LT4628B - Cefalosporano 7beta-(4-karboksibutanamido)rūgšties fermentinis gavimo būdas, panaudojant modifikuotą trigonopsis variabilis d-aminorūgšties oksidazės fermentą, produkuotą escherichia coli - Google Patents

Description

Aprašytas cefalosporano 7beta-(4-karboksibutanamido) rūgšties fermentinis gavimo būdas panaudojant modifikuotą Trigonopsis variabilis D-aminorūgšties oksidazę, produkuotą Escherichia coli. Šio fermento ekspresijos būdas apima: (I) DNR, atitinkančios geno, kuris koduoja D-aminorūgšties oksidazę, išskyrimą; (II) introno, kuris yra šiame gene, pašalinimą; (III) gauto DNR fragmento įterpimą į plazmidę, kuri gali replikuotis Escherichia coli', (V) sintetinio asemblerio, turinčio šešis histidinus koduojančią nukleotidų seką, prijungimą geno struktūrinės srities 5' gale; (V) Escherichia coli kamieno transformavimą gauta rekombinantine plazmidę; (V) transformuotų Escherichia coli ląstelių auginimą; ir (VII) D-aminorūgšties oksidazės išskyrimą iš gautos kultūros, panaudojant giminingumo chromatografiją.

IŠRADIMO SRITIS

Šis išradimas yra susijęs su 7p-(4-karboksibutanamido)cefalosporano rūgšties fermentiniu gavimo būdu. Konkrečiau, jame aprašomas geno, kuris koduoja fermentą, turinti D-aminorūgšties oksidazės aktyvumą, išskyrimo būdas, panaudojant rekombinantines DNR metodikas, šio geno klonavimas Escherichia rūšies mikroorganizme, šio fermento modifikavimas baltymų inžinerijos metodais, šio modifikuoto fermento hiperprodukavimas minėto mikroorganizmo fermentavimo būdu ir modifikuoto fermento ekstrahavimas norint gauti 73-(4-karboksibutanamido)cefalosporano rūgšti. Ši rūgštis yra tarpinis junginys 7-aminocefalosporano rūgšties, kuri savo ruožtu yra žinomas tarpinis junginys gaminant daugybę cefalosporinų šeimos priešbakterinių agentų, gamyboje.

ANKSTESNIS TECHNIKOS LYGIS

7p-(4-Karboksibutanamido)cefalosporano rūgšties, dar vadinamos glutaril-7-aminocefalosporano rūgštimi (toliau žymima GL-7ACA), gamyboje iš cefalcsporino C yra žinomas D-aminorūgšties oksidazės fermento (toliau žymima DAO) iš įvairių mikroorganizmų, kaip antai Trigonopsis variabilis (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1993) 31:709), Rhodotorula gracilis (J. Biol. Chem. (1994) 269:17809) ir Fusarium solani (J. Biochem. (1990) 108:1063), panaudojimas. DAO gavimas panaudojant šiuos mikroorganizmus turi daug trūkumų. Pirmiausia aktyvios DAO produkcijos lygis yra labai žemas, o antra vertus, kartu su minėtu fermentu yra stebimi kitokie nepageidautini fermentiniai aktyvumai, kaip antai esterazių ir katalazių.

Pirmasis skaldo GL-7ACA rūgštį, sumažindamas išeigą ir tuo pačiu padidindamas gryninimo proceso kainą. Antrasis aktyvumas suardo vandenilio peroksidą, kurio reikia katalizei, ir todėl reikia pridėti šio junginio, kas taip pat didina šio proceso kainą, o be to sumažina fermento aktyvumą ir jo pakartotino panaudojimo galimybes. Norint išvengti tokio fermentinio užterštumo, reikia išgryninti aktyvią DAO, o tai labai padidina kainas ir apsunkina GL-7ACA gavimo iš cefalosporino fermentini procesą.

Neseniai buvo aprašytas geno, kuris koduoja DAO T. variabilis ir ji ekspresuoja E. coli ir T. variabilis, išskyrimo būdas (Japonijos eksponuota patentinė paraiška Nr. 71180/1988; Europos patentinė paraiška Nr. 93202219.7, publikacijos Nr. 0583817A2). Be to, genas, kuris koduoja F.solani aktyvią DAO, taip pat buvo klonuotas ir ekspresuotas E. coli ir Achremonium chrysogenum (Japonijos eksponuota patentinė paraiška Nr. 2000181/1990; J. Biochem. (1990) 108:1063; BiofTechnology (1991) 9:188), o dar vėliau genas, kuris koduoja DAO R. gracilis, buvo klonuotas ir ekspresuotas E. coli (Ispanijos patentas P9600906).

Išeinant iš didelio susidomėjimo išgryninta aktyvia DAO, skirta pramoninei GL-7ACA gamybai, šis išradimo pagrindinis tikslas buvo gauti DAO aktyvumą turintį fermentą, kurj galima lengvai išgryninti. Šia prasme yra žinoma, kad vienas iš efektyviausių baltymų gryninimo būdų yra giminingumo chromatografijos panaudojimas (Sassenfeld, H. M. (1990) Trends Biotechnol. 8:88). Šiam tikslui reikia surasti chromatografini adsorbentą, kuris leistų selektyviai surišti ir/arba eliuuoti dominanti baltymą. Toks chromatografinis adsorbentas turi turėti tokią minėtą baltymą atpažįstančią molekulę arba ligandą, kad baltymo sąveika su ligandu būtų specifinė ir pakankamai stipri, ir leistų selektyviai eliuuoti šj baltymą. Giminingumo chromatografijos adsorbentų sukūrimas nėra paprastas, ir iki šiol nėra aprašytų būdų, duodančių galimybę išgryninti aktyvų DAO fermentą per vieną stadiją.

Be to, yra žinoma, kad tam tikri genetinės inžinerijos būdai duoda galimybę modifikuoti baltymus, pagerinant individualias savybes, kurios palengvina jų gryninimą. Tokiu būdu, baltymo struktūrai modifikuoti buvo ištobulintos įvairios sistemos, suteikiančios galimybę gryninti jj giminingumo chromatografijos metodu (Sii, D. and Sadana, A. (1991) J. Biotechnol. 19: 83; Narayanan, S. R. and Crane, L. J. (1990) Trends Biotechnol. 8: 12; Scouten, W. H. (1991) Curr. Opinion Biotechnol. 2: 37; Sassenfeld, H. M. (1990) Trends Biotechnol. 8: 88). Iš esmės tokios modifikacijos pasireiškia polipeptido, kuris turi specifines sąveikos su tam tikru chromatografiniu adsorbentu savybes, prijungimu prie baltymo, ir tai suteikia sulietam baltymui galimybę būti išgrynintam giminingumo chromatografijos metodu. Viena iš tokių modifikacijų yra polihistidininės sekos prijungimas prie aptariamo baltymo, kuri suteikia sulietam baltymui galimybę būti gryninamam giminingumo chromatografijos metodu naudojant adsorbentą, turintį dvivalenčio metalo jonų (Arnolds, F. H. (1991) Bio/technology 9: 151; Hochuli et ai. (1988) Bio/technology 6: 1321).

Nors sulietų baltymų gavimas, norint pagerinti jų gryninimo savybes, iš principo yra paprastas ir efektyvus metodas, jo pagrindinis trūkumas pasireiškia tuo, kad baltymo pirminės struktūros modifikavimas sukelia pokyčius, kurie gali turėti svarbų poveiki jo antrinei, tretinei ir ketvirtinei struktūrai. Tokie struktūriniai pokyčiai gali paveikti baltymą tokiu laipsniu, kad jis visiškai arba dalinai praranda savo funkcionalumą, paversdami ji baltymu, kuris nebetinka numatomai funkcijai atlikti. Todėl sulieto baltymo gavimas visada yra susijęs su dideliu neapibrėžtumu, nes galutinis rezultatas yra labai neprognozuojamas, ypatingai kai vykdomas pirmas suliejimo eksperimentas, t.y. kai ankstesnių suliejimų rezultatas nėra žinomas. Būtent tokio galutinio rezultato neapibrėžtume ir yra sulieto baltymo gavimo būdo naujumas, nes šiuo metu negalima tiksliai numatyti, kas atsitiks, kai bus atliktas baltymo suliejimo eksperimentas.

Mokslinėje literatūroje nėra aprašyta jokio T. variabilis DAO fermento, kuris yra modifikuotas taip, kad būtų galima jį išgryninti per vieną stadiją ir kad ji būtų galima hiperprodukuoti veiklioje formoje arba E. coli, arba kitame mikroorganizme, gavimo būdo.

SMULKUS IŠRADIMO APRAŠYMAS

Šio išradimo aprašymą reikia pradėti nuo mielių T. variabilis ATCC 20931, kurios yra dezoksiribonukleino rūgšties (toliau žymimos DNR) donorius. Gavus mielių genominę DNR (kurioje yra genas, turintis susijusią su DAO genetinę informaciją, toliau vadinamas dao genu), ji buvo naudojama DNR bibliotekai konstruoti E. coli, naudojant fago vektorių /.-GEM12. Šios DNR bibliotekos analizė buvo atliekama pagal standartines hibridizacijos metodikas, mėginiais naudojant sintetinius oligonukleotidus, sukonstruotus remiantis panašumo sritimis, rastomis skirtingose DAO. Tokiu būdu buvo išskirta eilė E. coli rekombinantinių klonų, kuriuose buvo T. variabilis DNR fragmentas, koduojantis dao geną. Taip gautas DNR fragmentas buvo perklonuotas i plazmidinj vektorių, gautą iš E. coli kamieno. Rekombinantinis vektorius buvo panaudotas DNR fragmento, kuriame yra T. variabilis dao genas, sekai gauti (SEQ ID NO:1). Minėtos sekos analizė leido apibūdinti dao geną, kuris susideda iš dviejų egzonų ir vieno introno.

Kadangi anksčiau gautas DNR fragmentas, turintis T. variabilis dao geno genominę seką, turi vieną introną, jo negalima naudoti tiesiogiai ekspresijai E. coli. Todėl buvo dedamos pastangos gauti dao geną, kuris neturėtų minėto introno. Šiam tikslui dao genas buvo amplifikuotas PGS būdu, naudojant du sintetinius oligonukleotidus. Pirmasis iš jų buvo sukonstruotas taip, kad jame būtų tokie elementai: ribosomos surišimo vieta, transliacijos inicijavimo vieta, pilna pirmojo egzono seka ir antrojo egzono 5' galo pirmieji nukleotidai. Antrasis oligonukleotidas turėjo komplementarią 3’ galo seką, atitinkančią dao.· geno antrąjį egzoną, įskaitant trasliacijos užbaigimo kodoną. Į šiuos sintetinius oligonukleotidus taip pat buvo Įvestos skirtingos restrikcijos vietos, tinkančios DNR fragmentų klonavimui. Tokiu būdu buvo gautas naujas DNR fragmentas, kuris po išskyrimo buvo klonuotas i E. coli plazmidinj vektorių (Fig.1). Po to, naudojant anksčiau sukurtus restrikcijos taikinius, DNR fragmentas, turintis pilną dao geną be introno, buvo jklonuotas j įvairius E. coli plazmidinius vektorius, kurie turėjo promotorius, suteikiančius galimybę ekspresuoti genus šiame šeimininkeLT 4628 B bakterijoje. įvairių klonų produkuotos DAO aktyvumas buvo nustatomas panaudojant kalorimetrines metodikas ir HPLC chromatografiją. Tokiu būdu buvo gauti rekombinantiniai E. coli klonai, kurie gamina didelį kiekį aktyvaus DAO fermento.

Po to dao genas buvo modifikuojamas prijungiant nukleotidų seką, koduojančią polihistidiną. Šiam tikslui dao geną turinti plazmidė karpoma restrikcijos fermentu, kuris įkerpa transliacijos iniciacijos kodoną, ir perkirpimo metu atsiradę DNR galai atbukinami E. coli DNR polimerazės I Klenovo fragmentu. Po to jie sujungiami sintetiniu linkeriu, kuriame yra polihistidino kodonai, su kuriais buvo pagaminta plazmidė, turinti modifikuotą dao geną jos koduojančios srities 5' gale (SEQ ID NO:2), Taip gauta rekombinantinė plazmidė buvo transformuota j E. coli kamieną ir atrinkta pagal hibridizacijos metodikas, mėginiais panaudojant polihistidininio linkerio oligonukleotidus. Norint patikrinti ar teisingai buvo produkuotas norimas suliejimas, buvo nustatyta modifikuoto dao geno seka.

Po to buvo tiriamas modifikuotos polihistidinu DAO (toliau žymima hisDAO) produkavimas, naudojant įvairius E. coli kamienus kaip anksčiau sukonstruotų plazmidžių šeimininkus. Šiuo būdu buvo patikrinta ar hisDAO fermentas yra aktyvus.

Norint produkuoti hisDAO panaudojant anksčiau atrinktus rekombinantinius E. coli klonus, jie buvo auginami terpėje, turinčioje anglies šaltinį, azoto šaltinį ir mineralinių druskų. Inkubavimo temperatūra buvo tarp 18 °C ir 37 °C, o pH turi būti palaikomas tarp 5 ir 9. Mažo masto fermentacijai gali būti naudojamos įvairios talpos (nuo 50 ml iki 1000 ml) kolbos, kuriose terpės kiekis yra tarp 10 % ir 50 % kolbos tūrio. Fermentacijos trukmė gali būti 12-90 vai. ribose.

DAO produkavimas, panaudojant šį rekombinantinj mikroorganizmą, gali būti pagerinamas, jeigu parenkamos auginimo sąlygos, tinkamos rekombinantinio vektoriaus stabilumui palaikyti, o tai pasiekiama j auginimo terpę pridedant antibiotikų, kuriems dao geną turintis rekombinantinis vektorius turi atsparumo markerį (ampicilino, chloramfenikolio, kanamicino, tetraciklino ir 1.1.). Nekalbant apie produkavimo stabilizavimą, tai apsaugo nuo auginimo terpės užteršimo kitais nepageidaujamais mikroorganizmais ir taip pat pašalina kamienus, kurie praradę rekombinantini vektorių stabdo DAO produkavimą.

Rekombinantinės hisDAO produkuojančios ląstelės buvo atskirtos nuo kultivavimo terpės centrifuguojant ir buvo suardytos arba padarytos laidžiomis cheminiais, fermentiniais arba mechaniniais būdais. Norint gauti didesnio grynumo fermentinį ekstraktą, hisDAO buvo gryninama vienastadijiniu giminingumo chromatografijos metodu naudojant Co²⁺-IDA kolonėles. Šiam tikslui negrynintas fermentinis ekstraktas buvo užpilamas ant Co²⁺-IDA dervos, ir baltymai-priemaišos eliuuojami plaunant 20 mM fosfatiniu buferiu, pH 7,0, kuriame yra 0,2 M NaCI. Po to hisDAO fermentas eliuuojamas plaunant 10 mM imidazolu.

Jeigu vietoj Co²⁺-IDA chromatografiniu adsorbentu yra naudojamas Cu²⁺-IDA arba Zn²⁺-IDA, hisDAO fermentas išlieka stipriai prijungtas prie matricos aktyvioje formoje ir jo negalima eliuuoti didelėmis imidazolo koncentracijomis. Šiuo atveju adsorbentas, jj tinkamai išplovus pašalinant baltymus-priemaišas, gali būti naudojamas kaip imobilizuota fermentinė sistema.

Naudojant išskirtą iš rekombinantinių E. coli klonų, kurie ekspresuoja chimerini geną, hisDAO, iš cefalosporino C buvo gauta GL-7ACA.

Dializuoti ir sukoncentruoti fermentiniai ekstraktai, gauti po chromatografijos per Co²⁺-IDA adsorbentą, taip pat gali būti imobilizuojami Įvykdant reakciją su kitais tinkamais inertiniais kietais nešikliais, ir imobilizuotas hisDAO gali būti naudojamas cikliniame procese.

Šio išradimo naujumas yra tame, kad pirmą kartą T. variabilis mielių fermentas DAO, modifikuotas kaip hisDAO, gali būti ekspresuojamas aktyvioje formoje prokariotiniame organizme, tokiame kaip E. coli, ir gali būti išgryninamas giminingumo chromatografijos metodu per vieną stadiją. Be to, buvo gautas DAO produkavimo padidėjimas, lyginant su kiekiu, gaunamu T. variabilis, o tai palengvina šio fermento panaudojimą pramoniniu mastu. Galimybė produkuoti hisDAO įvairiuose E. coli kamienuose, kurie neturi nepageidautinų fermentų, tokių kaip katalazė arba esterazės, o taip pat galimybė pagerinti jos stabilumą ir katalitines savybes, panaudojant papildomus baltymų inžinerijos metodus, yra kiti aspektai, kurie padidina šio patento naujumo sąvoką.

Šis išradimas, jo neapribojant, smulkiau bus pailiustruojamas pavyzdžiais, kurie aprašomi toliau.

PAVYZDYS

1. DAO aktyvumo tyrimas

DAO aktyvumo tyrimas buvo atliekamas pagal anksčiau aprašytą metodiką (J. Biol. Chem. (1967) 242: 3957) substratu naudojant D-fenilgliciną (25 mM). Inkubacija buvo vykdoma 50 mM fosfatiniame buferyje, pH 8,0, 1530 min., sustabdant reakciją 1/10 tūriu grynos acto rūgšties. Optinio tankio (OD) pokytis esant 252 nm bangos ilgiui atspindi fermento aktyvumą, priimant dėmesin, kad 89,77 nmol reakcijoje susidariusios benzoilskruzdžių rūgšties OD₂₅₂ yra 1,0.

2. DNR vektorių ir transformacijai skirtu imliųjų E. coli ląstelių gavimas

Plazmidiniai vektoriai pBluescript I KS (+) (Ap^r) (Stratagene) ir pKK233.2 (Ap^r) (Pharmacia) buvo gauti šarminės ližės metodu (Sambrook et ai. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Šiam tikslui aukščiau minėtas plazmides turintys E. coli kamienai buvo inkubuojami 16 vai. maišant sukamu 250 aps./min. maišikliu 37 °C temperatūroje 500 ml LB su 100 ųg/ml ampicilino. Šiuo metodu .gauta plazmides DNR buvo gryninama centrifuguojant CsCI gradiente.

Imliosios E. coli TG1 ir E. coli DH5a ląstelės buvo gautos pagal RbCI metodiką (Sambrook et ai. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA).

3. Donorinės DNR, turinčios su DAO produkavimu susijusia genetine informaciją, gavimas

T. variabilis ATCC 20931 kamienas buvo kultivuojamas YMPG terpėje (0,3 % salyklo ekstrakto, 0,3 % mielių ekstrakto, 0,5 % peptono ir 1 % gliukozės). Inkubavimas buvo vykdomas 36 vai. (OD₆6o = 5,0) maišant sukamu 250 aps./min. maišikliu 30 °C temperatūroje.

Po to ląstelės buvo nusodinamos, plaunamos ir lizuojamos zymoliaze, o DNR buvo ekstrahuojama pagal anksčiau aprašytą metodiką (Sherman et ai. (1986) Laboratory Course for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Norint pasiekti didesnį grynumą, DNR buvo veikiama RNaze, keletą kartų ekstrahuojama fenoliu ir chloroformo-izoamilo alkoholio mišiniu 24/1 (ČIA), ir nusodinama izopropanoliu. Nusodinta DNR buvo plaunama 100 % etanoliu ir 70 % etanoliu, ir ištirpinama 10 mM Tris-HCI buferyje, pH 7,5, turinčiame 1 mM EDTA (TE buferyje).

PAVYZDYS

1. T. variabilis DNR bibliotekos konstravimas

T. variabilis ATCC 20931 kamieno pilna DNR buvo gauta pagal 1 pavyzdžio 3 dalyje aprašytą metodiką. Minėtos DNR 300 ug buvo dalinai sukarpoma 20 vienetų Sau3AI 600 μΙ reakcijos tūryje 37 °C temperatūroje, ir atitinkamai po 45 sekundžių, 1 minutės ir 2 minučių paimamos 3 alikvotos sustabdant karpymą šalta 20 mM EDTA. Patikrinus sukarpymus 0,7 % agarozės gelyje, mėginiai buvo sumaišomi, pašildomi 10 min. 68 °C temperatūroje, leidžiama lėtai atvėsti iki kambario temperatūros ir užpilama ant 38 ml (10-40 %) sacharozės gradiento. Šis gradientas centrifuguojamas 24 vai. 15 °C temperatūroje esant 26000 aps./min., surenkamos 0,5 ml alikvotos, ir 10 μΙ šių alikvotų analizuojama 0,4 % agarozės gelyje. Alikvotos, kurių DNR yra 18-22 kb dydžio, sumaišomos ir praskiedžiamos distiliuotu vandeniu iki maždaug 10 % sacharozės. Po to ši DNR nusodinama etanoliu, resuspenduojama 50 μΙ TE buferio ir 3 μΙ pastarojo tirpalo analizuojama 0,4 % agarozės gelyje. Analizė šiame gelyje patvirtina, kad yra tinkamas DNR fragmentų dydis ir kad jų koncentracija yra maždaug 50 ng/μΙ.

Lygiagrečiai, pagal anksčiau aprašytas metodikas su nedideliais pakeitimais (Sambrook et ai. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) pagaminama bakteriofago Ž-GEM12 DNR. Šiam tikslui E. coli NM538 kamienas (Promega) buvo auginamas 10 vai. NZCYM-0,2 % maltozėje ir jo OD buvo matuojamas esant 600 nm bangos ilgiui. Kultūros, atitinkančios 3x10⁹ ląstelių, tūris buvo centrifuguojamas staline centrifūga 10 min. 4 °C temperatūroje esant 4000 aps./min. ir resuspenduojamas 1,2 ml SM buferio, j šias ląsteles pridedama 3x10⁷ plokštelių sudarančių vienetų (pfu) 7-GEM12 fago, ir mišinys inkubuojamas 30 min. 37 °C temperatūroje nemaišant. Kiekviena pašildyta iki 37 °C temperatūros kolba (500 ml tūrio su 100 ml NZCYM-0,2 % maltozės terpės) inokuliuojama 200 μΙ šių infekuotų ląstelių. Minėtos kolbos inkubuojamos 37 °C temperatūroje tol, kol prasideda kultūros lizavimasis (5-6 vai.). Lizatai veikiami DNaze (^g/ml) ir RNaze (2 p.g/ml) 45 min. kambario temperatūroje. Po to 100-ui ml lizato pridedama 5,8 g NaCI, ir mišinys laikomas 60 min. lede. Po šio laiko lizatas nufiltruojamas, norint pašalinti ląstelių liekanas, ir 100-ui ml lizato pridėjus 20 ml 50 % PEG-6000 mišinys laikomas 60 min. lede ir centrifuguojamas 20 min. 4 °C temperatūroje esant 10000 x g. Nuosėdos resuspenduojamos 1 ml TE buferio ir ekstrahuojamos du kartus ČIA, norint pašalinti PEG-6000 liekaną nesuardant fago. Po to ekstrahuojama du kartus neutraliu fenoliu, vieną kartą - fenoliuCIA ir vieną kartą - ČIA. Į vandeninę fazę pridedama NaCI iki 0,5 M (pridedant 4M NaCI), ir DNR nusodinama dviem tūriais etanolio -20 °C temperatūroje. Po 20 min. centrifugavimo minicentrifuga 4 °C temperatūroje esant 12000 aps./min., nusodinta DNR .plaunama 70 % etanoliu, džiovinama ir resuspenduojama 50 μΙ TE buferio.

μΙ bakteriofago DNR buvo karpoma endonukleazėmis fiamHI ir Xba\ 37 °C temperatūroje 2 valandas. Šis dvigubo karpymo mišinys buvo ekstrahuojamas fenoliu-CIA ir ČIA, nusodinamas etanoliu ir resuspenduojamas 50 μΙ TE buferio. Atskyrus 2 μΙ alikvotą, j liekaną pridedama MgCI₂ iki 10 mM koncentracijos ir inkubuojama 1 vai. 42 °C temperatūroje norint paskatinti vektoriaus atšakų susijungimą lipniais galais.

Vėl buvo atskirta 2 μΙ frakcija, kuri buvo analizuojama kartu su pirmesniaja 0,5 % agarozės gelyje. Patvirtinus, kad susijungimas lipniais galais Įvyko reikiamu būdu, mišinys supilamas ant 38 ml sacharozės gradiento (10-40 %). Šiuo atveju, prieš pilant ant gradiento DNR nebuvo šildoma 68 °C temperatūroje, nes tai atskirtų fago lipnius galus. Šis gradientas buvo centrifuguojamas 15 °C temperatūroje 24 vai, 26000 aps./min, greičiu, po to surenkamos 0,5 ml alkivotos. Išanalizavus 15 μΙ kiekvienos iš šių alikvotų 0,5 % agarozės gelyje, frakcijos, kuriose nebuvo nebūtino centrinio fragmento arba “šlamšto, buvo sumaišytos ir praskiestos distiliuotu vandeniu iki maždaug 10 % sacharozės koncentracijos. Ši DNR buvo nusodinama etanoliu, resuspenduojama 50 μΙ TE, ir 2 μΙ pastarojo tirpalo buvo analizuojama agarozės gelyje (0,5 %), norint patvirtinti, kad nėra centrinio fragmento ir kad jos apytikrė koncentracija yra 100 ng/μΙ.

Po to buvo atlikta eilė ligavimų, naudojant 0,25 μg intarpo ir 0,25-0,75 μg ribose esančius vektoriaus kiekius, keičiant intarpo/vektoriaus santyki. Reakcijų mišiniai buvo inkubuojami 12-14 °C temperatūroje 16 valandų. Patvirtinus 0,4 % agarozės gelyje, kad pasirodė DNR fragmentai (gauti ligavimo reakcijoje) didesni nei vektorius arba intarpas, visi ligavimo reakcijų mišiniai sumaišomi, nusodinami etanoliu ir resuspenduojami 4 μΙ ligavimo buferio.

Gautos po ligavimo rekombinantinės fago DNR pakavimas buvo vykdomas su Packagene (Promega) “in vitro” pakavimo ekstraktais. Pakavimo reakcijos rezultatas, resuspenduotas 500 μΙ SM, buvo naudojamas infekuoti E. coli NM538 esančių fagų skaičiaus nustatymui, ir E. coli NM539 (Promega) - rekombinantinių. fagų procentinio kiekio nustatymui. E. coli NM539 yra fago P2 lizogeninis kamienas ir duoda tik ližės plokšteles, jeigu fage, kuris ji infekuoja, nėra nebūtinos centrinės srities. Sukonstruota DNR biblioteka turėjo apie 200000 pfu ir apie 85 % fagų turėjo egzogenini DNR fragmentą.

Atlikus šiuos skaičiavimus, buvo infekuota E. coli NM539 ir pilna genetinė biblioteka paskleista ant 150 mm skersmens Petri lėkštelių.

2. Klonu, kurie turi dao gena, identifikavimas

Pilna DNR biblioteka buvo perkelta j nitroceliuliozės filtrus ir pagal anksčiau aprašytą hibridizacijos metodiką (Sambrook et ai. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) buvo atrinkti teigiami klonai. Atrinkimas buvo pradėtas nuo nitroceliuliozės filtrų prehibridizacijos inkubuojant juos 42 °C temperatūroje 3 vai. hibridizacijos buferyje. Hibridizacija buvo vykdoma pašalinant prehibridizacijoje naudotą buferį ir įvedant naują hibridizacijos buferį kartu su 10 pmol oligonukleotido OA (5’-TCTTGTCCTCGACACC-3’) ir OB (5'-GACGTGGATTGTCAACTG-3'), pažymėtų jų 5’ gale ³²P panaudojant fago T4 polinukleotidinę kinazę ir [γ-³²Ρ]ΑΤΡ (ICN Biochemicals) pagal standartines metodikas (Sambrook et ai. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Filtrai buvo inkubuojami 42 °C temperatūroje 16 valandų ir plaunami du kartus po 20 min. kambario temperatūroje 2 x SSC-0,1 % SDS, o po to plaunama dar du kartus tokį patį laiką hibridizacijos temperatūroje 0,1 x SSC-0,1 % SDS buferiu. Po to nitroceliulioziniai filtrai buvo eksponuojami su Hyperfilm-MP (Amersham) po amplifikacijos ekranais -70 °C temperatūroje 48 valandas.

Pabaigus prehibridizaciją, hibridizaciją, plovimus ir autoradiografiją, buvo atrinkti 63 klonai, kurie davė teigiamus signalus su abiem mėginiais OA ir OB. Tik 9 iš teigiamų ližės plokštelių buvo surinktos atskirai panaudojant Pastero pipetę ir kiekviena iš jų buvo resuspenduota 1 ml SM plius 50 μΙ chloroformo. Po to buvo titruojami šiame tirpale esantys fagai. Šiam tikslui reikėjo praskiesti minėtus fagus 5000 kartų, norint užtikrinti, kad jeigu bus infekuojama 20 μΙ šio mišinio, ližės plokštelių skaičius Petri lėkštelei bus tarp 500 ir 1000. Perkėlus kiekvienos Petri lėkštelės turinį ant atinkamo nitroceliuliozinio filtro, pastarasis buvo vėl hibridizuojamas su tais pačiais OA ir OB mėginiais. Autoradiografija parodė, kad tarp 20 ir 50 % fagų iš kiekvienos Petri lėkštelės davė teigiamą signalą. Todėl reikėjo išgyninti kiekvieną teigiamą fagą, panaudojant trečią hibridizacijos ciklą. Šiuo tikslu buvo panaudota Pastero pipetė teigiamoms ližės plokštelėms, kurios buvo labiau atsiskyrę nuo kitų, arba kurios buvo apsuptos taip pat teigiamomis ližės plokštelėmis, surinkti, ir jos buvo resuspenduotos 1 ml SM plius 50 μΙ chloroformo. Praskiedus fago tirpalą 100 kartų ir infekavus 15 μΙ šio tirpalo, buvo gauti maždaug 300 ližės plokštelių/Petri lėkštelei titrai. Pakartojus bandymą ankstesniems dviems ciklams identiškomis sąlygomis, buvo gautas rezultatas, kad 100 % fagų iš kiekvienos Petri lėkštelės buvo teigiami. Tokiu būdu buvo išgrynintos 9 nepriklausomos ližės plokštelės. Kiekviena ližės plokštelė buvo resuspenduota 100 μΙ SM plius 10 μΙ chloroformo, ir panaudojant 2 μί šio tirpalo buvo gautos susijungusios ližės plokštelės turint tikslą amplifikuoti minėtus teigiamus fagus ant kietos terpės. Surinkus viršutini agarozės sluoksnį ir resuspendavus jį 5 ml SM, buvo gauti kiekvieno teigiamo fago tirpalai, kurių koncentracija apytikriai 10⁷ pfu/μΙ.

Naudojant Southern’o metodą (Sambrook et ai. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA), aukščiau minėti oligonukleotidai OA ir OB buvo taip pat naudojami kaip mėginiai nustatyti genominės DNR fragmentams, kuriuose yra T. variabilis dao genas. Šiam tikslui buvo vykdoma hibridizacija su DNR, sukarpyta restrikcijos endonukleazėmis (Pharmacia) SamHI, ScoRI, Hind\\\, Knp\, Pst\, PvuU, Xba\ ir Xho\ ir frakcionuota agarozės gelyje žemiau aprašytomis sąlygomis. Agarozės gelis, kuriame buvo išskirstyti DNR fragmentai remiantis jų molekulių dydžiu, buvo iš eilės inkubuojamas kambario temperatūroje, silpnai maišant, 15 min. - 0,25 M HCI, 1 vai. denatūravimo tirpale ir 1 vai. - neutralizavimo tirpale. Po to šis gelis buvo padėtas ant pluošto VVhatman 3 MM filtro popierių, išmirkytų 10 x SSC, o ant jo buvo uždėtas tokių pačių kaip ir gelis išmatavimų BA85 nitroceliuiiozės filtras (0,45 μίτι) (Schleicher and Schuell), išmirkytas 2 x SSC, stengiantis, kad nesusidarytų burbuliukai. Ant šio nitroceliuiiozės filtro buvo uždėti du lapai Watman 3MM popieriaus, išmirkyto 2 x SSC, ant jų uždėta 8-10 cm aukščio pluoštas tokių pačių išmatavimų sauso filtrinio popieriaus, o ant jų viršaus maždaug 500 g svoris. Pernešimo procesas buvo vykdomas 16 valandų. Pernešus DNR, nitroceliuiiozės filtras 5 minutėms buvo atsargiai panardintas j 6 x SSC, paliktas 1 valandą išdžiūti kambario temperatūroje ir laikomas tarp dviejų VVhatman 3 MM popieriaus lapų 80 °C temperatūroje vakuume 3 valandas, kad DNR prisitvirtintų prie filtro. Tada buvo prehibridizuojama ir hibridizuojama tomis pačiomis sąlygomis kaip aprašyta anksčiau DNR bibliotekos atrinkimui. Autoradiografijos rezultatai parodė, kad atsirado kiekvienam sukarpymui būdingos hibridizacijos juostos. Tiksliau sakant, šias juostas atitinkantis dydis buvo: 10,2 kb karpant fcoRI, 3,7 kb - SamHI, 3,5 kb - Hind\\\, 11,6 kb - Knp\, 11,3 kb - Pst\, 4,8 kb - PvuU, 2,8 kb - Xba\ ir 4,7 kb Xho\.

3. DNR fragmento, kuris koduoja dao gena, klonavimas

Išgryninus fagų DNR, kaip nurodyta 2 pavyzdžio 1 dalyje bakteriofago X-GEM12 atveju, ji buvo karpoma Sa/I, ir identifikuota 9,2 kb juosta, kuri buvo įkionuota i pBluescript I KS(+) plazmidę (Stratagene), sukarpomą panaudojant T4 fago DNR ligazę, ATP ir fermento tiekėjų rekomenduojamą buferį, Gautas ligavimo mišinys buvo inkubuojamas 5 vai. 12 °C temperatūroje ir naudojamas imliosioms E. coli TG1 ląstelėms (Amersham) transformuoti. Transformantai buvo atrinkti kietoje LB terpėje, j kurią pridėta ampicilino (100 ųg/ml), X-gal (40 ųg/ml) ir 0,2 mM IPTG. Iš klonų, kurie rodo baltąjį selekcijos fenotipą, išskirta pALT1 plazmidė. Naudojant Sauthern’o metodiką ir OB mėgini, po to buvo lokalizuotas 3,7 kb fiamHI fragmentas, įeinantis j pALT1 plazmidę. Šis SamHI fragmentas buvo jklonuotas Į pBluescript I KS(+) plazmidę (Stratagene), sukarpytą fiamHI. Tokiu būdu buvo išskirtos pALT2 ir pALT3 plazmidės, kurios abiejose orientacijose turi 3,7 kb SamHI fragmentą (Fig.T).

4. Fragmento, kuris turi dao gena, sekos nustatymas

Fragmento, esančio pALT2 plazmidėje, nukieotidų seka buvo nustatyta imant tą pačią plazmidę anksčiau aprašytu būdu (Sanger et ai. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5464), naudojant T7 DNR polimerazės rinkinį (Pharmacia) ir [³⁵S]dATP. Ši seka yra parodytą SEQ ID NO:1. Sekas analizė ir jos palyginimas su kitomis tarptautinėse duomenų bazėse (GeneBank/EMBL) žinomomis sekomis parodė, kad klonuotas fragmentas koduoja T. variabilis dao geną.

PAVYZDYS

1. dao geno introno eliminavimas PGS būdu

0,15 ąg DNR mėginys iš pALT2 plazmidės buvo sumaišytas su 10 μΙ (25 μΜ) kiekvieno iš šių oligonukleotidų: DAO1 (5’-CATGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGGGCCGGTGTTGCCGGTTTAAC-3'), kuris koduoja pirmojo egzono pilną seką ir antrojo egzono 5’ galą ir turi Nco\ restrikcijos vietą; ir DAO2 (5^r-CCCAAGCTTCTAAAGGTTTGGACGAG-3), kuris turi Hind\\\ restrikcijos vietą ir 3’ galo seką, atitinkančią dao geno antrąjį egzoną, įskaitant transliacijos baigmės kodoną, i ši mišinį pridedama 2,5 vieneto Taq polimerazės (Perkin-Elmer) kartu su atitinkamu tiekėjų rekomenduojamu buferiu, ir preparatas amplifikuojamas PGS elemente (Gene-ATAQ, Pharmacia), naudojant 30 ciklų, kiekviename cikle esant 95 °C (1 minutė), 50 °C (2 minutės) ir 55 °C (2,5 minutės). Ampilfikacijos rezultatas Įvertinamas nudažant etidžio bromidu po elektroforezės 1 % agarozės gelyje.

PGS būdu gautas fragmentas, kurio dydis apytikriai 0,9 kb, buvo gryninamas ekstrahuojant agarozės gelį, panaudojant β-agarazę (Biolabs) pagal gamintojų instrukcijas. 0,2 ųg išgryninto fragmento buvo liguojama su 1ųg M13tg130 vektoriaus (Amersham), sukarpyto HincU (Pharmacia), panaudojant T4 fago DNR ligazę (Amersham) esant ATP, naudojant tiekėjo rekomenduojamą buferį. Šiuo būdu buvo pagamintas M13DAO fagas (Fig.1), po to buvo nustatyta jo seka, norint patikrinti ar buvo pakankamai eliminuotas intronas. M13DAO fage esančio fragmento nukleotidų seka buvo nustatyta imant tą patį rekombinantinį fagą anksčiau aprašytu būdu (Sanger et ai. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5464), naudojant T7 DNR polimerazės rinkinį (Pharmacia) ir [³³S]dATP. Ši nukleotidų seka parodė, kad klonuotas fragmetas yra 0,9 kb dydžio ir turi T. variabilis dao geno seką be introno.

2. Neturinčio introno dao geno jklonavimas i pKK233.2

0,1 ųg DNR mėginio iš pKK233.2 plazmidės buvo karpoma restrikcijos endonukleazėmis Nco\ ir Hind\\\ (Pharmacia) 37 °C temperatūroje tiekėjų rekomenduojamame buferyje 1 valandą ir norint sustabdyti reakciją pašildoma 10 min. 65 °C temperatūroje. Sukarpyta plazmidė sumaišoma su 0,2 ųg M13DAO fago, sukarpyto tomis pačiomis aukščiau nurodytomis endonukleazėmis, ir abi DNR liguojamos, panaudojant T4 fago DNR ligazę (Amersham) esant ATP ir naudojant tiekėjo rekomenduojamą buferį.

Gautas ligavimo mišinys naudojamas imliosioms E. co//TG1 ląstelėms transformuoti. Transformantai buvo išskirti LB terpėje su ampicilinu (100 ųg/ml). Pagal šią metodiką buvo gautas kionas, turintis rekombinantinę plazmidę pKDAO3 (Fig.1), kuris turi 0,9 kb DNR fragmentą, atsirandantį iš amplifikacijos PGS būdu, įterptą tarp pKK233.2 plazmidės Nco\ ir Hind III vietų, t.y ekspresuotą kontroliuojant trc promotoriui.

PAVYZDYS

1. Chimerinio DAO fermento, turinčio uodega iš 6 histidinu, konstravimas

Norint j T. variabilis DAO fermento amino-galą įterpti polihistidininę uodegą, 0,1 ųg pKDAO3 plazmidės buvo karpoma restrikcijos endonukleaze Nco\ (Pharmacia) 1 vai. 37 °C temperatūroje tiekėjo rekomenduojamomis sąlygomis ir šildoma 10 min. 65 °C temperatūroje reakcijai sustabdyti. Taip sukarpyta plazmidė veikiama E. coli DNR polimerazės I Kienovo fragmentu (Pharmacia) pagal tiekėjo istrukcijas, po to šis mėginys šildomas 10 min. 65 °C temperatūroje reakcijai sustabdyti. Gauta ištiesinta plazmidė liguojama su DNR fragmentu, kuris turi 6 histidino liekanas koduojančią nukleotidų seką, panaudojant T4 fago DNR ligazę (Amersham), esant ATP ir naudojant tiekėjo rekomenduojamą buferį. Šešias histidino liekanas koduojantis fragmentas buvo gautas panaudojant 1,5 ųg dviejų komplementarių oligonukleotidų, vadinamų HIS1 (5’-CATCATCACCACCATCACTT-3') ir HIS2 (5’AAGTGATGGTGGTGATGATG-3’), mišinio, kuris buvo pakaitintas 100 °C temperatūroje 5 minutes ir po to atvėsintas iki kambario temperatūros, kad susihibridizuotų susidarant dvigrandžiam DNR fragmentui.

Gautas ligavimo mišinys buvo panaudotas imliosioms E. coli TG1 ląstelėms transformuoti. Transformantai buvo išskirti LB terpėje su ampicilinu (100 ąg/ml). Pagal šią metodiką buvo gautas klonas, turintis rekombinantinę plazmidę pKDAOHIS, kuris turi dao geną, prijungtą prie 18 nukleotidų sekos, koduojančios 6 histidino liekanas 5’ gale. Norint patikrinti, ar pKDAOHIS plazmidė (Fig.1) turi laukiamą chimerini konstruktą, buvo nustatyta seka imant tą pačią rekombinantinę plazmidę pagal anksčiau aprašytą metodiką (Sanger et ai. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5464), naudojant T7 DNR polimerazės rinkini (Pharmacia) ir [³⁵S]dATP. Gauta seka parodyta SEQ ID NO:2.

pKDAOHIS plazmidę transformuotas E. coli TG1 kamienas buvo fermentuojamas LB terpėje 20 vai. 25 °C temperatūroje esant 250 aps./min. Po to ląstelės buvo surenkamos centrifuguojant, esant 5000xg, 10 min., suardomos ultragarsu ir tiriamas jų DAO aktyvumas pagal 1 pavyzdžio 1 dalyje aprašytą metodiką. Pagal šią metodiką gautos DAO aktyvumas buvo 350 vienetų/mg baltymo. Šiuo būdu buvo patvirtinta, kad taip gautas chimerinis DAO fermentas su histidinų grandine (hisDAO) yra aktyvus. Be to, naudojant SDS-poliakrilamidinio gelio eiektroforezę buvo patvirtinta, kad, kaip ir buvo laukiama, hisDAO fermentas yra šiek tiek didesnis nei natyvus DAO fermentas. pKDAOHIS plazmidę transformuotas E. coli TG1 kamienas buvo deponuotas Ispanijos tipinių kultūrų kolekcijoje (CECT), kuri yra Valensijos universiteto biologijos mokslų fakulteto mikrobiologijos departamente, 46100 Burjasot (Valencia), 1997.06.10.su depozito numeriu CECT4888.

PAVYZDYS

1. Agarozės-metalo chelato adsorbento gavimas

5,7 ml epichlorhidrino ir 11,4 ml etilenglikolio dimetiio eterio mišinys lėtai supilamas j 7 g agarozės CL6B suspensiją 57 ml 0,1 N NaOH tirpalo, turinčio 340 mg NaBH₄, ir suspensija lėtai maišoma be pertraukos 4 vai. 25 °C temperatūroje. Taip gautas agarozė-epoksidas plaunamas dideliu kiekiu distiliuoto vandens ir sudedamas j tirpalą, pagamintą iš 2,5 ml 2M natrio iminodiacetato ir 19 ml 0,1 M natrio rūgščiojo karbonato buferio, pH 11. Ši suspensija lėtai maišoma be pertraukos 12 vai. 25 °C temperatūroje. Pagaliau adsorbentas plaunamas distiliuotu vandeniu ir resuspenduojamas vandeniniame tirpale, kuriame yra norimo metalo druskos (5 mg/ml). Taip gautas agarozės-metalo chelato adsorbentas plaunamas dideliu kiekiu vandens ir paruošiamas tolimesniam naudojimui. Jeigu pridedama metalo druska yra CoCI₂, gaunamas agarozės-kobalto chelato adsorbentas.

2. Chimerinio hisDAO fermento gryninimas panaudojant agarozėskobalto chelato adsorbentą

Kolonėlė, kurioje yra agarozės-kobalto chelato adsorbentas, išlyginama 20 mM natrio fosfato buferiu (pH 7,0) ir 0,2 M NaCI. J šią kolonėlę supilamas tirpus ląstelių ekstraktas, gautas taip kaip aprašyta ankstesniame pavyzdyje iš transformuotų pKDAOHIS plazmide E. coli TG1 ląstelių. Supylus ši ekstraktą, kolonėlė plaunama dideliu kiekiu to paties išlyginimo buferio, tokiu būdu iš ekstrakto pašalinant visus baltymus, išskyrus hisDAO, kuris lieka kolonėlėje. Po to hisDAO fermentas eliuuojamas, naudojant 20 mM natrio fosfato buferi, pH 7,0, kuriame yra 10 mM imidazolo. Surenkamos frakcijos, kuriose yra hisDAO fermento, ir dializuojama 20 mM natrio fosfato buferyje, pH 7,0. Taip pagamintas fermentas (9000 vienetų/mg) yra didesnio nei 90 % grynumo ir yra paruoštas naudoti cefalosporino C pavertimui i GL7ACA.

SMULKUS FIGŪRŲ APRAŠYMAS

Fig.1. - pKDAOHIS plazmidės konstravimo būdas

Neturintis introno ir turintis Nco\ vietą ATG, kuris koduoja baltymo pirmąjį metioniną, dao genas buvo gautas PGS būdu iš pALT2 plazmidės. Po to PGS būdu amplifikuotas fragmentas buvo jklonuotas prie M13tg130 vektoriaus HincU vietos, susidarant M13DA0. Iš M13DAO gautas Nco\-HindU\ fragmentas buvo jklonuotas prie pKK233.2 plazmidės Nco\-Hind\U vietų, susidarant pKDAO3. Ši plazmidė turi dao geną, ekspresuojamą kontroliuojant E. coli trc promotoriui. Galų gale buvo įvestas DNR fragmentas, koduojantis dao geno polihistidininę uodegą 5' gale, gaunant pKDAOHIS plazmidę.

Claims (8)

1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

   1. Modifikuoto Trigonopsis variabilis D-aminorūgšties oksidazės fermento šeimininko (ne žmogaus) organizme gavimo būdas, b e s i s k i - r i a n t i s tuo, kad jis susidada iš tokių operacijų:

   (a) DNR geno, kuris koduoja aktyvią D-aminorūgšties oksidazę ši fermentą gaminančiame bet kokio kamieno mikroorganizme, išskyrimo;

   (b) introno, esančio minėtą gene, pašalinimo sintetinių oligonuleotidų ir polimerazinės grandinės sintezės (PGS) panaudojimu paremtos metodikos pagalba;

   (c) (b) stadijoje gauto DNR fragmento Įterpimo j plazmidę, kuri gali replikuotis šeimininko organizme;

   (d) sintetinio asemblerio, turinčio šešis histidinus koduojančią nukleotidų seką, prijungimo introno neturinčio geno, kuris koduoja aktyvią Daminorūgšties oksidazę, struktūrinės srities 5' gale;

   (e) šeimininko organizmo transformavimo (d) stadijoje gauta rekombinantine plazmidę;

   (f) gauto (e) stadijoje organizmo transformuotų ląstelių auginimo tinkamoje kultivavimo terpėje D-aminorūgšties oksidazės gaminimąsi užtikrinančiomis sąlygomis;

   (g) D-aminorūgšties oksidazės išskyrimo iš (f) stadijoje gautos kultūros, panaudojant giminingumo chromatografiją.
2. 2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad Daminorūgšties oksidazės fermentą koduojantis genas yra Trigonopsis variabilis genas.
3. 3. Būdas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad šeimininko (ne žmogaus) organizmas yra Escherichia coli.
4. 4. Būdas pagal bet kurį iš pirmesniųjų punktų, besiskiriantis tuo, kad giminingumo chromatografija, naudojama modifikuotam fermentui išskirti, yra paremta panaudojimu adsorbento dvivalenčių katijonų pagrindu.
5. 5. D-aminorūgšties oksidazės fermentas, besiskiriantis tuo, kad jis yra modifikuotas, pagamintas ir išgrynintas bet kuriame iš pirmesniųjų punktų apibrėžtu būdu.
6. 6. 7p-(4-karboksibutanamido)cefalosporano rūgšties fermentinės sintezės būdas, besiskiriantis tuo, kad jame naudoja Daminorūgšties oksidazės fermentą pagal 5 punktą.
7. 7. Būdas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad cefalosporiną C veikia D-aminorūgšties oksidazės fermentu vandeninėje terpėje.
8. 8. Būdas pagal 6 ir 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad fermentinę reakciją vykdo su imobilizuotu D-aminorūgšties oksidazės fermentu.