MX2007002771A

MX2007002771A - Aislados de virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2007002771A
Application number: MX2007002771A
Authority: MX
Inventors: Michael Roof; Wesley Johnson; Eric Vaughn
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date: 2004-09-21
Filing date: 2005-09-21
Publication date: 2008-03-07
Also published as: EP2298938A1; RU2007114957A; CA2577801A1; US8383131B2; US20100028860A1; KR20070105965A; EP1794329B1; EP1794329A4; ATE518012T1; EP1794329A2; EP2314721A1; RU2407802C2; WO2006034319A3; US20060063148A1; US20110195088A1; US7632636B2; AU2005286797A1; WO2006034319A2; BRPI0516951A2; JP2008513501A

Abstract

Se proporciona un metodo para predecir la virulencia de un aislado de virus del SRRP nuevo o sin caracterizar, en el que el aislado se inyecta en un cerdo y se deja replicar durante un periodo de aproximadamente 3-15 dias. Durante este periodo, se determinan la tasa de crecimiento del virus y/o la magnitud de la viremia, y estos datos se comparan con la correspondiente tasa de crecimiento y/o magnitud de la viremia de un aislado de virus del SRRP de virulencia conocida, como medida de la virulencia del aislado nuevo o sin caracterizar. Ademas, tambien se proporciona un metodo para seleccionar un aislado para incluir en una composicion inmunogenica, basado en la virulencia predicha, junto con composiciones que incorporan formas atenuadas de virus que se ha predicho son virulentos.

Description

AISLADOS DE VIRUS DEL SÍNDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO PORCINO Y MÉTODOS DE USO SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud de número de serie 11/022,262, presentada el 23 de diciembre, 2004, la cual reivindica el beneficio de la solicitud provisional de número de serie 60/611,824, que se presentó el 21 de septiembre, 2004. Las enseñanzas y contenido de cada una de estas solicitudes anteriores se incorporan por referencia en la presente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevos aislados de virus del SRRP de tipo silvestre, aislados y a los correspondientes virus del SRRP atenuados mejorados, a los usos de dichos virus atenuados en vacunas y composiciones inmunológicas, asi como a métodos para medir la magnitud de la viremia, tasa de crecimiento, respuesta de anticuerpos, y a sus combinaciones en dichos aislados y virus. Más particularmente, la presente invención proporciona métodos para predecir la virulencia de aislados de virus del SRRP nuevos o previamente no caracterizados, y la atenuación y el uso de dichos aislados en vacunas y composiciones inmunológicas..

Descripción de la Técnica Anterior El virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino (VSRRP) es un virus de ARN monocatenario con envoltura, clasificado en la familia de Arteriviridae (Cavanaugh, 1997). Causa una enfermedad del cerdo muy extendida que se describió por primera vez como la "enfermedad misteriosa del cerdo" en EE.UU. en 1987 (Hill, 1990) . La enfermedad se manifiesta como una enfermedad respiratoria en todos los grupos de edad del cerdo, que conduce a la muerte en algunos cerdos más jóvenes y a problemas reproductivos graves en hembras en edad de reproducción. La naturaleza dinámica del VSRRP permite un cambio constante de la enfermedad y proporciona una amplia oportunidad para la aparición de nuevos aislados (Andreyev et al., 1997; Murtaugh et al. 1998; Meng, 2000). El hecho de que el VSRRP cambie tan fácilmente, junto con su capacidad para producir problemas devastadores para los productores de cerdos, hace que este virus sea un objetivo importante para la investigación (Mengeling et al., 1998; Pejsak et al., 1997) y para el desarrollo de vacunas y otros métodos para reducir los efectos de la infección. La variación en los niveles de virulencia de los aislados se demostró en lesiones pulmonares y muerte de cerdos (Halbur et al., 1996), pero los esfuerzos para ligar las diferencias biológicas e inmunológicas a diferencias genéticas especificas no han tenido éxito en gran medida (Albina et al., 1998; Key et al.,12001; Yuan et al., 2001; Murtaugh et al., 2002; Grebennikova et al., 2004). Los estudios para examinar la seguridad y la eficacia de las vacunas del SRRP incluyen el trabajo de Labarque et al., (2003), Mengeling et al., (2003a), y Nodelijik et al. (2001) . Estos estudios muestran que en condiciones experimentales, las vacunas de SRRP vivas modificadas reducen la cantidad y duración de la viremia, asi como la fiebre y lesiones pulmonares después de una exposición virulenta. Opriessing et al. (2002) mostraron que los aislados con una secuencia de aminoácidos con alta homología en el marco de lectura abierto 5 (ORF5) producían niveles significativamente diferentes de neumonía en cerdos. A la variación de las respuestas del cerdo al VSRRP también le afecta la variación del hospedero (Mengeling et al., 2003b). La virulencia se ha examinado en relación con las tasas de replicación y distribución del VSRRP en cerdos (Haynes et al., 1997), las capacidades de depuración de cobre de macrófagos (Thanawongnuwech et al., 1998), y los niveles de anemia del animal hospedero (Halbur et al, 2002) . Sin embargo, estos métodos no han logrado proporcionar métodos eficaces para predecir la virulencia de aislados de VSRRP nuevos o no caracterizados previamente . Por consiguiente, lo que se necesita en la técnica es un método para predecir la virulencia de los aislados de VSRRP. Lo que se necesita además en la técnica es un método para predecir la virulencia de aislados de VSRRP basándose en la tasa de crecimiento del virus del SRRP in vivo y/o en la magnitud de la viremia en un cerdo, después de administración o exposición del aislado a un cerdo que previamente no tenia SRRP.

LA INVENCIÓN La presente invención supera los problemas resumidos antes y proporciona nuevos aislados de virus del SRRP de tipo silvestre aislados, versiones atenuadas de dichos virus, y las correspondientes vacunas que comprenden los virus del SRRP atenuados en composiciones farmacéuticas. Con más detalle, los virus de tipo silvestre de la presente invención se denominan SDSU 73, 17198-6 y MN 184, y sus mezclas. Las versiones atenuadas de estos aislados de virus, y las vacunas completas que comprenden los aislados atenuados son capaces de conferir inmunidad in vivo frente al SRRP en el cerdo, sin generar signos clínicos significativos de VSRRP. Otra característica de los aislados de virus del SRRP atenuados de la invención es que retienen una proporción sustancial de la viremia encontrada en los virus de tipo silvestre, no atenuados. Asi, los virus atenuados presentan al menos aproximadamente 50%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 75% de la viremia que presentan los virus de tipo silvestre, no atenuados. De esta forma, los virus atenuados son capaces de conferir una inmunidad frente al SRRP más rápida y completa en el cerdo. Los virus de tipo silvestre se pueden atenuar por una variedad de métodos, tales como el paso en cultivo celular repetido en series, inserción génica, cambio génico, supresión génica, sustitución de par de base y mutación sensible a la temperatura. Dichos virus atenuados se pueden usar después en una variedad de composiciones inmunológicas incluidas vacunas, usando métodos que son bien conocidos en la técnica. En algunas formas, estos virus atenuados se pueden además matar o inactivar usando métodos que son bien conocidos en la técnica, antes de la incorporación o inclusión en una composición inmunogénica según la presente invención. Los ejemplos de las composiciones inmunogénicas útiles para prevenir la infección del SRRP o reducir la gravedad de los signos clínicos de la infección del SRRP incluyen vacunas hechas con Abst-1 o JA-142. También se ha descubierto que las vacunas de la invención se pueden almacenar en un estado congelado hasta que estén listas para usar, sin quitar valor a las características deseables de las vacunas. Esto aborda un problema continuo en la técnica, puesto que las vacunas del SRRP anteriores no han sido adecuadas para el almacenamiento, congeladas. La presente invención proporciona además métodos para predecir el grado de virulencia de un aislado de virus del SRRP no caracterizado o nuevo. Dichos métodos en general implican evaluar en un aislado de virus del SRRP nuevo o previamente no caracterizado al menos uno de los siguientes parámetros: tasa de crecimiento viral; magnitud de la viremia; respuesta de anticuerpos; o combinaciones de los mismos. Después los resultados de dicha evaluación se usan para predecir el grado de virulencia del aislado nuevo o previamente no caracterizado. Los métodos en general implican administrar o exponer un cerdo sin SRRP a una cantidad del aislado de SRRP nuevo o no caracterizado y dejar que el virus se replique durante un periodo de hasta aproximadamente 15 dias, más preferiblemente de aproximadamente 2-12 dias, todavía más preferiblemente de aproximadamente 3-10 dias y todavía más preferiblemente de aproximadamente 3-7 dias. El modo de administración se puede realizar usando cualquier forma convencional, incluidas la administración oral, intranasal, intramuscular, intra-nódulo linfático, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, y sus combinaciones, pero lo más preferiblemente por administración intranasal. La cantidad de la dosis para administración intranasal preferiblemente es hasta aproximadamente 5 ml, todavía más preferiblemente entre aproximadamente 0.5 ml y aproximadamente 4 ml, todavía más preferiblemente entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 3 ml, y todavía más preferiblemente aproximadamente 2 ml . La concentración de virus en cada dosis debe ser de hasta aproximadamente 5.0 Logio DICTso/ml, más preferiblemente entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 4.0 Logio DICT50/ml, y todavía más preferiblemente aproximadamente de 2.5 a 3.5 Logio DICT5o/ml, y lo más preferiblemente aproximadamente 3.0 Logio DICTso/ml. En un momento o en momentos de tiempo seleccionados durante este periodo de replicación, se toman muestras biológicas del cerdo y se hacen mediciones de la tasa de crecimiento del virus administrado, magnitud de la viremia, respuesta de anticuerpos, y/o sus combinaciones. Después los datos recogidos en estas mediciones se comparan con la tasa de crecimiento, magnitud de la viremia, respuesta de anticuerpos y/o sus combinaciones para un aislado conocido y caracterizado, como una medida de la virulencia prevista de un aislado nuevo o desconocido. Usando los métodos de la presente invención, se midieron la tasa de crecimiento del virus del SRRP, la magnitud de la viremia, la respuesta de anticuerpos y/o combinaciones de estas características, en cerdos a los que se les habia administrado uno de ocho aislados de VSRRP diferentes. Cada uno de estos aislados tiene un nivel de virulencia y manifestaciones clínicas de la enfermedad, conocidos. Estas mismas características también se midieron en cerdos a los que se habia administrado una combinación de los ochos aislados. Más específicamente, cien (100) cerdos de dos-tres semanas de edad, sanos se dividieron aleatoriamente por peso en diez grupos, con 10 cerdos en cada grupo. En todos los cerdos se ensayó la infección de SRRP usando el ensayo de HerdChek ® PRRS ELISA 2XR (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME). Ocho de los grupos recibieron la administración de uno de los ocho aislados, un grupo recibió una administración que consistía en una combinación de los ocho aislados, y el último grupo recibió una administración de medio esencial minimo de Eagle (EMEM) para actuar como grupo de control. Se volvió a titular una muestra de cada inoculación viral para confirmar el titulo. Preferiblemente el titulo de virus administrado se modela para mimetizar un nivel de exposición natural del virus. Se recogieron muestras biológicas en forma de sangre a diferentes tiempos a lo largo del experimento. Cada muestra se analizó mediante aislamiento del virus, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), ensayo de HerdChek ® PRRS ELISA 2XR, y ELISA especifico para proteinas del VSRRP. El aislamiento del virus se realizó en células CL2621 (una linea celular de MA 104) mediante diluciones seriadas y combinándolo con EMEM, gentamicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y Fungizona (Invitrogen Corp., Grand Island, NY) . Después las diluciones se incubaron y se examinó el efecto citopático (ECP) . Se usó el cálculo de Reed-Muench para determinar los títulos. Se llevó a cabo la RT-PCR usando el equipo de QIAamp Viral RNA Mini-Kit ® (Qiagen, Inc., Valencia, CA) y el VSRRP se detectó usando un ensayo de un solo tubo de Tetracore, Inc. (Gaithersburg, MD) . Para determinar la cuantificación del virus, se desarrolló una curva patrón y se determinaron las concentraciones de las muestras desconocidas por extrapolación lineal de los valores umbral del ciclo representados frente a la concentración conocida del producto de transcripción de 3 'UTR.

Las mediciones de anticuerpos usando la relación S/P de ELISA se generaron usando el ensayo de HerdChek ® PRRS ELISA 2XR usando las instrucciones del fabricante. El ELISA especifico para proteínas del VSRRP se llevó a cabo usando proteina de nucleocápside (N) y no estructural 4 (nsp 4) de VR2332 aislado recombinante, expresadas en células BL21 (DE3J-RP (Stratagene, La Jolla, CA) . Todos los cerdos se pesaron al inicio y al final del estudio. Además, cada dia del estudio un veterinario evaluó y puntuó los signos clínicos de la enfermedad de SRRP de cada cerdo. Todos los datos resultantes se analizaron estadísticamente y se compararon grupo por grupo. Nueve de los diez grupos posteriormente se expusieron una segunda vez a un aislado de virus de alta virulencia para permitir la evaluación adicional de los niveles de protección homologa y vacuna frente a la protección heteróloga de tipo silvestre (concepto de exposición de virus vivo) . Después de esta exposición, los animales se evaluaron y se les practicó la necropsia para el análisis usando aislamiento de virus e inmunohistoquimica . La presente invención por lo tanto también proporciona una composición inmunogénica que comprende un aislado de virus del SRRP atenuado. En las formas preferidas, la composición también puede incluir un vehiculo y/o un adyuvante farmacológicamente compatible. Un ejemplo de dicha composición incluirla Abst-1 y/o una forma atenuada de un virus del SRRP que se ha predicho que es virulento por los métodos descritos anteriormente. La presente invención también proporciona un método mejorado para seleccionar un aislado de virus del SRRP, para atenuar e incluir en una composición inmunogénica. El método en general incluye las etapas de a) obtener un aislado de virus del SRRP de virulencia desconocida; b) administrar una cantidad de dicho aislado de virus del SRRP a un cerdo que no tenga SRRP; c) dejar que dicho aislado se replique en el cerdo durante un periodo de aproximadamente 3-15 dias; d) medir la tasa de crecimiento del virus y/o la magnitud de la viremia durante dicho periodo; e) comparar dicha tasa de crecimiento o magnitud de la viremia con la tasa de crecimiento y/o magnitud de la viremia de un aislado de virus del SRRP de virulencia conocida; y f) seleccionar un aislado para atenuar e incluir en una composición inmunogénica basándose en su tasa de crecimiento y/o su magnitud de la viremia comparado con los aislados de virulencia conocida. Seria preferible seleccionar un aislado que se hubiera predicho que era muy virulento para incluir en una composición inmunogénica, aunque se podian usar aislados que se ha predicho que son menos virulentos incluidos los que se ha predicho que no son virulentos. Esto se debe a que los aislados que se ha predicho que son más virulentos tienen mayores tasas de crecimiento y/o magnitudes de viremia, lo cual generalmente induce una respuesta inmunitaria más vigorosa y protectora. Usando los métodos de la presente invención, la selección de qué aislados usar para incluir en composiciones inmunogénicas se simplificará y aumentará la probabilidad de tener una vacuna útil que proteja frente a aislados de virus del SRRP virulentos. Como se emplea en la presente, "tasa de crecimiento" se refiere a la medición de la replicación viral frente al tiempo en el cerdo. En el Ejemplo 1 se proporcionan ejemplos preferidos de estas mediciones. "Magnitudes de la viremia" como se emplea en la presente, se refiere a la concentración de virus que circula en la sangre del cerdo. En el Ejemplo 1 también se proporcionan ejemplos preferidos de esta medición.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica de los títulos medios de virus en el suero frente al tiempo, expresados como logio DICTso/ml para el ensayo del cerdo del Ejemplo 1; La figura 2 es una gráfica de la concentración media de virus del SRRP en el suero en el ensayo de cerdo del ejemplo 1, medido por la RT-PCR en tiempo real; La figura 3 es una gráfica de las relaciones S/P medias frente al tiempo usando un ensayo comercial, de ELISA; La figura 4 es una gráfica que ilustra el análisis de mediciones repetidas para los datos del ensayo de ELISA comercial y de logio DICT50/ml del ejemplo 1, en la que se ha representado gráficamente la media del grupo del área bajo la curva de la relación S/P de ELISA frente a la media del grupo del área bajo el logio DICT50/ml; La figura 5 es una gráfica que ilustra el análisis de mediciones repetidas para los datos del ensayo de ELISA comercial y de concentración de RT-PCR del ejemplo 1, en la que se ha representado gráficamente la media del grupo del área bajo la curva de ELISA frente a la media del grupo del área bajo la curva de concentración de RT-PCR; La figura 6a es una gráfica de absorbancia frente al tiempo para el Ejemplo 1; La figura 6b es una gráfica de absorbancia frente al tiempo, que ilustra el efecto del aislado de VSRRP en la respuesta de la IgG a nsp-4, en la que los datos son valores medios de 10 animales, excepto cuando murieron animales; La figura 7 es una gráfica que ilustra el análisis de mediciones repetidas de datos de nsp-4 y logio DICT50/ml del ejemplo 1, en la que se ha representado gráficamente la media del grupo del área bajo la curva de nsp-4 frente a la media del grupo del área bajo la curva de logio DICT50/ml; La figura 8 es una gráfica que ilustra el análisis de mediciones repetidas usando los datos de calificaciones clínicas y logio DICT50/ml del ejemplo 1, en la que se ha representado gráficamente la media del grupo del área bajo la curva de calificaciones clínicas frente a la media del grupo del área bajo la curva de logio DICT50/ml; y La figura 9 es una gráfica de la calificación IHC para cada aislado en esta solicitud.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Los siguientes ejemplos exponen aislados preferidos y procedimientos de acuerdo con la presente invención. Ha de entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración solamente, y nada en ellos debe considerarse una limitación tras el alcance global de la invención.

EJEMPLO 1 Materiales y métodos : Se obtuvieron 100 cerdos de 2-3 semanas de edad sanos de una piara comercial que no tenia SRRP y se mantuvieron en Veterinary Resources, Inc., Ames, Iowa, bajo la supervisión de un veterinario. Los animales recibieron alimento y agua a voluntad. Todos los cuidadores de animales y personal de laboratorio implicados en el estudio, eran ciegos respecto a los tratamientos dados a los diferentes grupos de animales. Los cerdos se ensayaron con HerdChek® PRRS ELISA 2XR (IDEXX Laboratories Inc. Westbrook, ME) para determinar si algún cerdo estaba infectado con el VSRRP. Todos los cerdos para este ejemplo dieron el ensayo negativo. Después los cerdos se dividieron aleatoriamente por peso en 10 grupos con 10 cerdos por grupo. Se usaron un total de ocho aislados de VSRRP en este ejemplo. Estos aislados se han designado VR-2332, Ingelvac® PRRS MLV, JA 142, Ingelvac® PRRS A P, SDSU 73, Abst-1, MN 184, y 17198-6. Estos ocho aislados abarcan la historia de la enfermedad del SRRP, presentan un amplio intervalo de niveles de virulencia, y representan manifestaciones importantes de la enfermedad clinica. Todos los aislados de virus crecieron fácilmente en las células de la linea celular de ATCC CL2621 (CL2621 es una linea celular patentada de NVSL, Ames, IA, ) (una linea celular de riñon de mono MA-104) . Tres de los aislados de campo principales, VR-2332, JA-142, y SDSU 73, también tenian formas atenuadas, Ingelvac® PRRS MLV (Boehringer Ingeiheim Vetmedica Inc., St. Joseph, MO) , Ingelvac® PRRS ATP (Boehringer Ingeiheim Vetmedica Inc., St. Joseph, MO) y Abst-1, respectivamente. Todas estas formas atenuadas presentaban una virulencia baja o indetectable que se obtuvo por el pase in vitro para la atenuación. El aislado de VSRRP ATCC VR-2332 se aisló en 1991 en Minnesota y se usó en el pase en cultivo celular tres. La forma atenuada de este virus está disponible en el comercio con la marca registrada Ingelvac® PRRS MLV. El aislado de VSRRP JA 142 (ATCC N° PTA-6504), suministrado por William Mengeling, National Animal Disease Center, Ames, Io a, se aisló en 1997 en Iowa de un caso de "aborto repentino" grave de fallo reproductivo y se usó en el pase en cultivo celular cinco. La forma atenuada de JA 142 se vende en el comercio con el nombre comercial Ingelvac® PRRS ATP y se ha asignado el ATCC N° VR-2638. El VSRRP SDSU 73 (ATCC N° PTA-6322) se recuperó en Iowa de un caso grave de enfermedad reproductiva en 1996 y se usó en el pase en cultivo celular uno. La forma -atenuada de SDSU 73, designada Abst-1 (ATCC N° PTA-6320), se obtuvo por 52 pases. El aislado de VSRRP 17198-6 (ATCC N° PTA-6321) se obtuvo en Oklahoma en 1997 de un rebaño que experimentaba enfermedad reproductiva grave y se usó en el nivel de pase cuatro. El aislado de VSRRP MN 184 (ATCC N° PTA-6319) se obtuvo en 2001 de una granja de cerdos que experimentaba una enfermedad reproductiva grave y mortalidad de cerdos, en Minnesota del sur y fue suministrado por Kurt Rossow, University of Minnesota, St. Paul. Este aislado se usó en un pase en cultivo celular de uno. Adicionalmente, se produjo una mezcla que consistía en una combinación de todos los aislados. El dia 0, cada uno de los ocho aislados de VSRRP y la mezcla de VSRRP se diluyeron a aproximadamente 3.0 Logio DICT50/ml en medio esencial minimo de Eagle (EMEM) (JRH Bioscience, Lenexa, KS) que contenia FBS al 4% (JRH Bioscience, Lenexa, KS) y se administró por via intranasal a cerdos con una dosis de 2 ml (1 ml por orificio nasal) . El grupo de control sin tratar recibió 2 ml de medio. Los inóculos se titularon en placas de 96 pozos que contenían células CL2621 de tres dias de edad para confirmar la titulación usando el método de Reed-Muench (Reed et al., 1938) . Los títulos observados administrados a los cerdos, junto con una descripción del nivel de virulencia e información de aislamiento, se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Virulencia y titulo de inoculación de los aislados oo * aislados de VSRRP atenuados . ** Mezcla que contiene los ocho aislados *** Resumen de lesiones pulmonares descritas en el Symposium on Emerging Diseases , Roma 2003.

Después los aislados se compararon para determinar su similitud genética mediante un análisis de su porcentaje de identidad de secuencia. La identidad de secuencia se determinó enviando muestras de los virus al Laboratorio de Diagnóstico de la Universidad de Minesota para el análisis de secuencias. Se proporcionaron los resultados de ORF 5-6 y después se compararon con una secuencia de consenso del virus del SRRP. Se indicaron las diferencias de pares de bases individuales y después se comparó el % de identidad de secuencia entre los aislados. Como son conscientes los expertos en la técnica, también se puede hacer una búsqueda amplia en diferentes sitios web. Por ejemplo, la Universidad de Minesota proporciona una base de datos de VSRRP (ccgb.umn.edu/cgi-bin/common/web_blast . cgi) que lista secuencias de aislados de 1989-2003. Otro sitio que se usa con frecuencia es el enlace a NCBI BLAST que se encuentra en ncbi . nlm. nih . gov/BLAST . Como se muestra por el porcentaje de identidad de secuencia y el dendograma en la Tabla 2, los aislados de campo virulentos son genéticamente bastante distintos y representan un grupo diverso de aislados de VSRRP. En contraste, las parejas de VSRRP parental y de vacuna eran genéticamente casi idénticas. La comparación por parejas y el dendograma de la Tabla 2 se generaron usando el paquete de software de Lasergene de herramientas de análisis de secuencias (DNASTAR, Inc. (Madison, Wl)).

Tabla 2. Comparaciones por parejas de la secuencia de nucleótidos del ORF5 de los aislados de VSRRP virulentos y atenuados usados en el estudio. El porcentaje de similitud se muestra en la parte superior derecha y el porcentaje de divergencia se muestra en la parte inferior izquierda de la tabla. El dendograma muestra la relación genética de los aislados. El corte indica 1 cambio de nucleótido por 100 residuos. VR2332 es el aislado original de Ingelvac PRRS MLV, JA 142 es el aislado original de Ingelvac PRRS ATP y SDSU 73 es el aislado original de Abst-1.

Porcentaje de identidad Ingelvac Ingelvac PRRS PRRS MLV ATP 17198- VR 2332 JA-142 SDSU 73 Abst-1 MN 184 6 VR 2332 99.7 91.0 90.5 90.0 89.6 86.4 90.4 Ingelvac PRRS MLV 0.3 90.7 90.2 89.7 89.2 86.4 90.0 JA-142 9.7 10.1 99.2 92.7 92.2 87.2 92.2 Ingelvac PRRS ATP 10.3 10.7 0.8 91.9 91.4 86.4 91.4 SDSU 73 10.9 11.3 7.8 8.8 99.5 87.2 91.7 Abst-1 11.5 11.9 8.4 9.4 0.5 86.7 91.2 MN 184 15.5 15.5 14.4 15.5 14.4 15.1 86.1 17198-6 10.5 10.9 8.8 9.7 9.0 9.6 15.9 Porcentaje de divergencia El dia 49, se administraron por via intranasal 2 ml de aislado virulento del virus del SRRP MN 184 a los grupos 1-9. El aislado MN 184 se diluyó en MEM + FCS al 4%, de modo que la concentración era igual a log 3.0 +/-0.5 por ml. El virus de estimulación se tituló en placas de 96 pozos que contenían células CL2621 que tenian tres dias para ensayo. Los animales se evaluaron durante 14 dias y después se les practicó la necropsia.

Evaluación de la Viremia Se recogieron muestras de sangre de cada cerdo en cada grupo en tubos Vacutainer los dias 0, 1, 3, 7, 15, 21, 28, 35, 42 y 49. El suero se separó de la sangre entera coagulada por centrifugación a 6000 rpm durante 20 minutos. Después las muestras de suero se dividieron para el análisis mediante aislamiento del virus, ensayo de la DICT50, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR) , ensayo de HerdChek® PRRS ELISA 2XR, y ELISA especifico para proteinas del VSRRP. En este estudio las muestras de suero se procesaron inmediatamente después de recogerlas y se enfriaron en hielo en las 3 horas siguientes a la obtención. Las muestras se almacenaron durante un máximo de 24 h a 4°C y después a -70°C. El suero ensayado por RT-PCR se congeló a -70°C el dia en que se recogió y se almacenaba hasta que podia realizarse el ensayo, momento en el que solo la serie de muestras que se podia ensayar en las siguientes 24 horas se descongelaba, extraía y ensayaba. Para el ensayo de la DICT50, se añadieron 100 µl de suero de cada cerdo, en un tubo de dilución que contenia 900 µl de EMEMm + FBS al 2% + gentamicina 50 µg/ml (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) ' + Fungizona 2.5 µg/ml (Invitrogen Corporation, Grand Island NY) . Este tubo se agitó con vórtice y se transfirieron 100 µl a otro tubo de dilución que contenia 900 µl de EMEMm + FBS al 2% + gentamicina 50 µg/ml + Fungizona 2.5 µg/ml. Este procedimiento se repitió hasta que se alcanzó una dilución final de 10~6. Se cultivaron en placa cuatro replicaciones para cada dilución en placas de 96 pozos, que contenían las CL2621 (células MA 104), 100 µl por pozo, a 37°C y C02 al 4% durante ocho dias. Después en cada pozo se examinó el efecto citopático (ECP) y los títulos se determinaron usando el cálculo de Reed-Muench. Para el aislamiento de los virus se añadieron 100 µl de suero a cada uno de los pozos de ensayo que contenían células MA 104 por duplicado. Las placas después se incubaron durante una hora a 37°C y C02 al 4%. Después se añadieron 500 µl de EMEM + FBS al 2% + gentamicina 50 µg/ml + Fungizona 2.5 µg/ml a cada pozo. Después las placas se dejaron incubar a 37°C con C02 al 4% durante ocho dias, y después se examinó el ECP en cada pozo. Para extraer el ARN viral del suero para la RTPCR cuantitativa, se usó el equipo de QIAamp Viral RNA Mini-Kit® (Qiagen Inc. Valencia, CA) como se describe en las instrucciones del equipo. Para la PCR en tiempo real, Tetracore Inc. (Gaithersburg, MD) suministró un ensayo de RT-PCR en un solo tubo, en tiempo real, disponible en el comercio, para detectar el VSRRP de EE.UU. y se usó para detectar el ARN del VSRRP. Se diseñaron una sonda de nucleasa 5' de unión al surco menor (MGB) y cebadores a partir de la región no traducida 3' (UTR) de la región genómica del VSRRP por alineamiento de aislados de GenBank y basándose en áreas conservadas del cebador 3 ' UTR y la región de sonda. El ARN del VSRRP se transcribió en un tubo individual usando un volumen de reacción de 25 µl que consistía en mezcla original de VSRRP de EE.UU. de Tetracore (18.9 µl de mezcla original, 2 µl de mezcla enzimática 1, 0.1 µl de mezcla enzimática 2) y 4 µl de ARN extraído. Los tubos de reacción se cargaron en el bloque Smart Cycler II® (Cepheid, Sunnyvale, CA) y se establecieron los ajustes del software de detección fluorescente para el cálculo automático de los valores base con la resta de la señal de fondo. El programa del ciclador térmico consistía en 52°C durante 1800 segundos, 95°C durante 900 segundos, y 45 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 61°C durante 60 segundos y 72°C durante 60 segundos. Una reacción de PCR se consideró positiva si el nivel del ciclo umbral (Ct) se obtenía a =45 ciclos. Para la cuantificación, se usaron cantidades conocidas de producto de ARN transcrito in vitro en diluciones seriadas (de 1 x 10"1 a 1 x 108 copias/µl) para generar una curva patrón. Las concentraciones de copia/ml de las muestras desconocidas se determinaron por extrapolación lineal de los valores de Ct representados gráficamente frente a las concentraciones conocidas del producto transcrito de 3 'UTR.

Medición de anticuerpos Las relaciones de S/P de ELISA se generaron realizando el ensayo de HerdChek® PRRS ELISA 2XR (INDEXX Laboratories, Westbrook, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ELISA especifico de proteínas del VSRRP para el HerdChek® se llevó a cabo con proteína de nucleocápside (N) y no estructural 4 (nsp) de aislado de VR2332 recombinante, que se expresaron en células BL21 (DE3)-RP (Stratagene) a partir del plásmido pET 24b como proteínas de fusión que contenían un marcador myc en el amino terminal y un marcador 6x histidina en el carboxilo terminal. Las proteínas desnaturalizadas se dializaron en Tris HCl 0.1 M, pH 8, guanidina-HCl 0, 6 M, EDTA 2 mM y se ajustaron a una concentración de 3 mg/ml.

Se añadió DTT hasta 300 mM y la disolución se filtró a través de una membrana de 0.45 µm. Se añadió proteína reducida en tampón de replegado (Tris HCl 100 mM, pH 8.0, L-arginina 0.5 M, glutatión oxidado 8 mM, EDTA 2 mM, pepstatina A 10 µM, leupeptina 10 µM y PMSF 1 mM) , se filtró (0.22 µm) y se agitó durante una noche. La proteína purificada se concentró por filtración de flujo tangencial (Pellicon XL Ultracel PLC 5 kd, Millipore) y se dializó contra Tris HCl 20 mM, pH 8.0. Las proteínas se analizaron en un bioanalizador Agilent 2100 con el equipo de Protein LabChip. Las soluciones de proteinas purificadas se almacenaron a -80°C. Los ELISA específicos de proteína se llevaron a cabo por revestimiento de placas de microtitulación con 100 ng de proteína recombinante en tampón de carbonato, pH 9.6, o con amortiguador solo. Las placas se bloquearon con leche deshidratada sin grasa al 2.5% en solución salina amortiguada con fosfato que contenía Tween 20 al 0.1% (PBST). Se aplicaron 100 µl de una dilución 1:2000 de suero a los pozos por duplicado durante 2 horas, después de lo cual las placas se lavaron con PBST y la unión del anticuerpo se detectó por incubación con IgG anticabra de cerdo conjugada con peroxidasa de rábano (cadenas pesada + ligera (KPL, Gaithersburg MD) ) diluida 1:5000 durante 1 hora, seguido de lavado y desarrollo de color con 100 µl de sustrato de TMB (KPL) . Las reacciones se pararon con ácido fosfórico 1 M y las placas se leyeron a 450 nm.

Pesos corporales Todos los cerdos se pesaron el día 0 (primer día del estudio) y el día 49 (final del estudio) . Los cerdos se pesaron en un sistema de balanza de grúa electrónica portátil Weigh-Tronix™ modelo 615XL, (Weigh-Tronix Inc., Fairmont, MN) . La balanza se calibró usando pesos de prueba certificados antes y después de cada uso.

Calificaciones clínicas Cada día del estudio, un veterinario calificó a cada cerdo según los signos respiratorios, de comportamiento y tos en una escala de uno a cuatro para cada signo clínico. Un animal normal tenia una calificación de tres, la enfermedad clinica máxima se puntuaba nueve y un animal muerto recibía una calificación de 12. Se enviaron muestras de todos los animales que murieron en el estudio al Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad estatal de Iowa para el examen patológico.

Evaluación inmunohistológica de los pulmones Se fijó con formalina una muestra de pulmón de cada cerdo el día de la necropsia para ensayar la inmunohistoquímica y para el examen microscópico de lesiones compatibles con el VSRRP. Este ensayo se llevó a cabo en el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad estatal de Iowa.

Análisis estadístico Todos los datos se importaron al programa SAS versión 8.02 para la gestión y análisis de los datos. Se generaron los resúmenes estadísticos, incluidas la media, desviación típica, error típico, mediana y distribuciones de frecuencia para todas las variables de resultados según fuera adecuado. Los datos de peso, RT-PCR y Logio DICT5o/ml se analizaron por ANOVA de un factor para las diferencias generales entre los grupos de tratamiento, con ensayos por parejas para las diferencias entre los grupos de tratamiento por el ensayo t de diferencia significativa mínima. Todos los ensayos para las diferencias entre grupos se diseñaron como ensayos de dos colas. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p = 0.05. Se hicieron algunos cambios de los datos para facilitar los análisis de correlación. Los valores de Logio DICT50/ml listados como <2.00 se ajustaron a 1.0. Los valores de RT-PCR negativos se ajustaron a 1.0 y todos los valores de RT-PCR se normalizaron por transformación a la base logarítmica 10 antes del análisis. Los resultados del grupo de control no se incluyeron en los análisis de correlación. Los resultados de cada cerdo se convirtieron en un área bajo la curva aproximada, usando la regla del trapecio. El área bajo la curva se calculó para el periodo de estudio entero, desde la primera observación al dia 15, y desde el día 15 hasta la última observación, aunque en las figuras sólo se muestra el periodo de estudio entero.

Resultados Aislamiento del virus y cuantificación de Logio DICT50/ml Antes de la exposición el día de la infección, no había animales que dieran positivo el ensayo para el VSRRP. El día 1, después de infección intranasal, sólo 13 animales en 5 grupos dieron positivo el ensayo para el virus. Sin embargo, a los 3 días después de la infección todos los animales que se habían infectado con aislados de campo, excepto para el aislado 17198-6, eran positivos para el virus con valores medios de logio DICT50/ml en el intervalo de 2.1 (SDSU-73) a 3.9 (MN 184). En contraste, los animales inoculados con aislados atenuados eran uniformemente negativos por cultivo celular. Estos resultados se proporcionan en la figura 1. Los niveles máximos de viremia, de 3.6 a 4.6 logio DICT50/ml se alcanzaron el día 7 para cuatro de los cinco aislados virulentos. El aislado 17198-6 alcanzó el nivel máximo el dia 15. Los títulos permanecieron cercanos o por encima de 2 logio DICTso/ml en todos los virus virulentos durante 21 días, excepto para los cerdos infectados con JA 142 que tenían títulos por debajo de este nivel. Los niveles de viremia en los cerdos inoculados con aislados de VSRRP atenuados eran menores que en los cerdos inoculados con aislados de campo virulentos. Las medias de los grupos de los aislados atenuados alcanzaron niveles máximos con títulos por encima de un log menor que el máximo del título del grupo menos virulento. El aislado Abst-1, no se volvió a aislar, con excepción del días 3 después de inoculación. La viremia de Ingelvac® PRRS MLV fluctuaba entre 0.5 y 1.0 logio DICT50/ml de los días 7 a 28, y Ingelvac® PRRS ATP variaba entre 0.4 y 1.2 log10 DICT50/ml de los dias 7 a 28. Los virus aislados atenuados no se recuperaron del suero después del dia 28, y se recuperaron los virus de sólo dos de los grupos de aislados de campo virulentos, los cerdos infectados con la mezcla y los infectados con MN 184 el día 35 (también se muestra en la Fig. 1) . Casi todos los cerdos eran no virémicos por aislamiento del virus los dias 42 y 49. En conjunto, se observó que los aislados más virulentos se replicaban más rápido y con títulos mayores en los cerdos de lo que lo hacían los aislados atenuados. Los cerdos infectados con el aislado MN 184, mostraron, en particular, un aumento muy rápido de la replicación viral empezando el dia 3 y alcanzando un máximo por encima de 4,5 logio DICT5o/ml el día 7. Después de alcanzar el nivel máximo, la viremia de MN 184 disminuyó de forma constante pero mantenía todavía un título significativamente mayor (ensayo t, p=0.05) que todos los demás aislados los días 28 y 35. Se observó una tendencia similar en todos los demás grupos virulentos que quedaban, en concreto VR2332, JA 142, SDSU 73 y la mezcla (véase, Fig. 1) . Los cerdos infectados con 17198-6 siguieron la misma tendencia general descrita para el grupo infectado con MN 184, pero no tan cercana. Los grupos de cerdos a los que se administraron aislados atenuados (Ingelvac® PRRS MLV, Ingelvac® PRRS ATP, y Abst-1) siguieron una tendencia diferente. Mostraron un aumento moderado del título de virus, empezando después del día 3 y que alcanzó un máximo entre los dias 7 y 15, con un título de virus mayor que un log menos que cualquiera de los grupos de exposición virulenta y varios órdenes de magnitud menos que el grupo infectado con MN 184. Los títulos observados en estos grupos de exposición atenuada después disminuyeron a cero el dia o antes del día 35 (Véase, Fig. 1) . Cuando se comparan las medias de los grupos después de la segunda exposición, hay un aumento grande de los títulos de virus de los grupos atenuados, mientras que los grupos virulentos muestran un aumento menor o no muestran aumento en absoluto. Por ejemplo, Abst-1 tenia un título de 3.76 log siete días después de la segunda exposición, mientras que MN 184 tenía un título de cero. Los otros grupos atenuados alcanzaron el nivel máximo tres días después de la segunda exposición. El titulo más alto observado en cualquiera de los grupos virulentos después de la segunda exposición fue log 1.32 vista tres dias después de la exposición a JA 142.

Cuantificación del virus por RT-PCR en tiempo real Los niveles de viremia también se determinaron por la RT-PCR en tiempo real, ya que era posible que el crecimiento en células CL2621 no fuera igual para todos los aislados, y porque la RT-PCR puede ser una medición más sensible para la viremia que el crecimiento en células. Como se muestra en la Fig. 2, los grupos de exposición virulenta mostraron un aumento notable de la concentración media el dia 1, y todos los grupos alcanzaron un nivel máximo por encima de 8 log/ml entre los dias 7 y 15. Las concentraciones del grupo de exposición virulenta después fueron disminuyendo gradualmente durante las siguientes semanas, alcanzando concentraciones inferiores a 4 log/ml el dia 49. Los grupos de exposición a aislados atenuados mostraron un aumento mucho menos espectacular de la concentración, que también empezó alrededor del día 1 y el título medio del grupo nunca alcanzó o superó 7 log/ml (Fig. 2) . Las concentraciones observadas para los grupos de exposición atenuada se mantuvieron en niveles que fluctuaban, mostrando un amplio intervalo de valores en las semanas siguientes a la exposición. Las fluctuaciones se debían principalmente a los niveles esporádicamente altos de un solo cerdo. Los tres grupos de exposición a aislados atenuados alcanzaron todos niveles máximos en días diferentes del estudio. El grupo de Ingelvac® PRRS MLV alcanzó el nivel máximo con una concentración de 4.31 log/ml el día 28, el grupo de Ingelvac® PRRS ATP alcanzó el nivel máximo con 6.58 log/ml el día 3, y el grupo de Abst-1 alcanzó el nivel máximo con 6.85 log/ml el dia 35, que era el título más alto alcanzado por un aislado atenuado (Fig. 2) . Además, se observó que la concentración media de los grupos de aislados virulentos era significativamente mayor (P<0.05) que la concentración media de los grupos de aislados atenuados los días 3 y 15, pero el día 49 la concentración media de los grupos de aislados virulentos era significativamente menor (P<0.05) que la de los grupos de aislados atenuados.

Ensayo de HerdChek® PRRS ELISA 2XR Como se muestra en la figura 3, la respuesta inmunitaria humoral al VSRRP, medida por las relación S/P del ensayo de PRRS ELISA HerdChek® 2XR, mostraba que las medias de los grupos de exposición a aislados virulentos subían por encima del punto de corte de 0.4 para un resultado positivo el dia 15. En contraste, las medias de los grupos de exposición a aislados atenuados eran negativas y los tres grupos permanecieron por debajo de 0.4 hasta después del dia 21. Los grupos de Ingelvac® PRRS MLV y Ingelvac® PRRS ATP mostraron resultados positivos el dia 28, pero el grupo de Abst-1 no mostró una relación S/P media por encima de 0.4 hasta el dia 42. Comparando la respuesta humoral de los grupos infectados con aislador virulentos o con la mezcla con los grupos inoculados con aislados atenuados, estaba claro que la cinética y magnitud de la respuesta de anticuerpos estaba asociada con el nivel de viremia, en particular entre los días 14 y 35 después de la infección. Esta observación está además apoyada por la correlación entre los niveles de viremia y respuestas de anticuerpos humorales, determinada por comparaciones por parejas de las relaciones S/P del ensayo de HerdChek® PRRS ELISA 2XR respecto a la titulación de virus o la RT-PCR. Las figuras 4 y 5 muestran que la respuesta de anticuerpos humorales está muy asociada con la carga viral durante todo el periodo de estudio, con un coeficiente de correlación de r=0.858 para la titulación viral y r=0.794 para la RT-PCR. Estas asociaciones eran muy significativas (p<0.0001 en cada caso) . Además, los aislados atenuados muestran respuestas de anticuerpos y cargas virales bajas, mientras que los aislados virulentos muestran respuestas altas.

ELISA específico de proteínas del VSRRP Para comprender algo mejor la relación entre las diferencias en los inoculados dé VSRRP y las respuestas inmunitarias humorales, se determinaron los títulos de anticuerpos contra N, la proteína estructural principal, y nsp 4, una proteasa no estructural esencial pero minoritaria. La Fig. 6a ilustra que la cinética de la respuesta de IgG anti-N de la nucleocápside era casi idéntica en todos los grupos de cerdos, con un título máximo el día 28, seguido de una disminución fuerte en los siguientes días 7-14, después de lo cual los niveles se mantuvieron o aumentaron ligeramente entre los dias 42 y 49. La magnitud de la respuesta para cada aislado era similar a la encontrada en los resultados del ensayo de HerdChek® PRRS ELISA 2XR, y concordantes con los niveles de viremia. Los títulos máximos más bajos el dia 28 se observaron en los grupos inoculados con aislados atenuados, y el título más alto se alcanzó en los cerdos infectados con el aislado MN 184 muy virulento. El dia 49 la titulación de anti-N era equivalente en todos los grupos excepto para MN 184 y el de mezcla, lo que sugería que la respuesta humoral a MN 184 podia ser cualitativamente diferente. Además, sólo sobrevivieron 5 cerdos al dia 49 en cada uno de estos dos grupos, lo cual se reflejaba en el mayor error típico el día 49 en el grupo de MN 184. Como se muestra en la figura 6b, la respuesta de IgG a nsp 4 era sustancialmente diferente que a N. No se detectó anticuerpo anti-nsp 4 antes del día 21, la respuesta global era mucho más débil, y no se detectó respuesta significativa en los grupos que recibieron Ingelvac® PRRS MLV y Abst-1. Además, la magnitud de la respuesta anti-nsp 4 no estaba asociada con el nivel de viremia. Las respuestas a VR 2332, JA 142, MN 184, y la mezcla, eran todas equivalentes, con un máximo el día 28, seguido de una disminución al día 35, y después aumento otra vez al día 42, mientras que la magnitud transcurso del tiempo y duración de la viremia variaron entre estos cuatro grupos. La figura 7 ilustra que cuando se examinan los análisis de mediciones repetidas, datos para ELISA para nsp 4 comparado con datos de Logio DICTso/ml, se puede ver que no hay correlación entre el nivel de viremia y la respuesta de anticuerpos humorales a nsp 4. También había una pequeña respuesta secundaria después de la segunda exposición el dia 49 al aislado MN 184.

Peso corporal No había una diferencia significativa en el peso medio de ninguno de los grupos el dia 0 del experimento (P = 0.099). El dia 49, los cerdos inoculados con el aislado atenuado Abst-1 tenían el peso medio más alto, el cual era significativamente mayor que el de todos los demás grupos, excepto el grupo de control (Tabla 3) . También, el día 49, los pesos medios de todos los grupos de exposición a aislados virulentos, excepto el grupo de 17198-6, eran significativamente menores que el grupo de control (Tabla 3) . Los pesos medios de los grupos de exposición a aislados atenuados Ingelvac® PRRS MLV y Ingelvac® PRRS ATP y el grupo de control, eran estadísticamente equivalentes (Tabla 3) .

Tabla 3. Pesos corporales medios Aislado Día 0 Día 49 VR 2332 6.381 33.5b Ingelvac® PRRS MLV 6.56 34.6* JA 142 6.42 32.7b Ingelvac® PRRS ATP 6.24 35.0* SDSU-73 6.59 32.9b Abst-1 6.69 39.4a MN 184 6.73 23.7C 17198-6 6.36 34.5* Mezcla** 6.51 23.0C Control 6.48 38.4* 1 Los pesos están en kg no había diferencias significativas en los pesos medios el dia 0. * Indica pesos estadísticamente equivalentes entre esos grupos el día 49. ** Mezcla es una mezcla que contiene los ocho aislados. a Significativamente mayor que todos los grupos excepto que el grupo de control (p = 0.05) . b Significativamente menor que el grupo de control. c Significativamente menor que todos los demás grupos.

Calificaciones clínicas Se observaron aumentos de las calificaciones clínicas medias en sólo cuatro de los grupos de exposición virulenta : JA 142 , SDSU 73 , MN 184 y la Mezcla . Estas calificaciones más altas se mantuvieron a lo largo de todo el estudio, mientras que el resto de los grupos , tanto los de exposiciones virulentas como atenuadas , tuvieron calificaciones clínicas esencialmente normales durante el periodo del estudio . La única causa principal de cambios en las calificaciones clínicas medias observadas en este estudio se produj o cuando uno o más animales murieron en el grupo de tratamiento asociado (Tabla 4 ) . Tabla 4 . Mortalidad de los cerdos (después de la exposición Grupo Aislado Mortalidad Día(s) de Muerte (s) 1 VR 2332 0/10 N/E 2 Ingelvac® PRRS MLV 0/10 N/E 3 JA 142 1/10 = 10% 17 4 Ingelvac® PRRS ATP 0/10 N/E 5 SDSU 73 2/10 = 20% 9.23 6 Abs.-l 0/10 N/E 7 MN 184 5/10 = 50% 14, 14, 17, 23, 41 8 17198-6 0/10 N/E 9 Mezcla** 5/10 = 50% 12, 16, 17, 21, 21 10 Controles 2/10* 41, 48 VSRRP atenuado 0/30 = 0% VSRRP virulento 13/60 = 22% Todas las muertes en los grupos de tratamiento se atribuyeron a neumonía intersticial no supurativa moderada o grave debida al VSRRP con infección bacteriana secundaria . * Muertes atribuidas a neumonía bacteriana sin implicación del VSRRP . ** Mezcla es una mezcla que contiene los ocho aislados .

La gravedad de la enfermedad clinica estaba muy asociada con la carga viral (p<0.001 para la titulación de virus) . Como se muestra en la figura 8, las calificaciones clínicas más altas eran para los grupos infectados con MN 184 y la Mezcla. El 50 por ciento de los cerdos de cada grupo murió, y la titulación de virus indicó que el nivel de infección era sustancialmente más alto que para todos los demás grupos. Las diferencias de carga viral determinadas por RT-PCR eran menos marcadas (no se muestran los datos) y la correlación de los signos clínicos con la carga viral por RT-PCR era menor que con la titulación de virus (r=0.556 frente a r=0.803, respectivamente). Las calificaciones clínicas en el grupo 10 (control) aumentaron después de la muerte de dos cerdos por neumonía bacteriana. Se demostró que ambos cerdos eran negativos para el VSRRP por tinción inmunohistoquímica de tejido pulmonar, aislamiento de virus negativo y análisis por PCR en tiempo real, y la falta completa de seroconversión por ensayo de HerdChek® PRRS ELISA 2XR o ELISA de proteínas específicas. Resultados posteriores indicaron que había varios patógenos bacterianos en los animales que murieron inesperadamente durante el estudio, y estas muertes se atribuyeron de forma probable a infección bacteriana secundaria (Tabla 5) .

Tabla 5 . Causa de la mortal idad después de la exposición Cerdo n° Grupo Causa de la muerte Día de la muerte 993 JA 142 SRRP y Streptococcus suis 17 948 C Coonnttrrooll NNeg Arcanobacterium pyogenes y Pasteurella multocida 41 983 C Coonnttrrooll N ls eg A. pyogenes y P. multocida 48 922 SDSU 73 SRRP y neumonía bacteriana* 9 918 SDSU 73 S R R P y Escherichia coli 23 973 MN 184 SRRP y Actinobacillus suis 14 992 MN 184 SRRP y A. suis 14 980 MN 184 SRRP y E. coli 17 971 MN 184 SRRP y E. coli 23 958 MN 184 SRRP y E. coli 41 976 Mezcla SRRP y A. suis 12 970 Mezcla SRRP y V S. suis 16 972 Mezcla SRRP y S. suis 17 995 Mezcla SRRP y S. suis 21 969 Mezcla SRRP y A. pyogenes 21 El informe de diagnóstico indicaba "neumonía bacteriana" sin agente específico listado.

Evaluación inmunohistológica de los pulmones Aunque las calificaciones IHC medias y las lesiones por VSRRP observadas para los grupos individuales no eran significativamente diferentes, se vio una diferencia significativa comparando las calificaciones IHC según la virulencia. Para las calificaciones IHC medias y las lesiones por VSRRP véase la Fig. 9 y la Tabla 6.

Tabla 6: Calificaciones IHC medias basadas en la virulencia * = Significativo a p = 0.05 Discusión Un objetivo de estos ejemplos era examinar diferentes aislados de VSRRP con niveles conocidos de virulencia para determinar si había una relación con la replicación in vivo que se pudiera usar para predecir la virulencia de aislados de VSRRP, sin necesidad de llevar a cabo experimentos de exposición controlados. Además, tenia interés determinar la relación entre la virulencia del aislado, los niveles de viremia y la respuesta de anticuerpos humorales. Finalmente, puede tener interés desarrollar vacunas contra los aislados de VSRRP que se encuentra que son virulentos usando los métodos de la presente invención. Un objetivo seria tener estas vacunas que proporcionaran algún grado de protección contra otros aislados virulentos; sin embargo, dicha eficacia cruzada puede no ser universal para todos los aislados de VSRRP y puede ser necesario el ensayo adicional. Sin embargo, está claro que la presente invención proporciona una herramienta eficaz para identificar candidatos principales para el desarrollo de vacunas. Con el fin de ensayar los aislados de VSRRP en las mismas condiciones, era necesario usar dosificaciones de vacunas autorizadas que estuvieran por debajo de la dosis mínima de inmunización establecida por el USDA y que no fueran representativas de una dosis comercial. Además, la ruta intranasal de la administración de vacunas de MLV usada en el estudio, no estaba de acuerdo con el etiquetado de la USDA y se usó solo para imitar una exposición más natural. La dosis comercial típica de las vacunas de SRRP vivas modificadas (Ingelvac PRRS y Ingelvac PRRS ATP) es mucho mayor que la usada en este ensayo experimental. Estas dosis bajas experimentales de vacuna de SRRP viva modificada no representan la dosificación y forma real del producto, usadas en la técnica y explican fácilmente la respuesta serológica descrita. Usando una dosis de vacuna comercial, los títulos serológicos medidos por el ensayo de IDEXX serían detectables sobre el día 14. En este ensayo usando títulos de aproximadamente 3 log, esta respuesta serológica se retrasaba y era menor. Esto era de esperar, pero se hizo para asegurar la uniformidad de la administración de títulos entre los grupos y facilitar el análisis y la comparación entre aislados virulentos y atenuados. Aunque no se aborda específicamente en este ejemplo, es probable que el efecto de la dosis sea mucho más significativo para un virus atenuado o menos virulento que para un virus de campo virulento que puede crecer rápidamente y recuperarse por encima de 4 log/ml en el suero del cerdo en los siguientes 3-7 días de exposición. La dosis comercial intramuscular recomendada más alta da relaciones S/P en el ensayo de HerdChek® PRRS ELISA 2XR mayores que el valor de corte de 0.4 a los 14 dias después de la vacunación, que es la mitad del tiempo observado para las dosis usadas en este estudio (Roof et al., 2003). La dosis nominal usada en este estudio, 2 x 103 DICT50 por animal, produjo 50% de mortalidad en los grupos que recibieron el aislado MN 184 y respuestas antinucleocápside en todos los grupos. No se ensayaron dosis mayores, puesto que una mortalidad excesiva en los grupos expuestos a aislados muy virulentos habría comprometido los objetivos de este estudio. Además, estudios previos no habían mostrado diferencias de signos clínicos y viremia en cerdos jóvenes inoculados con aislado VR2332 con dosis de 102"2, 103-2 y 104-2 DICT50 por animal. Los resultados tanto de Logio DICT50/ml como los resultados de la RT-PCR en tiempo real mostraron que los niveles de viremia variaban significativamente entre los grupos después de la exposición al VSRRP. Esto indica que la tasa de crecimiento del VSRRP en los cerdos es una característica fenotípica de los virus, independiente de la posible variación de la susceptibilidad de los cerdos a la infección. Además, la atenuación del VSRRP por adaptación al crecimiento en células CL2621 redujo no solo su capacidad de crecimiento en cerdos, sino que también alteró la cinética de la replicación viral, de modo que la viremia máxima se producía más tarde. Chang et al. (2002) hicieron una observación similar y mostraron que incluso un periodo limitado de pase en cultivo celular del aislado de VSRRP moderadamente virulento VR 2332 reduela el crecimiento viral en los cerdos y retrasaba significativamente el tiempo para alcanzar la viremia máxima. Sin embargo, un retraso de tiempo para alcanzar la viremia máxima no es un diagnóstico para el pase en cultivo celular in vitro o para la atenuación, puesto que el aislado 17198-6 muy virulento también mostró un retraso de tiempo para alcanzar la viremia máxima. En conjunto, los aislados virulentos mostraron niveles de viremia sustancialmente mayores en el suero que los aislados atenuados con dosis equivalentes de inoculación. Por ejemplo, el titulo de virus más alto observado en cualquier de los grupos de exposición a aislados atenuados fue 1.22 log el día 15 en cerdos a los que se les había dado Ingelvac® PRRS ATP, mientras que el titulo más bajo de cualquier grupo virulento el dia 15 fue 2.40 log en el grupo de SDSU 73. El máximo de viremia los días 3-7 y los niveles de virus detectados (todos >3.5 log/ml) eran bastante uniformes entre los aislados de VSRRP virulentos, aunque para MN 184 eran significativamente mayores en magnitud y duración, con títulos de virus todavía presentes los días 28 y 35. Esto apoya el concepto de que los aislados de VSRRP muy virulentos se replican a un título sustancialmente mayor in vivo de los que lo hacen los aislados atenuados o poco virulentos, pero no establece una relación cuantitativa directa entre el nivel de virulencia y el nivel o la tasa de crecimiento in vivo entre los VSRRP de tipo silvestre (Haynes et al. 1997). Los grupos mostraron una amplia variedad de protección desde la segunda exposición con el aislado MN 184. Por ejemplo, no se detectaron virus en el grupo de MD 184 o de Mezcla, ambos recibieron el aislado MN 184 inicialmente. Puede verse que Abst-1 confiere muy poca protección después de exposición a MN 184. Estas observaciones confirman más el concepto de que la exposición homologa confiere más protección que la exposición heteróloga. La exposición virulenta homologa era más protectora y la exposición virulenta heteróloga era menos protectora, pero todavía más protectora que la exposición atenuada heteróloga. Los resultados de la RT-PCR en tiempo real eran estadísticamente muy similares a los resultados de Logio DICTso/ml, indicando que ambos métodos miden los niveles relativos de virus infeccioso entre los grupos. El coeficiente de correlación de Pearson entre la RT-PCR y Logio DICT50/ml el día 7 era 0.89 y para la RT-PCR en tiempo real y Logio DICT50/ml medios, el resultado era 0.88. Los valores de concentración determinados por la RT-PCR en tiempo real pueden haber sido varios órdenes de magnitud mayores que los valores de logio DICTso/ml por varias razones, incluidas las diferencias entre la frecuencia de partículas virales que contienen el amplicón objetivo y partículas que son totalmente infecciosas en células CL2621, y la presencia de anticuerpos neutralizantes que podía disminuir la infectividad (Dianzani et al., 2002). Sin embargo, no es probable que el anticuerpo neutralizante explique la diferencia, porque se observó en todos los puntos de tiempo, incluidos los tiempos anteriores a los cuales se había producido una respuesta de anticuerpos anti-VSRRP. Los valores de copias/ml determinados por la PCR en tiempo real eran mayores que los valores de los títulos de agente infeccioso medidos en cultivo celular por la DICTso/ml. Esto se debe a que habitualmente se usa una curva patrón basada en las copias de genoma del virus para la PCR cuantitativa que amplifica directamente una secuencia genómica del virus más que viriones infecciosos conocidos. Los ensayos biológicos tales como el cultivo celular miden la presencia de infectividad, sin embargo, pueden no contar todas las partículas infecciosas presentes en una preparación. En otros estudios se han observado factores que podían afectar al título de agente infeccioso tales como las condiciones del cultivo celular y los anticuerpos in vivo, que pueden neutralizar el virus, que calculan demasiado bajo la cantidad de virus infeccioso medido en la DICT50/ml en los sueros. Alternativamente, pueden encontrarse presentes virus no infecciosos o defectuosos en la replicación, lo cual se reflejarla por un número de copias más alto. En general, las observaciones por ELISA apoyan el concepto de que la magnitud de la respuesta inmunitaria humoral está relacionada con el nivel de replicación viral durante la infección aguda. La tendencia indicada en las figuras 4 y 5 ilustra esta relación. Los aislados de virus atenuados en cultivo celular provocaron una respuesta inmunitaria humoral más lenta y menos intensa, mientras que los aislados virulentos provocaron una respuesta inmunitaria humoral más rápida y más intensa. Además, estas observaciones también demuestran que al menos dos factores, el tipo de aislado y la dosis infecciosa, afectan a los valores de la relación S/P relativos, en el ensayo de HerdChek® PRRS ELISA 2XR. Aunque los resultados de ELISA mostrados en la figura 3 indican una respuesta media del grupo positiva o negativa clara, es importante señalar la variabilidad entre los animales individuales. Algunos cerdos en los grupos de virus atenuados eran positivos antes del día 21, y algunos cerdos en los grupos virulentos permanecían negativos hasta el dia 21. Los análisis de las respuestas de anticuerpos específicas para N y nsp 4 muestran que las respuestas inmunitarias al VSRRP varian de intensidad, de forma independiente del aislado inoculado. Las respuestas de anticuerpos a la proteina N en los animales que se inocularon con los aislados muy virulentos MN 184 y JA 142 mostraron una tendencia similar a las de todos los aislados, pero de una magnitud mayor. Los cerdos a los que se inoculó MN 184 y JA142 también tenían los títulos de virus más altos, como se muestra en las figuras 1 y 2. Esto indica que el nivel de respuesta inmunitaria humoral puede estar relacionado con la carga viral en la infección aguda medida por la titulación de virus. Es interesante, que el transcurso del tiempo de la respuesta era el mismo en todos los grupos, incluso cuando el tiempo para alcanzar el titulo máximo se retrasaba para el aislado muy virulento 17198-6 y los aislados atenuados. En contraste, la respuesta de anticuerpos a nsp 4 era baja en todos los puntos de tiempo y para todos los aislados, tanto atenuados como virulentos. El transcurso del tiempo de la respuesta anti-nsp 4 era equivalente en todos los grupos a pesar de las diferencias en el tiempo para alcanzar la carga viral máxima entre los grupos, como se observaba para la respuesta de anticuerpos anti-N. Todos los cerdos tenían respuestas anti-nsp 4 bajas como se muestra en la figura 7. Estas observaciones indican que algunas de las proteínas del VSRRP provocan una respuesta más fuerte en el sistema inmunitario del hospedero independientemente de la virulencia del aislado al que se ha expuesto. Sin embargo, las observaciones también indican que la magnitud de la respuesta inmunitaria a las proteínas más inmunogénicas es probable que esté relacionada con la virulencia del aislado al que se expone, o de la capacidad del aislado para replicarse in vivo. También es posible que las diferencias de respuestas de anticuerpos puedan deberse simplemente a diferencias genéticas entre los aislados que dan como resultado diferencias de reactividad antígena, de modo que los anticuerpos dirigidos contra N y nsp 4 de otros aislados no reaccionan o reaccionan mal a las proteinas recombinantes expresadas por los VR322 aislados que se usaron para revestir las placas de ELISA. Sin embargo, varias series de pruebas sugieren que las diferencias observadas en los niveles de anticuerpos reflejan respuestas inmunológicas importantes. El aislado MN 184 muestra la diferencia genética mayor respecto a VR2332, determinado por comparaciones del ORF 5, así como la respuesta de anticuerpos anti-N más alta. Kapur et al. (1996) mostraron previamente que las diferencias relativas entre los aislados de VSRRP en un marco de lectura abierto también están presentes en otros marcos de lectura abiertos. Además, las proteinas individuales contienen regiones conservadas y no conservadas (p. ej . Kapur et al., 1996) y se puede dirigir la reactividad inmunogénica extensa hacia los epítopes conservados (Ostrowski et al., 2002). No obstante, a los resultados de ELISA basados en las reacciones de los anticuerpos con las proteínas del VSRRP purificadas les pueden afectar la variación genética y antígena, y estos efectos deben considerarse. Se llevó a cabo el replegado de las proteinas recombinantes, pero no se observaron diferencias entre las placas de ELISA revestidas con proteínas no replegadas o replegadas. Se observó que aproximadamente a las 4 a 5 semanas después de la inoculación, se producía una disminución relativamente grande de la respuesta de anticuerpos a las proteínas tanto N como nsp 4. Foss et al. (2002) observaron un máximo similar de 1 a 2 semanas seguido de una disminución de la reactividad de los anticuerpos para GP5, la glucoproteina principal de la envoltura. Estas observaciones consideradas juntas sugieren que es probable que la respuesta a proteínas virales individuales, no represente el escenario completo de la respuesta inmunitaria del cerdo al VSRRP, puesto que la respuesta inmunitaria humoral medida por el ensayo de HerdChek® PRRS ELISA 2XR no muestra un máximo transitorio similar de la reactividad de los anticuerpos. El crecimiento y mortalidad menores era lo que correlacionaba la virulencia y la tasa de crecimiento viral in vivo. El peso medio más bajo observado en los grupos de exposición a aislados virulentos es probable que reflejara una diferencia en la capacidad de un aislado de VSRRP para replicarse in vivo e inducir una enfermedad más grave en el cerdo. Estas observaciones son concordantes con los datos previamente descritos de que la infección por VSRRP puede producir anorexia con una reducción de 25 a 40 por ciento de reducción en el aumento de peso diario (Thacker, 2003) . Las calificaciones clínicas de los animales expuestos a los aislados virulentos mostraron aumentos rápidos justo después de la inoculación, mientras que no hubo prácticamente cambio en las calificaciones de los animales expuestos a virus atenuados. El aumento de los signos clínicos se reflejó en las tasas de muerte observadas de 50%, 20% y 10% en los grupos de exposición virulenta que recibieron los aislados de VSRRP MN 184, SDSU 73 y JA 142, respectivamente. En contraste, los grupos de exposición atenuada no tuvieron muertes. La relación entre el crecimiento viral rápido y la patogénesis viral en las mismas condiciones de exposición viral era la más evidente comparando los grupos expuestos a MN 184 y Abst-1. Los títulos de inoculación eran prácticamente los mismos, 4.10 log/ml y 4.18 log/ml, respectivamente, y además, como se indicaba en la figura 8, no habia diferencias notables en la forma en la que los dos aislados afectaban a los cerdos. El aislado Abst-1 era casi inerte, apenas se replicaba in vivo y no producía signos clínicos. En contraste, el aislado MN 184 se replicaba a títulos extremadamente altos in vivo y producía signos clínicos graves, que daban como resultado la muerte de 50% de los animales expuestos. También es de notar que el grupo de cerdos expuesto a la mezcla de todos los aislados de virus mostró aproximadamente las mismas respuestas virológicas, clínicas e inmunológicas que los cerdos expuestos a MN 184. Este resultado indica que los virus que se replican más rápidamente en una infección mixta es probable que compitan con otros aislados de modo que el resultado neto sea esencialmente el mismo que en una infección con el aislado individual que tiene el potencial de crecimiento más alto. Las diferencias destacadas in vivo entre los aislados de VSRRP virulentos y aislados arrojan luz sobre la relación entre la virulencia de un aislado y su crecimiento y replicación in vivo. Cuando se administran a los cerdos dosis equivalentes, los aislados más virulentos muestran títulos de Logio DICT50/ml y concentraciones por RT-PCR que son exponencialmente más altas que las de los aislados atenuados. Los aislados virulentos inducen una respuesta inmunitaria humoral más rápida e intensa. Los aislados virulentos afectan negativamente al aumento de peso e inducen tasas de muerte mayores y signos clínicos más graves comparados con los aislados atenuados. Como conclusión, los ejemplos y ensayos en la presente solicitud indican que los aislados de VSRRP atenuados y virulentos inducen signos clínicos notablemente diferentes, asi como respuestas inmunitarias que difieren en intensidad. Estas diferencias se atribuyen a la capacidad de los virus para replicarse in vivo, una característica fenotípica que se puede medir cuantitativamente en las muestras de suero y se puede desarrollar para predecir la virulencia de los aislados de VSRRP.

EJEMPLO 2 Este ejemplo proporciona varios métodos de atenuación de aislados de VSRRP, así como su inclusión en composiciones inmunogénicas.

Materiales y métodos : Se formula una preparación de vacuna incorporando un virus vivo modificado o atenuado, para la inmunización de cerdos frente a la infección por el virus de SRRP. El VSRRP para la preparación de la vacuna se propaga en la línea celular continua MA-104, preferiblemente ATCC n° CL2621. La linea celular se hace crecer en matraces que contienen MEM, a los que se ha añadido suero de ternero fetal al 10%. El pH del medio se ajusta a aproximadamente 7.2 y se incuba a aproximadamente 37°C. Las células después se inoculan con el virus por adición de aproximadamente 1 ml de un inoculo congelado al medio líquido. Se deja que el virus se absorba en las células durante 24 horas. En este momento, el medio de crecimiento se cambia a un medio de mantenimiento que consiste en MEM al que se le ha añadido suero de ternero fetal al 4%, pH 7.6. El entorno preferiblemente está entre 35-37°C. El virus se deja crecer hasta que el 50% de la lámina de células MA-104 es destruida por el virus. Después la muestra se vuelve a congelar y se prepara para el pase a otro matraz de células MA-104. Este procedimiento se continúa a lo largo de 25 pases del virus en la linea celular. Después el virus se propaga otras 12 veces a aproximadamente 31 °C, frente a los 35-37°C, usando la misma técnica descrita antes. El 12° pase se congela en partes alícuotas pequeñas y se designa como el virus semilla original. A continuación se exponen los detalles del método preferido. I. Medio: a. Medio esencial mínimo de Eagle (MEM) de JRH Biosciences, n° 200-2041 b. Suero de ternero fetal (FCS) de JRH Biosciences c. Medio de crecimiento para siembra de células-MEM+suero de ternero fetal al 10% d. Medio de mantenimiento-MEM + suero de ternero fetal al 4% e. Tripsina-Versene IX f. Solución de bicarbonato de sodio al 5% o saturada II. Cultivo celular Línea celular usada: MA-104 (Células de riñon de mono verde africano, mantenidas con 20 niveles de pases (pases 58-78) ) III. Equipo matraces de cultivo tisular de 75 cm Incubador ajustado a 35-37°C. Incubador ajustado a 3°C. Centrífuga IV. Método usado para atenuar el virus VSRRP hecho crecer a 25-37°C. A. Preparación de la cepa en cultivo tisular: Botellas de cepa de 75 cm2 de MA-104 que tenían de 5 a 7 días se reparten 1:4 de la siguiente forma: a. Se apartan todos los medios (50 ml por botella) . b. La lámina de células se elimina usando 10 ml de tripsina-Versene por incubación a 37°C durante 5-10 minutos. c. Se sacan las células de la botella y se centrifugan a 270xg durante 5-10 minutos. d. Se decanta el liquido sobrenadante y se vuelven a suspender las células en 5-10 ml de medio de crecimiento (MEM FCS al 10%) . e. Se ponen todas las células en 200 ml de MEM FCS al 10% que después se reparte en cuatro botellas de 75 cm, 50 ml por botella para un reparto 1:4. Después las botellas se mantienen a 35-37°C hasta que sean necesarias (también se puede hacer sin C02) . f. Las botellas que tenían 3 ó 4 días que habían formando una lámina de células entera, ahora están listas para usar. g. Se ajusta el pH de 50 ml de medio en el matraz a pH 7.2 y después se añade 1 ml de virus al medio y el matraz se pone a 35-37°C. (También se puede hacer sin C02) . h. Después de 24 horas, se descarta el medio y el matraz se vuelve a alimentar con 50 ml de MEM FCS al 4%, pH 7.6, y se vuelve a poner a 35-37°C. i. 24 horas después de cambiar este fluido, que se podía mostrar por el ECP, y cuando hay 50-60% de agujeros en la lámina de células, se congela. j . Se descongela la botella anterior y se toma 1 ml de este fluido y se pasa a una botella nueva de 75 cm como, se ha listado antes para hacer el siguiente pase de virus . Este procedimiento anterior se lleva a cabo un total de 25 veces, con el crecimiento a 35-37°C. Método usado para atenuar el virus VSRRP hecho crecer a 31°C. Los virus pasados 25 veces a 35-37°C se usan para hacer el pase 1 para el virus hecho crecer a 31°C. A. Preparación de la cepa en cultivo tisular: botellas de cepa de 75 cm2 de MA-104 que tenían 5 a 7 días se reparten 1:4 de la siguiente forma: a. Se apartan todos los medios (50 ml por botella) . b. La lámina de células se elimina usando 10 ml de tripsina-Versene por incubación a 37°C durante 5-10 minutos . c. Se sacan las células de la botella y se centrifugan a 270xg durante 5-10 minutos. d. Se decanta el liquido sobrenadante y se vuelven a suspender las células en 5-10 ml de medio de crecimiento (MEM FCS al 10%) . e. Se ponen todas las células en 200 ml de MEM FCS al 10% que después se reparte en cuatro botellas de 75 cm, 50 ml por botella para una reparto 1:4. Después las botellas se mantienen a 35-37°C hasta que sean necesarias (también se puede hacer sin C02) . f. Las botellas que tenían 3 ó 4 días que habían formando una lámina de células entera ahora están listas para usar. g. Se ajusta el pH de 50 ml de medio en el matraz a pH 7.2 y después se añade 1 ml de virus al medio y el matraz se pone a 31°C. (También se puede hacer sin C02) . h. Después de 24 horas, se descarta el medio y el matraz se vuelve a alimentar con 50 ml de MEM FCS al 4%, pH 7.6, y se vuelve a poner a 31°C. i. 24 horas después de cambiar este fluido, que se podía mostrar por el ECP, y cuando hay 50-60% de agujeros en las láminas de células, se congelan. j . Se descongela la botella anterior y se coge 1 ml de este fluido para hacer el siguiente pase del virus SIRS VR-2332. Este procedimiento anterior se lleva a cabo un total de 12 veces, a 31°C. El pase 12° de virus hechos crecer a 31°C se designa como el virus semilla original para la producción de vacuna.

Atenuación del virus del SRRP por supresión génica Un experto en la técnica puede atenuar el VSRRP por el método convencional de supresión génica. En general, este método implica la supresión de un gen que codifica los fenotipos virulentos del virus. Dicho método se puede adaptar de referencias tales como Elbers et al. (solicitud de patente de EE.UU. n° 20020012670) o Schall et al. (patente de EE.UU. n° 6,740,324), cuyas enseñanzas y contenidos se incorporan por referencia en la presente.

Atenuación del virus del SRRP por muta ción sensible a la tempera tura Un experto en la técnica también puede atenuar el VSRRP por el método convencional de mutación sensible a la temperatura. En general, este método implica producir una mutación que limita el intervalo de temperatura en el que el virus es activo. Por ejemplo, el método de Skiadopoulos et al., "Identification of Mutations Contributing to the Temperature-Sensitive, Cold-Adapted, and Attenuation Phenotypes of the Live-Attenuated Cold-Passage 45 (cp45) Human Parainfluenza Virus 3 Candidate Vaccine", 73 No. 2 Journal of Virology 1374, (February 1999) se puede adaptar para usar con el VSRRP. Las enseñanzas y el contenido de Skiadopoulos et al. se incorporan por referencia en la presente.

Atenuación del virus del SRRP por generación de un clon infeccioso Un experto en la técnica puede atenuar el VSRRP por el método convencional de generación de un clon infeccioso. Este método en general implica la creación de un clon de ADNc de longitud completa del genotipo viral deseado, siendo este clon también virulento en los animales objetivo. Por ejemplo, el método de Nielson et al., "Generation of an Infections Clone of VR-2332, a Highly Virulent North American-Type Isolate of Procine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus", 77 Journal of Virology 3702 (Mar. 2003), se puede adaptar para una versión atenuada del VSRRP. Las enseñanzas y el contenido de Nielson et al. se incorporan por referencia en la presente .

Atenuación del virus del SRRP por inserción génica Un experto en la técnica también puede atenuar el VSRRP por el método convencional de inserción génica. Este método en general implica la inserción de un gen en el virus, que inhibe los fenotipos patógenos de dicho virus. Por ejemplo, el método de Schall et al. (patente de EE.UU. n° 6,740,324) se puede adaptar para una versión atenuada del VSRRP. Las enseñanzas y el contenido de Schall et al. se incorporan por referencia en la presente.

Atenuación del virus del SRRP por susti tución Un experto en la técnica también puede atenuar el VSRRP por los métodos convencionales de sustitución de codones y pares de bases. En general, la sustitución de codones o pares de bases implica la sustitución de un codón o par de bases por un codón o par de bases diferente, de modo que ahora el nuevo gen viral codifique una proteína que limite la patogenicidad del virus. Por ejemplo, el método de sustitución de codón de McAuliffe et al., "Codon Substitution Mutations at Two Positions in the L Polymerase Protein of Human Parainfluenza Virus Type 1 Yield Viruses with a Spectrum of Attenuation In Vivo and Increased Phenotypic Stability In Vitro", 78 Journal of Virology 2029 (Febrero 2004) se puede adaptar para crear un método de sustitución génica para atenuar el VSRRP. También, Hurrelbrink y McMinn, "Attenuation of Murray Valley Encephalitis Virus by Site-Directed Mutagenesis of the Hinge and Putative Receptor-Binding Regions of the Envelope Protein", 75 Journal of Virology 7692 (August 2001) y Elbers et al. (solicitud de patente de EE.UU. n° 20020012670) proporcionan métodos de sustitución de pares de bases que se pueden adaptar para crear un aislado de VSRRP atenuado. Las enseñanzas y contenidos de McAuliffe et al., Hurrelbrink y McMinn, y Elbers et al. se incorporan por referencia en la presente.

Atenuación del virus del SRRP mediante el uso de construcciones de SRRP quiméricas Un experto en la técnica también puede atenuar el VSRRP por el método convencional de construcciones quiméricas. En general, una construcción quimérica es una que contiene genes de una especie diferente con el fin de inducir una respuesta antígena en una célula hospedera. Por ejemplo, dicha construcción se puede crear adaptando el método de Harris et al. (solicitud de patente de EE.UU. n° 20040157307) para crear una construcción quimérica con genes de SRRP.

Incorporación de aislados de virus del SRRP a tenuados en composiciones inmunogénicas : Después de atenuar los nuevos aislados, preferiblemente por uno de los métodos indicados antes, los aislados atenuados se pueden incorporan en composiciones eficaces para proporcionar una respuesta inmunitaria frente a aislados virulentos del virus del SRRP. En formas preferidas, dichas composiciones proporcionarán a un animal que recibe una cantidad eficaz de la composición, inmunidad protectora contra la infección de SRRP. Dicha inmunidad protectora reducirá la gravedad de los signos clínicos de la infección de SRRP en los ' animales vacunados que posteriormente se exponen o son infectados por un aislado de virus del SRRP virulento. Preferiblemente, dichos signos clínicos se prevendrán por la administración de una cantidad eficaz de la composición inmunogénica o vacuna. En algunas formas, los aislados de virus del SRRP atenuados se usarán para producir una vacuna de virus vivos modificados, en la que se usan aislados atenuados en estado vivo en las composiciones inmunogénicas. En otras formas, los aislados atenuados se matarán o inactivarán antes de incorporarlos en las composiciones inmunogénicas.

Referencias Las enseñanzas y contenidos de cada una de las siguientes referencias se incorporan por referencia en la presente. Albina, E., Piriou, L. , Hutet, E., Cariolet, R., L'Hospitalier, R., 1998. Immune Responses in Pigs Infected with Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV). Vet . Immunol . Immunopa thol . 61, 49-66. Andreyev, V. G., Wesley, R. D., Mengeling, W. L., Vorwald, A. C, Lager, K. M., 1997. Genetic Variation and Phylogenetic Relationships of 22 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Field Strains Based on Sequence Analysis of Open Reading Frame 5. Arch. Virol. 142, 993-1001. Cavanagh, D., 1997. Nidovirales: a New Order Comprising Coronaviridae and Arteriviridae . Arch . Virol . 142, 629-633. Chang, C. C, Yoon, K. J., Zimmerman, J. J. , Harmon, K. M., Dixon, P. M. , Dvorak C. M. T., Murtaugh, M.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para predecir la virulencia de un aislado de virus del SRRP de virulencia desconocida, que comprende las etapas de administrar una cantidad del aislado de virus del SRRP a cerdos sin SRRP, permitir que el virus se replique en dichos cerdos durante un periodo de aproximadamente 3-15 dias, medir la tasa de crecimiento del virus y/o la magnitud de la viremia . durante el periodo, y comparar la tasa de crecimiento o magnitud de la viremia con la tasa de crecimiento y/o magnitud de la viremia de un aislado de virus del SRRP de virulencia . conocida como un predictor de la virulencia del aislado de virus del SRRP de virulencia desconocida.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el periodo es de aproximadamente 3 a 7 días.

3. Método según la reivindicación 1, que incluye la etapa de medir la magnitud de la viremia durante el periodo, y comparar la magnitud con la magnitud de la viremia del aislado de virus del SRRP conocido.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la cantidad de virus administrada es similar a la cantidad que recibiría un animal por exposición natural.

5. Método según la reivindicación 1, en el que el virus del SRRP se administra por un método seleccionado del grupo que consiste en administración oral, intranasal, intramuscular, intra-nódulo linfático, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, y sus combinaciones.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la tasa de crecimiento o magnitud de la viremia se miden en una muestra biológica del cerdo.

7. Método según la reivindicación 1, en el que la viremia se mide por el LoglO DICT50/ml, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, ELISA específico para SRRP, ELISA específico para proteínas de SRRP, y sus combinaciones.

8. Método según la reivindicación 1, que además incluye la etapa de observar en el cerdo los signos clínicos de infección de SRRP después de administrar el aislado de virus del SRRP.

9. Método según la reivindicación 8, en el que los signos clínicos incluyen signos respiratorios, de comportamiento, tos, y sus combinaciones.

10. Método según la reivindicación 1, que además incluye la etapa de predecir que el aislado de virus del SRRP será muy virulento cuando su tasa de crecimiento o la magnitud de la viremia son similares a las de un aislado con virulencia alta.

11. Método según la reivindicación 1, que además incluye la etapa de predecir que el aislado de virus del SRRP será poco virulento cuando su tasa de crecimiento o la magnitud de la viremia son similares a las de un aislado con virulencia baja.

12. Método según la reivindicación 1, en el que la cantidad administrada de virus del SRRP es de hasta aproximadamente 5 ml de inoculo que tiene una concentración viral de hasta 5.0 Logio DICT50/ml.

13. Composición inmunogénica que comprende un aislado de virus del SRRP atenuado y un vehículo farmacológicamente compatible, seleccionándose el aislado atenuado del grupo que consiste en Abst-1 y formas atenuadas de un virus del SRRP que se ha predicho que es virulento por el método según la reivindicación 1.

14. Composición según la reivindicación 13, en la que el aislado atenuado es Abst-1.

15. Composición según la reivindicación 13, en la que el virus del SRRP que se ha predicho que es virulento por el método según la reivindicación 1, se selecciona del grupo que consiste en ATCC VR-2332, ATCC PTA-6504, ATCC PTA-6319, ATCC PTA-6321, y ATCC PTA-6322.

16. Método de selección de un aislado de virus del SRRP para atenuar e incluir en una composición inmunogénica, que comprende las etapas de: a) obtener un aislado de virus del SRRP de virulencia desconocida; b) administrar una cantidad del aislado de virus del SRRP a un cerdo que no tiene SRRP; c) dejar que el aislado se replique en el cerdo durante un periodo de aproximadamente 3-15 días; d) medir la tasa de crecimiento del virus y/o la magnitud de la viremia durante el periodo; e) comparar la tasa de crecimiento o magnitud de la viremia con la tasa de crecimiento y/o magnitud de la viremia de un aislado de virus del SRRP de virulencia conocida; y f) seleccionar un aislado para atenuar e incluir en una composición inmunogénica basándose en su tasa de crecimiento y/o su magnitud de la viremia comparado con los aislados de virulencia desconocida.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la etapa (f) además incluye la etapa de seleccionar un aislado que tiene una tasa de crecimiento y/o magnitud de la viremia, similares a un aislado muy virulento.

18. Método según la reivindicación 16, que además incluye la etapa de atenuar el virus seleccionado.

19. Método según la reivindicación 18, en el que el virus se atenúa por un método seleccionado del grupo que consiste en pases seriados repetidos en cultivo celular, inserción génica, cambio génico, supresión génica, sustitución de par de bases y mutación sensible a la temperatura.

20. Método según la reivindicación 18, que además incluye la etapa de incorporar el virus seleccionado en una composición inmunogénica.