１９−Ｌ１２９も、ヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロン生存を強く阻止した。
図６は、０．０４ｎｇ／ｍｌのラットＮＧＦ（ほぼ１．５ｐＭ；下のパネルに示す）または０．４ｎｇ／ｍｌのラットＮＧＦ（ほぼ１５ｐＭ；上のパネルに示す）のいずれかの存在下における、様々なＦａｂのＮＧＦ阻止効果を比較するグラフである。１．５ｐＭのＮＧＦがほぼＥＣ５０であるに対し、１５ｐＭは、ＮＧＦの飽和濃度を表した。様々な濃度のＦａｂ Ｅ３；マウス９１１ Ｆａｂ；およびＦａｂ Ｈ１９−Ｌ１２９およびＦａｂ ８Ｌ２−６Ｄ５におけるＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存を上記の記載のように評価した。それぞれのＦａｂについてそれぞれのＮＧＦ濃度でＩＣ５０を（ｐＭで）計算して、表９に示す。Ｆａｂ Ｅ３は、１５ｐＭラットＮＧＦの存在下でほぼ３１．６ｐＭのＩＣ５０、そして１．５ｐＭラットＮＧＦの存在下でほぼ１．３ｐＭのＩＣ５０で、ラットＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロン生存を強く阻止した。Ｆａｂ ３ＣおよびＨ１９−Ｌ１２９も、ラットＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロン生存を強く阻止した。
表９：
Figure 0005340724
異なる実験において、我々は、０．４ｎｇ／ｍｌ（飽和濃度）のヒトＮＧＦの存在下でＥ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を阻害する、全長抗体Ｅ３およびＦａｂ ３Ｅの能力を比較した。この分析の結果を図１２に示す。全長抗体Ｅ３およびＦａｂ ３Ｅは、全抗体とＦａｂの濃度をＮＧＦ結合部位の数（Ｆａｂは、１つの結合部位を有し、全抗体は、２つの結合部位を有する）へ正規化するときに、ＮＧＦ依存性の生存へ類似レベルの阻害を示した。これらの結果は、全長抗体のＮＧＦ二量体への結合によるアビディティ効果がないことを実証した。
別の実験において、我々は、様々な濃度（２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、０．００６４、０．００１２８、および０．０ｎＭ）の抗体Ｅ３、抗体９１１、およびｔｒｋＡ受容体イムノアドヘシン（免疫グロブリンＦｃドメイン、ＣＨ２−ＣＨ３と縮合したＮＧＦ受容体ｔｒｋＡの細胞外ドメインからなる）が０．４ｎｇ／ｍｌ（飽和条件）の存在下でＥ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を阻害する能力を比較した。これらの結果を図１３に示す。これらの結果は、抗体Ｅ３が抗体９１１またはｔｒｋＡイムノアドへシンのいずれよりも良好にＮＧＦを阻止することを実証した。
実施例３：マウス三叉神経および結節ニューロン生存アッセイを使用する、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の特異性の評価
飽和濃度のＮＧＦ、ＮＧＦ関連ニュートロフィンのＮＴ３、またはＮＧＦ非関連の神経栄養因子、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）の存在下にマウスＥ１７／１８三叉神経ニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏ生存を阻害する抗体の能力の測定によって、ＮＧＦ活性を特異的に阻止する抗体Ｅ３の能力を評価した。マウスＥ１７／１８三叉神経ニューロンの生存は、これらのニューロンの生存を支援するのに、Ｅ１３．５ ＴＧニューロンの生存を支援するために必要とされるＮＧＦのレベルより高い濃度でＮＧＦが必要とされるので、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のＮＧＦ阻止活性を評価するための鋭敏なアッセイになる。これらのニューロンの生存はまた、ＮＴ３またはＭＳＰにより支援されるので、これらのニューロンの生存も、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体がＮＴ３またはＭＳＰも阻止するかどうかを評価するのに鋭敏なアッセイになる。
ＮＧＦ活性を特異的に阻止する抗体Ｅ３の能力も、飽和濃度のＢＤＮＦまたはＮＴ４／５の存在下にマウス結節Ｅ１７ニューロンの生存を阻害する抗体の能力の測定によって評価した。結節ニューロンの生存がＢＤＮＦまたはＮＴ４／５により支援されるので、これらのニューロンの生存は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のＢＤＮＦまたはＮＴ４／５阻止能力を評価するための鋭敏なアッセイになる。
この生存アッセイは、以下のように行なった：時間交配した妊娠スイス・ウェブスター雌マウスをＣＯ２吸入により安楽死させた。子宮角を取り出して、胚（１７または１８日目の胚）を摘出して断頭した。三叉および結節神経節を切り離して、清浄化した。次いで、この神経節をトリプシン処理し、機械的に解離させて、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンでコートした４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の規定の無血清培地において１００〜３００細胞／ウェルの密度でプレート培養した。
神経栄養因子を添加しない（陰性対照）か、または飽和濃度のヒトＮＧＦ（４００ｐＭおよび１５ｐＭ）（陽性対照）；ＮＴ３（４００ｐＭ）；またはＭＳＰ（６００ｐＭ）の存在下のいずれかでＥ１７／１８三叉神経ニューロンを増殖させた。変動濃度のＥ３および９１１ Ｆａｂおよび全長抗体が含まれる同一２検体の培養物を設定した。Ｆａｂおよび全長抗体の濃度は、結合部位あたりで示した（例えば、全長抗体が２つの結合部位を含有する一方で、Ｆａｂは１つの結合部位を含有する）。
添加する神経栄養因子の非存在下（陰性対照）か、または飽和濃度のＢＤＮＦ（４００ｐＭ）（陽性対照）またはＮＴ４／５（４００ｐＭ）またはＮＧＦ非関連増殖因子のＩＬＦ（インターロイキン阻害因子）と一緒のいずれかでＥ１７結節ニューロンを増殖させた。この実験の目標が抗体の特異性を検証することであったので、高濃度のニュートロフィンを使用した。様々な濃度の抗体Ｅ３および９１１の添加を伴うかまたは伴わない、同一２検体の培養物を設定した。４８時間の培養後、各条件の下でそれぞれのウェルに生存しているニューロンの全数を、位相差顕微鏡を使用する手動カウンティングによって確認した。
上記の実験の結果は、Ｅ３および９１１抗体がＥ１８三叉神経ニューロンに対するＮＧＦの生存促進効果を完全に阻止することを実証した。対照的に、Ｅ３および９１１抗体は、ＮＴ３またはＭＳＰにより促進される三叉神経ニューロンの生存や、ＢＤＮＦまたはＮＴ４／５またはＬＩＦにより促進される結節ニューロンの生存に対しては効果がなかった。これらの結果は、上記抗体と他のＮＧＦ関連ニュートロフィン（ＮＴ３、ＮＴ４／５、ＢＤＮＦ）の間には、ＮＧＦ阻止に有効な濃度より１０００倍〜１０，０００倍高い濃度でも検出される相互作用がなかったので、抗体Ｅ３がＮＧＦへの選択特異性を保有することを実証した。さらに、これらの結果は、ＮＧＦ依存性ニューロンのＮＧＦ補充培養物において抗体またはＦａｂ Ｅ３の添加時に見られるニューロン死が、これら抗体とＮＧＦの間の特異的な相互作用によるのであって、一般化される毒性効果によるものではないことを実証した。マウス抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体９１１も検査して、同様の結果を観察した。これらの抗体のＮＧＦへの結合アフィニティーの違いは、上記の条件下ではさほど明らかでないので、高濃度のニュートロフィンの使用により、抗体Ｅ３と９１１がともにその滴定条件へきわめて近づいて、ＮＧＦへ類似のレベルで結合すると予測されたことに留意すること。
これらの実験の結果を図１４、１５、１６、および１７に示す。このデータは、４８時間の培養後の、各実験の陽性対照で見られる生存（例えば、それぞれ、飽和ＮＧＦ濃度の存在下で増殖させた三叉神経ニューロンの１００％生存と、飽和ＢＤＮＦ濃度の存在下で増殖させた結節ニューロンの１００％生存）に対する平均生存パーセント（平均±標準誤差、各データ点でｎ＝３）を示した。図１４〜１５は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３またはＦａｂ Ｅ３が、２００ｎＭほど高い抗体濃度でも、ＮＴ３やＭＳＰにより促進される生存を阻害しなかったことを示すグラフである。対照的に、２０ｎＭの抗体Ｅ３またはＦａｂ ３ＥおよびＦａｂ ９１１は、ＮＧＦ誘発性の生存を完全に阻止した。マウス抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体９１１も検査して、同様の結果を観察した。具体的には、図１４は、無添加ニュートロフィン（「対照」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＮＧＦ（「ＮＧＦ−４００ｐＭ」と呼ぶ）、１０ｎＭ ＮＴ３（「ＮＴ３−１０ｎＭ」と呼ぶ）、または６００ｐＭ ＭＳＰ（「ＭＳＰ−６００ｐＭ」と呼ぶ）の存在下におけるＥ１８三叉神経ニューロンの生存に及ぼす、様々な濃度（２０ｎＭ、２ｎＭ、または０．２ｎＭ）のＥ３ Ｆａｂ（図で「３Ｅ」と呼ぶ）およびマウス抗体９１１ Ｆａｂの効果の比較を示すグラフである。図１５は、無添加ニュートロフィン（「無因子」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＮＧＦ（「ＮＧＦ−４００ｐＭ」と呼ぶ）、１０ｎＭ ＮＴ３（「ＮＴ３−１０ｎＭ」と呼ぶ）、または６００ｐＭ ＭＳＰ（「ＭＳＰ−６００ｐＭ」と呼ぶ）の存在下におけるＥ１７三叉神経ニューロンの生存に及ぼす、様々な濃度（２００ｎＭおよび８０ｎＭ）のＥ３ Ｆａｂおよび全長抗体とマウス抗体９１１全長抗体およびＦａｂの効果の比較を図示するグラフである。
図１６〜１７は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３またはＦａｂ Ｅ３がＢＤＮＦ、ＮＴ４／５またはＬＩＦにより促進されるＥ１７結節ニューロンの生存を阻害しなかったことを示すグラフである。マウス抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体９１１も検査して、同様の結果を観察した。具体的には、図１６は、無添加ニュートロフィン（「無因子」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＢＤＮＦ（「ＢＤＮＦ−４００ｐＭ」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＮＴ４／５（「ＮＴ４／５−４００ｐＭ」と呼ぶ）、または２．５ｎＭ ＬＩＦ（「ＬＩＰ−２．５ｎＭ」と呼ぶ）の存在下におけるＥ１７結節ニューロンの生存に及ぼす、様々な濃度（２００ｎＭまたは８０ｎＭ）の全長抗体Ｅ３（図で「３Ｅ」と呼ぶ）、Ｆａｂ Ｅ３、全長抗体、またはＦａｂ ９１１の効果の比較を示すグラフである。図１７は、無添加ニュートロフィン（「対照」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＢＤＮＦ（「ＢＤＮＦ−４００ｐＭ」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＮＴ４／５（「ＮＴ４／５−４００ｐＭ」と呼ぶ）、または２．５ｎＭ ＬＩＦ（「ＬＩＰ−２．５ｎＭ」と呼ぶ）の存在下におけるＥ１７結節ニューロンの生存に及ぼす、様々な濃度（２００ｎＭ、２０ｎＭ、２ｎＭ）のＦａｂ Ｅ３（図で「３Ｅ」と呼ぶ）、またはＦａｂ ９１１の効果の比較を示すグラフである。
実施例４：哺乳動物発現ベクターの調製と哺乳動物細胞における抗体Ｅ３の発現
哺乳動物細胞における抗体Ｅ３の発現における使用のために３つの哺乳動物発現ベクターを設計して構築した。
ベクターＤｂ．９１１．３Ｅは、Ｅ３抗体の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ２ａ定常領域を含んでなる発現ベクターであり、重鎖の一過性または安定発現に適している。Ｄｂ．９１１．３Ｅは、以下の領域に対応するヌクレオチド配列からなる：マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド１〜６１２）；合成イントロン（ヌクレオチド６１９〜１５０７）；ＤＨＦＲコード領域（ヌクレオチド７０７〜１２６７）；ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１５２５〜１６０２）；抗体３Ｅ重鎖可変領域（ヌクレオチド１６０３〜１９６５）；以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１→Ｓ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列を基準にするアミノ酸番号付け；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４を参照のこと）を含有するヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域；ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド２９７４〜３２１７）；ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド３２１８〜３４６３）；ファージｆ１領域（ヌクレオチド３５５１〜４００６）、およびβ−ラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド４４４３〜５３００）。Ｄｂ．９１１．３Ｅは、２００３年１月８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入れ番号ＰＴＡ−４８９５を割り当てられた。
ベクターＥｂ．９１１．３Ｅは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域とヒトκ鎖定常領域を含んでなる発現ベクターであり、軽鎖の一過性発現に適している。Ｅｂ．９１１．３Ｅは、以下の領域に対応するヌクレオチド配列からなる：マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド１〜６１２）；ヒトＥＦ−１イントロン（ヌクレオチド６１９〜１１４２）；ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１１４３〜１１５０）；抗体Ｅ３軽鎖可変領域（ヌクレオチド１２５１〜１５７１）；ヒトκ鎖定常領域（ヌクレオチド１５７２〜１８９２）；ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド１９１０〜２１５３）；ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド２１５４〜２３９９）；ファージｆ１領域（ヌクレオチド２４８７〜２４９２）、およびβ−ラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド３３７９〜４２３６）。Ｅｂ．９１１．３Ｅは、２００３年１月８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入れ番号ＰＴＡ−４８９３を割り当てられた。
ベクターＥｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域とヒトκ鎖定常領域を含んでなる発現ベクターであり、軽鎖の安定発現に適している。Ｅｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅは、以下の領域に対応するヌクレオチド配列からなる：マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド１〜６１２）；ヒトＥＦ−１イントロン（ヌクレオチド６１９〜１７５８）；ｐａｃ遺伝子（ピューロマイシンＲ）コード領域（ヌクレオチド７３９〜１２３５）；ヒトｈｓｐ７０ ５’ＵＴＲ領域（ヌクレオチド１７７１〜１９７３）；ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１９８５〜２０６２）；抗体Ｅ３軽鎖可変領域（ヌクレオチド２０６３〜２３８３）；ヒトκ鎖定常領域（ヌクレオチド２３８４〜２７０４）；ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド２７２２〜２９６５）；ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド２９６６〜３２１１）；ファージｆ１領域（ヌクレオチド３２９９〜３６４５）、およびβ−ラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド４１９１〜５０４８）。Ｅｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅは、２００３年１月８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受入れ番号ＰＴＡ−４８９４を割り当てられた。
一過性の細胞発現は、以下のように実施した：１５０ｍｍディッシュ中のＣＨＯおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２５μｇの各プラスミド（即ち、重鎖を含有する１つのプラスミドと軽鎖を含有する１つのプラスミド）で一過的に同時トランスフェクトした。製造業者の説明書に従って、ＤＮＡを１００μｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。このＤＮＡ−脂質複合体を、血清も抗生物質も含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において上記細胞とそのまま５時間接触させた。このインキュベーションに続いて、発現のために、添加物のないＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ培地を２日間変更した。引き続き培地を交換して、抗体を含有する細胞上清を連続的に４回まで採取した。ＭａｐＳｅｌｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（アマーシャム・バイオサイエンス １７−５１９９−０２）を使用して、上清をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。抗体を０．３Ｍグリシン、０．６Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８）においてプロテインＡ樹脂へ結合させてから、０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ３）で溶出させた。抗体含有分画を１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）ですぐに中和してから、抗体分画を透析して、ＰＢＳ中で濃縮した。
実施例５：抗ＮＧＦ抗体Ｅ３は、術後疼痛を治療するのに有効である。
我々は、術後疼痛を模倣する疼痛モデルを使用して、抗体Ｅ３での治療の効果を評価した。抗体Ｅ３は、以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１→Ｓ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列を基準にするアミノ酸番号付け；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４を参照のこと）を含有するヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域；ヒト軽鎖κ定常領域；および、表１Ａおよび１Ｂに示す重鎖および軽鎖可変領域を含んだ。
動物。２２０〜２４０グラムの体重の雄性スプリーグ・ドーリーラットをＨａｒｌａｎ（ウィスコンシン州）より購入して、術前１週間の間、動物施設へ馴化させた。
手術。手術は、Ｂｒｅｎｎａｎら．Ｐａｉｎ ６４：４９３−５０１（１９９６）により記載される手技に基づいた。空気混合物中２％イソフルラン（手術の間、鼻コーンを介して維持する）で動物を麻酔した。右後足の平らな表面をポビドン−ヨウ素パッドで準備して、皮膚および筋膜を通して、踵先端より０．５ｃｍで始めて爪先に向かって伸びる、１ｃｍの縦中央切開を施した。足を曲げた位置に固定した状態でルーラーを用いて測定した。湾曲鉗子を使用して足底筋を持ち上げて、縦方向に切開した。筋肉は、起点と挿入部の間をその最深部まで切開した。手術全体を通して、ガーゼパッドより圧力をかけて出血を抑えた。創傷部は、２つのさし縫い縫合（５−０エチロンブランク（ｅｔｈｉｌｏｎ ｂｌａｃｋ）単繊維）で閉じた。縫合糸は５〜６回結び目を作り、最初の結び目はゆるく締めた。創傷部位にバシトラシン溶液を塗布した。動物をそのまま回復させて、清潔なケージに２時間以上落ち着かせた後で、行動検査を開始した。
安静時疼痛の評価。累積疼痛スコアを使用して、体重忍耐（ｂｅａｒｉｎｇ）に関連した疼痛を評価した。清潔なプラスチックケージ中に、基板上でせり上げた（ｈ：１８”）プラスチックメッシュ（グリッド：８ｍｍ２）の上に動物を置いて、足の裏側の視察を可能にした。２０分の馴化時間の後で、体重忍耐を０〜２の尺度で評価した。足が白色化して、メッシュに対して圧をかけて、完全な体重忍耐を示すならば、０のスコアを与えた。足が、皮膚がメッシュにちょっと触れる状態を好み、皮膚の白色化や圧入がなければ、１のスコアを与え、足がメッシュから完全に離れた状態を保つならば、２のスコアを与えた。ラットが依然として安静状態にあっても足を引っ込めることがあれば、２とみなした。各動物について、５分毎に１分の間で、３０分間観察した。半時間の間に得る６回のスコアの合計（０〜１２）を使用して、切開した足の疼痛を評価した。２のスコアの頻度も算出して、重篤な疼痛の発症や、動物による足の完全防御を評価した。各動物について、術前２４時間（ベースライン）と術後２時間、２４時間、４８時間、および７２時間で検査した。この実験の結果を、３５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦマウス抗体９１１で処置した動物において観察された累積の安静時疼痛スコアを図示する図７に示す。これらの結果は、抗ＮＧＦ抗体での処置が術後の安静時疼痛を有意に抑えることを実証した。体重忍耐は、動物が肢を使用する意思とよく相関していたので、疼痛緩和の有効な尺度となった。
Ｅ３抗体は、切開の１５時間前に、様々な濃度の抗体（動物の体重１キログラムにつき０．００４、０．０１、０．０２、０．１、０．６、および１ｍｇ）で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。陰性対照には、抗体を与えず、生理食塩水溶液をｉ．ｐ．注射した。フェンタニル（０．０１ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として、術後２４時間で検査の３０分前にｉ．ｐ．注射した。各実験には、各条件につき８匹の動物（各群につきｎ＝８）が含まれ、対照群は、５６匹の動物を有した。手術を実施して、上記の記載のように累積疼痛スコアを測定した。術後２４時間で安静時疼痛を評価した。
図７に示すように、ヒト化抗ＮＧＦ抗体Ｅ３は、０．０２ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ投与量で投与するとき、術後の安静時疼痛を有意に（ｐ＜０．０５）抑制した。「＊」は、対照からの有意に有意な差（ｐ＜０．０５）を表す。０．０２ｍｇ／ｋｇでの処置は、０．０１ｍｇ／ｋｇのフェンタニルでの処置と少なくとも同じくらい有効に、疼痛行動を緩和した。このフェンタニルの用量は、この強力なオピオイドの正常なヒト用量の１０倍である。
別の実験において、術後投与するときに術後疼痛を抑えるＥ３抗体の効力について検査した。術後２時間で、抗体Ｅ３（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。対照群には抗体を与えず、生理食塩水溶液をｉ．ｖ．注射した。手術を実施して、累積疼痛スコアとして表す安静時疼痛を術後２４時間で評価した。図８に示すように、抗ＮＧＦ抗体での処置は、この抗体を切開後２時間で投与するときに、切開後２４時間での安静時疼痛を有意に（ｐ＜０．０５）抑制した。これらの結果は、Ｅ３抗体が、術後投与するときに、術後疼痛を有効に緩和することを実証した。
実施例６：ラット慢性関節リウマチモデルにおける、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体９１１の鎮痛効果の評価
ラットの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘発性慢性関節炎における抗ＮＧＦ抗体、９１１の鎮痛効果（Ｈｏｎｇｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９（３）：２１５−２２７（２０００）を参照のこと）について、発声検査を使用して、基準物質として使用するインドメタシンとの比較において検討した。
この試験には、実験期の開始時に１５０ｇ〜２２０ｇの体重である５０匹の雄性ルイスラット（ＬＥＷＩＳ ＬＥＷ／Ｃｒｌ Ｉｃｏ）（チャールズリバー、ベルギー）を含めた。すべての動物を実験の前少なくとも５日間飼育して、温度（１９．５〜２４．５℃）、相対湿度（４５〜６５％）、および１２時間の明／暗周期を制御した部屋に収容して、試験全体を通して、濾過水と標準ペレット実験食（Ｕ．Ａ．Ｒ．，フランス）を自由に摂らせた。動物は、１匹ずつ、尾に印をつけた。
０日目（Ｄ０）、牛酪菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）の鉱油懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）の０．０５ｍｌを尾の中へ皮内注射することによって、ラットに関節炎を誘発した。１４日目（Ｄ１４）、後足の穏やかな屈曲時に発声する能力に従って、そして、後足と前足それぞれについて炎症スコアを使用して評価する関節炎指標（Ｋｕｚｕｎａら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）２３：１１８４−１１９１（１９７５）；Ｐｅａｒｓｏｎら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２：４４０−４５９（１９５９）を参照のこと）によって、関節炎動物を試験に含めた。以下の判定基準に基づいて動物をスコア化した：スコア０：正常なアスペクト；スコア１：紅斑；スコア２：軽度浮腫を伴う紅斑；スコア３：強直を伴わない強い炎症；スコア４：強直症。穏やかな屈曲時に発声することが可能で、２または３のスコアを提示する動物だけをこの試験に含めた。
各群１０匹のラットの４群をこの試験に含めた。第１群（担体）では、選択後１４日目（Ｄ１４）に、ラットへ担体（生理食塩水）を静脈内注射した。１８日目（Ｄ１８）に後足の穏やかな屈曲により痛感強度を評価して、各動物について発声レベルの強度を記録した。第２群（４日）では、選択後１４日目にラットへ９１１（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。１８日目（Ｄ１８）に後足の穏やかな屈曲により痛感強度を評価して、各動物について発声レベルの強度を記録した。第３群（２４時間）では、ＣＦＡの注射後１７日目にラットへ９１１（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。２４時間後に後足の穏やかな屈曲により痛感強度を評価して、各動物について発声レベルの強度を記録した。第４群（インドメタシン）では、１８日目（Ｄ１８）に、インドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与後１時間で後足の穏やかな屈曲により痛感強度を評価した。各動物について発声レベルの強度も記録した。試験物質は、５ｍｌ／ｋｇの容量で静脈内経路により、盲検および無作為のやり方で投与したが、インドメタシンは、１０ｍｌ／ｋｇの容量で経口経路により投与した。
抗ＮＧＦ抗体９１１の鎮痛効果を表１０に示す。結果は、各動物についてｍＶ（平均±ＳＥＭ）で記録した発声レベルの強度により評価する痛感強度として各群について表し、痛感強度の変量の百分率は担体処置群の平均値より算出した。処置群と担体群の間の統計学的有意差は、分散の片側分析後の残差分散を使用するＤｕｎｎｅｔｔ検定で決定した（Ｐ＜０．０５）。
表１０．ラットの完全フロイントアジュバント誘発性慢性関節炎における９１１の鎮痛効果
Figure 0005340724
表１０に示すように、抗ＮＧＦ抗体９１１は、ラット慢性関節リウマチモデルにおいて、抗体の単回投与の２４時間または４日後に疼痛を有意に抑制した。
実施例７：ラット慢性関節リウマチモデルにおける、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３および９１１の薬理学的効果
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３および９１１の薬理学的効果（抗炎症および鎮痛効果）について、ラットの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘発性慢性関節炎モデルにおいて、インドメタシンを内部陽性対照物質として使用する比較において検討した。Ｅ３および９１１の鎮痛効果は、痛感応答の測定によって評価した。抗炎症効果については、足容積、関節炎指標（炎症スコア）、体重、および後足重量によって評価した。足サイトカインレベル（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＴＧＦ−β１）、血清中の循環ＴＧＦ−β１、Ｅ３および９１１の血漿濃度、生物学的変数、およびＸ線撮影は、実験の最後に実施した。
実験プロトコール
１．試験デザイン
この試験には、５週齢の８０匹の雄性ルイスラット（ＬＥＷＩＳ ＬＥＷ／Ｉｃｏ）（チャールズリバー・ラボラトリーズ、ベルギー）を含めた。それらを温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）の制御された１２時間の明／暗周期の部屋に収容して、試験全体を通して、濾過水と標準ペレット実験食（ＳＡＦＥ，フランス）を自由に摂らせた。動物施設での受入れ時に、それらを各ケージ５匹で収容して、１０日の馴化期間の間観察した後で試験した。動物は、１匹ずつ、尾に印をつけた。
各群１０匹の動物（５週齢の雄性ルイスラット−ＬＥＷＩＳ Ｌｅｗ／Ｉｃｏ、チャールズリバー・ラボラトリーズ、ベルギーより）の５群をこの試験に含めた：第１群：非関節炎ラット／生理食塩水（担体）、ｉ．ｖ．ボーラス、ｎ＝１０；第２群：関節炎ラット／生理食塩水（担体）、ｉ．ｖ．ボーラス、ｎ＝１０；第３群：関節炎ラット／インドメタシン ３ｍｇ／ｋｇ，ｐ．ｏ．１０日にわたり毎日、ｎ＝１０；第４群：関節炎ラット／Ｅ３、１ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．ボーラス、ｎ＝１０；第５群：関節炎ラット／９１１、１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．ボーラス、ｎ＝１０。用量は、フリーの活性物質（ｍｇ／ｋｇ）で表した。Ｅ３と９１１は、生理食塩水において、ストック溶液より望みの濃度へ用時調製した。Ｅ３ １ｍｇ／ｋｇ：３．４１ｍＬのストック溶液（０．８８ｍｇ／ｍｌ）を１５ｍＬの生理食塩水で希釈する。９１１ １０ｍｇ／ｋｇ：１２ｍＬのストック溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）を１５ｍＬの生理食塩水で希釈する。０．２０μｍの滅菌濾過ユニットを使用して、すべての希釈溶液を（ｉ．ｖ．注射の前に）滅菌した。希釈溶液のｐＨおよび重量モル浸透圧濃度の数値を各ｉ．ｖ．注射の前に測定した。１回目のｉ．ｖ．注射の前、生理食塩水、Ｅ３、および９１１の重量モル浸透圧濃度（ｍｏｓｍ／Ｌ）は、それぞれ２７８、２６９、および３０８であり；生理食塩水、Ｅ３、および９１１のｐＨは、それぞれ５．９３、６．７６、６．７１であった。２回目のｉ．ｖ．注射の前、生理食塩水、Ｅ３、および９１１の重量モル浸透圧濃度（ｍｏｓｍ／Ｌ）は、それぞれ２８０、２７０、および３０９であり；生理食塩水、Ｅ３、および９１１のｐＨは、それぞれ５．８６、６．７２、および６．５９であった。
Ｅ３または９１１または生理食塩水は、関節炎誘発後１４日および１９日目に、コードした無作為の順序で、ｉ．ｖ．ボーラス注射により５ｍＬ／ｋｇの容量で投与した。非関節炎群には、１４日および１９日目に、生理食塩水のｉ．ｖ．ボーラス注射を５ｍＬ／ｋｇの容量で与えた。インドメタシンは、１％メチルセルロースにおいて用時調製した。インドメタシンは、関節炎誘発後１４日目〜２３日目の１０日間にわたり毎日１回、コードした無作為の順序で、経口経路（ｐ．ｏ．）により１０ｍＬ／ｋｇの容量で投与した。
２．関節炎の誘発
０日目（Ｄ０）、０．０５ｍｌの牛酪菌懸濁液の尾への皮内注射によって、７０匹のラットに関節炎を誘発した。１０匹のラットの１群には、皮内注射を与えなかった（非関節炎ラット）。１４日目（Ｄ１４）、以下の判定基準を使用して、本試験に関節炎ラットを含めた：含めたすべてのラットは、非関節炎群の平均足容積（左足容積と右足容積の平均）（足容積の測定については以下に記載する）に比較して、少なくとも０．３０ｍｌの平均足容積（左足容積と右足容積の平均）の増加を表示し；含めたすべてのラットは、穏やかな屈曲時に発声を表示し（痛感応答の測定については以下に記載する）；そして含めたすべてのラットは、それぞれの後足に関して２〜３の関節炎指標のスコアを表示した（関節炎指標の測定については以下に記載する）（０、１、または４のスコアの動物は除外した）。
３．体重
動物は、０日目〜２４日目まで（処置前の週末日：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０を除く）毎日１回秤量した。Ｄ１４（７：３０〜９：００ａｍ）とＤ２４（７：３０〜８：００ａｍ）以外は、すべての測定を９：００と１２：００ａｍの間で実施した。
３．足容積の測定
肢体容積計を使用して、各ラット（関節炎および非関節炎ラット）の右足容積と左足容積を測定した。測定は、以下の時間で実施した（関節炎の誘発後）：１４日目（ｉ．ｖ．ボーラスまたはｐ．ｏ．投与の前）；および２４日目（最後のｉ．ｖ．ボーラス注射から５日後、または最後のｐ．ｏ．投与から２４時間後）。すべての測定を９：００と１２：００ａｍの間で実施した。すべてのデータを回収して、ＷｉｎＤａｓソフトウェアに保存した。
４．関節炎指標
左右の後足および前足（関節炎ラット）について炎症スコアを使用して関節炎指標を評価した：スコア０：正常なアスペクト；スコア１：紅斑；スコア２：軽度浮腫を伴う紅斑；スコア３：強直を伴わない強い炎症；スコア４：強直症。この評価は、以下の時間で実施した（関節炎の誘発後）：１４日目（ｉ．ｖ．ボーラスまたはｐ．ｏ．投与の前）；および２４日目（最後のｉ．ｖ．ボーラス注射から５日後、または最後のｐ．ｏ．投与から２４時間後）。すべての測定を２：００と３：００ｐｍの間（Ｄ１４）、８：００と９：００の間で実施した。すべてのデータを回収して、ＷｉｎＤａｓソフトウェアに保存した。
５．痛感応答の測定（発声検査）
痛感応答は、作業者の指で４〜５秒の間隔で２回繰り返して右および左の後足を穏やかに曲げることによって評価した（関節炎ラット）。各動物について、それぞれの後足につき、発声レベルの強度を記録した（右後足で２回：ｓ１およびｓ３；左後足で２回：ｓ２およびｓ４）。この評価は、以下の時間で実施した（関節炎の誘発後）：１４日目（ｉ．ｖ．ボーラスまたはｐ．ｏ．投与の前）；１８日目（２回目のｉ．ｖ．ボーラス注射またはｐ．ｏ．投与の１時間後）；および２４日目（最後のｉ．ｖ．ボーラス注射から５日後、または最後のｐ．ｏ．投与から２４時間後）。Ｄ１４（７：３０〜９：００ａｍ）とＤ２４（７：３０〜９：００ａｍ）以外は、すべての測定を９：００と１２：００ａｍの間で実施した。
６．Ｅ３または９１１濃度と循環ＴＧＦ−β１および血液学的変数の測定用の血液採取
２４日目（足容積および関節炎指標の測定と発声検査の後で）、イソフルラン（酸素および一酸化窒素の混合物中）を使用する全身麻酔下に、血液試料（約８００〜１０００μｌ）をマイクロピペットでの毛細管作用によって後眼窩より採取した。
Ｅ３または９１１濃度の測定（第２、４および５群）：ヘパリンリチウムを含有する試験管（氷上で維持する）に血液試料の一部を採取して、２５００〜３０００ｇで１０分間遠心分離した。血漿試料（少なくとも１００μＬ）を入手し、液体窒素に凍結させ、−８０℃で保存した。１つの試料がわずかに溶血した（担体−処理関節炎ラット＃３６）。
循環ＴＧＦ−β１の測定（第１−２−３−４−５群）：血液試料の一部を血清調製用ミクロ試験管に周囲温度で採取した。試料採取に続いて、血液を混ぜて、遠心分離に先立ってそのまま３０分間凝固させた。この試験管を約６０００ｇで３分間遠心分離させた。それぞれの血清試料（ラット＃５２および＃５３以外は、少なくとも１００μＬ）を分割して、ＴＧＦ−β１分析用の試料活性化まで−２０℃で保存した。これらのアリコート（５０バイアル）を試験の終わりから始まる６ヶ月の期間の間保管した。やや溶血した試料もあった（担体処置の非関節炎ラット：＃２、＃５、＃９、＃１０：担体処置の関節炎ラット：＃５３、＃６３；Ｅ３処置の関節炎ラット：＃３１、＃５１；９１１処置の関節炎ラット：＃５２、＃６２、＃６４）。ヒトＴＧＦ−β１ ＥＬＩＳＡキット（照会番号：ＤＢ１００，Ｂａｔｃｈ ２１２２５８および２１３６１０，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ−フランス）を使用してＴＧＦ−β１レベルを測定した。
血液学的変数のための血液採取（１−２−３−４−５群：５０バイアル）：血液試料の一部を、Ｋ３−ＥＤＴＡ（少なくとも１００μＬ）を含有する試験管に採取した。変数の定量は採取日に実施して、試料は保存しなかった。赤血球、白血球、血小板、ヘモグロビン、ヘマトクリットが含まれる血液学的変数は、血液細胞カウンター（Ｄ２４）で測定した。血液学的変数の中には、凝固試料のために測定されないものがあった（担体処置の非関節炎ラット：＃１０；Ｅ３処置の関節炎ラット：＃５９、＃６７；９１１処置の関節炎ラット：＃１６）。
７．足サイトカインレベル
２４日目（最後のｉ．ｖ．ボーラス注射から５日後、または最後のｐ．ｏ．投与から２４時間後）（Ｘ線撮影後）、それぞれの動物（関節炎および非関節炎ラット）の後足を秤量し、ラベルをしたポリエチレンバイアルに採取した。組織試料を液体窒素で凍結させて、−８０℃で保存した。
関節ホモジェネートの調製：Ｂｉｏ−Ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒを使用して、凍結した後足を粉末化した。ついで、この粉末化した後足を、５０μｌの抗プロテアーゼカクテルを補充した３ｍｌ ＰＢＳを含有する５０ｍｌコニカル遠心分離管に入れて、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジェナイザー（最高速度の５０％）を使用して、氷上でホモジェナイズした。次いで、ホモジェネートを２０００ｘｇで１５分間、４℃で遠心分離させて、上清を０．２μｍ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓフィルターに通して濾過し、分割して、使用まで−８０℃で保存した。
サイトカインレベル測定：ＴＮＦ−α（ラットＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット、照会番号：ＲＴＡ００、Ｂａｔｃｈ ２１３７１８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，フランス）、ＩＬ−１β（ラットＩＬ−１β ＥＬＩＳＡキット、照会番号：ＲＬＢ００、Ｂａｔｃｈ ２１２４３５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，フランス）、ＩＬ−６（ラットＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット、照会番号：Ｒ６０００、Ｂａｔｃｈ ２１１７７３、２１４００８、および２１４３６２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，フランス）、およびＴＧＦ−β１（ヒトＴＧＦ−β１ ＥＬＩＳＡキット、照会番号：ＤＢ１００、Ｂａｔｃｈ ２１２２５８および２１３６１０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，フランス）のサイトカインレベルを、製造業者の手順に従って、同一２検体で定量した。後足ホモジェネートのアリコートは、−８０℃で保存した。
８．Ｘ線分析
２４日目、血液採取の後で、動物を犠牲にして、関節病巣の評価用にＸ線写真（後足）を入手した。Ｘ線分析は、両方の後足の関節糜爛、関節隙間、骨膜異常に注目した。７つの異なる項目（柔組織損傷、変形、ミネラル除去、関節隙間、糜爛、骨形成、および骨膜反応）を見ることによって、すべてのＸ線写真を分析した。各動物について、初めの６つの項目は、より悪化した後足を見ることによって、独立して分析した。骨膜反応は、尾を見ることによって分析した。各項目について、スコアは０（正常）〜４（最大損傷）に及ぶ。故に、合計スコアは、０〜２８に及ぶ。Ｘ線写真の解釈は、その動物（処置または非処置）について何も知らない、同一の読み手によって行った。
９．観察
インドメタシン投与後のＤ２３（Ｄ２３での投与前）に、未知の理由で１匹の動物（＃６５）が死亡した。
１０．結果の解釈および表現
すべての結果を、各時点での各群１０匹のラットの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として報告した。足容積は、右足および左足の容積の平均値より計算してｍｌで表した。関節炎指標は、それぞれ４つの足について得たスコアの合計より計算した。痛感応答は、各動物について記録した発声レベルの強度（４つの数値の平均：２回／足）によりｍＶで評価した。痛感応答の阻害百分率は、担体処置関節炎群の平均値より計算した：［（担体処置関節炎群の平均値−処置関節炎群の平均値／担体処置関節炎群の平均値）＊１００］。体重は、グラムで表した。後足（左および右）の重量もグラムで表した。それぞれの後足のサイトカインレベル（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＴＧＦ−β１）は、ｐｇ／ｍｌで表した。ＴＧＦ−β１の循環レベルも、ｐｇ／ｍｌで表した。各変数（ミネラル除去、糜爛、骨膜反応、柔組織損傷、隙間関節、骨形成、変形）の放射医学指標と合計の放射医学指標（合計スコア）は、各変数について得られるスコアの合計より計算した。担体処置群（関節炎ラット）と担体処置群（非関節炎ラット）の数値間の偏差の群間有意性は、等分散または正規性検定がうまくいかない場合、スチューデントｔ検定またはマン・ウィットニーの順位和検定により評価した。担体処置群（関節炎ラット）とＥ３および９１１およびインドメタシン処置群の数値間の偏差の群間有意性は、分散ＡＮＯＶＡの１方向分析に続く非対のダンネットｔ検定によって評価した。Ｐ≦０．０５の確率を有意とみなした。統計解析は、いずれもＳｉｇｍａｓｔａｔＴＭソフトウェアによって実施した。
結果
１．痛感応答（発声検査）
表１１と図１８に示すように、Ｄ１４で、痛感応答は、担体、インドメタシン、Ｅ３、および９１１処置関節炎群で、それぞれ４１４７±３３１、４３８６±２３５、４６４４±３６７、および４４６８±１４３であった。インドメタシンは、３ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．（１０日間）後に、Ｄ１８およびＤ２４で、担体処置関節炎群に比較して、それぞれ約−３７６８ｍＶ（阻害％：７１％）および−４３５３ｍＶ（阻害％：７４％）まで、強くそして有意に痛感応答を減少させた（Ｄ１８：１５１１±３９８対５２７９±３２６ｍＶ；Ｄ２４：１５５２±５０８対５９０５±３４５ｍＶ）。Ｅ３（Ｄ１４およびＤ１９で１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、Ｄ１８およびＤ２４で、担体処置関節炎群に比較して、それぞれ約−４１６７ｍＶ（阻害％：７９％）および−５９０５ｍＶ（阻害％：１００％）まで、強くそして有意に痛感応答を減少させた（Ｄ１８：１１１２±４０１対５２７９±３２６ｍＶ；Ｄ２４：０±０対５９０５±３４５ｍＶ）。９１１（Ｄ１４およびＤ１９で２日間、１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、Ｄ１８およびＤ２４で、担体処置関節炎群に比較して、それぞれ約−３９３２（阻害％：７４％）および−５３５８ｍＶ（阻害％：９１％）まで、強くそして有意に痛感応答を減少させた（Ｄ１８：１３４７±４９２対５２７９±３２６ｍＶ；Ｄ２４：５４７±３０７対５９０５±３４５ｍＶ）。
表１１．Ｅ３および９１１がｉ．ｖ．注射（２日間：Ｄ１４−Ｄ１９）後に慢性関節リウマチラットの痛感応答に及ぼす効果
Figure 0005340724
２．体重
表１２および図１９に示すように、関節炎ラットでは、非関節炎ラットに比較して、Ｄ０〜Ｄ１４において関節炎の確立による体重増加の顕著な減少を観察した。Ｄ１４（選択日）で、関節炎ラットは、非関節炎ラットに比較して、有意な体重低下を表示した（２８９±２対２１７±４ｇ）（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。しかしながら、すべての関節炎群においては、（Ｄ１４で）体重に有意差を検出しなかった（ダンネットｔ検定：Ｐ＞０．０５）。インドメタシン処置群（３ｍｇ／ｋｇ／日、１０日間）では、Ｄ１７〜Ｄ２４において体重が適度および有意に増加して、Ｄ２４では、担体処置関節炎群に比較して最大約４３ｇの差があった（２６１±５対２１８±３ｇ）。Ｅ３処置（Ｄ１４およびＤ１９で１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）の後で、体重は、Ｄ１７〜Ｄ２４において適度および有意に増加して、Ｄ２４では、担体処置関節炎群に比較して最大約４６ｇの差があった（２６４±５ｇ対２１８±３ｇ）。９１１処置（Ｄ１４およびＤ１９で１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）の後で、体重は、Ｄ１８〜Ｄ２４において適度および有意に増加して、Ｄ２４では、担体処置関節炎群に比較して最大約４７ｇの差があった（２６５±７対２１８±３ｇ）。
表１２．Ｅ３および９１１がｉ．ｖ．注射（２日間：Ｄ１４−Ｄ１９）後に慢性関節リウマチラットの体重に及ぼす効果
Figure 0005340724
３．足容積
Ｄ１４では、足容積に関して均質な群を得るために、無作為化を実施した。表１３に示すように、Ｄ１４での後足容積（右および左足容積の平均）は、関節炎群において、非関節炎群より有意に大きかった（２．１０±０．０５対１．４４±０．０２ｍＬ（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５））。インドメタシン（３ｍｇ／ｋｇ／日 ｐ．ｏ．１０日間）は、担体処置関節炎群に比較して、足容積を有意に約−０．７５ｍＬ（Ｄ２４）減少させた。（１．５９±０．０３ｍＬ対２．３４±０．０８ｍＬ）。Ｅ３（Ｄ１４およびＤ１９で１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、足容積を軽度および有意に約０．３７ｍＬ増加させた（２．７１±０．０９ｍＬ対２．３４±０．０８ｍＬ）。９１１（Ｄ１４およびＤ１９で１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して足容積を軽度および有意に約０．３６ｍＬ増加させた（２．７０±０．１１ｍＬ対２．３４±０．０８ｍＬ）。
表１３．Ｅ３および９１１がｉ．ｖ．注射（２日間：Ｄ１４−Ｄ１９）後に慢性関節リウマチラットの足容積に及ぼす効果
Figure 0005340724
４．関節炎指標
表１４に示すように、Ｄ１４での関節炎指標は、担体、インドメタシン、Ｅ３、および９１１処置関節炎群でそれぞれ１０．１±０．８、８．７±０．６、１０．２±０．４、および９．４±０．７であった。インドメタシンは、３ｍｇ／ｋｇ／日 ｐ．ｏ．（１０日間）の後で、担体処置関節炎群に比較して、関節炎指標を強く、そして有意に約−８．０減少させた（２．７±０．７対１０．７±０．６）。Ｅ３（Ｄ１４およびＤ１９に１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、関節炎指標に影響を及ぼさなかった（１１．４±０．４対１０．７±０．６）。９１１（Ｄ１４およびＤ１９に１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、関節炎指標に影響を及ぼさなかった（１０．９±０．７対１０．７±０．６）。
表１４．Ｅ３および９１１がｉ．ｖ．注射（２日間：Ｄ１４−Ｄ１９）後に慢性関節リウマチラットの関節炎指標に及ぼす効果
Figure 0005340724
５．足サイトカインレベル
表１５に示すように、Ｄ２４での左足および右足サイトカインレベルは、関節炎担体処置群において、非関節炎担体処置群に比較して、最大約３．５（ＩＬ−１β）、４（ＴＮＦ−α）および１．８（ＴＧＦ−β１）倍増加した。右足および左足のＩＬ−６レベルは、２つの群の間で有意差を観察しなかった。関節炎群のサイトカインレベルは、左足と右足で同様であった：ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＴＧＦ−β１について、それぞれ２５９．７±３８．５対２１９．２±３２．４、４８０２．８±３６５．５対４００７．１±３８０．４、１７．８±１．６対１８．６±１．９、および９７３５．０±１２１９．８対９１６１．４±８４６．１ｐｇ／ｍｌ。インドメタシンは、３ｍｇ／ｋｇ／日 ｐ．ｏ．（１０日間）の後で、担体処置関節炎群に比較して、右足のＴＧＦ−β１レベルを軽度に、しかし有意に約１．３倍減少させた（７０５７．４±３３５．６対９１６１．４±８４６．１）。一方それは、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−１βのレベルを変化させなかった。左足では、同様の、しかし有意でない効果を観察した。Ｅ３（Ｄ１４およびＤ１９に１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、両方の足のＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、またはＴＧＦ−β１レベルに影響を及ぼさなかった。９１１（Ｄ１４およびＤ１９に１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、右足のＩＬ−１βレベルを増加させた（６２１５．３±６６６．７対４００７．１±３８０．４）。それは、両方の足の他のサイトカインレベルには影響がなかった。
表１５．Ｅ３および９１１がｉ．ｖ．注射（２日間：Ｄ１４−Ｄ１９）後に慢性関節リウマチラットの足サイトカインレベルに及ぼす効果
Figure 0005340724
６．循環ＴＧＦ−β１の測定
表１６に示すように、Ｄ２４での血清ＴＧＦ−β１レベルは、関節炎担体処置群において、非関節炎担体処置群に比較して増加した（８１７１５．７±１９８４．１対６０２６９．９±２１４２．８）。インドメタシンは、３ｍｇ／ｋｇ／日 ｐ．ｏ．（１０日間）の後で、担体処置関節炎群に比較して、血清ＴＧＦ−β１レベルを有意に約１．５倍減少させた（５７２２２．２±３１９４．１対８１７１５．７±１９８４．１）。Ｅ３（Ｄ１４およびＤ１９に１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）と９１１（Ｄ１４およびＤ１９に１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、Ｅ３および９１１処置群のサイトカインレベルが担体処置非関節炎群において観察されるものと同等であるほどに、血清ＴＧＦ−β１レベルを有意に減少させた（６０２６９．９±２１４２．８に対して、それぞれ６９４０８．８±３９２６．７および６７２１４．５±３６４９．４）。
表１６．Ｅ３および９１１がｉ．ｖ．注射（２日間：Ｄ１４およびＤ１９）後に慢性関節リウマチラットの血清ＴＧＦ−β１レベルに及ぼす効果
Figure 0005340724
７．血液学的変数
表１７に示すように、白血球および血小板のような血液学的変数は、担体処置関節炎ラットにおいて、担体処置非関節炎ラットに比較して高かった（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）が、赤血球、ヘモグロビン、およびヘマクリットは、不変であった（スチューデントｔ検定Ｐ＞０．０５）。インドメタシンは、３ｍｇ／ｋｇ／日 ｐ．ｏ．（１０日間）の後で、担体処置関節炎群に比較して、血液変数に影響を及ぼさなかった。Ｅ３（Ｄ１４およびＤ１９に１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、血液変数に影響を及ぼさなかった。９１１（Ｄ１４およびＤ１９に１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、血液変数に影響を及ぼさなかった。
表１７．Ｅ３および９１１がｉ．ｖ．注射（２日間：Ｄ１４およびＤ１９）後に慢性関節リウマチラットの血液変数に及ぼす効果（Ｄ２４で測定）
Figure 0005340724
７．後足重量
表１８に示すように、左および右の後足の重量は、担体処置関節炎ラットにおいて、担体処置非関節炎ラットより重かった（それぞれ、３．４３±０．１１対１．９８±０．０１、および３．３２±０．１２対１．９９±０．０２ｇ）（スチューデントｔ検定またはマン・ウィットニー、Ｐ＜０．０５）。インドメタシンは、３ｍｇ／ｋｇ／日 ｐ．ｏ．（１０日間）の後で、担体処置関節炎群に比較して、後足重量を有意に減少させた（左後足：２．２３±０．０４対３．４３±０．１１ｇ；右後足：２．２０±０．０５対３．３２±０．１２ｇ）。Ｅ３（Ｄ１４およびＤ１９に１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、左後足重量だけを有意に増加させた（左後足：３．８６±０．１４対３．４３±０．１１ｇ；右後足：３．７２±０．１３対３．３２±０．１２ｇ）。９１１（Ｄ１４およびＤ１９に１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、右後足重量だけを有意に増加させた（左後足：３．７３±０．１２対３．４３±０．１１ｇ；右後足：３．８３±０．１５対３．３２±０．１２ｇ）。
表１８．Ｅ３および９１１がｉ．ｖ．注射（２日間：Ｄ１４およびＤ１９）後に慢性関節リウマチラットの後足重量に及ぼす効果（Ｄ２４で測定）
Figure 0005340724
８．Ｘ線分析
表１９に示すように、担体処置非関節炎ラットでは、０．０±０．０の合計スコアを観察した。担体処置関節炎ラットは、１５．１±１．３の合計スコアを有し、ミネラル除去（２．４±０．３）、糜爛（２．７±０．３）、柔組織損傷（３．１±０．２）、および隙間関節（３．３±０．２）で高いスコア、骨膜反応（１．０±０．３）、骨形成（０．８±０．２）、および変形（１．８±０．２）で適度のスコアであった。インドメタシン（３ｍｇ／ｋｇ／日 ｐ．ｏ．１０日間）は、担体処置関節炎ラットに比較して、合計スコアを約１０．７減少させた（４．４±０．９対１５．１±１．３）。Ｅ３（Ｄ１４およびＤ１９に１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、合計スコアに影響を及ぼさなかった（１４．２±１．３対１５．１±１．３）。９１１（Ｄ１４およびＤ１９に１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）は、担体処置関節炎群に比較して、合計スコアに影響を及ぼさなかった（１５．４±１．０対１５．１±１．３）。
表１９．Ｅ３および９１１がｉ．ｖ．注射（２日間：Ｄ１４およびＤ１９）後に慢性関節リウマチラットのＸ線変数に及ぼす効果
Figure 0005340724
結論
上記の実験条件下で、Ｅ３（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．２日：Ｄ１４−Ｄ１９）と９１１（１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．２日：Ｄ１４−Ｄ１９）は強い鎮痛効果を示したが、この関節炎モデルでは、有意な抗炎症効果を示さなかった。
実施例８：ラット慢性関節リウマチモデルにおける、異なる用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の効果
関節炎ラットにおいて疼痛の抑制をもたらすＥ３の能力について、Ｅ３投与と疼痛抑制との用量応答関係を試験することによってさらに検討した。上記に記載のようにラットをアジュバントで処置して、関節炎を誘発させた。アジュバントを注射しない１０匹のラットを非関節炎対照として使用した。アジュバント注射から１４日後、上記に述べた判定基準に基づいて動物を本試験へ資格付け、１０匹のラットの８群へ無作為化して、その発声応答の強度を検査した。次いで、１４日目に、生理食塩水、または０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＥ３抗体を上記に記載のように投薬した。１６、１８、２０、および２４日目に、動物についてその発声応答を検査した。この発声検査の後で、１８日目に、生理食塩水または同じ用量のＥ３を動物に再投薬した。動物はまた、１４日目から始めて、毎日秤量した。このように、動物には所定用量の抗体または生理食塩水を１４および１８日に２回投薬して、疼痛を５回、１４、１６、１８、２０および２４日目に評価した。データを表２０〜２２と図２０〜２２に示す。
表２０．異なる用量のＥ３が慢性関節リウマチラットの痛感応答（発声強度）に及ぼす効果。発声強度の値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．としてｍＶで表す。
Figure 0005340724
動物を様々な用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３で処置することの疼痛誘発発声に及ぼす効果（表２０に示すデータ）について、２方向ＡＮＯＶＡを使用することによって統計学的に分析して、担体で処置した関節炎動物と所定用量の抗体Ｅ３で処置した動物の間の対で得られる結果を比較した。検査したすべてのレベルのＥ３できわめて有意な効果があった（ｐ＜０．０００１）。検査した最も低い用量（０．００３ｍｇ／ｋｇのＥ３）でも、発声の差は有意であった（ｐ＜０．０００１）。
表２０と図２０に示すように、上記の実験結果に一致して、１ｍｇ／ｋｇでの抗体Ｅ３での処置は、疼痛の速やかで目覚しい緩和を示した。２日（検査した最も早い時点）以内に、発声強度は、９０％まで下降した。より低い濃度のＥ３での処置も、目覚しい疼痛緩和をもたらしたが、より低い用量では、疼痛緩和が発現するのにやや長い時間がかかった。検査した最高用量以外のすべての動物で２４日目に効果が明らかに減少したのは、被検者ラットによる免疫応答に従属的な血漿Ｅ３レベルの実際のレベルの減少による可能性がある。このモデルでは、０．００３ｍｇ／ｋｇほど低い用量でも、少なくとも部分的な疼痛緩和をもたらすことが明らかである。
表２１．異なる用量のＥ３が慢性関節リウマチラットの体重に及ぼす効果（１４日目に対して正規化）。
Figure 0005340724
表２２．異なる用量のＥ３が慢性関節リウマチラットの体重に及ぼす効果（０日目に対して正規化）。
Figure 0005340724
動物を様々な用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３で処置することの体重に及ぼす効果について、２方向ＡＮＯＶＡを使用することによって統計学的に分析して、担体で処置した関節炎動物と所定用量の抗体Ｅ３で処置した動物の間の対で得られる結果を比較した。１４日目の体重へ正規化したデータ（表２１）を使用すると、０．０３ｍｇ／ｋｇのＥ３の用量は、体重の有意な変化をもたらした（ｐ＜０．００５）。Ｅ３のすべてのより高い用量で、処置関節炎動物と非処置関節炎動物の間の差は、有意であった（ｐ＝または＜０．０００１）。０日目の体重へ正規化したデータ（表２２）を使用すると、０．０３ｍｇ／ｋｇのＥ３の用量は、体重の有意な変化をもたらした（ｐ＜０．００２）。Ｅ３のすべてのより高い用量で、処置関節炎動物と非処置関節炎動物の間の差は、有意であった（ｐ＜０．０００１）。
やはり初期の試験と一致して、Ｅ３で処置したラットは、生理食塩水処置関節炎ラットほど明らかな体重損失を示さなかった（表２２と図２２）。事実、高用量の抗体Ｅ３で処置したラットは、初期の体重損失を回復していて、実際には、その非関節炎コホートより速やかに体重を増していた（表２１と図２１）。
実施例９．膝の骨関節炎由来の中等度〜重度疼痛の患者における抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の鎮痛効果
この無作為化した、プラセボ対照、二重盲検、用量上昇試験において、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の単回静脈内用量（３μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、または３００μｇ／ｋｇ）の鎮痛効果を、膝の骨関節炎由来の中等度〜重度疼痛の患者においてプラセボと比較した。膝の骨関節炎由来の中等度〜重度疼痛を体験しているが、他の点では全般に健康である成人男性および女性（３５〜６５歳）を本試験に登録した。スクリーニング期間の間、患者には、ＮＳＡＩＤ、シクロオキシゲナーゼ２型（ＣＯＸ−２）阻害剤、およびオピエートのような関節炎の医薬品を抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の投与に先立つ少なくとも１４日間は中止することを求めた。患者には、臨床所見とこれまでの治療歴に基づいて、アセトアミノフェンまたはイブプロフェンの救急医薬品をいくらかの制限付きで使用することが許された。本試験の間に救急医薬品を服用した患者もいたが、救急医薬品は、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の投与の前後２日間は消費されなかった。
３４名の患者を本試験へ受入れて、試験日１、１および２に入院患者として評価した。抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の投与は、１日目の朝に行った。電子ダイアリーを使用して、臨床および自宅での指定（ｉｎｄｅｘ）膝疼痛と救急医薬品使用を記録した。１０名の患者をプラセボで治療した。２４名の患者を抗ＮＧＦ抗体Ｅ３で治療し：各４名の患者を３μｇ／ｋｇ（コホート１）、１０μｇ／ｋｇ（コホート２）、および３０μｇ／ｋｇ（コホート３）の用量レベルとして、各６名の患者を１００μｇ／ｋｇ（コホート４）および３００μｇ／ｋｇ（コホート５）の用量レベルとした。使用したプラセボは、滅菌済み０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰ（通常の生理食塩水）であった。抗ＮＧＦ抗体Ｅ３は、１０ｍＭヒスチジン、２７５ｍＭショ糖、０．０１％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）の水溶液中１０ｍｇ／ｍｌの抗体からなる凍結液体製剤であった。ＩＶ投与に先立つ１時間前に、凍結抗体を融かして、塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰへ希釈した。被検者の１日目の体重と割り当てた用量レベルに基づいて各患者への容量を計算すると、コホート１では３〜６ｃｃ、コホート２では１０〜２０ｃｃ、コホート３では３０〜６０ｃｃ、そしてコホート４およびコホート５では１００ｃｃに及んだ。コホート１および２では、抗体Ｅ３を遅いＩＶボーラスにより３〜５分にわたり投与して、５ｃｃ塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのＩＶフラッシュを続けた。コホート３〜５では、抗体Ｅ３を注入ポンプにより１００ｃｃ／時間で投与して、５ｃｃ塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのＩＶフラッシュとＩＶの中止を続けた。各コホート内では、抗体Ｅ３と同じやり方で、遅いボーラスまたは連続注入によりプラセボ（塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰ）を投与した。
２日間の入院の後で、患者を退院させた。用量レベルコホートに応じて、彼らは、抗体Ｅ３投与後２８日間（コホート１、２、および３）または抗体Ｅ３投与後１８１日間まで（コホート４および５）、疼痛レベルを評価した。定期的な安全性評価は、すべての患者で１８１日間実施した。
鎮痛効果は、投薬前と抗体Ｅ３の投与後数回評価した。１０１点分割（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で０〜１００の範囲にある較正済み電子ＶＡＳを電流指定膝疼痛に使用した。患者は、１日４回キューで突いて、その時点での指定膝における関節炎疼痛のレベルを示すように指導された。１０１点分割で０〜１００の範囲にある較正済み電子ＶＡＳは、歩行の間の指定膝疼痛にも使用した。歩行の間の指定膝疼痛のＶＡＳは、４回目の電流指定膝疼痛ＶＡＳと同時に毎日完了させた。
データ収集用の電子ダイアリーを−８日目に渡して、電子ダイアリーコンプライアンスの７日間スクリーニング評価を−８日目〜−２日目に実施して、所定の被検者がこの電子ダイアリーを使用することの成否を決定した。被検者は、１日につき４回のダイアリーを完成させるように指導された。スクリーニング期間の間に記録した平均ＶＡＳを効力の評価のベースラインとして使用する。
ＷＯＭＡＣ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｓｃａｌｅ）３．１骨関節炎指標バージョンＶＡ．１（版権）も関節炎疼痛を評価するのに使用した。ＷＯＭＡＣ ３．１ＴＭは、３つのドメイン：疼痛（５つの質問）、こわばり（２つの質問）、および身体機能（１７の質問）へ分割された２４の質問からなる。Ｂｅｌｌａｍｙら，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １５：１８３３−４０（１９８８）；およびＢｅｌｌａｍｙ，Ｓｅｍｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１８：１４−７（１９８９）。身体機能のドメインは、日常生活の諸活動を行う能力の情報を提供する。患者は、１０１点分割で０〜１００の範囲にある較正済み電子ＶＡＳを使用して、指定の通院の間に、電子ダイアリーで直接この試験を実施した。構成している質問のＶＡＳスコアの平均を決定することによって、各ドメインをスコア化した。３つのドメインそれぞれからのスコアの平均を決定することによって、全体のＷＯＭＡＣ３．１ＴＭをスコア化した。患者にはまた、使用した救急医薬品について電子ダイアリーを介して報告することが求められた。
ベースライン（スクリーニング期間の疼痛レベル）からの変化としてアウトカムを評価して、異なる用量レベルについての疼痛強度差（ＰＩＤ）または総疼痛強度差（ＳＰＩＤ）として表した。活動測定におけるベースラインからの変化は、治療を主因子として、ベースライン疼痛を共変数とする共分散（ＡＮＣＯＶＡ）モデルの分析を使用して分析した。平均値と平均の変化について、ダンネット検定を使用して、抗体Ｅ３のプラセボとの比較を行った。Ｔｕｋｅｙ−Ｃｉｍｉｎｅｒａ−Ｈｅｙｓｅ傾向検定を使用して、用量応答関係を評価した。
図２４に示すように、検査したすべての用量で、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の単回投与後の平均１日疼痛強度の減少が観察された。一般に、疼痛強度を低下させる効果は、より低い用量（３μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇ）の処置群より、より高い用量（３０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、および３００μｇ／ｋｇ）の処置群でより長く続いた。図２５に示すように、疼痛強度の低下は、１００μｇ／ｋｇのＥ３の投与後、少なくとも８０日間続いた。
以下の表２３は、Ｅ３の各投薬について、ベースラインレベルと比較した、２〜８日目、２〜１４日目、２〜２１日目、および２〜２８日目の総疼痛強度差（ＳＰＩＤ）を示す。ＡＮＣＯＶＡを統計分析に使用した。表２３は、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の単回投与後に疼痛抑制が統計学的に有意（ｐ＜０．０５）であったことを示す。
表２３．ベースラインと比較した様々な時間間隔での総疼痛強度差
Figure 0005340724
統計学的分析は、補正せずに実施して、多重比較用には補正して実施した。それぞれの時間間隔についての第一行のｐ値（括弧）は補正しなかったが、第二行のｐ値（括弧）は、ダンネット補正を伴うものであった。
図２６に示すように、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の単回投与によるＳＰＩＤの最大低下パーセントは、試験したすべてのＥ３用量で、２日目〜１４日目に約４５％〜約６５％に達して、１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、および３００μｇ／ｋｇのＥ３用量で、２日目〜２８日目に約４５％〜約６０％に達した。
図２７に示すように、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の投与は、１日目〜２８日目のＷＯＭＡＣスコアも低下させた。Ｅ３の１００μｇ／ｋｇの用量で、疼痛、身体機能、およびこわばりのスコアが有意に低下した。これらのデータは、抗ＮＧＦ抗体の単回投与が、骨関節炎を有する患者において、疼痛を抑制するだけでなく、身体機能とこわばりも改善することを示す。
生物学的材料の寄託
以下の材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ ブルヴァール大学、バージニア州マナッサス、アメリカ（ＡＴＣＣ）に寄託されている：
Figure 0005340724
ベクターＥｂ．９１１．３Ｅは、Ｅ３軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであり；ベクターＥｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅは、Ｅ３軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、そしてベクターＤｂ．９１１．３Ｅは、Ｅ３重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
この寄託は、特許手続きの目的のための微生物の寄託とその下での規制の国際承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定下で行った。これは、寄託品の生きた培養物を寄託日より３０年間維持することを保証する。寄託品は、ブダペスト条約の条件下でＡＴＣＣにより入手可能になり、Ｒｉｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ社とＡＴＣＣの間の合意に処され、これは、関連する米国特許の発行時または、米国特許出願または外国特許出願の公への開示時に（どちらが先であっても）、寄託品の培養物の子孫の公への永久かつ無制限の利用を保証するとともに、米国特許および商標庁委員会により３５ ＵＳＣセクション１２２とそれに準ずる委員会規則（３７ ＣＦＲセクション１．１４、特に８８６ ＯＧ ６３８参照）に従って資格ありと決定されるものへの子孫の利用を保証するものである。
本出願の譲渡人は、寄託された材料の培養物が好適な条件の下で培養されるときに死亡する、または消失または破壊されることがあれば、その材料を、届出時に、同じものと速やかに交換することに同意した。寄託材料の利用可能性は、あらゆる政府の特許法に準拠した権限下に承認される権利に違反して本発明を実施する認可として解釈されてはならない。
抗体配列
重鎖可変領域（Ｋａｂａｔ ＣＤＲに下線を施す；Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲは、太字で斜体である）。
Figure 0005340724
軽鎖可変領域（Ｋａｂａｔ ＣＤＲに下線を施す；Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲは、太字で斜体である）。
Figure 0005340724
Ｅ３重鎖延長ＣＤＲ
Figure 0005340724
Ｅ３軽鎖延長ＣＤＲ
Figure 0005340724
マウスモノクローナル抗体９１１延長ＣＤＲ
９１１重鎖延長ＣＤＲ
Figure 0005340724
９１１軽鎖延長ＣＤＲ
Figure 0005340724
Ｅ３重鎖アミノ酸配列（全長）
Figure 0005340724
３Ｅ軽鎖アミノ酸配列（全長抗体）
Figure 0005340724
３Ｅ重鎖ヌクレオチド配列（全長抗体）
Figure 0005340724
３Ｅ重鎖可変ドメインヌクレオチド配列
Figure 0005340724
３Ｅ軽鎖ヌクレオチド配列（全長抗体）
Figure 0005340724
３Ｅ軽鎖可変ドメインヌクレオチド配列
Figure 0005340724
本明細書に記載の実施例および態様は、例示目的のためだけのものであり、当業者には、それに照らして様々な修飾または変更が示唆され、それらは、本出願の精神および範囲内に含まれると理解される。
図１Ａは、Ｅ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（「６」および「５＋アフィニティー成熟化Ｈ３」と標記する）を示す。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲとＫａｂａｔ ＣＤＲを下線テキストと太字およびイタリックのテキストによってそれぞれ図示する。図１Ａはまた、以下の重鎖可変領域アミノ酸配列のアライメントを示す；（２）ＶＨ４−５９ヒト生殖系アクセプタ配列（「ＶＨ４−５９」または「２」と標記する）（配列番号６９）；（３）マウス抗体９１１の延長ＣＤＲを移植したアクセプタ配列（「ＣＤＲ移植」または「３」と標記する）（配列番号７０）；（４）Ｖ７１Ｋ置換が含まれるＣＤＲ移植アクセプタ配列（「３＋１フレームワーク突然変異」または「４」と標記する）（配列番号７１）；（５）アフィニティー成熟化ＣＤＲ Ｈ１およびＨ２を含有するクローン（「５」または「４＋アフィニティー成熟化Ｈ１，Ｈ２」と標記する）（配列番号７２）；および抗体Ｅ３（上記に記載）。 図１Ａは、Ｅ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（「６」および「５＋アフィニティー成熟化Ｈ３」と標記する）を示す。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲとＫａｂａｔ ＣＤＲを下線テキストと太字およびイタリックのテキストによってそれぞれ図示する。図１Ａはまた、以下の重鎖可変領域アミノ酸配列のアライメントを示す；（２）ＶＨ４−５９ヒト生殖系アクセプタ配列（「ＶＨ４−５９」または「２」と標記する）（配列番号６９）；（３）マウス抗体９１１の延長ＣＤＲを移植したアクセプタ配列（「ＣＤＲ移植」または「３」と標記する）（配列番号７０）；（４）Ｖ７１Ｋ置換が含まれるＣＤＲ移植アクセプタ配列（「３＋１フレームワーク突然変異」または「４」と標記する）（配列番号７１）；（５）アフィニティー成熟化ＣＤＲ Ｈ１およびＨ２を含有するクローン（「５」または「４＋アフィニティー成熟化Ｈ１，Ｈ２」と標記する）（配列番号７２）；および抗体Ｅ３（上記に記載）。 図１Ｂは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（「５」または「４＋アフィニティー成熟化Ｌ３」と標記する）を示す。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲとＫａｂａｔ ＣＤＲを下線テキストと太字およびイタリックのテキストによってそれぞれ図示する。図１Ｂはまた、以下の軽鎖可変領域アミノ酸配列のアライメントを示す；（２）Ｏ８ヒト生殖系アクセプタ配列（「Ｏ８」または「２」と標記する）（配列番号７３）；（３）マウス抗体９１１の延長ＣＤＲを移植したアクセプタ配列（「ＣＤＲ移植」または「３」と標記する）（配列番号７４）；（４）ＣＤＲ移植アクセプタ配列（「３＋アフィニティー成熟化Ｌ１，Ｌ２」または「４」と標記する）（配列番号７５）；（５）アフィニティー成熟化ＣＤＲ Ｌ１およびＬ２を含有するクローン（「５」または「４＋アフィニティー成熟化Ｌ３」と標記する）；および抗体Ｅ３（上記に記載）。 図１Ｂは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（「５」または「４＋アフィニティー成熟化Ｌ３」と標記する）を示す。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲとＫａｂａｔ ＣＤＲを下線テキストと太字およびイタリックのテキストによってそれぞれ図示する。図１Ｂはまた、以下の軽鎖可変領域アミノ酸配列のアライメントを示す；（２）Ｏ８ヒト生殖系アクセプタ配列（「Ｏ８」または「２」と標記する）（配列番号７３）；（３）マウス抗体９１１の延長ＣＤＲを移植したアクセプタ配列（「ＣＤＲ移植」または「３」と標記する）（配列番号７４）；（４）ＣＤＲ移植アクセプタ配列（「３＋アフィニティー成熟化Ｌ１，Ｌ２」または「４」と標記する）（配列番号７５）；（５）アフィニティー成熟化ＣＤＲ Ｌ１およびＬ２を含有するクローン（「５」または「４＋アフィニティー成熟化Ｌ３」と標記する）；および抗体Ｅ３（上記に記載）。 図２は、抗体Ｅ３の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド（配列番号７６）を示す。 図３は、抗体Ｅ３の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド（配列番号７７）を示す。 図４は、様々な濃度のヒトおよびラットＮＧＦの存在下での、Ｅ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を示すグラフである。Ｘ軸は、ＮＧＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対応して、Ｙ軸は、カウントされたニューロンに対応する。 図５は、０．０４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（ほぼ１．５ｐＭ；下のパネルに示す）または０．４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（ほぼ１５ｐＭ；上のパネルに示す）のいずれかの存在下での様々なＦａｂのＮＧＦ阻止効果を比較するグラフである。様々な濃度のＦａｂ Ｅ３；マウス９１１ Ｆａｂ；およびＦａｂ Ｈ１９−Ｌ１２９およびＦａｂ ８Ｌ２−６Ｄ５におけるＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存を評価した。それぞれのＦａｂについて、それぞれのＮＧＦ濃度でＩＣ５０を（ｐＭで）計算して、表９に示す。Ｆａｂ Ｅ３は、ヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロン生存を強く阻止して、１５ｐＭヒトＮＧＦの存在下でほぼ２１ｐＭのＩＣ５０、そして１．５ｐＭヒトＮＧＦの存在下でほぼ１．２ｐＭのＩＣ５０であった。Ｆａｂ ３ＣとＨ１９−Ｌ１２９もヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロン生存を強く阻止した。両方のパネルにおいて、Ｘ軸は抗体濃度（ｎＭ）に対応して、Ｙ軸は、カウントされたニューロンに対応する。１．５ｐＭのＮＧＦはＩＣ５０に近く、１５ｐＭは、ＮＧＦの飽和濃度を表した。 図６は、０．０４ｎｇ／ｍｌのラットＮＧＦ（ほぼ１．５ｐＭ；下のパネルに示す）または０．４ｎｇ／ｍｌのラットＮＧＦ（ほぼ１５ｐＭ；上のパネルに示す）のいずれかの存在下での様々なＦａｂのＮＧＦ阻止効果を比較するグラフである。上記のように、様々な濃度のＦａｂ Ｅ３；マウス９１１ Ｆａｂ；およびＦａｂ Ｈ１９−Ｌ１２９およびＦａｂ ８Ｌ２−６Ｄ５におけるＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存を評価した。それぞれのＦａｂについて、それぞれのＮＧＦ濃度でＩＣ５０を（ｐＭで）計算して、表９に示す。Ｆａｂ Ｅ３は、ラットＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロン生存を強く阻止して、１５ｐＭラットＮＧＦの存在下でほぼ３１．６ｐＭのＩＣ５０、そして１．５ｐＭラットＮＧＦの存在下でほぼ１．３ｐＭのＩＣ５０であった。Ｆａｂ ３ＣとＨ１９−Ｌ１２９もラットＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロン生存を強く阻止した。１．５ｐＭのＮＧＦはＩＣ５０に近く、１５ｐＭは、ＮＧＦの飽和濃度を表した。両方のパネルにおいて、Ｘ軸は抗体濃度（ｎＭ）に対応して、Ｙ軸は、カウントされたニューロンに対応する。 図７は、術後２４時間で評価した安静時疼痛を図示して、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体Ｅ３での処置により疼痛が抑制されたことを示すグラフである。「＊」は、陰性対照からの統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）を示す。 図８は、術後２４時間で評価した安静時疼痛を図示して、０．５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体Ｅ３での処置（術後２時間で注射する）により安静時疼痛が有意に（ｐ＜０．００５）抑制されたことを示すグラフである。 図９は、マウス抗体９１１（Ｆａｂ）のヒトＮＧＦへの結合アフィニティーのＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を示すグラフである。マウス抗体９１１は、ＮＧＦへ３．７ｎＭのＫＤ、８．４ｘ１０−５ｓ−１のｋｏｆｆ、および２．２ｘ１０４Ｍｓ−１のｋｏｎで結合した。 図９は、抗体Ｅ３（Ｆａｂ）（「３Ｅ Ｆａｂ」と呼ぶ）のヒトＮＧＦへの結合アフィニティーのＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を示すグラフである。Ｅ３は、ヒトＮＧＦへほぼ０．０７ｎＭのＫＤで（および、約６．０ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎと、約４．２ｘ１０−５ｓ−１のｋｏｆｆで）で結合した。 図１１は、ＮＧＦとｔｒｋ（黒丸で示す）、そしてＮＧＦとｐ７５（白抜きの四角で示す）の間で検出される結合パーセントによって評価するように、ＮＧＦのその受容体、ｔｒｋＡおよびｐ７５との相互作用を抗体Ｅ３が阻止することを図示するグラフである。Ｘ軸は、抗体３Ｅ（Ｆａｂ）の濃度に対応して、Ｙ軸は、ＮＧＦ結合（最大ＲＵパーセント）に対応する。減少するシグナル（ＲＵで測定する）により示すように、増加濃度のＦａｂ Ｅ３は、ＮＧＦのｐ７５とｔｒｋＡの両方との相互作用を阻止した。抗体Ｅ３（Ｆａｂ）濃度がＮＧＦ濃度に等しいとき、ＮＧＦ結合は観察されなかった（０のシグナルにより示すように）。 図１２は、全長抗体Ｅ３およびＦａｂ Ｅ３のヒトＮＧＦ阻止能力を図示するグラフである。ヒトＮＧＦと様々な濃度のＦａｂ Ｅ３および抗体Ｅ３の存在下におけるＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存を評価した。Ｘ軸は、ＮＧＦ結合部位（ｎＭ）に対応して、Ｙ軸は、三叉神経（ＴＧ）ニューロンの正規化数に対応する。全長抗体Ｅ３およびＦａｂ ３Ｅは、全長抗体およびＦａｂの濃度をＮＧＦ結合部位の数へ正規化するとき（Ｆａｂは、１つの結合部位を有して、全長抗体は、２つの結合部位を有する）、三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存の阻害の同様のレベルを示した。 図１３は、様々な濃度（２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、０．００６４、０．００１２８、および０．０ｎＭ）の抗体Ｅ３（黒い三角形；「３Ｅ」と呼ぶ）、抗体９１１（黒丸）、およびｔｒｋＡ受容体イムノアドヘシン（黒い四角形；「ｔｒｋＡ−Ｆｃ」と呼ぶ）が０．４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（飽和濃度）の存在下にＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を阻害する能力を図示するグラフである。Ｘ軸は、抗体の濃度（ｎＭ）に対応し、Ｙ軸は、カウントしたニューロンに対応する。上記の結果は、抗体Ｅ３が、マウスモノクローナル抗ＮＧＦ抗体９１１またはｔｒｋＡイムノアドヘシンのいずれよりも有意によくＮＧＦを阻止することを実証した。 図１４は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３（図で３Ｅと呼ぶ）またはＦａｂ ９１１が、２００ｎＭと同じくらい高い抗体濃度でも、ＮＴ３、ＮＴ４／５、およびＭＳＰにより促進されるニューロン生存を阻害しなかったことを図示するグラフである。このデータは、各実験での陽性対照で観察される生存（飽和ＮＧＦ濃度の存在下に成長する三叉神経ニューロンの１００％生存）に対する、４８時間の培養後の平均生存パーセント（平均±標準誤差、各データ点でｎ＝３）を表した。様々な濃度（２０ｎＭ、２ｎＭ、または０．２ｎＭ）のＥ３ Ｆａｂ（図で「３Ｅ」と呼ぶ）とマウス抗体９１１ Ｆａｂを無添加ニュートロフィン（「対照」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＮＧＦ（「ＮＧＦ−４００ｐＭ」と呼ぶ）、１０ｎＭ ＮＴ３（「ＮＴ３−１０ｎＭ」と呼ぶ）、または６００ｐＭ ＭＳＰ（「ＭＳＰ−６００ｐＭ」と呼ぶ）の存在下に使用した。 図１５は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３（Ｆａｂまたは全長抗体）（「図で「３Ｅ」と呼ぶ）またはマウス抗体９１１（Ｆａｂまたは全長抗体）が、２００ｎＭと同じくらい高い抗体濃度でも、ＮＴ３、ＮＴ４／５、およびＭＳＰにより促進されるニューロン生存を阻害しなかったことを図示するグラフである。様々な濃度（２００ｎＭおよび８０ｎＭ）のＥ３ Ｆａｂおよび全長抗体とマウス抗体９１１全長抗体およびＦａｂを無添加ニュートロフィン（「無因子」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＮＧＦ（「ＮＧＦ−４００ｐＭ」と呼ぶ）、１０ｎＭ ＮＴ３（「ＮＴ３−１０ｎＭ」と呼ぶ）、または６００ｐＭ ＭＳＰ（「ＭＳＰ−６００ｐＭ」と呼ぶ）の存在下に使用した。 図１６は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３またはＦａｂ Ｅ３が、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５、またはＬＩＦにより促進されるＥ１７結節ニューロンの生存を阻害しなかったことを図示するグラフである。マウス抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体９１１についても試験して、同様の結果を観察した。様々な濃度（２００ｎＭおよび８０ｎＭ）の全長抗体Ｅ３（図で「３Ｅ」と呼ぶ）、Ｆａｂ Ｅ３、全長抗体９１１、またはＦａｂ９１１を、無添加ニュートロフィン（「無因子」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＢＤＮＦ（「ＢＤＮＦ−４００ｐＭ」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＮＴ４／５（「ＮＴ４／５−４００ｐＭ」と呼ぶ）、または２．５ｎＭ ＬＩＦ（「ＬＩＦ−２．５ｎＭ」と呼ぶ）の存在下に試験した。 図１７は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３またはＦａｂ Ｅ３が、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５、またはＬＩＦにより促進されるＥ１７結節ニューロンの生存を阻害しなかったことを図示するグラフである。様々な濃度（２００ｎＭ、２０ｎＭ、２ｎＭ）のＦａｂ Ｅ３（図で「３Ｅ」と呼ぶ）またはＦａｂ９１１を、無添加ニュートロフィン（「対照」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＢＤＮＦ（「ＢＤＮＦ−４００ｐＭ」と呼ぶ）、４００ｐＭ ＮＴ４／５（「ＮＴ４／５−４００ｐＭ」と呼ぶ）、または２．５ｎＭ ＬＩＦ（「ＬＩＦ−２．５ｎＭ」と呼ぶ）の存在下に試験した。 図１８は、抗ＮＧＦ抗体（Ｅ３および９１１）のＤ１４およびＤ１９に投与後の関節炎ラット（慢性関節リウマチモデル）における痛感応答を実証するグラフである。Ｅ３（１４日目と１９日目に１ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）、９１１（１４日目と１９日目に１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）、またはｉｎｄｏ（１０日にわたり連日のインドメタシン３ｍｇ／ｋｇ，ｐ．ｏ．）を関節炎マウスへ投与した。発声強度値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．としてｍＶで表す。 図１９は、抗ＮＧＦ抗体のＤ１４およびＤ１９に投与後の関節炎ラット（慢性関節リウマチモデル）の体重に及ぼす抗ＮＧＦ抗体の効果を実証するグラフである。Ｅ３（１４日目と１９日目に１ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）、９１１（１４日目と１９日目に１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）、またはｉｎｄｏ（１０日にわたり連日のインドメタシン３ｍｇ／ｋｇ，ｐ．ｏ．）を関節炎マウスへ投与した。体重の数値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．としてグラムで表す。 図２０は、異なる用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３（０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇ）のＤ１４およびＤ１８に投与後の関節炎ラット（慢性関節リウマチモデル）における痛感応答を実証するグラフである。発声強度値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．としてｍＶで表す。 図２１は、異なる用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇ）のＤ１４およびＤ１８に投与後の関節炎ラット（慢性関節リウマチモデル）の１４日目の体重の百分率（１４日目へ正規化）に及ぼす抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の効果を実証するグラフである。 図２２は、異なる用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇ）のＤ１４およびＤ１８に投与後の関節炎ラット（慢性関節リウマチモデル）における体重損失に及ぼす抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の効果を実証するグラフである。体重の数値は、０日目へ正規化した。 図２３は、連続番号付け、Ｋａｂａｔ番号付け、およびＣｈｏｔｈｉａ番号付けを使用して番号付けた、Ｅ３重鎖可変領域アミノ酸配列（図２３Ａ）と軽鎖可変領域アミノ酸配列（図２３Ｂ）を図示する。 図２３は、連続番号付け、Ｋａｂａｔ番号付け、およびＣｈｏｔｈｉａ番号付けを使用して番号付けた、Ｅ３重鎖可変領域アミノ酸配列（図２３Ａ）と軽鎖可変領域アミノ酸配列（図２３Ｂ）を図示する。 図２３は、連続番号付け、Ｋａｂａｔ番号付け、およびＣｈｏｔｈｉａ番号付けを使用して番号付けた、Ｅ３重鎖可変領域アミノ酸配列（図２３Ａ）と軽鎖可変領域アミノ酸配列（図２３Ｂ）を図示する。 図２３は、連続番号付け、Ｋａｂａｔ番号付け、およびＣｈｏｔｈｉａ番号付けを使用して番号付けた、Ｅ３重鎖可変領域アミノ酸配列（図２３Ａ）と軽鎖可変領域アミノ酸配列（図２３Ｂ）を図示する。 図２４は、０日目のベースラインと比較した、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の投与後の平均１日疼痛強度の変化を図示する。Ｙ軸は、０日目の平均１日疼痛強度に比較した、平均１日疼痛強度（ＶＡＳスコア）の低下に対応する。Ｘ軸は、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の投与後の日数に対応する。 図２５は、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の投与後の平均ＶＡＳスコアを図示する。「ＳＥ」は、標準誤差を意味する。 図２６は、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の投与後２日目〜１４日目と２日目〜２８日目の総疼痛強度差（ＳＰＩＤ）の最大低下パーセントを図示する。 図２７は、異なる用量（３μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、および３００μｇ／ｋｇ）の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の投与後１日目〜２８日目のＷＯＭＡＣ、疼痛サブスケール、身体機能サブスケール、およびこわばりサブスケールについての最小二乗平均（ＬＳＭ）応答を図示する。「ＳＥ」は、標準誤差を意味する。Ｘ軸は、投与した抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の用量に対応する。「＊」は、ダンネットｔ検定でベースラインと比較したＰ＜０．０５を示す。

Claims (17)

  1. 有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を含む、骨関節炎を有する個体においてこわばりを改善させるための医薬組成物。
  2. 個体がヒトである、請求項１の医薬組成物。
  3. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が毎週１回〜１２週毎に１回の範囲の投薬頻度で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１または２の医薬組成物。
  4. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が８週毎に１回の投薬頻度で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項３の医薬組成物。
  5. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が毎月１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、４ヵ月毎に１回、５ヶ月毎に１回、または６ヶ月毎に１回投与されるように用いられることを特徴とする、請求項３の医薬組成物。
  6. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が３μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１の医薬組成物。
  7. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が１００μｇ／ｋｇまたは３００μｇ／ｋｇの用量で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項６の医薬組成物。
  8. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が静脈内投与または皮下投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１から７のいずれかの医薬組成物。
  9. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から８のいずれかの医薬組成物。
  10. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体がヒト化抗体である、請求項１から９のいずれかの医薬組成物。
  11. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体がヒトＮＧＦへ結合する、請求項１から１０のいずれかの医薬組成物。
  12. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が齧歯動物のＮＧＦへさらに結合する、請求項１１の医薬組成物。
  13. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が：
    （ａ）ＮＧＦへ約２ｎＭ未満のＫＤで結合し；および／または
    （ｂ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を１００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し（ここでＩＣ５０は、１５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下に測定する）；
    および／または
    （ｃ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を１０ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する（ここでＩＣ５０は、１．５ｐＭのＮＧＦの存在下に測定する）、請求項１の医薬組成物。
  14. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が：
    （ｉ）
    （ａ）配列ＧＦＳＬＩＧＹＤＬＮを有するＣＤＲ１領域；
    （ｂ）配列ＩＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＶＫＳを有するＣＤＲ２領域；および
    （ｃ）配列ＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹを有するＣＤＲ３領域
    を含んでなる重鎖可変領域を含み、
    （ｉｉ）
    （ａ）配列ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮを有するＣＤＲ１領域
    （ｂ）配列ＹＴＳＲＦＨＳを有するＣＤＲ２領域；および
    （ｃ）配列ＱＱＥＨＴＬＰＹＴを有するＣＤＲ３領域
    を含んでなる軽鎖可変領域を含む、
    請求項１の医薬組成物。
  15. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が、
    （ａ）配列
    ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＬＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＶＫＳＲＶＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳを有する重鎖可変領域；および
    （ｂ）配列
    ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＥＨＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴ
    を有する軽鎖可変領域
    を含んでなる抗体である、請求項１４の医薬組成物。
  16. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が、
    （ａ）配列
    ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＬＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＶＫＳＲＶＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
    を有する重鎖；および
    （ｂ）配列
    ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＥＨＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＸＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
    を有する軽鎖
    を含んでなる抗体である、請求項１５の医薬組成物。
  17. 抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体と医薬的に許容される担体を含んでなる、骨関節炎を有する個体においてこわばりを改善させるための医薬組成物。
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