LU83028A1 - Pharmazeutischer ansatz zur verwendung als schutz gegen akutes lungenoedem,anaphylaktischen schock und andere arten von schock sowie hyperfibrinolyse - Google Patents

Description

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Pharmazeutischer Ansatz zur Verwendung als Schutz gegen akutes Lungenödem, anaphylaktischen Schock und andere Arten von Schock sowie Kyperfibrinolyse.

Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen pharmazeutischen Ansatz, der besondere Wirksamkeit bei akutem Lungenödem, bei durch bakterielle Endotoxine hervorgerufenem Schock, bei Hydrofibrinolyse und bei anaphylaktischem Schock zeigt. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Ester von L-Arginin.

Es sind zahlreiche Ester von L-Arginin bekannt, darunter beispielsweise Ester mit aliphatischen Alkoholen, die die allgemeine Form

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> . i! Θ x- Η-,Ν* NH2 * ' haben, worin X ein pharmazeutisch verträgliches organi sches oder anorganisches Anion und R eine Alkylgruppe be-; deuten.

Man erhält diese Ester mit aliphatischen Alkoholen durch Verestern von L-Arginin nach einer aus der Literatur be- - 4 - kannten Methode, beispielsweise Umsetzung von L-Arginin « mit einem aliphatischen Alkohol, der zuvor mit trockenem, gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigt worden ist, oder Veresterung durch Entfernen von Wasser durch azeotropische - Destillation oder Umsetzung mit einem Alkohol in Gegen wart von Thionylchlorid oder vergleichbare Methoden. Diese beispielsweise als salzsaure Salze vorliegenden Ester sind in festem Zustand beständig, und man kann bei neutralem oder leicht saurem pH Lösungen von den Estern hersteilen. Diese Lösungen sind über sehr lange Zeiträume stabil.

überraschenderweise hat sich nun herausgestellt, daß die Ester von ArgininiAt aliphatischen Alkoholen und deren Salze wertvolle therapeutische Eigenschaften für die Besserung einiger pathologischer Zustände besitzen, bas auf parenteralem Wege zu verabreichende Material besteht aus einer wäßrigen Lösung mit zwischen 5,5 und 8,5 liegendem pH und enthält das Kation des Argininesters und ein anorganisches oder organisches Anion im Molverhältnis von 1 : 1 oder einem anderen Molverhältnis. Insbesondere üben die Ester und ihre entsprechenden Salze eine Hemmwirkung bei akutem Lungenödem aus und erhöhen die Überlebenserwartung beim Auftreten von Schockerscheinungen mit einer Vielzahl von Ursachen, beispielsweise wegen bakterieller Endotoxine oder wegen Immunendotoxin.

Ferner hat sich gezeigt, daß die L-Arginin-Ester wertvolle Aktivität in vivo beim hyperfibrinolytischen Syndrom besitzen, das durch Verabreichung von Urokinase herbeigeführt ist. Es ist zu beachten, daß alle diese therapeutischen Wirkungen mit Dosen und mit seiner Verabreichungsweise herbeigeführt sind, die keine merklichen toxischen Wirkungen * - 5 - * t hervorrufen, und daß insgesamt die Toxizität aller dieser Substanzen sehr niedrig liegt. Im Hinblick auf die Dosierung, den Verabreichungsweg und insgesamt die Art und _ Weise, mit der die Wirkungen bei Tieren erreicht werden konnten, sind diese Substanzen auch für die Humantherapie bei der Behandlung pathologischer Zustände der obenerwähnten Art von Nutzen.

Die Aktivität der pharmazeutischen Ansätze gemäß der Erfindung wird nachstehend anhand der Versuchsergebnisse beschrieben.

Schutz gegen Lungenödem

Das Lungenödem wurde nach der Methode von A.M. Rothschild und A. Cästania (Arch. Pharmaco., 295, 177 (1976)) erzeugt, und zu Vergleichszwecken sind Substanzen mit bekannter therapeutischer Aktivität benutzt worden.

Zum Test wurden männliche Wistar-Rattenalbinos mit einem durchschnittlichen Gewicht von 250 bis 350 g verwendet. Während der Dauer von zehn Tagen wurden die Ratten bei einer Temperatur von 21 - 1° C mit kontrollierter Nahrungszufuhr und freier Wasseraufnahme stabilisiert. Vor dem Test wurden die Tiere in Gruppen von je zehn Tieren auf-geteilt, um eine gute Zufallsverteilung zu erreichen. Jede Dosis, wurde an drei Gruppen von Tieren untersucht. Die Tiere wurden vor dem Test mit einer Dosis von 30 mg/kg Pentobarbi-tal narkotisiert. Nachdem die Tiere sich in tiefer Narkose * . befanden, wurden folgende Substanzen auf parenteralem

Wege verabreicht: i 1, den Kontrolltieren: 1 ml/kg physiologische * - 6 -

Kochsalzlösung, 2. den Testtieren: eine Lösung der zu testenden Substanz in physiologischer Kochsalzlösung mit 1 ml/kg in den nachstehend in der Tabelle angegebenen Dosierungen.

Nach Ablauf von 15 Minuten wurden zur Bestimmung der Schutzwirkung der Substanzen 16 If/kg Adrenalin intravenös in physiologischer Kochsalzlösung gegeben, um ein akutes ödem hervorzurufen.

Nach fünf Minuten wurden die Tiere durch Enthaupten getötet, die Lungen wurden herausgenommen und ihr Gewicht bestimmt. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 1 zusammengefaßt, daneben die Konzentration der Substanzen und die relative ödemhemmung in Prozent. Die Ergebnisse werden am Ende der Tabellen erörtert.

Tabelle 1 VERBINDUNG DOSIS * % Ödemhemmung

Physiologische Lösung _ n nn lml/kg + Adrenalin * *υυ \

Aspirin 1 32.2 * 2.5 36.9 " . 5 , 48.2 " 10 54.3 '* 20 19.6 \ * Aprotinin ** 30 17.3 100 , 3Ö.5 " 300 54.5 * · 1000 42.7

VERBINDUNG DOSIS * % ÖDEMHEMMUNG

- 7 - L-A.M. *** 1 21.2 2.5 27.4 5 29.0 " 10 55.7 • 20 15.7 D-A.M.**** 1 16.8 M 2.5 11.7 5 ' 15.4 10 4.4 " 20 6.4 L-A.E.***** 0.1 3.4 0.25 32.2 " 0.5 33.3 1 55.7 " 2,5 47.9 " 5 41.0 " 10 38.9 ·· 20 39.7 D-A.E.****** 0.1 7 « 0.25 11 0.5 3 " 1.0 4.2 " . 2.5 7 « H 5.0 . 5.3 * 10 6 " 20 2.5 L-Arg.lnin . 2HC1 1 7 ·· 2.5 9 5 · 11 " 10 10.1 N ΟΛ 1 1

VERBINDUNG DOSIS % ÖDEMHEMMUNG

- 8 - Äthanol °·08 7 « 0.8 12 m 2 15 ·> 4 14.7.

8 1« ' m 16 15.9

Methanol °*00 2.3 « 0.8 5 2 12 « 4 6 8 15 « 16 15 L-Arginin. .2HC1 + Äthanol 1+0.08 1° » 2.5+0.8 9 ». 5+2 5*3 U 10+4 7*2 h 20+8 4*6 L-Arginino · 2HC1 + Methanol 1+0.08 11,4 « 2.5+0.8 7.2 . * · « ‘ 5+2, 9*5 « 10+4 8·1 * 20+8 6 * ln mg/kg, ausgenommen Aprotinin: die Zahlen bedeuten * * U.I.K,/kgf d.h. Hemm-Einheiten nach Kunitz ** es wurde das Handelsprodukt verwendet, das unter der Bezeichnung "Trasylol" von den Farbenfabriken Bayer vertrieben wird.

- 9 - *** L-A.M. = L-Argininraethylesterhydrochlorid.

D-A.M. = D-Argininmethylesterhydrochlorid.

L-A.E. = L-Argininäthylesterhydrochlorid.

D-A.E. = D-Argininäthylesterhydrochlorid.

Schutz gegen durch Endotoxine verursachten Schock

Der durch Endotoxin verursachte Schock wurde nach der Methode hervorgerufen# die von A. Bertelli und L. Donati in der Veröffentlichung "The Influence of Some Enzymes and Enzymes Inhibitors in Shock" ("SHOCK Biochemical, Pharmaceutical and Clinical Aspects"; A. Bertelli und N. Back Herausgeber, Advances in Experimental Medicine and Biology; Vol 9, Plenum Press New York - London 1970, Seite 215) beschrieben ist.

Zum Vergleich wurde eine Substanz mit wohlbekannter therapeutischer Aktivität benutzt, insbesondere Aprotinin, das von den Farbenfabriken Bayer unter dem Handelsnamen "Trasylol" vertrieben wird. Es wurde mit männlichen Wistar-Ratten von 120 - 10 g Gewicht gearbeitet. Die Ratten wurden zuvor wäh-rend der Dauer von zehn Tagen bei einer Temperatur von 21 -1° C mit kontrollierter Nahrungszufuhr bei freier Wasser-aufnahme stabilisiert. Vierundzwanzig Stunden vor dem Test wurden die Tiere in Gruppen von je zehn Tieren aufgeteilt, um eine gute Zufallsverteilung zu erreichen. Jede Einzeldosis wurde an sechs Tiergruppen untersucht.

Als Endotoxin wurde Lipopolysaccharid B von S. Enteritides (Difco Labs.) benutzt. Diese Substanz wurde in einer Dosis - · von 10 mg/kg endoperitoneal verabfolgt, eine Stunde nach der

Verabreichung der Substanz, die auf parenteralem Wege oder in Form einer physiologischen Lösung mit gleichem Volumen je Kilogramm an die zum Vergleich benutzten Tiere verabfolgt wurde.

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Die Mortalität in Prozent wurde an den Versuchstieren ira Vergleich zu den Vergleichstieren nach vierundzwanzig Stunden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

VERBINDUNG DOSIS % MORTALITÄT

70.9

Physiologische Lösung

Aprotinin 1000 50.0 » 3000 65.0 « 10000 65.0 « 100000 93·3 L-A.M. 5 5.5.0 « io 50.0 » 20 40.0 i· 50 28.0 D-A.M. 5 71.2 « 10 68.5 « 20 69 » 50 73 L-A.E. 5 51,3 *n 10 48.2 h 20 37.5 h 50 25.0 D-A.E. 5 72 ». 10 67 .. 20 69.3 * » 50 71 L-Arginin .2HC1 5 69 " 10 73 » 20 71

VERBINDUNG DOSIS % MORTALITÄT

* - 11 -

Methanol 2 76 .. 4 72 » 8 7 4 Ä.thanol 2 ^7 h 4 69 II 8 72 L-Arginin.2HCl+Methanol ' 4+0.61 73 « 8+1.23 71 « ' 16+2.46 75 L-Arginin.,.2HCl+Äthanol 4+1.06 69 “ 8+2.12 71 « 16+4.24 74

Die Abkürzungen sind unter Tabelle 1 erklärt. Auch hier sind die Dosen bei Aprotinin in U.I.K./kg ausgedrückt.

Schutz gegen anaphylaktischen Schock

Der anaphylaktische Schock wurde hervorgerufen nach der Methode von S.M. Feimberg, J. Pharmaeol, Exp. Therap., 99.1 195 (1950).

Es wurde mit männlichen Meerschweinchenalbinos von 350 - 20 g Durchschnittsgewicht gearbeitet/ die zuvor für eine Dauer von zehn Tagen bei einer Temperatur von 21 - 1° C mit kontrollierter NahrungsZufuhr bei freier Wasseraufnahme stabilisiert wurden. Drei Tage vor Beginn des Versuchs wurden die Tiere in Gruppen zu je zehn Tieren aufgeteilt/ um eine gute Zufallsverteilung zu erreichen. Jede Einzeldosis ist an drei Gruppen von Tieren untersucht worden.

Die Sensibilisierung wurde durch intravenöse Verabreichung von « - 12 - 1 ml/Meerschweinchen von Pferdeserum (Vollserum, nicht durch Konservierungsmittel behandelt), 1 : 10 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt vorgenomraen. Nach 14 Tagen wurden die Lösungen der zu testenden Substanzen und der Proben von physiologischen Lösungen für die Konfrontiere parenteral verabreicht. Gleichzeitig wurde Pferdeserum, unverdünnt, (1 ml/Meerschweinchen), intravenös verabfolgt; diese Substanz diente als Agens zur Auslösung der Anaphylaxie.

. Die Mortalität in Prozent wurde nach 12 Stunden bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengesteilt.

Tabelle 3

VERBINDUNG DOSIS % MORTALITÄT

Physiologische Lösung “ 80

Aprotinin 3000 40 " 10000 55 ” 100000 80 rL-A.M. 10 *40.5 ** ‘ 20 27 " 50 12.5 D-A.M. 10 78.8 ‘ ‘ 20 81.0 * . .50 76.3

St „ L-A.E. 10 35 M 20 23 " 50 9.5 »

VERBINDUNG DOSIS % MORTALITÄT

- 13 - Λ in 76.7 D-A.E. 10 « 20 79.4 «. 50 81,0 L-Arginin .2HC1 10 78.5 w 20 ’ 76.3 50 80

Methanol 2 76.6 , i» 4 79.4 « 8 81 JSthanol 2 76·* 4 74 n 8 ,76.5, L-Arginin .2HCl+Methanol 4+0.61 77.3 » 8+1.23 76·3 » « 16+2.46 81·° L-Arginin. .2HCl+Äthanol 4+1.06 75*8 «· 8+2.12 73,2 « 16+4.24 77*° »

Wegen Dosierung und Abkürzungen vgl. die Unterschrift zu Tabelle 1.

Hemmung der Hyperfibrinolyse

Die Hervorrufung des hyperfibrinolytischen Zustands erfolgt durch Verabreichung von Urokinase. Zur Bestimmung der » * - 14 -

Hemmung wird der F.D.P.-Wert (Fibrin Degradation Products = Fibrinabbauwert) nach dem Vorgehen von J. Hawiger et al, J. Lab. Clin. Med. 21/ 93 (1970) mit Hilfe des Staphylokokken-Agglutinationstests (Boehringer Mannheim GmbH) bestimmt.

Als Testtiere dienen Wister-Ratten von 300 - 10 g Gewicht/ die zuvor für die Dauer von zehn Tagen bei einer Temperatur *4* Λ von -21 - 1 C mit kontrollierter Nahrungszufuhr bei freier Wasseraufnahme stabilisiert wurden. Vierundzwanzig Stunden vor Versuchsbeginn wurden die Tiere in Gruppen zu je zehn . Tieren aufgeteilt, um eine gute Zufallsverteilung zu er zielen. Jede Einzeldosis wurde an drei Gruppen von Tieren erprobt,

Bei Versuchsbeginn, zur Zeit Null, wurden die zu testenden Verbindungen auf parenteralem Wege verabreicht. Den Konfrontieren wurde gleichzeitig ein gleiches Volumen physiologische Kochsalzlösung verabreicht, abgesehen davon, daß durch Herzpunktur etwas Blut entnommen wurde, um den Grundwert der fibrinolytischen Aktivität zu ermitteln. Nach 30 Minuten wurde eine Menge von 2500 U.I/Ratte Human-Uro-kinase (Produkt von Ukidan-Serono) intravenös verabfolgt. Nach weiteren zehn Minuten wurde durch Herzpunktur Blut für die abschließende Bestimmung des F.D.P.-Werts entnommen, eine Bestimmung, die in Millilitern ausgedrückt ist. Die auf diesem Wege erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4 - * VERBINDUNG DOSIS F.D.P.

i. " - 0.26 Grundwert * Physiologische Lösung - 3.30

Aprotinin 1000 0.34 « 3000 0.29 « 10000 0.30 Ή -15- VERBINDUNG_DOSIS_F.D.P.

Tranexamic Acid 5 0.58 » 10 0.39 h 20 0.33 L-A.M. 5 0.48 " 10 0.30 " 20 0.25 Λ D-A.M. ' 5 3.10 . Μ 10 3.03 " 20 3.16 L-A.E. 5 0.50 " 10 0.33 Μ 20 0.27 D-A.E. 5 3.20 * 10 3.16 * · 20 3.19 L-Arginin .2HC1 5 3.28 " 10 2.96 " 20 3.15

Methanol · 2 3.02 " 4 3.12 8 3.27 Äthanol 2 3.06 " 4 2.95 " 8 3.11 *· u i L-Arginin .2HCl+Methanol 4+0^61 3.00 v " 8+1.23 3.12 " 16+2.46 3.20 L-Arginin .2HC1+Äthanol 4+1.06 2.98 « - 16 -

Wegen Dosierung und Abkürzungen vgl. die Unterschrift zu Tabelle 1.

Tranexamic acid ist Trans-4-(aminomethyl)cyclohexan-carboxylsäure.

Die in den Tabellen 1 bis 4 mitgeteilten Werte zeigen die bemerkenswerte therapeutische Wirkung der Argininäthyl-1 oder -methylester auf die Testdosierung und die Spezifi- zität der Aktivität im Hinblick auf die Struktur und auch die Stereoisomerie der Verbindung. Demgegenüber wurden ‘ unspezifische Wirkungen und Wirkungen, die mit denen an den

Versuchstieren, die als Kontrolltiere mit physiologischer Kochsalzlösung mitgeführt wurden, vergleichbar waren, erzielt, wenn man den Tieren Arginin allein oder die Alkohole allein oder Mischungen von Arginin und den Alkoholen oder den D-Arginin-Estern verabreichte.

Die Toxizität der L-Argininester, deren therapeutische Aktivität in den obigen Beispielen veranschaulicht worden ist, wurde an zwei Tierarten untersucht: intravenös an Mäusen und intravenös und endoperitoneal an Ratten. Die Er- ** gebnisse bei DL-50 mg/kg waren:

Art: männliche Swiss-Mäusealbinos mit einem Durch- + schnittsgewicht von 22 - 1 h «

Verabreichungsweg: intravenös DL-50: 315,6 mg/kg (L.F. = 276,5 - 360,2)

Art: männliche Wistar-Rattenalhinos mit einem Durch schnittsgewicht von 180 - 10 g Verabreichungsweg: intravenös DL-50: 431,73 mg/kg (L.F. = 374,2 - 498,0)

Verabreichungsweg: endoperitoneal ' DL-50: 1111,1 mg/kg (L.F. = 1002,9 - 1230,8) 4 « - 17 - <* ï ' Man beachte, daß die Werte der Toxizität in einem Bereich liegen, der erheblich höher ist als der Dosisbereich, der für therapeutische Zwecke benutzt wird.

Bei den oben angegebenen Dosierungen und in der Verabreichungsweise, die oben angegeben ist, hat die Verabfolgung der Substanzen bei gesunden Tieren keine Mortalität verursacht und hat auch keine sichtbaren Vergiftungser-- scheinungen hervorgerufen. Die in den Tabellen 1 bis 4 zu- sammengetragenen Werte zeigen den therapeutischen Viert des pharmazeutischen Ansatzes gemäß der Erfindung.

* «c b

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Claims (4)

1. Pharmazeutischer Ansatz zur Verwendung als Schutz gegen akutes Lungenödem, anaphylaktischen Schock und aridere Arten von Schacks sowie Hyperfibrinolyse, die durch Agentien hervorgerufen ist, die Plasminogen aktivieren, gekennzeichnet durch Eine Lösung einer Esters von L-Arginin mit einem aliphatischen Alkohol, oder eines ^ seiner Salze mit einer pharmazeutisch geeigneten organi schen oder anorganischen Säure in lilasser bei einem pH zwischen 5,5 und B,5.

2. Ansatz nach Anspruch 1 in Einzelriosen mit 0,25 bis 100 mg/kg Körpergewicht des auf parenteralem Wege zu behandelnden Lebewesens.

3. Ansatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schack durch bakterielle Endotoxine hervorgerufen ist. k. Ansatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der , genannte Ester von L-Arginin als salzsaures Salz vor-liegt.

5. Ansatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Alkohol um Methyl- oder Äthylalkohol handelt. s \ . 'Λ